ES2288154T3 - Construccion de electrodos para aparato dielectroforetico y separacion por dielectroforesis. - Google Patents
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Abstract
Un electrodo para un aparato dielectroforético caracterizado por un espacio hueco vacante en dicho electrodo y que crea una zona en la cual la densidad de la línea de flujo eléctrico es baja, de manera que las sustancias influenciadas por una fuerza dielectroforética negativa se concentran en dicho espacio vacante o por encima o por debajo de dicho espacio vacante en una dirección vertical del mismo.
Description
Construcción de electrodos para aparato
dielectroforético y separación por dielectroforesis.
Esta invención se refiere a un electrodo para un
aparato dielectroforético, en el que se puede reducir el fondo para
potenciar la razón S/N (Señal/Ruido) en la detección de una
sustancia que se va a medir (moléculas que se van a medir) mediante
intensidad de fluorescencia o similar, un método para fabricar el
mismo, una constitución del electrodo proporcionada con el
electrodo, y un método para separar sustancias utilizando el
electrodo.
La tecnología de tratamiento de materiales a
escala de nanometros a micrometros por medio de una tecnología de
micromaquinaria tal como fotolitografía se ha establecido
recientemente por el desarrollo de tecnologías de semiconductores y
todavía continúa su progreso en la actualidad.
En los campos de la química y la bioquímica,
está creciendo una nueva tecnología denominada MicroSistema de
Análisis Total (\mu-TAS), el Laboratorio sobre los
chips, en el que se emplea semejante micromaquinaria para llevar a
cabo una serie completa de etapas analíticas químicas/bioquímicas de
extracción de uno o varios componentes que se van a analizar de
muestras biológicas (etapa de extracción), análisis del componente o
de los componentes con una o varias reacciones químicas/bioquímicas
(etapa de análisis), y posterior separación (etapa de separación) y
detección (etapa de detección) utilizando un dispositivo analítico
muy pequeño integrado en un chip que tiene cada lado de unos pocos
centímetros a diez centímetros de longitud.
Se espera que los procedimientos de
\mu-TAS hagan una gran contribución al ahorro del
tiempo de análisis, la reducción de las cantidades de muestras que
se van a utilizar y los reactivos para las reacciones
químicas/bioquímicas y el espacio para el análisis en el curso de
todas las etapas analíticas químicas/bioquímicas.
Para la etapa de separación en
\mu-TAS, en particular, se han desarrollado
métodos electroforéticos capilares en los que se utiliza un capilar
(tubo fino) con un diámetro interno de menos de 1 mm que está hecho
de Teflon, sílice, o similar como material como columna de
separación para lograr la separación con las diferentes cargas de
las sustancias en un campo eléctrico de alta intensidad, y métodos
cromatográficos en columna capilar en los que se utiliza un capilar
similar para alcanzar la separación utilizando la diferencia de
interacción entre un portador en el medio de la columna y las
sustancias.
No obstante, los métodos electroforéticos
capilares necesitan un alto voltaje para la separación y tienen el
problema de la baja sensibilidad de detección debida al volumen
limitado del capilar en la zona de detección y también se ha
encontrado que estos son un problema ya que no son adecuados para la
separación de sustancias de elevado peso molecular, aunque sean
adecuados para la separación de sustancias de bajo peso molecular,
ya que la longitud del capilar para la separación está limitada en
la columna del capilar sobre un chip y de este modo el capilar no
puede tener una longitud suficiente para separar sustancias de
elevado peso molecular. Además, en los métodos cromatográficos en
columna capilar existe un límite para hacer más alto el rendimiento
del tratamiento de separación y también existe el problema de que
reducir el tiempo de tratamiento es difícil.
De este modo, recientemente se ha prestado
atención a un método para resolver los problemas descritos antes,
que comprende utilizar un fenómeno denominado fuerza
dielectroforética de manera que se produce una polarización
positiva y negativa en las sustancias situadas bajo un campo
eléctrico no uniforme, proporcionando de ese modo una fuerza
conductora de movimiento de sustancias [H. A. Pohl,
"Dieletrophoresis", Cambridge Univ. Press (1978); T. B. Jones,
"Electromechanics of Particles", Cambridge Univ. Press (1995),
y similares].
Se cree en la actualidad que estos métodos de
separación son el método de separación adecuado en
\mu-TAS desde los siguientes puntos de vista: (1)
se puede esperar una separación rápida a un voltaje aplicado bajo
sin que se requiera un voltaje elevado como en la electroforesis
capilar, ya que se pueden incrementar un campo eléctrico y su
gradiente hasta un grado extremo si se emplean electrodos con
micromaquinaria (micromecanizados), debido a que el grado de
fuerzas dielectroforéticas depende del tamaño y de las propiedades
dieléctricas de las sustancias (partículas) y es proporcional al
gradiente del campo eléctrico; (2) el aumento de la temperatura
debido a la aplicación del campo eléctrico se puede minimizar,
puesto que una zona de fuerte campo eléctrico se localiza en una
región significativamente pequeña, y se puede formar un campo
eléctrico de alta intensidad; (3) en cuanto a la fuerza
dielectroforética es una fuerza proporcional al gradiente de campo
eléctrico, se entiende que la fuerza es independiente de la
polaridad aplicada, y de este modo funciona bajo un campo eléctrico
AC de un modo similar a un campo eléctrico D.C., y por lo tanto si
se emplea una alta frecuencia A.C., se puede suprimir la reacción
en el electrodo (reacción electrolítica) en una solución acuosa, de
manera que los propios electrodos puedan ser integrados en el canal
(ruta de flujo de la muestra); (4) se puede esperar una mejora en
la sensibilidad de detección, puesto que no existe restricción al
volumen de la cámara del componente de detección a diferencia de la
electroforesis capilar, y
similares.
similares.
La dieletroforesis nombrada en la presente
memoria es un fenómeno en el que las partículas neutras se mueven
dentro de un campo eléctrico no uniforme, y la fuerza que se ejerce
sobre las moléculas se denomina fuerza dielectroforética. La fuerza
dielectroforética se divide en dos fuerzas, esto es, una fuerza
dielectroforética positiva en la que las sustancias se mueven hacia
un campo eléctrico de alta intensidad, y una fuerza
dielectroforética negativa en la que las sustancias se mueven hacia
un campo eléctrico de baja intensidad.
El método del momento de dipolo equivalente es
un procedimiento de análisis de las fuerzas dielectroforéticas que
sustituye cargas inducidas por un dipolo eléctrico equivalente.
Según este método, la fuerza dielectroforética F_{d} que actúa
sobre una partícula esférica con un radio a que se sitúa en el campo
eléctrico E está dada por:
(1)F_{d} = 2
\pi a^{3}\varepsilon mRe[K_{\text{*}}(\omega)]\nabla
>(E^{2})
donde
K_{\text{*}}(\omega) representa la utilización de una
frecuencia angular del voltaje aplicado \omega y la unidad
imaginaria j como
sigue:
(2)K_{\text{*}}(\omega) =
\varepsilon_{p*} - \varepsilon_{m} * / \varepsilon_{p}
*+2\varepsilon_{m}*
\hskip0,7cm
(3)\varepsilon_{p}* =
\varepsilon_{p} - j\sigma_{p}/\omega, \varepsilon_{m} * =
\varepsilon_{m} -
j\sigma_{p}/\omega
donde \varepsilon_{p},
\varepsilon_{m}, \sigma_{p}, y \sigma_{m} son la
permisividad y la conductividad de la partícula y la solución, y
las cantidades de complejo se indican mediante
*.
La ecuación (1) indica que en el caso de
Re[K_{\text{*}}(\omega)] > 0, la fuerza
funciona de tal manera que atrae la partícula hacia un lado del
campo eléctrico fuerte (electroforética positiva, DEP positiva), y
en caso de Re[K_{\text{*}}(\omega)] < 0, la
fuerza funciona de tal manera que empuja la partícula hacia un lado
del campo eléctrico negativo (electroforética negativa, DEP
negativa).
Como resultará evidente a partir de las
Ecuaciones descritas antes, que se produzca la electroforesis
positiva en una cierta sustancia o que se produzca la
electroforesis negativa en ella es decidido por la interacción de
tres parámetros, esto es, 1) frecuencia de un campo eléctrico
aplicado, 2) conductividad y permisividad (constante dieléctrica)
del medio, y 3) conductividad y permisividad (constante dieléctrica)
de la sustancia.
Cuando estos parámetros cambian, incluso la
misma sustancia muestra una dielectroforesis positiva o una
dielectroforesis negativa. La dielectroforesis negativa es un
fenómeno en el que la sustancia se mueve hacia un campo eléctrico
de baja intensidad que tiene una débil densidad de línea de flujo
eléctrico mientras la dielectroforesis positiva se mueve hacia un
campo eléctrico de alta intensidad que tiene una elevada densidad de
línea de flujo eléctrico. La Fig 1 es una vista que explica la
dielectroforesis negativa. La fuerza dielectroforética negativa es
una fuerza para llevar las sustancias a un campo de manera que
disminuye cuando la densidad de la línea de flujo eléctrico es
recibida por la sustancia.
A veces, las sustancias se miden concentrándolas
en una zona en la que el campo eléctrico de un electrodo es débil
utilizando la dielectroforesis negativa como se ha descrito y
midiéndolas después por medio de la intensidad de fluorescencia o
similar. La detección de la intensidad de fluorescencia se lleva a
cabo irradiando una luz de excitación sobre la sustancia que se va
a medir para observar la luz fluorescente desde la superficie
superior del electrodo.
En ese momento, cuando se utiliza un electrodo
convencional, se plantea el problema de que la luz de excitación se
refleja incluso sobre el electrodo que está presente bajo la
sustancia que se va a medir, y de este modo la luz reflejada se
detecta como un fondo grande. Esto conduce al problema de la
reducción de la sensibilidad de la medida. Además, cuando se
utiliza un electrodo convencional, puesto que la luz no penetra a
través del electrodo, las sustancias concentradas (acumuladas)
sobre el electrodo no pueden ser detectadas por la absorbancia.
Adicionalmente, se contempla que la
dielectroforesis es un método de separación adecuado para
\mu-TAS. No obstante, considerando el caso de
aplicación de la dielectroforesis a \mu-TAS, es
extremadamente importante potenciar la capacidad de recogida.
Respecto a esto, todavía no se ha aprobado el aparato
dielectroforético convencional.
Esto es, si la capacidad de recogida de las
sustancias se potencia, se permite la separación en la región del
electrodo, y las sustancias se retienen eficazmente, por medio de lo
que se realiza la separación con una razón S/N (Señal/Ruido)
elevada. Adicionalmente, por ejemplo, concretamente, en el
fraccionamiento por flujo y campo para llevar a cabo la separación
mediante interacción de la fuerza dielectroforética y el arrastre
de fluido que ejerce sobre las sustancias, la separación en una
región del electrodo corto se puede realizar incluso a la misma
velocidad de
flujo.
flujo.
Del documento WO 98/28405, se conoce un sistema
de electrodos para jaulas de campo, especialmente microsistemas,
que comprende múltiples electrodos en los que cada zona terminal
puede ser sometida a un potencial eléctrico vía una zona de línea
de suministro. La zona terminal se diseña para formar la respectiva
jaula de campo y en campos de protección no homogéneos fuera de la
jaula de campo.
De la publicación "The dielectrophoretic
levitation of latest beads, with reference to
field-flow fractionation", J. Phys. D: Appl.
