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ES2281252B1 - Vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapeuticas contra el sida. - Google Patents

Vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapeuticas contra el sida. Download PDF

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ES2281252B1 ES200501841A ES200501841A ES2281252B1 ES 2281252 B1 ES2281252 B1 ES 2281252B1 ES 200501841 A ES200501841 A ES 200501841A ES 200501841 A ES200501841 A ES 200501841A ES 2281252 B1 ES2281252 B1 ES 2281252B1
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Abstract

Vectores recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) como vacunas preventivas y terapéuticas contra el SIDA. Los virus recombinantes de la invención contienen secuencias que se encuentran insertadas en el mismo sitio de inserción del MVA y que permiten la expresión simultáneamente de varios antígenos del VIH-1, concretamente una forma de la proteína de la envuelta que consiste en la proteína gp120 y que carece de secuencias correspondientes a la proteína gp41, y una proteína quimérica resultante de una fusión de Gag, Pol y Nef. Con ello se consiguen virus recombinantes estables, que permiten el desencadenamiento de una respuesta inmune contra una gran variedad de antígenos del VIH-1, adecuados para ser utilizados como vacunas preventivas y terapéuticas contra el SIDA, especialmente como parte de protocolos en los que se inoculan al sujeto varias dosis de inmunización que comprenden cada una de ellas vectores recombinantes de vacunación diferentes.

Description

Vectores recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) como vacunas preventivas y terapéuticas contra el SIDA.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a virus recombinantes que expresan antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), diseñados para utilizarse como vacunas preventivas y terapéuticas contra el SIDA. Más concretamente, la invención se refiere a virus recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) que expresan simultáneamente la proteína de la envuelta gp120, y una proteína quimérica resultante de una fusión de Gag, Pol y Nef.
Estado de la técnica
Los datos de la OMS indican que en el año 2004 la enfermedad del SIDA ha causado más de 23 millones de fallecimientos, con más de 40 millones de personas infectadas y con unas predicciones de sobrepasar los 60 millones de infectados para el año 2012. Las diferencias geográficas y económicas de esta enfermedad son evidentes, pues más del 95% de los casos y el 95% de las muertes por SIDA ocurren en el tercer mundo, la mayoría de ellas en el África subsahariana y el sudeste asiático, sobre todo entre jóvenes adultos, con un incremento progresivo entre las mujeres. De entre los países desarrollados, España continúa siendo el país con mayor número de personas infectadas de la Unión Europea. Si bien es cierto que una mejora en los servicios sanitarios en muchas regiones contribuiría a disminuir la velocidad de transmisión del virus, existe consenso en la comunidad internacional de la urgente necesidad en desarrollar vacunas profilácticas y terapéuticas contra el SIDA que ayuden a solucionar el problema.
El desarrollo del SIDA representa los últimos estadios de la infección por el retrovirus conocido como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El VIH es un retrovirus que pertenece al genero Lentivirus, con un genoma de 9,8 kb. El virión contiene dos copias de ARN de banda sencilla y de polaridad positiva. En los primeros estadios de la infección, el ARN genómico, por medio de la transcriptasa en reverso o retrotranscriptasa (RT) que llega a la célula asociada al ARN viral, se convierte en ADN lineal de doble banda. Este ADN se transporta al núcleo, donde se integra en la célula hospedadora en forma de provirus, a partir del cual se transcriben los genes estructurales gag, pol y env, los genes reguladores, tat, rev, nef, y los genes accesorios vif, vpr y vpu. Los productos de la traducción de dichos genes son los siguientes:
-
El producto de la traducción del gen Gag es la poliproteína precursora gag-p55 que se procesa dando lugar a la proteína matriz p17, la proteína de la cápsida p24 y las proteínas de la nucleocápsida p6 y p7.
-
El procesamiento del precursor Pol da lugar a las tres enzimas víricas: la proteasa (p11), la retrotranscriptasa (p6S/S1) (RT) y la integrasa (p32), de las que la RT posee actividad de ADN polimerasa (dependiente tanto de ARN como de ADN) y actividad endonucleasa (RNasa H), ambas requeridas durante la síntesis del ADN, mientras que la integrasa está involucrada en el proceso del integración del provirus, actuando como endonucleasa.
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El producto del gen Env es una proteína de 88 kDa que está fuertemente glicosilada (gp160). Esta proteína es procesada por proteasas celulares, dando lugar a las proteínas gp120 y gp41, que permanecen unidas por uniones no covalentes en la superficie del virión. En la glicoproteína gp120 se localizan los sitios de unión a los receptores celulares, el receptor CD4 y los correceptores CXCR4 (llamado X4) y CCR5 (llamado C5). Es a esta proteína a la que se debe mayoritariamente la variabilidad genética del VIH y su capacidad para escapar a la respuesta inmune tanto humoral como celular, por ser la que está más expuesta en la superficie del virus. Por su parte, la glicoproteína gp41 o transmembrana actúa como anclaje a la membrana lipídica, localizándose en su extremo amino terminal una zona hidrófoba altamente conservada requerida para la fusión de la membrana vírica y la membrana plasmática celular durante el proceso de entrada del virus en la célula hospedadora.
-
Los genes reguladores y auxiliares son codificados por seis fragmentos de lectura abierta solapante. Los genes Tat y Rev son necesarios para la replicación vírica en todas las células infectadas. El gen Tat codifica una proteína de 14 kDa que aumenta la expresión de los genes del VIH. El gen Rev codifica una proteína de 19 kDa que facilita el transporte al citoplasma de los ARNm. La proteína Nef, de 210 aminoácidos, se asocia con estructuras de membrana e induce la internalización y degradación de moléculas de CD4 en los lisosomas. El gen Vif codifica una proteína necesaria para la propagación del virus en linfocitos de sangre periférica, macrófagos primarios y algunas líneas celulares establecidas. El gen Vpr codifica una proteína de 15 kDa que se asocia con la proteína de la nucleocápsida p6. La proteína Vpu es una fosfoproteina que facilita la disociación dentro de la célula infectada de la gp 160 y CD4 por degradación de la molécula CD4 en el retículo endoplásmico.
En los extremos 5' y 3' del DNA viral se encuentran la secuencias LTR (long - terminal repeats), en las que se localizan importantes regiones reguladoras y que juegan un papel primordial durante el proceso de retrotranscripción.
Se han identificado dos clases del virus: VIH-1 y VIH-2, de las que la segunda, VIH-2, parece ser menos patógena que la primera y se localiza sobre todo en la zona occidental de África. Es la forma que genera la enfermedad con mayor rapidez, VIH-1, la que se encuentra más extendida por el planeta y la que más se ha diversificado. Existen tres subtipos del VIH-1, denominados M, N y O, aunque más del 95% de todos los aislados del VIH a nivel global en la población pertenecen al subtipo M. En función de las diferencias en la secuencia de nucleótidos, en especial en la parte correspondiente a las proteínas de la envuelta (Env), este subtipo se subdivide a su vez en ocho estirpes principales, a las que se alude generalmente como clades y que se denominan con las letras A, B, C, D, F, G, H y J. Los clades B y C representan aproximadamente el 80% de las infecciones a nivel mundial, siendo el clade B el más representativo en Europa y América del Norte, mientras que el clade C es prevalente en África y Asia. Son abundantes las zonas en las que los dos clases están presentes en la población (China, India, África subsahariana), por lo que se piensa que las vacunas que contuvieran antígenos correspondientes a los dos clades, B y C, serian mucho más eficaces en dichas zonas.
Una posibilidad para el diseño de tales vacunas consiste en la generación de moléculas de ADN recombinante que contengan secuencias capaces de expresar proteínas del VIH, o fragmentos o formas de fusión de las mismas de forma que, al ser administradas a un individuo, se sintetizan dichas proteínas, fragmentos o formas de fusión de las mismas y se genera una respuesta inmune contra ella. Dichas moléculas de ADN recombinante pueden generarse a partir de genomas de virus en los que se han eliminado o inactivado regiones cuya expresión es necesaria para la replicación del virus en las células diana y/o en los que se han sustituido regiones que codifican proteínas no imprescindibles para que el virus desarrolle la parte de su ciclo vital que se desea que tenga lugar en la célula diana. En esos casos, el ADN recombinante puede administrarse en forma de partículas virales completas que facilitan la transfección del ADN recombinante a la célula diana. De entre los virus que se están utilizando como vectores, las formas modificadas del virus Vaccinia están entre los vectores virales más tentativos para ser aplicados como vacuna recombinante. Algunas de ellas, como el virus NYVAC, (cuyo genoma se representa en la parte inferior de la Figura 1), han sido generadas por mutagénesis dirigida con el resultado de la eliminación de 18 genes del virus Vaccinia (estirpe Copenhague), aproximadamente 10 kb. Otras, como el virus Vaccinia modificado de Ankara (MVA) (cuyo genoma se representa en la parte superior de la Figura 1), han sido generadas de forma menos controlada; concretamente, el MVA se ha generado al haber pasado el virus por más de 570 pases seriados en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), lográndose una perdida del 15% del genoma viral parental (1, 2) que supone deleciones en genes de los que algunos de ellos están intactos en el genoma del virus NYVAC (que se indican subrayando su nombre en la Figura 1) y otros han sido delecionados en ambos vectores (genes que aparecen con el nombre en negrita en la Figura 1), existiendo también genes que permanecen intactos en el genoma del virus MVA y que presentan deleciones en el genoma de NYVAC (los genes cuyo nombre aparece en cursiva en la Figura 1). En el virus MVA, los genes estructurales del virus han permanecido inalterados, mientras que genes involucrados en la evasión del sistema inmune (3), y genes relacionados con el rango de hospedador (2, 4, 5), han sido delecionados o fragmentados. MVA produce su ciclo infeccioso completo en células CEF y en células de riñón de Hamster (BHK), mientras que en líneas celulares humanas, incluyendo las células HeLa, tiene un ciclo abortivo (6, 7). Aunque la replicación viral depende del tipo celular, el bloqueo del programa de morfogénesis en las células no permisivas ocurre en los pasos posteriores a la formación de formas virales inmaduras (IV), sin haber alteraciones de la expresión de genes virales tempranos y tardíos (8, 9). En células en cultivo, los recombinantes de MVA producen niveles similares o mayores de proteína heteróloga que los vectores derivados de la cepa silvestre del virus Vaccinia WR (Western Reserve) (9-11), lo que le hace interesante como sistema de expresión. En mamíferos, recombinantes de MVA han demostrado inducir una inmunidad protectora frente a un amplio espectro de patógenos (6, 12-16), mostrando las siguientes ventajas como vector de expresión de antígenos heterólogos:
-
Alta seguridad, demostrada cuando se usó en más de 120000 individuos durante la campaña de erradicación de la viruela en Alemania.
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Avirulento en una amplia variedad de animales en condiciones inmunosupresoras.
-
Poca o nula reacción sistémica o local tras su inoculación en humanos, incluyendo individuos de alto riesgo.
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Alta plasticidad y estabilidad de su genoma, lo que permite introducir grandes cantidades de material génico exógeno.
-
Potente inductor de una respuesta inmune eficaz frente a una gran variedad de antígenos.
Dada su seguridad y capacidad de producir protección, puede ser de gran utilidad en la generación de vacunas vivas frente a enfermedades infecciosas y en la terapia del cáncer. En particular, varios estudios realizados en macacos han demostrado la relevancia de recombinantes de MVA como vacuna potencial frente al VIH, especialmente cuando se utilizan en sistemas combinados de inmunización en los que se emplean dos o más dosis de vacunación separadas en el tiempo, suministrándose al menos en la primera dosis un vector diferente al de las siguientes dosis, aunque los antígenos expresados a partir de cada uno de los vectores pueden ser los mismos. Para hacer referencia a estos protocolos de vacunación en los que se suministra una primera dosis de desencadenamiento de la respuesta inmune con un vector que da lugar a la expresión de un antígeno y una o más dosis de potenciación o refuerzo de la respuesta inmune generada que contienen un vector diferente, pero que da lugar generalmente a la expresión del mismo antígeno, se emplea a menudo su denominación en inglés prime/boost. Estos protocolos se consideran especialmente adecuados para ser aplicados para la prevención o el tratamiento de las infecciones por el virus VIH pues, por una parte, evitan la administración de formas vivas atenuadas del virus, recurriéndose sólo a la utilización de componentes del mismo; por otra parte, el uso de vectores de expresión capaces de introducirse en las células en lugar de recurrir a la administración directa de las proteínas que expresan posibilita que las proteínas que deben actuar como antígenos se encuentren presentes en el citoplasma de las células hospedadoras para que se produzca su procesamiento mediante la ruta de presentación de antígenos del MHC de clase I, lo que es necesario para desencadenar una respuesta inmune de células T, particularmente respuestas citotóxicas inmunes asociadas con linfocitos T CD8^{+}; por último, el uso de vectores diferentes en cada una de las dosis disminuye la probabilidad de que el vector de vacunación como tal sea eliminado rápidamente por el sistema inmune del hospedador, evitándose la potenciación de la respuesta inmune dirigida contra las partes constituyentes del vector que no proceden del microorganismo contra el que se busca protección. En los estudios con macacos (12), los vectores recombinantes derivados del MVA están demostrando ser particularmente útiles para ser utilizados en protocolos combinados de inducción y potenciación de la respuesta inmune con vectores diferentes, en especial cuando el recombinante derivado del MVA se administra en la segunda dosis y expresa, al igual que el vector utilizado en la primera dosis, múltiples antígenos de VIH y VIS (Virus de la Inmunodeficiencia de Simio). La respuesta de células T citotóxicas y de memoria generada demuestra el potencial de los recombinantes de MVA como vacunas frente al VIH (17).
Por ello, se han diseñado distintos vectores recombinantes, basados en el MVA, capaces de expresar diversos antígenos del VIH. Intentando buscar formas más eficaces para generar una respuesta protectora, se han construido vectores capaces de expresar más de una proteína de dicho virus, en ocasiones formando proteínas de fusión. Así, por ejemplo, las solicitudes de patente WO 02/072754 y WO 2004/087201 describen en general vectores derivados del MVA que expresan las proteínas Env, Gag y Pol (rMVA), considerando como una opción adicional la posibilidad de que el antígeno inmunizante incluya también secuencias de vif, vpr, tat, rev, vpu o nef, aunque sin discutir que la expresión de alguna de esas secuencias tenga gran importancia de cara a la posible respuesta de protección generada ni utilizando esa opción en las realizaciones de la invención. Aunque en dichas solicitudes internacionales se menciona que las secuencias de vif, vpr, tat, rev, vpu o nef, así como las correspondientes a env, gag y pol, pueden en general codificar sólo fragmentos de la correspondiente proteína, y/o presentar mutaciones, es una característica definitoria de la invención que se intenta proteger en dichas solicitudes internacionales que el gen env carezca de parte o de la totalidad de los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático de gp41. El estado de la técnica no describe específicamente la posibilidad de que la parte codificante correspondiente a la proteína gp41 se elimine en su totalidad ni discute las consecuencias que esto tendría. Si se menciona en cambio en los ejemplos de ambas solicitudes que dichas proteínas de la envuelta, gracias al truncamiento de gp41, ven facilitada su acumulación en la membrana de las células que la expresan, lo que se trata como un efecto positivo buscado. También se trata como tal la formación de partículas similares a virus VIH en las que están presentes proteínas Gag y Env y que se pueden detectar, entre otras localizaciones, en el exterior de las células en las que las correspondientes proteínas se han expresado. Respecto al lugar de inserción de las secuencias expresadas, no se menciona que éste tenga una importancia especial salvo para manifestar como positivo el hecho de que la elección del sitio de la deleción III como uno de los lugares en los que se insertan secuencias permite que el recombinante MVA siga siendo TK^{+}. Ello implica que el vector recombinante MVA descrito en dicho estado de la técnica exprese timidina quinasa y, por consiguiente, mantenga una cierta virulencia. Tampoco se discute que tenga relevancia alguna que se utilice más de un lugar de inserción para incluir en el vector las secuencias que codifican los antígenos que se desean expresar, no describiéndose pruebas para demostrar la estabilidad de dichos vectores.
