KR20080035011A

KR20080035011A - 통각 과민증 및 척수의 ｐｇｅ2 방출에 대한 포스포리파제ａ2의 일련의 신규 억제제의 전신 및 경막내 효능

Info

Publication number: KR20080035011A
Application number: KR1020087006261A
Authority: KR
Inventors: 에드워드 데니스; 토니 야크시; 카린 킬러만 루카스; 카밀라 스벤손; 데이비드 에이 식스; 조지 코코토스; 바이올레타 콘스탄티노-코코토
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2005-08-17
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2008-04-22
Also published as: US20080319065A1; CN101291666A; WO2007022443A2; CA2619641A1; AU2006279341A1; WO2007022443A3; BRPI0614992A2; JP2009505990A; EP1937247A2

Abstract

포스포리파제 A₂(PLA₂) 포린은 척수에서 발현되며 이의 억제는 강력한 항통각 과민증을 유도한다. 탄화수소 꼬리부 및 4 탄소 사슬을 갖는 2-옥소아미드로 이루어진 공통 모티프를 포함하는 PLA₂ 억제제 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 IVA군 칼슘 의존성 PLA₂(cPLA₂) 및/또는 VIA군 칼슘 비의존성 PLA₂(iPLA₂) 및/또는 V군 분비형 PLA₂(sPLA₂)를 억제한다.

포스포리파제, 염증, 통각 과민증, 척수, 옥소아미드

Description

통각 과민증 및 척수의 ＰＧＥ2 방출에 대한 포스포리파제 Ａ2의 일련의 신규 억제제의 전신 및 경막내 효능{SYSTEMIC AND INTRATHECAL EFFECTS OF A NOVEL SERIES OF PHOSPHOLIPASE A2 INHIBITORS ON HYPERALGESIA AND SPINAL PGE2 RELEASE}

본 발명은 통각 과민증 및 척수의 ＰＧＥ₂ 방출에 대한 포스포리파제 Ａ₂의 일련의 신규 억제제의 전신 및 경막내 효능에 관한 것이다.

-정부 지원에 관한 진술-

본 발명은 전체적으로 또는 부분적으로 미합중국의 국립 보건원 NIH 연구 보조금 GM 20501 및 GM 0646에 따른 보조금을 지원받아 수행되었다. 미합중국 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 가질 수 있다.

조직 손상 및 염증은 자극 감응성에 분명한 촉진을 진행시켜서 중간 정도의 혐오 자극, 예를 들어, 통각 과민증을 유발시킨다. 이러한 현상은 시클로옥시게나제(COX) 활성을 차단하는 제제에 의해서 경감된다는 것은 이미 알려져 있다(Vane, Nat. New Biol, 231 : 232-235, 1971). 초기 연구는 이러한 작용이 말초 효과로부터 발생한다고 시사하고 있지만(Ferreira, Nat. New Biol, 240:200-203, 1972), 이 후, 척수 COX의 억제를 통해서 촉진된 상태의 반전을 일으킬 수 있다는 것이 확인되었다(Yaksh, 등, "Acetylsalicilic Acid: New Uses for an Old Drug", pp.137-152 (Barnet, 등, editors) Raven Press, 1982; Taiwo and Levine, J. Neuroscl, 8:1346-1349, 1988). 이러한 작용과 일관되게, 조직 손상으로 발생되는 것과 같은, 지속적인 소량의 구심성 입력은 척수로 전달된 COX 억제제로 인해 차단되었던 방식으로 생체 내에서 프로스타노이드의 유의한 척수 방출을 일으키는 것으로 나타났다(Ramwell, 등, Am. J. Physiol, 211 :998- 1004, 1966; Yaksh, 상동, 1982; Malmberg 및 Yaksh, Science, 257:1276-1279, 1992; Malmberg 및 Yaksh, J. Neuroscl, 15:2768-2776, 1995; Ebersberger, 등, 1999, Samad 등, Nature, 410:471-475, 2001, 및 Yaksh, 등, J. Neuroscl, 21 :5847-5853, 2001). COX 매개된 프로스타노이드 형성을 위한 기질인, 아라키돈산을 생성하는 것이 필요하므로, 프로스타글란딘(PG) 합성의 주요 성분은 포스포리파제 A₂(PLA₂)이다.

포스포리파제 A₂(PLA₂)는 막 인지질의 sn-2 위치로부터 지방산 에스테르의 가수분해를 촉매 작용으로 촉진하여, 유리 지방산 및 리소인지질을 생성시키는 효소의 수퍼 패밀리에 포함된다. 세포내 PLA₂ 중에는, 일반적으로 프로염증성 효소로 여겨지는, 시토졸 IVA군 PLA₂(GIVA PLA₂, 여기서는 또한 cPLA₂라고도 함), 칼슘 비의존성 IVA군 PLA₂(GVIA PLA₂, 여기서는 iPLA₂라고도 함) 및 분비형 V군 PLA₂(sPLA₂)가 있다. GVIA PLA₂는 실제로 85 kDa∼88 kDa 범위의 시토졸 효소군이고, 동일 유전 자의 몇몇 상이한 스플라이싱 변형체로 발현되는데, 이들 중 두 종만(VIA-I군 및 VIA-2군 PLA₂)이 촉매적 활성이 있는 것으로 나타났다(Larsson, 등, J. Biol. Chem. 273: 207-214, 1998). 염증 작용에서 GVIA PLA₂의 역할은 궤양이지만, 이 효소는 보고된 바에 의하면 막 항상성(Balsinde, 등, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 02:8527-8531, 1995; Balsinde, 등, J. Biol. Chem., 272: 29317-29321, 1997; Balsinde, 등, J. Biol. Chem., 272:16069-16072, 1997; Ramanadham, 등, J. Biol. Chem., 274:13915- 13927, 1999; Birbes, 등, Eur. J. Biochem., 267:7118-7127, 2000; 및 Ma, 등, Lipids, 36:689-700, 2001.), 인슐린 수용체 신호 전달(Ramanadham, 등, J. Biol. Chem., 274: 13915-13927, 1999; Ma, 등, J. Biol. Chem., 276: 13198-13208, 2001) 및 칼슘 채널 조절(Guo, 등, J Biol. Chem., 277: 32807-32814, 2002; Cummings, 등, Am. J. Physiol. Renal Physiol, 283 : F492-498, 2002) 등을 포함하는 세포 내 기초 대사작용 기능을 위한 주요 PLA₂인 것으로 보인다. GVIA, GIVA 및 GV PLA₂는 모두 중추 신경계 염증 작용에 존재하고 활성적인 역할을 한다(예컨대, 문헌 [Sun, 등, J.Lipid Res., 45 :205-213, 2004] 참조).

GVIA PLA₂ 효소는 모두 부위 지정 돌연변이법으로 검증된, 촉매성 세린을 갖는 공통 리파제 모티프, Gly-Thr-Ser^*-Thr-Gly를 함유한다(Larsson, 등, J. Biol. Chem., 273:207-14, 1998; Tang, 등, J. Biol. Chem., 272: 8567-8575, 2002). 촉매 작용에 핵심적인 다른 잔기는 더 확인해야하며, sn-2 연결을 절단하는 이 효소 에 의한 기전은 확립되지 않았지만, GVIA PLA₂는 IVA군 PLA₂와 유사한 촉매적 Ser/Asp dyad를 갖는 가수 분해 효소인 듯하다(Dessen, 등, Cell 1999, 97: 349-360, 1999; Dessen, Biochim. Biophys. Acta,l488:40-47 , 2000; Phillips, 등, J. Biol. Chem., 278: 41326-41332, 2003). IVA군 칼슘 의존성 PLA₂(IVA군 cPLA₂) 및 VIA군 칼슘 비의존성 iPLA₂ (VIA군 iPLA₂) 및 분비형 II군 및 V군 sPLA₂형에 대한 구성성 mRNA 및 단백질이 척수에서 검출되었다(Lucas, 등, Br. J. Pharmacol, 144:940-952, 2005, Svensson 등, Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol., 42:553-555, 2005).

시험관 내 및 생체 내에서 IVA군 cPLA₂를 억제하는 2-옥소아미드의 일련의 신규 구조물을 발견하였음이 최근 보고되었다(Kokotos, 등, J. Med.Chem., 45:2891-2893, 2002; Kokotos, 등, J. Med.Chem., 47:3615-3628, 2004). 초기 연구에서, 2-옥소아미드는 래트의 카라기난 유도된 발의 부종 분석에서 염증을 억제하는 것으로 관찰되었다(Kokotos, 등, 상동, 2004).

GIVA 및 GVIA PLA₂의 기질 유사성, 공통된 억제제 부류, 촉매성 세린 영역에서 매우 제한된 서열 상동성 및 활성 부위 유사성 등을 기초로 하면, GIVA PLA₂는 GVIA PLA₂와 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 따라서, 생체 내에서 GIVA PLA₂와 GVIA PLA₂를 구별할 수 있는 GIVA PLA₂ 및 GVIA PLA₂에 대한 선택적인 억제제를 설계하는 것은 쉽지 않다. 또한, GV PLA₂에 대한 선택적인 억제제를 설계하는 것도 용이하지 않다.

- 본 발명의 요약 -

본 발명은 IVA군 cPLA₂ 및/또는 VIA군 iPLA₂ 및/또는 sPLA₂에 선택적인 억제제를 포함하는 포스포리파제 A₂(PLA₂)에 대해 강력한 2-옥소아미드 억제제, 및 상기 억제성 화합물의 사용 방법을 제공한다. 상기 화합물은 예컨대 통각 과민증(자극에 대한 과민 반응으로 겪게되는 통증)과 같은 병태를 유발하는 척수 매개된 염증 작용과 원인적으로 관련된 척수 PLA₂ 활성을 억제하는데 특히 유용하다. 본 발명의 억제성 화합물은 각각, 역시 염증에 관여하는 시클로옥시게나제 효소를 배제하고, PLA₂에 특이적으로 작용한다.

본 발명의 PLA₂ 억제제는 PLA₂의 시토졸(cPLA₂) 및/또는 칼슘 비의존성(iPLA₂) 및/또는 분비형(sPLA₂) 이소폼에 대해 높은 정도의 특이성을 나타내는 2-옥소아미드 화합물이다. 본 발명의 대표적인 화합물은 5종의 관련 2-옥소아미드 유사체 AX006, AXOlO, AX048, AX057 및 AXO15(후자는 sPLA₂에 대해 약하게만 억제함)이다. 이들 화합물들에 있어서, cPLA₂ 활성을 억제하는 억제 효능 순위는 AX048 > AX006 > AX057 > AXOlO이고; iPLA₂ 활성을 억제하는 순위는 AX048 > AX057 > AX006 > AX010이다. sPLA₂에 대해, AX048은 cPLA₂ 및 iPLA₂에 대해 나타내는 억제 활성에 견줄만한 억제 활성을 갖는 것으로 증명된 반면, AXO15는 sPLA₂를 억제하지만 다른 두 PLA₂ 이소폼에 대해서 유의할만한 효능이 없었다.

