ES2191575T3 - Un metodo para escrutar sustancias en cuanto a su efecto sobre una translocacion intracelular. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar la translocación intracelular de un componente de procesos intracelulares que afectan a la ruta intracelular, que comprende: (a) cultivar una o más células que contienen una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende un luminófero unido al componente en condiciones que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos, (b) incubar la célula o las células con una sustancia que ha de ser escrutada para la función biológica o el efecto biológico, y (c) medir la luz emitida desde el luminófero en la célula o células incubadas y determinar el resultado o variación con respecto a la luz emitida desde dicho luminófero, siendo tal variación indicativa de la traslocación del componente en dicha célula o células.

Description

Un método para escrutar sustancias en cuanto a su efecto sobre una translocación intracelular.

Campo del invento

El presente invento se refiere a un método y unas herramientas para extraer información cuantitativa en relación con una influencia sobre una respuesta celular, en particular una influencia causada por la puesta en contacto o la incubación de la célula con una sustancia que influye sobre una respuesta celular, en que la respuesta celular se manifiesta en una redistribución de por lo menos un componente en la célula. En particular, el invento se refiere a un método para extraer información cuantitativa en relación con una influencia sobre una ruta intracelular que implica una redistribución de por lo menos un componente asociado con la ruta. El método del invento se puede usar como un procedimiento muy eficiente para ensayar o descubrir la influencia de una sustancia sobre un proceso fisiológico, por ejemplo en conexión con el escrutinio para descubrir nuevos fármacos, el ensayo de sustancias para determinar su toxicidad, la identificación de dianas de fármacos para fármacos conocidos o nuevos. Otros usos valiosos del método y de la tecnología del invento resultarán evidentes para una persona experta sobre la base de la descripción siguiente. En una realización particular del invento, el presente invento se refiere a un método para detectar la translocación o redistribución intracelular de polipéptidos biológicamente activos, preferiblemente de una enzima, que afecta a procesos intracelulares, y a una estructura artificial (construcción) de ADN y a una célula para usarse en el método.

Antecedentes del invento

Las rutas intracelulares son reguladas estrechamente por una cascada de componentes que experimentan modulación de una manera característica en el tiempo y en el espacio. Diversos estados morbosos pueden ser atribuidos a una actividad alterada de componentes individuales de señalización (es decir, cinasas de proteínas, fosfatasas de proteínas, factores de transcripción). Estos componentes se convierten por lo tanto a sí mismos como dianas atractivas para una intervención terapéutica.

Las cinasas y fosfatasas de proteínas son componentes bien descritos de diversas rutas de señalización intracelular. Se supone que la actividad catalítica de las cinasas y fosfatasas de proteínas desempeña un cometido virtualmente en todos los procesos celulares regulables. Aunque la implicación de las cinasas de proteínas en la señalización y regulación celulares se ha sometido a extensos estudios, con frecuencia es difícil obtener un conocimiento detallado acerca, p.ej., de las características de temporización y espaciales exactas de los sucesos de señalización, debido a la falta de una tecnología conveniente.

Se supone que las nuevas maneras de vigilar una modulación específica de rutas intracelulares en células vivas intactas, proporciona nuevas oportunidades en el descubrimiento de fármacos, en las características genómicas funcionales, la toxicología y la vigilancia de pacientes, etc.

Es posible que la orquestación en el espacio de la actividad de las cinasas de proteínas sea esencial para el alto grado de especificidad de cinasas de proteínas individuales. La fosforilación mediada por cinasas de proteínas es equilibrada por una actividad de fosfatasa. También dentro de la familia de las fosfatasas se ha observado una translocación, p.ej. una translocación de PTP2C a frunces de membranas [(Cossette y colaboradores, 1996)], y similarmente es probable que sea indicativa de una actividad de fosfatasa.

Las cinasas de proteínas muestran con frecuencia una distribución intracelular específica antes de, durante y después de la activación. Es por lo tanto probable que una vigilancia de los procesos de translocación y/o de la redistribución de cinasas de proteínas individuales o de subunidades de ellas, sea indicativa de su actividad funcional. Se ha mostrado una conexión entre la translocación y la activación catalítica para cinasas de proteínas tales como la cinasa C de proteínas (PKC, de Protein kinase C), dependiente del diacil-glicerol (DAG), la cinasa A de proteínas (PKA) dependiente de cAMP [(DeBernardi y colaboradores, 1996)] y la cinasa de proteínas Erk-1 activada por mitógenos [(Sano y colaboradores, 1995)].

Los métodos corrientemente usados de detección de la localización intracelular y la actividad de cinasas y fosfatasas de proteínas son la precipitación inmunitaria, la transferencia de borrones Western y la detección inmuno-citoquímica.

