ES2285120T3 - Procedimientos de purificacion de adenovirus. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de purificación de partículas de virus a partir de un lisado de células huésped que comprende la precipitación selectiva de ADN separándolo así de las partículas de virus mediante la adición de un agente de precipitación selectiva al medio de cultivo de células huésped después de la lisis de manera que al menos el 80% de ADN impuro precipite en el medio que contiene las partículas de virus, en el que dicho agente de precipitación selectiva se selecciona entre PEI, sales de monoalquiltrimetilamonio, sales de monoalquildimetilbencilamonio, sales de dialquildimetilamonio, sales de amonio heteroaromáticas, sales de amonio bis- cuaternario y sales de amonio cuaternario poliméricas.
Description
Procedimientos de purificación de
adenovirus.
Esta solicitud reivindica el beneficio, a tenor
del artículo del código 35 U. S. C. \NAK 119 (e), a la solicitud
de Estados Unidos Nº de serie 60/380.322, presentada el 14 de mayo
de 2002.
No aplicable
No aplicable.
La presente invención se refiere a
procedimientos de purificación de partículas de virus, especialmente
partículas de vectores de adenovirus recombinantes. Este
procedimiento se desarrolla para purificar adenovirus a partir de
lisado de células. Usa una combinación de precipitación selectiva,
filtración en profundidad y/o centrifugación, ultrafiltración,
digestión por nucleasa y cromatografía para producir de manera
fuerte y económica producto altamente purificado. En este
procedimiento, los niveles de ADN de células huésped contaminantes
se reducen de manera consistente a menos del límite de
cuantificación de un ensayo a base de PCR específico de ADN humano
(< 5 pg/10^{11} vp).
Los avances en las áreas de del uso de vectores
víricos recombinantes para terapia génica y aplicaciones de
vacunación de ADN han creado una necesidad para la fabricación y
purificación a gran escala de virus de calidad clínica. Una familia
de tales virus son los adenovirus. Los adenovirus están agrupados
dentro de la familia de Adenoviridae, que están divididas en
el género Aviadenovirus (pájaros) y Mastadenavirus
(humano, simio, bovino, equino, porcino, ovino, canino y de
zarigüeya). Una revisión de la familia de Adenoviridae se
puede encontrar en Fundamental Biology, edición 3ª, Fields, B.N.;
Knipe, D.M. y Howley, P.M. eds., capítulo 30, p.
979-1016 (1996), que se incorpora en esta memoria
descriptiva por referencia. De interés específico en las
aplicaciones de la vacunación génica y/o terapia génica es el uso de
un adenovirus incompetente de replicación de primera generación
(FG), mutilado por las supresiones de los genes E1 y/o E1/E3,
basándose en el serotipo 5 de adenovirus. El adenovirus tiene un
amplio tropismo celular que incluye células que presentan antígenos
profesionales tales como macrófagos y células dendríticas, pueden
infectar (si no replicar en) células de la mayoría de las especies
de mamíferos, y se pueden producir en grandes cantidades en líneas
celulares humanas apropiadas diseñadas para proporcionar el
producto génico F1 en trans. El genoma del adenovirus en
general está asociado a patologías benignas en los seres humanos, y
la organización genómica del virus se ha estudiado bien desde su
descubrimiento a principios de los años 1950. Además, el genoma es
susceptible de manipulación, dependiendo de la estrategia utilizada
para construir el vector respectivo. Un virus incompetente de
replicación (tal como un vector Ad5gag con supresión de E1/E3 que
expresa un transgen gag de VIH, como se ejemplifica en esta memoria
descriptiva) requiere una línea celular que complementa las
supresiones. Cualquiera de tales líneas celulares se puede usar
para generar vectores de virus recombinantes, con preferencia, pero
sin limitación, líneas celulares que incluyen células 293 y células
PER.C6™. Con este fin, se han descrito en la bibliografía numerosos
vectores de adenovirus recombinantes de primera generación (por
ejemplo, véase Bett y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:
8802-8806; documentos WO 01/02607 y WO 02/22080).
Los vectores adenovíricos "Cobarde" son un vector adenovírico
de 2ª generación desprovisto generalmente de secuencias que
codifican proteínas víricas, frecuentemente con proteínas víricas
complementadas en trans por un virus auxiliar (a menudo un
adenovirus con supresión de E1) desarrolladas con el adenovector
dependiente del auxiliar (HD) en la línea celular empaquetada (por
ejemplo PER.C6™). Las proteínas víricas ausentes, estos vectores
víricos pueden, como alternativa, estar complementados in
trans por una línea celular y/o "virus auxiliar" capaz de
expresar las proteínas adenovíricas estructurales y funcionales
necesarias para la replicación exitosa, empaquetamiento y rescate.
En vista del incremento de popularidad de estos vectores víricos y
la última necesidad de preparar cantidades a escala comercial de o
bien vacunas basadas en virus o vehículo de terapia génica, se ha
convertido en esencial concebir procedimientos económicos y a
escala de producción y purificación.
Las reseñas tempranas de purificación
cromatográfica a pequeña escala se reseñaron a finales de los años
1950 y principio de los años 1960 (por ejemplo, véase Klemperer y
Pereira 1959, Virology 9: 536-545; Philipson,
Virology, 1960, Virology 10: 459-465; harina, y
col., 1961, Virology: 13 264-267), pero se recolocó
por centrifugación en un gradiente de CsCl. En la última década se
ha reseñado de nuevo la purificación cromatográfica de
adenovirus.
La patente de Estados Unidos Nº 5.837.520 (véase
también Huyghe y col., 1995, Human gene Therapy 6:
1403-1416) describen un procedimiento de
purificación de adenovirus que comprende el tratamiento del lisado
de células con una nucleasa, seguido de (1) cromatografía de
intercambio de aniones y (2) cromatografía de ion metálico.
La patente de Estados Unidos Nº 6.261.523
describe un procedimiento de purificación de adenovirus que
comprende someter una preparación de virus a cromatografía de
intercambio de aniones seguido de cromatografía de exclusión por
tamaño.
La patente de Estados Unidos Nº 6.194.191
describe procedimientos de purificación de adenovirus que usan
velocidades de perfusión bajas durante el cultivo de células, y una
etapa de lisis de detergente, y/o una sola etapa de
cromatografía.
Shabram y col., 1997 (Human Gene Therapy 8:
453-465) describen un procedimiento para medir la
concentración de Ad5 con cromatografía de intercambio de iones
analítica.
A pesar de estas y otras reseñas, permanece una
necesidad para el desarrollo de un procedimiento a gran escala para
la purificación de vectores víricos generados dentro de sistemas de
cultivos de células huésped que se refieren tanto a publicaciones
cuantitativas como cualitativas que se imponen tras una vacuna
comercializada o producto de terapia génica. La presente invención
se refiere y reúne estas necesidades mediante la descripción de un
procedimiento de purificación que, en parte, depende de una etapa de
precipitación selectiva que facilita la eliminación de extensas
cantidades de ADN contaminante / impuro mediante clarificación.
La presente invención se refiere a
procedimientos de purificación de partículas de virus. A este fin,
la presente invención se refiere a procedimientos de purificación
de partículas de virus a partir de un lisado celular que comprende
precipitar de manera selectiva las impurezas de las moléculas de
ácido nucleico (ADN) separándolas así de las partículas de virus
dentro del medio de cultivo de las células huésped después de la
lisis mediante la adición de un agente de precipitación selectiva
de manera que al menos aproximadamente el 80% de las moléculas de
ácido nucleico de las células huésped precipitan a partir del medio
que contiene las partículas de virus. Como se describe en esta
memoria descriptiva, la etapa inicial permite la precipitación
selectiva del ADN impurificado, tal como el ADN de la célula
huésped, con al menos una reducción del 80% en ADN contaminante, y
como se ejemplifica en esta memoria descriptiva, incluso al menos un
a reducción del 80% hasta aproximadamente una reducción del 90% en
ADN impurificado después de la clarificación. Un virus preferido
para la purificación mediante los procedimientos descritos en esta
memoria descriptiva es cualquier serotipo de adenovirus. El
serotipo de adenovirus a purificar es o bien un tipo salvaje,
modificado o forma recombinante del serotipo de adenovirus
respectivo. La presente invención se ejemplifica, pero no significa,
que se limite, a un procedimiento de purificación de las
partículas del vector del adenovirus 5, las partículas del vector
del adenovirus 6 y las partículas del vector del adenovirus 35
recombinantes. Otras partículas de adenovirus preferidas para la
purificación mediante los procedimientos descritos en esta memoria
descriptiva incluyen, pero no se limitan a, partículas del
adenovirus 26 y partículas del adenovirus 36.
La presente invención se refiere a en parte a
una etapa preferida en el proceso de purificación, a saber la
inclusión de una etapa de precipitación selectiva después de la
lisis mediante la adición de al menos un (os) agentes de
precipitación selectivos que incluyen pero no se limitan a
detergente catiónico) que, cuando se compagina de manera preferible
con clarificación, da como resultado la eliminación de ácidos
nucleicos y otros desechos celulares que también pueden incluir
cápsides víricas vacías. La metodología descrita en esta memoria
descriptiva da como resultado un procedimiento más robusto y
económicamente factible para preparar grandes cantidades de calidad
comercial de partículas de adenovirus altamente purificadas. Los
niveles de ADN de las células huésped residuales se reducen de
manera consistente a menos del límite de cuantificación de un
ensayo basado en Q-PCR (< 5 pg/10^{11} vp).
Como se ha descrito en esta memoria descriptiva, una referencia a
una "etapa de precipitación selectiva después de la lisis",
"etapa de precipitación selectiva", "precipitación
selectiva" o similares significa que se refiere a una etapa de
precipitación en la que se añade un agente de precipitación
selectiva (SPA) hasta un cierto intervalo de concentración en la
preparación, provocando un alto porcentaje de moléculas de ácido
nucleico contaminante (por ejemplo, ADN) a precipitar de manera
selectiva separándolas así del virus respectivo.
El procedimiento de la presente invención
incluye, pero no requiere necesariamente las siguientes etapas de
procedimiento:
(1) liberar las partículas de virus de las
células infectadas mediante una etapa de lisis tal como una etapa de
lisis por detergente; (2) precipitación selectiva para eliminar un
alto porcentaje de ácidos nucleicos contaminantes; (3) filtración
profunda y/o centrifugación para eliminar los desechos de células y
precipitado de ácido nucleico; (4) ultrafiltración para reducir
volumen y tampón de intercambio; (5) tratamiento de nucleasa para
digerir el remanente de ácidos nucleicos y facilitar la
eliminación; (6) cromatografía de intercambio aniónico para
purificar el virus de contaminantes celulares, componentes de virus
no ensamblados y cápsides vacías; (7) ultrafiltración de flujo
tangencial para eliminar adicionalmente los contaminantes así como
la introducción de un tampón de formulación; (8) filtración
esterilizante de la preparación de virus; (9) opcionalmente, incluir
una (s) etapa (s) adicional (es) para purificar además la
preparación vírica, tal como una etapa de cromatografía de
intercambio catiónico de flujo continuo, una etapa de adsorción de
fase inversa, y/o una etapa de cromatografía de hidroxiapatito; y
(10) opcionalmente, una etapa previa a o junto con una cromatografía
de intercambio aniónico que es una etapa de filtración para
eliminar las partículas antes de la carga en una columna de
cromatografía de intercambio aniónico. La tabla 1 esboza, un
procedimiento por etapas ejemplificado de purificación de AdV.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de purificación de virus de tipo salvaje o
recombinante, especialmente adenovirus de tipo salvaje
recombinante, en el que una o más etapas del procedimiento
ejemplificado (véase la tabla 1) se omiten. Tal omisión se puede
utilizar por el experto en la técnica en una mezcla y base de
coincidencia con el fin de generar un protocolo completo para la
purificación de adenovirus que es cualitativamente aceptable y se
formula a una concentración que permite las aplicaciones clínicas
y/o comerciales. Cualquier tal procedimiento modificado
preferiblemente, pero no necesariamente, incluyen al menos las
siguientes etapas: (1) lisis de células; (2) precipitación de ADN
selectiva después de la lisis; (3) clarificación del sobrenadante
que contiene virus remanente, tal como mediante filtración profunda
para retirar desechos de células y precipitado de ácido nucleico
adicional, y (4) una etapa de filtración para concentrar el virus
purificado hasta niveles útiles para las administraciones clínicas
y/o comerciales y/o intercambiar el virus en un tampón
apropiado.
Otra realización de la presente invención se
refiere a la incorporación de cuatro etapas descritas anteriormente,
a saber (1) lisis de células; (2) precipitación selectiva de ADN;
(3) clarificación; (4) una etapa de concentración (con o sin un
tratamiento por nucleasa; con la etapa adicional de (5), que en una
etapa de cromatografía de intercambio aniónico, en cualquier orden
razonable que da como resultado la recuperación de cantidades de
calidad comercial de adenovirus.
La presente invención además se refiere a la
incorporación de metodología adicional hacia abajo además de las
etapas de 1-5 descritas en el párrafo anterior que
incluye una o más, y en cualquier combinación razonable y/u orden,
una etapa de ultrafiltración, una etapa de filtración para eliminar
las partículas antes de cargar en una columna de cromatografía de
intercambio iónico, una etapa de cromatografía alternativa u
ortogonal (incluyendo pero sin limitación una etapa de
cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de
hidroxiapatito, y/o etapas de cromatografía de adsorción de fase
inversa (por ejemplo, usando Amberlite XAD), y/o una etapa de
filtración esterilizante.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
diversos procedimientos de purificación de partículas víricas, tal
como adenovirus, que son más económicos y robustos que los
procedimientos conocidos. Las solicitudes cromatográficas
anteriores para la purificación de adenovirus se basan en la
combinación de altas concentraciones de nucleasa y baja carga de
adenovirus con el fin de generar resultados satisfactorios. Estos
factores conducen a procedimientos que son antieconómicos e
impracticables a escala superior. La presente invención supera estos
problemas describiendo los procedimientos de purificación de
partículas de virus, especialmente partículas de adenovirus, que
comprende una etapa de precipitación selectiva hacia arriba que
elimina la gran mayoría del ADN celular huésped cuando se combina
con una etapa de clarificación. Esta etapa temprana para retirar los
contaminantes de las células huésped permite la inclusión o
exclusión de diversas etapas hacia abajo en diversas etapas y/u
orden de etapa, dependiendo del nivel de pureza requerido para el
producto vírico purificado final. Como ejemplos, pero sin
limitaciones, las etapas hacia abajo adicionales incluyen
cromatografía de intercambio aniónico, ultrafiltración y un
tratamiento de nucleasa de baja concentración hacia abajo. Más
específicamente, una etapa adicional preferida posterior a una
etapa de precipitación selectiva es una etapa de de cromatografía de
intercambio aniónico en la que se añade poca o nada nucleasa. Se
muestra en esta memoria descriptiva que este procedimiento permite
cargar aproximadamente 5-20 veces la cantidad
reseñada anteriormente de adenovirus en al columna debido a la
previa precipitación de contaminantes. Tal etapa será útil para
mejorar un producto de alta pureza. También, un procedimiento que
incorpora la precipitación/clarificación selectiva de ADN mejora
significativamente la eficacia de una etapa de ultrafiltración
posterior. Y como se indica en esta memoria descriptiva, no se
requiere una etapa de tratamiento por nucleasa pero opcionalmente se
puede añadir para asegurar la robustez del procedimiento. Para
muchas aplicaciones, al pureza del producto ultrafiltrado puede ser
suficiente y la purificación cromatográfica se considera
innecesaria. Para las aplicaciones de muy alta pureza, tales como
lotes de calidad clínica o rellenos comerciales, o por razones
alternativas tales como validación de eliminación, una o más etapas
de cromatografía se pueden añadir. Como se ha mencionado
anteriormente, la cromatografía de intercambio aniónico es
extremadamente útil en tal procedimiento, dependiendo de la
cuidadosa selección de resina y condiciones operativas
(concentración de NaCl), así como la inclusión de un detergente (por
ejemplo, PS-80) en los tampones de desarrollo que
inhiben la agregación durante la carga y elución. De nuevo, la
utilización global de la resina AEX se mejora 5-20
veces sobre los mejores procedimientos reseñados, con la capacidad
ejemplificada utilizable, pero no limitada a 2,0 x 10^{13} vp/ml
de resina. Como alternativa o además de la cromatografía de
intercambio aniónico, la adsorción de fase inversa también puede ser
útil para reducir la concentración de impurezas. En particular, los
detergentes introducido durante el cultivo, lisis o precipitación
se pueden eliminar selectivamente usando una etapa de adsorción de
lote o basada en columna.