전체적으로, 이들 5종의 화합물에 있어서 sPLA₂ 억제 효능의 범위는 AX057 > AX048 > AX015 > AXOlO(AX006는 sPLA₂에 대해 시험하지 않음)으로 나타났다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 있어서, 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 및 이의 임의 기하 이성질체, 거울상 이성질체, 약학적 또는 면역학적 허용 염 또는 프로드러그를 제공한다

화학식 I에서, R¹은 임의 C₂-C₈ 알콕시 기로서, 여기서 상기 알콕시 기는 선형 또는 분지형이고; R²는 부재하거나, 임의 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이며, 여기서 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄는 임의 치환되고; R³은 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이며; n ≥ 0, m ≥ 0, k ≥ 0(바람직하게 13)이다. 일 구 체예에서, m은 0이고, n은 2이며, R¹은 에톡시이다(예를 들어, AX048). 다른 구체예에서, m은 0이고, n은 3이며, R¹은 t-부톡시이다(예를 들어, AX057). 다른 구체예에서, m은 2이고, n은 4이며, R¹은 에톡시이다(예를 들어. AX065). 또 다른 구체예에서, m은 0이고, n은 4이며, R¹은 t-부톡시이다(예를 들어, AX105). sPLA₂에 대해 약 95∼100% 억제 효능을 갖는 구체예에 있어서, m은 0이고, n은 1이며, R¹은 t-부톡시(예를 들어, AX113)이거나, m은 0이고, n은 0이고, R¹은 에톡시(AX114)이거나, 또는 m은 0이고, n은 1이며, R¹은 t- 부톡시(예를 들어, AX111)이다.

본 발명의 다른 측면에서, 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물, 및 이의 임의 기하 이성질체, 거울상 이성질체, 약학적 또는 면역학적 허용 염 또는 프로드러그를 제공한다.

화학식 Ia에서, R¹은 임의 C₁-C₈ 알콕시 기로서, 여기서 상기 알콕시 기는 선형 또는 분지형이고; R²는 부재하거나, 임의 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클 릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이며, 여기서, 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄는 임의 치환되고; R³은 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이고; m ≥ 0, k ≥ 0이다. 일 구체예에서, R¹는 메톡시이고, R²는 메틸이며, m는 2이다. 다른 구체예에서, R¹은 C₂-C₄ 알콕시이고, R²는 메틸이며, m은 2이다. 또 다른 구체예에서, R¹은 에톡시이고, R²는 부재하고, m은 2이다(e.g., AX093).

본 발명의 다른 측면에서, 화학식 II로 표시되는 화합물, 및 이의 모든 기하 이성질체, 거울상 이성질체, 약학적 또는 면역학적 허용 염 또는 프로드러그를 제공한다.

화학식 II에서, R은 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 C₂-C₈ 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이고; R³은 임의로 임의 치환된 방향족, 헤테로시클릭, 또는 카르보시클릭 기 또는 임의 치환된 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이고; k ≥ 0이다. sPLA₂에 대한 특이성을 갖는 구체예에서, R이 t-부톡시이고 k가 7(예를 들어, AX055)이고, sPLA₂에 대해 우선적인(비록 약하긴 하지만) 활성을 갖는 구체예에서, R은 NH₂이다(예를 들어, AXO15).

본 발명의 다른 측면에 따르면, 화학식 I, Ia 또는 II의 임의 화합물과 약학적 허용 담체를 배합하여 약학 조성물을 제공한다. 또한, 이하의 부가적인 약학 조성물을 제공한다.

예를 들어, 하기 화학식 III의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

다른 예로서, 하기 화학식 IV의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

다른 예로서, 하기 화학식 V의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세 포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 예로서, 하기 화학식 VI의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 IVA군 및 VIA군 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

다른 예로서, 하기 화학식 VII의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 IVA군 및 VIA군 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가 측면에 있어서, 본 발명의 하나 이상의 화합물의 IVA군 및 VIA군 포스포리파제 A₂에 대한 억제 유효량, 및/또는 V군 포스포리파제 A₂에 대한 억제 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 염증 작용의 효과를 조절하기 위한 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 조절되는 염증 작용의 효과 중 하나는 중추 신경계 염증이다. 다른 구체예에서, 조절되는 염증 작용은 척수 매개된다. 추가 구체예에서, 척수 매개되는, 조절되는 염증 작용 중 하나는 통각 과민증일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 투여되는 포스포리파제 A₂ 억제제는 sPLA₂에 특이적이거나(즉, cPLA₂ 또는 iPLA₂에 통계적 효능이 없음), 또는 sPLA₂ 및 iPLA₂에 특이적이다(즉, cPLA₂에 대한 통계적 효능이 없음).

도 1은 본 발명의 AX 화합물의 합성 순서를 나타내는 반응도이다.

도 1A는 화합물 AX048 및 AX057의 구조를 도시한 도면이다.

도 1B는 화합물 AX035 내지 AX041, AX073 및 AX074의 구조를 도시한 도면이다.

도 1C는 (A) AX010(우측 막대) 및 AX073(진한 막대)의 시간 의존적인 결합, (b) 억제의 가역성(대조군 = 억제제 없음)을 도시한 그래프이다. ID. AXOl0(●), AX041(○) 및 AX073(▼)에 의한 PLA₂ 억제의 용량 반응 곡선.

도 2는 IVA군 cPLA₂에 대한 AX006(원형 ○), AXOlO(사각형 ■), AX048(정삼각형 ▲), AX057(역삼각형 ▼)의 시험관 내 용량 반응적 억제 곡선을 나타내는 그 래프이다. 곡선은 로그 함수로 맞춘 것이다.

도 3은 IVI군 iPLA₂에 대한 AXOlO(사각형 ■), AX048(정삼각형 ▲), AX057(역삼각형 ▼)의 시험관 내 용량 반응적 억제 곡선을 나타내는 그래프이다. 곡선은 로그 함수로 맞춘 것이다.

도 4는 억제율(%)로서 나타낸 시험관 내 시클로옥시게나제 활성에 대한 본 발명의 화합물의 효능을 나타내는 그래프이다. 그래프에는 대조군에 대한 약물 처리 시료의 평균±SD로 나타내었다. 표시한 바와 같이, 사용된 용량에서 인도메타신(Indo, 50 uM)은 시클로옥시게나제 활성을 억제하는 작용을 하였지만, AX006(50 uM), AXOlO(50 uM), AX048(50 uM) 또는 AX057(50 uM)은 그렇지 않았다.

도 5는 카라기난의 뒷발 단측 주입을 통해 유발시킨 열 통각 과민증에 대한 AX006, AXOlO, AX048 및 AX057(3 ㎎/㎏, IP)의 효능을 도시한 그래프이다. 약물 또는 운반체는 카라기난의 족저내 투여전 30분경에 전달하였고, 열일탈 잠복기(thermal escape latency)를 주입 직전 및 주입 후 최대 180분 동안 일정 간격으로 측정하였다. 각 그래프 세트는 약물 및 운반체 처리 동물의 손상된 발(Inj) 및 손상되지 않은 발(Uninj)에 대해 시간 경과에 따른 반응 잠복기의 평균±SEM(초)으로 나타내었다. 대조 처리군에서, 카라기난 처리 발은 베이스라인으로부터 잠복기가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(1 way ANOVA). 이러한 감소는 AX048에 의해 방지되었다. 내부 막대 그래프는 시험 간격(90분∼180분) 동안 미손상 및 손상된 발 사이의 반응 잠복기에 대한 평균 군 누적 편차를 나타낸다. 표시한 바와 같이, 통각 과민증의 측정치는 AX049에 의해 유의하게 감소하였다(단측 t 검정법).

도 6은 카라기난의 단측 뒷발 주입으로 유발된 열 통각 과민증에 대한 AX048의 항통각 과민증 효능에 대한 용량 반응 곡선을 도시한 그래프이다. 각 지점은 손상 및 미손상 발 사이의 반응 잠복기에 있어서 총 편차의 평균 및 SEM(N=5)으로 나타낸 것이다. 수평 직선 및 점선은 운반체 처리한 대조군 동물의 평균±SEM을 나타낸다. 이 실험은 도 4에 기술한 바와 같이 수행하였다. 그래프는 용량 함수에 따라서 시험 간격(90분∼180분) 동안 미손상 및 손상된 발 사이의 반응 잠복기에 대한 군 누적 편차의 평균±SEM으로 나타내었다. 수평 직선 및 점선은 카라기난 주입 후 운반체 처리한 래트에서 관찰된 열 통각 과민증의 평균±SEM을 나타낸다. AX048의 ED₅₀ 용량은 열 일탈 잠복기의 50% 감소를 나타낸다.

도 7은 카라기난으로 유발시킨 열통각 과민증에 대한 AX048(3 ㎎/㎏, IP)의 항통각 과민증 효능에 대한 사전처리 간격의 효과를 도시한 그래프이다. 족저내 카라기난 전달 전 15, 30, 180 또는 360분에 약물을 전달하고 카라기난 주입 직전 및 주입 후 최대 3시간 동안의 간격에서 열 일탈을 측정하였다. 결과는 손상 및 미손상 발사이의 잠복기 누적 편차로서 나타내었다. 최대 효능은 30분경에 관찰되었고 3시간 동안 지속되었다. 1 way ANOVA(p=0.0006) 이후 본페로니의 다중비교 사후 검정(post hoc Bonferroni's Multiple Comparison Test)(n=4∼12 /처리군)을 수행하였다. ** 대조군에 대한 비교로 p < 0.05이다.

도 8은 카라기난의 뒷발 단측 주입으로 유발시킨 열 통각 과민증에 대한 AX006, AXOlO, AX048 및 AX057(IT 30 ㎍/10 ㎕)의 효능을 도시한 그래프이다. 카라기난의 족저내 주입전 15분에 약물 또는 운반체를 전달하고 열 일탈을 주입 직전 및 주입 후 최대 180분 동안의 간격에서 측정하였다. 각 그래프 세트는 약물 및 운반체 처리 동물의 손상된 발(Inj) 및 미손상된 발(Uninj)에 대한 시간 경과에 따른 반응 잠복기의 평균±SEM(초)으로 나타내었다. 표시한 바와 같이, 대조 처리군에서, 카라기난 발은 베이스라인으로부터 잠복기가 감소되는 것으로 나타났다(1 way ANOVA). 이러한 감소는 AX048에 의해 방지되었다. 내부 막대 그래프는 시험 간격 동안(90분∼180분) 미손상된 발과 손상된 발 사이의 반응 잠복기에서 평균 군 누적 편차를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 통각 과민증 측정치는 AX048에 의해 유의하게 감소되었다(단측 t 검정법).

도 9는 경막내 SP 유발된 열 통각 과민증에 대한 AX006, AXOlO, AX048 및 AX057(3 ㎎/㎏, IP)의 효능을 도시한 그래프이다. 기질 P(IT-SP: 30 nmol)의 경막내 전달 전 30분에 약물 또는 운반체를 전달하고 열 일탈을 IP SP 직전 및 이후 최대 60분 동안의 간격에서 측정하였다. 결과는 시간 경과에 따른 반응 잠복기(초)로서 나타내었다. 표시한 바와 같이, 1 way ANOVA에 의하면, AX048에 비해 운반체에서 유의한 열 통각 과민증의 반전을 보여준다.

도 10은 운반체, AX006, AXOlO, AX048 및 AX057(3 ㎎/㎏, IP)를 IP 주입하고 20분 이후 기질 P를 경막내 주입(IT- SP: 20 nmol)시키고 척수 투석 카테터를 이용하여 준비한 마취하지 않은 래트의 반응을 도시한 그래프이다. (상단) PGE₂ 방출의 시간 추이는 IP 운반체 또는 IP AX048(3 ㎎/㎏)로 사전처리한 동물에 IT SP한 후 45분간 연속 15분 간격으로 시료를 추출하여 측정하였다. IT SP는 운반체 IP 이후 시간 의존적으로 방출 증가를 유발하였지만 IP AX048 이후에는 그렇지 않았다(* p < 05). (하단) 운반체, AX006, AXOlO, AX048 또는 AX057을 주입받은 래트에서 0∼45분 간 PGE₂ 방출에 대한 시간 효과 곡선하의 면적이다. 표시한 바와 같이, IP AX006, AXOlO 또는 AX057 이후, IT SP는 운반체 단독 주입과 비교하여 유의한 증가를 유발하였다(Kruskall Wallace p <0.008. * p<0.05; ** p<0.01, 운반체에 대한 Dunns 다중 비교(Multiple Comparison versus vehicle)(VEH)). 대조적으로, IP AX048 이후에는 운반체 단독 IP와 비교하여 방출 사이에 편차가 없었다(p>0.05).

