ES2288107B1

ES2288107B1 - Derivados aciclicos saturados e insaturados de cadena larga de sulfamidas como activadores especificos de receptores ppar-alfa.

Info

Publication number: ES2288107B1
Application number: ES200600184A
Authority: ES
Inventors: Fernando Anton. Rodriguez De Fonseca; Manuel MACIAS GONZALEZ; Javier PAVON MORON; Maria Pilar Goya Laza; Juan Antonio PAEZ PROSPER; Carolina CANO RAMOS
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2026-01-27
Also published as: US20100048712A2; US20090221710A1; AU2007209465A1; ES2288107A1; JP2009524614A; RU2008134883A; KR20080109738A; NZ570701A; CN101395130A; AU2007209465A8; CA2640141A1; WO2007085469A1; US8188312B2; US20100179224A2; NO20083636L; MX2008009590A; EP1984326A1; EP1984326B1

Abstract

Derivados acíclicos saturados e insaturados de cadena larga de sulfamidas, sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, que muestran afinidad selectiva por el subtipo alfa de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR) y que, por tanto, modulan las acciones reguladas por estos receptores, en concreto, la inducción de saciedad y control de la ingesta, la disminución de la ganancia de masa corporal y la regulación del metabolismo lipídico.

Description

Derivados acíclicos saturados e insaturados de cadena larga de sulfamidas como activadores específicos de receptores PPAR-alfa.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a una nueva clase de derivados de sulfamida y a sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, que muestran afinidad selectiva por el subtipo alfa de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR) y que, por tanto, modulan las acciones reguladas por estos receptores, en concreto la inducción de saciedad y control de la ingesta, la disminución de la ganancia de la masa corporal y la regulación del metabolismo lipídico.

Antecedentes de la invención

Los receptores activados por el proliferador de peroxisoma (PPAR) son una superfamilia perteneciente a los receptores nucleares de hormonas, que son factores de transcripción activados por ligando que juegan un papel fundamental en la regulación del metabolismo de lípidos y de glúcidos.

Tres subtipos de receptores PPAR han sido descritos: PPARalfa, PPARgamma y PPARdelta^{i}. La activación del subtipo PPARgamma por ligandos potencia las acciones de la insulina en el hombre y reduce los niveles de glucosa circulante en los modelos de roedores de diabetes. El receptor de PPARgamma que se expresa en el tejido adiposo, juega una función central en la regulación de la diferenciación de adipositos in vitro. Se conoce menos acerca de la biología del subtipo PPARdelta, aunque parece jugar un papel importante en el control de la hiperglucemia y la hiperlipemia^{ii \ iii}.

La activación del subtipo PPARalfa por sus ligandos naturales está relacionada con el control de los niveles de lípidos circulantes. Se han descrito ácidos grasos de cadena media y larga y eicosanoides^{iv} que producen una reducción sustancial de los triglicéridos del plasma, una reducción moderada del colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (LDL) y un efecto de saciedad. Por ello, el subtipo alfa de esta familia de receptores se presenta como una diana terapéutica muy interesante para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con alteraciones metabólicas como las dislipemias, enfermedad cardiovascular, diabetes y obesidad^{v \ vi}.

Las dislipemias son desórdenes en el metabolismo lipídico que se caracterizan por concentraciones anormales de uno o más tipos de lípidos (ej. Colesterol y Triglicéridos), y/o apolipoproteínas (ej. Tipo A, B, C y E), y/o lipoproteínas (ej. de baja densidad (LDL), de muy baja densidad (VLDL) y de densidad intermedia (IDL)). La molécula de colesterol es transportada normalmente unida las lipoproteínas LDL. La elevación de los niveles de esta composición está directamente relacionada con el riesgo de enfermedad coronaria. Un porcentaje más pequeño de la molécula de colesterol es transportada a través de las lipoproteínas HDL, cuya función principal es extraer el colesterol depositado en las paredes arteriales y transportarlo hasta el hígado para su eliminación vía intestino. Se ha descrito que un nivel elevado de HDL-colesterol está asociado con la disminución del riesgo de enfermedad coronaria. Por tanto, en el tratamiento de las dislipemias es igualmente importante tanto disminuir los niveles de LDL-colesterol como elevar los niveles de HDL-colesterol^{vii \ viii \ ix}. En la actualidad se están utilizando clínicamente los derivados de fibrato, como por ejemplo clofibrato^{x}, bezafibrato y fenofibrato^{xi} para el control de las dislipemias uniéndose al subtipo PPARalfa, controlando así ciertos factores de transcripción implicados en algunos de los procesos anteriormente descritos^{xii}.