Tomando como un ejemplo la familia de las cinasas de proteínas C's (PKC's) dependientes de diacil-glicerol (DAG), se ha mostrado que las isoformas de PKC's individuales, que se distribuyen entre diferentes tejidos y células, tienen diferentes requisitos de activadores y experimentan una translocación diferencial como respuesta a una activación. Las PKC's dependientes de DAG, catalíticamente inactivas, se distribuyen generalmente por todo el citoplasma, mientras que ellas, al ser activadas, se translocan para quedar asociadas con diferentes componentes celulares, p.ej. una membrana plasmática [(Farese, 1992), (Fulop Jr. y colaboradores, 1995)], un núcleo [(Khalil y colaboradores, 1992)] o un citoesqueleto [(Blobe y colaboradores 1996)]. El fenómeno de la translocación, que es indicativo de una activación de PKC, ha sido vigilado usando diferentes enfoques: a) la inmuno-citoquímica en que la localización de isoformas individuales se puede detectar después de permeabilización y fijación de las células [Khalil y colaboradores, 1992)]; y b) la marcación de todas las isoformas de PKC's dependientes de DAG con un acetato-miristato de forbol (PMA, de phorbol myristate acetate) marcado fluorescentemente [(Godson y colaboradores, 1996)]; y c) la marcación química de la PKC b1 con el fluoróforo Cy3 [(Bastiaens & Jovin 1996)]; y d) la marcación genética de la PKC\alpha
[(Schmidt y colaboradores, 1997)] y de las PKC\gamma y PKC\varepsilon ([Sakai y colaboradores 1996]). El primero de los métodos no proporciona ninguna información dinámica mientras que los últimos métodos sí lo hacen. La marcación de las PKC's con miristato-acetato de forbol marcado fluorescentemente no puede distinguir entre diferentes isoformas de PKC's dependientes de DAG, pero que marcará y mostrará el movimiento de todas las isoformas. Las marcaciones químicas y genéticas de las PKC's dependientes de DAG, específicas, confirmaron que ellas, de una manera específica para una isoforma después de su activación, se mueven hacia la periferia o el núcleo de una célula.

En un método alternativo, la actividad de una cinasa A de proteínas ha sido medida en células vivas por marcación química de una de las subunidades de las cinasas (Adams y colaboradores, 1991). La base de la metodología es que la subunidad reguladora y catalítica de la cinasa A de proteínas, purificada, es marcada con fluoresceína y rodamina, respectivamente. A bajos niveles de cAMP, la cinasa A de proteínas se ensambla en una forma hetero-tetrámera que hace posible la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre los dos colorantes fluorescentes. La activación de la cinasa A de proteínas conduce a una disociación del complejo, eliminando con ello la transferencia de energía. Una desventaja de esta tecnología consiste en que la cinasa A de proteínas, marcada, se ha de microinyectar en las células que interesan. Esta técnica muy invasiva es complicada y no es aplicable a un escrutinio a gran escala de sustancias biológicamente activas. Una desventaja adicional de esta técnica, en comparación con el invento que aquí se presenta, consiste en que la cinasa A de proteínas, marcada, no puede ser introducida en organismos o animales como un transgén.

Recientemente, se descubrió que la Proteína Fluorescente Verde (GFP, de Green Fluorescent Protein) expresada en muchos tipos diferentes de células, inclusive células de mamíferos, se volvía muy fluorescente [(Chalfie y colaboradores, 1994)]. El documento de Solicitud de Patente Internacional WO 95/07463 describe una célula capaz de expresar la GFP y un método para detectar una proteína que interesa en una célula basándose en introducir dentro de una célula una molécula de ADN que tiene una secuencia de ADN que codifica la proteína que interesa enlazada a una secuencia de ADN que codifica una GFP, de tal manera que la proteína producida por la molécula de ADN tendrá la proteína que interesa fusionada a la GFP, luego cultivar las células en condiciones que permiten la expresión de la proteína fusionada y detectar la situación de la fluorescencia en la célula, localizando con ello la proteína que interesa en la célula. Sin embargo, no se proporcionan ejemplos de dichas proteínas fusionadas, y no se ha sugerido el uso de proteínas de fusión con GFP para la detección o cuantificación de una translocación o redistribución de polipéptidos biológicamente activos que afectan a procesos intracelulares después de una activación, tales como las proteínas implicadas en rutas de señalización, p.ej. cinasas o fosfatasas de proteínas. El documento WO 95/07463 describe además células que son útiles para la detección de moléculas, tales como hormonas o metales pesados, en una muestra biológica, enlazando operativamente un elemento regulador del gen, que es afectado por la molécula que interesa, con una GFP, la presencia de las moléculas afectará al elemento regulador, que a su vez afectará a la expresión de la GFP. De esta manera, el gen que codifica la GFP es usado como un gen reportero en una célula que está construida para vigilar la presencia de una identidad molecular específica.

