ES2259603T3

ES2259603T3 - Moleculas para el tratamiento y el diagnostico de tumores.

Info

Publication number: ES2259603T3
Application number: ES00910711T
Authority: ES
Inventors: Roger Ariel Alberto; Pascal Hafliger
Original assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2006-10-16
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: JP2002537360A; ATE325624T1; WO2000050086A1; DE60027873T2; AU3282300A; DK1154798T3; EP1154798A1; EP1154798B1; CA2360419C; DE60027873D1; CA2360419A1

Abstract

Moléculas para el tratamiento o el diagnóstico de tumores y neoplasias malignas, que comprenden un resto intercalante que se coordina con un resto radiactivo [M(CO)3]+, en el que M es un metal que se selecciona entre 99mTc, 186Re, 188Re y Mn, y una biomolécula buscatumores que se une mediante un enlace directo a un sitio de coordinación sobre el metal.

Description

Moléculas para el tratamiento y el diagnóstico de tumores.

La presente invención se refiere a nuevas moléculas para el tratamiento y el diagnóstico de tumores. Además, la invención se refiere a las composiciones terapéuticas que comprenden una o más de estas moléculas y al uso de ambas en el tratamiento y el diagnóstico del cáncer.

El diagnóstico y el tratamiento del cáncer todavía requieren un gran aportación de la industria farmacéutica y química. Aunque se realiza un esfuerzo significativo para desarrollar nuevos tratamientos, todavía existen muchos tipos de tumores para los que no existe ningún tratamiento. Un problema adicional es la formación de micrometástasis, que no se pueden diagnosticar o tratar.

Un problema importante en el tratamiento es la similitud entre las células normales y las células cancerosas. Los tratamientos que interfieren con el desarrollo de las células tumorales también interferirán en el desarrollo de las células sanas. La radioterapia, tal como se conoce actualmente, consiste básicamente en un fuego cruzado arbitrario desde fuera de la célula o desde el citoplasma. Dado que se trata de un tratamiento más bien tosco, las células y los tejidos circundantes también pueden resultar dañados, lo que conlleva efectos secundarios más o menos graves.

Por lo tanto, es muy deseable disponer de una radioterapia y de un método diagnóstico mejores contra el cáncer que utilicen cantidades muy bajas de radionúclidos y que conduzcan a un tratamiento directo contra la célula maligna.

Se sabe que el metabolismo de las células cancerosas difiere del de las células normales. Además, las células cancerosas tienen aumentada la permeabilidad de la membrana en comparación con las células normales, debido a un aumento de la expresión de los receptores de la membrana. El resultado es que las células cancerosas son más permeables a los vectores biológicos, como las proteínas y los péptidos.

La mejor captación de tales vectores biológicos se puede utilizar en el diagnóstico de tumores al unir un radionúclido a una proteína, por ejemplo, mediante la yodación de los grupos tirosina de la proteína o mediante la unión covalente de complejos con metales radiactivos. Estas moléculas combinan una función buscatumores y una función radiactiva. Aunque se han utilizado estos tipos de moléculas para el diagnóstico, todavía no se ha descrito su uso en tratamientos.

El objeto de la presente invención es mejorar más las moléculas anteriormente mencionadas para llegar a un tratamiento mejor confeccionado contra las células malignas.

Este objetivo se logra con la presente invención al proporcionar una molécula que comprende un resto intercalante que está coordinado con un resto [M(CO)_{3}]^{+} radiactivo, donde M es un metal que se selecciona entre ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re y Mn, y una molécula buscatumores que se une mediante un enlace directo a un sitio de coordinación del metal. La molécula se puede dirigir específicamente al tumor mediante la molécula buscatumores y ser internalizada por la célula. Luego, el resto intercalante se insertará en la cadena de ADN e inducirá roturas. Además, el metal radiactivo también conducirá a una rotura de la cadena del ADN. La ventaja de las nuevas moléculas es que se dirigen específicamente contra la célula maligna, que las ingiere.