Además del tratamiento de las dislipemias, se están utilizando agentes agonistas duales de PPARalfa/gamma con potencial uso para el tratamiento de la diabetes tipo 2^{xiii}. Distintos glitazones (derivados de bencil-2,4-tiazolidindiona) han sido aprobados para su uso en el tratamiento de la diabetes. Entre ellos se incluye isaglitazon^{xiv}, troglitazon, rosiglitazon y pioglitazon^{xv}. Están en desarrollo o en distintas fases de investigación clínica nuevas moléculas que están demostrando una actividad dual como activadores de los subtipos PPARalfa y gamma como el KRP-297^{xvi}, algunos tiazoles^{xvii} y derivados del ácido propiónicox^{xviii}.

Por último, distintas líneas de investigación se están concentrando en el desarrollo agentes selectivos del subtipo PPARalfa, como los derivados del ácido fenilpropiónicoe^{xix} o los de triazol y triazolona LY518674^{xx} como potencial tratamiento en enfermedades relacionadas con desórdenes del perfil lipídico y composición de grasa corporal.

Aunque los agentes actuales están dando buenos resultados en el tratamiento de algunas enfermedades como la diabetes, todavía se hace necesario seguir buscando nuevos compuestos con potencial terapéutico contra nuevas enfermedades, que no presenten los problemas de efectos adversos mostrados por los actuales, sobre todo los relacionados con hepatotoxicidad^{xxi}.

Descripción de la invención

La presente invención es continuación de un proyecto anterior en el que se describió al ácido graso endógeno oleiletanolamida (OEA) como un nuevo ligando capaz de activar al subtipo PPARalfa y su acción como inductor de saciedad y controlador de la ingesta en ratas, inhibidor de la ganancia de la masa corporal y el regulador del metabolismo lipídico^{xxii}.

Los compuestos descritos a continuación son una nueva clase de moléculas análogas de la OEA que, en general, fueron capaces de inducir la interacción entre PPARalfa y sus coactivadores en solución, y activar la transcripción de los genes regulados por PPARalfa, algunos de ellos, incluso con mayor potencia que la OEA, mediante ensayos in vitro. Además mostraron efectos similares a los de la molécula de referencia en los ensayos in vivo.

Por tanto, estos nuevos compuestos son útiles en la mejora de las condiciones fisiológicas reguladas por agonistas de los receptores PPARalfa, como por ejemplo los relacionados con la modulación de la grasa corporal y la inhibición de la ingesta, mostrando así, gran potencial de aplicación en el tratamiento de las enfermedades o situaciones patológicas derivadas de las anteriores condiciones, al tiempo que pueden disminuir los efectos adversos de los tratamientos actuales.

Los compuestos de la presente invención corresponden a derivados acíclicos saturados e insaturados de aminosulfonilamino disustituidos de estructura I

1

donde:

: R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o distintos,

: Cuando R_{1} y R_{2} son distintos,

: R_{1} es un miembro del grupo formado por alquilo lineal (C12-C20) o alquenilo lineal (C12-C20) con 1-4 dobles enlaces.

: R_{2} es un miembro formado por hidrógeno, alquilo C1-C4

: Cuando R_{1} y R_{2} son iguales, son miembros del grupo formado por alquilo lineal (C14-C20) o alquenilo lineal (C14-C20) con 1-4 dobles enlaces.