Phys. 30 (1997) 2470-2477, se conocen
microelectrodos interdigitados, que se han utilizado para
investigar la levitación dielectroforética pasiva de cuentas de
látex como una función de la frecuencia y el voltaje de la señal
eléctrica aplicada, la conductividad del medio suspensor, el tamaño
de las cuentas y las dimensiones características del electrodo.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un electrodo para el aparato dielectroforético que
reduce el fondo en el que la luz de excitación se refleja sobre un
electrodo que está presente bajo la sustancias (una molécula) y se
detecta para potenciar la razón S/N.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un electrodo para un aparato dielectroforético, que
puede ser detectado incluso mediante absorbancia.
El electrodo según la invención es definido por
las características de la reivindicación 1.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para separar sustancias y un método de
detección en el que se utiliza el electrodo anterior.
Para lograr los objetos anteriormente
mencionados, los autores de la presente invención han realizado
estudios con la mayor seriedad, como resultado de los cuales los
autores de la presente invención han pensado que se elimina un
electrodo en una zona en la que están concentradas (acumuladas) las
sustancias que se van a medir para posibilitar la reducción del
fondo ocasionado por el reflejo de una luz de excitación del
electrodo.
En el pasado, había muchas patentes y artículos
relacionados con un aparato y un método en el aparato de
cromatografía electroforética (Fraccionamiento de Flujo y Campo),
pero el aparato dielectroforético y el método que reduce el fondo
eliminando un electrodo que incluye una zona en la que se concentran
las sustancias que se van a medir para potenciar la razón S/N no
eran conocidos en absoluto, y semejante idea no se conocía en
absoluto.
La presente invención se caracteriza por formar
un espacio vacante en un electrodo, las sustancias sometidas a la
influencia de una fuerza dielectroforética negativa generada por la
aplicación de voltaje al electrodo se concentran en el espacio
vacante del electrodo, o en una posición por encima o por debajo del
espacio.
El espacio vacante está formado a partir de un
espacio hueco o formado de material que no refleja sustancialmente
la luz de excitación o deja pasar la luz hasta tal punto que es
capaz de medir la absorbancia. No obstante, el espacio vacante es
preferiblemente un espacio hueco.
El espacio en el que las sustancias sometidas a
la influencia de la fuerza dielectroforética negativa están
concentradas en un espacio en el que la densidad de la línea de
flujo eléctrico es baja para las sustancias.
Adicionalmente, completamente todas las
sustancias sometidas a la influencia de la fuerza dielectroforética
negativa se concentran preferiblemente en el espacio vacante, las
sustancias concentradas en el espacio vacante pueden ser una parte
de todas las sustancias.
La constitución del electrodo de la presente
invención se caracteriza por comprender un electrodo, y una tapa
proporcionada encima con el fin de formar un espacio entre la tapa y
dicha superficie del electrodo, estando formado el electrodo como
en el electrodo de la presente invención provisto de un espacio
vacante.
La constitución del electrodo de la presente
invención incluye un electrodo de la presente invención, un sustrato
(una placa base de electrodo) y una tapa. En el aparato
electroforético, se añaden al electrodo o a la constitución del
electrodo un dispositivo para aplicar un voltaje al electrodo y una
sección de detección.
Un método para fabricar un electrodo según la
presente invención caracterizado porque dicho espacio vacante está
formado por medios físicos o químicos.
El método de separación y el método de detección
según la presente invención se caracterizan por la utilización de
un electrodo de la presente invención provisto del espacio vacante,
un líquido que incluye las sustancias sometidas a la influencia de
la fuerza dielectroforética negativa generada por la aplicación de
voltaje al electrodo se sitúa en el electrodo o el espacio vacante
o en las proximidades del mismo, o hace que fluya por encima o por
debajo, por medio de lo cual las sustancias sometidas a la
influencia de la fuerza dielectroforética negativa se concentran
(acumulan) en el espacio vacante, o en la posición por encima o por
debajo del espacio.
El método de separación de la presente invención
puede ser utilizado para líquidos en los que están disueltas o
suspendidas dos o más clases de sustancias, pero preferiblemente,
las sustancias sometidas a la influencia de la fuerza de
dielectroforesis negativa concentrada en el espacio vacante o en una
dirección vertical del mismo son las sustancias granulares. En las
sustancias granulares pues, la zona en la que la densidad de la
línea de flujo eléctrico es baja y las sustancias granulares están
concentradas, tiende a ser el espacio vacante o una dirección
vertical del mismo.
El espacio vacante de la presente invención,
debe estar formado de tal manera que se pueda formar una zona en la
cual la densidad de la línea de flujo eléctrico es baja y las
sustancias granulares están concentradas en el espacio vacante o en
una dirección vertical del mismo cambiando el tamaño de las
sustancias sometidas a la influencia de la fuerza de
dielectroforesis negativa, y la anchura y la profundidad del
electrodo utilizado (la altura desde la superficie del electrodo
hasta la tapa o la altura desde la parte inferior del recipiente
hasta la superficie del electrodo) y se puede aplicar
frecuentemente.
No obstante, en particular, cuando las
sustancias que se van a medir están disueltas, por ejemplo, en un
líquido tal como agua, preferiblemente, las sustancias sometidas a
la influencia de la fuerza de dielectroforesis negativa están
unidas a las sustancias que se van a medir en la muestra por medio
de "sustancias que se unen a las sustancias que se van a
medir" para formar un complejo, y se aplica a la dielectroforesis
una sustancia de reacción que incluye el complejo.
Se indica que las sustancias que se van a medir
utilizadas en la presente invención representan sustancias
(moléculas) que se van a concentrar en la zona en la cual la
densidad de la línea de flujo eléctrico es baja, y necesitan ser
siempre objeto de medición.
Se describirá un aparato para potenciar la
capacidad de recogida de las sustancias en el que está presente un
líquido que contiene las sustancias que se van a separar en un campo
eléctrico no uniforme formado por un electrodo dielectroforético
para separar las sustancias por medio de la fuerza dielectroforética
que se ejerce sobre el sustrato.
Para lograr los objetos antes mencionados, los
autores de la presente invención realizaron estudios con la mayor
seriedad, como resultado de los cuales los inventores han
considerado que una placa base (sustrato) de entre los electrodos
es excavada para formar una parte más baja que el nivel del
electrodo por medio de lo cual se incrementa la región del campo
eléctrico no uniforme y el arrastre de fluido se reduce para
potenciar la capacidad de recogida.
En el pasado, había muchas patentes y artículos
relacionados con aparatos de separación y métodos para hacer uso de
la fuerza dielectroforética, concretamente, aparatos y métodos de
fraccionamiento de Flujo y Campo, pero no se conocían en absoluto
un aparato y un método que potenciaran la capacidad de recogida
formando "un sitio de nivel inferior que el nivel del
electrodo", y tal idea no se conocía en absoluto.
Se describe un aparato dielectroforético que
tiene un electrodo proporcionado sobre un sustrato, en el que se
forman medios para realizar un incremento de la región de campo
eléctrico no uniforme entre los electrodos.
Los medios para realizar un incremento de una
región del campo eléctrico no uniforme se caracterizan porque se
forman sitios de nivel inferior que el nivel del electrodo entre los
electrodos. Se forma un "sitio de nivel inferior que el nivel del
electrodo" por medio del cual se forman campos eléctricos no
solamente por encima entre los electrodos sino por debajo
incrementado así la región del campo eléctrico no uniforme, y
adicionalmente, cuando se utiliza por ejemplo el fraccionamiento de
Flujo y Campo, puesto que la velocidad de flujo del fluido en esos
sitios cae, el arrastre de fluido se reduce para intensificar la
capacidad de recogida de las sustancias.
Para formar "sitios de nivel inferior que el
nivel de los electrodos", se puede excavar una placa base
(sustrato) entre los electrodos por medios físicos y/o químicos
para formar el sitio de nivel inferior que el nivel del electrodo
entre los electrodos. Los medios físicos nombrados en la presente
memoria, son, por ejemplo, un método de excavación en el que se
utiliza un cuchillo adecuado o similar, por ejemplo, un método LIGA
(del alemán Lithographile Galvanoformung Abformung "Litografía,
Galvanoplastia y Moldeado") utilizando una luz radiante
sincrotrón. Adicionalmente, el método químico consiste en grabar
para excavar una placa base utilizando un grabado líquido para la
placa base. Adicionalmente, por ejemplo, se puede excavar una placa
base mediante grabado utilizando plasma de un gas de reacción
[grabado por iones reactivos (RIE)] formado mediante el suministro
de una potencia de alta frecuencia, en la que la excavación física y
la excavación química se realizan al mismo tiempo. Se observa que
los métodos descritos antes se pueden combinar apropiadamente para
llevar a cabo la excavación de la placa base.
Adicionalmente, un método de separación según la
presente invención es un método de separación de sustancias en las
que un líquido que contiene las sustancias que se van a separar está
presente en un campo eléctrico no uniforme formado por el electrodo
dielectroforético, y la separación se lleva a cabo debido a la
diferencia en la fuerza dielectroforética que se ejerce sobre las
sustancias caracterizada porque se realiza un incremento de la
región del campo eléctrico no uniforme por medio de espacios a nivel
inferior que el nivel del electrodo formados entre (o en medio de)
los electrodos, para potenciar de ese modo la capacidad de
recogida.
La dielectroforesis (DEP) mencionada en la
presente memoria es un fenómeno en el que una partícula neutra se
mueve en un campo eléctrico no uniforme por la interacción de la
conductividad y la constante dieléctrica de las sustancias, la
conductividad y la constante dieléctrica del medio, y la frecuencia
aplicada, y una fuerza que actúa sobre la partícula que se denomina
fuerza dielectroforética. La fuerza dielectroforética se divide en
dos clases, esto es, una fuerza dielectroforética positiva en la
cual las sustancias se mueven hacia el campo eléctrico de alta
intensidad, y una fuerza dielectroforética negativa en la cual las
sustancias se mueven hacia el campo eléctrico de baja
intensidad.
A continuación, se describirá un caso en el que
se ejerce una fuerza dielectroforética positiva sobre una
molécula.
A saber, como se muestra en la Figura 2, una
molécula neutra situada en un campo eléctrico tiene una carga de
polarización inducida positivamente +q aguas abajo del campo
eléctrico y una carga de polarización inducida negativamente -q
aguas arriba del campo eléctrico, respectivamente, de este modo +q
recibe una fuerza de +qE del campo eléctrico E y esta porción es
arrastrada aguas arriba en el campo eléctrico. Si la molécula es
neutra, +q y -q tienen un valor absoluto igual, y si el campo
eléctrico es uniforme con independencia de las posiciones, ambas
fuerzas recibidas están equilibradas, por lo tanto la molécula no se
mueve. No obstante, en el caso en el que el campo eléctrico no es
uniforme, la fuerza atractiva hacia un campo eléctrico fuerte se
hace mayor, de este modo la molécula es dirigida hacia el lado
fuerte del campo eléctrico.