Preferiblemente, la molécula buscatumores es una biomolécula, como un péptido o una proteína, que se dirige activamente contra la célula del tumor. Ejemplos de estas biomoléculas son las moléculas que se unen al receptor de la somastostatina, de la neurotensina y de la bombesina, anticuerpos monoclonales, penetratinas^{TM} y glucoproteínas, y las moléculas que se unen a los receptores GPIIb/IIIa. Sin embargo, la invención no se limita a estos ejemplos y se aplica de forma más general también a otros agentes buscatumores. Además, esta categoría abarca los compuestos que se conoce que se transportan hacia el interior del núcleo o a la membrana nuclear. Ejemplos de éstos son los oligonucleótidos antisentido, los agentes proliferativos, como la desoxiuridina, y las moléculas pequeñas, como la espermidina.

Preferiblemente, el resto intercalante es una molécula aromática con una afinidad de unión intercalante por el ADN bicatenario. Ejemplos de tales compuestos aromáticos son los compuestos que contienen, a saber, acridina, porfirina, elipticina, fenantrolina, carbazol, bencimidazol o compuestos con actividad citostática conocida (antibióticos) de la clase de las tetraciclinas (antraciclinas), como daunorrubicina, epirrubicina o mixoxantrona, y que se hacen funcionales con ligandos capaces de coordinarse con el resto [M(CO)_{3}]^{+}. Ejemplos de tales ligandos son los mencionados en la patente europea EP-879 606 y, adicionalmente, poliamino-policarboxilatos, fosfatos y fosfonatos, triaminas alifáticas o aromáticas o mezcladas y tionas.

Las funciones intercalante y buscatumores a veces se combinan en moléculas que ya existen. Ejemplos de agentes intercalantes que combinan un resto intercalante y un péptido son la actinomicina y la triostina.

La molécula radiactiva se selecciona entre ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re y Mn. Se utilizan estos núclidos emisores \gamma puros porque sus electrones de conversión de baja amplitud acompañantes conducirán a la escisión de enlaces, que están próximos al núcleo en desintegración. Así, la carga de dosis al paciente se mantiene muy baja.

En la figura 1 se ofrecen combinaciones particularmente adecuadas de las tres funciones.

Además, la invención se refiere al uso de las moléculas en el tratamiento y el diagnóstico y a las composiciones terapéuticas y diagnósticas que comprenden una o más de estas moléculas.

Las composiciones terapéuticas comprenden, al menos, una cantidad adecuada de la molécula en un diluyente o excipiente. Tales composiciones pueden tomar la forma de disoluciones y se administran por vía intravenosa, intraperitoneal o intratecal. Las cantidades adecuadas a administrar dependen de la vía de administración, el radionúclido utilizado y el indicio a tratar o diagnosticar. Las cantidades adecuadas varían entre 10^{-9} y 10^{-1} g por kg de peso corporal.

El experto en la técnica conoce bien los excipientes y los diluyentes para este tipo de medicamento. Sin embargo, las presentes moléculas requieren determinadas condiciones para la estabilidad. Preferiblemente, el excipiente o el diluyente debe ser de naturaleza hidrófila y preferiblemente orgánica.

Para propósitos diagnósticos, la composición consiste en, al menos, una cantidad adecuada de la molécula en un diluyente o excipiente. Los métodos diagnósticos a utilizar con la composición de la invención son la gammagrafía o la resonancia magnética nuclear (RMN).

En la actualidad, se ha encontrado que el método para la síntesis de los carbonilos de Tc y Re del agua descritos en la patente europea EP-879 606 es adecuado para preparar las moléculas de la invención. Con este método, es especialmente posible introducir ligandos intercalantes, que forman complejos muy estables (in vitro e in vivo) con los carbonilos anteriormente mencionados.