La Proteína Fluorescente Verde se ha usado en un análisis para la detección de una translocación del receptor de glucocorticoides (GR, de glucocorticoid receptor) [Carey, KL y colaboradores, The Journal of Cell Biology (La Revista de Biología Celular), volumen 133, n1 5, páginas 985-996 (1996)]. Se ha usado una fusión GR-S65TGFP para estudiar los mecanismos implicados en una translocación del receptor de glucocorticoides (GR) como respuesta al agente agonista dexametasona procedente del citosol, en donde está presente en la ausencia de un ligando, a través del poro nuclear hacia el núcleo, en donde permanece después de la fijación a un ligando. El uso de una fusión GR-GFP hace posible la reproducción en imágenes y la cuantificación en tiempo real de relaciones nucleares y citoplasmáticas de la señal de fluorescencia.

Muchos programas de escrutinio actualmente usados, que están diseñados para encontrar compuestos que afecten a la actividad de una cinasa de proteínas, están basados en mediciones de la fosforilación por la cinasa de substratos artificiales o naturales, la fijación a receptores y/o la expresión de genes reporteros. Sin embargo, Johnson y colaboradores (J. Biol. Chem. 271(40) 24962-24968) han identificado compuestos que inhiben específicamente la translocación de épsilon-PKC inducida por PMA, y muestran la capacidad de este compuesto para antagonizar la inhibición, inducida por PMA, del régimen de contracciones en cardiomiocitos. La translocación de PKC es determinada por localización inmunológica..

Descripción del invento

El presente invento proporciona una importante nueva dimensión en la investigación de sistemas celulares que implican una redistribución, por el hecho de que el invento proporciona una cuantificación de las respuestas o sucesos de redistribución causados/as por una influencia, típicamente un contacto con una sustancia química o una mezcla de sustancias químicas, pero también cambios en el entorno físico. La cuantificación hace posible establecer y ajustar relaciones significantes, expresadas numéricamente, o en forma de curvas o gráficos, entre las influencias (o el grado de las influencias) sobre sistemas celulares y sobre la respuesta a una redistribución. Esto es muy ventajoso puesto que, tal como se ha encontrado, la cuantificación se puede conseguir de una manera a la vez rápida y reproducible y - lo que posiblemente es incluso más importante - los sistemas que se hacen cuantificables utilizando el método del invento son sistemas a partir de los que se pueden obtener enormes cantidades de nueva información y de discernimiento y comprensión.

El presente programa de escrutinio tiene la manifiesta ventaja con relación a otros análisis de escrutinio, p.ej. análisis de fijación a receptores, análisis enzimáticos, y análisis de genes reporteros, de proporcionar un sistema en el que se pueden identificar sustancias biológicamente activas con modos de acción completamente nuevos, p.ej. inhibición o favorecimiento de la redistribución o translocación de un polipéptido biológicamente activo como una manera de regular su acción, en vez de una inhibición o activación de la actividad enzimática, de una manera que asegura una selectividad muy alta para la isoforma particular del polipéptido biológicamente activo y el desarrollo ulterior de la selectividad de un compuesto frente a otras isoformas del mismo polipéptido biológicamente activo o de otros componentes de la misma ruta de señalización.

En su aspecto más amplio, el invento se refiere a un programa de escrutinio que comprende un método para la identificación de una sustancia biológicamente activa que influye directa o indirectamente sobre la translocación de un polipéptido biológicamente activo, siendo el polipéptido biológicamente activo un polipéptido que afecta a procesos intracelulares después de una activación de una ruta de señalización intracelular, siendo la ruta de señalización intracelular los procesos intracelulares coordinados por los que una célula viva transduce una señal interna o externa a la forma de respuestas celulares, implicando la ruta de señalización intracelular una reacción enzimática, comprendiendo el método:

(a)

cultivar una o más células que expresan establemente un ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido que comprende un fluoróforo, codificado por un ácido nucleico, enlazado al polipéptido biológicamente activo o a una parte de éste, en unas condiciones que permiten una expresión de la secuencia de nucleótidos,

(b)

incubar la por lo menos una célula con una sustancia que se ha de escrutar en cuanto a la función biológica o al efecto biológico, y

(c)

medir la luz emitida a partir del fluoróforo en la por lo menos una célula incubada y registrar un resultado o una variación con respecto a dicha luz emitida a partir de dicho fluoróforo, realizándose que dicho resultado o dicha variación es indicativo/a de una translocación del polipéptido biológicamente activo en dicha por lo menos una célula.

Las células

En el invento, la célula y/o las células es(son) mecánicamente intacta(s) y está(n) viva(s) durante todo el experimento. En otra realización del invento, la célula o las células está(n) fijada(s) en un momento después de la aplicación de la influencia, en el que la respuesta ha sido predeterminada como significante, y el registro se hace en un momento posterior arbitrario.