La preparación y obtención de los compuestos recogidos en la presente invención se puede realizar según el esquema de reacción descrito en la Figura 1.

La ruta sintética descrita en la Figura 1 consiste en la reacción de sulfamida II con las correspondientes aminas monosustituidas de estructura III según procedimientos descritos^{xxiii}, si bien se modificaron las condiciones de reacción, para dar los compuestos de estructura I, donde R_{1} tiene la significación antes mencionada y R_{2} es igual a hidrógeno. Mencionar que el compuesto N-dodecilsulfamida ha sido reivindicado como precursor de material fotográfico^{xxiv}.

Los derivados de N-alquilsulfamoilo se prepararon siguiendo el procedimiento de reacción de Atkins y Burgess^{xxv} a partir de las correspondientes aminas de estructura III con el cloruro de N-alquilsulfamoilo IV preparado in situ según el procedimiento descrito por Kloek y Leschinsky^{xxvi}, donde R_{1} y R_{2} tiene la significación antes mencionada.

2

Los expertos en la técnica apreciarán que los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en la forma de una sal o un solvato de los mismos siendo ambos farmacéuticamente aceptables. Las sales fisiológicamente aceptables incluyen sales convencionales formadas a partir de los ácidos o bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables, así como las sales de adición de ácidos de amonio cuaternario.

En un primer uso, la presente invención se refiere a un método para modular el subtipo alfa de receptores activados por el proliferador de peroxisomas poniendo en contacto el receptor con al menos un compuesto de los representados por la Fórmula Estructural I, y sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables. Como se usa en esta memoria descriptiva, un "ligando de PPARalfa" es un compuesto que se une a un PPARalfa humano y a moléculas coactivadoras para dar lugar a procesos de transcripción tal y como se describe más adelante en el ensayo de unión GST.

En un segundo uso, la presente invención se refiere a los métodos y composiciones que contienen los productos representados por la Fórmula Estructural I y sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, que consiguen una disminución del apetito y de la ganancia de la masa corporal cuando son administradas a animales de laboratorio (ej. ratas, ratones, conejos).

Los compuestos de esta invención se pueden preparar mediante la química orgánica habitual tal y como se ilustra mediante los ejemplos operativos acompañantes. Los siguientes ejemplos se exponen para ilustrar la síntesis de algunos compuestos particulares de la presente invención y para ejemplificar los procedimientos generales. De acuerdo con lo anterior, la siguiente sección de ejemplos no tiene la intención de limitar de ningún modo el alcance de la invención contemplada en la presente memoria descriptiva.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos tienen carácter informativo y en ningún caso limitante de las metodologías empleadas, las cuales pueden ser alteradas con el fin de alcanzar unos resultados similares.

En esta memoria descriptiva los símbolos y convenciones usadas en estos procedimientos, esquemas y ejemplos son consistentes con los usados en el Sistema Internacional y la bibliografía científica contemporánea, por ejemplo, el Journal of Medicinal Chemistry. Salvo que se indique otra cosa, todos los materiales de partida se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional. Específicamente, se pueden usar las siguientes abreviaturas en los ejemplos y a lo largo de toda la memoria descriptiva: g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); \mug (microgramos); l o L(litros); ml o mL (mililitros); \mul o \muL (microlitros); mmol (milimoles); mol (moles); P.f. (punto de fusión); EM (espectro de masas); ES+ (pulverización electrónica); Anal. (Análisis Elemental); Rto. Rendimiento; TEA (trietilamina) MeOH (metanol); THF (tetrahidrofurano); EtOH (etanol); CDCl_{3} (cloroformo deuterado); DMSO (dimetilsulfóxido); GST (sulfur-transferasa de glutation); PBS (búfer fosfato salino); TIF2 (factor intermediario de transcripción 2). Salvo que se indique lo contrario, todas las temperaturas se expresan en ºC (grados celsius).