2003년 3월 7일 출원되고, 함께 계류중인, 공동 소유의 미국 실용 특허 출원 제10/506,059호의 내용을 본 발명에서 참조하여 포함시킨다. 본 발명을 이하에서 더욱 구체적으로 설명한다.

본 명세서에서 인용하는 모든 특허 및 기타 참조 문헌은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타내고, 각 참조 문헌이 개별적으로 전체에 참조하여 포함시킨 것과 동일한 정도로, 임의 표 및 도면을 포함하여 이들 전체를 참조하여 본 발명에 포함시킨다.

당분야의 당업자는 본 발명에 내재된 내용을 비롯하여, 언급된 목적 및 장점을 획득하는데 본 발명이 매우 적합하다는 것을 용이하게 알 수 있을 것이다. 목하 대표적인 바람직한 구체예로서 본 발명에서 기술한 방법, 변형법 및 조성물은 대표적인 일례이며 본 발명의 범주를 이에 한정하려는 목적이 아니다. 당분야의 당업자는 본 발명의 청구항에서 한정한 본 발명의 범주 내에서 본 발명의 변형 및 다른 용도가 포함된다는 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명에서 제공하는 정의는 달리 언급하지 않으면 당분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 의미 이외로 제한하려는 것이 아니다.

A. 본 발명의 화합물 구조의 개요

본 발명의 화합물은 탄화수소 꼬리부 및 4 탄화 사슬을 갖는 2-옥소아미드를 기초로 구축되었다. 이들 제제의 작용성에서 중요한 고려 사항은 6∼8 범위로 높은 이들의 cLog P 값이다. 일반적으로 5 보다 큰 log P 값을 갖는 제제들은 "약물성(druggable)"이 없는 것으로 여겨진다(Lipinski 등., Adv. Drug Deliv. Rev., 46:3-26, 2001). 주목할 점은 본 시스템에서, 약물 작용의 표적은 시토졸 내에 있다는 점이다. 이는 분자가 세포막을 용이하게 가로질러서 PLA₂와 상호 작용할 수 있도록 지용성 분자일 것을 요구한다.

이들 제제가 나타내는 시험관 내 및 생체 내 활성은 이들 분자가 직면한 분포에 대한 복잡한 문제에 따라 좌우될 수 있고; 구체적으로 AX048은 프로드러그로서 작용할 수 있다.

카르복시기는 cPLA₂를 억제하기 위해 필수적인 것으로 보이는데, 이는 아마도 인지질 천연 기질의 포스페이트 헤드기의 모방체로서 작용하는 듯하다. 주목할 것은, 잘리기 쉬운 sn-2 에스테르 결합과 포스페이트 헤드기 사이의 인지질 천연 기질의 공간배치가 γ-아미노 부티르산계 2-옥소아미드 또는 γ-노르루신계 2-옥소아미드와 유사하다. 따라서, 본 발명의 2-옥소아미드 억제제의 카르복시기는 cPLA₂의 활성 부위 내 일부 특이성과 상호 작용할 수 있다. 비록, sPLA₂에 세린 친핵체가 없지만, sPLA₂에 대해 활성을 갖는 본 발명의 2-옥소아미드 PLA₂ 억제제와 인지질 기질의 유사성은 아마도 이들 억제제가 sPLA₂ 활성 부위에 결합할 수 있게 할 것이다. 따라서, R₂ 위치의 유리 카르복시기는 본 발명에서 필수적인 것으로 추정된다. 또한, 다른 이소폼을 배제하고, sPLA₂에 대해 화합물 AXO15의 특이성(비록 약한 억제 활성이지만)이 부여된다면, 분자 내 1차 아민의 존재와 낮은 소수성은 이의 활성에서 중요한 역할을 할 것이고, 따라서 sPLA₂ 억제제의 바람직한 특성이 될 것이다.

B. PLA ₂ 억제의 다중 효능

치료적으로, 전신 생체 이용성 PLA₂-선택적 제제의 개발을 보여주는 본 발명의 연구는 동통 이외의 다른 치료 표적과 관련성이 있을 수 있다. 따라서, 다양한 신경염증 작용도 중추 신경계의 PLA₂ 이소폼의 활성화를 통해 매개할 수 있다.

설명하면, 말초 염증 및 조직 손상이 일어나면, 통각 수용성 자극의 과도한 작용화가 뒤이어 계속되고 이러한 촉진은 척수 수준에서 증가된 통각 수용성 작용화를 유발하는 하류 캐스캐이드의 부분적인 구심성-유발 개시를 초래한다는 것은 분명하다. 현재의 증거들은 상기 캐스캐이드의 주요 성분이 척수 방출된 프로스타노이드의 작용과 관련되어 있음을 시사한다. 이러한 이론은 프로스타글란딘의 척수 전달이 통각 과민증을 유도하게 되고 이 리피드산이 조직 손상 이후에 척수의 세포외 공간으로 방출된다는 관찰 결과에 의해 대부분 뒷받침된다. 또한, COX 억제제의 척수 전달은 SP 및/또는 글루타메이트 등과 같은 구심성 소 신경전달 물질의 IT 주입에 의한 이들 회로의 직접 활성화에 의해 또는 말초 손상에 의해 유도되는 촉진 상태뿐만 아니라 프로스타글란딘의 방출을 저하시킨다(문헌 [Svensson 및 Yaksh, 상동, 2002] 참조). 이 캐스캐이드는 시클로옥시게나제에 의해 매개되는 연결부에 선행하는 상류 연결부 추적에 대한 관련성; 그에 따라서, 척수 iPLA₂; cPLA₂ 및 sPLA₂에 대한 관심을 주장하기에 충분하다.

또한, PLA₂ 활성의 다른 산물이 통각 수용성 작용에 중요하다는 실질적인 증거가 존재하는데, 그 증거는 다음과 같다: i) PLA₂에 의해 생성된 아라키돈산이 NMDA 이온 운반체(ionophore) 기능을 직접적으로 증가시킬 수 있다(Richards, 등, Eur.J.Neurosci, 17:2323- 2328, 2003). NMDA 수용체는 척수 수준에서 전후 시냅시스 촉진에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(L'Hirondel, 등, Eur.J.Neurosci., 11: 1292-1300, 1999; Richards, 등, 상동, 2003). ii) PLA₂의 작용으로 형성된 아라키돈산은 또한 이소프로스탄의 시클로옥시게나제 비의존적 합성에 필요한 필수 기질을 제공한다. 척수 이소프로스탄을 이용한 연구에 따르면 이들은 촉진된 전달물질 방출 및 신경성 방출을 개시하고, 이들의 척수 전달로 인하여 통각 과민증이 유발되는 것으로 나타났다(Evans, 등, J.Pharmacol.Exp.Ther., 293:912-920, 2000). iii) 혈소판-활성화 인자(PAF)인, 알킬-인지질이 PLA₂에 의한 막 지질 가수분해로 생성된다. PAF는 척수 전달 이후 현저한 이질 통증을 일으킨다(Morita, 등, Pain, 111 :351-359, 2004). 이 지질 매개 인자는 척수에 존재하고 자극된 소교 세포에서 방출되는 것으로 보고되었다(Jaranowska, 등, Mol.Chem.Neuropathol., 24:95-106, 1995). 이들 제제는 프로스타노이드와 유사한 생리적 프로파일을 갖는다. iv) PLA₂는 리소포스페이트의 형성을 야기하게 된다. 이들 생성물은 또한 최근 동통 작용의 촉진 상태에 관여한다는 것이 보고되었다(Inoue, 등, Nat. Med., 10:712-718, 2004; Seung Lee, 등, Brain Res., 1035:100-104, 2005). 간략하게, 상기 성분들이 주어짐으로써, 척수 통각 수용성 작용에 대한 보다 두드러진 효능은 PLA₂에 의해 나타나는 것과 같이 COX에 연결된 상류 연결부를 차단하여 일으킬 수 있다는 가설을 세우는 것이 타당하게 되었다.

PLA₂의 억제는 중추적으로-(IT-SP) 그리고 말초적으로-(족저 카라기난) 개시된 통각 과민증에 상당한 효능이 있다. 본 발명의 화합물은 IVA군 cPLA₂ 및/또는 VIA군 iPLA₂ 및/또는 V군 sPLA₂를 가역적으로 차단하는 이러한 억제성을 가지는데, 척수 및 전신 전달 이후에 그와 같이 억제된다. 예를 들어, AXOlO는 약한 효능을 나타내고, AX006는 IVA군 PLA₂에 대해 우선적인 반면, AX048 및 AX057는 IVA군 cPLA₂ 및 VIA군 iPLA₂에 대해 우선적이고, AXO15는 sPLA₂에 대해 우선적이다(비록 약한 억제 활성을 갖지만).

또한, 전신 투여된 본 발명의 화합물은 임의 말초 손상 부재하에서 IT-SP에 의해 유발된 통각 과민증을 차단시킨다. 이는 전신 전달된 화합물의 항통각 과민증 활성이 중추 작용에 의해 매개된다는 것을 시사한다.

C. 본 발명의 PLA ₂ 억제제의 합성 및 구조

본 발명의 화합물은 억제제가 2 성분: (a) 활성 부위 세린 잔기와 반응할 수 있는 친전자성 기, 및 (b) 효소의 기질 결합 클레프트에서 적절한 배향성 및 특이적 상호 작용성 둘 모두에 필요한 화학적 모티프를 함유하는 친지성 부분으로 구성되어야 하는 원리를 기초로 하여 구조적으로 설계하였다(Kokotos, J. MoI. Catal. B-Enzym. 2003, 22:255-269). 이 전략은 친지성 2-옥소아미드(Chiou, 등, Lipids 2001, 36:535-542; Chiou, 등, Org. Lett. 2000, 2:347-350), 2-옥소아미드 및 비스-2-옥소아미드 트리아실글리세롤 유사체(Kotsovolou, 등, J. Org. Chem. 2001, 66:962-967; Kokotos, 등, Chemistry-A European Journal 2000, 6:4211-4217)를 비롯하여, 친지성 알데히드(Kotsovokm, 등, Org. Lett. 2002, 4:2625-2628) 및 췌장 및 위 리파제에 유효한 억제제인 트리플루오로메틸 케톤(Kokotos, 등, ChemBioChem 2003, 4: 90-95)의 개발에 성공적으로 적용되었다.

따라서, 본 발명은 GIVA PLA₂를 억제하는 신규한 부류의 2-옥소아미드를 제공한다(Kokotos, 등, J. Med. Chem. 2002, 45:2891-2893; Kokotos, 등, J. Med. Chem. 2004, 47:3615-3628). 이 측면에 있어서, GVIA PLA₂가 친핵성 잔기로서 세린을 사용한다는 것이 확인되었다(Tang, 등, J. Biol. Chem., 272:8567-8575, 1997). 본 발명의 2-옥소아미드는 하기 화학식 1로 표시되는 일반 구조를 공유한다.

[화학식 1]

올레산 또는 페닐 기를 기초로 하는 2-옥소아실 잔기 및 카르복시메틸 에스테르 기 또는 유리 카르복실기를 함유하는 2-옥소아미드 억제제의 합성 반응을 도 1에 도시하였다. 또한, 동일한 합성 반응도에 γ-아미노-α,β-불포화 산을 기초로 하는 억제제의 합성 반응을 나타내었다.

이러한 실험을 위해서, AX006 및 AXOlO는 이전에 기술된 바에 따라 제조하였다(Kokotos, 등, 상동, 2002; Kokotos 등, 상동, 2004). 제제 AX048 및 AX057의 합성 및 특징은 본 발명의 화합물의 대표적인 합성 반응으로서 기술하며, 도 1에 합성 반응을 요약하였고, 이하 더욱 구체적으로 설명한다.