Los ligandos reivindicados en la patente europea EP-879 606 y acridina, porfirina, elipticina, fenantrolina, carbazol y bencimidazol estabilizan el resto fac-[Tc(CO)_{3}]^{+} en suero y forman complejos en concentraciones muy bajas. Estos ligandos se pueden unir específicamente a un sitio de las biomoléculas y, posteriormente, marcarse con, a saber, ^{99m}Tc. Ya que el radionúclido está muy cercano al ligando intercalante, su electrón de baja energía penetrará muy bien entre las hebras de ADN e inducirá una rotura de las hebras. Cuando se intercale en uno de los surcos, la probabilidad de alterarlos es muy elevada porque el núcleo está prácticamente rodeado por el ADN.

Las biomoléculas obtenidas de acuerdo con la invención muestran una elevada selectividad y se internalizan. Tal y como se sabe de los intercalantes orgánicos puros, el complejo se va a intercalar en el ADN, en particular cuando la célula se está dividiendo. A diferencia de otros tratamientos, se puede lograr una elevada selectividad con esta combinación.

Si se aplica ^{188}Re como el radionúclido, los daños serán mucho más graves que en el caso del ^{99m}Tc pero, consecuentemente, la cantidad aplicada de la radiactividad será mucho menor que en el caso de radioterapia "normal". Así, se podrían evitar efectos secundarios graves como la toxicidad de la médula ósea.

Además, la presente invención se ilustrará con los ejemplos que siguen y que únicamente pretenden aclarar la invención, pero, de ningún modo, pretenden limitar el alcance de la misma.

En los ejemplos, se hace referencia a las figuras siguientes:

Figura 1: representación esquemática de las moléculas de la invención.

Figura 2: ejemplo de un complejo Tc(I) con este ligando intercalante y una biomolécula potencial unida mediante un enlace directo a otro sitio de coordinación.

Figura 3: representación esquemática del método para preparar las moléculas de la invención.

Figura 4: representación esquemática de tres tipos de estructuras de plásmidos.

Figura 5: gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de los tres tipos I, II y III de ADN (calle izquierda) y un marcador de masa molecular (calle derecha).

Figura 6: gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de una preparación de plásmido tratada con el compuesto [^{99m}Tc(P_{1}) (teta) (CO)_{3}]; el sitio de aplicación de la muestra se encuentra en la parte inferior del gel. La calle 1 es el marcador de masa molecular; la calle 2 es una disolución de referencia que contiene un plásmido superenrollado, relajado (rotura monocatenaria) y linealizado (rotura bicatenaria); la calle 3 es la disolución experimental que contiene tanto el plásmido como el intercalante de la invención, y la calle 4 es la referencia negativa que contiene sólo plásmido.

Figura 7: esquema de la reacción para preparar intercaladores bifuncionales de modelo.

Figura 8: esquema de la reacción para preparar intercaladores trifuncionales de modelo.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de las moléculas de la invención 1. Introducción

Para proporcionar una intercalación potente, el intercalante debe ser preferiblemente plano, heterocíclico y aromático. Además, los grupos colgantes en el intercalante deben estar coordinados de forma estable con el radionúclido (a saber, ^{99m}Tc). En este ejemplo, no es obligatorio que la unidad coordinada deba ser un ligando multidentado con una estabilidad termodinámica elevada, ya que la mayor parte de los complejos con Tc(I) muestran una estabilidad cinética extremadamente alta. Por estas razones y debido a los principios ya conocidos de complejación de varios ligandos mono- y bidentados (sobre todo el ácido picolínico), se seleccionó el ácido 5,6-benzoquinolin-3-carboxílico como intercalante.

La figura 2 describe un ejemplo de un complejo con Tc(I) con este ligando intercalante y una posible biomolécula unida mediante enlace directo a otro sitio de coordinación.