Como se ha descrito antes, la molécula en
solución se mueve de forma variable en un campo eléctrico según la
fuerza dielectroforética generada en la molécula. No obstante, por
ejemplo, en el Fraccionamiento de Flujo y Campo, el movimiento de
las moléculas está regido por tres factores: la fuerza
dielectroforética F_{d}, la fuerza F_{v} generada por el
arrastre debido al flujo en la ruta de flujo, y la fuerza F_{th}
debida al movimiento térmico. \ding{172} en el caso de F_{d}
>> F_{v} + F_{th}, las moléculas son capturadas
(atrapadas) sobre el electrodo, \ding{173} en el caso de F_{d}
<< F_{v} + F_{th}, las moléculas son eluidas con el flujo
en la ruta de flujo, con independencia del campo eléctrico.
\ding{174} en el caso de F_{d} \fallingdotseq F_{v} +
F_{th}, las moléculas son llevadas hacia abajo con una adsorción y
desorción repetitiva sobre el electrodo, de manera que las
moléculas llegan a la salida con retraso, con relación al flujo
ajustado en la ruta de flujo.
En la presente invención, puesto que una porción
entre los electrodos está excavada profundamente por medio de la
cual se forma un campo eléctrico no uniforme por debajo entre los
electrodos, la región del campo eléctrico no uniforme aumenta y el
flujo de fluido en esa porción se vuelve lento para reducir la
fuerza de arrastre F_{v} del fluido, por medio de lo cual F_{d}
se vuelve adicionalmente más grande en la condición \ding{172}
como se ha descrito antes y F_{v} se vuelve más pequeño
intensificando de este modo la velocidad de recogida.
Adicionalmente, las partículas atrapadas en el campo eléctrico
formado por debajo entre los electrodos son difíciles de hacer
fluir hacia afuera puesto que las partículas están situadas en
"sitios de nivel inferior al nivel del electrodo".
El objeto anterior y otros objetos y ventajas de
la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente
descripción.
La Fig. 1 es un vista explicativa de la
dielectroforesis negativa.
La Fig. 2 es una vista que muestra el principio
de la dielectroforesis positiva.
La Fig. 3 es una vista en el plano que muestra
una realización de un electrodo de la presente invención.
La Fig. 4 es una vista en el plano que muestra
una realización adicional de un electrodo de la presente
invención.
La Fig. 5 es una vista en el plano que muestra
otra realización de un electrodo de la presente invención.
La Fig. 6 es una vista en el plano que muestra
un ejemplo de un electrodo convencional.
La Fig. 7 es una vista en el plano que muestra
un ejemplo adicional de un electrodo convencional.
La Fig. 8 es una vista en el plano que muestra
otro ejemplo de un electrodo convencional.
La Fig. 9 es una vista en el plano que muestra
otro ejemplo de un electrodo convencional.
La Fig. 10 es una vista en el plano que muestra
otro ejemplo de un electrodo convencional.
La Fig. 11 es una vista en el plano que muestra
otro ejemplo más de un electrodo convencional.
La Fig. 12 es una vista explicativa del caso en
el que la medida de la fluorescencia se realiza según el método de
la presente invención, (A) mostrando el caso en el que la unidad de
medida de la fluorescencia es proporcionada encima, (B) mostrando
el caso en el que la unidad de medida de la fluorescencia es
proporcionada debajo.
La Fig. 13 es una vista en el plano que muestra
un electrodo de la presente invención preparado en el Ejemplo
1.
La Fig. 14 es respectivamente, una vista en el
plano (A) y una vista en sección (B) que muestra una realización
adicional de la presente invención.
La Fig. 15 es una vista en sección que muestra
un ejemplo de "sitios de nivel inferior que el nivel del
electrodo" de la presente invención formado mediante grabado
isotrópico (A), grabado anisotrópico (B), y RIE o LIGA (C).
La Fig. 16 es una vista en el plano que muestra
un electrodo utilizado en la presente invención.
La Fig. 17 es una vista en sección de un aparato
de cromatografía dielectroforética.
La Fig. 18 es una vista en sección que muestra
un ejemplo de formación de un "sitio de nivel inferior que el
nivel del electrodo" sobre en una placa base (sustrato) según el
método de la presente invención.
La Fig. 19 es un gráfico que muestra una
relación entre el tiempo de grabado y la profundidad de un surco
medida en el Ejemplo 3.
La Fig. 20 es un gráfico que mide la velocidad
de recogida con respecto a la proteína seralbúmina bovina (BSA),
utilizando el aparato de cromatografía dielectroforética según la
presente invención y el aparato de cromatografía dielectroforética
convencional.
La Fig. 21 es un gráfico que mide la velocidad
de recogida con respecto a ADN de 500 pb, utilizando el aparato de
cromatografía dielectroforética según la presente invención y el
aparato de cromatografía dielectroforética convencional.
A continuación se describirán las realizaciones
preferidas de la presente invención.
A continuación se describirá la invención con
detalle.
La Fig. 3 es una vista en el plano que muestra
una realización de un electrodo para el aparato dielectroforético
de la presente invención, que muestra un ejemplo en el que se forma
un espacio hueco (un espacio vacante) 12 en una porción 13 sobre la
cual están concentradas las sustancias (sustancias que se van a
medir) sometidas a la influencia de una fuerza dielectroforética
negativa generada por un electrodo 11 que tiene muchas porciones
hexagonales asociadas.
El espacio hueco 12 está formado con el fin de
formar una zona que tiene una baja densidad de línea de flujo
eléctrico en la cual las sustancias que se van a medir pueden estar
concentradas en el espacio hueco 12 o en una dirección vertical del
mismo. La zona que tiene una baja densidad de línea de flujo
eléctrico es una zona que tiene una densidad de línea de flujo
eléctrico menor que la de un electrodo en la circunferencia, y en
general, una zona que tiene la densidad más baja de línea de flujo
eléctrico. El tamaño del espacio hueco 12 es diferente dependiendo
de la clase y el tamaño de las sustancias que se van a medir, la
distancia entre la placa base del electrodo y un vidrio de
protección (profundidad) o similar, pero se forma generalmente para
que sea más grande que el espacio 13 sobre el cual se concentran las
sustancias que se van a medir cuando el espacio hueco no está
formado. El espacio hueco 12 puede estar comunicado como se muestra
en la Fig. 3 o cada porción hexagonal puede ser independiente como
se muestra en la Fig. 4.
En el espacio hueco 12, toda la circunferencia
puede estar rodeada por el electrodo o puede estar presente la
rotura 14 en una parte como se muestra en la Fig. 3, pero
preferiblemente, toda la circunferencia puede estar rodeada por el
electrodo.
Cuando toda la circunferencia del espacio
vacante está rodeada por el electrodo, se generan líneas de flujo
eléctrico desde la circunferencia del espacio vacante, y por lo
tanto, el espacio vacante va a estar rodeado por una región de
campo eléctrico de alta intensidad de manera que las sustancias
tienden a concentrarse en una porción específica y pueden ser
recogidas fácilmente.
Por otra parte, cuando un espacio del espacio
vacante no está rodeado por el electrodo, no se genera ninguna
línea de fuerza eléctrica desde esa porción, y por lo tanto, se
genera una porción que no es una región de campo eléctrico de alta
intensidad, y las sustancias pueden ser movidas fácilmente a través
de esa porción. Por lo tanto, existe un caso en el que es difícil
recoger la sustancia deseada.
Como el tamaño de las sustancias (partículas,
moléculas) que se van a concentrar sobre el espacio hueco es
pequeño, se debe prestar atención a la anchura del electrodo. Ya que
la zona por encima del electrodo será una porción que tenga una
densidad de línea de flujo eléctrico más baja para la sustancia que
el espacio hueco. La razón del por qué es que puesto que también se
genera una línea de flujo eléctrico desde un margen del electrodo
en contacto con el espacio hueco, el grado de influencia causado por
la línea de flujo eléctrico generada a partir de un margen del
electrodo en contacto con el espacio hueco es diferente dependiendo
del tamaño de la sustancia. Cuando las sustancias que se van a
concentrar sobre el espacio hueco son pequeñas, se puede resolver
este problema estrechando la anchura del electrodo que tiene el
espacio hueco.
La forma del electrodo y el espacio hueco puede
ser un círculo, un óvalo o un polígono, cuya forma no está
particularmente restringida. Asimismo, la anchura del propio
electrodo puede ser más amplia o delgada como un alambre. En
resumen, se puede emplear la construcción de un electrodo de manera
que no se encuentre presente un electrodo en la zona en la que se
concentran objetos detectados sometidos a la fuerza
dielectroforética negativa, y en una dirección vertical de la
misma.
Incluso desde la misma construcción del
electrodo, aparece una diferencia en la región en la que los objetos
medidos se concentran debido al cambio de la frecuencia del campo
eléctrico aplicado, y la conductividad y la constante dieléctrica
del objeto medido y el medio, la construcción del electrodo puede
ser decidida según la frecuencia del campo eléctrico aplicado según
el objeto que se utilice. Por el contrario, las sustancias que se
van a medir pueden ser concentradas en la posición deseada variando
la frecuencia o similar ajustándose a la construcción del
electrodo.
Preferiblemente, el espacio hueco 12 puede ser
formado en el electrodo, por ejemplo, por medios físicos tales como
un método de corte utilizando, por ejemplo, un cuchillo adecuado o
similar y el método de impresión en relieve ("embossing"),
medios químicos tales como el grabado para separar un electrodo, por
ejemplo, utilizando un líquido de grabado, o por ejemplo, mediante
medios físicos y químicos tales como el Grabado por Iones Reactivos
(RIE) utilizando un gas reactivo formado en plasma mediante el
suministro de energía de alta frecuencia, etcétera.
El electrodo formado con el espacio vacante 12
de la presente invención se prepara preferiblemente, por ejemplo,
mediante una técnica de tratamiento fina (Biochim. Biophys. Acta.
964, 231-230 etcétera) como se describe más
abajo:
- (A)
- Por ejemplo, se aplica como recubrimiento un "resist" (capa de protección) sobre una placa base que tiene cobre, oro, aluminio o similar sobre ella, y se lamina sobre el resist un electrodo fotomáscara. Después, se irradia luz para exponer y revelar el resist para disolver el resist correspondiente a un espacio vacante y una porción distinta del electrodo, que después es sumergido en un líquido de grabado para aplicar el grabado a la superficie del electrodo (superficie de aluminio), y el resist que queda sobre la superficie del electrodo se separa. Se observa que el resist puede ser un resist positivo para separar una porción expuesta a la luz o un resist negativo para separar una porción no expuesta.
- (B)
- Método de "levantamiento" (lift off)
- Después de que el resist se haya aplicado como recubrimiento sobre la placa base, se lamina un electrodo Photomask sobre el resist, a lo que se aplica la exposición. Después se lleva a cabo el revelado para separar un resist correspondiente a una porción del electrodo, y se lamina el material del electrodo sobre toda la superficie superior mediante depósito de vapor o pulverización de iones. Después, se separa un resist correspondiente a una porción distinta del electrodo y un espacio vacante (un electrodo está laminado sobre la superficie superior).
- (C)
- Método de la máscara de metal
- Una máscara de metal con solamente la porción del electrodo aplicada con vaciado es laminada sobre la placa base, sobre la cual la superficie superior está recubierta con un material de electrodo mediante depósito de vapor o pulverización de iones. Después, se separa la máscara de metal (un material de electrodo es laminado sobre la superficie superior).
En la presente invención, un electrodo está
hecho de materiales conductores tales como, por ejemplo, aluminio,
oro, cobre y similares. Su estructura puede ser cualquier estructura
capaz de ocasionar fuerzas dielectroforéticas, esto es, formar un
campo eléctrico no uniforme horizontal y verticalmente, incluyendo,
por ejemplo, una forma interdigitada (J. Phys. D: Appl. Phys. 258,
81-89 (1992); Biochim. Biophys. Acta., 964,
221-230 (1988), y similares].
