ITMI20061063A1 - Metrodo e apparato pe rla selezione e la modifica di singole cellule e loro piccoli aggregati - Google Patents

Description

7525PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.

Descrizione dell'invenzione dal titolo:

“Metodo e apparato per il monitoraggio e la modifica di singole cellule e

loro piccoli aggregati”

A nome di: MindSeeds Laboratories S.r.l.

Con sede in: Viale Ercolani 3 - 40138 BOLOGNA

Inventore designato: GUERRIERI Roberto

Depositata il con il n°

MI 2WA00 1 0 6& CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione concerne tecniche di selezione e modifica di

singole cellule e di piccoli aggregati delle stesse. Il campo di

applicazione di questa metodologia e del relativo apparato può’ essere

nel settore della biotecnologia, ad esempio per controllare l’esito

dell’interazione tra cellule anche in presenza di differenti composti

chimici; nel settore della medicina, ad esempio per determinare come il

sistema immunitario reagisce alla presentazione di nuovi stimoli a cellule

preposte al controllo immunitario; nel settore della biologia industriale, in

quanto il metodo ed apparato oggetto della presente invenzione

consentono di modificare cellule e batteri e di effettuare una selezione

degli stessi in modo da poter estrarre da una moltitudine di esemplari

quelli di maggiore interesse industriale.

STATO DELL'ARTE

Il supporto convenzionale che viene offerto a chi deve effettuare

esperimenti biologici o chimici miniaturizzati e’ la piastra a molti pozzi

detta anche “microtiter”. Ciascuno dei pozzetti presenti su queste

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piattaforme può’ ospitare materiale chimico e biologico, ma non ha

alcuna funzione attiva integrata nello stesso. Il numero di pozzetti

contemporaneamente presenti su di una piastra può oggi superare il

migliaio. La possibilità di intervenire in modo attivo sul contenuto dei

pozzetti permette di svolgere esperimenti altrimenti non fattibili. Per

ottenere questa interazione con il contenuto su scala microscopica a

livello di singola cellula sono disponibili alcune soluzioni.

La creazione di piattaforme ad elevato parallelismo e’ descritta in

US6716629: “Apparatus for assay, synthesis and Storage, and methods

of manufacture, use, and manipulation thereof che spiega come il

progetto di micro-pozzetti possa essere ottimizzato tramite una

opportune scelta dei materiali e delle relative superfici che li

caratterizzano. La assenza di sensori e attuatori in essi integrati li rende

non competitivi con la soluzione qui presentata.

La creazione di pozzetti capaci di misurare l’evoluzione del materiale in

essi contenuti e' stata proposta tra gli altri da Caillat et al. in

EP1390467A1: “USE OF A MINIATURE DEVICE FOR SEPARATING

AND ISOLATING BIOLOGICAL OBJECTS AND METHODS USED”. In

questo lavoro si insegna come realizzare pozzetti in cui e’ stato inserito

del materiale che viene mantenuto sotto controllo grazie alla misurazione

permessa da elettrodi inseriti nei pozzetti. I limiti di questa invenzione

superati da questo brevetto sono i seguenti: 1) i pozzetti non sono capaci

di spostare gli oggetti in essi contenuti. A causa di questo fatto non e’

possibile controllare oggetti di modeste dimensioni quali ad esempio

cellule, ma ci si restringe a misure di tipo macroscopico. Il problema

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deriva tra l’altro dalla possibilità che cellule deposte nel pozzetto si

collochino in zone che non sono misurabili dal dispositivo. 2) a maggior

ragione il dispositivo non permette di forzare la posizione di poche cellule

in modo da garantirne il contatto. Purtroppo le interazioni cellulari di

interesse immunologico sono mediate da un contatto tra le pareti

cellulari, rendendo quindi impossibile questo tipo di studio; 3) la scelta

della forma del pozzetto chiusa in fondo non permette un ricambio del

supernatante in cui le cellule crescono, eliminando ad esempio i residui

metabolici; 4) infine il dispositivo non permette di applicare le tensioni

necessarie per poter ottenere effetti di elettroporazione ed elettrofusione,

come si vedrà possibili su questa piattaforma.

La manipolazione di particelle all’interno di un fluido e’ affrontabile

tramite dielettroforesi anche come proposto in US 6,610,188: “Electrode

array for field cages”. In questo lavoro si presenta una configurazione di

elettrodi che presenta particolari qualità in termini di campo elettrico

generato per la formazione di gabbie dielettroforetiche. La soluzione

proposta in questo brevetto ha i seguenti vantaggi rispetto a quella

citata: 1) la configurazione degli elettrodi e’ più semplice e non richiede

procedure di allineamento per la fabbricazione degli stessi, riducendo

quindi costi e aumentando le rese; 2) i pozzetti sono sempre stati

concepiti o come strutture chiuse, impedendo quindi di modificare il

supernatante in cui le particelle vengono a trovarsi, o come formazioni di

campo che vengono create all’interno di un flusso di fluido. Questa

ultima configurazione impedisce di studiare interazioni di particelle che

debbono rimanere a contatto tra di loro; 3) la procedura di misurazione

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non si giova della possibilità di muovere le particelle in modo opportuno,

come verrà proposto in questo lavoro. Gli stessi autori propongono

svariati schemi di misura di impedenza delle caratteristiche del materiale

contenuto nei fluidi. A titolo di mero esempio e per dimostrare la

possibilità di misurare tramite variazione di impedenza le proprietà di

cellule, si fa riferimento al lavoro “Capacitance cytometry: measuring

biological cells one by one", PNAS, voi. 97, 10687-10690, 2000. In

questo lavoro si mostra che e’ possibile misurare variazioni capacitive

indotte dalla presenza di singole cellule. Il brevetto qui presentato

espande il concetto di misura di impedenza cellulare, noto in letteratura,

accoppiandolo in modo stretto a quello di movimentazione e

introducendo il fatto che lo spostamento di cellule nel pozzetto migliora la

qualità della misura.

Una proposta di G. Medoro in US6942776: “Method and apparatus for

thè manipulation of particles by means of dielectrophoresis” insegna

come creare una piattaforma elettronica in grado di creare trappole che

possono catturare e anche spostare particelle in esse intrappolate, oltre

che misurarne le caratteristiche tramite sensori integrati. Questa

metodologia integra in una singola piattaforma sia l’intrappolamento che

la successiva manipolazione di cellule o in generale particelle. Lo

svantaggio di questa tecnologia e’ legato alla necessità di creare una

camera chiusa in cui avvengono i processi di intrappolamento. Questo

fatto rende difficile ossigenare le cellule in essa intrappolate. Inoltre la

camera non permette di modificare a discrezione dello sperimentatore la

composizione dei fluido in cui e' sita la particella se non cambiandola in

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tutta la camera. Infine, la struttura a singola camera offre un numero limitato di canali di ingresso che non permettono quindi un facile accesso al contenuto dei siti in cui si fa avvenire la reazione chimica o biologica di interesse.

Un lavoro che ha studiato la evoluzione di tessuti biologici in presenza di farmaci o altri composti e’ stato presentato in Thielecke et al. “A Multicellular Spheroid-Based Sensor for Anti-Cancer Therapeutics”, Biosens. Bioelectron., 2001, 16, 261-9. In questo lavoro si dimostra come sia possibile controllare la evoluzione di un piccolo campione di tessuto organico e evidenziare così fenomeni utili da un punto di vista diagnostico e terapeutico. Questo brevetto migliora lo stato deH’arte descritto nel lavoro citato poiché 1) il controllo delle particelle avviene tramite la generazione di opportuni campi elettrici, molto più semplici da gestire rispetto all’approccio microfluidico utilizzato in quel lavoro; 2) l’interazione cellula-cellula non e’ compatibile con l’approccio là proposto a causa del fatto che il controllo di posizione non e’ adeguato allo scopo; 3) la metodologia non e’ scalabile al livello di parallelismo richiesto per applicazioni ad elevato parallelismo quali quelle qui descritte. Gli autori hanno presentato dispositivi in grado di gestire poche decine di campioni in parallelo, anche in presenza di un grande sforzo di ottimizzazione della parte fluidica.