2. Síntesis del intercalador del ejemplo 2.1 3-Ciano-4-benzoil-3,4-dihidrobenzo(f)quinolina 2

Se añadieron 648 \mul (5,58 mmol) de cloruro de benzoílo a un sistema de dos fases de agua/cloruro de metileno durante un periodo de 2 horas. Estas dos capas contienen 500 mg (2,79 mmol) de benzo(f)quinolina en la capa de cloruro de metileno y 545 mg (8,37 mmol) de KCN en agua. Se prosiguió con la agitación durante 6 horas. Se separó la fase orgánica y se lavó con agua, ácido clorhídrico al 5%, agua, una disolución de NaOH al 5% y, de nuevo, con agua. Después del secado sobre sulfato de magnesio, se evaporó la disolución hasta secarla.

La sal de bromuro de este llamado compuesto de Reissert se retrocristalizó desde etanol al 95% para producir la sustancia analíticamente pura. Rendimiento: 612 mg (71%).

2.2 Ácido 5,6-benzoquinolin-3-carbono (P1)

Se añadieron 2 ml de ácido bromhídrico al 48% a 287 mg (0,93 mmol) del compuesto de Reissert disuelto en 2 ml de ácido acético. La disolución se mantuvo con reflujo durante 24 horas, se enfrió y se filtró. Se lavó el producto filtrado con dietiléter, se secó y se retrocristalizó desde metanol para producir 169 mg (0,76 mmol) (82%) del hidrobromuro del intercalante como un sólido amarillo.

2.3 Síntesis macroscópica de los complejos con tecnecio y renio con P1 (ácido 5,6-benzoquinolin-3-carbono) 2.3.1 [NEt_{4}] [ReBr(P1) (CO)_{3}]

Una suspensión de 102 mg (133 \mumol) de [NEt_{4}] [ReBr_{3}(CO)_{3}], 29,7 mg (133 \mumol) de P1 y 116 \mul (226 mmol) de trioctilamina se mantuvieron con reflujo en diclorometano hasta alcanzar una disolución transparente. Después de evaporar la disolución, se extrajo el complejo 5 en THF. Después de la evaporación del THF, se lavó el resto con dietiléter para retirar el bromuro de trioctilamonio. Rendimiento: 63 mg (67%) del complejo amarillo.

2.3.2 [Re(P_{1}) (H_{2}O) (CO)_{3}]

Se mantuvieron con reflujo 200,0 mg (0,26 \mumol) de [NEt_{4}]_{2} [ReBr_{3}(CO)_{3}] en presencia de 29,1 mg del intercalante P1 durante 4 horas en una disolución de tampón MES a 1 M. Luego, se filtró la precipitación amarilla. Rendimiento: 114,2 mg (86%).

2.4 Síntesis microscópica del [^{99m}Tc(H_{2}O) (P_{1}) (CO)_{3}]

Se sintetizaron los complejos ^{99m}Tc en un procedimiento de dos etapas con un eluato generador normal. En una primera etapa, se sintetizó el complejo con un rendimiento superior al 97% de acuerdo con la bibliografía [R. Alberto et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 7987 (1988)]. Luego, se neutralizó la disolución con tampón fosfato en el vial de reacción y se añadió una disolución del correspondiente ligando. La concentración final estuvo entre 10^{-4} y 10^{-5}. Se dejó reposar durante 30 minutos a 75ºC. Se definieron la purificación radioquímica y el rendimiento mediante cromatografía de HPLC y se descubrió que se había formado [^{99m}Tc(HPO_{4}) (P_{1}) (CO)_{3}]^{2} (compuesto 10) con un rendimiento del 80 al 95% (que depende de la concentración del ligando y del tiempo de reacción).

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2.5 Síntesis de las moléculas trifuncionales de modelo de la invención

Éste es un ejemplo de cómo se puede construir una molécula trifuncional. El procedimiento se basa en las técnicas de síntesis conocidas para los correspondientes métodos de acoplamiento. El procedimiento esquemático se suministra en la figura 3.