La solicitud de patente WO 2004/035006 describe también vectores derivados de MVA que contienen secuencias codificantes de varias proteínas de VIH que se expresan en forma de proteínas de fusión, concretamente una fusión Gag-Pol y una fusión nef-tat, pero el enfoque es aquí diferente al de las solicitudes internacionales anteriormente comentadas: se busca que no haya empaquetamiento en proteínas virales, para lo cual la solución propuesta es que al menos una de las secuencias codificantes de proteínas del VIH esté unida a una secuencia líder heteróloga, siendo la del tPA la que se elige para las realizaciones correspondientes a vectores derivados del MVA y promoviéndose de esta manera la secreción de las proteínas sintetizadas. Para la inserción de las secuencias, además, se muestra preferencia por el sitio de la deleción III, utilizándose de nuevo en un mismo vector un segundo lugar de inserción de secuencias adicionales, el de la deleción II, para una proteína de fusión tPA-nef-tat, sin considerar que esto pueda tener consecuencias para la estabilidad del vector ni realizar experimentos para verificar que realmente sea estable. Además, la única forma considerada para la secuencia env, delta V2 env, donde posee deleciones es en la parte correspondiente a la proteína gp120, no considerándose de nuevo la posibilidad de eliminar la proteína gp41 ni las posibles consecuencias derivadas de ello.
Los vectores de la presente invención, por su parte, responden a un enfoque diferente a los descritos en las solicitudes anteriores. Estos vectores recombinantes derivados del MVA poseen secuencias que permiten la expresión simultánea de la proteína gp120 y de una proteína de fusión Gag-Pol-Nef. Tanto la secuencia que expresa la proteína gp120 como la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se encuentran insertadas en un mismo lugar, el correspondiente al gen de la timidina quinasa, con lo que se aumenta la estabilidad de los vectores al utilizar un único sitio de inserción con respecto a otros vectores derivados también del MVA que contienen varias secuencias codificantes de proteínas del VIH, dado que estos últimos, al llevar insertas cada una de las secuencias en un lugar diferente del MVA, pierden con facilidad los insertos presentes en ellos. Además, la utilización específica del locus de la timidina quinasa como lugar de inserción da lugar a que los vectores de la invención sean virus recombinantes derivados del MVA que presentan una mayor seguridad para ser utilizados como vacunas, por carecer de un gen, el de la timidina quinasa, involucrado en virulencia. A diferencia de lo descrito en las solicitudes WO 02/072754 y WO 2004/087201, la expresión de la proteína gp120 en ausencia de secuencias correspondientes a la proteína gp41, permite su liberación al medio extracelular pocas horas después de su síntesis en el citoplasma de la célula infectada, facilitándose con ello la inducción tanto de respuesta humoral como celular frente a esta proteína, la que mayor variabilidad presenta en su secuencia entre los distintos clades. Los recombinantes de la presente invención expresan al menos cuatro antígenos: Env, Gag, Pol y Nef, por considerar que un vector que exprese esos cuatro antígenos es mucho más eficaz que vectores recombinantes capaces de expresar sólo alguno de dichos antígenos o incluso otros, por la capacidad de los antígenos elegidos para inducir respuestas celulares específicas y por la menor diversidad genética entre aislados del VIH en lo que a las secuencias de Gag, Pol y Nef se refiere. Además, se considera una característica particularmente importante de la invención la presencia de secuencias correspondientes al gen regulador nef, junto con las correspondientes a los genes estructurales gag, pol y env, pues se expresa en etapas tempranas del ciclo del VIH y la generación de una respuesta celular frente a sus productos se considera necesaria para aumentar el repertorio de defensa inmunológica contra el VIH y conseguir una respuesta protectora adecuada que permita el control inmunológico de la infección por el VIH-1. La asociación de las secuencias codificantes de gag, pol y nef se ha realizado en los vectores de la invención de forma que se genere una proteína de fusión que mantiene todos los epítopos con capacidad para generar respuesta celular, posibilitando una mayor presentación antigénica que otros vectores que expresan fusiones que corresponden sólo a las proteínas Gag y Pol, pero generándose una proteína de fusión que no se proteoliza por acción de la proteasa viral, no da lugar a la formación de partículas virales y que, al contrario de lo que sucedía con las proteínas expresadas en las solicitudes anteriormente comentadas, se acumula en el citoplasma en forma de una poliproteína estable. El uso de un promotor sintético idéntico para dirigir la expresión tanto de la proteína gp120 como de la fusión Gag-Pol-Nef, promotor que se elige para que permita la expresión de las correspondientes proteínas tanto a tiempos tempranos como a tiempos tardíos durante la replicación del MVA, permite la expresión simultánea de las secuencias de la gp120 y de la proteína quimérica Gag-Pol-Nef, su acumulación a lo largo del ciclo de infección del MVA y el procesamiento antigénico de las mismas a tiempos tempranos y tardíos. La utilización para la generación de los vectores recombinantes de secuencias obtenidas específicamente de aislados naturales y que preferentemente pertenecen a los clades más representados en la naturaleza, B y C, posibilita además una vacunación mundial más representativa de la población infectada o en riesgo. Por todo ello, el uso de estos vectores para vacunación, de forma aislada o como parte de protocolos de inmunización en los que se suministran vectores codificantes de antígenos en varias dosis espaciadas en el tiempo, puede ser de especial utilidad para ayudar a contener la expansión del virus VIH. Además, estos vectores derivados del virus MVA representan tanto una alternativa a construcciones similares derivadas del virus NYVAC como un complemento útil para la utilización de cada uno de los mencionados vectores recombinantes en fases diferentes de protocolos de inmunización en los que se suministra una primera dosis para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis sucesivas para potenciarla, pues las pruebas realizadas hasta ahora por el grupo de los inventores muestran que, además de diferir en su genoma y en la respuesta inmune que generan en ratones frente a los antígenos del VIH gp120 y Gag- Pol-Nef, ambos vectores manifiestan un comportamiento diferencial en cultivos celulares y modelos animales (inducción de diferentes patrones de expresión de genes humanos en células HeLa, menor inducción por parte del MVA de apoptosis, de destrucción celular y de respuesta humoral contra sí mismo) que hace predecible que su comportamiento sea diferente también tras la administración a seres humanos como vacunas de vectores recombinantes generados a partir de cada uno de
ellos.
Descripción de la invención
La invención proporciona nuevos vectores recombinantes derivados del virus MVA capaces de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 y una proteína de fusión correspondiente a las proteínas Gag, Pol y Nef del VIH-1 que no se proteoliza por acción de la proteasa del VIH, estando la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef bajo el control de promotores idénticos e insertadas ambas en el mismo lugar de inserción del vector.
La expresión de la proteína Env sintetizada a partir de los vectores de la invención da lugar a proteínas gp120 no asociadas a proteínas gp41 o fragmentos de la misma, facilitándose con ello su salida de la célula y su liberación al medio, lo que hace más probable la activación de las células B y la producción de anticuerpos neutralizantes frente al VIH. En las realizaciones preferidas de la invención, la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env que forma parte de los vectores de la invención codifica una proteína gp120 completa, habiéndose delecionado toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120, eliminando con ello, la totalidad de la secuencia codificante correspondiente a la proteína gp41.
En cuanto a la proteína de fusión de Gag, Pol y Nef, está diseñada de manera que no dé lugar a la formación de partículas similares a partículas virales. La forma utilizada para la construcción de las realizaciones de la invención que se describen con detalle en la presente memoria se acumula en el citoplasma de las células infectadas con los vectores recombinantes de la invención en forma de poliproteína, sin experimentar el procesamiento característico del virus VIH provocado por la proteasa viral que daría lugar a su escisión en proteínas más pequeñas, aunque posteriormente sí va a experimentar el procesamiento celular que permite la presentación de péptidos antigénicos de la proteína de fusión y la generación de una respuesta inmune contra los mismos.
La invención se refiere también a composiciones que contienen dichos vectores recombinantes y a su uso para generar una respuesta inmunológica frente al virus VIH. La generación de esa respuesta protectora se puede conseguir mediante la administración únicamente de vectores de la invención, en una única dosis o en dosis separadas en el tiempo, o como parte de un protocolo de inmunización con vectores diferentes que expresan antígenos del VIH, formando parte los vectores de la invención de la dosis inicial que desencadena la respuesta y/o de una o más dosis posteriores destinadas a potenciar la respuesta previamente generada.
Además, la invención se refiere también a un método de vacunación para prevenir o tratar una infección provocada por el VIH en el que se administra al menos un vector de la invención. Los métodos de vacunación incluidos dentro del alcance de la invención pueden comprender una o más dosis de vacunación, siempre y cuando en una de ellas se administre al menos un vector de la invención. Se prefieren los métodos en los que se administra más de una dosis de vacunación para desencadenar o potenciar la respuesta inmune. De entre ellos, se prefieren especialmente los protocolos combinados en los que se usan vectores diferentes en la primera dosis de desencadenamiento de la respuesta inmune y en las dosis sucesivas destinadas a reforzar la respuesta desencadenada. Dado que los vectores derivados de MVA parecen ser de mayor utilidad para conseguir una respuesta de protección frente al VIH cuando se suministran en la segunda o en dosis sucesivas destinadas al refuerzo de la respuesta inmune previamente desencadenada, lo que más se prefiere es que al menos un vector recombinante derivado del MVA de la invención esté presente en la segunda dosis o en una dosis posterior, pudiendo estar ausente o presente de la primera dosis de vacunación. En los casos en los que al menos un vector derivado de MVA está presente en la segunda dosis y/o en una dosis posterior de vacunación, se prefiere que al menos un vector administrado en la primera dosis de vacunación sea capaz de expresar las mismas proteínas derivadas del VIH que el vector de la invención presente en otra dosis diferente. De ellos, los vectores derivados del virus NYVAC, NYVAC-B y NYVAC-C y las combinaciones que comprendan ambos vectores son una opción adecuada para ser utilizados en la primera dosis de vacunación como parte de un método de vacunación de la invención cuando el vector de la invención administrado en la segunda y/o en una dosis sucesiva de vacunación es, respectivamente, el vector de la invención que posteriormente se denomina MVA-B o el vector que posteriormente se denomina MVA-C o bien una composición que comprenda tanto MVA-B como MVA-C. También son realizaciones preferidas del método de vacunación de la invención aquellas en las que la primera dosis de vacunación contiene el vector de ADN desnudo DNA-B cuando en la segunda dosis y/o en dosis posteriores de vacunación está presente el vector MVA-B de la invención, así como aquellas en las que la primera dosis de vacunación contiene el vector de ADN desnudo DNA-C cuando en la segunda dosis y/o en dosis posteriores de vacunación está presente el vector MVA-C de la invención.
Se prefiere especialmente que el lugar del vector en el que se encuentran insertadas la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef sea el gen de la timidina quinasa, gen que queda inactivado por la presencia de las secuencias en él insertadas, aumentándose con ello la seguridad de los vectores de la invención para ser suministrados a individuos con el propósito de generar en ellos una respuesta inmune frente al VIH.
En las realizaciones preferidas de la invención, la secuencia codificante de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se genera a partir de secuencias de proteínas Gag, Pol y Nef para las que se deduce una secuencia de ADNc utilizando codones de lectura frecuentes en mamíferos, buscando con ello aumentar los niveles de expresión de la proteína de fusión. Además, en la secuencia codificante de la proteína de fusión se provocan modificaciones respecto a las secuencias naturales, para aumentar su inmunogenicidad y su seguridad. Las modificaciones por las que se tiene mayor preferencia incluyen la inactivación por mutagénesis del lugar activo de la proteasa y la eliminación mediante deleción del lugar activo de la integrasa, la realización de deleciones en el gen nef y su inserción en la región codificante de la RT, la traslocación del lugar activo de la RT al extremo C-terminal de la proteína de fusión y la fusión de la secuencia del gen gag en fase de lectura con pol-nef, creando una desviación de una fase de lectura e introduciendo un cambio de glicina a alanina para prevenir la formación de partículas semejantes a virus. De entre ellas, se prefiere específicamente las modificaciones realizadas para generar la secuencia correspondiente a la proteína de fusión descritas por Didierlaurent A. et al. (18).
En las realizaciones preferidas de la invención, el promotor se escoge de manera que permitan la expresión de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Env tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MVA. El promotor sintético temprano/tardío de poxvirus pE/L (19) es la opción elegida para las realizaciones más preferidas de la invención, aunque cualquier otro promotor de poxvirus podría utilizarse igualmente para la construcción de vectores de la invención.
En una realización particularmente preferida de la invención, tanto la secuencia correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia que da lugar a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de aislados naturales pertenecientes al clade B y/o al clade C. En realizaciones aún más preferidas de la invención, la secuencia correspondiente a la proteína Env y las secuencias utilizadas para generar la secuencia que da lugar a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de aislados naturales pertenecientes a un mismo clade, preferentemente el clade B o el clade C, pero también se consideran realizaciones de la invención aquellas en las que la secuencia correspondiente a la proteína Env procede de un aislado correspondiente a un clade y las secuencias utilizadas para generar la secuencia que da lugar a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de un aislado correspondiente a un clade diferente. Están incluidas también dentro del alcance de la invención aquellas realizaciones en las que al menos una de las secuencias utilizadas para generar la secuencia correspondiente a la proteína de fusión, es decir, la secuencia de gag, la secuencia de pol o la secuencia de nef, procede de un aislado diferente, pudiendo ser diferentes los tres aislados de los que se obtiene cada una de las correspondientes secuencias codificantes e, incluso, no pertenecer al mismo clade. Las composiciones de la invención que contienen vectores recombinantes de la invención, destinadas a ser utilizadas en la vacunación contra el virus VIH, pueden contener vectores recombinantes generados únicamente a partir de aislados de un clade concreto, preferentemente el B o el C, mezclas de vectores recombinantes de distintos clades en las que cada uno de los vectores se ha construido con secuencias procedentes de aislados de un único clade, vectores idénticos entre sí que se han construido a partir de secuencias procedentes de aislados de clades diferentes o mezclas de cualquiera de los vectores incluidos dentro del alcance de la invención. Se prefieren aquellas composiciones que contengan vectores de la invención generados a partir de un único clade, preferentemente el B o el C, o mezclas de vectores generados a partir de aislados del clade B y vectores generados a partir de aislados del clade C. Las composiciones que contengan tanto vectores generados a partir de aislados del clade B y vectores generados a partir de aislados del clade C deberían ser de especial utilidad para ser utilizadas para la prevención y/o el tratamiento de la infección por el VIH en aquellas zonas en las que ambos clades están representados de forma significativa.
En las realizaciones de la invención cuya construcción se describe en los ejemplos de la presente memoria, la secuencia correspondiente a la proteína Env se encuentra insertada en sentido opuesto con respecto al sentido de la transcripción de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef, encontrándose los promotores correspondientes a cada una de las secuencias correspondientes a proteínas del VIH insertados en orientaciones opuestas y en la zona más interna del inserto. Cada uno de los vectores cuya construcción se describe se generaron a partir de aislados naturales correspondientes a clades diferentes. El primero de ellos, MVA-B, permite la expresión de una forma del gen env obtenida a partir del aislamiento del VIH BX08, procedente de Europa, y una proteína de fusión Gag-Pol-Nef que resulta de la traducción de una secuencia polinucleotídica generada a partir de secuencias correspondientes a gag, pol y nef del aislamiento IIIB, que forma parte, como el aislamiento BX08, del clade B. El segundo de los vectores, MVA-C, permite la expresión una forma del gen env obtenida a partir del aislamiento del VIH CN54, procedente de China, y una proteína de fusión Gag-Pol-Nef que resulta de la traducción de una secuencia polinucleotídica generada a partir de secuencias correspondientes a gag, pol y nef del mismo aislamiento CN54, que forma parte del clade C. Las secuencias de aminoácidos expresadas a partir de cada uno de los genes env contenidos en los vectores derivados de MVA reproducen la secuencia completa de las proteínas gp120 correspondientes a los virus del aislamiento BX08, en el caso del MVA-B, y a los virus del aislamiento CN54 en el caso del MVA-C. La construcción de estos vectores y la evaluación de su capacidad inmunogénica se describen con más detalle con ayuda de las Figuras y los Ejemplos que aparecen más adelante en la presente memoria.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un esquema de los mapas de los genomas de los virus MVA (parte superior) y NYVAC (parte inferior), en los que la localización de los genes fragmentados se indica mediante un sombreado oscuro, indicándose su denominación inmediatamente debajo. Los nombres subrayados corresponden a denominaciones de genes delecionados en MVA e intactos en NYVAC, los nombres en negrita corresponden a denominaciones de genes delecionados tanto en MVA como en NYVAC y los nombres en cursiva corresponden a denominaciones de genes intactos en MVA y que presentan deleciones en NYVAC. Las letras A a Q situadas sobre cada una de las representaciones de los genomas se refieren a la denominación de los distintos fragmentos de restricción generados por la enzima HindIII al digerir con ella el ADN genómico de MVA y NYVAC. RTI: región terminal izquierda; RCC: región central conservada; RTD: región terminal derecha.