La particolare struttura dei pozzetti attivi proposta in questo brevetto rende anche possibile effettuare operazioni di modifica del patrimonio genetico di microrganismi. La tecnologia che verrà esposta si basa sulla realizzazione di elettroporazione all'interno di pozzetti e sulla

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elettrofusione di opportune cellule che in questo modo possono

condividere il loro patrimonio genetico. L’elettroporazione di singole

cellule e’ un processo che sta attraendo notevole interesse a causa della

necessità di modificare il DNA di cellule e batteri introducendo nelle

stesse nuovo materiale genetico. A titolo di mero esempio, il lavoro “A

microchip for electroporation of primary endothelial cells”, Sensors and

Actuators, A, Voi. 108, 2003, pp. 12-19, descrive una possibile

realizzazione di inserimento di DNA in cellule eucariote. Questa tecnica

e’ particolarmente interessate a causa della efficienza del processo,

misurato in termini di cellule effettivamente mutate, e di sopravvivenza

delle cellule. Questo brevetto estende lo stato dell’arte della

elettroporazione di cellule grazie alla possibilità di collocare moltitudini di

singole cellule di fronte all’elettrodo che le rende permeabili. In aggiunta,

di particolare importanza per protocolli piu’ sofisticati, questo brevetto

insegna come fondere piu’ microrganismi in modo controllato.

Si cita infine il fatto che lo stato dell’arte odierno nel campo della

deposizione di singole cellule vede prodotti commerciali che consentono

di deporre gocce di liquido al cui interno e’ garantita la presenza di una

sola cellula o particella del tipo desiderato. Questi depositatori di

materiale biologico vengono ad esempio forniti commercialmente da

DakoCytomation e possono depositare materiale che viene prelevato da

differenti contenitori, permettendo quindi di avere all'interno dello stesso

sito differenti cellule e/o particelle. La precisione geometrica con cui può

avvenire la deposizione e’ dell’ordine di pochi micron.

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SOMMARIO DELL'INVENZIONE:

Il dispositivo oggetto della presente invenzione consiste in una schiera di

pozzetti, in grado di contenere materiale biologico e di cambiare il

supernatante in cui sono immerse le particelle attingendo ad una o piu’

fonti di liquido; all’interno dei suddetti pozzetti e’ collocato un insieme di

elettrodi che hanno la funzione di spostare con precisione singole

particelle o piccoli gruppi di esse in modo da collocarle di fronte ad altri

elettrodi che misurano la variazione del valore di impedenza che si viene

a produrre a causa della presenza di particelle che vengono spostate di

fronte agli elettrodi di misura. Se necessario, gli elettrodi di misura

possono anche applicare tensioni relativamente più elevate in modo da

produrre fenomeni di elettroporazione e fusione cellulare. Cosituisce

ulterioree oggetto della presente invenzione un metodo di

quantificazione della interazione litica tra cellule e un metodo per la

modifica del patrimonio genetico di cellule tramite elettroporazione e/o

elettrofusione.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE:

Figura 1: Mostra una sezione, indicata con A-A’ nelle altre figure, di un

pozzetto secondo la presente invenzione.

Figura 2: Illustra la vista dall’alto degli elettrodi 1 e 4.

Figura 3: Mostra una vista dall’alto degli elettrodi 3 e 6.

Figura 4: Mostra una vista dall’alto degli elettrodi 2 e 5.

Figura 5: Mostra una ulteriore realizzazione preferita degli elettrodi 1 e 4

che sono ora fisicamente separati. In questo caso gli elettrodi possono

essere mantenuti a potenziali diversi .

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Figura 6: Mostra l’andamento del campo elettrico lungo la sezione A-A’ di un pozzetto nel caso in cui i potenziali applicati agli elettrodi 1 - 6 siano tra di loro in fase cosi’ come avviene per i potenziali applicati agli elettrodi 3 - 4; in questo caso i potenziali impressi alle coppie 1 - 6 e 3 - 4 sono sfasati di 180 gradi. In questo caso gli elettrodi 1 e 4 seguono la realizzazione mostrata in fig. 5.

Figura 7: Mostra una realizzazione dei canali 10 al cui interno fluisce in modo controllato il fluido che alimenta i pozzetti 14.

Figura 8: Mostra sensori che si trovano nei pozzetti con una organizzazione a schiera.

Figura 9: Mostra attuatori che si trovano nei pozzetti con una organizzazione a schiera.

Figura 10: Mostra una realizzazione del piano intermedio con gli elettrodi 2 e 5 ortogonali alla sezione A-A’.

Figura 11 : Mostra una microsfera 24 di diametro maggiore del foro di uscita del pozzetto che ha peso maggiore di quello della soluzione in cui e’ immersa;

Figura 12: Mostra una disposizione di elettrodi sulla parte superiore 25, 26 e inferiore 27, 28 e 29 del canale 10.

Figura 13: goccia d’acqua su una superficie idrofilica a) o idrofobica b) Figura 14: sezione di un micropozzetto con evaporazione opposta alla gravità.

Figura 15: Stabilità della marcatura con calceina dopo stimolazione DEP.

Per verificare che il trattamento dielettrico non altera il segnale fluorescente, LCL caricati con calceina sono stati trattati a 100 MMFIz e

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posti su SmartSIide e DEP array: come si vede l’intensità di fluorescenza

rimane più o meno costante nel tempo. Il segnale di fluorescenza,

rilevato ogni minuto, è determinato a partire da 125 cellule nel caso della

piattaforma SmartSIide e da 95 cellule nel caso della piattaforma DEP-array.

Figura 16. LCL marcati con calceina e caricati con il peptide EBV

(pannello di sinistra) e LCL di controllo non caricati, sono stati incubati

con CTL attivati per 15’. I complessi cellulari sono stati separati,

risospesi in tampone mannitolo e distribuiti su DEP array: quindi è stato

misurato il segnale di fluorescenza al tempo 0 e dopo 12 minuti: le frecce

indicano i complessi cellulari che non contengono LCL. Al tempo 12’, il

segnale di fluorescenza scompare solo dove si è avuta lisi specifica di

LCL, ma non nel controllo (pannello di destra).

Figura 17. Pannello A: l’istogramma rappresenta la diminuzione del

segnale di fluorescenza dovuta alla lisi di LCL caricati con il peptide EBV

oppure non caricati con il peptide, incubati con CTL per 15’ e 30’ e

separati su DEP array in tampone mannitolo. Gli istogrammi nel pannello

A si riferiscono al tempo 0, le curve nel pannello B ai tempi indicati

suN'asse delle x. In nero: lisi di LCL positivi (caricati con il peptide), in

bianco: controllo (LCL non caricati).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE:

In riferimento alla figura 1, vediamo una sezione, che viene indicata con

A-A’ nelle figure seguenti, di un pozzetto secondo la presente

invenzione. E’ visibile innanzitutto un ugello 13 preposto alla deposizione

di gocce di fluido contenenti un carico di interesse. Nel caso specifico

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questo ugello fa parte di un apparato in grado di depositare singole cellule o particelle. La goccia depositata viene posta all’interno del pozzetto 14. Le superici limitrofe al pozzetto 12 sono idrofobe qualora il fluido depositato sia acqua, idrofile se il fluido e’ lipidico. All'interno del pozzetto, realizzato in materiale dielettrico 8, sono affacciati gli elettrodi 1 - 4, 2 - 5 e 3 - 6. Questi elettrodi hanno il compito di imporre potenziali opportuni variabili nel tempo al liquido che si trova nel pozzetto. Il pozzetto può essere di tipo aperto o semichiuso. In questo ultimo caso, una membrana semipermeabile 9 separa il pozzetto dal fluido sottostante che fluisce grazie ad una differenza di pressione che si trova ai capi del condotto 10. La membrana semipermeabile può essere assente lasciando il pozzetto aperto. Il condotto 10 e’ realizzato con materiale bio-compatibile e, laddove possibile, trasparente. Se il fondo 11 della struttura e’ trasparente, una illuminazione che venga applicata al retro del dispositivo permette di illuminare il contenuto del pozzetto se aperto.