1. Síntesis de los ligandos bifuncionales, que llevan un intercalante y una funcionalidad de coordinación

Se preparó un ligando bifuncional de acuerdo con la estrategia descrita en la figura 3. La figura 7 muestra el esquema de reacción específico de la reacción que se describe a continuación.

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2-metilquinolina (1)

Se adquirió la 2-metilquinolina (1) a Fluka y se utilizó sin más purificación.

Quinolina-2-carbaldehído (2)

Una mezcla de 5,5 g de dióxido de selenio (49,5 mmol) en 50 ml de dioxano y 2 ml de agua se añadió en pequeñas porciones durante 10 minutos a una disolución en ebullición de 4,4 g (30,7 mmol) de 2-metilquinolina (1) en 20 ml de dioxano. Después de 6 horas de ebullición, se filtró la mezcla de reacción caliente. Se evaporó el filtrado, se disolvió en diclorometano y se filtró a través de Alox. El producto sólido amarillo oscuro obtenido después de la evaporación del disolvente se retrocristalizó desde diclorometano. Rendimiento: 3,76 g (78%).

^{1}H-RMN (DMSO): \delta, 10,12 s, 8,61 d, 8,22 d, 8,12 d, 7,99 d, 7,91 t, 7,79 t.

Compuesto 3a

Se agitó una mezcla de 500 mg de quinolina-2-carbaldehído (2) (3,2 mmol) y 330 mg de N-(2-aminoetil)-acetamida (3,23 mmol) en 15 ml de metanol durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto sólido marrón claro obtenido se utilizó directamente para la siguiente reacción. Rendimiento: \sim770 mg (\sim100%).

^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \delta, 8,57 s, 8,21 d, 8,13 d, 8,10 d, 7,85 d, 7,75 t, 7,59 t.

Compuesto 3b

Se añadió lentamente una disolución de 175 mg (4,62 mmol) de NaBH_{4} en 10 ml de etanol durante 2 horas a una disolución agitada de 500 mg (2,07 mmol) de 3a en 30 ml de etanol a 0ºC. A continuación, se agitó esta mezcla durante una noche a temperatura ambiente. La sustancia sólida obtenida después de la evaporación del disolvente se trituró con una disolución de Na_{2}CO_{3} a 3 M. Luego, se extrajo el producto marrón claro deseado (3b) con diclorometano. Rendimiento: 382 mg (76%).

^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \delta, 8,15 d, 8,05 d, 7,81 d, 7,71 t, 7,54 t, 7,35 d, 6,84 br, 4,21 s, 3,50 q, 3,02 t, 2,02 s.

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Compuesto 3c

Se mantuvo con reflujo una disolución de 200 mg de 3b (0,82 mmol) en 20 ml de HCl a 2 N durante 6 horas. El aceite obtenido después de la evaporación del disolvente se lavó con etanol para producir la sal de hidrocloruro sólida marrón clara deseada 3c. Rendimiento: 203 mg (90%).

^{1}H-RMN (D_{2}O): \delta, 8,40 d, 7,95 t, 7,76 t, 7,59 t, 7,49 d, 4,57 s, 3,46 t, 3,34 t.

N-BOC-dietilentriamina (4)

Una disolución de 500 mg (2,29 mmol) de di-terc-butil dicarbonato [(BOC)_{2}O] en 30 ml de dioxano se añadió lentamente a una disolución de 1,49 ml (1,42 g) (13,74 mmol) de dietilentriamina en 80 ml de dioxano a 10ºC. A continuación, se agitó la mezcla durante 15 horas a temperatura ambiente. Se precipitó el producto deseado como un aceite que, luego, se separó del resto de la disolución, se disolvió en agua, se filtró y se extrajo con diclorometano para obtener finalmente el producto deseado como un aceite amarillo claro. Rendimiento: 260 mg
(56%).

^{1}H-RMN (CDl_{3}): \delta, 5,15 br, 3,25 br, 3,18 t, 2,77 t, 2,69 t, 2,63 t, 1,76 br, 1,41 s, 1,19 t.