La célula o las células viva(s), mecánicamente intacta(s), se podrían seleccionar entre el grupo que consta de una célula o células fúngica(s), tal como una célula o células de levadura(s); una célula o células de invertebrado(s) inclusive una célula o células de insecto(s); y una célula o células de vertebrado(s), tal(es) como una célula o células de mamífero(s). Esta célula o estas células se incuba(n) a una temperatura de 30ºC o por encima de ésta, preferiblemente a una temperatura de desde 32ºC a 39ºC, más preferiblemente a una temperatura de desde 35ºC a 38ºC, y lo más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37ºC, durante el período de tiempo por el que se observa la influencia. En un aspecto del invento, la célula viva, mecánicamente intacta, es parte de una matriz de células idénticas o no idénticas.

Una célula usada en el presente invento debería expresar establemente una estructura artificial (construcción) de ácido nucleico, que codifique un polipéptido de fusión como aquí se define, y exprese establemente la secuencia codificada por la estructura artificial. La célula es una célula eucariótica seleccionada entre el grupo que consta de células fúngicas, tales como células de levaduras; células de invertebrados inclusive células de insectos; células de vertebrados tales como células de mamíferos. Las células preferidas son las células de mamíferos.

En otro aspecto del invento, las células podrían ser procedentes de un organismo que fuese portador, en al menos una de sus células componentes, de una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido de fusión como aquí se define y exprese establemente dicha secuencia de ácido nucleico. El organismo se selecciona entre el grupo que consta de organismos unicelulares y multicelulares, tales como un mamífero.

El luminóforo

El luminóforo es el componente que permite que la redistribución sea visualizada y/o registrada por emisión de luz en una distribución en el espacio que está relacionada con el grado de la influencia. En una realización del invento, el luminóforo es capaz de ser redistribuido de una manera que es fisiológicamente relevante para el grado de la influencia. En otra realización, el luminóforo es capaz de asociarse con un componente que es capaz de ser redistribuido de una manera que es fisiológicamente relevante para el grado de la influencia. En otra realización, la correlación del luminóforo entre la redistribución del luminóforo y el grado de la influencia se podría determinar experimentalmente. En un aspecto preferido del invento, el luminóforo es capaz de ser redistribuido sustancialmente de la misma manera que el por lo menos un componente de una ruta intracelular. Todavía en otra realización del invento, el luminóforo es capaz de ser sofocado o apagado después de una asociación en el espacio con un componente que es redistribuido por modulación de la ruta, siendo medido el sofocamiento o apagamiento como un cambio en la intensidad de la luminiscencia.

El luminóforo podría ser un fluoróforo. En una realización preferida del invento, el luminóforo podría ser un polipéptido codificado por, y expresado a partir de, una secuencia de nucleótidos albergada en la célula o las células. El luminóforo podría ser un polipéptido híbrido que comprendiese una fusión de por lo menos una porción de cada uno de dos polipéptidos, uno de los cuales comprendiese un polipéptido luminiscente y el otro de los cuales comprendiese un polipéptido biológicamente activo, como aquí se definen.

El polipéptido luminiscente podría ser una GFP como aquí se define, o podría seleccionarse entre el grupo que consta de proteínas fluorescentes verdes que tienen la mutación F64L, como aquí se definen, tales como F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP y EGFP. La GFP se podría aplicar como marca en el extremo terminal de N o de C, opcionalmente a través de un enlazador de péptidos, a un polipéptido biológicamente activo, o a una parte o una subunidad de éste. La sonda fluorescente podría ser un componente de una ruta de señalización intracelular. La sonda es codificada por una estructura artificial (construcción) de ácido nucleico.

La ruta de investigación en el presente invento podría ser una ruta de señalización intracelular.

La influencia

En una realización preferida del invento, la influencia podría ser un contacto entre la célula viva, mecánicamente intacta, o el grupo de células vivas, mecánicamente intactas, con una sustancia química, y/o una incubación de la célula viva, mecánicamente intacta, o del grupo de células vivas, mecánicamente intactas, con una sustancia química. La influencia modulará los procesos intracelulares. En un aspecto, la modulación podría ser una activación de los procesos intracelulares. En otro aspecto, la modulación podría ser una desactivación de los procesos intracelulares. Todavía en otro aspecto, la influencia podría inhibir o favorecer la redistribución sin afectar directamente a la actividad metabólica del componente de los procesos intracelulares.

En una realización, el invento se usa como una base para un programa de escrutinio, en el que el efecto de influencias desconocidas, tales como las de una biblioteca de compuestos, se podría comparar con la influencia de compuestos de referencia conocidos en condiciones normalizadas.