La selezione funzionale di cellule e’ un punto chiave di indagini immunologico e biotecnologico. L’interesse per questo problema deriva dal fatto che la selezione di cellule può essere fatta sia in termini di caratteristiche biochimiche delle stesse, quali ad esempio la presenza di speciali recettori di membrana, o in base al comportamento delle stesse in particolari situazioni di interesse. In questo ultimo caso, la selezione non richiede una complessa caratterizzazione preliminare, ma solo una precisa definizione delle caratteristiche desiderate. Il problema della selezione funzionale e’ un passo chiave anche delle procedure di

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“evoluzione diretta” per la generazione di microrganismi che abbiano caratteristiche desiderabili. Questo approccio si basa sulla possibilità di introdurre modifiche al patrimonio genetico di un microrganismo in modo sostanzialmente casuale, salvo poi selezionare tra i vari differenti esemplari così generati quelli funzionalmente più promettenti. Tipici parametri di selezione sono ad esempio la capacità di vivere in ambienti a pH differente da quello consueto. In questo caso, la selezione può avvenire in modo semplice modificando lentamente il pH e verificando quali sono i microrganismi che sopravvivono. Più complessa e’ la situazione in cui la selezione non può essere fatta semplicemente distruggendo i microrganismi che non sopravvivono, ma richiede una analisi quantitativa. A titolo di esempio, la capacità di un microrganismo di produrre una sostanza di interesse richiede una misura della stessa. La tecnica qui proposta permette di effettuare selezioni che riconducano i parametri misurabili a variazioni di impedenza. Il dispositivo secondo la presente invenzione può’ essere impiegato per lo svolgimento di funzioni diverse, elencate e descritte nel seguito.

Vediamo come avviene il Funzionamento del dispositivo come attuatore dielettroforetico.

Il funzionamento del dispositivo prevede che i canali 10 siano utilizzati per riempire gli stessi e i pozzetti 14 ad essi afferenti. I canali 10 sono soggetti, quando necessario, ad una lieve depressione tra gli ingressi 16 e le uscite 17 degli stessi. Questa depressione produce un flusso di fluido ed un conseguente trasporto di materiale dall’ingresso 16 ai pozzetti 14 e dai pozzetti 14 alle uscite 17. Come si vede in Figura 1, i

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pozzetti hanno una superficie idrofila al proprio interno per cui il liquido viene spinto verso l'alto dalla forza di capillarità sino a raggiungere il bordo superiore del pozzetto. A questo punto il livello si stabilizza in quanto la superficie 12 esterna al pozzetto ha caratteristiche idrofobe. Si noti che in tutta la descrizione che segue del funzionamento si assume che il liquido di interesse sia acqua con opportuni altri composti in essa disciolti. Nel caso in cui il liquido fosse di natura lipidica, si deve intendere che le caratteristiche delle superfici all’interno del pozzetto 14 e esterne ad esso 12 sono rispettivamente idrofobe e idrofile.

Quando il pozzetto e' pieno, e' possibile applicare potenziali sinusoidali ai contatti 3 e 6, forzando una tensione di uguale modulo e con differenza di fase pari a 180 gradi, mantenendo a massa gli altri contatti 1 e 4. Per il momento trascuriamo la presenza dei contatti 2 e 5. In queste condizioni, il campo elettrico ha una distribuzione del seguente tipo:

1. nella zona compresa tra i contatti 3 e 6, il modulo del campo ha un valore molto alto laddove i contatti sono prossimi e tende a calare nella zona centrale a causa della distanza tra gli elettrodi;

2. nella zona compresa tra i contatti 1 e 4 il modulo del campo e' molto piccolo o nullo a causa della vicinanza a contatti equipotenziali;

3. nella zona cilindrica 14, il modulo del campo e’ maggiore in prossimità delle superfici laterali e cala andando verso il centro della struttura.

Campì elettrici che variano nello spazio come descritto creano effetti dielettroforetici all’interno del liquido. In particolare, per i fenomeni di

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nostro interesse, gli effetti dielettroforetici si manifestano come una forza

che spinge le particelle verso le zone a minore intensità di campo

elettrico. Questo fenomeno e’ detto dielettroforesi negativa ed e’ di

particolare rilievo quando si e' in presenza di soluzioni ad elevata

conducibilità, quale ad esempio la soluzione fisiologica. La situazione

opposta e’ detta dielettroforesi positiva. In base alla descrizione fatta in

precedenza, la forza in questione tende quindi a posizionare le particelle

in una zona centrale del pozzetto 14 e a spingere le particelle verso

l’alto. Dal momento che in generale le particelle o cellule di interesse

sono più pesanti dell’acqua, questa forza contrasta la tendenza ad

affondare delle particelle stesse. Quando le forze dielettroforetiche e

quelle gravitazionali si annullano, la particella rimane intrappolata in una

regione centrale del pozzetto. La equi-potenzialita’ degli elettrodi 1 e 4

permette di realizzarli tramite un’unica struttura metallica forata come

mostrato in Figura 2, mentre gli elettrodi 3 e 6 sono realizzati come in

Figura 3. E’ chiaro quindi che la realizzazione di questa struttura e’ di

estrema semplicità dal momento che non richiede alcun allineamento tra

gli elettrodi superiori, inferiori ed il pozzetto. L’unico allineamento

richiesto e’ quello necessario tra il pozzetto 14 e la zona che separa gli

elettrodi 3 e 6 come mostrato in Figura 3. Nel caso in cui le particelle

abbiano peso specifico inferiore a quello del fluido in cui sono immerse

esse galleggiano. In questo caso e’ possibile realizzare una struttura

degli elettrodi che permette un controllo delle particelle esercitando una

forza sulle stesse che bilancia la spinta di galleggiamento. La nuova

configurazione degli elettrodi e’ ottenuta sostituendo all’elettrodo

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mostrato in Figura 2 quelli mostrati in Figura 5. In questo caso gli elettrodi 1 e 4 sono elettricamente separati e quindi e’ possibile imporre tensioni differenti ai due. Scegliendo ora di applicare una coppia di tensioni sinusoidali ad 1 e 4 aventi valor medio nullo, uguale ampiezza mentre la fase della tensione applicata ad 1 e’ uguale a quella imposta a 6 e quella applicata a 4 e’ uguale a quella applicata 3, l’analisi svolta in precedenza si può applicare nuovamente con una importante variante: la differenza di potenziale tra 1 e 4 crea una zona tra di essi compresa in cui il modulo del campo e’ significativo. Nelle condizioni di uso più frequente, questo campo elettrico avente modulo significativo tra i due elettrodi superiori genera una forza che contrasta la forza di galleggiamento delle particelle. In aggiunta, a causa della presenza di forze esercitate dagli elettrodi inferiori 3 e 6 che spingono verso l’alto le particelle e quelli superiori 1 e 3 che spingono verso il basso, si ha un effetto di intrappolamento delle particelle. Qualora poi l’ampiezza della tensione impressa tra 3 e 6 fosse nulla, si avrebbe una situazione speculare a quella descritta inizialmente. Un esame della Figura 6 permette di chiarire ulteriormente il funzionamento del dispositivo. La sezione mostrata e’ sita lungo l’asse A-A’ ed ha particolare rilevanza poiché, a causa della simmetria assiale, il campo elettrico ha struttura bidimensionale allineata al piano mostrato. Nell’ipotesi significativa per le applicazioni di interesse e semplificativa per l’analisi del comportamento elettrico del dispositivo, si assuma anche che le distanze tra le zone a contatto del fluido degli elettrodi 1 e 3, 1 e 4, e 4 e 6 siano le stesse.

Nell’ipotesi che le tensioni impresse agli elettrodi siano sinusoidali con

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stessa fase per 1 e 6 e fase ruotata di 180 gradi in 4 e 3, da questo si

ottiene come approssimazione che il campo elettrico ha l’andamento

illustrato dalle frecce mostrate in figura. In particolare, e’ elevato nelle

zone in cui le coppie di elettrodi 1, 4 e 3, 6 sono affacciate. Dal momento

poi che la distanza tra 1 , 3 e 4, 6 e’ analoga a quella tra 1 , 4 e 3, 6, si ha

un significativo campo elettrico anche tra queste due ultime regioni.

Quanto piu’ ci si avvicina alla regione centrale, tanto piu’ le linee di

campo si elidono, riducendo quindi l’intensità del campo stesso e

creando un minimo di modulo di campo nella regione centrale del

pozzetto. Per ragioni di simmetria, il modulo del campo elettrico lungo la

sezione centrale della struttura e’ nullo. Rammentando quanto detto in

precedenza, la zona centrale e’ quindi caratterizzata da una

configurazione di campo in grado di intrappolare le particelle presenti

all’interno del pozzetto.