Compuesto 5a

Una mezcla de 140 mg de quinolina-2-carbaldehído (2) (0,89 mmol) y 200 mg de N-BOC-dietilentriamina (0,99 mmol) en 30 ml de metanol se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego, el sólido obtenido después de la evaporación del disolvente se lavó con agua para obtener el producto marrón claro deseado. Rendimiento: 304 mg (94%).

^{1}H-RMN (DMSO): \delta, 8,32 d, 7,97 t, 7,73 t, 7,71 d, 7,57 t, 6,65 t, 4,33 s, 3,08 t, 2,97 t, 2,85 t, 1,28 s,
1,09 t.

Compuesto 5b

Una disolución de 41 mg (1,08 mmol) de NaBH_{4} en 10 ml de etanol se añadió lentamente durante 2 horas a una disolución agitada de 148 mg (0,43 mmol) de 5a en 30 ml de etanol a 0ºC. A continuación, se agitó esta mezcla durante una noche a temperatura ambiente. El aceite marrón obtenido después de la evaporación del disolvente se trituró con una disolución de Na_{2}CO_{3} a 3 M. Luego, se extrajo el producto marrón claro deseado (3b) con diclorometano. Rendimiento: 136 mg (92%).

^{1}H-RMN (DMSO): \delta, 8,29 d, 7,94 d, 7,92 d, 7,71 t, 7,61 d, 7,54 t, 6,71 t, 3,95 s, 2,96 q, 2,59 s, 1,33 s,
1,22 t.

Compuesto 5c

Se mantuvo con reflujo una disolución de 100 mg de 5b (0,29 mmol) en HCl a 3 N durante 2 horas. El aceite obtenido después de la evaporación del disolvente se lavó con dietiléter para producir la sal de hidrocloruro sólida marrón clara deseada 5c. Rendimiento: 102 mg (94%).

^{1}H-RMN (D_{2}O): \delta, 8,44 d, 7,95 t, 7,77 t, 7,6 t, 7,51 d, 4,51 s, 3,44 s, 3,34 t, 3,27 t.

2. Síntesis de intercalantes trifuncionales del modelo

Se prepararon intercalantes trifuncionales partiendo de 5a o 3b de la parte 1 anterior. La figura 8 ofrece el esquema de reacción específico.

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1. Alquilación de una amina con el etiléster del ácido bromo-acético

Se agitaron la amina I (figura 7; 547 mg, 2,83 mmol) y la trietilenamina (0,510 ml,3,08 mmol) en metanol (10 ml). Se enfrió la disolución a 0ºC y se añadió bromoacetato de etilo II (0,313 ml, 2,83 mmol) por goteo durante 5 minutos. Después de agitar la disolución a temperatura ambiente durante 18 horas, se retiró el disolvente al vacío. Se disolvió el residuo en diclorometano (50 ml) y se lavó tres veces con agua (20 ml). Las fases acuosas se lavaron dos veces con diclorometano (50 ml). Se secaron las fases orgánicas sobre MgSO_{4}, se filtraron y se retiró el disolvente al vacío para producir III como un aceite amarillo. Rendimiento: 590 mg (2,11 mmol, 74,6%). TLC (sílice, etanol) R_{F} 0,4.

^{1}H RMN (200 MHz, d_{6}-acetona) \delta = 8,44 (m, 1H, picolina), 7,65 (m, 1H, picolina), 7,45 (m, 1H, picolina), 7,21 (m, 1H, picolina), 4,12 (q, 2H, J = 7,2 Hz, CH_{2} éster), 3,94 (s, 2H, CH_{2}), 3,64 (s, 2H, CH_{2}), 3,32 (m, 2H, H-CH_{2}-CH_{2}-N), 2,82 (m, 2H, N-CH_{2}-CH_{2}-N), 1,84 (s, 3H, CH_{3}-CO), 1,21 (t, 3H, J = 7,2 Hz, CH_{3} éster).