1. 4-아미노- 부타노에이트의 에스테르와 2-히드록시- 헥사데칸산의 커플링

CH₂Cl₂(20 ㎖) 중 2-히드록시-헥사데칸산(2.0 mmol) 및 4-아미노-부타노에이트의 에스테르(2.0 mmol)의 교반 용액에, Et₃N(6.2 ㎖, 4.4 mmol) 및 이후 WSCI(0.42 g, 2.2 mmol) 및 HOBt(0.32 g, 2.0 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반하고 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발시키고 EtOAc(20 ㎖)를 부가하였다. 유기층을 연속적으로 염수, 1 N HCl, 염수, 5% NaHCO₃, 및 염수로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조하였으며 감압하에서 증발시켰다. 용리액으로서 CHCl₃-MeOH(95:5)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하였다.

에틸 4-[(2- 히드록시헥사데카노일 )아미노] 부타노에이트

수율 72%; ¹H NMR: δ 6.68 (1H, t, J = 7 Hz, NH), 4.13 (3H, m, CH, COOCH₂CH₃), 3.34 (2H, m, CH₂NH), 2.68 (1H, b, OH), 2.32 (2H, t, J = 7 Hz, CH₂COO), 1.80-1.58 (4H, m, CH₂CH₂COO, CH₂CH), 1.45-1.23 (27H, m, 12×CH₂, COOCH₂CH₃), 0.85 (3H, t, J = 7 Hz, CH₃); ¹³C NMR: δ 174.0, 173.8, 72.2, 60.6, 38.5, 34.9, 31.9, 31.7, 31.4, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 25.0, 24.6, 22.7, 14.1. Anal. calcd. for C₂₂H₄₃NO₄ (385.58): C, 68.53; H, 11.24; N, 3.63. Found: C, 68.12; H, 11.32; N, 3.48.

tert -부틸 4-[(2- 히드록시헥사데카노일 )아미노] 부타노에이트

수율 64%; ¹H NMR: δ 6.49 (1H, t, J= 7 Hz, NH), 4.12 (1H, m, CH), 3.34 (2H, m, CH ₂NH), 2.73 (1H, b, OH), 2.27 (2H, t, J= 7 Hz, CH ₂COO), 1.82-1.49 (4Η, m, CH ₂CH₂COO, CH ₂CH), 1.45 [9H, s, C(CH₃)₃], 1.38-1.15 (24H, m, 12×CH₂), 0.89 (3H, t, J= 7 Hz, CH₃); ¹³C NMR: δ 173.9, 173.7, 80.1, 72.3, 38.3, 35.4, 31.9, 31.8, 31.4, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 28.7, 25.1, 24.5, 22.8, 14.1. Anal. calcd. for C₂₄H₄₇NO₄ (413.63): C, 69.69; H, 11.45; N, 3.39. Found: C, 69.42; H, 11.61; N, 3.27.

2. 2-히드록시-아미드의 산화

톨루엔-EtOAc(15 ㎖)의 혼합물 중 2-히드록시-아미드(1.00 mmol)의 용액에, 수(1.3 ㎖)중 NaBr(0.11 g, 1.05 mmol)의 용액을 첨가하고, 이어서 AcNH-TEMPO(2 ㎎, 0.01 mmol)를 첨가하였다. -5℃로 냉각시킨, 최종 2상 시스템에, NaHCO₃(0.25 g, 3 mmol)를 함유하는 0.35 M NaOCl(3.1 ㎖, 1.10 mmol)의 수성 용액을 1시간의 기간 동안 -5℃에서 강하게 교반하면서 점적하였다. 0℃에서 추가 15분간 혼합물을 교반시킨 후, EtOAc(15 ㎖) 및 H₂O(5 ㎖)를 부가하였다. 수층을 분리하고 EtOAc(10 ㎖)로 세정하였다. 배합된 유기층을 연속적으로 KI(0.04 g) 함유한 5% 수성 시트르산(15 ㎖), 10% 수성 Na₂S₂O₃(6 ㎖), 및 염수로 세정하고 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에서 증발시키고, 컬럼 크로마토그래프[EtOAc-석유 에테르 1:9 (bp 40∼60℃)]를 통해 잔류물을 정제하였다.

에틸 4-[(2- 옥소헥사데카노일 )아미노] 부타노에이트(AX048)

수율 86%; 백색 고체; m.p. 63∼64℃; ¹H NMR: δ 7.16 (1H, m, NH), 4.12 (2H, q, J= 7 Hz, COOCH ₂CH₃), 3.33 (2H, m, CH ₂NH), 2.89 (2H, t, J= 7 Hz, CH₂COCO), 2.34 (2H, t, J= 7 Hz, CH₂COO), 1.87 (2H, m, CH ₂CH₂COO), 1.57 (2H, m, CH ₂CH₂COCO), 1.40-1.15 (25H, m, 11×CH₂, COOCH₂ CH ₃ ), 0.85 (3Η, t, J= 7 Hz, CH₃); ¹³C NMR: δ 199.0, 172.7, 160.2, 60.4, 38.5, 36.5, 31.7, 31.4, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 28.9, 24.2, 23.0, 22.5, 14.0, 13.9; MS (FAB) m/z (%) 384 (100) [M⁺+H]. Anal. calcd. for C₂₂H₄₁NO₄ (383.57): C, 68.89; H, 10.77; N, 3.65. Found: C, 68.71; H, 10.88; N, 3.54.

tert -부틸 4-[(2- 옥소헥사데카노일 )아미노] 부타노에이트(AX057)

수율 95%; 백색 고체; m.p. 61∼62℃; ¹H NMR: δ 7.11 (1H, m, NH), 3.33 (2H, m, CH ₂NH), 2.91 (2H, t, J = 7 Hz, CH₂CO), 2.28 (2H, t, J= 7 Hz, CH₂COO), 1.84 (2H, m, CH ₂CH₂COO), 1.60 (2H, m, CH ₂CH₂COCO), 1.45 [9H, s, C(CH₃)₃], 1.38-1.23 (22H, m, 11×CH₂), 0.89 (3H, t, J= 7 Hz, CH₃); ¹³C NMR: δ 198.6, 171.6, 159.7, 80.0, 38.1, 36.1, 32.2, 31.3, 29.0, 28.9, 28.8, 28.7, 28.4, 27.4, 23.8, 22.5, 22.0, 13.5; MS (FAB) m/z (%) 412 (17) [M⁺+H], 356 (100). Anal. calcd. for C₂₄H₄₅NO₄ (411.62): C, 70.03; H, 11.02; N, 3.40. Found: C, 69.89; H, 11.32; N, 3.47.

3. 2- 옥소아미드 억제제의 합성

a. 2-히드록시-산과 아미노 성분의 커플링

CH₂Cl₂(20 ㎖) 중의 2-히드록시-산(2.0 mmol) 및 히드로클로라이드 메틸 γ-아미노부티레이트(2.0 mmol)의 교반 용액에, Et₃N(6.2 ㎖, 4.4 mmol) 및, 이후 l-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드(WSCI)(0.42 g, 2.2 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)(0.32 g, 2.0 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반하고 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에서 증발시키고 EtOAc(20 ㎖)를 부가하였다. 유기층은 연속적으로 염수, 1 N HCl, 염수, 5% NaHCO₃, 및 염수로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰으며, 감압하에서 증발시켰다. 용리액으로 CHCl₃을 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 통해 잔류물을 정제하였다.

4-(2-히드록시-5- 페닐 - 펜타노일아미노 )-부티르산 메틸 에스테르(2a)

수율 82%; 백색 고체; m.p. 34∼35℃; ¹H NMR: δ 7.24-7.11 (5H, m, C₆H₅), 6.82 (1H, m, NHCO), 4.06 (1H, m, CH), 3.62 (3H, s, CH₃O), 3.53 (1H, d, J= 5.2 Hz, OH), 3.26 (2H, m, CH ₂NH), 2.59 (2H, t, J= 7.8 Hz, CH ₂C₆H₅), 2.30 (2H, t, J= 6.8 Hz, CH₂COO), 1.82-1.70 (6H, m, 3×CH₂); ¹³C NMR: δ 174.2, 173.8 142.0, 128.3, 128.2, 125.7, 71.7, 51.7, 38.3, 35.5, 34.3, 31.3, 26.8, 24.6.

4-(2-히드록시-6- 페닐 - 헥사노일아미노 )-부티르산 메틸 에스테르(2b)

수율 85%; 백색 고체; m.p. 50∼51℃; ¹H NMR: δ 7.31-7.15 (5H, m, C₆H₅), 6.76 (1H, m, NHCO), 4.08 (1H, m, CH), 3.68 (3H, s, CH₃O), 3.32 (2H5 m, CH ₂NH), 3.10 (1H, d, J= 4.8 Hz, OH), 2.62 (2H, t, J= 7.8 Hz, CH ₂C₆H₅), 2.36 (2H, t, J= 7.4 Hz, CH₂COO), 1.91-1.49 (8H, m, 4×CH₂); ¹³C NMR: δ 174.0, 142.3, 128.3, 128.2, 125.7, 72.0, 51.7, 38.4, 35.7, 34.7, 31.4, 31.1, 24.6.

4-(2-히드록시- 노나덱 - lO - 에노일아미노 )-부티르산 메틸 에스테르(2c)

수율 82%; 백색 고체; m.p. 55∼57℃; ¹H NMR: δ 6.80 (1H, m, NHCO), 5.33 (2H, m, CH=CH), 4.07 (1H, m, CH), 3.67 (3H, s, CH₃O), 3.30 (2H, m, CH ₂NH), 2.37 (2H, t, J= 7.2 Hz, CH₂COO), 1.98 (4H, m, 2×CH ₂CH=CH), 1.85 (2H, m, CH ₂CH₂NH), 1.26 (24H, br s, 12×CH₂), 0.87 (3H, t, J= 6.6 Hz, CH₃); ¹³C NMR: δ 174.2, 173.8, 129.9, 129.7, 72.1, 51.7, 38.4, 34.8, 31.8, 31.3, 29.7, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 27.2, 25.0, 24.6, 22.6, 14.1.

b. 메틸 에스테르기를 함유하는 2-히드록시-아미드의 산화(방법 A)

톨루엔-EtOAc 1:1의 혼합물(30 ㎖) 중 2-히드록시-아미드(5.00 mmol)의 용액에, 수(2.5 ㎖) 중 NaBr(0.54 g, 5.25 mmol)의 용액을 부가하고 이어서 TEMPO(11 ㎎, 0.050 mmol)를 부가하였다. -5℃로 냉각시킨, 최종 2상 시스템에, NaHCO₃(1.26 g, 15 mmol)을 함유하는 0.35 M NaOCl(15.7 ㎖, 5.50 mmol)의 수성 용액을 1시간의 기간 동안 -5℃에서 강한 교반하에서 점적하였다. 이 혼합물을 0℃에서 추가 15분간 교반시킨 후, EtOAc(30 ㎖) 및 H₂O(10 ㎖)를 첨가하였다. 수층을 분리하고 EtOAc(20 ㎖)로 세정하였다. 배합된 유기층을 연속적으로 KI(0.18 g) 함유한 5% 수성 시트르산(30 ㎖), 10% 수성 Na₂S₂O₃(30 ㎖), 및 염수로 세정하고 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에서 증발시키고 컬럼 크로마토그래피[EtOAc-석유 에테르(b.p. 40∼60℃), 1:9]를 통해 잔류물을 정제하였다.