Variando il modulo del campo e’ noto che si varia l’intensità della forza

dielettroforetica applicata alla particella. Ad esempio, assumendo di

essere in presenza di una particella avente peso specifico superiore a

quello dell’acqua e quindi avente tendenza a sprofondare nel pozzetto, e'

possibile modulare in ampiezza i voltaggi impressi agli elettrodi 3 e 6,

mentre i voltaggi impressi a 1 e 4 sono ad esempio nulli, ottenendo che,

se la suddetta variazione in ampiezza e’ lenta paragonata alle costanti di

tempo proprie del moto della particella in un fluido viscoso, la particella

trasli con moto alternato in direzione verticale nel pozzetto. Questa

osservazione ha una notevole importanza per le applicazioni ai sensori

che verranno illustrate in seguito.

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In base a quanto detto sino ad ora, e’ quindi possibile creare una zona centrale al dispositivo ove il modulo del campo elettrico e’ nullo. Questa zona ha lunghezza pari all’intero diametro del pozzetto 14 ed e’ sita lungo il piano A-A’ nella zona intermedia del pozzetto 14. In molti casi e’ utile considerare come sia possibile creare gabbie chiuse, intendendo con questo dire gabbie che forzano il contatto tra particelle che si trovano nella zone di mimino uni-dimensionale di campo di cui sopra.

Per fare questo possiamo esaminare il caso illustrato in figura 10. Nelle ipotesi che due particelle soggette a dielettroforesi negativa siano state inserite nel pozzetto ed in esso intrappolate nella regione di minimo di campo, la loro locazione e’ approssimativamente quella mostrata in figura 10. Assumiamo ora per semplicità che la forza di gravita’ non abbassi molto il livello a cui si trovano le particelle stesse ed esse rimangano in posizione allineata con gli elettrodi 2 e 5 che in questo caso sono stati costruiti in modo da essere allineati con la linea di minimo di campo elettrico e sono ora ortogonali al piano A-A’ differentemente da quanto mostrato nelle precedenti figure. Operazioni che coinvolgono l’uso di questa coppia di elettrodi richiedono la applicazione di tensioni sinusoidali agli stessi. Assumiamo che si scelga per queste tensioni valor medio nullo ed una fase pari a 90 e 270 gradi rispettivamente per quella applicata all’elettrodo 2 e 5, con riferimento di fase all’elettrodo 1. Se la differenza di potenziale di picco tra 2 e 5 e’ inferiore a quella imposta tra 1 e 4 e tra 3 e 6, la configurazione di campo avente un minimo lungo l’asse centrale e’ sostanzialmente preservata. Il campo indotto invece dagli elettrodi 2 e 5 ha un importante

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effetto sulle cellule 22 e 23 che normalmente hanno costante dielettrica e conducibilità’ elettrica avente valore inferiore a quella del fluido circostante e quindi le particelle si trovano in situazione di dielettroforesi negativa. In queste condizioni e grazie alla forma quasi sferica di cellule in sospensione, le cellule 22 e 23 sì comportano come lenti divergenti di campo elettrico. Questo vuole dire che ad esempio 22 crea un aumento di campo elettrico nella zona tra 22 e l’elettrodo 2, mentre 23 fa lo stesso nella zona tra 23 e l’elettrodo 4. Per la stessa ragione, 22 riduce l’intensità di campo nella regione opposta a 2 e 23 nella regione opposta a 4. Questi minimi e massimi relativi di intensità di campo elettrico hanno l’effetto di sospingere le due cellule in prossimità stretta sino al loro contatto. E’ chiaro che la forza richiesta per ottenere questo scopo e’ molto piccola poiché non deve contrastare altre forze come quella di gravita’. In queste condizioni e’ possibile quindi generare un contatto tra cellule e/o altri oggetti e tenerli tra di loro a contatto. In aggiunta, l’allineamento delle cellule con gli elettrodi di misura le colloca in posizione favorevole per la misura stessa. Una dettagliata trattazione di questi argomenti può’ essere rintracciata nel libro di H. Morgan e N.

Green, AC Electrokinetics: colloide and nanoparticles”, 2003, Research Studies Press, Baldock, England, pp. 59-62. Un’altra applicazione di questa analisi e’ mostrata in Figura 11. La forma conica del pozzetto 14 e’ ottenuta tramite impulsi laser applicati in sequenza di opportuna intensità. Se si depone nel pozzetto una microsfera ad esempio di polistirene, in assenza di campo impresso la stessa e’ soggetta alla forza di gravita’ e raggiunge il fondo del pozzetto. Nel caso in cui il

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diametro di (14) sia inferiore a quello della sfera, la stessa si arresta

come mostrato in Figura 11. Se ora si applicano tensioni adeguate agli

elettrodi (3) e (6), essi inducono un forte campo nella regione a loro

vicina. Il campo viene amplificato a causa della presenza della sfera e si

forma un massimo relativo che spinge la sfera verso l’alto. Se le tensioni

impresse a (3) e (6) vengono poi riportate a condizioni di equipotenziali,

la sfera torna a cadere per forza di gravita’. Si ha quindi la possibilità di

creare una valvola programmabile che separa, quando chiusa, il

pozzetto (14) dal canale (10) ad esso sottostante.

Vediamo adesso come il dispositivo oggetto della presente invenzione

può’ essere impiegato come sensore.

Gli attuatori integrati realizzati dagli elettrodi 1 , 3, 4 e 6 sono costruiti su

piani tra i quali e’ locato un altro piano in cui si trovano gli elettrodi 2 e 5.

Questi elettrodi hanno un differente compito rispetto agli altri: essi sono

usati per misurare l’impedenza esistente tra gli elettrodi stessi. Dal

momento che le particelle di interesse biologico hanno una sostanziale

differenza di capacità e, in alcuni casi, di resistenza rispetto al mezzo

circostante, la presenza o assenza di una particella modifica la

impedenza complessiva vista tra i due elettrodi. La misura può essere

più precisa arrivando a misurare anche il tipo di cellula che si viene a

trovare tra gli elettrodi come descritto da Sohn et al., PNAS, Seti. 26,

2000, Voi. 97. Un aspetto innovativo della presente invenzione e’ legato

al fatto che l’allineamento della particella di fronte agli elettrodi 2 e 5 e’

essenziale per massimizzare il rapporto segnale/rumore ottenuto durante

la misura. La possibilità di muovere la particella all’interno del pozzetto

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consente di collocarla in una posizione in cui e' massima la variazione di

impedenza. Un ulteriore aspetto innovativo della presente invenzione e’

la possibilità offerta di misurare particelle molteplici volte mentre sono in

movimento, spostate dalla variazione di ampiezza di tensione imposta ai

morsetti o dal moto casuale indotto dal fluido soggetto a fluttuazioni

termiche. Lo spostamento della particella induce una variazione della

impedenza nel tempo. Nel caso in cui si possa campionare più volte il

valore della stessa in corrispondenza di differenti posizioni, e’ possibile

determinare il valore della impedenza valutando parametri chiave quale

ad esempio il valore massimo che essa acquisisce nel tempo, allo scopo

di ottenere una precisa collocazione della particella tra gli elettrodi 2 e 5.

Il sensore e’ costituito da elettrodi metallici 2 e 5 che hanno larghezza

sensibilmente inferiore rispetto a quella degli elettrodi che fungono da

attuatori 1, 3, 4 e 6. In questo ambito e’ quindi opportuno considerare il

fatto che il campo elettrico generato dagli attuatori e’ modificato dai

sensori a cui viene impressa una tensione molto più piccola di quella

imposta agli altri elettrodi. Assumendo come prima approssimazione che

i sensori siano modellabili come una massa, si ottiene che il campo

elettrico ha modulo ridotto nelle zone locate di fronte ad essi. Pur

essendo questa una variazione di modesta entità spaziale, essa rafforza

il minimo di campo elettrico sito in zona centrale alla struttura rispetto

alle zone circostanti e quindi contribuisce ad aumentare la capacità di

intrappolamento della struttura. La qualità della misura e’ influenzata

dagli accoppiamenti capacitivi che legano gli elettrodi di misura con quelli

necessari per l'attuazione. Il rumore prodotto dalle tensioni variabili nel

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tempo sugli elettrodi deputati all’attuazione deve quindi essere eliminato prima della lettura del segnale desiderato. Le due tecniche possibili sono le seguenti: filtraggio del rumore in frequenza o spegnimento degli elettrodi per attuazione durante la lettura dell’impedenza.