A este fin, la presente invención se refiere a
un procedimiento de purificación de partículas de virus,
especialmente partículas de adenovirus, que se caracteriza por una
etapa de precipitación selectiva después de la lisis que puede ser
útil en combinación adicional con una etapa de clarificación y
etapas óptimas de ultrafiltración, tratamiento de nucleasa,
reducción de volumen y/o cambio de tampón.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de purificación de partículas de virus, especialmente
partículas de adenoviris, en el que se utiliza una etapa de
precipitación de ADN selectiva después de la lisis en combinación
con una etapa de clarificación, una etapa de cromatografía de
intercambio aniónico y una etapa de ultrafiltración, con
tratamientos opcionales que incluyen pero no se limitan a un
tratamiento de nucleasa, reducción de volumen y/o cambio de
tampón.
La presente invención además se refiere a un
procedimiento ejemplificado de purificación de partículas de virus,
especialmente partículas de vectores de adenovirus recombinantes,
como se describe en la Tabla 1.
La presente invención además se refiere a
diversas modificaciones que se hacen evidentes para los expertos en
la técnica tras la revisión de esta memoria descriptiva, tales
modificaciones que utilizan un elemento central de una etapa de
precipitación de ADN selectiva después de la lisis; una etapa que,
cuando se combina con una etapa de clarificación, establece el
resto del procedimiento de purificación generando un producto
relativamente alto para la manipulación adicional. De este modo se
hace evidente tras la revisión de esta memoria descriptiva que
ninguna, una o más de una etapa de purificación adicional se puede
añadir con la complacencia de los expertos en la técnica con el fin
de generar un producto vírico purificado. Tales etapas adicionales
pueden ser etapas descritas en esta memoria descriptiva (por
ejemplo, véase la Tabla 1) o que se conocerían en la técnica.
Por lo tanto, las realizaciones preferidas de la
presente invención se refieren a procedimientos de purificación de
lotes de adenovirus que son de calidad clínica en cantidades
comercialmente viables en los que el procedimiento comprende al
menos una etapa después de la lisis de la etapa de preparación
selectiva mediante la adición de un SPA que elimina la mayoría del
ADN celular cuando se combina con al menos las etapas adicionales de
clarificación y ultrafiltración. La inclusión de esta etapa de
precipitación después de la lisis mejora de manera significativa la
eficacia de cualquier (cualesquiera) etapa (s) de ultrafiltración
posterior (es). Por lo tanto la metodología descrita en esta
memoria descriptiva reúne la necesidad de un esquema de purificación
de virus que permita a gran escala, los requerimientos de
producción comerciales. Los procedimientos descritos en esta
memoria descriptiva son especialmente útiles en la vacuna génica /
terapia génica que permite superar muchos inconvenientes de los
procedimientos de purificación vírica conocidos. Como se ha indicado
a lo largo de esta memoria descriptiva, los procedimientos
descritos en esta memoria descriptiva dan como resultado
preparaciones concentradas de adenovirus con cantidades
inapreciables de contaminación de ADN. Se prefiere que las
preparaciones de adenovirus de la presente invención contienen
adenovirus de al menos 1 x 10^{11} vp/ml, y preferiblemente mayor
de 1 x 10^{12} vp/ml, mientras que tiene un nivel de ADN de célula
huésped al menos menor de 100 picogramos/10^{11} vp, o además
menos de 30 picogramos/ 10^{11} vp/ml, preferiblemente menos de 10
picogramos/ 10^{11} vp/ml, y los más preferible menos de 5
picogramos/ 10^{11} vp/ml.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de purificación de adenovirus, que al
menos incluye la inclusión de una etapa de precipitación selectiva
después de la lisis mediante la adición de un SPA que se puede
acoplar con una (s) etapa (s) de clarificación adicional (es) y una
(s) etapa (s) de ultrafiltración. Esta metodología promueve la
eliminación de ácidos nucleicos y otros desechos celulares, dando
como resultado cantidades de calidad comercial más robustas de
partículas de adenovirus altamente purificadas.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de purificación de adenovirus, que
al menos incluye la incorporación de las cuatro etapas descritas
anteriormente, a saber (1) (1) lisis de células; (2) precipitación
selectiva de moléculas de ácido nucleico mediante la adición de un
SPA; (3) clarificación; (4) etapa de concentración (con o sin
tratamiento de endonucleasa); con la etapa adicional de (5) una
etapa de cromatografía de intercambio aniónico.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de purificación de adenovirus, que al
menos incluye la incorporación de etapas además de las etapas
1-5 del párrafo anterior, que puede incluir
cualquier combinación y orden razonable, una (s) etapa (s) de
ultrafiltración, una etapa de filtración para eliminar las
partículas antes de cargar en una columna de cromatografía de
intercambio aniónico, una etapa de cromatografía alternativa u
ortogonal (que incluye pero no se limita a una etapa de
cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de
hidroxiapatito, y/o cromatografía de adsorción en fase inversa y/o
una etapa de filtración esterilizante).
(2) Todavía otro objeto de la presente invención
se ejemplifica como un procedimiento de purificación de adenovirus,
que incluye, pero no requiere necesariamente casa una de las
siguientes etapas del procedimiento: (1) liberación de las
partículas de las células infectadas mediante una etapa de lisis
tal como una etapa de lisis con detergente; (2) precipitación
selectiva para eliminar un alto porcentaje de ácidos nucleicos
contaminantes; (3) filtración profunda y/o centrifugación para
eliminar los desechos de células y precipitado de ácido nucleico;
(4) ultrafiltración para reducir volumen y tampón de intercambio;
(5) tratamiento de nucleasa para digerir el remanente de ácidos
nucleicos y facilitar la eliminación; (6) cromatografía de
intercambio aniónico para purificar el virus de contaminantes
celulares y componentes de virus no ensamblados; (7) ultrafiltración
de flujo tangencial para eliminar adicionalmente los contaminantes
así como la introducción de un tampón de formulación; (8) filtración
esterilizante de la preparación de virus; (9) opcionalmente,
incluir una (s) etapa (s) adicional (es) para purificar además la
preparación vírica, tal como una etapa de cromatografía de
intercambio catiónico de flujo continuo, una etapa de adsorción de
fase inversa, y/o una etapa de cromatografía de hidroxiapatito; y
(10) opcionalmente, una etapa previa a o junto con una
cromatografía de intercambio aniónico que es una etapa de
filtración para eliminar las partículas antes de la carga en una
columna de cromatografía de intercambio aniónico. La tabla 1
esboza, un procedimiento por etapas ejemplificado de purificación de
Ad, en el que la combinación y/u orden de cada etapa de
procedimiento respectiva puede ser capaz de ajustarse por el experto
en la técnica.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"vp" se refiere a -partícula vírica-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"AEX" se refiere a -cromatografía de intercambio aniónico-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"CEX" se refiere a -cromatografía de intercambio
catiónico-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"TFF" se refiere a -filtración de flujo tangencial-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"TNBP" se refiere a -fosfato de
tri-n-butilo-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"CPC" se refiere a -cloruro de cetilpiridinio-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"DB" se refiere a -bromuro de domifeno-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"CTAB" se refiere a -bromuro de cetil trimetilamonio-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"BTC" se refiere a -cloruro de bencetonio-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"TTA" se refiere a -cloruro de tetradeciltrimetil amonio-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"PS-80" se refiere a -polisorbato 80-.
Como se usa en esta memoria descriptiva
"SPA" se refiere a -agente de precipitación selectiva-. Un
agente de precipitación selectiva se define en esta memoria
descriptiva como cualquier agente, compuesto o tal que, cuando se
añade a una preparación que contiene una población de virus, tal
como adenovirus, y moléculas de ácido nucleico contaminante,
afectará a la precipitación selectiva de al menos una cantidad
sustancial de moléculas de ácido nucleico contaminante del virus
respectivo.
Como se usa en esta memoria descriptiva el
término "adenovirus" o "ad" o "AdV" se refiere a
cualquier adenovirus, que incluye pero no se limita a cualquier
serotipo de adenovirus que es un virus de tipo salvaje, un virus
modificado (tal como un virus atenuado), y/o un virus recombinante,
tal como cualquier serotipo de adenovirus que es, por ejemplo, un
vector de adenovirus recombinante de 1º o 2ª generación que puede o
no puede contener uno o más transgenes heterólogos insertados
dentro del vector de adenovirus recombinante respectivo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "células huésped" o "línea celular huésped" se
refiere a cualquier línea celular de mamífero que apoya la réplica
de un virus, tal como un adenovirus de tipo salvaje, modificado o
recombinante. Se apreciará que cualquiera de tales líneas celulares
huéspedes se desarrolla en cultivo hasta una fase de crecimiento
conocida en la técnica, seguido de la infección con una reserva de
semilla del virus respectivo, después seguido de cultivo adicional
en condiciones farmacéuticamente aceptables, dando como resultado
la producción de una población de virus adicional, que se puede
recoger mediante los procedimientos descritos en esta memoria
descriptiva.
La figura 1 muestra un ejemplo de cromatografía
de intercambio aniónico preparativo (AEX). La alimentación se ajustó
hasta aproximadamente 38 mS/cm y se cargó en la Source 15Q. La
columna se lavó con 5 volúmenes de HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM,
NaCl 0,39 M, PS-80 al 0,1%, pH 7,5 y un gradiente
lineal se desarrolló a NaCl 0,47 M.
Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran los resultados
de los cromatogramas de ensayo de intercambio aniónico para la etapa
de cromatografía preparativa AEX. (A) alimentación; (B) flujo a
través; (C) combinación de productos. Las ID de los máximos son como
sigue: impurezas 1 minuto-misc,
PS-80; 7 minutos-proteína hexón; 11
minutos-partículas de AdV; 16 minutos-ácido
nucleico.
La Figura 3 muestra un perfil de intercambio
aniónico preparativo para el ejemplo 2. Se muestran la carga,
lavado, y elución.
La Figura 4 muestra los perfiles de
precipitación de adenovirus para los detergentes catiónicos BTC, DB,
CTA., CPC y TTA.
La Figura 5 muestra los perfiles de
precipitación de ADN para los detergentes catiónicos BTC, DB, CTA.,
CPC y TTA.
La Figura 6 muestra diversas capacidades para
una filtración profunda de CE-25 y
DE-45 en diversas condiciones de mezcla.
La figura 7 muestra un análisis de SDS_PAGE de
un procedimiento por etapas de purificación de adenovirus
(MRKAd5gag) a partir de 300 litros de un cultivo celular. La carga
se normalizó hasta 6,4^{9} vp.
La Figura 8 muestra el análisis de proteína en
gel SDS-PAGE en el intermedio del producto de
intercambio aniónico (AEP) para tres preparaciones de adenovirus
ejemplificadas. Todas las muestras cargadas a 1,19^{10} vp total.
Banda (1) marcadores MW.; (2) 0112A; (3) 0112C; (4) 0114; (5)
0113A1; (6) 0113A2; (7) 0113A3; (8) 0113B; (9) 0113C; (10)
0113D.
La figura 9 muestra los tiempos de separación
para diversos adenovirus recombinantes (Ad5, Ad24 y Ad35) mediante
cromatografía de intercambio aniónico.
\newpage
La Figura 10 muestra el efecto de concentración
de bromuro de domifeno en diversos serotipos o adenovirus
recombinante y ADN de cada virus recombinante respectivo.
La presente invención se refiere a
procedimientos de purificación de partículas de virus a partir de un
lisado de células. A este fin, la presente invención se refiere a
procedimientos de purificación de partículas de virus a partir de
un lisado de células de un medio de cultivo de células que comprende
precipitar de manera selectiva las moléculas de impurezas (ADN)
(tal como ADN genómico de células huésped) de las partículas de
virus dentro del lisado de células mediante la adición de un agente
de precipitación selectiva al medio de cultivo de células huésped
después de la lisis de manera que al menos aproximadamente el 80% de
moléculas de ADN impuras se precipitan del medio que contiene las
partículas de virus. Como se describe en esta memoria descriptiva,
esta etapa inicial permite la precipitación selectiva de ADN
contaminante, con al menos una reducción del 80% del ADN
contaminante, como se ejemplifica en esta memoria descriptiva,
incluso aproximadamente una reducción del 90% en ADN después de la
clarificación (por ejemplo, filtración profunda o centrifugación y
una etapa de filtración profunda de refinado). A este fin, la
presente invención se refiere a procedimientos de purificación de
virus, especialmente adenovirus, donde al menos 70%, o al menos 80%,
o incluso al menos 90% de ADN contaminante (por ejemplo, impureza)
se retira de las partículas de virus después de una etapa inicial
después de la lisis de precipitación selectiva o una etapa de
precipitación selectiva después de la lisis inicial seguido de una
etapa de clarificación (por ejemplo, tal como filtración profunda o
centrifugación y una etapa de filtración profunda de refinado).
Aunque cualquier número de virus de tipo salvaje
o modificados puede permitir esta metodología, un virus preferido
es un adenovirus de tipo salvaje o modificado o vector adenovírico
recombinante, ejemplificado en esta memoria descriptiva con un
vector de adenovirus recombinante de serotipo 5, 6 y 35. Un virus
preferido de purificación es cualquier adenovirus de tipo salvaje,
modificado, mutado y/o recombinante (de nuevo, véase Fundamental
Biology, 3ª Ed., Fields, B. N., Knipe, D. M., y Howley, P. M., Ed.,
en el capítulo 30, p. 979-1016 (1996)). La presente
invención se refiere en parte a un procedimiento de purificación
mediante el que se incluye una etapa después de la lisis al menos
una etapa de precipitación selectiva mediante la inclusión de un
agente de precipitación selectiva, que es preferiblemente un
detergente catiónico, que elimina de manera eficaz la mayoría de las
moléculas de ácido nucleico libres, así como otros desechos
celulares. La metodología de la presente invención da como
resultado la recuperación de las cantidades comercialmente viables
del vector de adenovirus con características de pureza excelentes,
haciendo esta metodología especialmente útil para el llenado y
distribución de vacunas a base de adenovirus o productos de terapia
génica a base de adenovirus. La presente invención se refiere a
procedimientos de obtención de virus purificado a partir de
instalaciones de producción a gran escala que incluye, en un primer
aspecto, una combinación de precipitación, filtración profunda y/o
centrifugación, ultrafiltración, digestión con nucleasa y
cromatografía para de manera contundente y económica producir
producto altamente purificado. Los niveles de ADN de células
huésped residuales son consistentes por debajo de 5 pg/10^{11} vp
cuando se usan los procedimientos de al presente invención se
ejemplifican en la Tabla 1. Será evidente para el experto en la
técnica que una medición del contenido de ADN de las células huésped
residuales no significa que se considere como una limitación a esta
metodología. En su lugar, estos datos apoyan la esencia de la
presente invención: una metodología a gran escala para la generación
de partículas de virus que da como resultado un producto altamente
purificado que se puede utilizar en escenarios clínicos y
comerciales. Se puede hacer notar que la importancia de lograr los
niveles de ADN particulares en el producto final es específico del
producto. Los productos para uso parenteral en los seres humanos
requerirán los patrones más rigurosos pero, incluso en ese caso,
los objetivos pueden variar entre 100 pg/dosis hasta 10 ng/dosis
(``WHO Requirements for the Use of Animal Cell as in vitro
Substrates for the Production of Biologicals (requirements for
Biologicals Substances Nº 50), WHO Technical Report Series, Nº 878,
1998) o mayor, y probablemente se ajustan dependiendo de la
indicación de los productos. Además, para los productos a base de
adenovirus, la dosificación puede variar en varios órdenes de
magnitud. Por lo tanto, no existe significación específica de lograr
unos niveles residuales de ADN específicos inferiores (tal como por
debajo de 5 pg/10^{11} vp) y, en la mayoría de las aplicaciones,
no es probable que sean de mucha consecuencia variaciones de varias
veces alrededor del nivel entre lotes. Por lo tanto, como se ha
indicado anteriormente, se prefiere que las preparaciones de
adenovirus de al presente invención contengan adenovirus de al
menos 1 x 10^{11} vp/ml, y preferiblemente mayor de 1 x 10^{12}
vp/ml, mientras que tienen un nivel de ADN de células huésped
residual al menos menor que 100 picogramos/10^{11} vp, o además
menos de 30 picogramos/10^{11} vp, preferiblemente menos de
10
picogramos/10^{11} vp.
picogramos/10^{11} vp.