La Figura 2 muestra un esquema de la construcción del vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/
gagpolnef-B-1 y los plásmidos a partir de los cuales se genera.
La Figura 3 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus TK del virus MVA-B. La parte superior de la figura muestra un esquema en el que se representan las posiciones de los oligonucleótidos utilizados como cebadores, los tamaños estimados de los fragmentos que se generan en la PCR con las diferentes combinaciones de oligonucleótidos, así como su localización con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes de los mismos. La parte inferior muestra fotografías de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con diferentes parejas de cebadores. A: PCR cebada con los oligonucleótidos TK-L y GPN7649; B: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN8170 y E/L; C: PCR cebada con los oligonucleótidos BX08556/TK-R. Las muestras
correspondientes a cada calle son: 1: pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1; 2: MVA-B; 3: MVA-WT; 4: NYVAC-WT.
La Figura 4 muestra una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis los productos resultantes de una reacción de PCR en la que se utilizaron como cebadores oligonucleótidos que hibridaban con las secuencias flanqueantes del gen TK. Las muestras correspondientes a cada calle son: 1: NYVAC-WT; 2: MVA-B; 3: MVA-WT.
La Figura 5 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos gp120-BX08 (parte superior de la figura) y gagpolnef-IIIB (parte inferior de la figura, en la que la proteína gagpolnef-IIIB se abrevia como GPN) desde un vector NYVAC-B (primera calle), desde los stocks P1, P2 y P3 (calles 2-4: P1, P2 y P3) y desde células en las que se había simulado la infección (calle 5).
La Figura 6 muestra los resultados correspondientes a las pruebas de estabilidad del vector MVA-B. La parte A muestra los resultados de las inmunotinciones de células CEF infectadas con el vector MVA-B y tratadas con los anticuerpos anti-WR (fotografía de la izquierda), anti-p24 (fotografía central) y anti-gp120 (fotografía de la derecha), junto con un gráfico en el que se representa el total de células teñidas con cada anticuerpo. La parte B muestra la detección de la expresión de las proteínas gagpolnef-IIIB (fotografía de la izquierda) y gp120-BX08 (fotografía de la derecha) mediante transferencia tipo Western y detección con anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas en células infectadas con el virus recombinante NYVAC-B (NYVACB), células en las que se había simulado la infección (M) y stocks de virus correspondientes a los pases 7 a 10 (P7, P8, P9 y P10).
La Figura 7 muestra la cinética de expresión de la proteína gp120-BX08 obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-gp120 del clade B de transferencias tipo Western correspondientes a muestras tomadas pasadas 4, 8, 16 y 24 horas de una infección con un virus recombinante. La parte superior corresponde a la infección con el virus MVA-B y la inferior a la infección con el virus NYVAC-B. Para cada una de las muestras aparece inmediatamente debajo la intensidad de las señal lograda al incubar las muestras con un anticuerpo anti-\beta-actina (\beta-act.) P: precipitado; S: sobrenadante; M: simulación de infección.
La Figura 8 muestra la cinética de expresión de la proteína gagpolnef-IIIB obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-p24 del clade B de transferencias tipo Western correspondiente a muestras tomadas pasadas 6, 18 y 24 horas de una infección con un virus recombinante. Las calles marcadas como "1" corresponden a muestras infectadas con el virus NYVAC-B, las calles marcadas como "2" a muestras infectadas con el virus MVA-B y la calle marcada como M a una muestra en la que se simuló la infección. La flecha indica la posición de la proteína gagpolnef-IIIB (abreviada como GPN).
La Figura 9 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT expandido de células T secretoras de IFN-\gamma generadas por la inmunización de ratones BALB/c con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. En ordenadas se indica el número de células T secretoras de IFN-\gamma detectadas por cada 10^{6} esplenocitos, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B que se indican en abscisas. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA-B y la segunda a animales inmunizados con NYVAC-B.
La Figura 10 muestra la producción de citoquinas detectada en ratones BALB/c inmunizados con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. La parte izquierda corresponde a los niveles de IFN-\gamma y la derecha a los niveles de IL-10, ambos en pg/ml, detectados en los sobrenadantes de esplenocitos de animales inoculados con MVA-B (primera barra de cada uno de los grupos de péptidos) o NYVAC-B (segunda barra de cada uno de los grupos de péptidos) frente a grupos específicos de péptidos representativos del clade B.
La Figura 11 muestra gráficos correspondientes a los niveles de distintos tipos de células T secretoras de IFN-\gamma y presentes en los esplenocitos de ratones BALB/c inoculados con MVA-B (primera barra de cada grupo de péptidos) o NYVAC-B (segunda barra de cada grupo de péptidos) reestimulados por los grupos de péptidos representativos del clade B indicados en abscisas. El gráfico superior muestra el porcentaje de celulas T CD8+ que secretan IFN-\gamma, el gráfico intermedio el porcentaje de celulas T CD4+ que secretan IFN-\gamma y el gráfico inferior el porcentaje total de células T CD8+ y T CD4+ que secretan IFN-\gamma, todos ellos detectados por cada 3 x 10^{5} esplenocitos.
La Figura 12 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IFN-\gamma generadas por la inmunización de ratones BALB/c con distintas combinaciones de vectores a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB, así como los resultados correspondientes a los controles, en todos los casos administrando los vectores siguiendo protocolos de inducción/potenciación. En ordenadas se indica el número de células T secretoras de IFN-\gamma detectadas por cada 10^{6} esplenocitos, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B que se indican en abscisas. Para cada uno de esos péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con DNA-B+MVA-B, la segunda a animales inmunizados con DNA-B+NYVAC-B, la tercera a animales inmunizados con DNA-B+DNA-B, la cuarta a animales inmunizados con DNA \diameter +MVA-WT y la última a animales inmunizados con DNA \diameter + NYVAC-WT. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; la presencia de asteriscos (*) indica diferencias significativas (p<0,05) entre los distintos grupos.
La Figura 13 muestra la producción de IFN-\gamma, en pg/ml, generada tras la reestimulación, con los grupos de péptidos indicados en abscisas, de esplenocitos extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de combinación de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de iniciación de la respuesta excepto en la última muestra, que se inocula con ADN sin inserto (DNA-\phi), inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo), NYVAC-B (segunda barra), el DNA-B de nuevo (tercera barra), MVA-WT (cuarta barra) y NYVAC-WT (quinta barra, correspondiente a la muestra a la que se le inoculó primeramente DNA-\phi.
La Figura 14 muestra la producción de quimioquinas, en pg/ml, generada tras la reestimulación, con los grupos de péptidos del clade B indicados en abscisas, de esplenocitos extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de combinación de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de iniciación de la respuesta salvo en el control, que se inoculó con ADN sin inserto (DNA-\phi, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo), NYVAC-B (segunda barra), el DNA-B de nuevo (tercera barra), y NYVAC-WT (cuarta barra, correspondiente al control inoculado primeramente con DNA-\phi). El gráfico de la izquierda corresponde a la concentración detectada de MIP-1 \beta y el de la derecha a la concentración detectada de RANTES.
La Figura 15 muestra gráficos correspondientes a los niveles de distintos tipos de células T secretoras de IFN-\gamma o TNF-\alpha presentes en esplenocitos reestimulados por los grupos de péptidos representativos del clade B indicados en abscisas tras haber sido extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos combinados de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de iniciación de la respuesta salvo en los controles, que fueron inoculados con ADN sin inserto (DNA-\phi), inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo), NYVAC-B (segunda barra) y el DNA-B de nuevo (tercera barra), mientras que los controles inoculados con DNA-\phi recibieron en la segunda dosis MVA-WT (cuarta barra) o NYVAC-WT (quinta barra). La parte superior corresponde a células productoras de IFN-\gamma y la inferior a células productoras de TNF-\alpha. Los gráficos de la izquierda corresponden a las células CD8^{+}, los gráficos intermedios a las células CD4^{+} y los gráficos de la derecha al total de células. En cada caso, el valor dado se refiere a número de células secretoras del tipo correspondiente (CD8^{+}, CD4^{+}, total) detectadas por cada 3 x 10^{5} esplenocitos.
La Figura 16 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en abscisas, generadas por la inmunización de ratones BALB/c mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. En ordenadas se indica el número de células T secretoras de IFN-\gamma, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B que se indican en abscisas, detectadas por cada 10^{6} esplenocitos. Para cada uno de esos péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con NYVAC-B+MVA-B, la segunda a animales inmunizados con MVA-B+NYVAC-B y la tercera a animales inmunizados con MVA-WT+NYVAC-WT.
La Figura 17 muestra la producción de IFN-\gamma, en pg/ml, generada tras la reestimulación, con los grupos de péptidos del clade B indicados en abscisas, de esplenocitos extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de combinación de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB: NYVAC-B+MVA-B (primera barra), MVA-B+NYVAC-B (segunda barra) y MVA-WT+NYVAC-WT (tercera barra).
La Figura 18 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en abscisas, generadas por la inmunización de ratones humanizados HHDII mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo) o NYVAC-B (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un DNA sin inserto (DNA \diameter) en la primera dosis y MVA-WT en la segunda. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; la presencia de asteriscos (*) indica diferencias significativas (p<0,05) entre los distintos grupos.
La Figura 19 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IL-2 específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en abscisas, generadas por la inmunización de ratones HHDII mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo) o NYVAC-B (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un DNA sin inserto (DNA \diameter) en la primera dosis y MVA-WT en la segunda. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; la presencia de asteriscos (*) indica diferencias significativas (p<0,05) entre los distintos grupos.
La Figura 20 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en abscisas, generadas por la inmunización de ratones humanizados HHDII mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. En ordenadas se indica el número de células T secretoras de IFN-\gamma, específicas para cada uno de los grupos de péptidos, detectadas por cada 10^{6} esplenocitos. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA+NYVAC-B, la segunda a animales inmunizados con NYVAC-B+MVA-B, la tercera a animales inmunizados con MVA-B+MVA-B. la cuarta a animales inmunizados con NYVAC-B+NYVAC-B y la quinta a animales inmunizados con NYVAC-WT+MVA-WT. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo.
La Figura 21 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IL-2 específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en abscisas, presentes por cada 10^{6} esplenocitos de ratones HHDII inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA+NYVAC-B, la segunda a animales inmunizados con NYVAC-B+MVA-B, la tercera a animales inmunizados con MVA-B+MVA-B. la cuarta a animales inmunizados con NYVAC-B+NYVAC-B y la quinta a animales inmunizados con NYVAC-WT+MVA-WT. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo.
La Figura 22 muestra un esquema de la construcción del vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/
gagpolnef-C-14 y los plásmidos a partir de los cuales se genera.
La Figura 23 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus TK del virus MVA-C. La parte superior de la figura muestra un esquema de los tamaños de los fragmentos que se generan con las diferentes combinaciones de oligonucleótidos, así como su localización con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes de los mismos. La parte inferior muestra fotografías de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con diferentes parejas de cebadores. A: PCR cebada con los oligonucleótidos TK-L y gp120-1213; B: PCR cebada con los oligonucleótidos gp120-1050 y gp120-10; C: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN-2018 y GPN-3820; D: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN-4000 y TK-R; E: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN-802 y GPN-2198. Las muestras correspondientes a cada calle son: 1: NYVAC-C; 2: MVA-C (P2); 3: MVA-WT; 4: NYVAC-WT.
La Figura 24 muestra, en su parte superior, un esquema de los fragmentos obtenidos al amplificar mediante PCR el locus TK a partir de muestras que contienen o carecen de insertos en dicho locus, mientras que la parte inferior es una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis los productos resultantes de una reacción de PCR en la que se utilizaron como cebadores oligonucleótidos que hibridaban con las secuencias flanqueantes del gen TK. Las muestras fueron: NYVAC-C (calle 1), MVA-C correspondiente a los stocks P1 (calle 2) y P2 (calle 3) y MVA-WT (calle 4).
La Figura 25 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos gp120-C (parte superior) y gagpolnef-C (parte inferior, en la que la proteína gagpolnef-C se abrevia como GPN) desde un vector NYVAC-C (última calle), desde los stocks P2 y P3 (calles primera y segunda, marcadas como P2-M y P3, respectivamente) y desde células en las que se había simulado la infección (M).
La Figura 26 muestra los resultados correspondientes a las pruebas de estabilidad del vector MVA-C. La parte A muestra los resultados de las inmunotinciones de células CEF infectadas con el vector MVA-C y tratadas con los anticuerpos anti-WR (fotografía de la izquierda), anti-gp 120 específico del clade C (fotografía central) y anti-p24 específico del clade C (fotografía de la derecha), así como un gráfico en el que se representan los porcentajes de las placas teñidas con cada uno de los anticuerpos calculados con respecto al total de placas teñidas con el anticuerpo anti-WR. La parte B muestra la detección de la expresión de las proteínas gagpolnef-C (fotografía de la izquierda) y gp120-C (fotografía de la derecha) mediante transferencias tipo Western y detección con anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas en células infectadas con el virus recombinante NYVAC-C (calles marcadas como "NYVAC-C", células en las que se había simulado la infección (calles marcadas como "CEF" y stocks de virus correspondientes a los pases y a 10 (calles marcadas como P7, P8, P9 y P10).
La Figura 27 muestra la cinética de expresión de la proteína gp120-C obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-gp120 del clade C de transferencias tipo Western correspondientes a muestras tomadas pasadas 6, 18, y 24 horas de una infección con un virus recombinante. La parte superior corresponde a la infección con el virus MVA-C y la inferior a la infección con el virus NYVAC-C. Para cada una de las muestras aparece inmediatamente debajo la intensidad de las señal lograda al incubar las muestras con un anticuerpo anti-\beta-actina (\beta-act.). P: precipitado; S: sobrenadante; M: simulación de infección; P: precipitado; S: sobrenadante; M: simulación de infección.
La Figura 28 muestra la cinética de expresión de la proteína gagpolnef-C obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-p24 del clade C de transferencias tipo Western correspondientes a precipitados celulares de muestras tomadas pasadas 6, 18 y 24 horas de una infección con un virus recombinante. Las calles marcadas como "1" corresponden a muestras infectadas con el virus MVA-C, las calles marcadas como "2" a muestras infectadas con el virus NYVAC-C y las calles marcadas como M a muestras en las que se simuló la infección. La flecha indica la posición de la proteína gagpolnef-C (abreviada como GPN).
La Figura 29 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IFN-\gamma generadas por la inmunización de ratones humanizados HHDII con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. La parte A corresponde a las células T secretoras de IFN-\gamma, detectadas por cada 10^{6} esplenocitos, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C que se indican en abscisas. La parte B corresponde a las células T secretores de IFN-\gamma generadas contra los propios vectores, la respuesta frente a la parte de los virus recombinantes que deriva de Vaccinia. Tanto en el caso de los péptidos (parte A) como en el de la respuesta anti-Vaccinia, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA-C y la segunda a animales inmunizados con NYVAC-C.
La Figura 30 muestra la producción de citoquinas detectada en ratones HHDII inmunizados con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. La parte superior corresponde a los niveles de IFN-\gamma y la inferior a los niveles de IL-10, ambos en pg/ml, detectados en los sobrenadantes de esplenocitos de animales inoculados con MVA-C (primera barra de cada uno de los grupos de péptidos) o NYVAC-C (segunda barra de cada uno de los grupos de péptidos) frente a grupos específicos de péptidos representativos del clade C.
La Figura 31 muestra gráficos correspondientes a los porcentajes de distintos tipos de células T productoras de IFN-\gamma generadas frente a grupos de péptidos específicos representativos del clade C por la inoculación de MVA-C (primera barra de cada grupo de péptidos) o NYVAC-C (segunda barra de cada grupo de péptidos) a ratones HDDII. El gráfico superior representa el porcentaje de células CD8^{+} respecto al total de células secretoras de IFN-\gamma, el gráfico intermedio el porcentaje de células CD4^{+} y el gráfico inferior al porcentaje que la suma de las células CD8^{+} y CD4^{+} anteriores supone sobre el total de células secretoras de IFN-\gamma.