Nel primo caso, si sfrutta il fatto che l’oscillazione applicata per l’attuazione può avere una frequenza differente da quella utilizzata per leggere l’impedenza. In questo caso, e’ noto agli esperti del settore che un filtro passa-banda avente un adeguato valore di reiezione della frequenza indesiderata riduce fortemente l’accoppiamento. Un’altra tecnica sfrutta il concetto di misura in presenza di particelle in movimento. In questo caso la procedura e’ organizzata come segue: 1) gli elettrodi di attuazione 1, 3, 4 e 6 applicano una tensione in grado di collocare la particella in posizione soprastante quella degli elettrodi di misura 2 e 5; 2) gli elettrodi di attuazione sono fissati ad un potenziale di riferimento o potenziale di massa; 3) gli elettrodi di misura 2 e 5 misurano in modo continuo nel tempo l’impedenza tra gli elettrodi stessi. Dal momento che la forza di gravita’ sposta verso il basso le particelle, la misura di impedenza vede una prima fase in cui la particella e’ soprastante i sensori, una seconda durante la quale la particella si posiziona di fronte ai sensori ed un’ultima durante la quale la particella li sorpassa, scendendo verso il basso. E' possibile quindi raccogliere una quantità di dati che possono essere sfruttati essendo nota la dinamica con cui si spostano le particelle.

Vediamo nel seguito come avviene il funzionamento del dispositivo come schiera di sensori ed attuatori

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L’organizzazione di una molteplicità di dispositivi del tipo di quelli qui

mostrati e’ facilmente ottenibile come mostrato in Figura 8 per i sensori e

in Figura 9 per una parte degli attuatori.

Focalizzandoci sulla organizzazione dei sensori, il funzionamento di una

schiera quale quella indicata in Figura 8, che rappresenta il piano

contenente gli elettrodi 2 e 5, si interpreta come segue. Gli elettrodi 5, 5’,

7 e T mostrano la situazione di una schiera che comprende 4 pozzetti.

La generalizzazione ad un caso a maggiore parallelismo e’ immediata. Si

immagini ora di applicare una tensione sinusoidale all’elettrodo 5 mentre

l’elettrodo 5’ e’ mantenuto connesso ad una tensione di riferimento

uguale a quella imposta su 20. In questa condizione, si colleghino agli

elettrodi 7 e 7’ due amplificatori operazionali 18 aventi l’ingresso non

invertente 20 connesso a una tensione di riferimento. La retroazione

esercitata tramite l’impedenza 19, realizzata ad esempio come una

resistenza, forza la tensione su 7 e 7’ ad avere lo stesso valore della

tensione di riferimento imposta su 20. La corrente che fluisce su 19 per

tenere le tensioni costanti come precedentemente descritto causa una

caduta di tensione sull’impedenza 19 e quindi una variazione di tensione

sulla uscita 21 dell’amplificatore. Se solo un elettrodo viene stimolato,

l’assorbimento di corrente richiesto da una colonna 7 o 7’ e’ dovuto

all’assorbimento richiesto dalla corrente che fluisce nei pozzetti stimolati

dalla tensione imposta su 5, mentre tutti gli altri pozzetti non hanno

alcuna caduta di potenziale sulle coppie di elettrodi 5’-7 e 5’-7’ che sono

equipotenziali. In questo modo e’ possibile controllare l'impedenza che si

viene a creare attraverso ciascun pozzetto scandendo in modo

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sequenziale la schiera. Se necessario e’ poi possibile ripetere la scansione in modo ciclico.

Il funzionamento a schiera del dispositivo come attuatore e’ più semplice come mostrato in Figura 9 che mostra uno dei piani su cui si trovano gli elettrodi. La descrizione che segue del funzionamento si ripete in modo identico anche per l’altro piano. In particolare, la tensione che e' necessaria per creare le gabbie in cui verranno contenute le particelle aventi rilievo biologico richiedono tensioni tra di loro identiche se il materiale e’ analogo. In queste condizioni quindi e’ sufficiente collegare tra di loro tutti gli elettrodi 3 e stimolarli con una tensione sfasata di 180 gradi rispetto agli elettrodi 6 tutti equipotenziali e collegati tra di loro. Nel caso in cui la schiera superiore sia organizzata come mostrato in Figura 5, si ottiene che tutti gli elettrodi 1 possono essere tra di loro equipotenziali ed anche equipotenziali con gli elettrodi 6, mentre gli elettrodi 4 possono essere tra di loro equipotenziali e anche equipotenziali con gli elettrodi 3. In queste condizioni quindi si vede che a livello di “microtiter” due sole tensioni sono necessarie per pilotare gli elettrodi necessari come attuatori dai vari pozzetti.

Vediamo adesso come si realizza il controllo del deflusso di particelle nel canale di uscita 10. Detto canale di uscita 10 permette di mettere in comunicazione gli ingressi di fluidi 16 con le fuoriuscite degli stessi 17, raccogliendo le cellule o le particelle eventualmente rilasciate dai pozzetti come prima descritto. Nel caso in cui non sia necessario mantenere alcuna informazione sulla locazione da cui le cellule sono state rilasciate, il flusso stesso del fluido consente di trasportare il

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materiale. Nel caso in cui si desideri mantenere una informazione

precisa relativa alla locazione del pozzetto da cui il materiale e' stato

rilasciato, e’ opportuno organizzare la superficie superiore e inferiore dei

canali 10 come mostrato in Figura 12. La superficie superiore del canale

e’ ora ricoperta di materiale conduttivo 25 e 26 in grado di imporre una

tensione che supponiamo essere nulla. Durante la apertura del pozzetto

e nel caso in cui sia assente la membrana, i potenziali 3 e 6 hanno

ampiezza nulla. Applichiamo ora una tensione sinusoidale di ampiezza

opportuna, tipicamente 5V per un canale largo 100 micron, all’elettrodo

27, mentre 28 e 29 sono connessi a massa. Questa scelta crea un

significativo modulo di campo elettrico nella zona soprastante 27 a causa

dei potenziali impressi e, in particolare, a causa degli effetti indotti dagli

spigoli degli elettrodi. Questo campo elettrico ha una regione di intensità

modesta nella zona soprastante gli elettrodi 28 e 29 che sono

equipotenziali a 25 e 26. In queste condizioni una particella sottoposta a

dielettroforesi negativa si colloca nella regione che sovrasta 28. Se ora si

applica a 28 lo stesso potenziale applicato a 27 mentre il potenziale

impresso a 29 e’ a massa, si ottiene che la particella si sposta verso la

nuova zona di minimo di campo elettrico che sovrasta 29. In questa

maniera, ripetendo la procedura, e’ possibile spostare una particella con

precisione da un pozzetto alla uscita del sistema. Il problema di questo

controllo dello spostamento e’ legato alle zone in cui un pozzetto

soprastante toglie il riferimento di potenziale superiore. In queste

condizioni e’ importante la presenza degli spigoli degli elettrodi (26) per

indurre un significativo effetto di repulsione.

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Vediamo ora il funzionamento del dispositivo oggetto della presente

invenzione come elettroporatore e modificatore cellulare.