La presente invención se refiere en parte a una
etapa preferida en el procedimiento de purificación, a saber la
inclusión de una etapa de precipitación selectiva después de la
lisis que, cuando se combina preferiblemente con clarificación, da
como resultado la eliminación de ácidos nucleicos residuales y otros
desechos celulares, permitiendo de este modo la preparación de un
procedimiento más contundente y económicamente factible para
preparar grandes cantidades de calidad comercial de partículas de
adenovirus altamente purificados. El procedimiento de la presente
invención incluye, pero no requiere las siguientes etapas del
procedimiento: (1) liberar las partículas de virus de las células
infectadas mediante una etapa de lisis tal como una etapa de lisis
por detergente; (2) precipitación selectiva para eliminar un alto
porcentaje de ácidos nucleicos contaminantes; (3) filtración
profunda y/o centrifugación para eliminar los desechos de células y
precipitado de ácido nucleico; (4) ultrafiltración para reducir
volumen y tampón de intercambio; (5) tratamiento de nucleasa para
digerir el remanente de ácidos nucleicos y facilitar la
eliminación; (6) cromatografía de intercambio aniónico para
purificar el virus de contaminantes celulares y componentes de virus
no ensamblados; (7) ultrafiltración de flujo tangencial para
eliminar adicionalmente los contaminantes así como la introducción
de un tampón de formulación; (8) filtración esterilizante de la
preparación de virus; (9) opcionalmente seguido de o añadido como
una etapa anterior una etapa independiente, adicional para además
purificar la preparación vírica, tal como etapa de cromatografía de
intercambio catiónico de flujo continuo, una etapa de adsorción de
fase inversa, y/o una etapa de cromatografía de hidroxiapatito; y
(10) opcionalmente, una etapa previa a o junto con una cromatografía
de intercambio aniónico que es una etapa de filtración para
eliminar las partículas antes de la carga en una columna de
cromatografía de intercambio aniónico. La tabla 1 esboza, un
procedimiento por etapas ejemplificado de purificación de Ad. Como
se ha indicado anteriormente, una opción adicional al procedimiento
descrito en esta memoria descriptiva es la adición de una etapa de
filtración antes de o en combinación con cromatografía de
intercambio aniónico. Es posible que en ciertos casos, (que puede
depender de los componentes particulares del medio de cultivo así
como de las propiedades de tanto la línea celular de producción como
del producto), partículas pequeñas o "agregados" pueden o bien
pasar a través de la etapa de clarificación principal o formarse
durante el tratamiento de nucleasa o ultrafiltración,
particularmente cuando la ultrafiltración incorpora una etapa de
concentración. En este caso, se contempla una etapa de filtración
adicional para eliminar estas partículas antes de cargar en la
cromatografía de intercambio aniónico. El filtro se puede colocar en
línea durante la carga de la columna, o se puede usar en una
operación independiente. La ultrafiltración en general estaría
acompañada de uso de filtros de cápsula o de cartucho desechables.
Estos filtros terminal pueden ser profundos o basados en membrana.
Los medios en estos filtros pueden ser polipropileno, celulosa,
ésteres de celulosa, fluoruro de polivinilideno, nylon,
poliétersulfona, o cualquier otro material que es consistente con
la baja unión de producto; además de todos estos medios pueden estar
presentes con o sin agentes modificantes tales como tierra de
diatomeas y/o resinas que mejoran las propiedades del filtro. El
tamaño nominal de tal filtro estaría entre 0,2 y 1 micrón.
La presente invención además se refiere a un
procedimiento para purificar virus de tipo salvaje o recombinante,
especialmente adenovirus de tipo salvaje o recombinante, en el que
se omiten una o más etapas de un procedimiento ejemplificado (véase
la Tabla 1). Tal omisión se puede utilizar por el experto en la
técnica en base a una mezcla o de coincidencia con el fin de
regenerar un protocolo completo para la purificación de adenovirus
que es cualitativo aceptable y se formula a una concentración que
permite las aplicaciones clínicas y/o comerciales. Cualquiera de
tal procedimiento modificado preferiblemente, pero no
necesariamente, incluirá al menos las siguientes etapas: (1) lisis
de células; (2) precipitación de ADN selectiva después de la lisis;
(3) clarificación del sobrenadante que contiene virus remanente,
tal como mediante filtración profunda para retirar desechos de
células y precipitado de ácido nucleico adicional, y (4) una etapa
de filtración para concentrar el virus purificado hasta niveles
útiles para las administraciones clínicas y/o comerciales y/o
intercambiar el virus en un tampón apropiado.
Otra realización de la presente invención se
refiere a la incorporación de cuatro etapas descritas anteriormente,
a saber (1) lisis de células; (2) precipitación selectiva de ADN;
(3) clarificación; (4) una etapa de concentración (con o sin un
tratamiento por nucleasa; con la etapa adicional de (5), que en una
etapa de cromatografía de intercambio aniónico.
La presente invención además se refiere a la
incorporación de metodología adicional hacia a bajo además de las
etapas de 1-5 descritas en el párrafo anterior que
incluye una o más, y en cualquier combinación razonable, una etapa
de ultrafiltración, una etapa de cromatografía alternativa u
ortogonal (incluyendo pero sin limitación una etapa de
cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de
hidroxiapatito, y/o etapas de cromatografía de adsorción de fase
inversa (por ejemplo, usando Amberlite XAD, y/o una etapa de
filtración esterilizante).
Las etapas 1-4 se pueden
extender a cualquier producto con características que permiten la
precipitación selectiva de ADN basada en la carga y/o
hidrofobicidad, con tal que el producto no esté inactivado por el
agente selectivo. Por ejemplo, cualquier producto catiónico (o anión
con una densidad de carga menor que ADN) debe permanecer libre en
solución con ADN que precipita con detergentes catiónicos o
polímeros). Los ejemplos ejemplares pueden incluir pero no se
limitan a virus asociados a adeno (VAA), virus de papiloma humano
(VPH)o VLP derivado de su (s) proteína (s) estructural (es),
y virus de la hepatitis A (VHA). De particular interés es VAA, ya
que la purificación que usa cromatografía de intercambio catiónico
se ha demostrado y pueden ser necesarias instalaciones de
producción a gran escala si se aprueba como vector para o bien
productos de terapia génica o de vacuna. En ese caso, los
detergentes catiónicos se pueden usar para precipitar tanto ADN de
células huésped como adenovirus auxiliar contaminante. Después de
clarificación, el VAA se puede además procesar mediante
ultrafiltración y cromatografía, siendo el intercambio catiónico la
etapa preferida y la cromatografía de intercambio aniónico añadida
solamente si se desea una contundencia adicional. A este fin se debe
hacer notar que un aspecto de la presente invenciones el uso
específico de bromuro de domifeno como una precipitación selectiva
para los esquemas de purificación que requieren la eliminación de
cualquier número de componentes celulares, especialmente ácidos
nucleicos, aparte de cualquier número de tipos diferentes de
productos biológicos, que incluyen pero no se limitan a partículas
de virus, partículas de tipo virus (por ejemplo, vacuna basada en
VPH), o cualquier otro producto biológico que se puede separar
sustancialmente de un producto contaminante a base de cultivos
mediante una etapa de precipitación selectiva. Aunque un gran número
de SPA se pueden usar para practicar la presente invención, el
bromuro de domifeno es de particular interés debido principalmente
a sus disponibilidad como una materia prima de calidad de GMP y de
uso actual en otros productos propuestos para uso humano. Más
específicamente, ya que el bromuro de domifeno se usa como
ingrediente activo en productos de higiene oral así como cremas de
antibiótico tópicas, esta molécula se produce en grandes cantidades
y se liberan en condiciones de GMP. Se conoce en la técnica el uso
de un agente de precipitación selectiva, y más específicamente a la
precipitación de ácido nucleico del virus. El incremento de
selectividad de Db se produce por su capacidad de discriminar
fácilmente entre componentes de de corriente que poseen pequeñas
diferencias en densidades de carga o carga global. La implementación
exitosa de esta tecnología en corrientes que tienen diferencias
mínimas en la densidad de carga (por ejemplo, adenovirus y ADN)
realza su aplicación potencial a través de un número de
aplicaciones comerciales actuales o futuras. La gran ventana de
procesamiento que acompaña tal aplicación se puede solamente
incrementar tanto como los diferenciales de carga entre producto e
impurezas. Selectivamente se puede además potenciar mediante la
adición de sales inorgánicas o variando la resistencia iónica.
Durante la precipitación, para los compuestos que también incorporan
un grupo amonio, se sabe que las cargas positivas sobre las
moléculas de detergentes neutralizan los grupos cargados
negativamente sobre las moléculas que poseen un grado de
electronegatividad. Una vez que las cargas sobre las moléculas
están neutralizadas, las colas hidrófobas de las moléculas de
detergente interactúan entre sí mediante interacciones hidrófobas,
haciendo que los componentes solubles precipiten. La molécula de DB
posee una similitud estructural a muchos detergentes catiónicos
usados comúnmente ya que contiene un grupo amonio cargado aunque la
combinación del (de los) grupo (s) amonio, éster (es), y anillo (s)
benceno proporcionen selectividad y robustez adicional a las
interacciones basadas en la carga de manera que se pueda implementar
una tecnología novedosa (por ejemplo, que incluye, pero no se
limita a moléculas de ADN, ARN, Proteínas, VLP, y
polisacáridos).
De este modo la presente invención se refiere a
la metodología que da como resultado la purificación de partículas
de vector de adenovirus a partir de instalaciones de producción a
gran escala que hacen comercialmente viables cantidades de virus
recuperado así como mostrando también excelentes características de
pureza. El término "gran escala" como se usa en esta memoria
descriptiva se considera que es volúmenes totales de cultivo de
células huésped mayores de aproximadamente 10 litros hasta
aproximadamente 50.000 litros, siendo la norma procesamientos entre
aproximadamente 300 litros y aproximadamente 20.000 litros.
En un aspecto ejemplificado de la presente
invención, una combinación de etapas de lisis de células,
precipitación con un SPA, filtración profunda y/o centrifugación,
ultrafiltración, digestión por nucleasa y cromatografía se utilizan
para producir de manera fuerte y económica producto altamente
purificado, veles de ADN de células huésped residual de menos que
los niveles detectables cuando se usa un ensayo de
Q-PCR para ADN de células huésped. Una etapa de
lisis inicial proporciona la liberación máxima de adenovirus
intracelular a partir de las células huésped y proporciona un
potencial para inactivar los agentes potenciales adventicios en
particular, virus con envuelta tales como herpes virus o
retrovirus) que pueden hipotéticamente contaminar el cultivo de
células a un nivel bajo.
Como se ha indicado anteriormente, la primera
etapa de lisis de células infectadas permite una recogida de virus
tanto asociados (intracelular) como no asociados a células
(extracelular) del medio de cultivo de células huésped. Como
resultado, se proporciona flexibilidad en al selección de
condiciones de cultivo que son óptimas para la productividad del
virus global. Además, la presencia de detergente a lo largo del
procedimiento minimiza la asociación del virus al ADN de las
células huésped. La lisis por detergente de las células huésped,
aunque es el procedimiento preferido de lisis de células huésped
que contienen AdV, se pueden reemplazar por procedimientos de lisis
no mecánica que permiten procedimientos de purificación a gran
escala (tal como tratamiento por enzimas) y/o procedimientos
fragmentación mecánica (tal como ultrafiltración de fibra hueca)
para liberar cantidades máximas de adenovirus. Se puede usar
cualquier componente de lisis de células que permite la introducción
en un sistema biológico tal como un protocolo de terapia génica o
de purificación de vacuna para lisar las células huésped
infectadas, a saber un detergente o enzima conocida en la técnica
que es útil en aplicaciones biológicas, que incluye pero no se
limita a detergentes Triton y/o Polisorbato-80.
Además, se puede añadir un disolvente tal como TNBP al lisado o
clarificar el lisado a bajas concentraciones (por ejemplo, 0,3%)
para complementar estos detergentes en su capacidad para inactivar
los virus con envuelta. También, la autolisis de las células
huésped puede proporcionar la liberación sustancial de virus
intracelular. Por lo tanto, cualquier forma de lisis de células
huésped que se conoce en la técnica se puede usar para liberar el
virus intracelular en el medio de cultivo de células huésped para
la recogida eventual mediante los procedimientos descritos en esta
memoria descriptiva.
Después de la lisis, el ADN se precipita de
manera selectiva mediante la adición de de una solución de SPA
concentrada mientras deja el adenovirus en la fase líquida. Esta
etapa permite la precipitación selectiva de ADN de células huésped
y también mejora la robustez hacia abajo. Como se ejemplifica en
esta memoria descriptiva, esta etapa de precipitación de fase
temprana da como resultado aproximadamente 90% de reducción en el
ácido nucleico después de la clarificación. Las nucleasas (que
incluyen pero no se limitan de ninguna manera a Benzonase™
(Industrias EM), ADNasas y ARNasas) no se requieren ya más pero
todavía son beneficiosas para la máxima reducción de ADN. En vista
de la capacidad de esta etapa de precipitación para eliminar la gran
mayoría de los ácidos nucleicos contaminantes, la cromatografía de
intercambio aniónico puede no ser esencial para la pureza del
producto dependiendo de la dosificación final. Sin embargo, una
etapa de AEX puede permanecer en el procedimiento para robustez.
Aunque sin estar unido a ninguna teoría, se cree
que al adición de un SPA después de la lisis de células da como
resultado los grupos cargados positivamente (y anillos aromáticos,
si están presentes) sobre los compuestos que se unen a los grupos
fosfato cargado negativamente (y pares de bases) en las moléculas de
ADN. Las colas hidrófobas en los detergentes interactúan después
entre sí dando como resultado precipitación. Los resultados
experimentales descritos en esta memoria descriptiva muestran que
las moléculas de ADN tienen una afinidad mayor a los SPA que el
adenovirus, por lo tanto las moléculas no interactuarán con el
adenovirus hasta que la concentración de ADN en la fase líquida
sea baja. Las micelas mixtas también proporcionan un incremento de
robustez. Este mecanismo proporciona la selectividad requerida
durante la precipitación. Los SPA que pueden ser útiles en la
práctica de la invención descritos en esta invención incluyen, pero
no se limitan a, copolímeros de amina, compuestos de amonio
cuaternario, y cualesquiera mezclas respectivas de los mismos. Las
mezclas de los SPA proporcionan un comportamiento similar a los SPA
puros mientras incorporan mecanismos de precipitación múltiples 8es
decir sitios de unión primarios). Una mezcla de SPA se puede añadir
al lisado de células a medida que se incorpora el tampón de
precipitación o una metodología de adición de alto corte/bajo corte.
Más específicamente, las muchas formas de polietilen imina (PEI)
han mostrado que son muy eficaces en la neutralización del exceso
de carga aniónica (impurezas de ADN), especialmente en condiciones
de pH ácido o neutro. Teóricamente, los copolímeros de PEI
modificados que tienen relativamente una masa molecular alta puede
ser eficaz.
Los compuestos de amonio cuaternario de las
siguientes siete clases se ha mostrado que son beneficiosos para la
presente invención. éstos incluyen pero no se limitan a las
siguientes clases y ejemplos de productos comercialmente
disponibles: sales monoalquiltrimetil amonio (los ejemplos de
productos comercialmente disponibles incluyen bromuro o cloruro de
cetiltrimetilamonio como CTA, bromuro o cloruro de
tetradeciltrimetilamonio como (TTA), cloruro de alquiltrimetil
amonio, cloruro de alquilariltrimetilamonio, bromuro o cloruro de
dodeciltrimetilamonio, bromuro de
dodecildimetil-2-fenoietilamonio,
hexadecilamina: sal cloruro o bromuro, dodecilamina o sal cloruro,
y bromuro o cloruro de cetildimetil amonio), sales de
monoalquildimetilbencil amonio (los ejemplos incluyen cloruros de
alquildimetilbencil amonio y cloruro de bencetonio como BTC), sales
de dialquildimetil amonio (los productos comerciales incluyen
bromuro de domifeno como DB, haluros de didecildimetil amonio, y
cloruro o bromuro de octildodecildimetil amonio), sales de amonio
heteroaromáticos (los productos comerciales incluyen haluros de
cetilpiridio (CPC o sal bromuro y bromuro o cloruro de
hexadecilpiridinio), isómero cis de
1-[3-cloroalil]-3,5,7-triaza-1-azoniaadamantano,
bromuro de alquilisoquinolinio, y cloruro de
alquildimetilnaftilmetil amonio (BTC 1110). Las sales de amonio
cuaternario polisustituido (los productos comercialmente disponibles
incluyen, pero no se limitan a alquildimetilbencil amonio
sacarinato y alquildimetilbencil amonio ciclohexilsulfamato), sales
de amonio bis-cuaternario (los ejemplos de productos
incluyen 1,10-bis(cloruro de
2-metil-4-aminoquinolinio)-decano,
cloruro de
1,6-Bis{1-metil-3-(2,2,6-trimetil
ciclohexil)-propildimetil amonio] hexano o cloruro
de triclobisonio, y la bis-quat denominada como CDQ
por Buckman Brochures), y las sales de amonio cuaternario
poliméricas (incluye poliyononas tales como cloruro de
poli[oxietilen(dimetiliminio)etilen(dimetilimino)etileno],
bicloruro de
poli[N-3-dimetilamonio)propil]N-[3-etilenoxietilendimetilamonio)propil]urea,
y alfa-4- [cloruro de
1-tris(2-hidroxietikln)
amonio).
amonio).