Sulfamidas N-monosustituidas Ejemplo 1 Preparación y obtención de N-(cis-9-octadecenil)sulfamida, también denominada N-oleilsulfamida

A una disolución de 0,20 g de sulfamida (2,1 mmol) en 20 ml de H_{2}O agitándose y a reflujo se le añade gota a gota 0,1 ml (2,1 mmol) de N-oleilamina en 10 ml de EtOH durante 30 min. La mezcla de reacción se agita y refluye durante 6 h. Entonces se evapora el disolvente y el sólido blanco se purifica por cromatografía en columna, utilizando como eluyente CH_{2}Cl_{2}:MeOH/NH_{3} 9,4:0,6. Se obtienen 0,52 g de sólido blanco. Rto.: 72%; P.f.: 68-70ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 347 (100%). Anal.: Calculado (C_{18}H_{38}N_{2}SO_{2}, 346,57): C: 62,38; H: 11,05; N: 8,08; S: 9,25; Hallado: C: 62,38; H: 11,30; N: 8,32; S: 9,01.

Ejemplo 2 Preparación y obtención de N-octadecilsulfamida

Se agitan y refluyen 0,27 g (1,0 mmol) de N-octadecilamina y 0,10 g (1,0 mmol) de sulfamida en 50 ml de THF durante 51 h. Se evapora el disolvente y el crudo se purifica por cromatografía en columna, utilizando como eluyente CH_{2}Cl_{2}: MeOH/NH_{3} 9:1. Se obtienen 0,06 g de sólido blanco. Rto.: 18%; P.f.: 105-107ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 349 (100%). Anal.: Calculado (C_{18}H_{40}N_{2}SO_{2}, 348,64): C: 62,06; H: 11,49; N: 8,09; S: 9,19; Hallado: C: 62,11; H: 11,60; N: 8,01; S: 9,20.

Ejemplo 3 Preparación y obtención de N-hexadecilsulfamida

Se prepara siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1, utilizando como reactivo de partida 0,5 g (2,0 mmol) de N-hexadecilamina y 0,195 g (2,0 mmol) de sulfamida, obteniéndose 0,087 g de sólido blanco. Rto.: 16%; P.f.: 102-104ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 321 (100%). Anal.: Calculado (C_{16}H_{36}N_{2}SO_{2}, 320,53): C: 59,95; H: 11,32; N: 8,74; S: 10,00; Hallado: C: 59,68; H: 11,04; N: 8,65; S: 9,91.

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Ejemplo 4 Preparación y obtención de N-tetradecilsulfamida

Se prepara siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1, utilizando como reactivo de partida 0,43 g (2,0 mmol) de N-tetradecilamina y 0,2 g (2,0 mmol) de sulfamida, obteniéndose 0,37 g de sólido blanco. Rto.: 63%; P.f.: 99-101ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 293 (100%). Anal.: Calculado (C_{14}H_{32}N_{2}SO_{2}, 292,48): C: 57,49; H: 11,03; N: 9,58; S: 10,96; Hallado:C: 57,25; H: 10,97; N: 9,47; S: 11,21.

Sulfamidas N,N'-disustituidas Ejemplo 5 Preparación y obtención de N-(cis-9-octadecenil)-N'-propilsulfamida, también denominada N-oleil-N'-propilsulfamida

Se añaden 0,20 g (1,2 mmol) de cloruro de N-propilsulfamoilo recién destilado a una disolución de 0,28 g de N-oleilamina (1,2 mmol) y 0,36 g de TEA (3,6 mmol) en 30 ml de tolueno seco a 0ºC y atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 40 h. Se filtra el sólido blanco TEA HCl, se evapora el tolueno a vacío y el crudo se purifica por cromatografía en columna, utilizando como eluyente CH_{2}Cl_{2}:MeOH/NH_{3} 9:1. Se obtienen 0,27 g de sólido blanco. Rto.: 58%; P.f.: 82-83ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 389 (100%). Anal.: Calculado (C_{21}H_{44}N_{2}SO_{2}, 388,65): C: 64,86; H: 11,32; N: 7,20; S: 8,23 Hallado: C: 65,06; H: 11,60; N: 7,34; S: 8,33.