La Figura 32 muestra la respuesta humoral generada por inoculación de MVA-C o NYVAC-C a ratones HHDII o C57/BL6 mediante los valores de densidad óptica a 492 nm obtenidos al detectar por ELISA anticuerpos IgG frente a: (A) extractos celulares de una infección con Vaccinia; (B) proteína Gag o (C) la proteína gp160. Los grupos de inmunización fueron: 1: MVA-C en HHDII; 2: MVA-C en C57/BL6; 3: NYVAC-C en HHDII; 4: NYVAC-C en C57BL6; 5: control. En cada grupo, la situación de los símbolos marca el valor obtenido para cada uno de los ratones del grupo: \blacklozenge: ratón 1; \sqbullet: ratón 2; \blacktriangle: ratón 3; \bullet: ratón 4; la posición de la barra horizontal - indica el valor medio correspondiente a los cuatro ratones de cada grupo.
La Figura 33 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados en abscisas; presentes por cada 10^{6} esplenocitos de ratones HHDII inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-C en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-C (primera barra de cada grupo) o NYVAC-C (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un DNA sin inserto (DNA \diameter) en la primera dosis y NYVAC-WT en la segunda. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; la presencia de asteriscos indica diferencias significativas entre los distintos grupos: *: p<0,05; **: p<0,005.
La Figura 34 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IL-2 específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados en abscisas, presentes por cada 10^{6} esplenocitos de ratones HHDII inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-C en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-C (primera barra de cada grupo) o NYVAC-C (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un DNA sin inserto (DNA \diameter) en la primera dosis y NYVAC-WT en la segunda. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; la presencia de asteriscos indica diferencias significativas entre los distintos grupos: *: p<0,05; **: p<0,005.
La Figura 35 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELISPOT de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados en abscisas, presentes por cada 10^{6} esplenocitos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con NYVAC-C+MVA-C, la segunda a animales inmunizados con MVA-C+MVA-C, la tercera a animales inmunizados con MVA-C+NYVAC-C, la cuarta a animales inmunizados con NYVAC-C+NYVAC-C y la quinta a animales inmunizados con NYVAC-WT+MVA-WT. Los círculos (\bullet) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; la presencia de asteriscos indica diferencias significativas entre los distintos grupos: *: p<0,05; **: p<0,005.
La Figura 36 muestra la producción de citoquinas detectada tras la inmunización de ratones BALB/c mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. La parte izquierda corresponde a los niveles de IFN-\gamma (en ng/ml) y la derecha a los niveles de IL-10 (en pg/ml), detectados en los sobrenadantes de esplenocitos, reestimulados con cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados junto a cada grupo de barras, extraídos de animales inoculados con: MVA-C+NYVAC-C (primera barra de cada grupo), MVA-C+MVA-C (segunda barra), NYVAC-C+MVA-C (tercera barra), NYVAC-C+NYVAC-C (cuarta barra), NYVAC-WT+MVA-WT (quinta barra) o MVA-WT+NYVAC-WT (sexta barra).
La Figura 37 muestra gráficos correspondientes a los niveles de distintos tipos de células T secretoras de IFN-\gamma y presentes en los esplenocitos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C, tras ser reestimulados por los grupos de péptidos representativos del clade C indicados en abscisas. El gráfico superior corresponde a las células CD8^{+} productoras de IFN-\gamma presentes por cada 3 x 10^{5} células CD8^{+}, el gráfico intermedio a las células CD4^{+} productoras de IFN-\gamma presentes por cada 3 x 10^{5} células CD4^{+} y el gráfico inferior al conjunto de células CD8^{+} más CD4^{+} productoras de IFN-\gamma presentes por cada 3 x 10^{5} células CD8^{+}+CD4^{+}. Las barras que se aparecen en cada grupo de péptidos corresponden a animales inoculados con: NYVAC-C+MVA-C (primera barra de cada grupo), MVA-C+MVA-C (segunda barra), MVA-C+NYVAC-C (tercera barra), NYVAC-C+NYVAC-C (cuarta barra), NYVAC-WT+MVA-WT (quinta barra).
La Figura 38a muestra los resultados obtenidos al tratar con anticuerpos dirigidos contra la proteína PARP lisados de células HeLa recogidos transcurrido los distintos tiempos, en horas, que se indican sobre las calles tras la infección con MVA-WT (calles encabezadas por "MVA") o con NYVAC (calles encabezadas por "NYVAC"). PARPc indica la posición de la proteína PARP completa; PARPf indica la posición de la proteína PARP que ha sufrido una rotura específica. La parte inferior muestra la intensidad de las señales logradas al incubar las muestras con un anticuerpo anti-(\beta-actina (\beta-act.).
La Figura 38b muestra las señales de inmunofluorescencia detectadas a partir de células infectadas con MVA-WT (fotografía superior) o NYVAC-WT (fotografía inferior) cuyos núcleos habían sido teñidos con DAPI.
La Figura 38c muestra una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis muestras de ARN ribosómico obtenidas de células HeLa transcurridos los tiempos en horas (18 y 24) que se indican sobre las calles tras infectar dichas células con: muestras carentes de virus (pocillos marcados como "HeLa"), virus Vaccinia silvestre de la cepa Western Reserve (pocillos marcados como "WR"), MVA-WT (pocillos marcados como "MVA"), o NYVAC-WT (pocillos marcados como "NYVAC"). Se indican las posiciones en las que se detectan los ARN ribosómicos 28S (28S rRNA) y 18S (18S rRNA) y la de las bandas resultantes de su degradación.
La Figura 38d muestra un gráfico en el que se indica en ordenadadas el factor de incremento del número de células apoptóticas detectado mediante citometría de flujo en células HeLa infectadas según se indica en abscisas: M: simulación de infección; WR: infección con virus Vaccinia silvestre de la cepa Western Reserve; MVA: infección con MVA-WR; NYVAC: infección con NYVAC-WT. Los signos "-" y "+" indican, respectivamente, la ausencia o la presencia del inhibidor de caspasas zVAD en las muestras utilizadas para provocar la infección.
Ejemplos Ejemplo 1 Generación del MVA-B Construcción del vector plasmídico pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1
El vector plasmídico pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1 fue construido por los inventores para la generación del virus recombinante de MVA que expresa los genes Env de VIH-1 (aislamiento BX08) y la quimera de Gag, Pol y Nef (aislamiento IIIB), ambos pertenecientes al clade B. El ADN de la quimera Gag-Pol-Nef fue generado por GeneArt (Regensburg, Alemania) y el ADN de gp120 fue generado por el grupo Aventis; los plásmidos que los contienen utilizados para la construcción de pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1 y del MVA-B a partir de éste último, fueron cedidos al grupo de los inventores en el marco del programa de colaboración EuroVacI.
El plásmido pLZAW1gp 120B/gagpolnef-B-1 es un derivativo de pUC diseñado para la selección de placas azules/blancas. Contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa (TK), el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección \beta-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampicilina (AP). Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentran las dos secuencias que se desean expresar, gp 120-BX08 (SEQ ID NO:15) y gagpolnef-IIIB (SEQ ID NO:16), que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes. La posición de cada uno de los componentes incluidos en el plásmido se describe a continuación en la Tabla 1.
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TABLA 1 Posición de los componentes del plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1 
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1000 
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Para la construcción de este plásmido se utilizaron otros dos plásmidos diferentes:
- pMA60gp120B/gagpolnefB-12,17 (proporcionado por el grupo Aventis, Canadá). El plásmido es un derivativo de pUC que contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa (TK), el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección \beta-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampicilina (AP). Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentras las dos secuencias que se desean expresar, gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB, que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes.
- pLZAW1: El plásmido fue proporcionado por Linong Zhang, del grupo Aventis, Canadá. Es un plásmido basado en pUC que contiene un brazo izquierdo del gen de TK, sitios de clonación para insertar genes exógeno, una repetición corta del brazo izquierdo el gen de TK, un promotor E3L dirigiendo la expresión de un casete con \beta-gal y un brazo derecho del gen de TK.
La construcción del plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1 a partir de estos otros dos plásmidos se representa en la Figura 2. Brevemente, un fragmento de ADN de 5,6 Kb que contenía los genes de interés fue sacado por digestión con BamHI del plásmido pMA60gp120/gagpolnefB-12,17 modificado por incubación con la ADN polimerasa Klenow para generar extremos romos, y clonado en el vector pLZAW 1 previamente digerido con la endonucleasa de restricción AscI, modificado por incubación con Klenow, y desfosforilado por incubación con la enzima fosfatasa alcalina, generándose de esta forma el vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1. El plásmido generado dirige la inserción de los genes de interés en el locus TK del genoma del virus atenuado MVA.
Construcción del virus recombinante MVA-B
Cultivos primarios de fibroblastos de embrión de polio (CEF) fueron infectados con virus atenuado MVA en pase 586 (habiendo sido el MVA-F6, pase 585, proporcionado por Gerd Sutter) a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, y posteriormente transfectados con 10 \mug del vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1, usando para ello lipofectina comercial suministrada por Invitrogen y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas post-infección las células fueron recogidas, sonicadas y usadas para la selección de los virus recombinantes. Los virus MVA recombinantes que contenían los genes gp120B/gagpolnef-B y coexpresaban de forma transitoria el gen marcador \beta-Gal (MVA-B (X-Gal^{+})), fueron seleccionados por pases consecutivos de purificación de placas en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactósido (XGal) (300 \mug/ml). Los MVA recombinantes que contenían los genes gp120B/gagpolnef-B y que habían perdido el gen marcador (MVA-B (X-Gal^{+})), fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células CEF en presencia de XGal. En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en CEF durante 3 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el paso de purificación de placas consecutivo.
Tras 4 pases consecutivos de purificación fueron aisladas 12 placas recombinantes que expresaban eficientemente ambos antígenos y que habían perdido el gen marcador. Se hizo crecer el recombinante designado como MVA-B-4.1.5.2 (P1) para generar un stock crudo (P2) que se envió a producción en condiciones GMP para estudios clínicos. La secuencia del inserto situada en el locus de la timidina quinasa de este recombinante está representada por SEQ ID NO:19. La localización en dicha secuencia de cada uno de los elementos que componen el inserto se indica a continuación en la Tabla 2:
TABLA 2 Posición de los componentes principales del inserto del vector MVA-B
1001
A partir del P2, se preparó un stock P3 de virus purificado de células CEF infectadas a una multiplicidad de infección de 0,05 ufp/célula a través de dos colchones de sacarosa al 45%. Este stock P3, con un título de 2,4 x 10^{9} ufp/ml, fue el que se utilizó en los protocolos de inmunización.
Caracterización del MVA-B
Para confirmar la homogeneidad genética del virus MVA-B generado y la integridad de los genes insertados, se realizó un análisis por PCR del ADN viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula, empleando para ello oligonucléotidos que hibridan o con las regiones TK flanqueantes del inserto de interés o con regiones internas de los genes insertados. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados como cebadores y la posición en que aparecen sobre el vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1 se muestran en la Tabla 3. Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las distintas PCR y la localización de los mismos con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes, aparecen representados en la parte superior de la Figura 3.
TABLA 3 Oligonucleótidos utilizados como cebadores de las PCR de caracterización del vector MVA-B
1002
La parte inferior de la Figura 3 muestra fotografías de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con las diferentes parejas de cebadores para efectuar el análisis de los fragmentos del VIH-1 incluidos en el virus MVA-B. Para ello, 100 ng de ADN viral extraído de células de embrión de pollo (CEF) infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus MVA-B del stock P3 (calle 2), MVA-WT (calle 3) y NYVAC-WT (calle 4) o bien con 10 ng del plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1 (calle 1), fueron usados como molde para hacer una amplificación mediante PCR de los diferentes fragmentos del VIH-1 incluidos en MVA-B. Las condiciones de cada PCR se estandarizaron de forma individualizada para cada pareja de oigonucleótidos cebadores empleada. Como se observa en las fotografía mostradas en la parte inferior de la Figura 3, las muestras correspondientes al control positivo, el plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1, dan lugar en todos los casos a bandas de igual tamaño que las correspondientes muestras MVA-B, mientras que en las calles 3 y 4, correspondientes a muestras que carecen de inserto (MVA-WT y NYVAC-WT, respectivamente), no se observan bandas.
El virus NYVAC de tipo silvestre utilizado en este ejemplo, así como las formas recombinantes NYVAC-B y NYVAC-C utilizadas posteriormente y que se han generado insertando sobre el NYVAC de tipo silvestre las mismas secuencias utilizadas para generar, respectivamente, los vectores de la invención MVA-B y MVA-C, fueron donados por el grupo Aventis, en el marco de colaboración del proyecto EuroVac I, en viales conteniendo aproximadamente 7x10^{7} unidades infecciosas por vial. Previamente a su utilización, el vector NYVAC-B fue crecido en células CEF y purificado en colchón de sacarosa en las mismas condiciones que MVA-B.
La Figura 4, por su parte, muestra una fotografía de un gel correspondiente al análisis de productos de PCR correspondientes al locus TK. Para su obtención, 100 ng del ADN viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus NYVAC-WT (calle 1), MVA-B (calle 2) o MVA-WT (calle 3), fueron usados como molde para hacer un análisis por PCR del locus TK empleando como cebadores 100 ng de los oligonucleótidos que hibridan con las secuencias flanqueantes; del gen TK, TK-L (SEQ ID NO:1) y TK-R (SEQ ID NO:2) en una mezcla de reacción que contenía 0,3 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl_{2} y 2,5 U de la enzima polimerasa Platinum Taq. El programa incluye un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 5 min, 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 min, hibridación a 60ºC durante 1 min y extensión a 68ºC durante 2 min, y finalmente un ciclo de extensión a 68ºC durante 10 min. Los productos de PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 0,7%, obteniéndose el resultado que se muestra en la Figura 4. En la calle 2, la correspondiente al vector MVA-B, se observa una banda de aproximadamente 6 Kb compatible con la presencia del inserto completo, mientras que en las calles correspondientes a los virus de tipo silvestre MVA-WT (3) y NYVAC-WT (1) aparecen bandas mucho menores, que corresponderían al locus de TK sin inserto. Las diferencias observadas en los tamaños de las bandas correspondientes a los virus sin inserto MVA-WT y NYVAC-WT se debe a que el gen TK es uno de los que ha sufrido una inactivación selectiva en el virus NYVAC (véase la Figura 1), siendo el tamaño del gen TK menor en esta forma atenuada de Vaccinia.
Ejemplo 2 Análisis de la expresión de proteínas del VIH a partir del MVA-B
La expresión de las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-B por el virus MVA-B fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los diferentes stocks de virus recombinante MVA-B: P1, P2 y P3. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio) que reconoce la proteína gp120 del aislamiento BX08; y frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-p24 (cedido por el programa EVA, ARP432) que reconoce la quimera gagpolnef-B del aislamiento IIIB. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células infectadas con el vector NYVAC-B.
Como se observa en la Figura 5, ambos antígenos son expresados eficientemente por los diferentes stocks del recombinante MVA-B generado.
Ejemplo 3 Comprobación de la estabilidad del MVA-B
Para verificar que el recombinante MVA-B podía ser pasado sucesivamente sin perder la expresión de los genes insertados, se realizó un ensayo de estabilidad efectuando varios pases sucesivos del virus recombinante MVA-B en células CEF. Monocapas de células CEF crecidas en placas P100 fueron infectadas de forma sucesiva, a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, partiendo del stock P2 del MVA-B (pase 6) hasta generar el pase 10 (P10). A continuación, monocapas de células CEF crecidas en placas de 6 pocillos fueron infectadas con una dilución 10^{-5} del extracto viral obtenido del último pase (P10). A las 48 horas post-infección, las placas de lisis generadas fueron analizadas por inmunotinción, empleando anticuerpos policlonales anti-WR (que reconoce proteínas del virus MVA); anti-gp120 (que reconoce la gp120 del aislamiento BX08); y anti-p24 (que reconoce la quimera gagpolnef-B del aislamiento IIIB); estos dos últimos anticuerpos fueron los mismos que se utilizaron en el Ejemplo 2. Los resultados de estas inmunotinciones se muestran en la parte A de la Figura 6. Los recuentos de placas efectuados mostraron que un 100% de las placas resultaban teñidas con los anticuerpos anti-WR, anti-p24 y anti-gp120. Por ello, se puede considerar que, tras 10 pases sucesivos del virus en células CEF, ambos antígenos se expresan eficientemente (100% de las placas reconocidas por los tres anticuerpos), corroborándose la estabilidad del producto generado.