2. Desprotección

Se disolvió la amina III (576 mg, 1,94 mmol) en etanol (4 ml) y agua (8 ml). Se añadió NaOH a 2 M (2 ml) y se agitó la disolución a temperatura ambiente durante 1,5 horas. La HPLC analítica mostró un solo pico, lo que indica que el grupo éster estaba escindido cuantitativamente.

Se retiró el disolvente al vacío, se disolvió el residuo en agua (8 ml) y se añadió HCl a 2 N (1 ml) para neutralizar la disolución. Se añadió HCl al 33% (1 ml) y se agitó la mezcla de reacción a 90ºC durante 48 horas. Se añadió NaHCO_{3} para neutralizar la mezcla de reacción, se retiró el disolvente al vacío y se lavó el residuo con etanol. La retirada del disolvente dio el producto desprotegido V como aceite amarillo. Rendimiento: 352 mmol (1,62 mmol, 68,6%).

^{1}H RMN (300 MHz, D_{2}O) \delta = 8,44 (m, 1H, picolina), 7,85 (m, 1H, picolina), 7,45 (m, 1H, picolina), 7,39 (m, 1H, picolina), 3,78 (s, 2H, CH_{2}), 3,35 (m, 2H, N-CH_{2}-CH_{2}-N), 3,22 (s, 2H, CH_{2}), 3,32), 2,79 (m, 2H, N-CH_{2}-CH_{2}-N).

Ejemplo 2 Rotura de la cadena con las moléculas de la invención en un sistema de modelo 1. Introducción 1.1 El uso de plásmidos

Para investigar la capacidad de los complejos intercalantes con ^{99m}Tc para inducir roturas de la cadena de ADN, se utilizaron plásmidos como un sistema de modelo. Los plásmidos son muy adecuados porque los análisis electroforéticos permiten diferenciar entre roturas monocatenarias y bicatenarias. Adicionalmente, se pueden producir grandes cantidades de plásmidos de manera muy sencilla utilizando métodos biológicos celulares.

Un plásmido es una molécula de ADN bicatenario circular, cuyo eje de la doble hélice se puede retorcer en una superhélice. Esta forma de superhélice se describe como tipo I. Este tipo puede aflojar su estructura de superhélice mediante una rotura monocatenaria y, entonces, presentarse como un ADN circular relajado (tipo II). Mediante una rotura bicatenaria de ambos tipos, se creará una forma lineal (tipo III) del plásmido. La figura 4 muestra un ejemplo de la estructura de estos 3 tipos de ADN.

Dado que estos tres tipos de ADN tienen diferentes estructuras, se pueden separar bien gracias a su tamaño y, especialmente, a su forma mediante electroforesis en gel de agarosa. Se deposita la mezcla (tipos I-III después del experimento) a investigar en un gel de agarosa. Luego, se aplicará un voltaje constante y los fragmentos de ADN cargados negativamente migrarán hacia el cátodo. Cuanto mayor sea la forma del fragmento, será más lenta la migración por el gel. El ADN de tipo I (el más compacto) es el que se mueve más rápido, el de tipo II es el más lento. Luego, se añadirá el gel a una disolución que contiene muy poco bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN se hacen visibles mediante la intercalación y la irradiación con luz ultravioleta de 300 nm, que lo ilumina con una fluorescencia de color rojo-anaranjado (590 nm). Este método es tan sensible que se detectan ADN de menos de 5 ng por banda. En la representación fotográfica de los geles de la figura 5, la dirección de la migración es de arriba abajo.