El electrodo de la presente invención está
formado, preferiblemente, sobre la superficie superior y/o la
superficie inferior de la placa base (sustrato). Normalmente,
puesto que el líquido que contiene la sustancia que se va a medir
se hace fluir por encima del electrodo, se utiliza el electrodo
formado sobre la superficie de la placa base. No obstante, un
electrodo se coloca en un estado en el que flota en un hueco, y el
líquido que contiene la sustancia que se va a medir se puede hacer
fluir por debajo del electrodo. En este caso, se utiliza un
electrodo formado sobre la superficie inferior de la placa base o
sobre la superficie tanto superior como inferior de la placa
base.
Los electrodos utilizados en la presente
invención incluyen, por ejemplo, un electrodo de una conformación
que tiene muchos electrodos de la misma forma (hexágono) asociados,
como se muestra en las Figs. 3 y 4, y un electrodo formado de
manera que se proporcionan un cátodo y un ánodo internamente y
externamente, respectivamente, y las porciones longitudinal o
lateral se elaboran de lo mismo o algo diferente, como se muestra en
la Fig. 5.
Puesto que el electrodo mostrado en las Figs. 3
y 4, pueden formar regiones dielectroforéticas negativas no
solamente en un lugar si no en diversos lugares, se pueden preparar
espacios huecos que tienen una zona que tiene una baja densidad de
la misma línea de flujo eléctrico, por medio de lo cual se mide la
intensidad fluorescente de diversos lugares y se promedian para
obtener de ese modo datos con exactitud.
Adicionalmente, en un electrodo provisto de un
cátodo y un ánodo internamente y externamente, respectivamente,
como se muestra en la Fig. 5, existe un lugar de medición, pero
puesto que el espacio requerido es pequeño, eso puede contribuir a
la integración de la medición de muchos objetos examinados.
Otros ejemplos concretos de electrodos como los
mostrados en las Figs. 3 y 4 incluyen una conformación en la que
muchas partes que se proyectan hacia afuera triangulares están
asociadas en una relación espaciada opuesta a la porción superior o
inferior de una red lineal como se muestra en la Fig. 6, una
conformación en la que muchas partes que se proyectan hacia afuera
trapezoidales están asociadas en una relación espaciada opuesta a
una porción superior o inferior de una red lineal como se muestra en
la Fig. 7, una conformación en la que muchos hexágonos están
asociados linealmente como se muestra en la Fig. 8, una conformación
en la que muchas partes que se proyectan hacia afuera cuadradas en
una relación espaciada opuesta a una porción superior o inferior de
una red lineal como se muestra en la Fig. 9, y una conformación en
la que muchas partes que se proyectan hacia afuera semicirculares
están asociadas en una relación espaciada opuesta a una porción
superior o inferior de una red lineal como se muestra en la Fig. 10.
Si bien en (A) y (B) en las Figs. 6 a 10, las conformaciones de los
extremos son diferentes, cualquiera de ellas puede ser
suficiente.
Adicionalmente, otros ejemplos concretos de
electrodos como los que se muestran en la Fig. 5 incluyen, por
ejemplo, como se muestra en las Figs. 11(A) a (G), electrodos
en los que se forma un ánodo externo que es un polígono tal como un
cuadrado y un octógono, un círculo, un semi-círculo,
y un óvalo; y como cátodo interno, se forma una cabeza catódica
localizada en la parte central del cátodo para que sea un polígono
tal como un cuadrado o un octógono, círculo o similar. En la
presente invención, se puede utilizar cualquier electrodo con tal
que se pueda utilizar el propio electrodo para la dielectroforesis
para formar un espacio hueco, y la clase de electrodos no está
restringida.
La placa base (sustrato) utilizada cuando se
prepara un electrodo no está particularmente restringida si se
puede utilizar en este campo, y se prefiere una placa base formada
de un material no conductor, por ejemplo, tal como vidrio,
plástico, cuarzo, silicio o similar.
La placa base puede estar formada por un
material transparente, pero el material no necesita ser siempre un
material transparente si la luz de excitación no se refleja
sustancialmente, o la luz penetra hasta tal punto que es capaz de
medir la absorbancia.
El electrodo puede ser similar a los de la
técnica anterior excepto por la formación del espacio vacante, y se
puede formar una capa orgánica sobre el electrodo para evitar la
adsorción de diversos materiales sobre el electrodo.
Para fabricar el aparato electroforético en el
que se utiliza el electrodo de la presente invención formado con el
espacio vacante como se ha descrito antes, se pueden formar de una
manera similar a la técnica anterior aquellos distintos del
electrodo.
Para incorporar el método de separación de la
presente invención en el que se utiliza el electrodo y el aparato
dielectroforético de la presente invención formado con el espacio
vacante como se ha descrito antes, se puede llevar a cabo el propio
método de separación de una manera similar a la técnica
anterior.
Esto es, se coloca un líquido que contiene las
sustancias que se van a separar, un líquido en el que están
disueltas o suspendidas dos o más clases de sustancias (moléculas o
partículas) en presencia de un campo eléctrico no uniforme formado
utilizando el electrodo descrito antes, y la separación se puede
completar debido a la diferencia en la fuerza dielectroforética que
se ejerce sobre las sustancias. Se observa que el campo eléctrico
aplicado en la presente invención puede ser o bien un campo
eléctrico CC o bien un campo eléctrico CA, pero se prefiere un
campo eléctrico CA.
En el método de separación de la presente
invención, las sustancias granulares de 100 nm a 100 \mum se
concentran fácilmente en una zona que tiene una densidad de línea
de flujo eléctrico inferior. Por eso las sustancias granulares que
tienen un tamaño hasta cierto punto se pueden concentrar fácilmente
sobre un electrodo que tiene una zona que tiene una baja densidad
de línea de flujo eléctrico en la que se concentran las sustancias
que se van a medir en el espacio vacante y en una posición por
encima o por debajo del espacio. No obstante, es posible, incluso
cuando las sustancias que se van a separar o medir son partículas o
moléculas pequeñas, constituir un electrodo capaz de formar una
zona que tenga una baja densidad de línea de flujo eléctrico en las
direcciones superior e inferior del espacio vacante estrechando la
anchura de un electrodo o aumentando la profundidad (la distancia
entre la placa base del electrodo y el vidrio de protección y/o la
distancia entre la parte inferior del recipiente y el electrodo).
En resumen, puesto que la influencia de la línea de flujo eléctrico
recibida por las partículas es diferente según el tamaño de las
partículas, cuando se aplica al método de separación de la presente
invención una partícula que tiene el tamaño hasta cierto punto, se
puede formar fácilmente un electrodo en el que se concentran las
partículas en el espacio vacante o en las direcciones superior e
inferior del mismo.
Por consiguiente, para separar moléculas o
partículas pequeñas, que son materiales medidos, en una solución de
moléculas o una suspensión de partículas pequeñas, se somete un
complejo en el que las sustancias que se van a medir (por medio de
"sustancias que se unen a las sustancias que se van a medir",
si fuera necesario) se unen a las sustancias sometidas a la
influencia de la fuerza dielectroforética negativa, preferiblemente,
sustancias granulares que tienen el tamaño de 100 nm a 100 \mum
al método de separación utilizando una dielectroforesis. Esto es,
por el hecho de que si el tamaño de las partículas es demasiado
pequeño, se necesita que la anchura del electrodo sea
extremadamente estrecha.
Las sustancias granulares se unen como se ha
descrito antes por medio de lo cual las sustancias se agrandan, y
así, se facilita la separación de las sustancias que se van a medir.
Por consiguiente, las sustancias granulares funcionan como
sustancias para potenciar la separación.
La sustancia granular utilizada en la presente
invención incluye óxidos metálicos inorgánicos tales como sílice y
alúmina; metales tales como oro, titianio, hierro, y níquel; óxidos
de metales inorgánicos y similares que tienen grupos funcionales
introducidos mediante procedimientos de acoplamiento de silano y
similares; seres vivos tales como diversos microorganismos y
células eucarióticas; polisacáridos tales como agarosa, celulosa,
dextrano insoluble; compuestos macromoleculares sintéticos tales
como látex de poliestireno, copolímero de
estireno-butadieno, copolímero de
estireno-metacrilato, copolímero de
acroleína-dimetacrilato de etilenglicol, látex de
estireno-estirenosulfonato, poliacrilamida,
polimetacrilato de glicidilo, partículas recubiertas con
poliacroleína, poliacrilonitrilo entrecruzado, copolímero acrílico o
de éster acrílico, acrilonitrilo-butadieno, cloruro
de vinilo-éster
acrílico-poli(acetato-acrilato)
de vinilo; moléculas biológicas relativamente grandes tales como
eritrocitos, azúcares, ácidos nucleicos, proteínas y lípidos, y
similares.
Las "sustancias granulares" están unidas
normalmente a "sustancias que se unen a las sustancias que se van
a medir" para su uso. Haciendo esto, se pueden unir a la
"sustancia que se va a medir" de una muestra. Sin embargo, la
sustancia granular se puede unir directamente a la sustancia que se
va a medir mediante un método de unión química, por ejemplo, tal
como un método para la introducción de un grupo funcional en la
superficie de la sustancia granular y después de eso unión a través
del grupo funcional, o un método de unión de la sustancia granular
a la sustancia que se va a unir a través de un ligador.
Adicionalmente, para unir la sustancia granular
a la "sustancia que se une a la sustancia que se va a medir",
se puede emplear un método similar al método para marcar la
sustancia medida por medio de una sustancia marcadora descrita más
adelante.
Cuando se utiliza una sustancia que tiene
propiedades capaces de unirse específicamente a la sustancia que se
va a medir directamente como sustancia granular, la operación
descrita antes es innecesaria. El material granular descrito
incluye, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, lípidos
etcétera.
La "sustancia que se une a la sustancia que se
va a medir" utilizada en la presente invención se une a la
sustancia granular utilizada para formar un complejo de la sustancia
que se va a medir, la "sustancia que se une a la sustancia que se
va a medir", y la sustancia granular de la sustancia que se va a
medir en una muestra, y no se puede formar sustancialmente un
complejo de una molécula distinta de la sustancia que se va a
medir, la "sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir" y la sustancia granular, lo que no está particularmente
restringido. En resumen, incluso si se une a las sustancias
distintas de la sustancia que se va a medir, será suficiente si
aquella no puede formar el complejo de tres sustancias mencionado
antes. No obstante, actualmente se prefiere utilizar la
"sustancia que se une específicamente a la sustancia que se va a
medir".
La "sustancia que se une a la sustancia que se
va a medir" hace referencia a una sustancia que se une a "la
sustancia que se va a medir" mediante interacciones tales como
una reacción "antígeno"-"anticuerpo", una reacción
"cadena azucarada"-"lectina", una reacción
"enzima"-"inhibidor", una reacción
"proteína"-"cadena peptídica", y una reacción
"cromosoma o cadena de nucleótidos"-"cadena de
nucleótidos". Si una de las parejas es la sustancia que se va a
medir en cada una de las combinaciones descritas antes, la otra es
una "sustancia que se une a la sustancia que se va a medir"
descrita antes.