Los extractos de células CEF infectadas con los pases 7, 8, 9 y 10 también fueron analizados por inmunotransferencia tipo Western, pruebas a las cuales corresponden las tinciones mostradas en la parte B de la Figura 6. Para realizar estos ensayos, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los extractos virales obtenidos en los pases 7 (P7), 8 (P8), 9 (P9) y 10 (P10) del virus recombinante MVA-B. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDA-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa y hechos reaccionar con los mismos anticuerpos policlonales anti-gp120 (parte derecha de la figura) o anti-p24 (parte izquierda de la figura) utilizados en la prueba correspondiente a la parte A de la Figura 6. Ambos anticuerpos se utilizaron a una dilución 1/500. Como control positivo se empleó un extracto de células CEF infectadas con el virus NYVAC-B (cedido por el grupo Aventis). Los resultados confirman la correcta expresión de las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-B en todos los extractos obtenidos por la infección con virus procedentes de distintos pases.
Ejemplo 4 Liberación de gp120-BX08 y cinética de expresión a partir del MVA-B en el transcurso del tiempo
Para definir si la proteína gp120-BX08 era eficientemente secretada, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con MVA-B a 5 ufp/célula. A las 4, 8, 16 y 24 horas post-infección las células se recogieron separando el precipitado (P) del sobrenadante (S) celular. Los sobrenadantes de cada tiempo analizado fueron concentrados y fraccionados junto a los precipitados celulares en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a reacción frente al anticuerpo policlonal anti-gp120 (diluidos 1/500) anteriormente utilizado en los Ejemplos 2 y 3. De igual forma fueron tratadas células CEF infectadas con el NYVAC-B (proporcionado por el grupo Aventis), usado como control positivo en el ensayo. Como control interno para verificar que había sido aplicado en el gel la misma cantidad de proteína, las membranas fueron incubadas también frente a un anticuerpo monoclonal anti-\beta-actina. Los resultados se muestran en la Figura 7. En su parte superior, correspondiente a la muestra del MVA-B, puede apreciarse que la proteína gp120-BX08 es expresada eficientemente por el MVA-B desde las 4 horas post-infección, detectándose en el sobrenadante celular a partir de las 8 horas post-infección, y con un comportamiento similar al que se observa en células infectadas con el NYVAC-B, para el cual se muestran los resultados obtenidos en la parte inferior de la Figura 7.
La expresión de la proteína de fusión gagpolnef-B fue analizada siguiendo un procedimiento similar: monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con MVA-B a 5 ufp/célula aunque, en este caso, la presencia de la proteína se ensayó en el precipitado celular obtenido a las 6, 18 y 24 horas post-infección, igualmente mediante transferencia tipo Western y poniendo de manifiesto la presencia de la proteína mediante reacción con el anticuerpo policlonal anti-p24 utilizado en los Ejemplos 2 y 3. Los resultados se muestran en la Figura 8. En ella puede observarse la correcta expresión de esta proteína de fusión a lo largo del tiempo de infección tanto desde MVA-B (calle 2 de cada tiempo de infección) como desde NYVAC-B (calle 1), aunque se produce una mayor acumulación de la proteína de fusión en células infectadas con MVA-B.
Ejemplo 5 Inmunogenicidad del MVA-B: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma
Una vez generado y caracterizado el recombinante MVA-B, el siguiente objetivo fue analizar su capacidad de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino frente a los antígenos que expresa. Para ello, ratones BALB/c (n=4) de 6-8 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-B (stock P3) o de NYVAC-B. 10 días después de la inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, y se les extrajo el bazo para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT que detecta las células T específicas frente al antígeno en función de su cualidad para producir IFN-\gamma, que es un indicador positivo de que un inmunógeno es capaz de activar selectivamente una respuesta celular del tipo CD4^{+}Th1, característica esta última que se considera indicadora de la eficacia de un proceso de vacunación.
Para ello, placas de 96 pocillos con fondos de nitrocelulosa se cubrieron con 75 \mul/pocillo a una concentración de 6 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal de rata anti-IFN-\gamma murino (R4-6A2, Pharmingen, San Diego, CA) resuspendido en PBS, incubándose toda la noche a temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron los pocillos tres veces con medio RPMI y finalmente se incubó con medio complementado con 10% FCS, al menos una hora a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%. Por otro lado, los bazos de los ratones inmunizados, que una vez extraídos se mantuvieron en RPMI + 10% FCS, se dispusieron en una rejilla estéril sobre una placa de 60 mm, y se homogeneizaron, disgregando el extracto mediante su paso por agujas de diferente calibre (21G->25G). Las células así disgregadas se centrifugaron 5 min a 1.500 rpm a 4ºC, y se lavaron dos veces con RPMI + 10% FCS. Para lisar los eritrocitos de las muestras, se añadió NH_{4}Cl 0,1 M estéril (2 ml/bazo) y se mantuvo a 4ºC durante 3-5 min, se añadió RPMI + 10% FCS y se centrifugó. Después se lavaron 2 veces, y finalmente se resuspendieron en 1-2 ml de RPMI + 10% FCS. El recuento de la viabilidad de los esplenocitos se realizó mediante tinción con azul tripan (4% en agua, Sigma).
Para evaluar la respuesta inmune específica, se utilizaron diferentes grupos de 40-50 péptidos de 15 aminoácidos cada uno, solapantes en 11 aminoácidos, que cubrían todas las regiones antigénicas incluidas en el recombinante MVA-B de la invención. Cada grupo de péptidos se diluyó a una concentración de 10 \mug/ml en RPMI + 10% FCS a los que se les añadió 30 U/ml de IL-2. Una vez preparado, se añadió a cada pocillo 100 \mul de mezcla del grupo de péptidos, sobre lo cual se añadió 100 \mul/pocillo de esplenocitos de los animales inmunizados, a una concentración de 10^{7} esplenocitos/ml y diluciones 1/4 y 1/16 de la misma. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC en atmósfera de CO^{2}, se lavaron 5 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST), y se incubaron con 2 \mug/ml del anticuerpo monoclonal de rata anti-IFN-\gamma biotinilado XMG1.2 (Pharmingen) diluido en PBST, durante 2 horas a temperatura ambiente. Después se lavaron las placas 5 veces con PBST y se añadió una dilución 1/800 de avidina-peroxidasa (0,5 mg/ml) (Sigma). Tras 1 hora a temperatura ambiente se lavó 3 veces con PBST y 2 con PBS, añadiéndose finalmente la mezcla reveladora con 1 \mug/ml del sustrato DAB (Sigma), resuspendido en Tris-HCl 50 mM pH 7,5, que contenía 0,015% de H_{2}O_{2}. La reacción se detuvo lavando la placa con abundante agua y, una vez seca, se llevó a cabo el recuento de las manchas generadas con la ayuda de un estereomicroscopio de Leica MZ122 APO y el software Imaging System QWIN (Leica, Cambridge, Reino Unido). El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados, que se muestran en la Figura 9, demuestran que el MVA-B es capaz de potenciar una respuesta inmune específica frente a casi todos los grupos de péptidos ensayados, en distinta proporción que su homólogo NYVAC-B.
Ejemplo 6 Inmunogenicidad del MVA-B: Producción de citoquinas por esplenocitos reestimulados
A continuación, se procedió a evaluar la producción de citoquinas estimulada en los esplenocitos de los ratones inmunizados al ser mezclados con los diferentes grupos de péptidos solapantes. Para ello, los esplenocitos aislados en el Ejemplo 5 fueron cultivados (5x10^{6} células/pocillo) en una placa de 24 pocillos y estimulados con 1 \mug/ml de cada grupo de péptidos. La placa se incubó durante 5 días a 37ºC en atmósfera del 5% CO_{2}. Después de este período, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se centrifugaron a 1.500 rpm, 5 min, a 4ºC, almacenándose a -70ºC hasta su utilización.
Tal como se ha comentado anteriormente, los niveles de la citoquina interferón-gamma (IFN-\gamma) son un indicador positivo de la activación de una respuesta celular del tipo CD4^{+} Th1, mientras que la citoquina IL-10, por su parte, es un indicador de activación de la respuesta celular tipo CD4^{+} Th2. La relación entre los niveles de IFN-\gamma e IL-10 indica si la vacunación es más o menos eficaz. Para conocer los niveles de una y otra citoquina, IL-10 e IFN-\gamma, presentes en los sobrenadantes de cultivos de esplenocitos reestimulados "in vitro", se procedió a la determinación de estos niveles mediante kits de ELISA comerciales de Pharmingen. Siguiendo las instrucciones del fabricante, placas de 96 pocillos de fondo plano se cubrieron con el anticuerpo anti-citoquina, diluido en su correspondiente tampón, y se incubó toda la noche a 4ºC. Después, los pocillos se lavaron con PBST, y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBST + 10% FCS (PBSTB). Posteriormente, se añadieron diluciones seriadas en PBSTB de las muestras y de las citoquinas estándar, incubándose la placa a temperatura ambiente durante 2 horas. Después, se lavó con PBST y se incubó a temperatura ambiente, durante 1 hora, con el anticuerpo específico anti-citoquina biotinilado, junto a la estreptavidina conjugada con peroxidasa, todo ello diluido en PBSTB. Finalmente, la reacción se detectó con TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, Sigma), a temperatura ambiente y en oscuridad, y se detuvo, tras 30 min de incubación, con H_{2}SO_{4} 2 N. La absorbancia se leyó a 450 nm y los valores obtenidos fueron extrapolados en la curva estándar (pg/ml).
Los resultados, mostrados en la Figura 10, indican que existe una polarización de la respuesta celular específica hacia un subtipo Th1, caracterizado por la secreción de altos niveles de IFN-\gamma, tanto para MVA-B como para NYVAC-B, frente a los diferentes grupos de péptidos ensayados. Existen claras diferencias entre las respuestas generadas por cada uno de los recombinantes.
Ejemplo 7 Inmunogenicidad del MVA-B: Identificación de los tipos de células T específicas secretoras de IFN-\gamma
Como las células presentadoras que se estaban empleando hasta el momento en la caracterización de la respuesta celular eran las propias del bazo que expresan las moléculas de histocompatibilidad tanto de clase I (MHC-I) como de clase II (MHC-II), el siguiente paso fue dilucidar si la respuesta celular que se estaba obteniendo en ELISPOT era debida a la secreción de IFN-\gamma por las células T CD8^{+} o por las células T CD4^{+}. Para ello, los esplenocitos obtenidos en el Ejemplo 5 fueron reestimulados in vitro durante 1 hora a 37ºC con 5 \mug/ml de cada grupo de péptidos solapantes pertenecientes al clade B, tras lo cual se añadió Brefeldina a una concentración de 10 \mug/ml, incubándose durante toda la noche a 37ºC. Siete días después se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados a FITC, seguido de un marcaje intracelular empleando anti-IFN-\gamma conjugado a PE. Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citómetro de flujo.
Los resultados, mostrados en la Figura 11, permiten apreciar que, tanto para el grupo de animales inmunizado con el MVA-B, como para el grupo inmunizado con NYVAC-B, la respuesta productora de IFN-\gamma es mayoritariamente debida a la población de células T CD8^{+} específicas activadas frente a los diferentes grupos de péptidos. Al determinar los niveles totales de IFN-\gamma secretados por ambos tipos de células, se corroboró el resultado obtenido en el ensayo de ELISPOT descrito en el Ejemplo 5, donde se observaba una respuesta específica frente a la mayoría de los grupos de péptidos en los animales inmunizados con ambos recombinantes. De nuevo, existen diferencias claras entre las respuestas generadas por cada uno de los recombinantes.
Ejemplo 8 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma
Una vez establecido que la administración de una primera dosis de inmunización que contenía el MVA-B era capaz de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino, se evaluó a continuación si la utilización de este vector de la invención como parte de protocolos de inducción/potenciación (priming/boosting) daba lugar a un incremento en la magnitud y en la amplitud de la respuesta inmune. Para ello, grupos de 4 ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 \mug del vector de ADN DNA-B (cedido por GeneArt, Alemania), que contiene las mismas secuencias codificantes de proteínas del VIH-1 que lleva insertadas el MVA-B, pero bajo el control de sendos promotores de citomegalovirus e insertadas en vectores plasmídicos (uno para gp120 y otro para la proteína de fusión Gag-Pol-Nef). Los grupos control fueron inoculados (i.m.) con 100 gg de ADN sin inserto (DNA \diameter). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-B (stock P3) o de NYVAC-B (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-B. Un tercer grupo recibió una segunda dosis de DNA-B (100 \mug, i.m.). Los grupos control recibieron una dosis de 2 x de 10^{7} ufp/ratón de MVA-WT o NYVAC-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas (pools) de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 12, en la que aparece el número de células secretoras de IFN-\gamma específicas detectadas por cada 10^{6} esplenocitos en los ratones inmunizados con las diferentes combinaciones de vectores. Se observa para casi todos los grupos de péptidos analizados que la inclusión de vectores derivados de poxvirus que codifican antígenos del VIH-1 en la segunda dosis de refuerzo de la respuesta inmune da lugar en casi todos los casos a un incremento significativo de la respuesta inmune con respecto a la utilización únicamente de vectores de ADN, siendo la respuesta generada diferente según se utilice MVA-B o NYVAC-B.
Ejemplo 9 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Producción de citoquinas por esplenocitos reestimulados
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 8 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (1 \mug/ml) e incubados durante 5 dias a 37ºC. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC. Los niveles de IFN-\gamma se determinaron por ELISA usando un Kit comercial (Pharmigen). Los resultados se muestran en la Figura 13, donde se observa que la producción de IFN-\gamma difiere según se utilice MVA-B o NYVAC-B como segundo vector de inmunización.
Ejemplo 10 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Producción de \beta-quimioquinas por esplenocitos reestimulados
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 8 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (1 \mug/ml) e incubados durante 5 días a 37ºC. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC. Los niveles de MT-1 \beta y RANTES se determinaron por ELISA usando kits comerciales (Pharmigen).
Los resultados se muestran en la Figura 14, donde se observa que la producción de quimioquinas MT-1 \beta y RANTES difieren según se utilice MVA-B o NYVAC-B como segundo vector de inmunización.
Ejemplo 11 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Identificación de los tipos de células T específicas productoras de IFN-\gamma y TNF-\alpha
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 8 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con el péptido de la envuelta del aislado Bx08 (5 \mug/ml) e incubados durante 1 hora a 37ºC. Transcurrido ese tiempo se le añadió Brefeldina A (10 \mug/ml) y se dejó incubando a 37ºC. Siete días después, se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados a FITC (diluidos 1/100), seguido de un marcaje intracelular empleando anti-IFN-\gamma o anti-TNF-\alpha conjugado a PE (diluido 1/100). Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citómetro de flujo.
Los resultados se muestran en la Figura 15. En ellos se observan diferencias en los niveles de células CD8^{+} entre los grupos, con un mayor incremento de células secretoras de TNF-\alpha en el grupo que había recibido DNA-B+MVA-B.
Ejemplo 12 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma
Grupos de 4 ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de con 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-B (stock P3), NYVAC B (grupo Aventi) o MVA WT. 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 10^{7} ufp/ratón de vector, de manera que se inoculó NYVAC-B a los ratones que habían recibido MVA-B en la primera dosis, MVA-B a los ratones que habían recibido NYVAC-B en la primera dosis y NYVAC-WT (grupo Aventis) a los ratones que habían recibido MVA-WT en la primera dosis. Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: NYVAC-B+MVA-B, MVA-B+NYVAC-B y MVA-WT+NYVAC-WT.
10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 16. En ella puede observarse como las dos combinaciones de vectores que contienen secuencias derivadas de VIH-1 incrementan tanto la magnitud como la amplitud de la respuesta inmune específica generada, según se observa con los diferentes grupos de péptidos. La combinación en la que el NYVAC-B se inocula en la primera dosis y el MVA-B en la segunda fue la que dio lugar al número más elevado de células secretoras de IFN-\gamma frente a los diferentes grupos de péptidos.