El lisado de células tratadas con SPA se
clarifica mediante filtración profunda para eliminar las impurezas
precipitadas y desechos de células. También es posible la
centrifugación con o sin filtración profunda de refinado. Por lo
tanto, la clarificación del lisado precipitado se puede realizar
usando solo centrifugación, o centrifugación en tándem con una
etapa de clarificación de refinado tal como filtración profunda.
Para mayores volúmenes de líquido (mayores que aproximadamente 50
l), la centrifugación continua se preferirá sobre los
procedimientos de lote. La centrífuga continua puede ser de un
diseño tubular, como en la CARR Powerfuge, o disco, como en la
Westfalia CSA-1, aunque otras elaboraciones y
modelos son probablemente más satisfactorios. En general, los
tiempos de residencia y fuerza centrífuga requeridos se dispondrán
por la eficacia del equipo individual así como la distribución del
tamaño de precipitado, y la metodología para las condiciones de
selección apropiadas para eliminar el precipitado pero no el
adenovirus serán evidentes para los expertos en la técnica. El
ejemplo 15 muestra el uso de la centrifugación continua seguida de
una filtración profunda de refinado. El uso de centrifugación
continua se prefiere en las aplicaciones en las que la densidad
celular sea alta (por ejemplo, cultivo por lote de alimentación o
de perfusión) y/o cuando los volúmenes son mayores (mayor que 1000
l). El lisado de células clarificado se concentra después según sea
apropiado (dependiendo de la masa de células y productividad de
adenovirus) de cultivo, siendo 10-20 veces típico de
los procedimientos de lote sencillos), opcionalmente tratado por
nucleasa, y diafiltrado. La combinación de la precipitación y
clarificación retiran aproximadamente el 90% del ADN total y,
dependiendo de las condiciones de ultrafiltración / tratamiento por
nucleasa, la pureza de esta corriente puede ser suficiente para
muchas aplicaciones. El procedimiento no requiere nucleasa, aunque
se pueden usar pequeñas cantidades para asegurar la robustez del
procedimiento. Para muchas aplicaciones, la pureza del producto
ultrafiltrado puede ser suficiente y la purificación cromatográfica
se considera innecesaria. Para las aplicaciones de pureza muy alta
(o por razones alternativas tales como validación de eliminación),
se pueden añadir una o más etapas de cromatografía, como se describe
en esta memoria descriptiva. Estará dentro del alcance del experto
en la técnica para ensayar sustitutos potenciales para los SPA
descritos en esta memoria descriptiva para identificar un compuesto
que precipita de manera eficaz moléculas de ácido nucleico y otros
desechos celulares de las partículas de virus como se ejemplifica en
esta memoria descriptiva para el bromuro de domifeno (DB). Por lo
tanto, la presente invención se refiere en parte a procedimientos
de purificación de partículas de virus a partir de un medio de
cultivo de células huésped que comprende selectivamente precipitar
las moléculas de ácido nucleico de células huésped de las
partículas de virus dentro del medio de cultivo de células huésped
después de la lisis mediante la adición de un agente de
precipitación selectiva al medio de cultivo celular de células
huésped después de la lisis. En tales condiciones se esperará que
una mayoría sustancial de ácidos nucleicos contaminantes
precipitarán aparte del virus, entre al menos el 70%, más
probablemente al menos el 80% de tal ADN contaminante y hasta al
menos el 90% de tal ADN contaminante 7 impuro, especialmente
cuando sigue una etapa de clarificación tal como filtración profunda
sola o filtración profunda combinada con una etapa de filtración
profunda de
refinado.
refinado.
En esta memoria descriptiva se ejemplifica y se
prefiere que la etapa de de precipitación selectiva se produzca en
la primera etapa después de la lisis. Sin embargo, esta preferencia
no significa que sea una limitación, ya que la etapa de
precipitación selectiva se puede insertar en otras fases del
procedimiento de purificación para eliminar mejor las moléculas de
ácido nucleico residuales y desecho celular a partir de un lisado
celular tamponado o una solución de tampón que contiene Ad en fase
tardía. Por ejemplo, la precipitación con detergente se puede
colocar alternativamente después de clarificación o
ultracentrifugación (concentración/diafiltración) con la adición de
una clarificación posterior. La clarificación puede tomar cualquiera
de las varias formas que incluyen filtración profunda o de
membrana.
Se puede contemplar una etapa de filtración para
retirar el desecho celular y precipitado de ácido nucleico. La
etapa proporciona un medio conveniente para retirar de manera
económica el desecho celular y el precipitado. Cuando se elige un
filtro o esquema de filtro era necesario asegurar un comportamiento
robusto en el caso de que se produzcan cambios o variaciones hacia
arriba. El mantenimiento del balance entre el buen comportamiento
de clarificación y el rendimiento de las etapas requiere
investigación de una gran variedad de tipos de filtro con medios
internos variables. Los filtros adecuados pueden utilizar filtros de
celulosa, fibras de celulosa regenerada, fibras de celulosa
combinadas con adyuvantes de filtro inorgánicos (por ejemplo, tierra
de diatomeas, perlita, sílice de pirólisis), fibras de celulosa
combinadas con adyuvantes de filtro inorgánicos y resinas
orgánicas, o cualquier combinación de los mismos, y filtros
poliméricos (los ejemplos incluyen pero no se limitan a nylon,
polipropileno, poliétersulfona) para lograr la retirada eficaz y
recuperaciones de virus aceptables. En general es preferible pero
no requerido un procedimiento de etapas múltiples. Un procedimiento
ejemplar de dos o tres fases consistiría en un (os) filtro (s)
rústico (s)<para retirar el precipitado grande y desecho celular
seguido de filtro (s) de segunda fase de refinado a con tamaños de
poros nominales mayores que 0,2 micrones menos de 1 micrón. La
combinación óptima será función de la distribución del tamaño del
precipitado así como otras variables. Además, las operaciones de una
sola fase que emplean un filtro relativamente hermético o
centrifugación también puede producir un producto de buena calidad.
Más generalmente, cualquier planteamiento de clarificación que
incluye filtración terminal, microfiltración, centrifugación, o
alimentación del cuerpo de los adyuvantes de filtro (por ejemplo,
tierra de diatomeas) en combinación con filtración terminal o
profunda, que proporciona un filtrado de claridad adecuada para no
ensuciar la membrana y/o resina en las etapas posteriores, serán
aceptables para practicar la presente invención.
La filtración profunda o filtraciones profundas
en combinación con centrifugación han sido los procedimientos más
robustos de clarificación para la presente invención. éstos incluyen
pero no se limitan a los siguientes ejemplos de productos
comercialmente disponibles: los filtros de profundidad de la serie
AP que incorpora CUNO (los ejemplos incluyen APO1), los filtros de
profundidad de la serie CP que incorpora CUNO (los ejemplos
incluyen CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90), los filtros de
profundidad de la serie HP que incorpora CUNO (los ejemplos
incluyen HP10, HP30, HP50, HP60, HP70, HP90), los filtros de
profundidad de la serie CA que incorpora CUNO (los ejemplos
incluyen CA10, CA30, CA50, CA60, CA70, CA90), los filtros de
profundidad de la serie CA que incorpora CUNO (los ejemplos
incluyen CA10, CA30, CA50, CA60, CA70, CA90), los filtros de
profundidad de la serie SP que incorpora CUNO (los ejemplos
incluyen SP10, SP30, SP50, SP60, SP70, SP90), los filtros Delipid y
delipid Plus de CUNO, los filtros de profundidad de la serie CE de
Millipore Corporation (los ejemplos incluyen CE15, CE20, CE25,
CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75), los filtros de
profundidad de la serie DE de Millipore Corporation (los ejemplos
incluyen DE15, DE20, DE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE70,
DE75), los filtros HC de Millipore Corporation (los ejemplos
incluyen A1HC, B1HC, COHC), los filtros de Polynet de CUNO (un
ejemplo incluye Polynet-PB), los filtros clarigard y
Polygard de Millipore, los filtros Life assure de CUNO, los filtros
de profundidad de ManCel associates (los ejemplos incluyen pero no
se limitan a PR 12 UP, PR12, PR 5 UP), y los filtros de PALL o
SeitzSchenk Incorporated (los ejemplos incluyen pero no se limitan a
Bio20, SUPRA EKIP, KS-50P).
Un aspecto adicional del procedimiento descrito
son una serie de etapas para concentrar el Adenovirus, añaden un
tratamiento de nucleasa adicional (por ejemplo, Benzonase™,
Industrias EM) y para introducir un tampón de intercambio mediante
la diafiltración. El tamaño de membrana seleccionado permite la
eliminación de proteínas estructurales de virus no ensambladas,
detergente y nucleasa. La adición de Benzonase™ no se requiere para
derivar un producto que es altamente puro mediante intercambio de
HPLC, pero no conduce a niveles de ADN residuales al final de esta
etapa y presumiblemente en el producto final purificado.
La membrana de ultrafiltración particular
seleccionada será de un tamaño lo suficientemente pequeño para
retener adenovirus pero suficientemente grande para eliminar de
manera eficaz impurezas. Dependiendo del fabricante y tipo de
membrana, los cortes del peso molecular nominal (NMWCO) entre 100 y
1000 kDa pueden ser apropiados. la composición de membrana puede
ser, pero no se limita a, celulosa regenerada, poliéter sulfota,
polisulfona, o derivados de los mismos. Estas membranas pueden ser
hojas planas o fibras huecas. Se prefiere la ultrafiltración que
usa modo de flujo tangencial. Las retículas que promueven
turbulencia también pueden ser útiles para optimizar la eliminación
de impurezas. En una realización preferida, se usan hojas planas
NMWCO PES de 300 kDa 0 500 kDa con una retícula que promueve
turbulencia (por ejemplo, Pellicon 2 Biomax de Millipore con
retícula C) en un modo de flujo tangencial. En el modo de flujo
tangencial, la etapa se puede controlar estableciendo un flujo
transversal fijo con o sin contrapresión en el retorno retenido,
estableciendo una presión de transmembrana fija, o fijando tanto el
flujo transversal como el flujo perneado.
El factor de concentración dirigido durante la
ultrafiltración será función de las condiciones de cultivo,
incluyendo el medio usado, densidad celular, y productividad vírica.
Para el cultivo del lote con una densidad de células de infección
de aproximadamente 10^{6} células/ml, se prefiere 5- a 40 veces de
concentración; se prefiere especialmente una concentración de 10- a
25 veces.
El tratamiento de nucleasa también se puede
considerar para inclusión en el procedimiento, pero no significa
que se requiera. El tratamiento de nucleasa puede incluir el uso de
una nucleasa de amplio espectro (por ejemplo Benzonase™), una
ADNasa, una ARNasa, o cualquier combinación de las mismas. Se
prefiere una nucleasa o cóctel con tanto ARNasa como ADNasa. Se
puede contemplar una etapa de tratamiento de nucleasa en cualquier
punto en el procedimiento, mientras que el contenido en nucleasa
residual en el producto final sea aceptable a la aplicación. Se
prefiere que el tratamiento de nucleasa se produzca después de la
clarificación, y se prefiere especialmente que el tratamiento de
endonucleasa se produzca después de la clarificación y una etapa de
concentración, pero antes de una etapa de cromatografía de
intercambio aniónico. Una manifestación útil del procedimiento
permite el tratamiento de endonucleasa en el aparato de
ultrafiltración después de al concentración. La permeación se puede
detener temporalmente para una longitud de incubación apropiada, y
después volver a comenzar la dialfiltración.
Puede ser deseable la diafiltración en un tampón
que usa ultrafiltración. En la mayoría de las aplicaciones, se
usarán varios volúmenes de lote para asegurar el intercambio
completo. Si el procedimiento va a acabar en este punto, se puede
usar un tampón de formulación apropiado (por ejemplo, véase la
publicación PCT WO 01/66137) para maximizar la estabilidad del
producto. Si la corriente se va a cargar en una columna de
cromatografía, la diafiltración se debe de llevar a cabo en un
tampón apropiado para esa aplicación. Por ejemplo, si el producto
se va a cargar en una columna de intercambio aniónico, la
diafiltración en un tampón con pH entre 6,5 y 8,0 se prefiere,
aunque no se requiere. Más específicamente, puede ser apropiado la
diafiltración en HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 1 M, pH 7,5,
con o sin detergente para evitar la agregación (tal como
PS-80 al 0,1%).
Como se ha indicado a lo largo de esta memoria
descriptiva y se muestra en al Tabla 1, también puede ser útil una
etapa de cromatografía de intercambio iónico para muchas
aplicaciones. Para la purificación de adenovirus de tipo 5 con
Source 15Q, la concentración de NaCl para cargar y lavar puede ser
presumiblemente en cualquier parte entre 0,33 y 0,41 M a pH 7,5 y
se desplazaría a pH alternativo. El pH de los tampones necesita ser
lo suficientemente alto para unirse (mayor que aproximadamente
6,5). Además, el ph del sistema de tampón también debe ser lo
suficientemente bajo para evitar la inestabilidad vírica. El pH
máximo preciso que se puede usar dependerá del experto en la
técnica para esa aplicación particular. Como una guía y ciertamente
sin ninguna limitación, un intervalo de pH entre Ad5 puede variar
potencialmente entre aproximadamente 6-10, con
niveles preferidos d 6,5-9, e incluso más preferido
entre 6,5-8,0. La presencia de PS-80
al 0,1% en los tampones es crítica para lograr niveles bajos de ADN
residual en el producto debido a que atenúa la asociación de
virus/ADN y agregación de virus. Estará dentro del dominio de la
experimentación de rutina para el experto en la técnica establecer
concentraciones de detergente mayores o menores o detergentes
alternativos que serían útiles para promover la disociación de
partículas de virus de otros virus así como diversos contaminantes
celulares. También está dentro del mismo área de experimentación que
el experto en al técnica pueda elegir un detergente alternativo
para el tampón de procedimiento. Como un ejemplo, pero de ninguna
manera significa que sea una limitación, tensioactivos no iónicos
que se pueden usar potencialmente para inhibir la agregación en
intercambio aniónico y a lo largo del procedimiento incluyen ésteres
de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, que incluyen pero no se
limitan a Polisorbato- 80 (Tween 80 ®) [como se ejemplifica en esta
memoria descriptiva], polisorbato-60 (Tween 60 ®,
Polisorbato-40 (Tween 40 ®, y
Polisorbato-20 (Tween 20 ®), éteres de
polioxietilen alquilo, que incluyen pero no se limitan a Brij 58 ®,
Brij 35 ®, así como otros tales Triton X-100 ®,
Triton X-114 ®, NP 40 ®, Span 85 y la serie Pluronic
de tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Pluronic 121). De éstos,
se prefiere la serie de Polisorbato. Se describe en esta memoria
descriptiva que una resina tal como una resina Source 15Q (Amersham
Biosciences) tiene una capacidad de unión extremadamente alta para
adenovirus que se puede utilizar de manera eficaz debido a la
inhibición de la agregación. La evidencia anecdótica y técnica
conocida sugiere que las cargas bajas (< 1 x 10^{12} vp/ml de
resina) son la norma de la industria. Para Source 15Q, se prefieren
columnas con alturas de lecho con más de 5 cm cuando el diámetro de
la columna excede de 10 cm. Las columnas con alturas de lecho entre
10 y 25 cm trabajan especialmente bien. Aunque no se requiere, es
preferible implementar una estrategia que fraccione el pico del
producto principal de las impurezas relacionadas
cromatográficamente, por ejemplo, empleando un valor de corte para
absorbancia de UV. Otras resinas que son adecuadas para la
purificación de adenovirus en este procedimiento incluyen pero no
se limitan de ninguna manera a Source 30Q (Amersham Biosciences),
Fractogel TMAE (industrias EM), y Q-Sepharose XL
(Amersham Biosciences). Se puede usar cualquier intercambiador
iónico, los inventorews han demostrado que otros incluyen Fractogel
DEAE (Industrias EM), Q-Hyper D/F (Biosepra),
Toyopearl DEAE-650M (Tosohaas), Toyopearl
DEAE-750C (Tosohaas) y Toyopearl
QAE-550 M (Tosohaas). Además, los productos de
cromatografía de membrana de intercambio aniónico tales como los
producidos por Pall (por ejemplo la serie Mustang™) y Sartorius
(por ejemplo la serie Sartobind) son adecuados para la purificación
de Adenovirus.