La disponibilità di una schiera di pozzetti all’interno dei quali e’ allocata la

capacità di effettuare movimentazione e misurazione delle caratteristiche

delle particelle permette di creare un efficiente elettroporatore in grado di

lavorare in parallelo su moltitudini di singole cellule. Come si comprende

dalla precedente descrizione di funzionamento, il dispositivo permette di

effettuare con efficienza numerose manipolazioni che sono essenziali

per questo protocollo. In particolare, e’ possibile collocare i

microrganismi di fronte agli elettrodi di misura 2 e 5 ed accertarsi di

questo tramite misure di impedenza. A valle di queste misure gli stessi

elettrodi possono essere utilizzati per forzare tensioni della entità

richiesta per ottenere elettroporazione. Gli impulsi di potenziale possono

essere di intensità minore di quanto normalmente usato negli

elettroporatori convenzionali. Questo e’ dovuto al fatto che la

elettroporazione avviene in una camera di dimensioni idonee a

contenere una o pochissime cellule. La ridotta dimensione fa si che si

possa ottenere un campo significativo anche con modeste escursioni di

potenziale. Questi potenziali opportunamente imposti creano dei pori

temporanei nella membrana cellulare e permettono a specie presenti nel

supernatante a concentrazione superiore a quella che si trova nel

citoplasma di migrare all’interno della cellula stessa. Di particolare utilità

e’ la possibilità di cambiare il supernatante all’interno del quale viene

collocato il microrganismo. E’ infatti noto che la elettroporazione richiede

supernatanti caratterizzati da bassa conducibilità per evitare un

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eccessivo passaggio di corrente e quindi un eccessivo riscaldamento del

materiale biologico. Questi supernatanti sono però poco idonei ad

ospitare per un tempo prolungato il microrganismo dopo la

elettroporazione. E’ quindi normale pratica rimuovere i microrganismi

dalle camere al cui interno avviene la procedura e spostarli in ambienti

più idonei per superare la fase critica durante la quale si ha una

riparazione della membrana. Questa procedura e’ difficile da effettuare

quando si ha a che fare con piccoli numeri di cellule ed, in aggiunta, si

trova che lo spostamento dei microrganismi tende a perturbarli durante

questa fase delicata. La soluzione proposta in questo brevetto risolve

questo problema, in quanto il supernatante può cambiare mentre il

microrganismo rimane in una collocazione stabile, mantenuto in sito

dalle gabbie dielettroforetiche. Per schematizzare i vari passi, si inizia

quindi da una fase in cui il supernatante e’ costituito da soluzione

fisiologica per mantenere il microrganismo in condizioni ottimali. Si

sostituisce quindi il supernatante precedente con una soluzione a bassa

conducibilità. Durante questa fase e’ possibile controllare la collocazione

delle particelle tramite la procedura descritta in precedenza a proposito

degli attuatoli. Dopo che la elettroporazione e' avvenuta, si elimina il

supernatante a bassa conducibilità e si ripristina la situazione originaria,

tornando a porre il microrganismo in condizioni ottime per ricostruire la

membrana danneggiata senza doverlo spostare.

Un altro protocollo di grande importanza per il cambiamento del

patrimonio genetico di microrganismi e’ quello di elettrofusione. In questo

caso, la procedura precedentemente descritta non cambia, ma si sfrutta

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la deposizione di singole cellule di differente tipo all’interno delle camere per poter creare un ampio numero di fusioni tra cellule in parallelo. In particolare, come ampiamente descritto in letteratura per grandi numeri di cellule o batteri, si crea un aggregato cellulare a cui si applica un potenziale in grado di facilitare la fusione dei microrganismi opportunamente trattati in modo da facilitare lo scambio di DNA. Nel caso di batteri, gli organismi vengono trattati in modo tale che la membrana perda lo strato protettivo. I protoplasti cosi ottenuti sono messi a contatto tra di loro applicando i potenziali descritti nella sezione dedicata agli attuatori e creando una forza dielettroforetica che obbliga i protoplasti a rimanere nella stessa regione spaziale. In seguito sono fatti fondere tramite l'applicazione di una tensione opportuna. La procedura si completa permettendo ai microrganismi che sono sopravvissuti di ricostruire la membrana e di recuperare le funzionalità vitali danneggiate dall’intervento precedentemente descritto. L’intera procedura ricalca quanto detto per la procedura di elettroporazione. In particolare, la possibilità di cambiare il supernatante in differenti fasi permette di introdurre liquido a bassa conducibilità quando si cerca la fusione dei protoplasti, liquido in grado di eliminare lo strato protettivo della membrana durante la fase di preparazione degli stessi ed infine liquido contenente opportuni composti nutritivi durante la fase di riattivazione funzionale. Dal momento che i pozzetti consentono di eseguire tutti questi passi su scala di singole cellule, la procedura complessiva a

p

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nuove possibilità di organizzazione dei protocolli in quanto l’esito della procedura di fusione e’ molto controllato e quindi sono applicabili algoritmi di ottimizzazione che si basano sulla conoscenza della precisa interazione tra cellule che ha dato un certo tipo di risultato.

Le procedure precedentemente descritte danno luogo ad una popolazione di batteri che a) sono sopravissuti al trattamento e b) mostrano caratteristiche funzionali differenti tra di loro.

I sensori disponibili nel pozzetto sono fondamentali durante questa fase poiché: a) la sopravvivenza può’ essere misurata grazie al fatto che la massa cellulare cresce e quindi modifica l’impedenza misurata tra gli elettrodi in carico della misura; b) in dipendenza dal tipo di fenotipo cercato, e’ a volte possibile effettuare una selezione dei cloni che evidenziano una maggiore espressione del fenotipo stesso. A titolo di esempio, la capacità di un ceppo batterico di produrre sostanze lipidiche può essere misurata grazie al fatto che la costante dielettrica e la resistività dei lipidi e’ molto differente da quella degli altri materiali costituenti una cellula. In questo caso ad esempio si ha quindi una dipendenza della impedenza misurata dalla concentrazione dei lipidi.

Applicazione alla selezione di cloni cellulari basati su selezione funzionale.

La piattaforma oggetto del presente brevetto ha un’applicazione immediata alla selezione di cloni basati sulle loro capacità litiche selettive nei confronti di opportune cellule bersaglio. A titolo di esempio, e’ noto che alcune cellule del sistema immunitario appartenenti alla famiglia delle CTL e NK esibiscono una attività litica significativa nei confronti di

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cellule tumorali riconoscendo le cellule sane come tali. E’ ancora ignoto

perché queste cellule con effetto litico siano presenti in numero ridotto

nei pazienti e, ancora piu’ importante, come sia possibile isolare queste

cellule di particolare interesse. Si pone quindi un problema di selezione

funzionale di cellule, owero di cellule che vengono scelte non in base a

marcatori di superficie noti, bensì’ grazie al fatto che dimostrano speciali

proprietà funzionali.

Quanto spiegato in precedenza consente di realizzare su questa

piattaforma un protocollo di selezione basato sulla disponibilità di

macchine in grado di depositare singole cellule quali quelle prodotte da

DakoCytomation e seguendo questi passi: 1) le cellule bersaglio, ad

esempio cellule tumorali, sono depositate nei pozzetti in quantità nota e

ad esempio con una cellula per pozzetto; questo risultato richiede che la

cellula depositata venga catturata dal dispositivo; 2) si deposita nei

pozzetti una quantità nota di cellule aventi presumibile effetto litico, ad

esempio una cellula; le tensioni rimangono tali da catturare le particelle

inserite nel pozzetto; 3) avendo creato una configurazione di campo che

forza l’interazione di superficie tra le cellule presenti all’interno di un

pozzetto, si misura se si ha un effetto litico tramite il rilevamento di una

differente impedenza tramite una procedura simile a quella descritta

precedentemente; 4) si recuperano le cellule che hanno mostrato un

effetto litico e si espandono in modo monoclonale in un contenitore

convenzionale; 5) si effettua la procedura descritta ai punti 1) - 4) per

verificare se le cellule cosi selezionate hanno un effetto selettivo, ovvero

non attaccano bersagli indesiderati, quali ad esempio cellule sane; 6) si

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espandono nuovamente le cellule nel caso in cui la selettività sia

accertata. In questo caso, la piattaforma oggetto di questo brevetto e’

utile anche per verificare e eventualmente selezionare le cellule durante

la loro espansione in vitro. Come e’ noto infatti, la espansione di cellule

CTL mostra che dopo alcuni cicli di riproduzione, il codice genetico di

alcune cellule figlie cambia. Questo e’ di particolare rilevanza se si

considera che il numero di cellule selezionate durante la fase iniziale del

protocollo e’ dell’ordine di alcune decine mentre le quantità utili da un

punto di vista terapeutico richiedono alcuni centinaia di milioni di cellule.