Ejemplo 13 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Producción de IFN-\gamma por esplenocitos estimulados
Tres grupos de ratones BALB/c (n=4) de 6-8 semanas de edad fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 12 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (1 \mug/ml) utilizadas en los Ejemplos anteriores e incubados durante 5 días a 37ºC. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC. Los niveles de IFN-\gamma se determinaron por ELISA usando un kit comercial (Pharmigen).
Los resultados se muestran en la Figura 17, donde se observa que la producción de IFN-\gamma más amplia se obtiene con la combinación NYVAC-B+MVA-B, al igual que en el Ejemplo 12.
Ejemplo 14 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de ADN y vectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma en ratones humanizados HHDII
Se procedió también a realizar experimentos con ratones humanizados HHDII. Estos ratones, generados por F. Lemonier en Francia y cedidos por él para la realización de los experimentos descritos en la presente memoria, sólo permiten la presentación de antígenos en el contexto del MHC de clase I humano, al tener reemplazados los genes murinos del MHC clase I y \beta-microglobulina por los correspondientes genes humanos.
Grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 \mug del vector de ADN DNA-B (cedido por GeneArt, Alemania) utilizado también en el Ejemplo 8. Los grupos control fueron inoculados (i.m.) con 100 \mug de ADN sin inserto (DNA \diameter). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-B (stock P3) o de NYVAC-B (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-B. Un tercer grupo recibió una segunda dosis de DNA-B (100 \mug, i.m.). El grupo control recibió una dosis de 2 x de 10^{7} ufp/ratón de MVA-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. \bullet denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada grupo respecto al control negativo. * denota diferencias significativas (p< 0,05) entre los distintos grupos.
La Figura 18 muestra los resultados obtenidos. Se observa que las combinaciones DNA-B+MVA-B y DNA-B+NYVAC-B inducen una amplia respuesta frente a los grupos de péptidos, con inmunodominancia frente a Env.
Ejemplo 15 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de ADN y vectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IL-2 en ratones humanizados HHDII
Grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 \mug del vector de ADN DNA-B (cedido por GenArt, Alemania). El grupo control fue inoculado (i.m.) con 100 \mug de ADN sin inserto (DNA \diameter). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-B (stock P3) o de NYVAC-B (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-B. Un tercer grupo recibió una segunda dosis de DNA-B (100 \mug, i.m.). El grupo control recibió una dosis de 2 x de 10^{7} ufp/ratón de MVA-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IL-2 obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. La Figura 19 muestra los resultados obtenidos, en la que: \bullet denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada pool respecto al control negativo. * denota diferencias significativas (p< 0,05) entre los distintos grupos. Se observa inmunodominancia de antígenos de Env, con amplia respuesta frente a los distintos grupos de péptidos y diferencias significativas entre los grupos DNA-B+MVA-B y DNA-B+NYVAC-B.
Ejemplo 16 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma en ratones humanizados HHDII
Cinco grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-B (stock P3) (2 grupos), NYVAC B (grupo Aventis) (2 grupos) o NYVAC WT (grupo control). 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 10^{7} ufp/ratón de vector, de manera que a uno de los grupos que había recibido MVA-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B y a otro de nuevo MVA-B, a uno de los grupos que habían recibido NYVAC-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B de nuevo y a otro MVA-B y, finalmente, el grupo control recibió en la segunda dosis MVA-WT (Aventis-Pasterur). Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: MVA-B+NYVAC-B, NYVAC-B+MVA-B, MVA-B+MVA-B, NYVAC-B+NYVAC-B y NYVAC-WT+MVA-WT.
10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. La Figura 20 muestra los resultados obtenidos, en la que: \bullet denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo. Se observa que la inmunización combinada de vectores virales, MVA-B y NYVAC-B, induce una amplia respuesta inmune contra distintos antígenos del VIH.
Ejemplo 17 Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IL-2 en ratones humanizados HHDII
Cinco grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-B (stock P3) (2 grupos), NYVAC B (grupo Aventis) (2 grupos) o NYVAC WT (grupo control). 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 10^{7} ufp/ratón de vector, de manera que a uno de los grupos que había recibido MVA-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B y a otro de nuevo MVA-B, a uno de los grupos que habían recibido NYVAC-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B de nuevo y a otro MVA-B y, finalmente, el grupo control recibió en la segunda dosis MVA-WT (grupo Aventis). Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: MVA-B+NYVAC-B, NYVAC-B+MVA-B, MVA-B+MVA-B, NYVAC-B+NYVAC-B y NYVAC-WT+MVA-WT.
10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IL-2 obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. La Figura 21 muestra los resultados obtenidos, en la que: \bullet denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo. Como en el Ejemplo 16, se observa que la combinación de vectores induce una amplia respuesta inmune (producción de IL-2) frente a distintos antígenos del VIH.
Ejemplo 18 Generación del MVA-C Construcción del vector plasmídico pLZAW1gp120C/gagpolnef-C-14
El vector plasmídico pLZAW1gp120C/gagpolnef-C-14 fue construido por los inventores para la generación del virus recombinante de MVA que expresa secuencias génicas correspondientes a la proteína gp 120 (gp 120-C) y a la quimera de Gag, Pol y Nef (gagpolnef-C) del aislamiento CN54, que pertenece al clade C. El vector pMA60gp120C/
gagpolnefC-14,15 utilizado para su construcción, contiene las secuencias codificantes de ambas proteínas; se construyó utilizando la secuencia codificante de la proteína de fusión gagpolnef-C generada por GeneArt (Regensburg, Alemania) y fue cedido a los inventores para la construcción del vector MVA-C en el marco del programa de colaboración EuroVacI.
El plásmido pLZAW1gp120C/gagpolnef-C-14 es un derivativo de pUC diseñado para la selección de placas azules/blancas. Contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa (TK), el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección \beta-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampicilina (AP). Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentras las dos secuencias que se desean expresar, gp120-C (SEQ ID NO:17) y gagpolnef-C (SEQ ID NO:18), que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes. La posición de cada uno de los componentes incluidos en el plásmido se describe a continuación en la Tabla 4.
TABLA 4 Componentes del plásmido pLZAW1gp120C/gagpolnef-C-14
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Para la construcción de este plásmido se utilizaron otros dos plásmidos diferentes:
- pMA60gp120C/gagpolnef-C-14,15 (proporcionado por el grupo Aventis, Canadá). El plásmido es un derivativo de pUC que contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa (TK) en sitios de clonación del pUC. Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentras las dos secuencias que se desean expresar, gp120-C y gagpolnef-C, que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes.
- pLZAW1: El plásmido fue proporcionado por Linong Zhang, del grupo Aventis, Canadá. Es un plásmido basado en pUC que contiene un brazo izquierdo del gen de TK, sitios de clonación para insertar genes exógenos, una repetición corta del brazo izquierdo el gen de TK, un promotor E3L dirigiendo la expresión de un casete con \beta-gal y un brazo derecho del gen de TK.
La construcción del plásmido pLZAW1gp120C/gagpolnefC-14 a partir de estos otros dos plásmidos se representa en la Figura 22. Brevemente, un fragmento de ADN de 6047 kpb que contenía los genes de interés fue sacado por digestión con EcoRV del plásmido pMA60gp120C/gagpolnefC-14,15, modificado por incubación con la ADN polimerasa de Klenow para generar extremos romos, y clonado en el vector pLZAW1 previamente digerido con la endonucleasa de restricción AscI, modificado por incubación con Klenow, y desfosforilado por incubación con fosfatasa alcalina de intestino de ternera, generándose de esta forma el vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120C/gagpolnef-C-14. El plásmido generado dirige la inserción de los genes de interés en el locus de la TK del genoma del virus atenuado MVA. Después de aislar el virus recombinante deseado mediante el análisis de la expresión de actividad \beta-galactosidasa la posterior propagación del virus recombinante conduce a la autodeleción de \beta-gal por recombinación homóloga entre el brazo izquierdo de TK y la repetición corta del brazo izquierdo de TK que flanquean el
marcador.
Construcción del virus recombinante MVA-C
Cultivos primarios de fibroblastos de embrión de polio (CEF) fueron infectados con virus atenuado MVA en pase 586 (MVA-F6, pase 586, proporcionado por Gerd Sutter) a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, y posteriormente transfectados con 10 \mug de ADN del plásmido de transferencia pLZAW1gp120C/gagpolnefC-14, usando para ello lipofectina comercial suministrada por Invitrogen y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas post-infección las células fueron recogidas, sonicadas y usadas para la selección de los virus recombinantes. Los virus MVA recombinantes que contenían los genes gp120C/gagpolnef-C y coexpresaban de forma transitoria el gen marcador \beta-Gal (MVA-B (X-Gal^{+})), fueron seleccionados por pases consecutivos de purificación de placas en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactósido (XGal) (300 \mug/ml). En lo sucesivo, los MVA recombinantes que contenían los genes gp120C/gagpolnef-C y que habían perdido el gen marcador (MVA-B (X-Gal^{-})), fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células CEF en presencia de XGal. En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en CEF durante 3 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el paso de purificación de placas consecutivo.
Tras 4 pases consecutivos de purificación fueron aisladas 24 placas recombinantes que expresaban eficientemente ambos antígenos y que habían perdido el gen marcador. Se hizo crecer el recombinante designado como MVA-C-1.7.1.2 (P1) (SEQ ID NO:16) para generar un stock crudo (P2) que se envió a producción en condiciones de buenas prácticas de fabricación para estudios clínicos. La secuencia del inserto que este recombinante lleva incluido en el sitio de la timidina quinasa viene representada por SEQ ID NO:20. La localización en dicha secuencia de cada uno de los elementos que componen el inserto se indica a continuación en la Tabla 5.
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TABLA 5 Posición de los componentes principales del inserto del vector MVA-C
101 
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A partir del P2, se preparó un stock P3 de virus, purificándolo a partir de células CEF infectadas a una multiplicidad de infección de 0,05 por pase a través de dos colchones de sacarosa al 36%. Este stock P3, con un título de 4,25 x 10^{8} ufp/ml, fue el que se utilizó en los protocolos de inmunización en el modelo murino.
Caracterización del virus recombinante MVA-C
Para confirmar la homogeneidad genética del virus MVA-C generado y la integridad de los genes insertados, se realizó un análisis por PCR del ADN viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula, empleando para ello oligonucléotidos que hibridan o con las regiones TK flanqueantes del inserto o con regiones internas de los genes insertados. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados como cebadores y la posición en que aparecen sobre el vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120C/gagpolnefC-14 se muestran en la Tabla 6. Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las distintas PCR y la localización de los mismos con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes, aparecen representadas en la parte superior de la Figura 23.
TABLA 6 Oligonucleótidos utilizados como cebadores de las PCR de caracterización del vector MVA-C
102
La parte inferior de la Figura 23 muestra fotografías de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con las diferentes parejas de cebadores para efectuar el análisis de los fragmentos del VIH-1 incluidos en el virus MVA-C. Para ello, 100 ng del ADN viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus NYVAC-C (calle 1), MVA-C (calle 2), MVA-WT (calle 3) o NYVAC-WT (calle 4), fueron usados como molde para hacer una amplificación mediante PCR de diferentes fragmentos de VIH-1 incluidos en MVA-C. Las condiciones de cada PCR se estandarizaron de forma individualizada para cada pareja de oligonucleótidos cebadores empleada. Como se observa en las fotografías mostradas en la parte inferior de la Figura 23, en las calles 3 y 4, correspondientes a muestras que carecen de inserto, no se observan bandas en ninguno de los casos, mientras que el control positivo NYVAC-C expresa los mismos genes incluidos en MVA-C.
La Figura 24, por su parte, muestra una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis los productos resultantes de una reacción de PCR en la que se utilizaron como cebadores oligonucleótidos (TK-L y TK-R) que hibridan con las secuencias flanqueantes del gen TK. En las calles 2 y 3, correspondiente a los stocks P1 y P2 del vector MVA-C se observa una banda de algo más de 6 Kb compatible con la presencia del inserto completo; mientras que en la calle 4, correspondiente a ADN extraído de células CEF infectadas con la cepa silvestre MVA-WT del virus MVA aparece una banda mucho menor, que correspondería al locus de TK sin inserto.
Ejemplo 19 Análisis de la expresión de proteínas del VIH a partir del MVA-C
La expresión de las proteínas gp120-C y gagpolnef-C por el virus MVA-C fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los diferentes stocks de virus recombinante MVA-B. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio) que reconoce la proteína gp120 del aislamiento CN54; y frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-p24 (cedido por el programa EVA, ARP432) que reconoce la quimera gagpolnef-C del mismo aislamiento. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células infectadas con el vector NYVAC-C.
Como se observa en la Figura 25, ambos antígenos son expresados eficientemente por diferentes stocks (P2, P3) del recombinante MVA-C generado.
Ejemplo 20 Comprobación de la estabilidad del MVA-C
Para verificar que el recombinante MVA-C podía ser pasado sucesivamente sin perder la expresión de los genes insertados, se realizó un ensayo de estabilidad análogo al descrito en el Ejemplo 3, efectuando varios pases sucesivos del virus recombinante MVA-C en células CEF. Monocapas de células CEF crecidas en placas P100 fueron infectadas de forma sucesiva, a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, partiendo del stock P2 del MVA-C (pase 6) hasta generar el pase 10 (P10). A continuación, monocapas de células CEF crecidas en placas de 6 pocillos fueron infectadas con una dilución 10^{-5} del extracto viral obtenido del último pase (P10). A las 48 horas post-infección, las placas de lisis generadas fueron analizadas por inmunotinción, empleando anticuerpos policlonales anti-WR (que reconoce proteínas del virus MVA); anti-gp120 (que reconoce la gp120 del aislamiento CN54); y anti-p24 (que reconoce la quimera gagpolnef-C del mismo aislamiento); estos dos últimos anticuerpos fueron los mismos que se utilizaron en el Ejemplo 19. Los resultados de estas inmunotinciones se muestran en la parte A de la Figura 26. Los recuentos de placas demostraron que, tras 10 pases sucesivos del virus en células CEF, ambos antígenos se expresan eficientemente (100% de las placas reconocidas por el anticuerpo anti-WR fueron reconocidas por los anticuerpos anti-gp120 y anti-p24), corroborándose la estabilidad del producto generado.
Los extractos de células CEF infectadas con los pases 7, 8, 9 y 10 también fueron analizados por inmunotransferencia tipo Western, pruebas a las cuales corresponden las tinciones mostradas en la parte B de la Figura 26. Para realizar estos ensayos, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los extractos virales obtenidos en los pases 7 (P7), 8 (P8), 9 (P9) y 10 (P10) del virus recombinante MVA-C. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDA-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa y hechos reaccionar con los mismos anticuerpos policlonales anti-gp120 (parte derecha de la figura) o anti-p24 (parte izquierda de la figura) utilizados en la prueba correspondiente a la parte A de la Figura 26. Ambos anticuerpos se utilizaron a una dilución 1/500. Como control positivo se empleó un extracto de células CEF infectadas con el virus NYVAC-C (cedido por el grupo Aventis). Los resultados confirman la correcta expresión de las proteínas gp120-C y gagpolnef-C en todos los extractos obtenidos por la infección con virus procedentes de distintos pases.
Ejemplo 21 Liberación de gp120-C y cinética de expresión a partir del MVA-C en el transcurso del tiempo
Para definir si la proteína gp120-C era eficientemente secretada, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con el virus recombinante MVA-C a 5 ufp/célula. A las 6, 18 y 24 horas post-infección las células se recogieron separando el precipitado (P) del sobrenadante (S) celular. Los sobrenadantes de cada tiempo analizado fueron concentrados y fraccionados junto a los precipitados celulares en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a reacción frente al anticuerpo policlonal anti-gp120 específico para el aislamiento CN54 anteriormente utilizado en los Ejemplos 19 y 20. De igual forma fueron tratadas células CEF infectadas con el NYVAC-C (proporcionado por el grupo Aventis), usado como control positivo en el ensayo. Como control interno para verificar que había sido aplicado en el gel la misma cantidad de proteína, las membranas fueron incubadas también frente a un anticuerpo monoclonal anti-\beta-actina. Los resultados se muestran en la Figura 27. En su parte superior, correspondiente a la muestra del MVA-C, puede apreciarse que la proteína gp120-C es expresada eficientemente por el MVA-C desde las 6 horas post-infección, detectándose en el sobrenadante celular a partir de las 18 horas post-infección, y con un comportamiento similar al que se observa en células infectadas con el NYVAC-C, para el cual se muestran los resultados obtenidos en la parte inferior de la Figura 27.