En cualquier realización de la presente
invención, el producto de intercambio aniónico se puede se puede
diafiltrar en tampón de formulación y filtrase estéril. Como
alternativa, se puede añadir una etapa adicional de cromatografía
(por ejemplo intercambio catiónico antes o después de la
diafiltración con el potencial de mejorar la robustez de al
eliminación de impurezas y/o virus/prión. La ultrafiltración de
flujo tangencial es útil en la eliminación de proteína residual y
ácido nucleico y para cambiar el virus en un tampón de formulación.
La etapa proporciona control de PS-80 y puede
proporcionar la eliminación de impurezas residuales incluyendo ADN,
detergentes residuales y proteínas de células huésped. La presencia
d PS- 80 en la alimentación y tampón de diafiltración minimiza el
potencial para la agregación del producto. Es importante el control
de flujo para la reducción eficaz de PS-80 en
presencia de altas concentraciones de adenovirus. La elección entre
membranas de 300 kD y 500 kD se disponen mediante el sacrificio
entre rendimiento y eliminación de impureza mejorada. Otras
configuraciones de membrana (tal como fibra hueca) son sustitutos
aceptables. Más generalmente, la selección de las condiciones para
esta ultrafiltración es similar a las descritas anteriormente. Esto
es, la membrana de ultrafiltración particular seleccionada será de
un tamaño suficientemente pequeño para retener adenovirus pero
suficientemente grande para eliminar impurezas de manera eficaz.
Dependiendo del fabricante y tipo de membrana, pueden ser
apropiados cortes de peso molecular nominal (NMWCO) entre 100 y 1000
kDa. La composición de membrana puede ser, pero no se limita a,
celulosa regenerada, poliétersulfona, polisulfona, los derivados
del mismo. Estas membranas pueden ser hojas planas o fibras huecas.
Se prefiere la ultrafiltración que usa modo de flujo tangencial.
Las retículas que promueven turbulencia también pueden ser útiles
para optimizar la eliminación de impurezas. En otra realización se
usan membranas de hoja plana PES de NMWCO de 300 kDa o 500 kDa (por
ejemplo, Millipore Pellicon 2 Biomax con retícula C) en el modo de
flujo tangencial. En el modo de flujo tangencial, la etapa se puede
combinar estableciendo un flujo transversal fijo (con o sin
contrapresión sobre la línea de retorno retenida), estableciendo
una presión de transmembrana fija, o fijando tanto el flujo
transversal como el flujo de perneado. Se prefiere el control del
flujo transversal y flujo de perneado. El tampón de diafiltración
particular elegido debe ser un tampón de formulación apropiado
(véase el documento WO 0166137) o un subconjunto de los componentes
deseados. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a (1) Tris 5 mM,
MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5%, PS-80
al 0,005%, pH 8,0, (2) Tris 10 mM, Histidina 10 mM, MgCl_{2} 1 mM,
NaCl 75 mM, sacarosa al 5%, PS- 80 al 0,005%, pH 7,4, (3) Tris 5
mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%,
PS-80 al 0,005, pH 7,4, y (4) Tris 10 mM, Histidina
10 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5%,
PS-80 al 0,02%, EDTA 0,01 mM, etanol al 0,5% (v/v),
pH 7,4.
Se puede incluir una etapa de filtración
esterilizante, que es útil en la eliminación de bioburden. El
producto se puede filtrar a través de una membrana de 0,22 micrones
de fluoruro de polivinilideno (PVDF) modificado (por ejemplo
Millipore Millipak). Además de PVDF modificado, el filtro
esterilizante se puede construir de una diversidad de otros
materiales que se conocen bien en la técnica y están disponibles
para el experto en la técnica. Éstos pueden incluir pero no se
limitan a polipropileno, celulosa, ésteres de celulosa, nylon,
poliétersulfona, o cualquier otro material que es consistente con la
unión de producto baja. El filtro puede teneruna sola capa de
membrana o puede incorporar un prefiltro del mismo o diferente
material. El producto se puede mantener congelado o a
aproximadamente 4ºC durante la formulación o llenado posterior. Una
etapa opcional adicional hacia abajo en el procedimiento es la
inclusión de una etapa de purificación ortogonal con el fin de
eliminar cualquier remanente de impurezas y/u otros agentes. Una
etapa como tal incluye, pero no se limita necesariamente a, una
etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Si se elige, la
operación de la etapa de intercambio catiónico debe ser en modo de
flujo continuo. La segunda ultrafiltración actúa como antes excepto
la concentración de sal del tampón de diafiltración se puede reducir
(por ejemplo, a 10 mM). Después de la ultrafiltración e
inmediatamente antes del intercambio catiónico, el pH del lote se
erduce a 6,5 mediante la adición de un tampón de bajo pH
(histidina). Se pueden lograr pH más bajos pero con riesgo de
pérdida de adenovirus en el tampón de formulación ejemplificado, los
pH más altos reducen la eficacia de la etapa pero mejoran la
estabilidad de adenovirus. De manera similar puede variar la
concentración de NaCl. Hasta la fecha, se han evaluado un número de
resinas para la recuperación de adenovirus que incluye Poros 50HS,
Source 30S, Sourde 15S, SP Sepharose HP, SP Sepharose XL, SP
Sepharose FF; se prefiere Source 30S. Inmediatamente después del
intercambio catiónico, el pH se aumenta en la formulación diana
mediante la adición d un tampón Tris de alto pH. Además de cómo se
ha indicado anteriormente, los productos de cromatografía de
membrana de intercambio aniónico tales como los producidos por Pall
(por ejemplo los de la serie Mustang™) y Sartorius (por ejemplo los
de la serie sartorius) son adecuados para la purificación de
adenovirus. El producto puede después filtrarse de manera estéril
como antes.
También se puede añadir una etapa de adsorción
de fase inversa, preferiblemente después de la etapa de
clarificación o la primera ultrafiltración. La adsorción de fase
inversa puede eliminar detergentes incluyendo Triton
X-100 y bromuro de domifeno así como componentes del
medio de cultivo tales como pluronic y rojo fenol así como una
diversidad de otras impurezas hidrófobas. Por lo tanto representa un
procedimiento conveniente para incrementar la robustez o eliminar
las etapas hacia abajo. La etapa de adsorción puede actuar en modo o
bien de lote o de columna. En el modo de lote, el adsorbente se
debe posteriormente retirar usando una filtración, preferiblemente
en modo terminal. En el modo de columna, el lote se debe bombear
sobre la resina a un tiempo de residencia adecuado para permitir la
adsorción de detergentes y otras impurezas. Las resinas adecuadas
deben tener un tamaño de poro que excluye el producto y puede
incluir cualquiera de la serie Amberlite XAD, por ejemplo XAD4,
XAD16, XAD1180 (Rohm and Haas) o resinas similares de otros
fabricantes, por ejemplo Bio-Beads SM2
(Bio-Rad).
También se puede considerar una etapa de
cromatografía de hidroxiapatito para eliminar las impurezas
adicionales. Esta etapa puede actuar en modos o bien de
unión/elución o de flujo continuo. La etapa se puede colocar después
de o bien la etapa de ultrafiltración finalizando la UF con una
diafiltración en un tampón con aproximadamente fosfato 10 mM y NaCl
0,5 M a un pH preferencial entre 6,5 y 8. Un gradiente en fosfato a
0,4 M es suficiente para la elución de adenovirus.
Será evidente tras la revisión de esta memoria
descriptiva que el procedimiento de la presente invención son
escalables, desarrollando al gama desde cultivos celulares de
pequeña escala (por ejemplo, procesamientos de aproximadamente
5-10 litros) hasta el final para preparaciones de
escala comercial, tales como procesamientos de producción de 10.000
a 50.000 litros. Las secciones de los ejemplos 2 y 5 muestran datos
de procesamientos completos a escala más pequeña, mientras que la
descripción más adelante en esta sección contempla, como un ejemplo
y ciertamente sin limitación, un procedimiento de purificación de
adenovirus entre cultivos de 1000 litros (l) (800 l de volumen
operativo) de células PER.C6™ (Crucell) infectadas previamente con
el vector adenovirus respectivo. A este fin, la Tabla 1 resume los
descriptores del procedimiento para un procesamiento en biorreactor
de 1000 l profético (800 l de volumen operativo)será
escalable de manera lineal). Las etaaps del procesamiento inicial
(lisis, filtración profunda y ultrafiltración) se escalan con
volumen de cultivo mientras que la cromatografía de intercambio
aniónico y etapas posteriores se escalan con producción de
partículas virales. Por lo tanto, el tamaño de las últimas etapas
se basará en una estimación de productividad de biorreactor de 4 x
10^{3} partículas de virus por litro (vp/l). bajo estas
suposiciones, se producirán aproximadamente 1,6 x 10^{16} vp por
lote. De manera adicional, el ejemplo 9 muestra los datos generados
a partir del procesamiento de 600 l de Ad5.
Una primera etapa en un procesamiento de
purificación de la presente invención es una etapa de lisis de
células huésped, que proporciona la máxima liberación de partículas
de adenovirus a partir de las células así como proporcionar una
oportunidad de inactivar de manera potencial agentes adventicios.
Como se ha mencionado anteriormente, un disolvente (por ejemplo,
TNBP) también se puede añadir a baja concentración (es decir, 0,3%)
para incrementar la eficacia de inactivación de agentes
adventicios. El mantenimiento prolongado de un lisado o flujo de
lisado clarificado que incorpora TNBP puede conducir potencialmente
a una disminución en la capacidad de infección del producto. A
partir de un procedimiento de cultivo de adenovirus de 800 l,
aproximadamente 8 litros de de Triton X-100 al 10%
y 40 litros de Tris 0,5 M, MgCl_{2} 40 mM, PS-80
al 1% se añadirá al biorreactor con agitación suave. La lisis de
células se completará en 2 horas pero se puede mantener durante un
tiempo adicional para propósitos de eliminación viral. El lisado de
células se puede después mantener a 4ºC o purificarse
inmediatamente. Esta etapa de lisis inicial, independiente de la
escala del cultivo de adenovirus, permite la recogida de tanto
virus asociado a célula (intracelular) como no asociado
(extracelular). Como resultado, proporcionará flexibilidad en al
selección de las condiciones de cultivo que son óptimas para la
productividad de virus global. Además, la presencia de detergente a
lo largo del procedimiento minimizará la asociación del virus con
ADN de células huésped.
Como se ha indicado anteriormente, un esquema de
purificación preferido incorpora una etapa para precipitar
moléculas de ácido nucleico huésped y otros desechos celulares así
como la mejora de la robustez hacia abajo. Continuando con una
descripción de un procedimiento de purificación proyectado para un
procesamiento de 800 l, aproximadamente 60 l de bromuro de domifeno
al 0,5% (CTAB o CPC se puede sustituir con algún ajuste de la
concentración final), se añade lentamente al biorreactor o tanque de
recogida para una concentración final de aproximadamente 0,04%. Si
es necesario, al concentración de SPA óptima para un procesamiento
específico se puede determinar usando estudios de sonda a escala de
1 ml. Se prefiere pero no se requiere la adición por debajo de la
superficie del SPS. El lisado precipitado se clarifica
inmediatamente. Tal precipitación dará lugar aproximadamente un 90%
de reducción en ácido nucleico después de la clarificación. Además,
también se pueden flocular otras impurezas (desechos celulares,
etc) durante esta precipitación. Cuando se compara con controles
sin precipitar, el rendimiento de al filtración profunda se
potenciará notablemente y se mejorarán las producciones. El
producto clarificado a partir del procesamiento mencionado de 800
litros será significativamente menos turbio y el comportamiento de
la ultrafiltración posterior se mejorará notablemente. Las nucleasas
(por ejemplo Benzonase™ y ARNasas) no se requerirán más sino que
incluso serán beneficiosas para una reducción de ADN máxima. La
cromatografía de intercambio aniónico puede no ser esencial para la
pureza del producto dependiendo de la dosificación final pero, como
se muestra en este ejemplo profético así como en las secciones de
los ejemplos 2 y 5 pueden permanecer en el proceso para
robustez.
El lisado de células tratadas con SPA se
clarifica para retirar las impurezas precipitadas y el desecho de
células. Esta etapa puede incluir o bien una etapa de filtración
profunda o una etapa de centrifugación con o sin la etapa de
refinado de filtración profunda. Cuando se incorpore cualquier
etapa, el lisado celular clarificado se concentrará después
10-20 veces, opcionalmente se tratará con nucleasa,
y se diafiltrará. La combinación de la precipitación y
clarificación eliminará aproximadamente el 90% del ADN total y,
dependiendo de las condiciones de ultrafiltración / tratamiento con
nucleasa, la pureza de esta corriente puede ser suficiente para
muchas aplicaciones. Más específicamente, una etapa de filtración
profunda será útil para eliminar el desecho celular y los ácidos
nucleicos huéspedes. Cuando se opta por filtración profunda, el
lisado de células se filtrará a través de dos filtros profundos en
serie para eliminar el desecho celular. La filtración utilizará dos
cartuchos de filtros de 16 pulgadas (40,64 cm) MilliporeMillistak
CE20 (75 pies cuadrados (6,97 metros cuadrados) seguido de dos
cartuchos de 16 pulgadas (40,64 cm) Millistak CE50 (75 pies
cuadrados (6,97 metros cuadrados). Estas áreas incluyen un factor
de seguridad de la menos 2. La filtración se llevará a cabo usando
un caudal constante de aproximadamente 9/l/h/pie^{2} (9l/h/0,092
m^{2}). El líquido restante en la tubería se desplazará con
presión de aire. La filtración profunda proporciona un medio
conveniente para eliminar de manera económica el desecho celular y
precipitado. Se sabe que los expertos en la técnica al menos tras la
revisión de esta memoria descriptiva que la selección del filtro
real se puede cambiar para optimizar de manera adicional el
rendimiento o eliminación de impureza. Como se ha indicado
previamente, al centrifugación es una alternativa viable para la
filtración profunda que se puede aplicar especialmente a
procesamientos a mayor escala.
En el esquema de purificación como se muestra en
la Tabla 1, las etapas de concentración, tratamiento de nucleasa y
diafiltración se incorporan en orden para reducir el volumen del
lote, digerir y eliminar los ácidos nucleicos residuales, y
promover un cambio de tampón. Más específicamente, el lisado
clarificado se concentrará desde aproximadamente 800 l a
aproximadamente 40 l usando una ultrafiltración de volumen constante
con una membrana de NMWCO poliétersulfona (PES) de 300 kD en
condiciones de flujo constante. Después de al concentración, 0,6 MM
Unidades de Benzonase™ (15 U/ml) se añadirán directamente al
retenido y se volverán a circular lentamente en el sistema de
ultrafiltración con mezclado. Después de 1-2 horas a
temperatura ambiente, el lote se diafiltrará contra 5 volúmenes
(200 l) de HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 1 M, pH 7,5 en
condiciones de flujo constante. Se debe indicar que el tamaño de
membrana seleccionada permitirá al eliminación de proteínas
estructurales de virus sin ensamblar, micelas de detergente y
Benzonase™. Un MWCO mayor (por ejemplo, 500 kD) también puede
proporcionar un comportamiento adecuado. La adición de Benzonase™ no
se requiere para derivar un pico que es altamente puro mediante
HPLC de intercambio aniónico pero conducirá a menores niveles de ADN
residual al final de esta etapa y presumiblemente en el producto
final purificado.
La etapa de cromatografía de intercambio
aniónico (AEX) de la Tabla 1 será útil para purificar el virus de
las proteínas, ácidos nucleicos, y componentes virales no
ensamblados de células huésped. La conductividad del lote se
ajustará ahsta 38 mS mediante la adición de aproximadamente 62 l de
HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, PS-80 al 0,1%, pH
7,5. Después de la dilución, el lote se bombeará sobre una columna
de resina Source 15Q (Amersham Biosciences) a una carga de
aproximadamente 5 x 10^{12} partículas por ml de resina. Para
MRKAd5gag, esto corresponde a una columna de aproximadamente 5
litros (aproximadamente 20 cm de altura x 10 cm de diámetro).
Después de la carga, la columna se lavará con 5 volúmenes de HEPES
50 mM, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 0,39 M, PS-80 al 0,1%,
pH 7,5 para eliminar el Triton residual y las impurezas de proteína.