El registro

Además de la intensidad, hay diversos parámetros de fluorescencia o luminiscencia que se pueden modular por el efecto de la influencia sobre los fenómenos celulares subyacentes, y que por lo tanto se pueden usar en el invento. Algunos ejemplos son la transferencia de energía de resonancia, el tiempo de vida de la fluorescencia, la polarización, o el desplazamiento de longitudes de onda. Cada uno de estos métodos requiere una clase particular de filtro en la trayectoria de la luz de emisión para seleccionar el componente de la luz que se desea y rechazar otros componentes. El registro de la propiedad de la luz podría hacerse en la forma de un conjunto ordenado de valores tales como un conjunto de CCD (de Charge Coupled Device = dispositivo acoplado a cargas) o un dispositivo de tubo de vacío tal como un tubo vidicón.

En una realización del invento, la luz distribuida en el espacio, emitida por un luminóforo, se podría detectar por un cambio en la transferencia de energía de resonancia entre el luminóforo y otra entidad luminiscente capaz de suministrar energía al luminóforo, cada uno o cada una de los o las cuales se ha seleccionado o tratado por ingeniería genética para resultar parte de, unida a, o asociada con, componentes particulares de la ruta intracelular. En esta realización, ya sea el luminóforo o la entidad luminiscente capaz de suministrar energía al luminóforo, experimenta una redistribución como respuesta a una influencia. La transferencia de energía de resonancia sería medida como un cambio en la intensidad de emisión procedente del luminóforo, percibida preferiblemente por un único fotodetector de canales, que responde solamente a la intensidad media del luminóforo de una manera no resuelta en el espacio.

En una realización del invento, el registro de la luz distribuida en el espacio se podría hacer en un único momento después de la aplicación de la influencia. En otra realización, el registro podría hacerse en dos momentos, siendo un momento anterior a la aplicación de la influencia y siendo el otro momento posterior a la aplicación de la influencia. El resultado o la variación se determina a partir del cambio en fluorescencia, comparado con la fluorescencia medida antes de la influencia o modulación. En otra realización del invento, el registro se podría realizar en una serie de momentos, en los que la aplicación de la influencia se produce algún tiempo después del primer momento en la serie de registros, realizándose el registro, p.ej., con un espaciamiento en el tiempo previamente determinado de desde 0,1 segundos a 1 hora, preferiblemente desde 1 a 60 segundos, más preferiblemente desde 1 a 30 segundos, en particular desde 1 a 10 segundos, durante un intervalo de tiempo de desde 1 segundo a 12 horas, tal como desde 10 segundos a 12 horas, p.ej., desde 10 segundos a una hora, tal como desde 60 segundos a 30 minutos o 20 minutos. El resultado o la variación se determina a partir del cambio de fluorescencia en el curso del tiempo. El resultado o la variación se podría también determinar como un cambio en la distribución en el espacio de la fluorescencia durante el transcurso del tiempo.

Aparato

El registro de la luminiscencia distribuida en el espacio, emitida a partir del luminóforo, se realiza por un aparato para medir la distribución de la fluorescencia en la célula o las células, y por lo tanto cualquier cambio en la distribución de la fluorescencia en la célula o las células, que incluye como mínimo las siguientes partes componentes: (a) una fuente de luz, (b) un método para seleccionar la o las longitud(es) de onda de la luz procedente de la fuente que excitará la fluorescencia de la proteína, (c) un dispositivo que puede bloquear o dejar pasar rápidamente la luz de excitación hacia el resto del sistema, (d) una serie de elementos ópticos para transportar la luz de excitación a la muestra, recoger la fluorescencia emitida de una manera resuelta en el espacio, y formar una imagen a partir de esta emisión de fluorescencia, (e) un banco o estante que sostiene el recipiente de las células que están siendo medidas en una geometría previamente determinada con respecto a la serie de elementos ópticos, (f) un detector para registrar la fluorescencia resuelta en el espacio en la forma de una imagen, (g) un ordenador o un sistema electrónico y un sistema lógico asociado para adquirir y almacenar las imágenes registradas, y calcular el grado de redistribución a partir de las imágenes registradas.

En una realización preferida del invento, el sistema de aparatos está automatizado. En una realización, los componentes en los apartados d) y e) antes mencionados comprenden un microscopio de fluorescencia. En una realización, el componente en el apartado f) antes mencionado es una cámara de CCD.

En una realización, la imagen es formada y registrada por un sistema de exploración óptica.

En una realización, un sistema de adición de líquidos se usa para añadir un compuesto conocido o desconocido a una cualquiera o a la totalidad de las células en el soporte de células en un momento determinado de antemano. Preferiblemente, el sistema de adición de líquidos está bajo el control del ordenador o sistema electrónico. Dicho sistema automático se podría usar para un programa de escrutinio debido a su capacidad de generar resultados a partir de un número de compuestos de ensayo mayor que el que un operador humano podría generar usando el aparato de una manera manual.