La expresión de la proteína de fusión gagpolnef-C fue analizada en el precipitado celular igualmente a las 6, 18 y 24 horas post-infección siguiendo un procedimiento análogo al utilizado para la proteína gp120-C, aunque utilizando en este caso el anticuerpo anti-p24 específico para el aislamiento CN54. Los resultados se muestran en la Figura 28. En ella puede observarse que esta proteína de fusión se expresa eficientemente a lo largo del tiempo de infección tanto desde MVA-C (calle 1 de cada tiempo de infección) como desde NYVAC-C (calle 2).
Ejemplo 22 Inmunogenicidad del MVA-C: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma
Una vez generado y caracterizado el recombinante MVA-C, el siguiente objetivo fue analizar su capacidad de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino frente a los antígenos que expresa. Para ello, ratones transgénicos HHDII (n=4) de 10 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-C o de NYVAC-C. 8 días después de la inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, y se les extrajo el bazo para llevar a cabo un ensayo de ELISPOT análogo al descrito en el Ejemplo 5, siguiendo la misma metodología descrita en dicho Ejemplo con la excepción de que, en este caso, para evaluar la respuesta inmune específica, se utilizaron diferentes grupos que contenían 40-50 péptidos solapantes de 15 aminoácidos cada uno, pertenecientes al clade C, que cubrían todas las regiones antigénicas incluidas en el recombinante MVA-C de la invención.
Los resultados, que se muestran en la Figura 29, demuestran que el MVA-C es capaz de potenciar una respuesta inmune específica frente a casi todos los grupos de péptidos ensayados, evidenciándose la mejor respuesta frente a los grupos de péptidos representativos de los genes de la envuelta (Env1 y Env2).
Adicionalmente, se evaluó también la respuesta generada contra los propios vectores, las formas atenuadas de Vaccinia utilizadas para la construcción de los recombinantes, MVA y NYVAC. Para ello, los esplenocitos de los animales inmunizados se pusieron en contacto durante 48 horas con células RMAS-HDD previamente infectadas durante 5 horas con 5 ufp/célula de las cepas silvestres de MVA y NYVAC, MVA-WT y NYVAC-WT. El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frentea a las células RMAS-HHDII sin infectar (control negativo) fue sustraído en todos los casos. Los resultados, que se muestran en la parte B de la Figura 29, demuestran que la respuesta anti-Vaccinia fue superior en el grupo de ratones inmunizados con NYVAC-C.
Ejemplo 23 Inmunogenicidad del MVA-C: Producción de citoquinas por esplenocitos reestimulados
Los esplenocitos aislados de los animales inmunizados con MVA-C y NYVAC-C aislados en el Ejemplo 22 fueron cultivados (5x10^{6} células/pocillo) en una placa de 24 pocillos y estimulados con 1 \mug/ml de cada grupo de péptidos pertenecientes al clade C. La placa se incubó durante 5 días a 37ºC en atmósfera del 5% CO_{2}. Después de este período, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se centrifugaron a 1.500 rpm, 5 min, a 4ºC, almacenándose a -70ºC hasta su utilización.
Para conocer los niveles de IL-10 e IFN-\gamma presentes en los sobrenadantes de cultivos de esplenocitos reestimulados in vitro, se procedió a la determinación de estos niveles mediante kits de ELISA comerciales de Pharmigen, siguiendo las instrucciones del fabricante de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 6.
Los resultados, mostrados en la Figura 30, indican que MVA-C induce la secreción de las citoquinas IL-10 e IFN-\gamma en el sobrenadante de cultivo de los esplenocitos reestimulados. Los niveles de IFN-\gamma fueron significativamente superiores frente a los grupos de péptidos GPN2, Env-1 y Env-2, evidenciando una clara polarización de la respuesta celular antígeno-específica hacia un subtipo Th1.
Ejemplo 24 Inmunogenicidad del MVA-C: Identificación de los tipos de células T específicas productoras de IFN-\gamma
Para dilucidar si la respuesta celular que se estaba obteniendo en ELISPOT era debida a la secreción de IFN-\gamma por las células T CD8^{+} o por las células T CD4^{+}, los esplenocitos obtenidos en el Ejemplo 22 fueron reestimulados durante 1 hora con 5 \mug/ml de cada grupo de péptidos, tras lo cual se añadió Brefeldina a una concentración de 10 \mug/ml, incubándose durante toda la noche. Posteriormente se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados a FITC, seguido de un marcaje intracelular empleando anti-IFN-\gamma conjugado a PE. Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citómetro de flujo.
Los resultados, mostrados en la Figura 31, permiten apreciar que, tanto para el grupo de animales inmunizado con el MVA-C, como para el grupo inmunizado con NYVAC-C, la respuesta productora de IFN-\gamma es mayoritariamente debida a la población de células T CD8^{+} específicas activadas frente a los diferentes grupos de péptidos. Al determinar los niveles totales de IFN-\gamma secretados por ambos tipos de células, se corroboró el resultado obtenido en el ensayo de ELISPOT, donde se observaba una respuesta específica frente a la mayoría de los grupos de péptidos en los animales inmunizados con ambos recombinantes. De nuevo, existen diferencias claras entre las respuestas generadas por cada uno de los recombinantes.
Ejemplo 25 Inmunogenicidad del MVA-C: Respuesta humoral generada
Para evaluar la respuesta humoral generada por la inoculación de MVA-C y NYVAC-C, grupos de 4 ratones HHDII o C57BL/6 de 6-10 semanas de edad fueron inoculados por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-C (stock P3) o de NYVAC-C (grupo Aventis, Francia). 14 días después, se extrajo sangre del plexo suborbital de los ratones inmunizados y, tras dejarlo toda la noche a 4ºC se centrifugó obteniéndose el suero. La cantidad total de anticuerpos IgG presentes en los sueros frente a la proteína Gag (2 \mug/ml), la proteína de la envuelta gp-160 (2 \mug/mL) o frente a extractos celulares de una infección con vaccinia fue determinada por ELISA, diluyendo para ello los sueros 1/500 para la detección de los anticuerpos frente a Vaccinia y 1/50 para la detección de los anticuerpos frente a la proteína Gag y frente a la proteína gp160.
Los resultados, que se muestran en la Figura 32, muestran un aumento de la respuesta humoral generada frente a la proteína de la envuelta en los ratones inmunizados con el vector recombinante MVA-C con respecto a los controles y los ratones inmunizados con NYVAC-C, siendo inferior la respuesta humoral generada frente a los antígenos del propio vector Vaccinia en los ratones inmunizados con MVA-C que en los ratones del mismo tipo inmunizados con NYVAC-C.
Ejemplo 26 Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de ADN y vectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma generada en ratones humanizados HHDII
Grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 \mug del vector de ADN DNA-C (cedido por GeneArt, Alemania), formado por dos plásmidos recombinantes derivados de pcDNA que contienen cada uno de ellos una de las secuencias codificantes de proteínas del VIH-1 (gp120-C y gagpolnef-C) que lleva insertadas el MVA-C, bajo el control de sendos promotores de citomegalovirus. El grupo control fue inoculado (i.m.) con 100 \mug de ADN sin inserto (DNA \diameter). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-C (stock P3) o de NYVAC-C (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-C. El grupo control recibió una dosis de 2 x de 10^{7} ufp/ratón de NYVAC-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-C y NYVAC-C. El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados se muestran en la Figura 33. Se observa que la inmunización combinada de vectores genera una respuesta inmune amplia, con producción de IFN-\gamma frente a distintos antígenos del VIH, con diferencias significativas entre los vectores. La combinación DNA-C+NYVAC-C produjo inmunodominancia frente a Env.
Ejemplo 27 Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de ADN y vectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IL-2 generada en ratones humanizados HHDII
Grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 \mug del vector de ADN DNA-C (cedido por GeneArt, Alemania) utilizado en el Ejemplo 26. El grupo control fue inoculado (i.m.) con 100 \mug de ADN sin inserto (DNA \diameter). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-C (stock P3) o de NYVAC-C (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-C. El grupo control recibió una dosis de 2 x de 10^{7} ufp/ratón de NYVAC-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con las mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (5 \mug/ml), que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-C y NYVAC-C, utilizadas en los Ejemplos anteriores referentes al MVA-C. El número de células productoras de IL-2 obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 34. Se observa que la inmunización combinada de vectores genera una respuesta inmune amplia, con producción de IL-2 frente a los distintos antígenos del VIH, con diferencias significativas entre los vectores. La combinanción DNA-C +NYVAC-C produjo inmunodominancia frente a Env.
Ejemplo 28 Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-\gamma en ratones BALB/c
Habiendo establecido que la administración de una primera dosis de inmunización que contenía el MVA-C era capaz de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino, se evaluó a continuación si la utilización de este vector de la invención como parte de un protocolo de inducción/potenciación, con diferentes combinaciones de MVA-C y NYVAC-C, daba lugar a un incremento en la magnitud y la amplitud de la respuesta inmune. Por ello, se suministró una primera dosis de inmunización a 4 grupos de ratones BALB/c (n=4) de 6-8 semanas de edad que contenía 2 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-C (P3), NYVAC-C (grupo Aventis), MVA-WT o NYVAC-WT por la ruta intraperitoneal. 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 10^{7} ufp/ratón, de manera que a uno de los grupos que había recibido MVA-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-C y a otro de nuevo MVA-C, a uno de los grupos que habían recibido NYVAC-C en la primera dosis se le inoculó NYVAC-C de nuevo y a otro MVA-B y, el grupo control que había recibido MVA-WT recibió en la segunda dosis NYVAC-C y el grupo control que había recibido NYVAC-WT recibió en la segunda dosis MVA-WT (grupo Aventis). Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: MVA-C+NYVAC-C, NYVAC-C+MVA-C, MVA-C+MVA-C, NYVAC-C+NYVAC-C, NYVAC-WT+MVA-WT y MVA-WT+NYVAC-WT.
10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELISPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (5 \mug/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-C y NYVAC-C. El número de células productoras de IFN-\gamma obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 35. De ellos se deduce que las diferentes combinaciones de vectores derivados de poxvirus (MVA-C+NYVAC-C, MVA-C+MVA-C, NYVAC-C+MVA-C, NYVAC-C+NYVAC-C, NYVAC-WT+MVA-WT, MVA-WT+NYVAC-WT) incrementan tanto la magnitud como la amplitud de la respuesta inmune específica generada, según se observa con los diferentes grupos de péptidos. Los grupos de péptidos mejor reconocidos fueron los correspondientes a Env1, GPN1 y GPN2, seguidos de GPN3 y Gag1.
Las combinaciones de MVA-C y NYVAC-C dieron lugar a mayores respuestas que la administración de dos dosis de virus homólogos, MVA-C+MVA-C o NYVAC-C+NYVAC-C. El grupo de ratones al que se le administró en la primera dosis NYVAC-C y en la dosis de potenciación MVA-C fue el que mostró el número más elevado de células secretoras de IFN-\gamma frente a los diferentes grupos de péptidos.
Ejemplo 29 Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Producción de citoquinas por esplenocitos reestimulados procedentes de ratones BALB/c
Seis grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y la potenciación de la misma mediante la inoculación de un segundo vector en una segunda dosis, de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 28 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (1 \mug/ml) e incubados durante 5 días a 37ºC. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC. Los niveles de IFN-\gamma e IL-10 se determinaron por ELISA usando kits comerciales (Pharmigen).
Los resultados se muestran en la Figura 36. Se observa que la combinación de vectores virales induce una respuesta celular tipo Th2, con polarización hacia los antígenos Env y gpn1.
Ejemplo 30 Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Identificación de los tipos de células T específicas secretoras de IFN-\gamma generadas en ratones BALB/c
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y la potenciación de la misma mediante la inoculación de un segundo vector en una segunda dosis, de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 28 y utilizando las mismas combinaciones de vectores salvo en el caso de los controles, en el que se prescindió de inocular la combinación MVA-WT+NYVAC-WT en este orden. Los esplenocitos extraídos fueron reestimulados in vitro durante 1 hora a 37ºC con 5 \mug/ml de cada grupo de péptidos solapantes pertenecientes al clade C, tras lo cual se añadió Brefeldina a una concentración de 10 \mug/ml, incubándose durante toda la noche a 37ºC. Siete días después se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados a FITC, seguido de un marcaje intracelular empleando anti-IFN-\gamma conjugado a PE. Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citómetro de flujo.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 37. Se observa que la combinación de vectores virales induce un menor aumento de células CD8^{+} productoras de IFN-\gamma que de células CD4^{+}, con la combinación NYVAC-C+MVA-C induciendo el mayor incremento frente a los péptidos de Gag1, Env1, Gpn1 y Gpn2.
Ejemplo 31 Perfil diferencial de cambios en los niveles de expresión de genes humanos inducidos durante la infección con los vectores MVA y NYVAC
Para evaluar si las diferencias en las respuestas inmunes inducidas por la inoculación de vectores recombinantes derivados de MVA y NYVAC iban acompañadas también de perfiles diferentes de inducción de variaciones en los niveles de expresión de genes en las células infectadas, se realizó un experimento de infección de células HeLa con MVA y NYVAC y se evaluaron los cambios experimentados en los niveles de expresión de 15000 genes humanos utilizando microarrays con ADNc humano.
Para ello, se generaron microarrays de ADNc tal como se ha descrito previamente (20), utilizando la genoteca de ADNc humano 40K de Research Genetics (http://www.resgen.com/products/SVHcDNA.php3), que contenían 15.360 secuencias de ADNc, (de las cuales 13295 corresponden a genes conocidos y 2.257 corresponden a genes de control), utilizando portaobjetos CMT-GAPS II (Corning) sobre los que se fijaron las secuencias de ADNc mediante el Microgrid II (BioRobotics) a 22ºC y una humedad relativa de 40-45%. Por otro lado, se cultivaron células HeLa (de la American Type Culture Collection) en placas de 10 cm de diámetro, en medio de Dulbecco al que le había añadido suero bovino de recién nacido al 10% y antibióticos y se llevaron a cabo infecciones con el MVA-WT y el NYVAC-WT a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula. El ARN total se aisló de las células infectadas utilizando Ultraespect-II RNA (Biotecx), siguiendo las instrucciones del fabricante, a partir de muestras tomadas por duplicado de las células infectadas con cada uno de los virus transcurridas 2, 6 y 16 horas del momento de la infección. Cada muestra de ARN se utilizó en dos hibridaciones diferentes: en una hibridación, la muestra infectada con MVA-WT se marcó con dUTP-Cy3 y la muestra infectada con NYVAC-WT se marcó con dUTP-Cy5, mientras que en la otra la muestra infectada con MVA-WT se marcó con dUTP-Cy5 y la muestra infectada con NYVAC-WT se marcó con dUTP-Cy3. El doble marcaje se utilizó para suprimir diferencias en el marcaje y la hibridación debidas a características específicas del Cy-dUTP. Una mezcla que contenía 40 \mug de ARN, 150 pmoles de oligo(dT)_{20}, dATP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, dTTP 0,1 mM dUTP Cy3/Cy5 0,05 mM (Amersham), tampón de reacción para la primera hebra 1X (Invitrogen) y ditiotreitol 10 mM en un volumen de 38 \mul se calentó (65°C, 5 min) y se preincubó (42°C, 5 min), tras lo cual se añadieron 400 U de SuperScript II (Invitrogen) y 40 U de inhibidor de RNasa (Roche) y se incubó la mezcla a 42°C durante 2,5 horas. La reacción se terminó añadiendo EDTA y el molde de ARN de partida se retiró añadiendo 2 \mul de NaOH 10 N, seguido de incubación (20 min, 65°C). La reacción se neutralizó añadiendo 4 \mul de ácido acético 5 M. Se mezclaron las sondas de Cy5 y Cy3 y los colorantes no incorporados se retiraron mediante precipitación con isopropanol. Las sondas se resuspendieron en agua desionizada; los agentes bloqueantes añadidos para incrementar la especificidad fueron poli(A) (20 \mug, Sigma), ARNt (20 \mug, Sigma) y ADN humano Cot-1 (20 \mug, Invitrogen). Mientras las sondas se secaban en una Speed-Vac, los microarrays se prehibridaron con una mezcla que contenía SSC 6x (SSC 1X está formado por NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,015 M), dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5% y albúmina de suero bovino al 1% (42°C, 1 hora), se lavaron cinco veces con agua, y se secaron mediante centrifugación (563 x g, 1 min). Las sondas se resuspendieron en 40 \mul de tampón de hibridación (formamida al 50%, SSC 6x, SDS al 0,5%, solución de Denhardt 5x) y se incubaron con los portaobjetos que contenían los microarrays (42°C, 16 horas) en cámaras de hibridación (Array-It) en un baño de agua en la oscuridad. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron dos veces en SSC 0,1X-SDS 0,1% durante 5 minutos cada vez y tres veces en SSC 0,1x durante 5 minutos cada vez. Finalmente, los portaobjetos se secaron mediante centrifugación como se describió anteriormente y se escanearon en un ScanArray 4000 (Packard Biosciences) utilizando el software ScanArray 3.1. A partir de las imágenes de Cy5 y Cy3 se obtuvieron datos preliminares utilizando el software QuantArray 3.0 (Packard Biosciences), que se procesaron utilizando el software SOLAR (BioALMA, Madrid, España. La señal de fondo se resta de la señal, se representa log_{10}(señal) frente log_{2}(relación) y se realiza una normalización mínima. Este valor se calcula para las cuatro réplicas y se obtiene una tabla con la señal media, el factor de cambio, log (relación), la desviación estándar del logaritmo de la relación y el valor z (una medida de la proximidad de un valor [log relación] a otros valores con señales similares) (21). Una vez obtenidos estos datos, el juego de datos se redujo eliminando los genes con una desviación estándar entre las réplicas >1 y aquellos que mostraban valores de z \leq 2, después de lo se reprocesaron los datos, se agrupó los genes utilizando el mapa clásico de autoorganización de Kohonen (22,23,24) y se analizó el mapa resultante utilizando el software Engene, disponible en http://www.engene.cnb.uam.es.