Ejemplo 6 Preparación y obtención de N-octadecil-N'-propilsulfamida

Se prepara siguiendo el método descrito para el ejemplo 5, utilizando como reactivo de partida 0,54 g (2,0 mmol) de N-octadecilamina y 0,31 g (2,0 mmol) de cloruro de N-propilsulfamoilo, obteniéndose 0,06 g de sólido blanco. Rto.: 31%; P.f.: 110-112ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 391 (100%). Anal.: Calculado (C_{21}H_{46}N_{2}SO_{2}, 390,67): C: 64,61; H: 11,49; N: 7,17; S: 8,20; Hallado: C: 64,42; H: 12,01; N: 7,17; S: 8,35.

Ejemplo 7 Preparación y obtención de N-hexadecil-N'-propilsulfamida

Se prepara siguiendo el método descrito para el ejemplo 5, utilizando como reactivo de partida 0,15 g (0,6 mmol) de N-hexadecilamina y 0,10 g (0,6 mmol) de cloruro de N-propilsulfamoilo, obteniéndose 0,15 g de sólido blanco. Rto.: 70%; P.f.: 108-110ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 363 (100%). AE: Calculado (C_{19}H_{42}N_{2}SO_{2}, 362,61): C: 62,93; H: 11,67; N: 7,73; S: 8,84; Hallado: C: 62,71; H: 11,90; N: 7,49; S: 9,12.

Ejemplo 8 Preparación y obtención de N-propil-N'-tetradecilsulfamida

Se prepara siguiendo el método descrito para el ejemplo 5, utilizando como reactivo de partida 0,100 g (0,5 mmol) de N-tetradecilamina y 0,076 g (0,5 mmol) de cloruro de N-propilsulfamoilo, obteniéndose 0,092 g de sólido blanco. Rto.: 55%; P.f.: 105-107ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 335 (100%). Anal.: Calculado (C_{17}H_{38}N_{2}SO_{2}, 334,561): C: 61,03; H: 11,45; N: 8,37; S: 9,58; Hallado: C: 60,87; H: 11,68; N: 8,09; S: 9,86.

Ejemplo 9 Preparación y obtención de N,N'-di(9-cis-octadecenil)sulfamida, también denominada N,N'-dioleilsulfamida

Se añaden gota a gota 0,68 ml de N-oleilamina (1,4 mmol) a 0,20 g de N-propilsulfamida (1,4 mmol) en 2 ml de H_{2}O a temperatura ambiente. Se agita y refluye la mezcla de reacción incolora durante 48 h volviéndose naranja. Se evapora el disolvente y el crudo se purifica por cromatografía en columna, utilizando como eluyente CH_{2}Cl_{2}. Se obtuvieron 0,26 g de sólido blanco correspondiente al ejemplo 12 y 0,12 g de sólido blanco del producto correspondiente al ejemplo 5. Rto.: 22%; P.f.: 85-88ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 598 (100%). Anal.:Calculado (C_{21}H_{44}N_{2}SO_{2}, 597,0): C: 72,42; H: 12,16; N: 4,69; S: 5,37; Hallado: C: 72,65; H: 13,41; N: 4,92; S: 4,32.

Ejemplo 10 Preparación y obtención de N-(cis-9-cis-12-octadecadienil)sulfamida

Se prepara siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1, utilizando como reactivo de partida 0,044 g (0,16 mmol) de N-(cis-9-cis-12-octadecadienil)amina y 0,016 g (0,16 mmol) de sulfamida, obteniéndose 0,007 g de sólido blanco. Rto.: 12%; P.f.: 55-57ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 345 (100%). Anal.: Calculado (C_{18}H_{36}N_{2}SO_{2}, 344,55): C: 62,79; H: 10,46; N: 8,14; S: 9,30; Hallado: C: 62,90; H: 10,80; N: 8,03; S: 9,51.