Cuantificación de la influencia

El registro de la variación o del resultado con respecto a la luz emitida a partir del luminóforo se realiza registrando la luz distribuida en el espacio como una o más imágenes digitales, y el tratamiento de la variación registrada, para reducirla a uno o más números representativos del grado de redistribución, comprende un proceso de tratamiento de imágenes digitales o una combinación de procesos de tratamiento de imágenes digitales. La información cuantitativa que es indicativa del grado de la respuesta celular a la influencia o al resultado de la influencia sobre la ruta intracelular, se extrae a partir del registro o de los registros de acuerdo con una calibración previamente determinada, basada en respuestas o resultados, registradas/os de la misma manera, a grados conocidos de una influencia específica relevante. Este proceso de calibración es desarrollado de acuerdo con los principios descritos seguidamente (en Desarrollo de una Técnica de Análisis Basada en Imágenes). Las descripciones específicas de los procesos para análisis particulares se dan en los ejemplos.

Mientras que el proceso escalonado necesario para reducir la imagen o las imágenes al valor representativo que es particular para cada análisis, las operaciones individuales son métodos generalmente bien conocidos de tratamiento de imágenes. Algunos ejemplos de las operaciones individuales son operaciones puntuales tales como resta, establecimiento de relaciones y comparación con un umbral, métodos de filtración digital tales como nivelación, agudización, y detección de aristas, métodos de detección de aristas o bordes, métodos de frecuencia espacial tales como una filtración de Fourier, correlación cruzada entre imágenes y auto-correlación entre imágenes, descubrimiento y clasificación de objetivos (análisis de heterogeneidad en osciloscopio = blob) y manipulaciones en el espacio de los colores para visualización. Además de los procesos algorítmicos, se pueden usar también métodos heurísticos tales como los de redes neuronales.

Estructuras artificiales de ácidos nucleicos

Las estructuras artificiales (construcciones) de ácidos nucleicos, que se usan en el presente invento, codifican en sus secuencias de ácidos nucleicos a polipéptidos de fusión que comprenden un polipéptido biológicamente activo que es un componente de una ruta de señalización intracelular, o una parte de ella, y una GFP, preferiblemente una mutante F64L de GFP, fusionada en el extremo terminal de N o de C, opcionalmente a través de un enlazador de péptidos, con el polipéptido biológicamente activo o una parte de éste.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa o una fosfatasa de proteínas.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es un factor de transcripción o una parte de éste, que cambia la localización celular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una proteína, o una parte de ésta, que está asociada con la red citoesquelética y que cambia de localización celular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa de proteínas, o una parte de ésta, que cambia de localización celular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa de proteínas, serina / treonina, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización intracelular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es un cinasa de proteína, tirosina, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización intracelular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa de proteínas, serina / treonina, dependiente de fosfolípidos, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización intracelular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es un cinasa de proteínas, dependiente de cAMP, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización celular después de su activación. En una realización preferida, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una fusión PKAc-F64L-S65T-GFP.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa de proteínas, dependiente de cGMP, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización celular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa de proteínas, serina / treonina, dependiente de calmodulina, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización celular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa de proteínas, serina / treonina, activada por un mitógeno, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización celular después de su activación. En realizaciones preferidas, el polipéptido biológicamente activo por las estructuras artificiales de ácidos nucleicos, son una fusión ERK1-F64L-S65T-GFP o una fusión EGFP-ERK1.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una cinasa de proteínas, serina / treonina, dependiente de una ciclina, o una parte de ésta capaz de cambiar de localización celular después de su activación.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo codificado por la estructura artificial de ácido nucleico, es una fosfatasa de proteínas, o una parte de ésta, capaz de cambiar de localización celular después de su activación.

En una realización preferida del invento, las estructuras artificiales de ácidos nucleicos pueden ser estructuras artificiales de ADN.

En una realización, el polipéptido biológicamente activo es codificado por la estructura artificial de ácido nucleico. En una realización, el gen que codifica GFP en la estructura artificial de ácido nucleico se deriva de Aequorea victoria. En una realización preferida, el gen que codifica GFP en la estructura artificial de ácido nucleico es EGFP o una variante de GFP seleccionada entre F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP y F64L-S65T-GFP.

En realizaciones preferidas del invento, las estructuras artificiales son las de ADN que se pueden identificar por cualesquiera de las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142 o son variantes de estas secuencias capaces de codificar el mismo polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión que es equivalente biológicamente a éste, p.ej. una isoforma, o una variante por empalme o un homólogo procedente de otras especies.