Las diferencias más representativas detectadas en las células infectadas con uno y otro virus se resumen en la Tabla 7, en la que se indican el factor de aumento de la expresión de varios genes representativos observado transcurridos distintos intervalos de tiempo (horas post-infección: h.p.i.) tras el momento de la infección. En ella puede observarse que el perfil de inducción de variaciones en los niveles de expresión de genes en las células infectadas es diferente según el virus utilizado para la infección. Por ejemplo, el incremento por MVA y no por NYVAC de genes coestimuladores de la respuesta inmune, como IL-7, proteína B7, NFATC3 y MAP2K5, puede condicionar el menor grado de respuesta inmune de un vector frente al otro.
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(Tabla pasa a página siguiente)
103
Ejemplo 32 Perfil diferencial de cambios en los niveles de inducción de apoptosis inducidos durante la infección de células en cultivo por los vectores MVA y NYVAC
Para evaluar si las diferencias observadas en la resupuesta inmune inducida por la inoculación de vectores derivados de MVA y NYVAC iban acompañadas de variaciones en los niveles de inducción de muerte celular por apoptosis, se llevaron a cabo distintos experimentos para evaluar el grado de apoptosis, evaluando distintos parámetros indicativos del mismo.
Una de las características de la apoptosis es la rotura específica por proteasas de la proteína PART). Para evaluarla, se procedió a la infección de células HeLa con 5 ufp/célula de MVAo NYVAC y se recogieron a 4, 8 y 16 horas postinfección en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M, NP-40 10%, SDS 1%). Se separaron cantidades iguales de lisados de proteínas (10 \mug) mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo anti-PARP humano (1:500 dilución) de Cell Signalling, obteniéndose los resultados que se muestran en la parte superior de la Figura 38a, en la que se indica la posición de la banda correspondiente a la proteína PARP completa (PARPc) y la correspondiente a un fragmento de la proteína PARP escindido de la proteína completa (PARPf). Como control interno para verificar que había sido aplicado en el gel la misma cantidad de proteína, las membranas fueron incubadas también frente a un anticuerpo monoclonal anti-\beta-actina (SIGMA), obteniéndose la señal que se muestra en la parte inferior de dicha Figura.
Los resultados muestran que la infección de células HeLa con NYVAC induce con el tiempo de infección la degradación de PARP. Esta degradación es mucho menor en células infectadas con MVA.
La inducción de apoptosis por NYVAC también se confirmó mediante pruebas de inmunofluorescencia de células HeLa infectadas con 5 ufp/célula cuyos núcleos fueron teñidos a las 24 horas postinfección con DAPI durante 30 min a temperatura ambiente y las célula fotografiadas. Los resultados se muestran en la Figura 38b, en cuya parte inferior, correspondiente a células HeLa infectadas con NYVAC, se observa que NYVAC favorece condensación de la cromatina y formación de cuerpos apoptóticos, algo que no se observa en la infección con MVA (parte superior de la Figura).
Otro indicador de apoptosis es la activación de la enzima RNasa L, que favorece la ruptura del ARN ribosómico. Para evaluar esta activación, se aisló el total de ARN usando el sistema de purificación por resina de ARN Ultraspec-II (Bioteck), a partir de muestras de células HeLa infectadas con 5 ufp/célula obtenidas transcurridas 18 ó 24 de la infección con la cepa Western Reserve (WR) de Vaccinia, con MVA o con NYVAC, añadiendo un control en el que se simuló la infección. Se sometieron los ARNs (2 microgramos) a electroforesis en geles de agarosa-formaldehido al 1% que contenían bromuro de etidio y se fotografió bajo luz ultravioleta el patrón de bandas obtenido. Los resultados, mostrados en la Figura 38c muestran que la infección de células HeLa con NYVAC induce a las 18 horas degradación del ARN ribosómico en fragmentos característicos de la activación de la enzima RNasa L, lo que no se observa en la infección con MVA.
Finalmente, otro indicador de apoptosis es la cuantificación del número de células apoptóticas por citometría de flujo. Este ensayo se realizó de nuevo en células HeLa infectadas (5 ufp/célula) con Vaccinia WR, MVA y NYVAC, así como en controles en los que se simuló la infección. Los diferentes estadios del ciclo celular y el porcentaje de células en la fase subGo fueron analizadas por tinción con yoduro de propidio (IP). Para cada uno de ellos se realizó el ensayo en muestras que habían sido incubadas en ausencia o en presencia del inhibidor general de caspasas zVAD (4 micromolar, Calbiochem). A las 24 horas se recogieron las células, se lavaron con PBS frío, se permeabilizaron con etanol al 70% en PBS a 4°C durante 30 min. Después de tres lavados con PBS, las células se incubaron durante 45 min a 37°C con RNasa A y se tiñeron con IP (10 microgramos/ml). El porcentaje de células que presentaban DNA hipodiploide se determinó por citometría de flujo. Los datos fueron adquiridos en 15000 células por muestra y los resultados se representan como veces de incremento en células apoptóticas respecto a las células sin infectar. El gráfico de la Figura 38d muestra el factor de incremento de células apoptóticas observado en cada uno de los casos. En él puede observarse que la infección con NYVAC provoca apoptosis en una gran parte de la población celular (más del 40%) y que este fenómeno se previene con la adición del inhibidor general de caspasas zVAD. La inducción de apoptosis por MVA fue mucho más reducida.
Los resultados de estos ensayos demuestran que NYVAC induce apoptosis durante la infección, mientras que MVA no parece activar apoptosis o da muestras de activar en menor medida.
Estas diferencias bioquímicas, junto a las diferencias genéticas definidas en el Ejemplo 31, indican que es de esperar que los vectores recombinantes generados a partir de MVA y NYVAC, a pesar de contener las mismas secuencias codificantes del VIH-1 bajo el control de promotores idénticos, den lugar a comportamientos diferentes al ser inoculados en seres humanos con la intención de provocar una respuesta inmune contra el VIH. Los vectores recombinantes derivados de MVA, por tanto, representan una interesante alternativa para sustituir o complementar de forma ventajosa a los vectores recombinantes derivados de NYVAC en protocolos de inmunización frente al VIH-1.
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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
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<120> VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL VIRUS MODIFICADO DE ANKARA (MVA) COMO VACUNAS PREVENTIVAS Y TERAPÉUTICAS CONTRA EL SIDA
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<130> P-100283
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<160> 20
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<212> ADN
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<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPN7649
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agccccatcg agaccg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPN8170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attagcctgc ctctcgg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> E/L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatttttttt ttttggaata taaatag 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gp120-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgagcatgg acagggcc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gp120-1050
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcttgttct ggaagtgc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gp120-1213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcatcacca tcccctgc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPN-802
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgggtttaaa caagatcg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPN-2018
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaggtgaag cagtggcc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPN-2198
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgggtcctct tgttcagc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPN-3820
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggccttgcc gatcttgg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPN-4000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgacaagag cgagagcg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1482
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial derivada del aislado BX08 del VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gp120-bX08
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
104
105 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3981
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial derivada del aislado IIIB del VIH
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gagpolnef-IIIB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
106
107
108
109
110 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial derivada del aislado CN54 del VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gp120-C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
111
112
113 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial derivada del aislado CN54 del VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gagpolnef-C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
114
115
116
117
118
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6907
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial quimérica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Inserto del MVA-B
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia flanqueante izquierda de TK
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..502
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tk_{L}
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia complementaria a secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 537..4517
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gagpolnef-IIIB
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia complementaria de promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4527..4565
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pE/L para gagpolnef-IIIB
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4580..4618
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pE/L para gp120-BX08
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> CDS: 4628..6109
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gp120-BX08
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia flanqueante derecha de TK
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6216..6907
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tk_{R}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
120
121
122 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial quimérica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Inserto del MVA-C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia flanqueante izquierda de TK
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..502
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tk_{L}
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia complementaria a secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 647..2143
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gp120-C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia complementaria de promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2153..2191
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pE/L para gp120-C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2206.2244
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pE/L para gp120-C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> CDS: 2254..6507
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gagpolnef-C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia flanqueante derecha de TK
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6656..7347
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tk_{R}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
123
124
125

Claims (57)

1. Un vector recombinante derivado del virus MVA capaz de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad y una proteína de fusión que contiene secuencias de las proteínas Gag, Pol y Nef del VIH-1, estando la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env y la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef bajo el control de promotores idénticos e insertadas ambas secuencias en el mismo lugar de inserción del vector.
2. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env y la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se encuentran insertadas en el locus de la timidina quinasa de forma que se inactiva dicho gen.
3. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se generan a partir de las secuencias de proteínas Env, Gag, Pol y Nef de aislados naturales.
4. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env se ha generado realizando en ella modificaciones en la secuencia correspondiente destinada a eliminar la expresión de la proteína gp41 de manera que se ha eliminado toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120.
5. Un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef no se proteoliza por acción de la proteasa del VIH.
6. Un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los promotores bajo cuyo control están la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores idénticos que permiten la expresión de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef y de la proteína Env carente de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MVA.
7. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 6, en el que los promotores bajo cuyo control están la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L.
8. Un vector recombinante según las reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env y la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se encuentran insertadas en el locus de la timidina quinasa de forma que se inactiva dicho gen, la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env se ha generado eliminando toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef da lugar a una poliproteína que no se proteoliza por acción de la proteasa del VIH y los promotores bajo cuyo control están la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L.
9. Un vector recombinante según la reivindicación 8, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de aislados naturales pertenecientes al clade B.
10. Un vector recombinante según la reivindicación 9, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado BX08, representada por SEQ ID NO:15.
11. Un vector recombinante según la reivindicación 9, en el que las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden del aislado IIIB, estando la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión representada por SEQ ID NO:16.
12. Un vector recombinante según las reivindicaciones 10 y 11, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado BX08 y las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden del aislado IIIB, estando representadas dichas secuencias, respectivamente, por SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16.
13. Un vector recombinante según la reivindicación 8, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de aislados naturales pertenecientes al clade C.
14. Un vector recombinante según la reivindicación 13, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado CN54, representada por SEQ ID NO:17.
15. Un vector recombinante según la reivindicación 13, en el que las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden del aislado CN54, estando la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión representada por SEQ ID NO:18.
16. Un vector recombinante según las reivindicaciones 14 y 15, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado CN54 y las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden también del aislado CN54, estando representadas dichas secuencias, respectivamente, por SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:18.
17. Una composición que contiene al menos un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Una composición que contiene al menos un vector recombinante según la reivindicación 17 destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayude a prevenir o a tratar una infección provocada por el virus VIH.
19. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18 que contiene al menos un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
20. Una composición según la reivindicación 19, que contiene al menos un vector recombinante según la reivindicación 12.
21. Una composición según la reivindicación 20, destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayuda a prevenir o tratar una infección provocada por el virus VIH como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
22. Una composición según la reivindicación 21, destinada a ser administrada como la primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune.
23. Una composición según la reivindicación 21, destinada a ser administrada tras la primera dosis de vacunación como una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune ini-
cial.
24. Una composición según la reivindicación 21, destinada a ser administrada tanto en la primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune como en una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
25. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18 que contiene al menos un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
26. Una composición según la reivindicación 25, que contiene al menos un vector recombinante según la reivindicación 16.
27. Una composición según la reivindicación 26, destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayuda a prevenir o tratar una infección provocada por el virus VIH como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
28. Una composición según la reivindicación 27, destinada a ser administrada como la primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune.
29. Una composición según la reivindicación 27, destinada a ser administrada como una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
30. Una composición según la reivindicación 27, destinada a ser administrada tanto como primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune como en una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
31. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18 que contiene al menos un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y al menos un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
32. Una composición según la reivindicación 31, que contiene al menos un vector recombinante según la reivindicación 12 y al menos un vector recombinante según la reivindicación 16.
33. Una composición según la reivindicación 32, destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayuda a prevenir o tratar una infección provocada por el virus VIH como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
34. Una composición según la reivindicación 33, destinada a ser administrada como la primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune.
35. Una composición según la reivindicación 33, destinada a ser administrada tras la primera dosis de vacunación como una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
36. Una composición según la reivindicación 33, destinada a ser administrada tanto en la primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune como en una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
37. Uso de un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la fabricación de un medicamento destinado a ser utilizado como vacuna para ayudar a prevenir o a tratar una infección provocada por el virus VIH.
38. Uso según la reivindicación 37 en el que medicamento está diseñado para ser la única vacuna que se suministre a un individuo para ayudar a prevenir o a tratar una infección provocada por el virus VIH.
39. Uso según la reivindicación 38 en el que el medicamento contiene al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
40. Uso según la reivindicación 37 en el que el medicamento está diseñado para ser administrado como al menos una de las dosis que forman parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una segunda o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
41. Uso según la reivindicación 40 en el que el medicamento está diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial.
42. Uso según la reivindicación 41 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
43. Uso según la reivindicación 42 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos un vector según la reivindicación 12 y/o al menos un vector según la reivindicación 16 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector recombinante derivado del virus NYVAC.
44. Uso según la reivindicación 43 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos un vector según la reivindicación 12 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos el vector recombinante NYVAC-B.
45. Uso según la reivindicación 43 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos un vector según la reivindicación 16 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos el vector recombinante NYVAC-C.
46. Uso según la reivindicación 42 en el que tanto el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial como el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contienen al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
47. Uso según la reivindicación 46 en el que tanto el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial como el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contienen al menos un vector según la reivindicación 12.
48. Uso según la reivindicación 46 en el que tanto el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial como el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contienen al menos un vector según la reivindicación 16.
49. Uso según la reivindicación 40, en el que el medicamento está diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada.
50. Uso según la reivindicación 49 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
51. Uso según la reivindicación 50 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos un vector recombinante derivado del virus NYVAC.
52. Uso según la reivindicación 51 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según la reivindicación 12 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos el vector recombinante NYVAC-B.
53. Uso según la reivindicación 51 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según la reivindicación 16 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos el vector recombinante NYVAC-C.
54. Uso según la reivindicación 50 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos un plásmido recombinante que contiene secuencias codificantes de antígenos del VIH-1.
55. Uso según la reivindicación 54 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos un plásmido recombinante que contiene secuencias codificantes de antígenos del VIH-1 que están presentes también en al menos uno de los vectores según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 o según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 que forman parte o constituyen la segunda dosis y/o dosis posteriores de vacunación.
56. Uso según la reivindicación 55 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según la reivindicación 12 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos el plásmido recombinante DNA-B.
57. Uso según la reivindicación 55 en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contiene al menos un vector según la reivindicación 16 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial contiene al menos el plásmido recombinante DNA-C.
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