Para formar un complejo de unión de la sustancia
que se va a medir en una muestra con la sustancia granular
directamente o a través de "la sustancia de unión a la sustancia
que se va a medir", una muestra que contiene la sustancia que se
va a medir, la sustancia granular y, si fuera necesario la
"sustancia que se une a la sustancia que se va a medir", se
disuelven, se dispersan o se suspenden respectivamente en agua o un
líquido tampón, por ejemplo, tal como tampones
tris(hidroximetilaminometano), tampón de Good, un tampón
fosfato, tampón borato en un material líquido, y estos materiales
líquidos se pueden mezclar y poner en contacto entre sí.
El método de separación de la presente invención
se divide aproximadamente en dos métodos como sigue:
Método de separación
1
Primero, cuando la sustancia que se va a medir,
o el complejo de la sustancia sometida a la influencia de la fuerza
dielectroforética negativa (sustancia para potenciar la separación)
y la sustancia que se va a medir (por medio de la "sustancia que
se une a la sustancia que se va a medir", si es necesario)
muestra la misma fuerza dielectroforética negativa que la de la
sustancia distinta de la sustancia que se va a medir, en el caso de
la sustancia que se va a medir o el complejo que muestra una fuerza
dielectroforética mayor que la de la sustancia distinta de la
sustancia que se va a medir, solamente sustancialmente la sustancia
que se va a medir, o la sustancia para potenciar la separación y el
complejo de la sustancia para potenciar la separación y la
sustancia que se va a medir reciben una gran fuerza
dielectroforética y se separan.
Esto es, por ejemplo, ajustando adecuadamente la
intensidad del campo eléctrico y las condiciones del medio de tal
manera que la sustancia que se va a medir o la sustancia del
complejo de la sustancia sometida a la influencia de la fuerza
dielectroforética negativa y la sustancia que se va a medir (por
medio de la "sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir", si fuera necesario) se concentren en el espacio vacante
por encima del electrodo dielectroforético o en las direcciones
superior e inferior del mismo, pero que las sustancias distintas de
la sustancia que se va a medir no se concentren, esta sustancia que
se va a medir y la sustancia distinta de la sustancia que se va a
medir se pueden separar.
El método de la presente invención es adecuado
para la separación en un estado sin flujo. No obstante, se puede
utilizar el denominado aparato de cromatografía dielectroforética
(aparato de Fraccionamiento por Flujo y Campo) que lleva a cabo la
separación mediante la interacción de la fuerza dielectroforética
generada en las moléculas por el campo eléctrico y el movimiento de
las moléculas, para llevar a cabo la separación. En este caso,
ajustando adecuadamente la velocidad de flujo (la velocidad se hace
más lenta) de tal manera que solamente la sustancia que se va a
medir o el complejo de la sustancia sometida a la influencia de la
fuerza dielectroforética negativa y la sustancia que se va a medir
(por medio de la "sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir", si fuera necesario) es recogida en el espacio vacante del
electrodo o en las direcciones superior e inferior por medio de la
fuerza dielectroforética, se pueden separar estas sustancias que se
van a medir y las sustancias distintas de la sustancia que se va a
medir. En las condiciones en las que la sustancia atrapada en el
espacio hueco del electrodo o en las direcciones superior e inferior
del mismo no es movida por el flujo, se pueden aplicar muchas
muestras al espacio hueco del electrodo para la medición en el
flujo, aumentando de ese modo la sensibilidad de la medición.
Método de separación
2
Segundo, cuando la sustancia que se va a medir o
el complejo de la sustancia sometida a la influencia de la fuerza
dielectroforética negativa y la sustancia que se va a medir (por
medio de la "sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir", si fuera necesario) es sometida a la influencia de una
fuerza dielectroforética negativa diferente de las sustancias
distintas de la sustancia que se va a medir, esto es cuando la
sustancia que se va a medir o el complejo de la sustancia para
potenciar la separación (sustancia sometida a la influencia de la
fuerza dielectroforética negativa) y la sustancia que se va a medir
muestra una fuerza dielectroforética negativa y las sustancias
distintas de la sustancia que se va a medir muestran una fuerza
dielectroforética positiva, cualquiera de \ding{172} la sustancia
que se va a medir o el complejo de la sustancia que se va a medir y
la sustancia sometida a la influencia de la fuerza dielectroforética
negativa y \ding{173} la sustancia distinta de la sustancia que
se va a medir se mueve al espacio hueco o en las direcciones
superior e inferior del mismo mientras la otra se mueve a una
región del electrodo diferente por medio de lo cual la sustancia que
se va a medir se puede separar de las sustancias distintas de la
sustancia que se va a medir.
Cuando la sustancia que se va a medir separada
mediante el método de separación según la presente invención puede
ser detectada mediante un método según las propiedades poseídas por
la sustancia, se puede medir (detectar) la presencia o ausencia de
la sustancia que se va a medir contenida en una muestra.
Esto es, utilizando el electrodo según la
presente invención, la constitución del dielectrodo y el aparato
dielectroforético, un material líquido (muestra) que contiene la
sustancia sometida a la influencia de la fuerza dielectroforética
negativa generada mediante la aplicación de voltaje al electrodo [o
sustancia que se va a medir o complejo de la sustancia para
potenciar la separación y sustancia que se va a medir (por medio de
la "sustancia que se une a la sustancia que se va a medir, si
fuera necesario")] se localiza en el electrodo según la
presente invención, o el espacio vacante en las proximidades del
mismo, o se hace fluir por encima o por debajo del mismo, por medio
de lo cual las sustancias sometidas a la influencia de la fuerza
dielectroforética negativa están concentradas en el espacio
vacante, por encima o por debajo del mismo, y después de eso, la
sustancia que se va a medir en la muestra puede ser detectada
mediante detección óptica de la sustancia.
La sustancia que se va a medir en el método
descrito antes es aquella que se puede medir mediante cualquier
método óptico, o aquella que se puede marcar mediante una sustancia
de marcaje ópticamente detectable, o unida a la "sustancia que se
une a la sustancia que se va a medir" que se puede medir
(detectar), o aquella que se puede marcar mediante una sustancia de
marcaje ópticamente detectable.
En la presente invención, la sustancia que se va
a medir o la "sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir" puede ser marcada mediante una sustancia de marcaje
ópticamente detectable, y el propio marcaje se puede llevar a cabo
mediante un método de marcaje bien conocido llevado a cabo
generalmente en un método convencional utilizado generalmente en el
campo, por ejemplo, de EIA, RIA, FIA bien conocidos o un método de
hibridación.
Las sustancias de marcaje ópticamente
detectables que se pueden utilizar en la presente invención son
cualquiera de las sustancias utilizadas normalmente en la técnica
del inmunoanálisis enzimático (EIA), el fluoroinmunoanálisis (FIA),
los métodos de hibridación, y similares, y no están particularmente
limitadas. No obstante, es particularmente preferida la sustancia
de marcaje susceptible de ser detectada por la intensidad de
fluorescencia, la intensidad de emisión de luz o la
absorbancia.
En el método descrito antes, en cuanto a la
"sustancia que se une a la sustancia que se va a medir", se
utiliza una "sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir" que puede ser medida (detectada) mediante cualquier
método ópticamente detectable o que puede ser marcada mediante una
sustancia de marcaje ópticamente detectable.
Más concretamente, el método de detección según
la presente invención se puede llevar a cabo de la manera que se
describe más abajo.
La sustancia que se va a medir o el complejo de
la sustancia que se va a medir y la sustancia que potencia la
separación (si fuera necesario, por medio de la sustancia que se une
a la sustancia que se va a medir y/o la sustancia que se une a la
sustancia que se va a medir marcada con la sustancia de marcaje
ópticamente detectable) obtenidos haciendo reaccionar la sustancia
que se va a medir y la sustancia que potencia la separación (si
fuera necesario, y la sustancia que se une a la sustancia que se va
a medir y/o la sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir marcada por medio de la sustancia de marcaje ópticamente
detectable) y las sustancias distintas de la sustancia que se va a
medir (por ejemplo, la sustancia libre que se une a la sustancia
que se va a medir o la sustancia marcada libre para unirse a la
sustancia que se va a medir) se separan según el método de la
presente invención como se ha mencionado antes. A continuación, la
sustancia separada que se va a medir o el complejo separado se
detecta ópticamente basándose en las propiedades de la sustancia que
se va a medir o la sustancia que se une a la sustancia que se va a
medir (o la sustancia de marcaje que se une a la sustancia que se
une a la sustancia que se va a medir en el complejo) en el complejo
para medir la presencia o ausencia de la sustancia que se va a
medir en la muestra.
Adicionalmente, según la presente invención, no
solamente se puede detectar la presencia de la sustancia que se va
a medir en la muestra, si no que también se puede medir
cuantitativamente la cantidad de sustancia de la muestra. La
medición cuantitativa de la sustancia que se va a medir se puede
realizar de un modo similar a la técnica anterior donde no se forma
el complejo, y en caso de que se forme la sustancia compleja, se
puede emplear el siguiente método.
Esto es, la sustancia que se va a medir o el
complejo de la sustancia que se va a medir y la sustancia que
potencia la separación (si fuera necesario, por medio de la
sustancia que se une a la sustancia que se va a medir y/o la
sustancia marcada que se une a la sustancia medida) y las sustancias
distintas de la sustancia que se va a medir [por ejemplo, la
sustancia libre que se une a la sustancia que se va a medir (o la
sustancia marcada libre que se une a la sustancia que se va a
medir)] se separan según el método de separación de la presente
invención como se ha descrito antes. A continuación, se obtiene la
cantidad de sustancia separada que se va a medir o sustancia que se
une a la sustancia que se va a medir en el complejo (o la sustancia
de marcaje ópticamente detectable que se une a la sustancia que se
une a la sustancia que se va a medir en el complejo), o la cantidad
de sustancia libre que se une a la sustancia que se va a medir (o la
sustancia de marcaje ópticamente detectable que se une a la
sustancia marcada libre que se une a la sustancia que se va a
medir) mediante el método de medición óptica según estas
propiedades, y se puede obtener la cantidad de sustancia que se va
a medir en la muestra basándose en la cantidad
obtenida.
obtenida.
En el método descrito antes, con el fin de
obtener la cantidad de la sustancia que se va a medir en la muestra
basándose en las cantidades obtenidas de la sustancia que se va a
medir, la sustancia que se une a la sustancia que se va a medir o
la sustancia de marcaje, por ejemplo, se puede calcular la cantidad
de moléculas específicas en la muestra, utilizando una curva de
calibración que muestra la relación entre la cantidad de la
sustancia que se va a medir, y la cantidad de la sustancia que se
une a la sustancia que se va a medir en el complejo (o la sustancia
marcada que se une a la sustancia que se va a medir) o la cantidad
de la sustancia libre que se une a la sustancia que se va a medir
(o la sustancia de marcaje ópticamente detectable en la sustancia
marcada que se une a la sustancia que se va a medir), obtenida
llevando a cabo el mismo método de medición mencionado antes
excepto que se utiliza una muestra cuya concentración de la
sustancia que se va a medir es conocida.
Según la presente invención, la sustancia que se
va a medir (moléculas que se van a medir) se pueden concentrar en
el espacio hueco del electrodo o en direcciones superiores o
inferiores del mismo. Cuando la luz de excitación es irradiada
sobre las moléculas medidas concentradas, puesto que el electrodo no
está presente bajo las moléculas, no se detecta el fondo causado
por ser reflejado ni siquiera sobre el electrodo, en comparación con
el caso en el que se utiliza el electrodo convencional, como se
muestra en la Fig. 12(A). Como resultado, se intensifica la
razón S/N, en comparación con la técnica anterior y se intensifica
la sensibilidad de la medición.