4-(2-옥소-5- 페닐 - 펜타노일아미노 )-부티르산 메틸 에스테르( AX037 )

수율 67%; 백색 고체; m.p. 30∼31℃; ¹H NMR: δ 7.19-7.15 (6H, m, C₆H₅, NHCO), 3.67 (3H, s, CH₃O), 3.35 (2H, m, CH ₂NH), 2.94 (2H, t, J= 7.4 Hz, CH₂COCO), 2.65 (2H, t, J= 7.8 Hz, CH ₂C₆H₅), 2.36 (2H, t, J= 7.0 Hz, CH₂COO), 1.91 (4H, m, 2×CH₂); ¹³C NMR: δ 198.7, 173.2, 160.0, 141.1, 128.3, 128.2, 125.8, 51.6, 38.5, 35.9, 34.8, 31.1, 24.6, 24.1.

4-(2-옥소-6- 페닐 - 헥사노일아미노 )-부티르산 메틸 에스테르( AX038 )

수율 75%; 백색 고체; m.p. 52∼54℃; ¹H NMR: δ 7.29-7.16 (6H, m, C₆H₅, NHCO), 3.69 (3H, s, CH₃O), 3.37 (2H, m, CH ₂NH), 2.95 (2H, t, J= 7.0 Hz, CH₂COCO), 2.64 (2H, t, J= 7.0 Hz, CH ₂C₆H₅), 2.38 (2H, t, J= 7.0 Hz, CH₂COO), 1.89-1.66 (6H, m, 3×CH₂); ¹³C NMR: δ 198.8, 173.2, 160.1, 141.9, 128.21, 128.15, 125.6, 51.6, 38.5, 36.4, 35.4, 31.1, 30.6, 24.2, 22.6.

c. 메틸 에스테르기를 함유하는 2-히드록시-아미드의 산화(방법 B)

무수 CH₂Cl₂(20 ㎖) 중의 2-히드록시-아미드(1 mmol)의 용액에 Dess-Martin 페리오디난(0.64 gr, 1.5 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 유기 용액을 10% 수성 NaHCO₃로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰으며 유기 용매를 감압하에서 증발시켰다. 잔류물은 재결정화[EtOAc/석유 에테르(b.p. 40∼60℃)]를 통해 정제하였다.

4-(2-옥소- 나노덱 -10- 에노일아미노 )-부티르산 메틸 에스테르( AX041 )

수율 82%; 기름성 고체; ¹H NMR: δ 7.13 (1H, m, NHCOCO), 5.33 (2H, m, CH=CH), 3.67 (3H, s, CH₃O), 3.33 (2H, m, CH ₂NH), 2.91 (2H, t, J= 7.2 Hz, CH₂COCO), 2.38 (2H, t, J= 7.4 Hz, CH₂COO), 1.98 (4H, m, 2×CH ₂CH=CH), 1.88 (2H, m, CH ₂CH₂NH), 1.59 (2H, m, CH ₂CH₂COCO), 1.26 (20H, br s, 1O×CH₂), 0.87 (3H, t, J= 6.6 Hz, CH₃); ¹³C NMR: δ 199.2, 173.3, 160.3, 129.9, 129.7, 51.7, 38.0, 36.7, 31.8, 31.3, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.0, 28.98, 27.2, 27.1, 24.3, 23.1, 22.6, 14.1; MS (FAB): m/z (%): 410 (100) [M⁺+H].

c. 메틸 에스테르의 비누화

디옥산-H₂O(9:1, 20 ㎖) 혼합물 중의 화합물 2a 또는 2b(2.00 mmol)의 교반 용액에 1 N NaOH(2.2 ㎖, 2.2 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 유기 용매는 감압하에서 증발시키고 H₂O(10 ㎖)를 첨가하였다. 수층을 EtOAc로 세정하고, 1 N HCl로 산성화시켰으며, EtOAc(3 × 12 ㎖)로 추출하였다. 배합된 유기층을 염수로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰으며, 감압하에서 증발시켰다. 잔류물은 결정화[EtOAc-석유 에테르(b.p. 40∼60℃)] 후에 정제하였다.

4-(2-히드록시-5- 페닐 - 펜타노일아미노 )-부티르산(3a)

수율 79%; 백색 고체; m.p. 63∼65 ℃; ¹H NMR: δ 7.26-7.12 (6H, m, C₆H₅, NHCO), 4.09 (1H, m, CH), 3.27 (2H, m, CH ₂NH), 2.59 (2H, t, J= 6.6 Hz, CH ₂C₆R₅), 2.31 (2H, t, J= 6.6 Hz, CH₂COOH), 1.78 (6H, m, 3×CH₂); ¹³C NMR: δ 177.3, 175.5, 142.0, 128.3, 125.8, 71.8, 38.4, 35.5, 34.1, 31.3, 26.8, 24.3.

4-(2-히드록시-6- 페닐 - 헥사노일아미노 )-부티르산(3b)

수율 86%; 백색 고체; m.p. 78∼80℃; ¹H NMR: δ 7.30-7.13 (6H, m, C₆H₅, NHCO), 4.11 (1H, m, CH), 3.30 (2H, m, CH ₂NH), 2.60 (2H, t, J= 7.8 Hz, CH ₂C₆H₅), 2.35 (2H, t, J= 6.6 Hz, CH ₂COOH), 1.81-1.47 (8H, m, 4×CH₂); ¹³C NMR: δ 177.4, 175.5, 142.4, 128.3, 128.2, 125.7, 71.9, 38.4, 35.7, 34.3, 31.4, 31.1, 24.7, 24.4.

d. 유리 카르복실기를 함유하는 2-히드록시-아미드의 산화(방법 C)

이 경우는 워크업전에 수층을 산성화시키고, 이어서 EtOAc로 추출하였으며, 배합된 유기층을 KI 함유 5% 수성 시트르산, 및 10% 수성 Na₂S₂O₃(30 ㎖)으로 세정한 것만 다르고, 상기에 기술한 방법 A에 수반되는 것과 동일한 과정을 수행하였다. 잔류물은 컬럼 크로마토그래피[EtO Ac-석유 에테르 (b.p. 40∼60℃)]를 통해 정제하였다.

4-(2-옥소-5- 페닐 - 펜타노일아미노 )-부티르산( AX036 )

수율 48%; 백색 고체; m.p. 65∼67℃; ¹H NMR: δ 7.25-7.11 (6H, m, C₆H₅, NHCOCO), 3.33 (2H, m, CH ₂NH), 2.86 (2H, t, J= 7.4 Hz, CH₂COCO), 2.60 (2H, m, CH₂), 2.36 (2H, m, CH₂), 1.86 (4H, m, 2×CH₂); ¹³C NMR: δ 198.8, 178.5, 160.3, 141.2, 128.41, 128.37, 126.0, 38.5, 36.1, 34.9, 31.2, 24.7, 24.0; MS (FAB) : m/z (%): 278 (10) [M⁺+H].

4-(2-옥소-6- 페닐 - 헥사노일아미노 )-부티르산( AX035 )

수율 47%; 백색 고체; m.p. 60∼62℃; ¹H NMR: δ 7.27-7.15 (6H, m, C₆H₅, NHCOCO), 3.35 (2H, m, CH ₂NH), 2.94 (2H, t, J= 7.4 Hz, CH₂COCO), 2.60 (2H, m, CH₂), 2.38 (2H, m, C_H2), 1.86 (2H, m, CH₂), 1.64 (4H, m, 2×CH₂); ¹³C NMR: δ 198.8, 178.8, 160.3, 142.0, 128.33, 128.27, 125.7, 38.6, 36.5, 35.5, 31.4, 30.7, 24.2, 22.6; MS (FAB) : m/z (%): 292 (100) [M⁺+H].

4-(2-옥소- 노나덱 - l0 - 에노일아미노 )-부티르산( AXO4O )

수율 69%; 백색 고체; m.p. 57∼59 ℃; ¹H NMR: δ 10.05 (1H, br, COOH), 7.23 (1H, m, NHCOCO), 5.33 (2H, m, CH=CH), 3.38 (2H, m, CH ₂NH), 2.90 (2H, t, J= 7.2 Hz, CH₂COCO), 2.41 (2H, t, J= 6.8 Hz, CH ₂COOH), 1.98 (4H, m, 2×CH ₂CH=CH), 1.89 (2H, m, CH ₂CH₂NH), 1.58 (2H, m, CH ₂CH₂COCO), 1.26 (24H, br s, 12×CH₂), 0.87 (3H, t, J= 6.6 Hz, CH₃); ¹³C NMR: δ 199.1, 178.4, 160.4, 129.9, 129.7, 38.5, 36.7, 32.7, 31.8, 31.2, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.02, 28.96, 27.1, 24.1, 23.1, 22.6, 14.1.

화합물 5는 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다(Kokotos, G.,Kotsovolou, S., Six, D.A., Constantinou-Kokotou, V., Beltzner, CC, 및 Dennis, E.A., J. Med. Chem., 45: 2891-2893, 2002). 화합물 AX073 및 AX074는 상기 과정에 따라서 제조하였다.

4-(2-옥소- 헥사데카노일아미노 )- 옥트 -2- 에노산 메틸 에스테르( AX073 )

백색 고체; m.p. 48∼50℃; [α]_D-12.1 (c 0.95 CHCl₃); ¹H NMR: δ 7.21 (1H, d, J= 8 Hz, NHCO), 6.85 (1H, dd, J ₁ = 6 Hz, J ₂ = 16 Hz, CHCH=CH), 5.87 (IH, d, J= 16 Hz, CH=CHCOOCH₃), 4.58 (1H, m, CH), 3.73 (3H, s, COOCH₃), 2.91 (2H, t, J= 7 Hz, CH₂COCO), 1.61 (4H, m, 2×CH₂), 1.30 (26H, m, 13×CH₂), 0.88 (6H, t, J= 7 Hz, 2×CH₃); ¹³C NMR: δ 199.3, 166.7, 159.8, 146.9, 121.4, 51.9, 50.4, 37.0, 34.1, 32.1, 29.9, 29.8, 29.6, 29.5, 29.3, 27.9, 23.4, 22.9, 22.5, 14.3, 14.0.

4-(2-옥소- 헥사데카노일아미노 )- 옥트 -2- 에노산 ( AX074 )

백색 고체; m.p. 65∼67℃; [α]_D-7.7 (c 0.84 CHCl₃); ¹H NMR: δ 7.0 (1H, m, NHCO), 6.82 (1H, dd, J ₁ = 6 Hz, J ₂ = 16 Hz, CHCH=CH), 5.87 (1H, d, J= 16 Hz, CH=CHCOOCH₃), 4.6 (1H, m, CH), 2.91 (2H, t, J= 7 Hz, CH₂COCO), 1.61 (4H, m, 2×CH₂), 1.25-1.44 (26H, m, 13×CH₂), 0.88 (6H, t, J= 7 Hz, 2×CH₃); ¹³C NMR: δ 199.0, 170.8, 159.6, 149.0, 120.8, 50.2, 36.7, 33.7, 31.9, 29.6, 29.4, 29.3, 29.0, 27.7, 23.1, 22.7, 22.3, 14.1, 13.8.

억제제 AXOOl, AX002, AX006, AX009, AXOl0 및 AXO15는 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다(Kokotos, 등, (2002) J. Med. Chem. 45, 2891-2893.; Kokotos, 등, (2004) J. Med. Chem. 47, 3615-3628).

1-히드록실벤조트리아졸(HOBt)의 존재하에서 축합제로서 l-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드(WSCI)를 사용하여 에틸 및 tert-부틸 4-아미노-부타노에이트를 2-히드록시-헥사데칸산과 커플링시켰다. 합성된 2-히드록시아미드는 촉매량의 4-아세트아미도-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일옥시 자유 라디칼(AcNH-TEMPO) 존재하에서 NaOCL을 이용하여 산화시켜서 화합물 AX048 및 AX057을 생성시켰다(도 1A). 화합물 AX035-AX041 및 AX073-AX074는 도 1B에 기술된 반응에 따라서 합성하였다.