Il numero di cicli di espansione richiesto e’ superiore a quello durante il

quale si preserva il codice genetico originario. Il problema può essere

risolto eseguendo una procedura a più passi di selezione simili a quelli

precedentemente descritti. A titolo di esempio, si espandono una prima

volta le cellule estratte tramite la selezione e, dopo un opportuno numero

di espansioni, si verificano tramite una ripetizione della procedura di

selezione se le cellule mostrano le stesse caratteristiche funzionali. In

questo modo, il numero di espansioni necessarie per raggiungere un

valore terapeutico e’ ridotto e la riproducibilità delle caratteristiche

funzionali delle cellule e’ garantita, li funzionamento ora descritto e’

ottenuto applicando una sequenza di tensioni opportune. In particolare

durante le fasi di deposizione di cellule nei pozzetti, verranno attivate le

tensioni agli elettrodi (3) e (6), mentre gli altri elettrodi avranno tensione

con ampiezza nulla. Questa scelta permette di avere una chiusura alla

uscita del pozzetto e di non intralciare l’introduzione delle cellule nello

stesso. La fase di interazione procede come descritto in precedenza,

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applicando una tensione appropriata a tutti gli elettrodi con lo scopo di

forzare l’interazione tra di esse. La eventuale lisi viene rilevata dai

sensori di cui i vari pozzetti sono dotati o tramite osservazione ottica

basata sul rilascio di opportuni coloranti che vengono rilasciati quando le

cellule subiscono lisi. Queste osservazioni permettono di rilevare quando

e dove si hanno cellule di interesse che debbono essere recuperate. La

procedura di recupero può essere organizzata come segue: 1) tutti i

potenziali impressi agli elettrodi 1 e 4, 2 e 5 vengono posti a massa; 2) le

tensioni applicate agli elettrodi 3 e 6 subiscono un aumento della

ampiezza della tensione scelto in modo tale che la tensione impressa sia

sufficiente da impedire la fuoriuscita di particelle dal pozzetto anche nel

caso in cui uno degli elettrodi 3 o 6 venga posto ad ampiezza nulla; 3) si

sceglie il pozzetto di cui si desidera recuperare il contenuto; assumiamo

che le coordinate del pozzetto in questione siano identificate da due

numeri i e j, associati rispettivamente alla riga e colonna che identificano

univocamente il pozzetto prescelto; 4) si pone a ampiezza nulla la

tensione associata all’elettrodo 3 della riga i e all’elettrodo 6 della riga j.

Questa scelta permette di avere le seguenti situazioni: a) pozzetti i cui

elettrodi 3 e 6 hanno ad essi associata una tensione avente fase 0 e 180

ed una ampiezza tale da impedire il deflusso del contenuto dei pozzetti;

b) pozzetti lungo la colonna j e la riga i con eccezione del pozzetto i,j; in

questo caso abbiamo che almeno uno degli elettrodi 3 o 6 ha una

tensione ad esso associato avente ampiezza tale da impedire il deflusso

del contenuto del pozzetto; c) il pozzetto i.j e’ l’unico avente ambedue gli

elettrodi 3 e 6 ad esso afferenti aventi tensione ad essi associata con

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ampiezza nulla. In base a questo fatto, e’ quindi possibile selezionare con precisione uno solo tra tutti i pozzetti per il rilascio del contenuto del materiale. In questo contesto, le cellule che scendono nel canale 10 sono ora trasportabili verso il terminale di uscita 17.

Vediamo adesso in dettaglio un ulteriore impiego del dispositivo secondo la presente invenzione che costituisce una metodologia fluidica per ridurre l’intensità della forza dielettroforetica.

L’intensità della forza dielettroforetica e’ imposta dal contrasto che essa esercita nei confronti della forza di gravita’. La struttura del pozzetto che ha l’orifizio superiore aperto consente di utilizzare in modo sinergico la possibile evaporazione del liquido per ridurre l’intensità’ richiesta alla forza dielettroforetica stessa, riducendo quindi i campi elettrici richiesti e la dissipazione di potenza nel fluido. Il controllo microfluidico di particelle e’ stato presentato in letteratura in numerosi ambiti. Si cita a titolo di esempio il lavoro apparso su Lab on a Chip, 2005, pp. 1355-1359 in cui si documenta come il flusso di fluido controllato possa essere usato per spostare particelle. La esigenza di effettuare spostamenti precisi richiede complesse strutture di controllo della temperatura che non sono facilmente generalizzabili a schiere quali quelle descritte in questo brevetto. Sempre a titolo di illustrazione, minuscole gocce d’acqua che si formino su superfici idrofile o idrofobe hanno forme differenti come mostrato in Figura 13. Si consideri ora Figura 14 in cui si mostra la presenza di liquido che crea un menisco 30. In questa figura si assume che l’intero pozzetto sia caratterizzato da pareti idrofile mentre solo la superficie superiore e’ idrofoba. La superficie 30 e’ esposta ad un flusso

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di aria possibilmente forzato da opportuno meccanismo che induce una

evaporazione del liquido stesso. La evaporazione causa un moto verso

l’alto del fluido presente nel pozzetto che produce un moto contrastante

quello indotto dalla forza di gravita’. In particolare, la velocità richiesta al

flusso di liquido per contrastare completamente la forza di gravita’

assumendo che la velocità di discesa di una cellula eucariota immersa in

acqua e’ dell’ordine di 10 u/secondo. Un flusso di uguale ed opposta

velocità che fluisca in un pozzetto 14 avente diametro pari a 50 micron

nella regione ove sono presenti gli elettrodi da’ luogo ad una portata di

fluido pari a 1 nL/minuto. Se la forma del pozzetto nella regione

soprastante a quella ove sono siti gli elettrodi mostra un rapido aumento

di diametro sino a 1mm nella regione ove si forma il menisco 30,

l’evaporazione richiesta per bilanciare la portata richiesta e’ compatibile

con quella ottenibile tramite un flusso di aria in convezione forzata con

un salto di temperatura pari a 7K rispetto al punto di rugiada. Nelle

condizioni appena descritte, e’ chiaro che il controllo della posizione

della particella risulta essere impreciso se il flusso di fluido fosse l’unico

modo di controllo della particella. Combinando invece la tecnologia

basata su principi dielettroforetici con quella che sfrutta la evaporazione

del fluido, si ottiene una utile sinergia tra la precisione offerta dal primo e

la riduzione dei campi elettrici resi possibili dal secondo metodo.

Una dimostrazione di fattibilità del protocollo di selezione funzionale di

cellule con attività litica e’ descritta negli esperimenti mostrati nelle figure

15-17 realizzati con un piattaforma commerciale, il DEPArray, prodotto

da Silicon Biosystems S.r.l., Bologna, Italia.

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In figura 15 è mostrato che il DEPArray crea gabbie dielettroforetiche secondo un principio fisico analogo a quello della presente invenzione e che gli effetti elettromagnetici sono compatibili con una misurazione delle condizioni cellulari di tipo ottico ed in particolare con la misurazione di fluorescenza in seguito a marcatura con calceina. Un totale di 95 cellule sono state collocate in un DEPArray, , marcate con calceina ed esposte per più di 20 minuti a campi elettromagnetici a 100 MHz di ampiezza analoga a quella richiesta nella presente invenzione .Si e’ potuto osservare che queste cellule danno un segnale di fluorescenza rilevabile senza calo di intensità per tutta la durata dell’esposizione al campo elettrico, confermando che in queste condizioni non si hanno importanti fenomeni di lisi spontanea .

La possibilità di evidenziare con il metodo descritto nella presente invenzione, l’attività litica di CTL effettori verso cellule bersaglio che presentano antigeni tumorali, è dimostrata nell’esperimento della figura 16. Il contesto sperimentale è il seguente: linee cellulari linfoblastoidi (LCL) sono state ottenute dopo infezione di linfociti B umani con il ceppo Epstein-Barr Virus (EBV) B95.8 (Salter, R. D., and P. Cresswell. 1986.

Impaired assembly and transport of HLA-A and -B antigens in a mutant TxB celi hybrid. EMBO J. 5:943-949). Il peptide EBV-specifico HPVGEADYFEY (corrispondente agli aa 407-417 della proteina EBNA1) è stato utilizzato per la stimolazione. Linfociti da sangue periferico (PBL) da un donatore HLA-B35 sono stati piastrati alla concentrazione di 3,5x10<6>cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti in terreno di coltura RPMI 1640, 10% FCS (Hyclone) e stimolati con il peptide HPV (10 μΜ).

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Le colture sono state ristimolate dopo 7 e 14 giorni, e il medium è stato supplementato con 10 U/ml rlL-2 (Chiron). Ai giorni 14 e 21 le colture di cellule T sono state analizzate per attività CTL utilizzando canonici saggi di citotossicità (<51>Cr-release) (Hillman GG, Roessler N, Fulbright RS, Pontes JE, Haas GP. 51Cr-release assay adapted to a 96-well format sample reading. Biotechniques. 1993;15(4):744-9).