Adicionalmente, si se utiliza el electrodo de la
presente invención, puesto que el electrodo no está presente bajo
las sustancias que se van a medir, se puede proporcionar un detector
fluorescente en el lado opuesto como se muestra en la Fig. 12 (B).
Adicionalmente cuando éste se proporciona en el lado opuesto, la
razón S/N se intensifica (efecto ranura) puesto que las partes
distintas de la región en la que se concentran las sustancias que
se van a medir están cubiertas por el electrodo, por medio de lo
cual en dichas partes la luz de excitación irradiada desde la
superficie superior no alcanza la superficie inferior, y por lo
tanto, se puede reducir el fondo.
Adicionalmente, según la presente invención,
puesto que la medición se puede realizar desde la superficie
inferior, se mide la absorbancia de las sustancias que se van a
medir, lo que hasta ahora era imposible, para permitir la medición
cualitativa (detección) y cuantitativa de las sustancias que se van
a medir.
En este caso, la razón S/N se intensifica
adicionalmente (efecto ranura) puesto que las partes distintas de
la región en la que se concentran las sustancias que se van a medir
está cubierta por el electrodo, por medio de lo cual en dichas
partes la luz no pasa a través del electrodo desde la superficie
superior a la superficie inferior, y por lo tanto, se puede reducir
el fondo adicionalmente.
La Fig. 14 muestra una realización de la
presente invención, que muestra un ejemplo en el cual el electrodo
3 está soportado en una relación espaciada longitudinalmente por un
miembro convexo 2 (una columna de soporte) sobre un sustrato (un
sustrato de vidrio) 1.
Se forma un "sitio de nivel inferior que el
nivel del electrodo" (un surco de comunicación) 4 que tiene una
sección semicircular entre los electrodos 3, 3, como se muestra en
la Fig. 14 (B), y los surcos de comunicación 4, 4 adyacentes entre
sí están comunicados en partes distintas del miembro convexo 2, como
se muestra en la Fig. 14 (A). Sin embargo, alternativamente, el
electrodo 3 está soportado por una pared (un miembro convexo) 2', y
los surcos 4', 4' adyacentes entre sí están aislados por la pared 2'
de manera que no estén comunicados, como se muestra en la Fig. 15
(B).
En las realizaciones mostradas en las Figs. 14 y
15, las porciones distintas de los miembros convexos 2 y 2' se
forman sobre el "sitio de nivel inferior que el nivel del
electrodo 3" (4 y 4').
No obstante, puede haber una porción cóncava
(hueco) única o plural en una relación espaciada proporcionada en
una parte entre los electrodos 3, 3, pero preferiblemente, toda o la
mayor parte de la porción entre o en medio de los electrodos se
forma en un sitio de nivel inferior que el electrodo (4 o 4') como
se muestra en las Figs. 14 y 15 para potenciar la capacidad de
recogida.
Cuando se forma la porción cóncava (hueco) en
una parte entre los electrodos 3, 3, preferiblemente, puede estar
formada en un espacio mínimo 5 entre los electrodos. Puesto que esta
porción tiene una alta intensidad de campo eléctrico, si la porción
cóncava (hueco) se forma en esta porción, la capacidad de recogida
se potencia adicionalmente. No obstante, si ésta se forma en la
totalidad que incluye esta porción, se puede potenciar
adicionalmente la capacidad de recogida, ya que la porción para
atrapar las moléculas aumenta.
La anchura del surco 4 (la misma que la
distancia entre los electrodos 3, 3 en el caso mostrado en las Figs.
14 y 15) se decide adecuadamente según el tamaño de las sustancias
como sustancias separadas por la dielectroforesis y se dice
absolutamente aunque produzca un gran efecto en la intensidad del
campo eléctrico. En las sustancias de un tamaño de micrometros, la
anchura es preferiblemente, 1 vez a 100 veces el diámetro de la
sustancia, más preferiblemente, 1 vez a 10 veces. Adicionalmente,
en el caso de una bio-molécula tal como una
proteína, un gen o similar, por ejemplo, tal como un péptido, una
proteína o similar, normalmente, la anchura es de 1 nm a 10 \muM,
preferiblemente 1 nm a 5 \mum. En el caso de una cadena de
nucleótidos (polinucleótido, oligonucleótido), normalmente, la
anchura es de 1 nm a 100 \mum, preferiblemente 1 nm a 50
\mum.
Generalmente, si la profundidad es mayor, la
porción para atrapar las moléculas aumenta. Adicionalmente, en
concreto, en el caso del fraccionamiento de Flujo y Campo, la
velocidad de flujo en la porción del surco se suprime para
potenciar la capacidad de recogida (tasa de recogida). Sin embargo,
si es demasiado profunda, cuando es necesario medir una molécula
atrapada sobre el electrodo mediante dielectroforesis, a veces la
molécula atrapada es difícil de liberar de la porción del surco o
no es liberada. Por consiguiente, la profundidad del surco es,
preferiblemente, 1/1.000 veces a 10 veces la anchura del surco, más
preferiblemente, 1/1.000 a 1 vez.
Con respecto a la profundidad del surco, si se
utiliza el grabado isotrópico para su formación como se muestra en
las Figs. 14 y 15, cuando el surco se elabora con más anchura que el
electrodo, el miembro convexo que sostiene el electrodo está
totalmente descubierto y por tanto el electrodo 3 se desprende. Por
consiguiente, cuando se forma el surco mediante este método, la
profundidad se ajusta a 1/2 o menos de la anchura máxima del
electrodo.
Cuando se utiliza el grabado anisotrópico de una
oblea de silicio para la formación, como se muestra en la fig.
15(B), el grabado solamente progresa en una dirección de la
profundidad con un ángulo de aproximadamente 55 grados. Por
consiguiente, cuando el grabado se realiza mediante este método,
resulta la distancia máxima en profundidad (la distancia entre los
electrodos \div 2) x 1,42 (tan 55 grados).
Como se muestra en la Fig. 15 (C), cuando la
formación se realiza mediante RIE o LIGA, el grabado progresa
sustancialmente de manera vertical. Por consiguiente, cuando se
realiza el grabado mediante estos métodos, la profundidad del surco
está en el intervalo descrito antes, esto es, preferiblemente,
1/1.000 veces a 10 veces, más preferiblemente 1/1.000 veces a 1
vez.
El espaciamiento del surco (= anchura del propio
electrodo) no resulta afectado por el objeto separado si se limita
a la separación mediante dielectroforesis positiva. Normalmente la
exactitud del procedimiento en la técnica de tratamiento fino es de
1 nm a 50 \mum, más preferiblemente de 1 nm a 10 \mum.
El surco por grabado isotrópico mostrado en la
Fig. 15 (A) está formado mediante grabado de una placa base de
vidrio o una placa base de plástico. En el grabado isotrópico, se
forman diferentes conformaciones según el grado de grabado tal como
el caso en el que el electrodo 3 es soportado por la pared 2 sobre
la placa base y los surcos 4, 4 adyacentes entre sí se forman de
manera que están aislados por la pared 2, o el caso en el que el
electrodo 3 está soportado por el miembro convexo 2 sobre la placa
base, y los surcos (surcos de comunicación) 4, 4 adyacentes entre
sí están comunicados.
El surco por grabado anisotrópico mostrado en la
Fig. 15 (B) se forma mediante grabado de una placa base de silicio.
En este caso, el electrodo 3 es soportado sobre la pared 2' sobre la
placa base, y los surcos 4', 4' adyacentes entre sí están aislados
por la pared 2'.
El surco por RIE mostrado en la Fig. 15 (C) se
forma mediante grabado de una placa base de silicio o SiO_{2}, y
el surco por LIGA se forma mediante grabado de una placa base de
polímero, cerámica, plástico etc. En estos casos, el electrodo 3 es
soportado sobre la pared 2'' sobre la placa base, y los surcos 4'',
4'' adyacentes entre sí están aislados por la pared 2''.
En el grabado isotrópico mostrado en las Figs.
14 y 15 (A), generalmente, se forma el surco o el surco de
comunicación 4 para que tenga una conformación cuya sección sea
semi-circular, o semi-oval. Cuando
se forma un surco mediante grabado anisotrópico mostrado en 15 (B),
generalmente, el surco 4' se somete a grabado en una conformación
sustancialmente en V finalmente vía una sección sustancialmente
trapezoidal. Cuando se forma un surco mediante RIE o LIGA mostrado
en la Fig. 15 (C), generalmente, el grabado se realiza hasta una
sección sustancialmente cuadrada. Por consiguiente, se forman
diversas conformaciones en sección según el modo de grabado y el
modo de formación de "un sitio de nivel inferior que el nivel del
electrodo", pero en la presente invención, la conformación del
"sitio de nivel inferior que el nivel del electrodo" (tal como
un surco de comunicación, un surco, una parte cóncava, etc) no está
particularmente limitada.
Una pared o un miembro convexo 2 de la Fig 15
(A) están formados con una conformación en la que está unida la
parte central; un pared 2' de la Fig. 15 (B) está formada con una
conformación trapezoidal; y una pared 2'' de la Fig. 15 (C) está
formada con una conformación cuadrada, pero la pared, el miembro
convexo 2, la pared 2', y la pared 2'' pueden tener cualquier
conformación con tal que puedan soportar el electrodo 3, y no está
particularmente limitada.
El electrodo 3 utilizado en la presente
invención está formado por un material conductor, por ejemplo, tal
como aluminio, oro, o similar, y la construcción del mismo bastará
para que produzca la fuerza dielectroforética, esto es, un campo
eléctrico no uniforme en dirección horizontal y vertical, por
ejemplo, una conformación interdigitada, siendo enumerados [J.
Phys. D: Appl. Phys. 258, 81-88, (1992), Biochim.
Biophys. Acta. 964, 221-230, (1988), etc.]
Más concretamente, son preferibles, como se
muestra en la Fig. 16 (A), las conformaciones en las que se forman
muchas partes que se proyectan hacia afuera triangulares 7a en una
relación en el espacio opuesta a las partes superiores e inferiores
de una parte de tipo red lineal 6; (B) una conformación en la que se
forman muchas partes que se proyectan hacia afuera cuadradas 7b en
una relación en el espacio opuesta a las partes superiores e
inferiores de una parte de tipo red lineal 6; (C) una conformación
en la que se forman muchas partes que se proyectan hacia afuera
trapezoidales 7c en una relación en el espacio opuesta a las partes
superiores e inferiores de una parte de tipo red lineal 6; (D)
estando la conformación de onda sinusoide en las porciones
superiores e inferiores, una conformación en la que se forman muchas
partes convexas 8 y partes cóncavas 9 de la onda sinusoide (parte
cóncava 9 y parte convexa 8) linealmente opuestas a las porciones
superiores e inferiores; y (E) estando la conformación en dientes
de sierra en las porciones superiores e inferiores, una
conformación en la que se forman muchas partes convexas de los
dientes de sierra 8' y partes cóncavas de los dientes de sierra 9'
(parte cóncava 9' y parte convexa 8') linealmente opuestas en las
porciones superiores e inferiores. No obstante, se puede utilizar
cualquier conformación si se puede utilizar el electrodo para
dielectroforesis, y las conformaciones no están particularmente
limitadas.