D. 본 발명의 2- 옥소아미드 억제제에 의한 GIVA 및 GVTA PLA ₂ 의 선택적인 억제

다양한 2-옥소아미드를 이용하여 시험관 내 분석 시스템에서 PLA₂에 대한 억제 시험을 하였다. 결과는 하기 표 Ia, 1b 및 2에 나타내었는데, 달리 언급하지 않으면 X _I(50) 값으로 나타내었다. X _I(50)은 50% 억제율을 생성시킨 억제제의 농도로서 정의한다. GIVA 및 GVIA PLA₂가 3차원 용액보다는 2차원 지질 경계면에서 활성이 있기 때문에 보다 일반적인 IC₅₀에 대립하는 것으로서 X _I(50)를 사용하였다(Deems, Anal. Biochem., 287:1-16, 2000). 2-옥소아미드 억제제는 미셀 경계면에 분배되어 있는 듯하며, 따라서 벌크 농도(몰 유닛)에 대립하는 것으로서 표면 농도 비율(몰분율)로서 나타내야 한다(Kokotos, 등, J. Med. Chem., 45:2891-2893, 2002).

표 1a에 열거한 14종의 화합물 중, 5종은 시험한 최고 농도에서 GVIA PLA₂를 적어도 부분적으로 억제하는 것으로 나타났다. 표 1b에 나타낸 추가 7종의 화합물 중에서, 3종이 GVIA PLA₂를 비롯하여 GIVA PLA₂ 및 GV PLA₂를 적어도 부분적으로 억제하는 것으로 나타났다.

[표 1a]

2-옥소아미드 억제제의 구조 및 이들의 GIVA 및 GVIA PLA₂에 대한 효능

^aND: 최고 용량에서 무시해도 좋을 정도로 낮은 억제율(0∼25%).

^bLD: 최고 용량에서 한계 억제율(25∼50%).

^c Ref. 22에서 취한 데이타.

[표 1b]

N.D.는 0.091 몰분율에서 25% 또는 그 이하의 억제율을 표시하는 것이고, L.D.는 0.091 몰분율에서 25%와 50% 억제율 사이를 의미한다. X _I(5O)는 효소를 50% 만큼 억제하기 위해 필요한 전체 기질 경계면에서 억제제의 몰분율이다. 보다 일반적인 IC₅₀ 또는 K_I 대신 X _I(5O)을 사용하는 이유는 PLA₂가 이의 기질 인지질이 존재하는, 인지질 표면 예컨대 막, 인지질 소포체, 또는 인지질 미셀에서만 활성이 있기 때문이다.

1차 2-옥소아미드 AXOOl 및 AXOl5 중에서, 어떠한 것도 GIVA 또는 GVIA PLA₂에 대해 유의한 억제율을 나타내지 않았다. R¹ 또는 R² 위치에 탄소 장쇄가 존재하는 2차 2-옥소아미드인, AX002 및 AX009는 GVIA PLA₂에 대해 한정된 억제율을 나타냈지만, GIVA PLA₂에 대해서는 검출가능한 정도의 억제율을 나타내지 않았다. R¹ 위치에 치환된 페닐쇄를 함유하는 4종의 2-옥소아미드(AX035∼AX038)는 GVIA PLA₂를 억제하지 않았다. 이는 페닐 함유 플루오로케톤 또는 플루오로포스포네이트의 선택성에 대해 기술된 이전 보고서에서 예측하지 못한 것이다. 어떠한 페닐 함유 2-옥소아미드도 GIVA PLA₂를 억제하지 않았다.

유리 카르복실기를 함유하는 2-옥소아미드(AX006, AX040, AX074)는 GIVA PLA₂를 억제하였지만, GVIA PLA₂는 억제하지 않았다. 사실, 모든 경우에 있어서, 이들 화합물은 효소 활성을 증가시켰다. GIVA PLA₂ 활성 증가는 유리 카르복실기를 갖는 억제제가 첨가되어서 미셀 표면에 음 전하가 증가되었기 때문일 것이다. GIVA PLA₂의 억제제와는 달리, GVIA PLA₂의 억제제(AXOlO, AX041, AX073)는 하전되지 않았다. AX006에 존재하는 유리 카르복실 대신 카르복시메틸 에스테르를 보유하는 AX010 및 AX006을 비교한 경우, 이러한 전하의 효과가 두드러진다. AXOlO는 GVIA PLA₂에 대해 한정된 억제율을 나타내지만, GIVA PLA₂를 유의하게 억제하지 않는다. AX006는 최대 0.091 몰분율의 농도에서 GVIA PLA₂를 유의하게 억제하지 않지만, 0.017 몰분율의 X _I(50) 값을 갖는 GIVA PLA₂의 강력한 억제제이다(Kokotos, 등, J Med. Chem., 45:2891-2893, 2002). AX041는 0.067 몰분율의 X _I(50) 값을 갖는 GVIA PLA₂의 억제제인데, 흥미롭게도, 이는 또한 0.012 몰분율의 X _I(50) 값으로 GIVA PLA₂를 억제한다. AX041의 하전된 변형체인 AX040은 GVIA PLA₂를 억제하지는 않지만, 0.011 몰분율의 X _I(50) 값을 갖는 GIVA PLA₂의 억제제이다. 화합물 AX073 및 AX074를 이용하여 일관된 결과를 확인하였다. 이들 화합물들은 또한 카르복시메틸 에스테르(AX073) 또는 유리 카르복실 기(AX074)를 함유하는 변형체이다.

AX010, AX041 및 AX073에 의한 GVIA PLA₂의 억제 경향을 관찰한 바에 의하면, R¹ 또는 R²에서 불포화쇄가 포화쇄보다 바람직한 것으로 나타났다. 이는 다양한 인지질의 sn-2 위치에 불포화 지방산이 존재하는 것과 일관되는 것이다.

하기 표 2에서는 하나 이상의 cPLA₂, iPLA₂ 또는 SPLA₂ 이성체를 억제하는 분자의 활성을 검증한 결과를 나타내었다.

[표 3]

2-옥소아미드 억제제의 구조 및 이들의 GIVA 및 GVIA PLA₂ 및 GV PLA₂에 대한 효능

N.D., 몰분율: ^a0.091, ^b0.08, ^c0.048, ^d0.04, ^e0.03, ^f0.02, ^g0.01에서 검출되지 않음.

PLA₂의 거의 모든 억제제들이 적어도 어느 정도 인지질 표면에 분배되어 있는데, 이들이 일반적으로 PLA₂의 소수성 활성 부위를 보상하는 소수성 부분을 갖기 때문이다. 이들 억제제들이 표면에 분배되어 있는 경우, 표면 희석이라고 하는 중요한 물리적 효과가 작용한다. 이 경우, 억제제에 대한 PLA₂의 친화력은 억제제의 몰 단위의 3차원(벌크) 농도에 좌우되는 것이 아니라, 억제제의 몰분율 단위의 2차원(표면) 농도에 따라 좌우된다. 표시한 바와 같이(도 2 및 3, 표 1b 참조), AX048 및 AX057는 IVA군 PLA₂ 및 VIA군 PLA₂에 대해 효능이 있었고, AX006는 IVA군 PLA₂에만 효능이 있었으며, AXOlO은 둘 모두에 대해 덜 효과적이었다.

흥미롭게도, 페닐 함유 AXO15은 0.091 몰분율에서 45.3%의 효능으로 sPLA₂에 대해 약하게 억제하였지만, cPLA₂ 또는 iPLA₂에 대해 유의한 활성은 없었다. 대조적으로, AX048 및 AX057은 0.091 몰분율에서 PLA₂에 대하여, 각각 61.5% 및 76.7%의 효능을 나타내어, 목적하는 모든 3종의 PLA₂에 대해 활성이 있었다(ClogP는 각각 7.6 및 8.3임). AX073도 sPLA₂에 대하여 75.3%의 효능을 나타내었고, ClogP는 8.95였다.

다른 화합물들은 cPLA₂ 및 iPLA₂에 대해 효능을 보였지만, sPLA₂에 대하여 가장 강력하였는데, 예컨대 AX105, AX110, AX111, AX113 및 AX114로서, AX113은 0.091 몰분율에서 약 100% 억제율에 도달하였다. 모두 iPLA₂ 보다는 cPLA₂ 및 sPLA₂에 대한 효능이 보다 강력하였다.

E. 2- 옥소아미드 억제제에 의한 GVIA PLA ₂ 억제의 가역성 및 PGE 및 COX -2에 대한 효과

AXOlO 및 AX073에 대하여 이들 억제제가 GVIA PLA₂에 대한 시간 의존적 또는 비가역적 억제성을 나타내는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. GVIA PLA₂(25 ng)를 0분, 5분, 15분 또는 30분 동안 AXOlO 또는 AX0073 (5 uM)과 사전 항온 반응시키고, 이어서 5 uM 억제제를 함유하는 표준 GVIA PLA₂ 분석 믹스에서 분석하였다. 이 분석 믹스에서 억제제의 최종 농도는 0.01 몰분율이었고, 시료들은 30분 동안 40℃에서 항온 반응시켰다. AXOlO 및 AX073은 둘 다 장기간 항온 반응으로 그 효능이 증가하는 것으로 나타나지 않았는데, 이는 빠른 결합(도 1cA)과 억제의 가역성(도 1cB)을 보여주는 것이다. 후자의 측면에서, 25 ng의 GVIA PLA₂를 10 uM AXOlO 또는 AX073과 10분간 사전 항온 반응시키고 이후 상기 효소를 억제제가 결여된 표준 GVIA PLA₂ 분석 믹스에 1:50으로 희석하고, 30분간 40℃에서 항온 반응시켰다. 이 분석에서 최종 억제제의 농도는 0.0004 몰분율이었는데, 이는 AXOlO 또는 AX073이 효소를 억제하는 표면 온도보다 꽤 낮은 온도이다. GVIA PLA₂는 이 시스템에서 완전한 활성을 나타내었는데, AXOlO 및 AX073 둘 모두가 자유롭게 가역적인 억제제라는 것을 의미한다(도 1cB).

쥣과 동물 RAW 264.7 마크로파지 유사 세포주의 장기 지질다당류(LPS) 자극 경로에서 몇몇 2-옥소아미드를 시험하였다(Raschke, 등, Cell, 1978, 15, 261-267). 이 경로는 GIVA PLA₂ 활성을 필요로 하고, 프로스타글란딘 PGE₂를 포함하는 다양한 아이코사노이드 화합물의 세포외 방출을 일으킨다(Gijon, 등, leukoc. Biol., 1999, 65, 330-336). GIVA PLA₂를 유의하게 억제하지 않는 AXOlO은 PGE₂ 방출을 억제하지 않았다. 낮은 uM 범위에서, AX041 및 AX073은 대략 40% 만큼 PGE₂ 방출을 감소시켰다(도 1(D)). 1 uM 및 5 uM 농도에서, 소량의 활성화가 종종 관찰되었다. AX010, 즉 선택적인 GVIA PLA₂ 억제제가 세포내 효능이 없다라고 하면 시험관 내 및 세포 내 결과는 모두 GVIA PLA₂의 공지 역할과 일관된다. GVIA PLA₂-특이적 2-옥소아미드 억제제는 세포내 시스템에서 GVIA PLA₂의 역할에 대한 연구를 유의하게 향상시켜야 한다. GIVA PLA₂에 선택적인 억제제 또는 이중 특이성 억제제는 PGE₂ 수준을 감소시키며, 이는 또한 PGE₂ 생성에서 GIVA PLA₂의 공지 역할과 일관성이 있는 결과이다.