Programa de escrutinio

El presente invento describe un método que se puede usar para establecer un programa de escrutinio para la identificación de sustancias biológicamente activas que afectan directa o indirectamente a las rutas de señalización intracelulares y que a causa de esta propiedad son potencialmente útiles como medicamentos. Basándose en mediciones en células vivas de la redistribución de la luminiscencia resuelta en el espacio, procedente de luminóforos que experimentan un cambio en la distribución después de la activación o desactivación de una ruta de señalización intracelular, el resultado de la medición individual de cada sustancia que está siendo escrutada indica su actividad biológica potencial.

En una realización del invento, el programa de escrutinio se usa para la identificación de una sustancia biológicamente tóxica, como aquí se define, que ejerce su efecto tóxico interfiriendo con una ruta de señalización intracelular. Basándose en mediciones en células vivas de la redistribución de una luminiscencia resuelta en el espacio, procedente de luminóforos que experimentan un cambio en la distribución después de la activación o desactivación de una ruta de señalización intracelular, el resultado de la medición individual de cada sustancia que está siendo escrutada indica su actividad tóxica biológicamente potencial. En una realización de un programa de escrutinio, se puede encontrar un compuesto que modula a un componente de una ruta intracelular, como aquí se define, y la cantidad terapéutica del compuesto se puede estimar por un método de acuerdo con el método del invento. En una realización preferida, el presente invento conduce al descubrimiento de una nueva manera de tratar una condición o enfermedad relacionada con la función intracelular de un polipéptido biológicamente activo, que comprende la administración a un paciente, que padece de dicha condición o enfermedad, de una cantidad efectiva de un compuesto que se ha descubierto por un método cualquiera de acuerdo con el invento. En otra realización preferida del invento se establece un método para la identificación de una nueva diana de fármaco o de varias nuevas dianas de fármacos entre el grupo de los polipéptidos biológicamente activos que son componentes de rutas de señalización intracelulares.

En otra realización del invento, se establece un régimen de tratamiento individual para el tratamiento selectivo de un paciente seleccionado, que padece de una afección en la que los medicamentos disponibles, usados para el tratamiento de la afección, se ensayan en una célula o en células primaria(s) relevante(s) obtenida(s) de dicho paciente a partir de uno o varios tejidos, usando un método que comprende transfectar la célula o las células con por lo menos una secuencia de ADN que codifica una sonda fluorescente de acuerdo con el invento, transferir la célula o las células transfectada(s) de retorno a dicho paciente, o cultivar la célula o las células en condiciones que permitan la expresión de dichas sondas y exponerla(s) a un conjunto de los medicamentos disponibles, luego comparar los cambios en los modelos de fluorescencia o en los modelos de redistribución de las sondas fluorescentes en la célula o las células viva(s) intacta(s), con el fin de detectar la respuesta celular a los medicamentos específicos (es decir, obtener un perfil de acciones celulares), luego seleccionar un medicamento o varios medicamentos basándose en la actividad deseada y el nivel aceptable de efectos colaterales, y administrar una cantidad eficaz de estos medicamentos al paciente seleccionado.

Retro-seguimiento de una ruta de transducción de señales

El presente invento describe un método que se puede usar para establecer un programa de escrutinio para el retro-seguimiento de las rutas de transducción de señales que aquí se definen. En una realización, el programa de escrutinio se usa para establecer con más exactitud a qué nivel uno o varios compuestos afectan a una ruta específica de transducción de señales, ensayando de modo consecutivo o en paralelo la influencia del compuesto o de los compuestos sobre la redistribución de una luminiscencia resuelta en el espacio a partir de varios de los luminóforos que experimentan un cambio en su distribución después de la activación o desactivación de la ruta de señalización intracelular que se está estudiando.

Construcción y ensayo de las sondas

En general, una sonda, es decir una fusión "GenX"-GFP o una fusión GFP-"GenX", se construye usando una PCR (de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de polimerasa) con cebadores específicos para el "GenX", seguido por una operación de clonación para fusionar el "GenX" dentro del marco con GFP. La fusión puede contener una corta secuencia derivada de un vector entre el "GenX" y la GFP (p.ej. parte de una región de múltiples sitios de clonación en el plásmido), dando como resultado un enlazador de péptidos entre el "GenX" y la GFP en la resultante proteína de fusión.

Proceso escalonado detallado

- Identificación de la secuencia del gen. Ésta se realiza con la máxima facilidad buscando e investigando un depositario de información genética, p.ej. la Base de Datos de Secuencias GenBank, que está ampliamente disponible y es usada rutinariamente por los biólogos moleculares. En los ejemplos específicos que se dan más adelante, se proporciona el número de Acceso al GenBank del gen en cuestión.