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Ejemplo 11 Preparación y obtención de N-(cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-eicosatetraenil)sulfamida

Se prepara siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1, utilizando como reactivo de partida 0,10 g (0,3 mmol) de N(cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-eicosatetraenil)amina y 0,03 g (0,3 mmol) de sulfamida. Rto.: 14%; P.f.: aceite. EM (ES+): [M+H]^{+} 369 (100%). Anal.: Calculado (C_{20}H_{36}N_{2}SO_{2}, 368,58): C: 65,17; H: 9,84; N: 7,60; S: 8,70; Hallado: C: 64,85; H: 9,75; N: 7,54; S: 8,50.

Ejemplo 12 Preparación y obtención de N-(cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-eicosatetraenil)-N'-propilsulfamida

Se prepara siguiendo el método descrito para el ejemplo 5, utilizando como reactivo de partida 0,35 g (1,2 mmol) de N(cis-5-cis-8-cis-11-cis-14- eicosatetraenil)amina y 0,19 g (1,2 mmol) de cloruro de N-propilsulfamoilo, obteniéndose 0,09 g de aceite amarillo. Rto.: 18%; P.f.: aceite. EM (ES+): [M+H]^{+} 411 (100%). Anal.: Calculado (C_{23}H_{42}N_{2}SO_{2}, 410,66): C: 67,31; H: 10,24; N: 6,82; S: 7,80; Hallado: C: 67,24; H: 10,35; N: 6,88; S: 8,02.

Ejemplo 13 Preparación y obtención de N-(cis-9-cis-12-octadecadienil)-N'-propilsulfamida

Se prepara siguiendo el método descrito para el ejemplo 5, utilizando como reactivo de partida 0,09 g (0,35 mmol) de N-(cis-9-cis-12-octadecadienil)amina y 0,05 g (0,35 mmol) de cloruro de N-propilsulfamoilo, obteniéndose 0,02 g de sólido blanco. Rto.: 17%; P.f.: 70-75ºC. EM (ES+): [M+H]^{+} 387 (100%). Anal.: Calculado (C_{21}H_{42}N_{2}SO_{2}, 386,64): C: 65,28; H: 10,88; N: 7,25; S: 8,29; Hallado: C: 65,30; H: 11,12; N: 7,22; S: 8,40.

Ensayo in vitro de interacción proteína PPARalfa con proteína de fusión TIF2 Y GST (GST-Pull-down Assays)

La precipitación a través de GST (también conocida como GST-pull down) es un método in vitro utilizado para determinar y cuantificar la existencia de interacciones físicas entre proteínas, siendo útil para confirmar en nuestro caso la interacción del factor de transcripción PPAR-\alpha y el coactivador TIF2 inducida por ligando^{xxvii}. A partir de las resinas 4B sefarosa-glutation con GST solo o GST-TIF2_{646-926} al 50% en PBS, se llevó a cabo una centrifugación eliminando el sobrenadante y se añadió a la fase precipitada un tampón de bloqueo para evitar uniones inespecíficas con PBS y albúmina sérica bovina (Aldrich) centrifugando de nuevo. A continuación, se añadió tampón de inmunoprecipitación (al 50%) a la fase precipitada. Se tomó 50 \muL de la resina sefarosa-glutation con GST o GST-TIF2 en tampón de inmunoprecipitación y se añadió: 20 \muL de PPAR-\alpha marcado con ^{35}[S] preincubado con el posible ligando, 8 \muL del mismo ligando en 100% DMSO y 22 \muL de tampón de inmunoprecipitación durante 20 minutos a 30ºC y 40 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, las proteínas marcadas que no resultaron en una fusión con GST-TIF2_{646-926} unidos a resinas sefarosa por glutation fueron lavadas con el tampón de inmunoprecipitación después de centrifugar a máxima velocidad.