1.2 Producción de los plásmidos

Se ha producido el plásmido Bluescript KS^{TM} de un tamaño de 2958 pares de bases siguiendo el protocolo estándar de la compañía QIAGEN. Normalmente, este plásmido existe en la forma de superhélice (tipo I). Con la enzima de restricción KpnI se puede producir la forma linealizada del ADN plasmídico (tipo III). Mediante la enzima ADNasa I, se puede inducir una rotura monocatenaria que da lugar a una forma circular relajada del plásmido (tipo II). La figura 5, calle derecha, muestra la electroforesis en gel de agarosa de una mezcla de estos tres tipos de ADN. Para la electroforesis, se ha utilizado como referencia un marcador con varios tamaños de piezas de ADN (calle izquierda).

Como se demuestra por las tres bandas de la calle derecha, se separaron claramente los tres tipos de ADN y se pueden distinguir después de la visualización. Se podría detectar fácilmente con este método si los electrones de conversión producen roturas monocatenarias o bicatenarias.

2. Investigación de la capacidad del [^{99m}Tc(P_{1}) (teta) (CO)_{3}] para inducir roturas de las cadenas

Se dejaron reposar 5 \mul de una disolución que contenía aproximadamente 0,3 mCi/ml de [^{99m}Tc(P_{1})(teta)(CO)_{3}] y 100 ng del plásmido de tipo I (\sim3=^{*}10^{-5} M en pares de bases) durante un periodo de 18 horas. Luego, se realizó una electroforesis de esta mezcla y de las tres referencias (figura 6).

Es claramente visible que los plásmidos en la disolución de medición (calle 3) migran más lentamente que en la disolución de referencia. La razón de esta observación es que, probablemente, se induce un pequeño cambio en la estructura de los plásmidos por la intercalación del complejo en la doble cadena. Luego, este cambio en la estructura terciaria del plásmido permitió una mejor intercalación del bromuro de etidio, lo que explica la intensidad más fuerte de la banda de la disolución de muestra.

Además, en la comparación con la disolución de referencia negativa (calle 4), es obvio que aparezcan una o posiblemente dos nuevas bandas (flechas) en la calle de la disolución tratada con el complejo ^{99m}Tc. La mayor intensidad de estas dos bandas corresponde aproximadamente a la posición del tipo II sobre la banda de la disolución de referencia en la calle 2, que contiene los tres tipos. Esto significa que el complejo ha inducido una rotura monocatenaria en el plásmido.

Claims

1. Moléculas para el tratamiento o el diagnóstico de tumores y neoplasias malignas, que comprenden un resto intercalante que se coordina con un resto radiactivo [M(CO)_{3}]^{+}, en el que M es un metal que se selecciona entre ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re y Mn, y una biomolécula buscatumores que se une mediante un enlace directo a un sitio de coordinación sobre el metal.

2. Moléculas de acuerdo con la reivindicación 1, en las que la biomolécula se selecciona del grupo que consiste en moléculas de unión al receptor de la somastostatina, de la neurotensina y de la bombesina, anticuerpos, penetratinas y moléculas que se unen a receptores GPIIb/IIIa.

3. Moléculas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en las que el agente intercalante es una molécula aromática con una afinidad de unión intercalante por el ADN bicatenario.

4. Moléculas de acuerdo con la reivindicación 3, en las que el agente intercalante se selecciona del grupo que consiste en acridina, porfirina, elipticina, fenantrolina, carbazol, bencimidazol o compuestos con actividad citostática conocida (antibióticos) de la clase de las tetraciclinas (antraciclinas), como daunorrubicina, epirrubicina o mixoxantrona.

5. Moléculas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, que tienen la fórmula estructural general que se proporciona en la figura 2.

6. Molécula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, que tienen una cualquiera de las estructuras que se muestran en la figura 1.

7. Moléculas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, para su uso como, o dentro de, agente terapéutico o diagnóstico para tratar o diagnosticar tumores o neoplasias malignas.

8. Uso de moléculas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de un agente terapéutico o diagnóstico para tratar o diagnosticar tumores cancerígenos o neoplasias malignas.

9. Composición terapéutica, que comprende una o más moléculas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6 y uno o más excipientes adecuados.