Después el producto se eluye en un gradiente lineal de 4 volúmenes
a NaCl 0,47 M y se recoge basándose en al señal de A_{260}. La
necesidad de controlar la temperatura durante este proceso se
dictará mediante el tipo de procesamiento y la estabilidad del AdV
en esta fase. La carga a una conductividad de 38 mS es
aproximadamente equivalente a NaCl 0,38 M. La concentración es
adecuada para unir partículas de adenovirus pro no las impurezas
relacionadas; esto se traduce en una capacidad mayor de unión para
adenovirus. La presencia de PS-80 al 0,1% (o un
compuesto relacionado en una concentración biológicamente eficaz)
en los tampones será crítico para lograr bajos niveles de ADN
residual en el producto debido a que atenúa la asociación virus/ADN
y agregación de virus. La resina Source 15 Q tiene una capacidad de
unión extremadamente alta para adenovirus que se puede utilizar de
manera eficaz debido a que nosotros inhibimos la agregación.
La ultrafiltración de flujo tangencial es una
etapa mostrada en la tabla 1 que es útil para eliminar también
proteína residual y ácido nucleico así como para cambiar virus en un
tampón de formulación. En resumen, el área de la membrana MWCO PES
de 300 kD) se selecciona para una carga de 1-2 x
10^{16} vo por m^{2}. El producto de AEX se diluirá hasta
aproximadamente 1,1 x 10^{12} vp/ml aproximadamente 16 litros) y
después se diafiltra usando control de flujo contra 5 volúmenes de
tampón de formulación (Tris 5 M, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM,
sacarosa al 5%, PS-80 al 0,05%, pH 8,0). La etapa se
hace actuar a aproximadamente 4ºC y el producto se mantiene a 4ºC
hasta filtración esterilizante. La etapa proporcionará control de
PS-80 y puede proporcionar la eliminación de
impurezas residuales que incluyen ADN y proteína s de células
huésped. La presencia de PS-80 en la alimentación y
tampón de diafiltración minimizará el potencial para la agregación
del producto. El control de flujo es importante para la reducción
eficaz de PS-80 en la presencia de altas
concentraciones de adenovirus. Se pueden sustituir las membranas de
500 kD, sin embargo, existe algún potencial para la permeación de
virus. Otras configuraciones de membrana (por ejemplo de fibra
hueca) proporcionan sustitutos aceptables.
Se puede añadir filtración esterilizante, según
la tabla 1, para eliminar la biocarga. El retenido final se
filtrará a través de una membrana de fluoruro de polivinilideno
modificado de 0,22 micrones (PVDF) (por ejemplo Millipore Millipak
200 ) usando una carga de filtro de aproximadamente 3 x 10^{13}
vp/cm^{2}. Además del PVDF modificado, el filtro estéril puede
estar construido de una diversidad de materiales diferentes que se
conocen en la técnica y estás disponibles para el experto en la
técnica. Éstos pueden incluir pero no se limitan a polipropileno,
celulosa, ésteres de celulosa, nylon, poliéetrsulfoona, o cualquier
otro material que sea consistente con una unión baja de producto.
El filtro puede tener una sola CAAP de membrana o puede incorporar
un prefiltro del mismo o material diferente. El producto se puede
mantener congelado a aproximadamente 4ºC durante la formulación y
llenado posterior.
Se puede añadir una etapa de purificación
ortogonal para tratar la eliminación de impurezas así como un agente
de eliminación adventicio. Las etapas de purificación ortogonal no
se requieren necesariamente y de pueden determinar por los expertos
en la técnica y a su vez implementarse basándose en la necesidad. La
concentración de dosis clínica más alta, la robustez de eliminación
de impurezas, y lo referente a sustrato de células con relación a
la capacidad de generar tumores, virus adventicios y priones todos
pueden definir esta necesidad para los expertos en al técnica. Las
etapas potenciales incluyen cromatografía de intercambio catiónico
de flujo continuo, adsorción de fase inversa, y cromatografía de
hidroxiapatito. El intercambio catiónico de flujo continuo es
particularmente deseable debido a que proporciona un factor de
eliminación alto para PrP y muchos virus adventicios potenciales,
incluyendo virus asociados a adeno (VAA).
Como se ha indicado en esta memoria descriptiva,
la presente invención se refiere a la purificación de virus de tipo
salvaje, modificados o recombinantes. De interés específico en las
aplicaciones de vacunación y/o terapia génica es el uso de
adenovirus incompetentes de replicación de 1ª o 2ª generación,
mutilados por E1 o supresiones adicionales, incluyendo vectores
adenovirus "cobardes". El genoma de adenovirus está
generalmente asociado a patologías benignas en seres humanos, y al
organización genómica del virus se ha estudiado bien desde su
descubrimiento a comienzos de los 1950. Además, el genoma es capaz
de manipulación, dependiendo de al estrategia utilizada para
construir el vector respectivo. Un virus incompetente de
replicación (tal como un vector Ad5gag con supresión de E1/E3 que
expresa un transgen gag de VIH, como se ejemplifica en esta memoria
descriptiva) requiere una línea celular que complementa las
supresiones. Cualquier línea celular mencionada se puede usar para
generar vectores de virus recombinantes, con preferencia, pero sin
limitación, las líneas celulares que incluyen células 293 y células
PER.C6™. A este fin, se han descrito en al bibliografía numerosos
vectores recombinantes de 1ª generación (por ejemplo, véase Bett y
col., 1994, Proc. Natl. Acad. sci. 91: 8802-8806;
documentos WO 01/02607 y WO 02/22080). Los vectors adenovirus
"cobardes" son vectores de adenovirus de 2ª generación en
general desprovistos de secuencias de codificación de proteínas
frecuentemente con proteínas víricas complementadas in trans
por un virus auxiliar (a menudo un adenovirus con supresión E1)
desarrollado con el adenovector dependiente del auxiliar (HD) en
una línea celular empaquetada (por ejemplo PER.C6™). Ausente de las
proteínas víricas, estos vectores víricos pueden, como alternativa,
estar complementadas in trans por una línea celular capaz de
expresar las proteínas adenovíricas estructurales y funcionales
necesarias para la replicación exitosa, empaquetamiento y rescate. A
la vista del aumento de la popularidad de estos vectores víricos y
la última necesidad de preparar cantidades a escala comercial de o
bien un vector viral basado en vehículo de vacuna o de terapia
génica, ha llegado a ser esencial desarrollar metodología más
eficaz cualitativa y cuantitativa para la producción de vectores de
adenovirus recombinantes de calidad comercial. Se entenderá que
serotipos alternativos, que incluyen pero no se limitan a los
serotipos 2, 4, 12, 6, 17, 24, 26, 31, 33, 34, 35, 36 y 16 son
capaces de purificación mediante los procedimientos a gran escala
descritos en esta memoria descriptiva. Los serotipos adenovíricos 2,
5 y 6, 24, 26 y 36, particularmente 5 se prefieren para uso en esta
invención, ya que en este momento, se conoce más sobre estos
serotipos en general que otros serotipos, y se conocen las
secuencias de ADN completas. El adenovirus de serotipo 5 prototipo
se ha secuenciado completamente (Chroboczek y col., 1992, J. Virol
186: 280, que se incorpora ene esta memoria descriptiva por
referencia). También pertenecen al subgrupo C de adenovirus, que no
están asociados a malignidades de seres humanos y roedores. Sin
embargo, como se ha indicado anteriormente, se prevé que se puede
usar cualquier serotipo de adenovirus en esta invención, incluyendo
quimeras (tal como virus Ad recombinantes "cambiado", donde
la región E4 dicha de un serotipo (por ejemplo Ad5) reemplaza la
región similar de un serotipo alternativo (por ejemplo, Ad24), que
puede permitir el crecimiento del virus quimérico Ad24 en una línea
celular (por ejemplo PERC6) que expresa una región E1 de Ad5.
Además, también se pueden purificar serotipo no humanos (por
ejemplo, cepas de adenovirus que infectan chimpancés) mediante los
procedimientos descritos en esta memoria descriptiva. Un vector de
Ad5 recombinante ejemplificado, pero sin limitación, es MRKAd5gag,
así como MRKAd5pol, los cuales se describen en el documento WO
02/22080. Otro vector Ad relacionado es Ad5gag, como se describe en
el
documento WO 01/02607. Estas publicaciones PCT se incorporan en esta memoria descriptiva por referencia.
documento WO 01/02607. Estas publicaciones PCT se incorporan en esta memoria descriptiva por referencia.
La célula huésped para uso en el procedimiento
presentado en esta memoria descriptiva comprende cualquier línea
celular de mamífero que apoyará la infección y réplica de un vector
de adenovirus de 1ª o 2ª generación. Una célula huésped preferida
es una línea celular que apoya la infección y réplica de un
adenovirus recombinante con supresiones E1 y/o E1/E3. Como se
describe en esta memoria descriptiva, tal virus incompetente de
réplica (tal como un Ad5gag, como se ejemplifica en esta memoria
descriptiva) requiere una línea celular auxiliar que complementa la
supresión de E1 de Ad5. Cualquier línea celular mencionada se puede
usar para generar virus recombinante, las líneas celulares
preferidas, pero no limitantes, incluyen células 293, células
PER.C6™, células 911 de una línea celular de la retina embrionaria
humana (Fallaux y col., 1996, Human Gene Therapy 7:
215-222); aminocitos transformados por EI (Schiedner
y col., 2000, Human Gene Therapy 11: 2105-2116);
una línea celular A549 transformada por EI para un carcinoma de
pulmón humano (Imier y col., 1996, Gene Therapy 3:
75-84) y GH329: HeLa (gao y col., 2000, Human Gene
Therapy 11: 213-219). Tal línea celular se
transforma para apoyar la réplica y empaquetamiento de una
denovirus recombinante respectivo, tal como un adenovirus
recombinante con supresiones E1 o E1/E3. Las líneas celulares
adicionales que se pueden utilizar en al presente invención son de
nuevo líneas celulares que se han adaptado para que actúen como
células huésped para un virus termo estable particular. Es
preferible que la línea celular sea una línea celular continua y más
preferible que al fuente de las células cultivadas se originan de
un tejido no neoplásico. También es preferible que la fuente sea
mamífero, más probablemente de origen primate, y especialmente de
origen humano. De nuevo, una línea celular preferida es una línea
celular que es útil para la propagación de un virus recombinante con
supresiones E1 o E1/E3 de Ad; un virus recombinante que cumplimenta
el vector de adenovirus con supresión E1 incluía líneas celulares
transfectadas con el gen que codifica E1 de Ad que se han
seleccionado para este fenotipo transformado, tal como células 293
(células epiteliales de riñón humano) y PER.C6™ (retinoblastos
embrionarios humanos). Otros tipos de células incluyen pero no se
limitan a células HeLa, células A549, células KB, células CKT1,
células NIH/sT3, células Vero, células de ovario d Hámster Chino
(CHO), o cualesquiera células eucarióticas que apoyan el ciclo de
vida de adenovirus.
Cualquier procedimiento de producción de virus
hacia arriba conocido en la técnica se puede adaptar a cultivo de
células de gran escala de células huésped de mamíferos se puede
utilizar para generar el material de partida (es decir, un cultivo
de células huésped infectado por virus que se ha sometido a un
periodo después de la infección de cultivo desarrollado de manera
que se maximice la cantidad de virus intracelular o extracelular)
para la metodología de purificación de la presente invención,
teniendo en cuenta las modificaciones conocidas por los expertos en
al técnica según sea apropiado para ser responsables de, por
ejemplo, cambios en la densidad celular o la presencia de
microvehículos. Esta metodología se conoce en la técnica (por
ejemplo, véase la patente de Estados Unidos nº 6.194.191 para una
revisión de las técnicas de cultivo de células conocidas en al
técnica, así como "Cultura of animal Cells: A Manual of Basic
Techniques", 2000, Ed. R. I. Freshney,
Wiley-Liss, ambos documentos se incorporan en esta
memoria descriptiva por referencia) y se pueden adaptar de virus a
virus y sitio a sitio con el fin de optimizar la producción de
virus. Por ejemplo, las células PER.C6™ se pueden cultivar en un
biorreactor de 300 l con 240 l de volumen operativo y cultivarse con
un Adenovirus recombinante que codifica un transgen gag de VTH (tal
como MRKAd5gaga o Ad5gag) a una concentración de células viables de
0,59 x 10^{6} células/ml a una multiplicidad de infección (MOI) de
280 vp/célula. Aproximadamente cincuenta horas después de la
infección (hpi), se recoge el biorreactor, a una concentración total
de aproximadamente 0,55 x 10^{6} células/ml con un 555 de
viabilidad. En el momento de la partida de esta unidad de operación,
aproximadamente el 25% del virus es el sobrenadante, según un
ensayo de AEX. De manera similar, se cultivan células PER.C6™ en
Biorreactores de 20 l Wave con un volumen de trabajo de 10 l y se
infectan con un vector de Adenovirus recombinante que codifica un
transgen nef de VIH a una multiplicidad de infección (MOI) de
aproximadamente 290 partículas virales por célula (vp7célula) y una
concentración de células viables de aproximadamente 0,72 x 10^{6}
células/ml. Aproximadamente cincuenta horas después de la infección
(hpi) se recogen dos biorreactores Wave a una concentración total
de aproximadamente 0,66 x 10^{6} células/ml con un 815 de
viabilidad. En el momento del comienzo de la concentración, 20,4%
del virus estaba en el sobrenadante según ensayos de AEX de
intercambio aniónico.
Los siguientes ejemplos no limitantes se
presentan para ilustrar mejor la invención.
Una cromatografía de intercambio aniónico (AEX)
con cierta selección de resina y condiciones operativas de columna
(concentración de NaCl y pH) permiten altas capacidades de carga de
virus. En esta memoria descriptiva también se muestra que la
inclusión de un detergente (por ejemplo, PS-80) en
los tampones de desarrollo inhiben las agregaciones durante la
carga y elución. En conjunto, en esta memoria descriptiva se
describe que la utilización de la resina de AEX según se practica
mejorará 5-20 veces sobre los procedimientos
reseñados previamente, con una capacidad utilizable demostrada
(pero no necesariamente limitada) a 2,0 x 10^{13} vp/ml de resina.
es crucial para la implementación de un procedimiento
económicamente eficaz y robusto la elección de erizan con una
capacidad dinámica de adenovirus y metodologías para asegurar que la
capacidad se puede utilizar sin la agregación de producto. Estas
ventajas significativas dirigen esos aspectos: (1) Source 15Q
(Amersham Biosciences) se ha seleccionado por su alta capacidad -
otras resinas que incluyen Source 30Q (Amersham Biosciences) y
Fractogel TMAE (industrias EM) también proporcionan resultados
aceptables aunque con capacidades menores que están probablemente
causadas por menores relaciones de área superficial eficaz a
volumen; (2) PS-80 se ha añadido a los tampones de
desarrollo al 0,1% para evitar la agregación; y (3) el producto se
carga a una conductividad que es lo suficientemente alta para
asegurar que las impurezas de hexón de adenovirus y
cromatográficamente similares no se unen a la resina. Por ejemplo,
la carga a una conductividad d 38 mS es aproximadamente equivalente
a NaCl 0,38 M. La concentración de sal es adecuada para unir
partículas de adenovirus pero no impurezas relacionadas; esto se
traduce en una mayor capacidad de unión para adenovirus. La
conductividad óptima dependerá del serotipo de adenovirus (por
ejemplo, Adenovirus de Tipo 6 se debe cargar a aproximadamente NaCl
0,33 M ya que esta concentración permite que el hexón libre permite
que las partículas víricas se unan fácilmente). Estas condiciones
dan como resultado una etapa que actúa de manera significativa más
eficazmente que otras condiciones reseñadas. La figura 1 muestra
como actúa este procedimiento. Para propósitos ilustrativos, se
muestra un cromatograma preparativo que usa el procedimiento
descrito en una corriente que no se ha sometido a precipitación
selectiva. En su lugar, el lisado clarificado se ah tratado con
altos niveles de nucleasa. Además, la alimentación (Figura 2A),
flujo continuo (Figura 2B), y eluido (Figura 2C)) de este
planteamiento, el pico comprendido predominantemente por hexón de
adenovirus se puede mover al de flujo continuo eliminando cualquier
competición para unión y mejorando d manera significativa la
resolución de de adenovirus de estas impurezas y la capacidad de
columna. el producto de intercambio aniónico se ha diafiltrado
después en tampón de formulación y se filtra estéril. Como
alternativa, se puede añadir una etapa de cromatografía adicional
(por ejemplo, intercambio catiónico) o bien antes o después de la
diafiltración con el potencial de mejorar la robustez de impureza
y/o eliminación de virus/prión.