Desechado el sobrenadante, la fase precipitada con los complejos marcados unidos a sefarosa se resuspendió con tampón de carga de proteínas (a proporción 1:1 en volumen) y se calentó en agitación unos 95ºC durante 5 minutos, separando la resina sefarosa del complejo GST-TIF2_{646-926} con ^{35}S PPARalfa tras una nueva centrifugación de 5 minutos a máxima velocidad. A continuación, se cargaron las diferentes muestras del sobrenadante en el gel y se realizó una electroforesis SDS-PAGE a 100 V durante 1 hora aproximadamente. Finalmente, se cuantificaron y visualizaron los geles sobre un lector Fuji FLA3000 por fosforescencia usando un software Image Gauge de Fuji.

Transfección celular y ensayo del gen indicador de Luciferasa (RGA)

Células humanas de cáncer de mama MCF-7 fueron cultivadas en placas de 6 pocillos (105 células/mL) y crecidas en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) libre de rojo fenol suplementado con un 5% de suero bovino fetal (FBS) tratado con carbón^{xxviii}.

Los liposomas con plásmidos de ADN fueron obtenidos por incubación de 1 \mug del plásmido indicador con luciferasa y el vector de expresión de PPAR-a humano tipo salvaje con 10 \mug de N-1-(2,3-dioleoiloxi)-propil-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP de Roche Diagnostics) durante 15 minutos a temperatura ambiental en un volumen total de 100 \muL. Después de la dilución con 900 \muL de DMEM libre de rojo fenol, los liposomas fueron añadidos a las células. Después de 4-5 h de la trasnfección a las células, el DMEM libre de rojo fenol suplementado con 500 \muL de FBS tratado con carbón al 15% fue añadido, en este caso con los ligandos (OEA, AEA y derivados sulfamidas) de PPAR-\alpha o solventes controles (DMSO) a diferentes concentraciones de 10-8, 10-7, 10-6 y 10-5 M.

Las células fueron lisadas 16 horas después del comienzo de la estimulación con el tampón de lisis de gen indicador (Roche Diagnostics) y el ensayo del gen indicador o RGA (reporter gene assay) luciferasa, de señal luminosa constante, se llevó a cabo siguiendo las indicaciones del proveedor (Roche Diagnostics). Las actividades de luciferasa fueron normalizadas respecto a la concentración de proteína y los factores de inducción se calcularon como la ratio de actividad luciferasa de las células estimuladas por ligando respecto a los controles solventes^{xxix}.

Estudios de ingesta de comida: tratamiento agudo

Los efectos de los diferentes compuestos sobre la conducta en alimentación fueron analizados en ratas Wistar machos privados de comida durante 24 horas, que fueron habituados a su manipulación^{xxx \ xxxi \ xxxii}. Para este fin, 48 horas antes de cada ensayo las ratas se disponían en jaulas individuales, se retiraba el material de base (arena o serrín), y se situaban pequeños contenedores con comida dentro de las jaulas durante 4 horas. Pasada esta fase inicial, los animales fueron privados de comida durante 24 horas, siempre con acceso libre al agua. Transcurridas las 24 horas de ayuno, se establecieron distintos grupos de tratamiento (N=8-10 cada grupo) administrándose i.p. distintas dosis de la sulfamida correspondiente a cada sesión experimental en su solución vehículo en un volumen de 1 mL/kg, además de un grupo control tratado únicamente con el vehículo:

1): Grupo tratado con dosis 0,03 mg/kg de la sulfamida en solución vehículo.

2): Grupo tratado con dosis 0,3 mg/kg de la sulfamida en vehículo.

3): Grupo con dosis 3 mg/kg de la sulfamida correspondiente en vehículo.

4): Grupo control tratado con el vehículo tween-80 al 5% en suero fisiológico.