Nell’esperimento i cui risultati sono riportati in Figura 16, la linea linfoblastoide umana infettata con EBV (LCL), ulteriormente caricata con un peptide EBV (LCL-B35 positiva) e marcata con calceina è stata incubata con CTL ottenuti da PBL (Peripheral Blood Lymphocytes) di sangue periferico depleti di monociti e stimolati in vitro con un peptide specifico di EBV (corrispondente agli aa 407-417 della proteina EBNA1 di EBV) e con IL-2. In figura 16 è mostrato che linfociti bersaglio precimentati con CTL specifici possono essere movimentati attraverso forza DEP e disposti in gruppi di 4-5 cellule, in array, nelle gabbie corrispondenti ai diversi elettrodi. Dopo 12 minuti, i complessi di cellule che contengono CTL, rilevabili come segnali fluorescenti, scompaiono solo dove si ha lisi specifica (12 minuti, pannello di sinistra), resa possibile dalla presenza sulle cellule bersaglio degli epitopi tumorali (peptide di EBV) riconosciuti dai CTL. La riproducibilità della lisi specifica è stata verificata nell’esperimento mostrato in figura 17, in cui sono riportate le medie di tre esperimenti diversi effettuati come descritto per la figura 16. La rilevazione del segnale di fluorescenza effettuato ogni 30 minuti secondi in tempo reale, indica che il sistema messo a punto basato su gabbie DEP, permette di rilevare lisi specifica dei complessi

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che comprendono CTL e che tale lisi si evidenzia con valori distinguibili

da un controllo (cellule “bersaglio” non caricate con il peptide) già dopo

2’.

E’ stato quindi dimostrato secondo la presente invenzione che una

attività biologica quale quella di riconoscimento e lisi specifica di linfociti

bersaglio da parte di CTL non viene modificata dalle condizioni di dielettroforesi in associazione, ad esempio, con un metodo di marcatura

vitale con un colorante fluorescente quale calceina, che secondo la

presente invenzione può essere utilizzata come segnale ottico in dielettroforesi ed è in grado di rilevare le modificazioni di complessi

cellulari comprendenti da una a poche cellule bersaglio.

Pertanto la presente invenzione riguarda, secondo una realizzazione

preferita, un metodo per la selezione di cellule o di condizioni

sperimentali che inducono degenerazione cellulare, ad esempio lisi,

apoptosi, necrosi, dove tale degenerazione è rilevabile grazie alla

variazione di un segnale ottico o elettrico (ad es. impedenza) in un

tampone o altro mezzo biocompatibile. Tale metodo utilizza un supporto

solido, preferibilmente una micropiastra, comprendente i pozzetti

secondo l’invenzione disposti in serie che permette sia la

movimentazione di cellule all’interno di un pozzetto, finalizzata

all’interazione tra cellule ed alla loro disposizione in array che la

rilevazione di variazioni di impedenza all'interno dello stesso pozzetto o

microcamera.

La presente invenzione offre quindi i seguenti vantaggi:

a) la marcatura radioattiva delle cellule per la rilevazione di reazioni

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citolisi non è più necessaria;

b) molti gruppi di cellule incubate nelle stesse condizioni, possono essere seguiti in parallelo ed offrire valori statisticamente significativi;

c) l’analisi su singola cellula è in questo caso possibile, e questo comporta anche il vantaggio di poter utilizzare un numero di cellule bersaglio minimo;

d) il protocollo è veloce ed i risultati sono ottenibili nel giro di pochi minuti

e) la rilevazione delle alterazioni cellulari (ad es. citolisi) possono avvenire in tempo reale.

Secondo una realizzazione preferita il metodo è finalizzato alla selezione ed all’amplificazione di linfociti citotossici o NK, autoioghi o eterologhi in grado di riconoscere e lisare in modo specifico cellule tumorali, oppure cellule infettate con microorganismi, batteri e/o virus, o ancora cellule che presentano in condizioni patologiche caratteristiche antigeniche e/o funzionali riconoscibili rispetto a cellule normali.

Preferibilmente i linfociti autoioghi o eterologhi sono stimolati in modo aspecifico, o dove possibile anche in modo specifico, prima di essere cimentati con le cellule bersaglio.

Claims (1)

1. 7525PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A. RIVENDICAZIONI: 1. Un pozzetto caratterizzato dal fatto di comprendere almeno tre

   elettrodi al suo interno, atti ad essere polarizzati in modo tale da formare configurazioni di campo elettrico che intrappolino particelle al proprio interno tramite effetto dielettroforetico contrastante l’effetto gravitazionale; 2. il pozzetto secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto di comprendere una coppia di elettrodi in grado di misurare l’impedenza che si trova tra di essi; 3. il pozzetto secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto di avere il fondo collegato ad un erogatore di fluido; 4. il pozzetto secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto di avere quattro elettrodi in grado di generare campi elettrici tali da formare configurazioni di campo elettrico che intrappolino particelle al proprio interno tramite gabbia dielettroforetiche chiuse; 5. il pozzetto secondo le rivendicazioni 2 e 4 comprendente almeno due elettrodi collocati su di un piano intermedio a quelli in cui sono siti gli elettrodi di attuazione; 6. il pozzetto secondo la rivendicazione 5 in cui gli elettrodi sono collocati lungo l’asse di simmetria A-A’ in facce opposte rispetto a detto pozzetto; 7. il pozzetto secondo la rivendicazione 5 in cui gli elettrodi sono ortogonali all’asse di simmetria A-A’ in facce opposte rispetto al pozzetto; 8. il pozzetto secondo le rivendicazioni 6 e 7 caratterizzato dal fatto di essere in grado di creare gabbie dielettroforetiche che forzano il

   7525PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A. contatto tra cellule; 9. il pozzetto secondo la rivendicazione 5 caratterizzato dal fatto di misurare la variazione di impedenza dovuta alla presenza e alla caratteristica delle cellule in esso contenute; 10. il pozzetto secondo la rivendicazione 6 caratterizzato dal fatto di essere in grado di rilevare la variazione di impedenza dovuta alla lisi, o apoptosi di cellule in esso contenute; 11. il pozzetto secondo le rivendicazioni 1 - 10 caratterizzato dal fatto di rilevare segnali di tipo ottico 12. il pozzetto secondo la rivendicazione 11 dove tale segnale di tipo ottico è la fluorescenza in seguito a marcatura delle cellule con calceina 13. il pozzetto secondo le rivendicazioni 1 - 12 caratterizzato dal fatto di essere in grado di applicare tensioni opportune alle cellule in esso contenute causandone elettroporazione; 14. il pozzetto secondo le rivendicazioni 1 - 13 caratterizzato dal fatto di essere in grado di mettere a contatto cellule e sottoporle a procedura di elettrofusione. 15. Un supporto solido comprendente più pozzetti in accordo con le rivendicazioni 1-14 disposti in serie 16. Il supporto secondo la rivendicazione 15 costituito da una micropiastra multipozzetto 17. Un metodo per la selezione di cloni linfocitari in grado di lisare cellule bersaglio, basato sull'utilizzo di un supporto secondo le rivendicazioni 15-16. 18. Il metodo secondo la rivendicazione 17 in cui tali cloni linfocitari<O>r 7525PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A. sono autoioghi con la cellula bersaglio. 19. Il metodo secondo le rivendicazioni 17-18 dove tali cloni linfocitari sono linfociti citotossici (CTL), cellule naturai killer (NK). 20. Il metodo secondo le rivendicazioni 18-19 dove tali cellule bersaglio sono cellule tumorali, cellule infettate da microorganismi, cellule con attività autoimmune, cellule presentanti antigeni di superficie riconosciuti da CTL o da cellule NK. 21. Il metodo secondo la rivendicazione 20 dove tali microorganismi sono virus, batteri, funghi. 22. Un metodo per la preparazione di una popolazione cellulare di origine clonale caratterizzato dal fatto che il clone originale è selezionato con il metodo secondo le rivendicazioni -17-21 e comprendente un passaggio di amplificazione cellulare in vitro. 23. Il metodo secondo la rivendicazione 22 in cui il clone originale è un linfocita citotossico (CTL) ed in cui prima della selezione clonale la popolazione linfocitaria è stimolata in vitro. 24. Il metodo secondo la rivendicazione 23 dove tale stimolazione in

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