Se obtuvieron aproximadamente 12,5 litros de
material lisado por Triton MRKAd5gaga (lote 0114) a partir de un
procesamiento en Biorreactor de 300 l y se dividieron en alícuotas
de 9,5 y 3 litros. Las alícuotas se precipitaron de manera separada
en vasos de precipitado Nalgene de 20 litros. Se especificaron
parámetros mixtos para cada alícuota reduciendo las condiciones de
precipitación de 1000 l razonables manteniendo un tiempo de
recambio volumétrico constante. Ambas alícuotas se precipitaron
mediante la adición de DB hasta una concentración final de 0,0435%
en peso/vol usando una solución concentrada (DB al 2% en NaCl 40
mM). La velocidad de adición de esta mezcla era 0,3 ml/min para
cada litro de lisado. Se añadió la solución DB por debajo de la
superficie. El uso de la adición por debajo de la superficie se
apoya por los datos generados por los inventores.
Una vez que se completó la precipitación, se
llevó a cabo la filtración profunda de manera secuencial sobre cada
alícuota usando el mismo aparato de filtración. La clarificación se
llevó a cabo usando un filtro Millipore Opticap
CE-25 en serie con un Opticap DE-45.
Ambos filtros proporcionan áreas de superficie de filtración de 1
pie^{2} (0,093 m^{2}). Los 12,5 l de material precipitado se
procesaron de manera exitosa con un aumento de presión máxima en
cada filtro de 1 psi (6,89 kPa). Después de la clarificación se
redujo la turbidez desde aproximadamente 540 a 3,6 NTU. Como se
muestra en la Tabla 2, el rendimiento en esta etapa era solamente
el 60% pero parecía estar provocado por un fenómeno de adsorción y
por lo tanto estaba exacerbado por el bajo rendimiento usado en este
ejemplo.
Solamente 9,5 litros de este material se procesó
a través del producto final. La concentración y diafiltración se
realizaron usando un ultrafiltro PES de 0,1 m^{2} de NMWCO de 500
kDa (Millipore Pellicon 2). Esta membrana se incorporó en un
aparato TFF que contenía una carcasa de filtro de membrana y una
bomba de lóbulos. Un factor de concentración de 20 se realizó n el
material clarificado para disminuir el volumen del lote total.
Después de la concentración, se añadió Benzinas™ a 15 U/ml de
material y el lote se recirculó lentamente en el sistema durante
dos horas con la línea de perneado cerrada. Después de la incubación
el lote se diafiltró contra 5 volúmenes de HEPES 50 mM, MgCl_{2}
2 mM, NaCl 1 M, pH 7,5.
Se realizó una cromatografía de intercambio
aniónico a una carga de 2,4 x 10^{12} vp/ml de resina. La caída
de presión a lo largo de la columna no se incrementó durante la
carga indicando que al corriente estaba esencialmente sin desecho y
agentes de suciedad. Además, no se observó casi absorbancia de UV (a
260 ó 280 nm) durante carga de producto, lavado, o después de la
elución de producto (Figura 3). Estas observaciones demuestran que
el grueso de las impurezas se retiraban hacia debajo de la
cromatografía de intercambio aniónico y eran consistentes con los
datos de impureza más adelante.
La segunda ultrafiltración se realizó usando
cinco membranas PES de 50 cm^{2}, de 500 kD. Se llevaron a cabo
cinco volúmenes de diafiltración para cambiar el virus en el tampón
de formulación. Como se muestra en al tabla 2, el rendimiento a
través de esta etapa era menor pero probablemente provocado por la
permeación de virus y/o carga de membrana baja. Después el producto
se filtró estéril con un filtro de 0,22 micrones de 10 cm^{2}
Millipore Sterivex GV. No se observó aumento de presión durante la
filtración esterilizante que sugiere una pérdida de virus agregado.
Hay que indicar que los rendimientos del procedimiento actual son
conservadores ya que no tienen en cuenta el muestreo sustancial para
propósitos de análisis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los datos de la eliminación de proteína y ADN se
ilustran el la Tabla 3. hay que hacer notar que los niveles de ADN
residual están por debajo del límite de cuantificación del ensayo
después de intercambio aniónico indicando que el procedimiento
ejemplificado tiene una robustez de procedimiento sustancial. Los
niveles de proteína específicos no cambian del producto UF1 al
producto final y están cerca de los niveles teóricos para
adenovirus. Esta observación es completamente consistente con la
pérdida de señal de UV mostrada en el flujo continuo de AEX
preparativo y lavado. La "limpieza" potenciada de la corriente
mediante la precipitación y clarificación se cree que es la causa
principal de esta mejora. La Tabla 3 también muestra que la
infectividad se mantiene a lo largo del procedimiento.
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Se estudiaron tensioactivos alternativos para
investigar la especificidad relativa de tipos diferentes de
detergentes catiónico. Este ejemplo proporciona un entendimiento
adicional de aumento de selectividad de DB. La Tabla 4 contiene la
lista de tensioactivos usados en este ejemplo junto con sus pesos de
fórmula y estructuras moleculares.
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Se trataron alícuotas de 1 ml con un intervalo
de concentraciones de tensioactivos y se agitaron en un aparato
Vórtex inmediatamente. Después de la filtración con filtros de
jeringa de 0,45 micrones, se analizaron las muestras para evaluar
la concentración de ADN mediante ensayo de Picogreen (Molecular
Probes) y se determinó la concentración de adenovirus usando un
ensayo de HPLC de intercambio aniónico. La Figura 4 muestra los
perfiles de precipitación de adenovirus. Una longitud de cadena más
corta (por ejemplo, CTAB contra TTA) muestra un perfil de
precipitación más distinta. Aunque 0,03% es la máxima concentración
de tensioactvo que se puede permitir antes de la precipitación de
adenovirus para tanto CTAB como TTA; los perfiles de ADN son
diferentes (véase la figura 5). Cuando se comparan los perfiles de
precipitación de DB y BTC se encontraron que eran casi idénticos.
Aunque, cuando se apartan del borde al que la precipitación de
adenovirus comienza, la selectividad para el ADN es mayor para DB
que para BTC a todas las concentraciones (véase la Figura 5). Es
decir, el contacto entre nitrógeno cargado positivamente de BTC y
el grupo fósforo de ADN se puede impedir de manera estérica
mediante la proximidad más cercana del anillo de benceno en BTC. Un
resultado de la carga que se está blindada o carece de una cola
hidrófoba distinta también se puede desechar. Sin embargo, se puede
concluir que las estructuras de anillo son más robustas y
selectivas para el ADN. La interacción hidrófoba propuesta podría
ser la fuerza directora para este fenómeno. Todavía una sola
diferencia entre las moléculas de CPC y CTAB es al presencia de un
anillo de piridinio. La carga positiva se distribuye a lo largo de
este anillo. Como se observa en la Figura 5 la precipitación
inicial de adenovirus por CPC y CTAB comienza a 0,03%. Además el
perfil de precipitación es mucho menos agresivo cuando se distribuye
la carga positiva. Sin embargo, como se observa también en la
Figura 5, CTAB precipita más ADN a través de una mayoría de
concentraciones de tensioactivos.
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La precipitación con bromuro de domifeno (DB) de
ADN en el lisado de PERC.6 ™ es sensible a las condiciones de
mezcla. El comportamiento de la filtración profunda para diferentes
condiciones de mezcla generadas mediante diferente velocidad de
impulsor se evalúa en este ejemplo. MRKAd5gag 0114 se precipitó
diversas velocidades de impulsor de 30, 65, y 250 rpm. La
clarificación consistía en una filtración de dos fases. La
filtración se filtró primero usando un CE-25
Millipore Millistak +50 (0,02 pies^{2} (0,00186 m^{2})) a 9
l/hora/pie^{2} (0,93 m^{2}). El material se reunió y se filtró
usando un DE-25 Millipore Millistak +50 (0,02
pies^{2} (0,00186 m^{2})) al mismo caudal. La presión cae como
una función de rendimiento para las diversas condiciones de mezcla
se comparan con en control antes de precipitación en la figura 6. El
mezclado a 30 rpm mostró un incremento significativo en
rendimiento para el filtro CE-25 a 20 psig (137,9
kPa) cuando se compara con el caso control, pero mostró mayores
pérdidas en el rendimiento global con relación a las condiciones de
mezcla de 65 y 250 rpm. Las otras condiciones de mezclado mostraron
menor rendimiento que el caso control para el filtro
CE-25, pero mostraron mayor rendimiento global entre
la precipitación y filtración profunda que el caso control. La
dependencia de clarificación en las condiciones de mezclado subraya
la importancia de la reoptimización después de que se hayan
determinado las condiciones de mezclado. Como para el rendimiento
del DE-45, se observó poco incremento de presión (1
psi (6,89 kPa)9 en todo el material examinado. Así ya que el
DE-45 nunca llegó a su capacidad, el filtro
CE-25 es el factor limitante en el esquema de
clarificación. aunque los filtros CE-25 redujeron
la turbidez a cantidades variables, como se observa en la tabla 5,
los siguientes filtros DE-45 redujeron la turbidez
de los lisados precipitados hasta menos de 6 NTU, mientras que
solamente reducían la turbidez del lisado precipitado hasta 10.
Un cultivo de células a escala de 240 l se
realizó en un biorreactor de 300 l. Este lote confirmó la
escalabilidad del procedimiento de publicación con operaciones
unitarias individuales desarrolladas al equivalente de 60 y 214
litros de suspensión de células. El rendimiento de proceso global
era 54% medido mediante HPLC de intercambio aniónico. La relación
de capacidad de infección (vp/IU) y contenido de ADN específico del
producto final eran 31 vp/IC) y (< 16,5 pg/10^{11} vp),
respectivamente, y eran comparables con los datos históricos.
Lisis - La lisis se completó mediante la
adición de tampones concentrados para logar las concentraciones
finales de 0,1% de Triton X-100 y
Polisorbato-80 al 0,05%. El lisado se mantuvo
durante toda una noche a temperatura ambiente antes de la etapa de
preparación de detergente.
Precipitación - la precipitación de ADN
se realizó a escala de 214 l en el biorreactor. Una solución de
bromuro de domifeno al 0,5% con NaCl 40 mM se añadió por encima de
la superficie durante aproximadamente dos horas hasta una
concentración final de 0,04% de bromuro de domifeno. El agitador se
accionó a 80 rpm durante este tiempo. La velocidad de agitación se
seleccionó actuando a un tiempo de recambio volumétrico de que se
había demostrado como eficaz a escala más pequeña y que se podía
implementar a gran escala. Después de la precipitación,
aproximadamente 153 kg de lisado precipitado se transfirió para
filtración profunda.
Filtración profunda - El lisado
precipitado se clarificó con un esquema de filtración profunda de
dos fases. Para este procesamiento, se usaron cartuchos Millstack
de 12 pulgadas (0,3048 m) con un filtro de CE20 de 6,8 pies
cuadrados (0,6317 metros cuadrados) seguido de un filtro
CE-50 de 6,8 pies cuadrados (06317 metros
cuadradso). La filtración se llevó a cabo a un caudal constante de 2
l/min y se recuperaron 144,2 kg de lisado clarificado. El
rendimiento global fue 84%.
Ultrafiltración - Se concentraron
aproximadamente 60 l de lisado clarificado 20 veces con 0,3 m^{2}
de área de membrana (PES de 500 kDa de Millipore Pellicon II). La
velocidad de recirculación se mantuvo a 1 l/min y se controló el
flujo del perneado a 0,3 l/min. La digestión por nucleasa se realizó
mediante la adición de 15 U/ml de Benzonase™ seguido de dos horas
de incubación a temperatura ambiente. A continuación, se cambió el
tampón con 5 volúmenes de diafiltración de HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2
mM, NaCl 1 M, pH 7,5 para la eliminación de impurezas. El producto
se mantuvo durante toda una noche a 4ºC.
Cromatografía de intercambio aniónico -
El producto UF1 se diluyó hasta una conductividad de 38 mS7cm
usando HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, PS-80 al 0,1%,
pH 7,5. Una columna FineLine de 10 cm de diámetro (Amersham
Biosciences) se envasó con un total de 863,5 ml de resina Source
15Q (Amersham Biosciences). El producto se cargó a una velocidad
lineal de 1,5 cm/min, se lavó con 5 volúmenes de columna de HEPES 50
mM, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 0,39 M, PS-80 al 0,1%, pH
7,5. Una columna FineLine de 10 cm de diámetro y después se eluyó
durante un gradiente de 4 columnas a NaCl 0,47 M.
\newpage
Ultrafiltración - El máximo de producto
se diluyó y se ajustóhata una concentración de adenovirus de
aproximadamente 1,05 x 10^{12} vp/ml y una concentración de sal
de NaCl 1 M. El lote se diafiltró en tampón de formulación (Tris 5
mM, NaCl 75 mM, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%,
PS-80 al 0,005%, pH 8,0) mediante una membrana PEs
de 500 kDa de 0,1 m^{2} (Millipore Pellicon II Biomax). El flujo
de permeado se mantuvo a 80 ml/min.
Filtración esterilizante - El retenido de
ultrafiltración se filtró para esterilizar con un filtro Millipore
Millipak-20 (100 cm^{2}) a un caudal constante de
150 ml/min.
La Tabla 6 muestra los rendimientos de etapa y
neto de MRKAd5gaga. Este lote produjo 1,91E15 partículas víricas
con un rendimiento global neto de 54%. Hay que indicar que en
algunos casos la entrada a una etapa es significativamente menor
que la salida de al etapa anterior debido al muestreo.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La figura 7 muestra el análisis mediante
ASDS-PAGE del lote ejemplificado así como algunos
experimentos adicionales que no se describen en esta memoria
descriptiva. Las bandas 2-4, en particular, muestran
procedimientos intermedios de este ejemplo y demuestran la alta
pureza del producto ya que todas las bandas significativas se
identifican como proteínas estructurales de adenovirus.
La Tabla 7 resume la retirada de ADN del lote.
Se logró una reducción de ADN de 2 logs mediante la precipitación y
filtración profunda. De nuevo, se logran los niveles cerca del
límite de detección del ensayo. La Tabla 7 también presenta el
perfil de eliminación de detergente durante este procesamiento
ejemplificado. Los detergentes se eliminaron tanto eficazmente en
intercambio aniónico como ultrafiltración segunda. La cantidad de
detergente en la corriente del producto se redujo hasta por debajo
del límite de detección (aproximadamente 0,001%9 después de UF2.
Se utilizó MRKAd5gaga para comparar un
procedimiento que incorpora la precipitación de CTAB y sin
tratamiento de nucleasa (brazo C) con un procedimiento que utiliza
niveles altos de nucleasa (150 U/ml, Benzonase™, 150 U/ml de
ARNasa) pero sin precipitación (Brazo A). La tabla 8 contiene los
datos de eliminación de ADN residual para ambos brazos de
purificación. hay que hacer notar que la precipitación de CTAB
reduce el ADN global temprano en el procedimiento mientras que el
caso base logra la mayoría de su eliminación a través del
tratamiento de nucleasa (UF1 CR a UF1 DR). Los niveles de ADN en el
producto de intercambio aniónico (AEP) están dentro de la
variabilidad del ensayo. Estos datos muestran que una etapa de
precipitación basada en detergente puede reemplazar un tratamiento
de nucleasa de alta concentración completamente sin un impacto sobre
la calidad del producto.
En este ejemplo, se comparan procedimientos que
utilizan precipitación por CPC o por DB (sin uso de nucleasa) a un
control de alto nivel de nucleasa. En particular, se comparan los
siguientes escenarios de purificación
0113A: Sin precipitación, Benzonase Y ARNasa a
150 U/ml cada uno, carga de AEX a aproximadamente 5 x 10^{12}
vp/ml
0113C: Precipitado con CPC, sin uso de nucleasa,
carga de AEX a aproximadamente 5 x 10^{12} vp/ml
0113D: Precipitado con DB, sin uso de nucleasa,
carga de AEX a aproximadamente 5 x 10^{12} vp/ml
Los rendimientos de etapa eran comparables a
través de tres brazos excepto para rendimientos inusualmente bajos
de UF1 en el brazo A (véase la tabla 9).
Los datos de ADN residual para el lote se
enumeran en la tabla 10. Estos datos sugieren una alta eficiencia
global para los procedimientos basados en precipitación incluso en
la ausencia de cualquier uso de nucleasa. el producto de
intercambio aniónico no se procesó a través de UF2 en este ejemplo,
así los valores del producto final no están disponibles.
La eliminación de proteína se muestra en la
tabla 11 más adelante. La eficacia de la eliminación de proteína en
la etapa UF1 parece mejorar significativamente antes de la
precipitación, pero las diferencias de pureza en la etapa AEP no se
pueden discernir usando proteína total ya que la gran mayoría de la
proteína presente es el producto. Como resultado, la impureza de
proteína relativa para los AEP se dirige mediante análisis de
SDS-PAGE en el ejemplo 8.