실시예 I

통각 과민증에 대한 동물 모델 및 분석 방법

동물

숫컷 Holtzman Sprague-Dawley 래트(300∼350 g; Harlan Industries)를 개별 사육하고, 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하면서 12시간 명암 주기로 유지시켰다.

경막내 카테터 이식

척수 약물 주입을 위해서, Yaksh가 기술한 방법(Yaksh 및 Rudy, 상동, 1976) 의 변형법에 따라서 이소플루란 마취하에서 래트에 요추 카테터를 이식하였다. 폴리에틸렌 카테터(PE-5; Spectranetics, OD = 0.014)를 경막강에 삽입하고, 환추 후두막에 절개를 통해서 요추 확장부의 문측 가장자리로 전진시켰다. 이식후 5일경 래트를 실험에 사용하였다. 척수 프로스타글란딘 방출을 시험하기 위한 개별 실험에서, 래트는 문헌 [Yaksh, 등, 상동, 2001]에 이미 기술된 바와 같이, 3 루멘이 있는 요추 루프 투석 카테터를 이용하여 준비하였다.

간략하게, 외부 2 루멘을 투석 튜브의 길이로 연결하였다(10 Kda 컷오프). 이어서 상기 경막내 카테터에 대해 기술한 바와 동일한 방법을 이용하여 카테터를 경막으로 이식하였다. 실험에 동물을 포함시키기 전에 3일을 경과시켰다. 모든 경우에서, 배제 기준은 i) 임의 신경학적 후유증의 존재, ii) 이식 후 20%의 체중 손실, 또는 iii) 카테터 폐색이다.

행동 분석

열 통각 과민증: 두 가지의 접근법을 사용하여 통각 과민 상태를 유발시켰다. 염증으로 유발된 열 통각 과민증은 좌측 뒷발의 족저면에 2 ㎎의 카라기난(Sigma, St. Louis, MO, 생리 식염수 내 20%(w/v) 용액 100 ㎕)을 피하 주입하여 유도시켰다. 열로 유발시킨 발의 후퇴 반응(paw-withdrawal response)을 측정하기 위해서, Hargreaves 등이 문헌 [Hargreaves, Pain, 32:77-88, 1988]에 기술되어 이후에 만들어진 시판 디바이스를 사용하였다(문헌 [Ding 및 Yaksh, Neurosci. Lett., 220:93-96, 1996; Dirig, 등, J.Neurosci. Methods, 76:183-191, 1997] 참조).

간략하게, 상기 디바이스는 유리 표면(25℃ 유지)으로 이루어지는데 이 유리 위에서 래트가 개별적으로 플렉시 유리 큐비클(9 × 22 × 25 cm)에 놓여진다. 열통 자극은 유리 표면 밑에 위치하는 집중 투사 벌브에서 발생시켰다. 이 자극은 자극 공급원 상에 고정된 각이 있는 거울의 보조로 각 시험 개체의 뒷발에 개별적으로 전달하였다.

광원과 함께 타이머를 작동시켰고, 잠복기는 자극을 종결시키고 타이머를 중지시키는 포토다이오드 모션 센서를 통해 탐지 지 상기 발이 활발한 후퇴를 보이는데 요구되는 시간으로서 정의하였다. 발후퇴 잠복기(PWL)는 임의 처리 전(대조군) 및 처리 후 일정 시간 간격으로 측정하였다. 좌측(손상) 및 우측(미손성) 발 후퇴 잠복기를 측정하고 시간에 따라 그래프로 나타내었다. 또한, 편차 잠복기 점수(미손상-손상)를 산출하고 주입 후 관찰 시간 간격 동안 평균 후퇴 잠복기를 처리군 간 비교를 위해 산출하였다.

말초 염증을 사용한 것 이외에도, 열통각 과민증을 또한 SP의 경막내 주입(20 nmol/10 ㎕)으로 유발시켰다. 좌우 발의 평균 PWL을 각 시간점에서 측정하였다. IT-SP 전 및 IT-SP 후의 반응 잠복기 점수 간 평균 편차를 분석을 위해 산출하였다.

경막내 투석 및 PGE ₂ 분석

PGE₂의 척수 방출을 명확하게 하기 위한 척수 투석 실험은 투석 카테터 이식 후 3일 경 마취시키지 않은 래트에서 수행하였다. 시린지 펌프(Harvard, Natick, MA)를 연결하고 투석 튜브를 10 ㎕/분의 유속에서 인공 뇌척수액(ACSF)으로 관류하였다. ACSF는 151.1 mM Na⁺, 2.6 mM K⁺, 0.9 mM ㎎²⁺, 1.3 mM Ca² ⁺, 122.7 mM Cl^-, 21.0 mM HCO₃, 2.5 mM HPO₄ 및 3.5 mM 덱스트로스를 함유하고 각 실험전에 95% O₂/5% CO₂로 발포시켜서 최종 pH를 7.2로 조정하였다. 유출물(분획당 20분)을 자동 분획 수집기(Eicom, Kyoto, Japan)에서 4℃에서 수집하였다. 2 베이스라인 시료는 30분 세척 후 회수하였고, NMDA의 IT 주입(0.6 ㎍) 이후 추가 3 분획을 회수하였다. 척수 투석물 중 PGE₂ 농도는 시판되는 키트(Assay Designs 90001, Assay Designs, Ann Arbor, MI)를 사용하여 ELISA로 측정하였다. 항체는 PGF₁, PGF₂, 6-케토PGF₁ PGA₂ 또는 PGB₂에 대한 교차 반응성이 2.0% 미만이지만, PGE₁ 및 PGE₃와는 교차 반응하고, PGE₂에 특이적인 항체이다.

약물 전달

약물은 전신(IP) 또는 척수(IT) 전달하였다. 복막내 약물은 0.5 ㎖/㎏의 양으로 준비한 용량을 균일하게 전달하였다. IT 주입된 약물은 10 ㎕의 총량으로 투여한 후 운반체 10 ㎕를 이용하여 플러싱하였다.

효소 분석

이전에 기술된 바와 같이(Kokotos, 등, 상동, 2002), 시험관 내 IV군 cPLA₂ 및 VI군 iPLA₂ 분석을 수행하였다. 간략하게, 100 uM 지질 기질 및 100,000 cpm 방 사성 동위 원소 표지된 유사체를 N₂ 하에서 건조해 내리고 400 uM Triton X-100을 함유하는 분석 완충액에 용해시켜서 혼합된 미셀 기질 용액을 생성시켰다. DMSO에 용해된 억제제를 반응 튜브에 첨가하고 5분간 4O℃에서 기질과 항온 반응시켰다. 순수한 효소를 최종 부피가 500 ㎕가 되도록 첨가하였고, 40℃에서 30분간 분해를 수행하였다. 반응을 켄칭하고 Dole 방법을 이용해 추출하였으며, 생성물을 액체 섬광 계측으로 정량하였다. 억제율은 X _I(50) 산출에 대한 억제 몰분율 농도 범위에서 결정하였다.

유사한 분석법으로 GV sPLA₂ 활성을 측정하였다. 최종 분석 완충액은 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 5 mM CaCl₂을 포함한다. 각 분석은 100 ㎕의 5×기질 용액(20 ㎕의 10 mM Triton X-100 및 80 ㎕ 분석 완충액), 390 ㎕ 분석 완충액, 10 ㎕ GV sPLA₂ 용액(1 ㎕의 40 ng/㎕ 저장액 및 9 ㎕ 분석 완충액), 및 5 ㎕의 DMSO 또는 DMSO 중의 2-옥소아미드로 이루어진 전체 500 ㎕ 부피에서 수행하였다. 5×기질 용액은 N₂로 인지질(유기 용매 내)을 건조시켜서 준비하였다. 적절한 양의 10 mM Triton X-100을 첨가하고, 가열하였으며, 투명하게 될 때까지 와류시켰다. 이후 분석 완충액을 첨가하여 5×기질 용액을 만들었다. 최종 혼합 미셀은 400 uM Triton X-100 및 100 uM DPPC(이중에 100,000 cpm의 ¹⁴C-DPPC)을 포함한다.

Cayman Chemical의 COX Activity Assay Kit(카달로그 760151)를 이용하여 시험관 내에서 시클로옥시게나제-1 및 시클로옥시게나제-2의 억제에 대해 시험하였 다. COX-1 및 COX-2 단백질을 함유하는 10 ㎕의 공급 COX 표준물(카달로그 760152)을 이용하여 96 웰 평판에서 분석을 수행하였다. 활성은, 611 nm의 최대 흡광도를 갖는 산화된 N,N,N',N'-테트라메틸페닐렌디아민(TMPD)의 생성을 통해서 595 nm에서 색측정으로 검출하였다(Kulmacz 및 Lands, Prostaglandins, 25:531-540, 1983). DMSO(시험 화합물) 또는 에탄올(인도메타신)에 용해된 억제제를 50 uM의 최종 농도로 첨가하고 효소를 포함하는 분석 혼합물과 함께 5분간 항온 반응시켰다. TMPD 및 아라키돈산을 첨가한 후, 시료를 혼합하고 실온에서 5분간 항온 반응시키고 이후 결과 측정을 위해서 595 nm에서 흡광도를 판독하였다. 결과를 산출하고 억제율 값을 얻었다.

약물

이들 실험에서 사용한 PLA₂ 억제제를 하기에 기술하였다. 이들 제제는 5% Tween 80의 운반체에 준비하였다. 실험에 사용되는 다른 제제들에는 칸나비노이드 작용제 아난다미드, CB1 길항제(SR141716A)(Benjamin Cravatt, Scripps Institute, La Jolla, CA가 제공)가 포함된다. 아난다미드는 100% DMSO 중에 준비하였고 SR141716A는 에탄올 에멀포르(Emulphor) 및 식염수(1:1:18) 중에 준비하였다. 대조 실험군은 개별 운반체를 이용하였다.

실시예 II

경막내 전달 후 카라기난 유도된 열통각 과민증의 치료

대조군 : 통각 과민증을 유도하기 전, 베이스라인 열 일탈 잠복기는 모든 군 에서 10∼12초 순이었다. 카라기난의 족저내 주입으로 주입 뒷발에 염증과 상응하는 열통각 과민증이 유발되었고 이는 실험 동안 60분 지속후에 탐지가능하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, IP 또는 IT 운반체로 처리한 동물에서 열 일탈 잠복기는 90분 내지 120분 이내에 대략 3∼5초까지 유의하게 감소되었다(도 5 및 6 참조).

복막내 전달 : 카라기난 주입 전 4종의 제제 3 ㎎/㎏(IP)으로 사전 처리(30분)한 바에 따르면, AX048은 염증이 일어난 발에서 관찰된 것과는 다르게 열통각 과민증을 감소시켰는데, AX006, AX010 또는 AX057은 그렇지 않았다(도 5). 중요한 것은, 운반체 처리 또는 약물 처리 동물에서 미손상 발의 열 일탈 잠복기에 어떠한 변화도 없었으며, 예를 들어, 상기 제제가 항통각 과민증 제제로서 기능적으로 작용하였다. 미손상 및 손상 발의 반응 잠복기 사이의 평균 군 편차를 비교한 바에 의하면 운반체 처리군과 비교하여 AX048 처리군에서 유의한 감소가 확인되었다.

용량 의존성 : IP AX048의 효능이 0.2∼3 ㎎/㎏ 범위에 걸쳐서 용량 의존적인 것으로 관찰되었다(기울기; p < 0.0004)(도 6 참조). ED50은 운반체 처리 동물에서 관찰되는 통각 과민증을 50% 만큼 감소시키는 용량으로 정의하였다. 이를 기초로, IP AX048에 대해 측정한 IP ED50은 1.2 ㎎/㎏이었다(95% CI: - 0.5572∼0.7713).