Semejante electrodo descrito se prepara
normalmente proporcionando un par o más de electrodos que tienen las
conformaciones descritas antes en forma de dientes de peine sobre
la placa base formada por un material conductor, por ejemplo, tal
como vidrio, plástico, cuarzo, silicio, etc. utilizando mecanismos
de tratamiento fino [Bichim. Bioophys. Acta., 964,
221-230, etc.]. Adicionalmente, la distancia entre
los electrodos 3 opuestos (adyacentes) entre sí no está
particularmente limitada con tal que se pueda formar un campo
eléctrico CA no uniforme de fuerte intensidad de campo eléctrico, y
debe ser ajustado adecuadamente según la clase de moléculas
deseadas.
El grosor del electrodo 3 puede ser similar al
de la técnica anterior, y concretamente, el grosor es normalmente
de 0,5 nm o más, preferiblemente, 0,5 \mum a 1.000 nm, más
preferiblemente, 1 nm a 1.000 nm.
El electrodo 3 puede ser similar al de la
técnica anterior excepto en el grosor, y se puede formar una capa
orgánica sobre el electrodo con el fin de evitar la adsorción de
diversos materiales sobre el electrodo.
El aparato dielectroforético se puede fabricar
de una manera similar a la de la técnica anterior excepto por "un
sitio de nivel inferior que el nivel del electrodo" (tal como el
surco de comunicación 4, un surco 4', una porción cóncava etc.) tal
como una ruta de flujo y un electrodo dielectroforético.
El "sitio de nivel inferior que el nivel del
electrodo" se puede formar, por ejemplo, excavando una placa
base entre los electrodos por medio de métodos físicos tales como un
método de excavación utilizando un cuchillo adecuado o similar, un
método LIGA (Litografía, Galvanoplastia y Moldeado) utilizando una
luz sincrotrón radiante y un método de impresión en relieve
utilizando un troquel de impresión en relieve adecuado; métodos
químicos para excavar una placa base, por ejemplo, utilizando un
líquido de grabado para la placa base; o métodos físicos y químicos
tales como el grabado utilizando gases reactivos formados en plasma
mediante el suministro de una potencia de alta frecuencia [Grabado
por Iones Reactivos (RIE)]. Se observa que los métodos descritos
antes se pueden combinar adecuadamente para llevar a cabo la
excavación de un sustrato.
En cuanto al líquido de grabado, se puede
seleccionar un líquido de grabado según el material del sustrato.
Cuando se forma un sitio de nivel inferior que el nivel del
electrodo en una parte del sustrato, el grabado se puede completar
aplicando adecuadamente una máscara a la porción que no se desea
excavar.
Para incorporar el método de separación de la
presente invención utilizando el aparato dielectroforético según la
presente invención, el método de separación como tal es el mismo que
el de la técnica anterior.
Esto es, un líquido que contiene una sustancia
que se va a separar, por ejemplo, un líquido en el que dos o más
clases de sustancias (moléculas o partículas) están disueltas o
suspendidas está presente en un campo eléctrico no uniforme formado
utilizando el electrodo (placa base del electrodo) como se ha
descrito antes por medio del cual se puede completar la separación
por una diferencia en la fuerza electroforética que se ejerce sobre
las sustancias.
Generalmente, se forma horizontalmente y
verticalmente un campo eléctrico no uniforme en una ruta de flujo
sobre el sustrato para hacer que fluya el líquido que contiene la
sustancia que se va a separar desde una entrada, y la separación se
puede completar por una diferencia en la fuerza dielectroforética
que se ejerce sobre las sustancias. No obstante, por supuesto, la
sustancia se puede separar en un componente sostenido en una
porción específica de un electrodo y un componente no sostenido para
llevar a cabo la separación sin generar flujo.
Para la separación mediante una diferencia en la
fuerza dielectroforética que se ejerce sobre las sustancias
(moléculas, partículas), las sustancias se pueden separar en una
molécula etc. sostenida en una porción específica de un electrodo y
una molécula etc. no sostenida. O, puesto que las moléculas
sometidas a una fuerza dielectroforética mayor se mueven más tarde
que las moléculas sometidas a una fuerza dielectroforética débil, la
separación se puede completar haciendo uso del hecho de que se
produce una diferencia en el tiempo de movimiento.
Como se muestra por medio de una flecha en la
Fig. 17, cuando se hace que un líquido que contiene una sustancia
que se va a separar en una dirección que cruza longitudinalmente el
electrodo fluya en una ruta de flujo del aparato según la presente
invención, la velocidad de flujo del pasaje de comunicación (surco)
4 se vuelve más lenta que la de la porción de la ruta de flujo de
manera que el arrastre Fv del fluido aplicado a la molécula que
entra en el surco de comunicación 4 se puede reducir.
Adicionalmente, proporcionando el surco de comunicación 4 entre los
electrodos 3, 3, el intervalo afectado por el campo eléctrico se
amplía, y el espacio en el que se almacenan las moléculas atrapadas
se amplía por medio de lo cual se potencia la tasa (capacidad) de
recogida.
El método de medida de la presente invención se
puede llevar a cabo conforme al método conocido descrito antes
distinto del que utiliza el método de separación de la presente
invención, y los reactivos utilizados se pueden seleccionar
adecuadamente a partir de los reactivos conocidos.
Aunque más delante se describirá adicionalmente
la presente invención concretamente haciendo referencia a los
Ejemplos y Ejemplos de Referencia, la presente invención no está en
absoluto limitada a estos.
Ejemplo
1
El electrodo según la presente invención fue
preparado aplicando como recubrimiento un resist sobre una placa
base de vidrio aplicado con depósito de vapor de aluminio,
exponiendo después por medio de laminación una fotomáscara que
tiene un electrodo y un patrón de espacio vacante representado por
un haz de electrones que representa el dispositivo sobre el resist,
y revelando el resist, disolviendo una película de resist
correspondiente al espacio vacante y porciones distintas del
electrodo, y sumergiéndolo después en un líquido de grabado para
aplicar el grabado a una superficie de aluminio, y separando el
resist que queda sobre la superficie de aluminio para formar un
electrodo que tiene un espacio vacante mostrado en la Fig. 13.
El patrón del espacio vacante se cambió para
preparar los electrodos 1 a 4 de diferente longitud (\mum) de a)
a e) en la Fig. 13. La Tabla 1 muestra la longitud (\mum) de a) a
e) de los electrodos 1 a 4 preparados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Cuando se sometieron cuentas que tenían un
diámetro de 1 \mum a dielectroforesis utilizando un electrodo
convencional, las cuentas se concentraron (acumularon) en una
posición del electrodo cuya intensidad de campo era débil. En el
diseño del electrodo preparado en el Ejemplo 1, se excluye la
porción del electrodo de aluminio de la región en la que se
acumulan las cuentas.
El ensayo dielectroforético se llevó a cabo en
el campo eléctrico en el que las cuentas muestran la
dielectroforesis negativa en el electrodo (electrodo 2 de la Tabla
1) preparado en el Ejemplo 1, utilizando cuentas que tienen un
diámetro de 1 \mum con la superficie de las mismas marcada con
fluorescencia.
Una solución de muestra con las cuentas
suspendidas se hizo gotear por encima del sustrato del electrodo
(espacio hueco), y después de eso, se puso un vidrio de protección,
y se realizó la observación mediante un microscopio óptico.
Como resultado de la observación del ensayo
dielectroforético, se ha confirmado que las cuentas estaban
concentradas en el espacio hueco (espacio vacante) del electrodo
por la fuerza dielectroforética negativa. Las cuentas se
concentraron mientras flotaban en la solución por encima del espacio
hueco (cerca del vidrio de protección).
Ejemplo de referencia
1
Se diseñó una formación de múltiples electrodos
que tenía un espacio mínimo de 7 \mum, un paso de electrodo de 20
\mum, y un número de electrodos de 2.016 (1.008 pares), y se
elaboró una fotomáscara según el diseño para fabricar el electrodo
como sigue.
Sobre un sustrato de vidrio sobre el que se
depositó el aluminio y al que se aplicó un fotoresist, se trazó un
patrón de electrodo como se ha diseñado sobre una máquina para
trazar haces de electrones, y después el fotoresist se reveló y el
aluminio se grabó para elaborar una fotomáscara.
El sustrato del electrodo se fabricó según el
método descrito en T. Hashimoto, "Ilustrative
Photofabrication", Sogo-denshi Publication
(1985), como sigue.
La fotomáscara elaborada de este modo se puso en
íntimo contacto con el sustrato de vidrio con aluminio depositado
al cual se aplicó un fotoresist, y después se expuso al patrón de
electrodo con una lámpara de mercurio. El sustrato de electrodo se
fabricó revelando el sustrato de vidrio expuesto para el electrodo y
grabando la superficie de aluminio, seguido de separación del
fotoresist que quedaba en la superficie de aluminio.
Ejemplo
3
Como se muestra en la Fig. 18, se aplicó el
grabado al sustrato de vidrio 1 del electrodo dielectroforético
preparado de la manera descrita en el Ejemplo de Referencia 1 para
formar un surco de comunicación 4 en una porción en medio de los
electrodos 3 sobre el sustrato de vidrio 1.
Como líquido de grabado, se utilizó fluoruro de
sodio-ácido sulfúrico (NH_{4}F 3%, H_{2}SO_{4}, H_{2}O). El
fluoruro de sodio-ácido sulfúrico tiene propiedades para disolver
tanto el vidrio como el aluminio, pero debido a que la velocidad
para grabar el vidrio es muy rápida en comparación con la del
grabado del aluminio, se puede someter a grabado una porción de
vidrio distinta del electrodo de aluminio con un electrodo de
aluminio como máscara.
Se observó que en el caso en el que el grosor
del aluminio de un electrodo es de 40 nm, cuando se realiza el
grabado a una profundidad de 3 \mum o más, un electrodo se inclina
por el flujo de agua cuando el líquido de grabado se lava con agua
pura. Sin embargo, en el caso de un grosor de 250 nm, no se observa
el fenómeno de que el electrodo se
incline.
incline.
Se midió la relación entre el tiempo de grabado
(seg.) y la profundidad (\mum) de un surco de comunicación
formado entre los electrodos, después del grabado. El resultado
indicaba que el tiempo de grabado y la profundidad del surco que se
formaba estaban en una relación proporcional como se muestra en la
Fig. 19. La profundidad del surco se midió cortando el electrodo
con una cuchilla de vidrio y observando su sección con un
microscopio.
Ejemplo de referencia
2
Con el fin de separar las moléculas mediante el
movimiento de las moléculas en un campo eléctrico no uniforme, se
elaboró una ruta de flujo sobre el sustrato del electrodo fabricado
en el Ejemplo 3 utilizando goma de silicona.
La ruta de flujo de goma de silicona para enviar
una solución que contiene moléculas disueltas sobre el electrodo
tenía una profundidad de 25 \mum y una anchura de 400 \mum y se
diseñó de manera que la ruta de flujo corre a través de una región
en la que está situado el electrodo del sustrato del electrodo.