Mientras que el CTAB se muestra que no tiene un
efecto sobre la infectividad de adenovirus (lote 0112), las
diferencias estructurales y diferencias de mecanismo posible de
precipitación por CPC y DB garantizaron datos de infectividad
adicionales. Para estas tres purificaciones, la relación de
partículas virales a unidades infecciosas era como sigue:
A-26 vp/IU; C-32 vp/IU;
D-29 vp/IU. Estas relaciones son estadísticamente
equivalentes y demuestran que los procedimientos esbozados en esta
memoria descriptiba no tienen impacto en la infectividad del
producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un análisis de proteína en gel de
SDS-PAGE sobre las muestras en curso a partir de
lotes de purificación adicional MRKAd5gag0112, MRKAd5gag0113
(Ejemplo 7) y MRKAd5gag0114 (Ejemplo 2), como se muestyra en la
Figura 8. Se pueden hacer varias observaciones importantes. Primero
la incorporación de la precipitación de CTAB (0112C, banda 3) parece
conducir un pureza de proteína más alta en el producto de
intercambio aniónico (AEP) que el brazo control (0112A, banda 2).
Segundo las bandas 5-10 muestran una pureza similar
para el AEP a pesar de las siguientes variaciones de procedimiento:
(a) carga AEX a 5, 10, y 15 x 10^{12} vp por ml de resina con 150
U/ml de tratamiento de Benzonase™ y sin precipitación
(0113A1-A3-líneas
5-7); (b) uso de solamente 5 U/ml de Benzonase sin
precipitación (0113B-banda 8); (c) precipitación por
CPC o DB sin uso de nucleasa (0113C y D, bandas 9 y 10). Tercero,
el AEP del lote 0114 (banda 4), que se incorporó tanto por
precipitación por DB como por uso de bajo nivel de Benzonase,
muestra mejor pureza de proteína (por ejemplo, impurezas de menos de
39- y 50 kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento se aumentó a escala
adicionalmente, comenzando con 600 l de lisada de células. Las
especificaciones del procedimiento usadas son similares a las
descritas en el ejemplo 5, pero incluyen las siguientes diferencias:
(1) la filtración profunda se reaalizó con un filtro Millipore
seguido de un filtro CUNO CP50 (incorpora carga positiva) en una
relación de área de 2:1, (2) se usaron ultrafiltros de 200 kDa, (3)
PS-80 al 0,1% está incluido en el tampón de
diafiltración, y (4) un adenovirus recombinante sometido a
purificación era MRKAd5pol, que se describe en detalle en la
publicación PCT WO 02/22080.
Los rendimientos para este procedimiento se
muestran en la Tabla 12. La infectividad del producto final se
confirmó mediante un ensayo TCID_{50}, con una relación de
infectividad de 4 vp/IU. El tamaño de partícula media por
dispersión de luz dinámica era 123 nm, consistente con expectaciones
teóricas. Los niveles de ADN residual específico, niveles de
proteína total, y compuestos residuales del procedimiento se
muestran en la tabla 13. Estos datos confirman además la
escalabilidad de este procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se purificó adenovirus de tipo
6 (del subgrupo C). Los cambios en el procedimiento en este ejemplo
están predominantemente en la etapa de en la etapa de cromatografía
de intercambio aniónica preparativa. Ahí, el producto UF1 se diluyó
hasta aproximadamente 30,7 mS/cm y se cargó en la resina Source 15Q.
La columna se lavó con un tampón que contenía NaCl 0,32 M. La
elución del producto se produjo a través de un gradiente de columna
de 4 columnas hasta una concentración de NaCl de 0,41 M. Por otra
parte, el procedimiento se llevó a cabo esencialmente como se ha
descrito en el ejemplo 9.
Los rendimientos de esta purificación demuestran
que el comportamiento del procedimiento es comparable a Ad5 (tabla
5). Específicamente, los niveles de ADN residual mediante
Q-PCR se redujeron por encima de 2 logs después de
la precipitación y clarificación. Los niveles se reducen hasta 3
pg/10^{11} vp en el producto. Los valores de proteína total
específicos (Tabla 15) también indican que la gran mayoría de la
proteína total se elimina al final de UF1 y las impurezas
residuales se normalizan después de AEX. Como se ha observado con el
adenovirus de tipo 5 estos datos indican que los tipos de
adenovirus en el mismo subgrupo se pueden purificar.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se purificó adenovirus de tipo
35 (del subgrupo B). Los cambios en el procedimiento cuando se
comparan con el ejemplo 5 estaban predominantemente en la etapa de
en la etapa de cromatografía de intercambio aniónica preparativa.
Ahí, el producto UF1 se diluyó hasta aproximadamente 28 mS/cm y se
cargó en la resina Source 15Q. La columna se lavó con un tampón que
contenía NaCl 0,29 M y se eluyó en un gradiente de columna de 4
columnas hasta una concentración de NaCl de 0,38 M. Por otra parte,
el procedimiento se llevó a cabo esencialmente como se ha descrito
en los ejemplos 5 y 9.
Los rendimientos de esta purificación demuestran
que el comportamiento del procedimiento es comparable a Ad5 (Tabla
16). Los niveles específicos de ADN residual mediante
Q-PCR se redujeron por encima de 3 logs después de
la precipitación y clarificación hasta 11 ng/10^{11} vp. Los
niveles se reducen hasta 1,0 ng/10^{11} vp después de la primera
ultrafiltración (UF1). Los valores de proteína total específicos
(Tabla 17) también indican que la gran mayoría de la proteína total
se elimina al final de UF1; estos datos indican que este producto
alcanza relativamente alta pureza sin ninguna purificación
cromatográfica y que muchos subgrupos de adenovirus se pueden
purificar mediante el procedimiento existente, a saber someter un
lisado clarificado, precipitado por SPA a una sola etapa de
ultrafiltración.
Pequeñas cantidades de cromatografía de
adenovirus purificado por CsCl-ultracentrifugación
se inyectaron en una columna Source 15Q de escala analítica (véase
la Figura 9), se usó un gradiente de NaCl de 0,2 a 0,6 M. El
procedimiento claramente es capaz de de unirse/eluir virus del
subgrupo C (Ad5), subgrupo D (Ad24), o subgrupo B (Ad35). Además,
mediante la inyección de nuevos tipos de un tipo conocido (en el
caso Ad5), el tiempo de elución relativa se puede calcular; a
partir del tiempo de elución relativo y conocimiento de tampones
preparativos para Ad5, los tampones preparativos para cualquier otro
serotipo se pueden determinar fácilmente. Este cambio es la única
modificación notable necesaria para adaptar esta invención a otros
serotipos de adenovirus.
Se añadió un intervalo de concentraciones de DB
(0 a 0,065%) a viales de 1 ml de diferentes lisados de células de
adenovirus que contenían aproximadamente triton al 0,1%,
PS-80 al 0,05%, MgCl_{2} 2 nM, y Tris 25 mM, pH
8. Las células se prepararon eb cultivo en suspensión con infección
a aproximadamente 10^{6} células/ml. Estas muestras se agitaron
en un aparato Vórtex inmediatamente y se filtraron con filtros de
jeringa de 0,45 micrones. Se retiraron alícuotas para la
determinación de adenovirus y concentraciones de ADN mediante
ensayos de AEX-HPLC y Picogreen.
Como se muestra en la figura 10, el adenovirus
no precipita de manera aprecable a concentraciones de bromuro de
domifeno por debajo de 0,05%. Por lo tanto, la adición de bromuro de
domifeno a niveles entre 0,03 y 0,05% dará como resultado la
precipitación selectiva de ADN. Para las propiedades de corriente
particulares usaads aquí, la adición a 0,04% es adecuada para todos
los serotipos. La precipitación de impurezas residuales mediante
CPC, CTAB, y SPA alternativos mencionados también muestra un
comportamiento similar a través de los múltiples subgrupos de
adenovirus.
La purificación de adenovirus que usa un
procedimiento que incluye intercambio catiónico puede proceder a
través de cromatografía de intercambio aniónico como se describe en
los ejemplos precedentes. Este ejemplo describe el procesamiento
del producto de intercambio aniónico a través de una segunda
filtración, un ajuste de pF, intercambio catiónico de flujo
continuo, y un segundo ajuste de pH/tampón para llegar a un producto
en el tampón de formulación final.
El producto de intercambio aniónico se diluyó y
se ajustó hasta una concentración de adenovirus de aproximadamente
1,77 x 10^{12} vp/ml y una concentración de sal de NaCl 1 M. El
lote se diafiltró en tampón (Tris 5 mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 1
mM, sacarosa al 5%, PS-80 al 0,005%, pH 7,4)
mediante tres membranas PES de 300 kDa de 0,05 m^{2} (Millipore
Pellicon XL). El flujo de perneado se mantuvo a 80
ml/min-m^{2}.
El retenido ultrafiltrado se ajustó a pH hasta
aproximadamente 6,5 con tampón Tris 5 mM, Histidina 0,2 M, NaCl 10
mM, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%, PS-80 al 0,005,
HCl 50 mM, pH 6,5) antes de la etapa de cromatografía de
intercambio catiónico. Se empaquetó una columna Vantage L de 1,6 cm
de diámetro (Millipore Corporation) con 18,8 ml de resina Source
30S (Amersham Biosciences). El producto se cargó a una velocidad
lineal de 1 cm/min y se lavó con 6 volúmenes de columna de tampón
(Tris 5 mM, Histidina 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} mM, sacarosa al
5%, PS-80 al 0,02%, pH 6,5. La operación se
desarrolló en modo de flujo continuo y la recogida de producto se
detuvo una vez que la línea basa alcanzó la A_{260}. El producto
se ajustó a las condiciones de formulación añadiendo tampón Tris
0,17 M, Histidina 10 mM, NaCl 2,27 M, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al
5%, PS-80 al 0,02%, pH 9,3. La Tabla 18 muestra el
rendimiento para este procedimiento.
Este ejemplo demuestra que se puede usar una
centrífuga continua con filtro profundo de refinado para clarificar
el lisado de células precipitado. El lisado de células precipitado
de un lote de Ad5 se centrifugó usando una centrífuga continua CARR
Pilot Powerfuge a un tiempo de residencia de 2 min y tanto 20.000g
como 10.000 g. El recipiente usado tenía un volumen de
aproximadamente 1 l. El centrifugado se alimentó de forma continua
en un filtro profundo CUNO CP50 a 0,14 lpm/pie^{2} (0,093 m^{2})
a una carga de 60 l/pie^{2} (0,093 m^{2}). Las muestras de
centrifugado y filtrado puntuales se tomaron periódicamente para
controlar el progreso de la clarificación. Los rendimientos de
adenovirus a través de la centrifugación estaban en exceso de 90%,
con un rendimiento de clarificación global de 80%. La turbidez del
lisado clarificado era menor que 2 NTU. El lisado clarificado
combinado se procesó después como se ha descrito en otros ejemplos
con resultados similares en términos de eliminación de ADN
residual, pureza de proteína, e infectividad de producto.
Claims (25)
1. Un procedimiento de purificación de
partículas de virus a partir de un lisado de células huésped que
comprende la precipitación selectiva de ADN separándolo así de las
partículas de virus mediante la adición de un agente de
precipitación selectiva al medio de cultivo de células huésped
después de la lisis de manera que al menos el 80% de ADN impuro
precipite en el medio que contiene las partículas de virus, en el
que dicho agente de precipitación selectiva se selecciona entre PEI,
sales de monoalquiltrimetilamonio, sales de
monoalquildimetilbencilamonio, sales de dialquildimetilamonio, sales
de amonio heteroaromáticas, sales de amonio bis- cuaternario y sales
de amonio cuaternario poliméricas.
2. Un procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el agente de precipitación selectiva se selecciona entre el
grupo constituido por DB, CPC, CTAB, BTC, TTA y PEI.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que las partículas de virus son partículas de
adenovirus.
4. Un procedimiento de la reivindicación 3 en el
que el agente de precipitación selectiva se selecciona entre el
grupo constituido por DB, CPC, CTAB, BTC, TTA y PEI.
5. Un procedimiento de la reivindicación 3 o
reivindicación 4 que comprende:
a) lisar las células huésped dentro de la
preparación de cultivo de células;
b) precipitar de manera selectiva el ADN en la
preparación de cultivo de células separándolo así de las partículas
de adenovirus mediante la adición del agente de precipitación
selectiva;
c) clarificar el medio que contiene las
partículas de adenovirus; y
d) llevar a cabo la ultrafiltración en el medio
que contiene adenovirus de la etapa c), dando como resultado una
población de partículas de adenovirus concentradas, purificadas.
6. Un procedimiento de la reivindicación 5 en el
que la etapa c se realiza mediante un procedimiento seleccionado
entre el grupo constituido por filtración profunda, filtración sin
salida, microfiltración, centrifugación o una combinación de las
mismas.
7. Un procedimiento de la reivindicación 5 en el
que la etapa c) se realiza mediante filtración profunda.
8. Un procedimiento de la reivindicación 5 en el
que la etapa c) se realiza mediante la combinación de centrifugación
y filtración profunda.
9. Un procedimiento de la reivindicación 5 en el
que las partículas de adenovirus purificadas de la etapa d) se
someten a cromatografía de intercambio catiónico.
10. El procedimiento de la reivindicación 5 en
el que el medio clarificado de la etapa c) se trata con una
nucleasa.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 ó 4 que comprende:
a) lisar las células dentro de la preparación de
cultivo de células;
b) precipitar de manera selectiva el ADN en la
preparación de cultivo de células separándolo así de las partículas
de adenovirus mediante la adición del agente de precipitación
selectiva;
c) clarificar el medio que contiene las
partículas de adenovirus;
d) someter el medio que contiene adenovirus de
la etapa c) a una cromatografía de intercambio aniónico, y
e) diafiltrar el eluido que contiene adenovirus
recuperado de la etapa d), dando como resultado una población de
partículas de adenovirus concentradas, purificadas.
12. El procedimiento de la reivindicación 11 en
el que la etapa c) se realiza mediante un procedimiento seleccionado
entre el grupo constituido por filtración profunda, filtración sin
salida, microfiltración, centrifugación o una combinación de las
mismas.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 ó reivindicación 4 que comprende:
a) lisar las células huésped dentro de la
preparación de cultivo de células huésped;
b) precipitar de manera selectiva el desecho de
células huésped en la preparación de cultivo de células huésped
separándolo así de las partículas de adenovirus mediante la adición
del agente de precipitación selectiva;
c) clarificar el medio que contiene las
partículas de adenovirus;
d) llevar a cabo un primer procedimiento de
ultrafiltración en el medio que contiene adenovirus de la etapa
c);
e) someter el medio que contiene adenovirus de
la etapa d) a una cromatografía de intercambio aniónico;
f) llevar a cabo un segundo procedimiento de
ultrafiltración en el medio que contiene adenovirus recuperado de la
etapa e); y
g) opcionalmente someter las partículas de
adenovirus de la etapa f) a una cromatografía de intercambio
catiónico, dando como resultado una población de partículas de
adenovirus concentradas, purificadas.
14. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la etapa c) se realiza mediante un procedimiento seleccionado
entre el grupo constituido por filtración profunda, filtración sin
salida, microfiltración, centrifugación o una combinación de las
mismas.
15. Un procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la etapa c) se realiza mediante filtración profunda.
16. Un procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la etapa c) se realiza mediante la combinación de
centrifugación y filtración profunda.
17. Un procedimiento de la reivindicación 11 o
reivindicación 13 en el que la cromatografía de intercambio aniónico
de la etapa d) o e), respectivamente, emplea un tampón que comprende
un detergente.
18. Un procedimiento de la reivindicación 17 en
el que el detergente es un tensioactivo no iónico.
19. Un procedimiento de la reivindicación 18 en
el que el detergente es polisorbato-80
(PS-80).
20. Un procedimiento de la reivindicación 19 en
el que la concentración de PS-80 es 0,1%.
21. Un procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la etapa d) comprende diafiltración en un tampón con un pH
entre 6,5 y 8,0.
22. Un procedimiento de la reivindicación 21 en
el que la etapa d) comprende diafiltración en un tampón que
comprende HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 1 M, pH 7,5.
23. Un procedimiento de la reivindicación 21 en
el que el tampón comprende además polisorbato-80
(PS-80).
24. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la etapa (f) comprende diafiltración en un tampón que
contiene polisorbato-80 (PS-80).
25. El procedimiento de la reivindicación 24 en
el que dicho tampón comprende Tris 5 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75
mM, sacarosa al 5%, PS-80 al 0,005%, pH 8,0.
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