작용의 시간 추이 : 시간 경과에 따른 약물 작용을 측정하기 위하여, -15분, -30분 및 -180분에서 AX048(3 ㎎/㎏)의 IP 전달을 실시하였다(도 7). 표시한 바와 같이, 최고 효능은 30분에 나타났고 최소 효능은 15분에 관찰되었다. 이 효과는 180분간 지속되었지만 360분까지 대조군과 차이가 없었다.

실시예 III

대조군 : 운반체를 경막내 주입으로 투여받은 동물에, 카라기난의 족저내 주입한 결과 미주입 발과 비교하여 유의한 단측 열통각 과민증이 일어났다(도 8).

약물 효능 : 카라기난 전달 전 15분경 4종의 제제 30 ㎍/10 ㎕를 사전 처리한 바에 따르면 AX048은 열통각 과민증을 감쇠시켰지만, AX006, AXOlO 또는 AX057은 그렇지 않았다(도 8 참조). 또한, 경막내 전달 후, 운반체 처리 또는 약물 처리 동물의 미손상 발의 열 일탈 잠복기에 어떠한 변화도 없었다. 미손상 및 손상 발의 반응 잠복기 간 평균 군 편차를 비교한 결과 운반체 처리군과 비교하여 AX048 처리군에 유의하게 감소가 일어났다.

실시예 IV

경막내 기질 P 유도된 열통각 과민증의 치료

대조군 : 베이스라인 열 일탈 잠복기는 10∼12초 순이었다. 전신 운반체 처리 동물에, SP의 경막내 주입(20 nmol/10 ㎕)은 주입 후 15분 정도로 초기에 열 일탈 잠복기를 유의하게 감소시켰으며, 45분 시험 기간 동안 지속되었다가, 60분에 베이스라인으로 돌아왔다(도 9 참조).

약물 효능 : SP의 경막내 전달 전 30분 4종의 제제를 3 ㎎/㎏ (IP)로 사전 처리한 결과 AX048은 척수에 의해 유발되는 열통각 과민증을 완전하게 방지하였지만, AX006, AXOlO 또는 AX057은 그렇지 않았다(도 9). 카라기난 실험에서처럼, AX048이 베이스라인보다 높은 값까지 처리후 잠복기를 증가시키는 증거는 없었고, 예를 들어, 상기 제제는 항통각 과민증 제제로서 기능적으로 작용하였다.

실시예 V

부작용 프로파일

임의 화합물의 경막내 용량(20 ㎍) 또는 최고 전신 용량(3 ㎎/㎏)을 전달한 후, 눈 깜박임, 귓바퀴 이상(pinnae), 자리잡기(placing), 보행(steppint) 등을 포함하여 평가한 어떠한 반사 작용 종료점에도 변화가 없었다. 동물들은 정위 반응, 대칭 보행 또는 자발적 활동성에 변화를 보이지 않았다.

실시예 VI

프로스타글란딘 방출 억제

대조군 : 약물 처리 전 초기 세척 이후 전체 베이스라인 투석물 농도는 555±75 pg/lOO ㎕ 관류물인 것으로 측정되었다. SP의 경막내 주입(20 ㎍) 결과 운반체 처리한 대조군과 비교하여 척수 투석물에 PGE₂ 농도가 통계적으로 유의하게 증가하였지만(또 10) 운반체(식염수, 결과 도시하지 않음)는 그렇지 않았다.

약물 효과 : IT SP(20 ㎍/10 ㎕)의 전달 전 15분 4종의 제제를 사전 처리한 결과, 유발된 PGE₂ 방출은 AX048 처리군에서만 감소하였다. 따라서, 4종의 제제 중, AX048만이 PGE2 합성 및 방출에 유의하게 억제 효능을 나타내었다(도 10 참조).

본 명세서에서 예시적으로 설명한 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 개시한 임의 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들없이 적절하게 실시할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하다" 또는 "함유하다"(comprising, including, containing) 등은 어떠한 제한없이 광범위하게 해석해야한다. 또한, 본 명세서에서 사용한 용어 및 표현들은 설명을 위해 사용한 것으로서 이에 제한하려는 것이 아니며, 도시하고 설명한 특징의 임의 동등물 또는 이의 일부를 배제하고 이러한 용어 및 표현을 사용하려는 의도는 없지만, 본 발명에서 청구한 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것은 분명하다. 따라서, 본 발명에서 바람직한 구체예 및 선택적인 특징으로 구체적으로 개시하였지만, 본 발명에 포함되는 변형 및 개조는 당분야의 당업자가 구분할 수 있으며, 이러한 변형 및 개조는 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 간주하는 것은 자명하다.

본 발명을 광범위하고 총체적으로 기술하였다. 일반적인 개시 내용에 속하는 협의의 종 및 하위 장르 분류도 본 발명의 일부를 형성한다. 삭제된 요소를 여기서 구체적으로 열거했거나 그렇지 않건 상관없이, 특정 종류에서 임의 대상을 제거하는 조건 또는 음성적 한정을 갖는 본 발명의 총체적인 설명을 포함한다.

다른 구체예도 하기의 청구항에 속한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 측면을 마쿠시 그룹 형태로 설명한 부분은, 이를 통해서 본 발명을 마쿠시 그룹의 일 구성원의 하위군 또는 임의 개별 구성원을 들어 설명하는 것임을 당분야의 당업자는 이해할 것이다.

Claims

하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 기하 이성질체, 거울상 이성질체, 약학적 또는 면역학적 허용 염 또는 프로드러그:

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

R¹은 임의 C₂-C₈ 알콕시 기로서, 여기서, 상기 알콕시 기는 선형 또는 분지형이고;

R²는 부재하거나, 임의 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄이고, 여기서 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄는 임의 치환되며;

R³은 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄이고;

n ≥0, m ≥0, k ≥0이다.
제1항에 있어서, k는 > 0이고, m 및 n 중 하나는 > 0인 화합물.
제1항에 있어서, k는 2∼22인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, R³은 메틸인 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, m은 0이고, n은 1∼12인 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, m은 0이고, n은 2이며, R¹은 (-OCH₂CH₃)인 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, m은 0이고, n은 3이며, R¹은 t-부톡시(-OC(CH₃)₃)인 화합물.
제1항에 있어서, k는 7이고, m은 0이며, R¹은 메틸이고, R²는 부재하며, R³은 알케닐 쇄인 화합물.
제1항에 있어서, m은 2이고, n은 4이며, R¹은 (-OCH₂CH₃)인 화합물.
제1항에 있어서, m은 0이고, n은 4이며, R¹은 (-OCH₂CH₃)인 화합물.
제1항에 있어서, m은 0이고, n은 4이며, R¹은 t-부톡시(-OC(CH₃)₃)인 화합물.
제1항에 있어서, m은 0이고, n은 2이며, R¹은 t-부톡시(-OC(CH₃)₃)인 화합물.
제1항에 있어서, m은 0이고, n은 2이며, R¹은 (-OCH₂CH₃)인 화합물.
제1항에 있어서, m은 0이고, n은 1이며, R¹은 t-부톡시(-OC(CH₃)₃)인 화합물.
제9항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, k는 13인 화합물.
하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물, 이의 기하 이성질체, 거울상 이성질체, 약학적 또는 면역학적 허용 염 또는 프로드러그:

[화학식 Ia]

상기 화학식 Ia에서,

R¹은 임의 C₁-C₈ 알콕시 기로서, 여기서, 상기 알콕시 기는 선형 또는 분지형이고;

R²는 부재하거나, 임의 방향족, 헤테로시클릭, 또는 카르보시클릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이고, 여기서, 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄는 임의 치환되며;

R³은 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클릭 기, 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 쇄이고;

n ≥0, m ≥O, k ≥0이다.
제15항에 있어서, R¹은 에톡시이고, R²는 부재하며, m은 2인 화합물.
제16항에 있어서, k는 13인 화합물.
하기 화학식 II의 화합물, 이의 기하 이성질체, 거울상 이성질체, 약학적 또는 면역학적 허용 염 또는 프로드러그:

[화학식 II]

상기 화학식 II에서,

R은 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 C₂-C₈ 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄이고;

R³은 임의로 임의 치환된 방향족, 헤테로시클릭 또는 카르보시클릭 기 또는 임의 치환된 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 알케닐 또는 알키닐 쇄이고;

k ≥0이다.
제19항에 있어서, R³은 C_1O-C₂₀ 알케닐인 화합물.
제19항 또는 제20항에 있어서, R은 에틸인 화합물.
제19항 또는 제20항에 있어서, R은 t-부틸인 화합물.
제19항 또는 제20항에 있어서, R은 이소프로필인 화합물.
제22항에 있어서, k는 7인 화합물.
제22항에 있어서, k는 12인 화합물.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 따른 화학식 I의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
제26항에 있어서, 억제되는 효소 활성은 포스포리파제 cPLA₂, iPLA₂ 및 sPLA₂의 활성인 약학 조성물.
제27항에 있어서, 화합물은 AX048인 약학 조성물.
제27항에 있어서, 화합물은 AX057인 약학 조성물.
제27항에 있어서, 화합물은 AX113인 약학 조성물.
제27항에 있어서, 화합물은 AX111인 약학 조성물.
제27항에 있어서, 화합물은 AX114인 약학 조성물.
제27항에 있어서, 화합물은 AX110인 약학 조성물.
제27항에 있어서, 화합물은 AX105인 약학 조성물.
제16항 또는 제17항에 따른 화학식 Ia의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
제18항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 따른 화학식 II의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
제24항 또는 제25항에 따른 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 분비형 포스포리파제 A₂(sPLA₂)의 효소 활성을 억제하는데 사용하 기 위한 약학 조성물.
제2항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 따른 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 분비형 포스포리파제 A₂(sPLA₂)의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
제17항에 따른 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 분비형 포스포리파제 A₂(sPLA₂)의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
화합물 AX015 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 분비형 포스포리파제 A₂(sPLA₂)의 효소 활성을 특이적으로 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
하기 화학식 III의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물:

[화학식 III]
하기 화학식 IV의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물:

[화학식 IV]
하기 화학식 V의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물:

[화학식 V]
하기 화학식 VI의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 IVA군 및 VIA군 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물:

[화학식 VI]
하기 화학식 VI의 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 세포 또는 유기체에서 IVA군 및 VIA군 포스포리파제 A₂의 효소 활성을 억제하는데 사용하기 위한 약학 조성물:

[화학식 VII]
제1항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 따른 하나 이상의 화합물의 IVA군 및 VIA군 포스포리파제 A₂에 대한 억제 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 염증 작용의 효과를 조절하는 방법.
제46항에 있어서, V군 포스포리파제 A₂에 대한 억제 유효량으로 화합물을 추가 투여하는 것인 방법.
V군 포스포리파제 A₂특이적 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 염증 작용의 효과를 조절하는 방법.
제48항에 있어서, 억제제는 IVA군 또는 VIA군 포스포리파제 A₂에 대해 통계적으로 유의한 억제 효과를 갖지 않는 것인 방법.
제49항에 있어서, 억제제는 AXO15인 방법.
제48항에 있어서, 억제제는 IVA군 포스포리파제 A₂에 대해 통계적으로 유의한 억제 효과를 갖지 않는 것인 방법.
제51항에 있어서, 억제제는 AX093 또는 AX081인 방법.
제46항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조절되는 염증 작용의 효과 중 하나는 중추 신경계 염증인 방법.
제46항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조절되는 염증 작용은 척수 매개되는 것인 방법.
제54항에 있어서, 척수 매개되는, 조절되는 염증 작용 중 하나는 통각 과민증인 방법.
제55항에 있어서, 통각 과민증은 열 통각 과민증인 방법.
제46항에 있어서, 포유류는 인간인 방법.
제48항에 있어서, 포유류는 인간인 방법.