Su fabricación se llevó a cabo según el método
descrito en T. Hashimoto, "Illustrative Photofabrication",
Sogo-denshi Publication (1985). Al principio, se
aplicó un fotoresist negativo de tipo lámina que tenía un grosor de
25 \mum sobre el sustrato de vidrio, se expuso a través de una
fotomáscara diseñada para elaborar la ruta de flujo, y se reveló el
fotoresist negativo. La goma de silicona no curada se moldeó
utilizando el sustrato del fotoresist negativo como molde, y
después se curó para producir una superficie de goma de silicona
que tenía la superficie cóncava con una altura de 25 \mum en la
región en la que estaba colocado el electrodo.
El sustrato del electrodo y la ruta de flujo de
goma de silicona se adhirieron con una goma de silicona de curado
del tipo de dos fluidos de manera que la superficie cóncava de la
goma de silicona estaba enfrentada con la región en la que estaba
situado el electrodo del sustrato del electrodo. Se colocó una
jeringa para inyectar una solución aguas arriba de la ruta de
flujo, y se añadió al sustrato del electrodo un aparato que
permitía que una solución en la que estaban disueltas las moléculas
fluyera sobre el electrodo.
Ejemplo
4
Se preparó un electrodo formado con un surco de
comunicación que tenía una profundidad de 2 \mum a 4 \mum
preparado como en el Ejemplo 3, se preparó una ruta de flujo como en
el Ejemplo de Referencia 2, se preparó un dispositivo de
cromatografía dielectroforética de la presente invención, y se midió
la tasa de recogida del dispositivo de la siguiente manera. Con
fines comparativos, con respecto al dispositivo de cromatografía
dielectroforética preparado de un modo similar excepto que no se
formaba un surco de comunicación, también se midió la tasa
de
recogida.
recogida.
Como muestra, se utilizó una solución que
contenía BSA marcada con FITC (peso molecular: aproximadamente 65
kD) (60 \mug/ml).
Para evitar la adsorción de las moléculas de
proteína sobre el sustrato del electrodo o la ruta de flujo, se
utilizó un bloque A (fabricado por Snow Brand Milk Products Co.,
Ltd.) para bloquear la superficie de la ruta de flujo, después de
lo cual se aplicó la BSA marcada con FITC al dispositivo de
cromatografía dielectroforética.
La velocidad media de la muestra utilizada era
de 556 \mum/seg., y se aplicó el campo eléctrico durante 30 a 120
segundos a partir del inicio de la medición. La tasa de recogida se
midió con respecto a la intensidad del campo eléctrico aplicado en
ese momento de 2,14 Mv/m, 2,5 Mv/m, y 2,86 Mv/m.
La medición de la tasa de recogida se obtuvo
mediante la siguiente Ecuación:
Tasa\ de\
recogida\ (%) = [(I_{0} - I_{min})\ x\ 100] / (I_{0} -
I_{fondo})
donde I_{0} representa el valor
fijado de la intensidad de fluorescencia antes de la aplicación del
campo eléctrico, I_{min} representa el valor mínimo de la
intensidad de fluorescencia durante la aplicación del campo
eléctrico, e I_{fondo} representa el
fondo.
La Fig. 20 muestra los resultados. En la Fig.
20, se muestran los resultados obtenidos mediante el uso del
dispositivo de cromatografía dielectroforética de -\Delta-
(profundidad 4 \mum), -\square- (profundidad 2 \mum), y
-\lozenge- (profundidad 0 \mum).
Como resulta evidente a partir de los resultados
mostrados en la Fig. 20, cuanto mayor es la profundidad del surco,
más aumenta la tasa de recogida (%). A 2,86 Mv/m, la tasa de
recogida del aparato de la presente invención que tiene un surco de
comunicación de 4 \mum es del 40% en comparación con la tasa de
recogida del 28% del aparato convencional que no tiene surco de
comunicación, y la tasa de recogida aumentaba aproximadamente un
43%, en otras palabras, la capacidad de recogida de las sustancias
deseadas aumenta notablemente mediante el uso del aparato según la
presente invención.
Ejemplo
5
Se utilizó como muestra ADN de 500 pb marcado
con colorante fluorescente intercalador YOYO-1
(Molecular Probe Ltd.). La tasa de recogida (%) se midió mediante
el dispositivo de cromatografía electroforética de una profundidad
de surco de 0 \mum, 2 \mum y 4 \mum. La Fig. 21 muestra los
resultados.
En la Fig. 21, se muestran los resultados
obtenidos mediante el uso del dispositivo de cromatografía
electroforética que tiene un surco de comunicación de -\Delta-
(profundidad 4 \mum), -\square- (profundidad 2 \mum), y
-\lozenge- (profundidad 0 \mum).
Como resulta evidente a partir de los resultados
mostrados en la Fig. 21, también en este caso, en el campo
eléctrico de intensidad 1,5 Mv/m o más, la tasa de recogida del
aparato de la presente invención que tiene un surco de comunicación
con una profundidad de 4 \mum aumentaba aproximadamente un 20% en
comparación con el aparato convencional que no tiene surco de
comunicación.
Según la invención, puesto que las sustancias
que se van a medir pueden ser concentradas (acumuladas) en el
espacio hueco del electrodo o en las direcciones superior e inferior
del mismo, el electrodo no está presente bajo las sustancias que se
van a medir, y por lo tanto, cuando se detecta intensidad de
fluorescencia, se evita el reflejo de la luz de excitación por el
electrodo bajo las sustancias medidas. Como resultado, se reduce el
fondo, se intensifica la razón S/N, y se intensifica la sensibilidad
de la medición. Adicionalmente, la medición se puede realizar desde
la superficie inferior del electrodo. Adicionalmente, según la
presente invención, puesto que la medición se puede realizar desde
la superficie inferior, es posible medir las sustancias que se van
a medir mediante la absorbancia que era imposible en la técnica
anterior.
Cuando la medición se realiza desde la
superficie inferior del electrodo, puesto que las partes distintas
de la región en la que se concentran las sustancias que se van a
medir están cubiertas con el electrodo, por medio de lo cual en
dichas partes la luz de excitación irradiada desde la superficie
superior no alcanza la superficie inferior, se reduce el fondo, se
intensifica la razón S/N y se intensifica la sensibilidad de la
medición (efecto ranura). Esto supone una ventaja extremadamente
grande.
La provisión de sitios de nivel inferior que el
nivel del electrodo entre o en medio de los electrodos que no se
había realizado en absoluto en la técnica anterior conduce a una
notable intensificación de la capacidad (tasa) de recogida que
tiene un papel muy importante para la separación de sustancias
mediante dielectroforesis, que es un efecto enorme. Esta es por lo
tanto una invención extremadamente trascendental.
Claims (16)
1. Un electrodo para un aparato
dielectroforético caracterizado por un espacio hueco vacante
en dicho electrodo y que crea una zona en la cual la densidad de la
línea de flujo eléctrico es baja, de manera que las sustancias
influenciadas por una fuerza dielectroforética negativa se
concentran en dicho espacio vacante o por encima o por debajo de
dicho espacio vacante en una dirección vertical del mismo.
2. El electrodo según la reivindicación 1, donde
toda la circunferencia de dicho espacio vacante (12) está rodeada
por el electrodo (11).
3. El electrodo según la reivindicación 1, donde
la zona en la cual las sustancias sometidas a la influencia de una
fuerza dielectroforética negativa se concentran es una zona en la
cual la densidad de una línea de flujo eléctrico es baja.
4. El electrodo según la reivindicación 1, donde
dicho electrodo (11) tiene forma circular, oval o poligonal, y se
forma un espacio vacante circular, oval o poligonal (12) en la parte
central del mismo.
5. El electrodo según la reivindicación 1, donde
dicho electrodo (11) es proporcionado sobre un sustrato.
6. El electrodo según la reivindicación 5, donde
dicho sustrato proporcionado con dicho electrodo se elabora de un
material que no refleja sustancialmente la luz de excitación o
penetra la luz hasta tal punto que es capaz de medir la
absorbancia.
7. El electrodo según la reivindicación 6, donde
dicho sustrato proporcionado con dicho electrodo se elabora de un
material transparente.
8. El uso del electrodo según la reivindicación
1, donde las sustancias influenciadas por la fuerza
dielectroforética negativa son sustancias granulares.
9. Una construcción de electrodo para un aparato
dielectroforético que comprende un electrodo (11) según la
reivindicación 1 y una tapa proporcionada encima con el fin de
formar un espacio entre la tapa y dicha superficie del electrodo,
donde el espacio hueco vacante (12) está formado en el electrodo
(11) por encima o por debajo de una porción en la cual se
concentran las sustancias objeto de la medición por la fuerza
dielectroforética negativa generada por la aplicación de voltaje a
dicho electrodo.
10. Un método para fabricar un electrodo según
la reivindicación 1, caracterizado por dicho espacio vacante
está formado por medios físicos o químicos.
11. Un método para fabricar un electrodo según
la reivindicación 1, donde dicho electrodo y dicho espacio vacante
se preparan mediante técnicas finas de tratamiento, que comprenden
al menos las siguientes etapas:
(A) recubrir con un resist una placa base;
laminar un electrodo fotomáscara sobre el resist; irradiar luz para
exponer y revelar el resist para disolver el resist correspondiente
al espacio vacante; o
(B) recubrir con un resist una placa base;
laminar un electrodo fotomáscara sobre el resist, al que se aplica
la exposición; revelar para separar el resist correspondiente a la
porción de electrodo; laminar un material de electrodo sobre toda
la superficie superior; y separar el resist correspondiente a una
porción distinta del electrodo y el espacio vacante.
12. Un método de separación de sustancias,
caracterizado porque un líquido que contiene sustancias
sometidas a la influencia de una fuerza dielectroforética negativa
generada mediante la aplicación de voltaje a un electrodo según la
reivindicación 1 se sitúa en dicho electrodo que tiene un espacio
vacante o encima del espacio vacante o en la proximidad del mismo,
con el fin de concentrar dichas sustancias influenciadas por una
fuerza electroforética negativa en dicho espacio vacante o por
encima o por debajo de dicho espacio en una dirección vertical del
mismo.
13. El método de separación según la
reivindicación 12, donde dicho electrodo compuesto de una
construcción de electrodo con un sustrato sobre el que se
proporciona dicho electrodo y una tapa de tal manera que se forma
un espacio entre dicho electrodo y dicha tapa, y un líquido que
contiene sustancias sometidas a la influencia de una fuerza
dielectroforética negativa, se carga a través de dicho espacio para
permitir que las sustancias contacten o se comuniquen con el
electrodo.
14. El método de separación según la
reivindicación 13, donde dicha sustancia influenciada por dicha
fuerza dielectroforética negativa está unida a una sustancia que se
va a medir en una muestra por medio de sustancias que se unen a la
sustancia que se va a medir para formar un complejo.
15. Un método de detección de sustancias,
caracterizado porque un líquido que contiene dichas
sustancias influenciado por una fuerza dielectroforética negativa
generada por la aplicación de voltaje a un electrodo según la
reivindicación 1, está situado en dicho electrodo que tiene un
espacio vacante en él o por encima del espacio vacante o en la
proximidad del mismo, o se hace fluir por encima o por debajo del
mismo, con el fin de concentrar dichas sustancias influenciadas por
una fuerza dielectroforética negativa en dicho espacio vacante o por
encima o por debajo de dicho espacio en una dirección vertical del
mismo, y dicha sustancia se detecta ópticamente.
16. El método de detección según la
reivindicación 15, donde dicha sustancia influenciada por dicha
fuerza dielectroforética negativa está unida a una sustancia que se
va a medir en una muestra a través de sustancias que se unen a la
sustancia que se va a medir para formar un complejo.
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