A los 15 minutos de la administración se colocaban los contenedores con una cantidad de comida conocida (normalmente 30-40 g) y una botella de agua fresca. Estos contenedores de comida se pesaron a los 30, 60, 120 y 240 minutos después de su presentación, de modo que fue controlada la comida ingerida por cada animal.

Estudios de ingesta de comida: tratamiento crónico

Se llevó a cabo un tratamiento crónico con los compuestos utilizando ratas Wistar machos que fueron habituados a su manipulación.

Para ello, las ratas se dispusieron en jaulas individuales manteniendo el material de base (arena o serrín). Tras una fase de adaptación a las condiciones del estabulario donde se efectuó el ensayo, se establecieron tres grupos distintos (N=8 cada grupo) en función del tratamiento recibido:

1): Grupo tratado con ejemplo 6 en su solución vehículo a dosis 1 mg/kg.

2): Grupo vehículo tratado con tween-80 al 5% en suero fisiológico.

3): Grupo control tratado con suero fisiológico.

La duración total del experimento fue de ocho días, con dos administraciones i.p. (volumen inyectado de 1 mL/kg) diarias de las diferentes soluciones con un intervalo de 12 horas entre ambas inyecciones. Todos los días y previamente a la administración de las 8:00 horas, se pesó a cada animal. Durante el tiempo total del ensayo se controló diariamente el peso individual de cada animal y los parámetros bioquímicos en suero.

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Claims

1. Derivados acíclicos saturados e insaturados de cadena larga de sulfamidas de estructura química I,

3

donde:

: R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o distintos,

: cuando R_{1} y R_{2} son distintos,

: R_{2} es un miembro formado por hidrógeno, alquilo C1-C4

: cuando R_{1} y R_{2} son iguales, son miembros del grupo formado por alquilo lineal (C14-C20) o alquenilo lineal (C14-C20) con 1-4 dobles enlaces,

: con la condición de que cuando R_{1} es n-dodecilo, entonces R_{2} no es hidrógeno, y de que cuando R_{1} y R_{2} son iguales, entonces no son grupos alquilo C18.

2. Derivados acíclicos saturados e insaturados de cadena larga de sulfamidas de estructura química I según la reivindicación 1, de nombre químico:

N-(cis-9-octadecenil)sulfamida también denominado N-oleilsulfamida

N-octadecilsulfamida

N-hexadecilsulfamida

N-tetradecilsulfamida

N-(cis-9-octadecenil)-N'propilsulfamida también denominado N-oleil-N-propilsulfamida

N-octadecil-N'-propilsulfamida

N-hexadecil-N'-propilsulfamida

N-propil-N'-tetradecilsulfamida

N,N'-di(cis-9-octadecenil)sulfamida también denominado N,N'-dioleilsulfamida

N-(cis-9-cis-12-octadecadienil)sulfamida

N-(cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-eicosatetraenil)sulfamida

N-(cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-eicosatetraenil)-N'-propilsulfamida

N-(cis-9-cis-12-octadecadienil)-N'-propilsulfamida

3. Utilización de un derivado acíclico saturado o insaturado de sulfamida de estructura química I

donde:

: R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o distintos,

: cuando R_{1} y R_{2} son distintos,

\newpage

: R_{2} es un miembro formado por hidrógeno, alquilo C1-C4

para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad o afección mediada por el subtipo alfa de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR).

4. Utilización de un derivado acíclico saturado o insaturado de sulfamida de estructura química I, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde:

R_{1} y R_{2}, tienen la significación dada en la reivindicación 1 o 3

para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento, entre otros, de diabetes, obesidad, síndrome metabólico y enfermedades cardiovasculares.

5. Preparado farmacéutico que comprende:

a) como sustancia activa una cantidad efectiva de un derivado acíclico saturado o insaturado de sulfamida de estructura química I, sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde:

R_{1} y R_{2}, tienen la significación dada en la reivindicación 1.

b) uno o mas excipientes farmacéuticamente aceptables.