- Diseño de cebadores específicos para el gen. La inspección de la secuencia del gen permite el diseño de cebadores específicos para el gen que se han de usar en una reacción PCR. Típicamente, el cebador de hebra superior abarca el codón de iniciación ATG del gen y los alrededor de 20 nucleótidos que le siguen, mientras que el cebador de hebra inferior abarca el codón de detención y los alrededor de 20 nucleótidos que le preceden, si el gen ha de ser fusionado detrás de GFP, es decir una fusión GFP-"GenX". Si el gen ha de ser fusionado delante de GFP, es decir una fusión "GenX"-GFP, se debe de evitar un codón de detención. Opcionalmente, puede no usarse en la fusión la secuencia de plena longitud del GenX, sino meramente la parte que se localiza y redistribuye como el GenX como respuesta a una señal.

Además de secuencias específicas para el gen, los cebadores contienen por lo menos una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción, con el fin de permitir la clonación subsiguiente del producto de la PCR. Los sitios se escogen de manera tal que sean singulares en el producto de la PCR y compatibles con sitios existentes en el vector de clonación. Además, puede ser necesario incluir un número exacto de nucleótidos entre el sitio para la enzima de restricción y la secuencia específica para el gen, con el fin de establecer el cuadro de lectura correcto del gen de fusión y/o una secuencia de consenso para la iniciación de la traducción. Por último, los cebadores siempre contienen unos pocos nucleótidos delante del sitio para la enzima de restricción con el fin de permitir una digestión eficiente con la enzima.

- Identificación de una fuente del gen que se ha de amplificar. Con el fin de que una reacción PCR produzca un producto con cebadores específicos para el gen, la secuencia del gen debe estar presente inicialmente en la reacción, p.ej. en la forma de un ADNc (ADN cromosomal). La información existente en el GenBank o en la bibliografía científica indicará usualmente en qué tejido(s) es expresado el gen, y las bibliotecas (genotecas) de ADNc, procedentes de una gran variedad de tipos de tejidos o células procedentes de diversas especies, están disponibles comercialmente, p.ej. a partir de Clontech (Palo Alto), Stratagene (La Jolla) e Invitrogen (San Diego). Muchos genes también están disponibles en forma clonada a partir de la American Type Tissue Collection [Colección Americana de Tejidos Tipo] (Virginia).

- Optimización de la reacción PCR. Se conoce que varios factores influyen sobre la eficiencia y la especificidad de una reacción PCR, incluyendo la temperatura de reanillamiento de los cebadores, la concentración de iones, particularmente Mg^{2+} y K^{+}, presentes en la reacción, así como el pH de la reacción. Si se estima que el resultado de una reacción PCR es insatisfactorio, esto puede ser debido a que los parámetros antes mencionados no son óptimos. Se deberán ensayar diversas temperaturas de reanillamiento, p.ej. en una máquina para PCR con un gradiente de temperatura incluido, disponible p.ej. de Stratagene (La Jolla), y/o se deberán probar diversas composiciones tamponadoras, p.ej. el sistema tamponador OptiPrime procedente de Stratagene (La Jolla).

- Clonación del producto de la PCR. El vector en el que será clonado y fusionado con la GFP el producto del gen amplificado, ya habrá sido tomado en consideración cuando los cebadores fueron diseñados. Cuando se escoge un vector, se deberá considerar por lo menos en cuáles de los tipos de células será expresada la sonda subsiguientemente, de manera tal que el promotor que controla la expresión de la sonda sea compatible con las células. La mayor parte de los vectores de expresión contienen también uno o más marcadores selectivos, p.ej. que confieren resistencia a un fármaco, la cual es una característica útil cuando se desea producir transfectantes más estables. El marcador selectivo deberá ser también compatible con las células que se hayan de usar.

La clonación real del producto de la PCR no deberá presentar ninguna dificultad, puesto que típicamente será una clonación en una sola etapa de un fragmento digerido con dos diferentes enzimas de restricción dentro de un vector digerido con las mismas dos enzimas. Si la clonación demuestra ser problemática, esto puede ser debido a que las enzimas de restricción no trabajan bien con el fragmento de la PCR. En este caso se podrían añadir prolongaciones más largas al extremo de los cebadores con el fin de solventar una posible dificultad de digestión cerca de un extremo de fragmento, o se podría introducir una operación de clonación intermedia que no estuviera basada en una digestión con enzimas de restricción. Diversas compañías ofrecen sistemas para este enfoque, p.ej. Invitrogen (San Diego) y Clontech (Palo Alto).

Una vez que el gen ha sido clonado y, en el proceso, fusionado con el gen de GFP, el producto resultante, usualmente un plásmido, deberá ser comprobado cuidadosamente para asegurarse de que es tal como se espera. El ensayo más exacto podría consistir en obtener la secuencia de nucleótidos del gen de fusión.

Ensayo de la sonda

Una vez que se ha generado una estructura artificial de ADN para una sonda, se pueden ensayar su funcionalidad y su utilidad sometiéndola a los siguientes ensayos:

- Transfectarla a células capaces de expresar la sonda. La fluorescencia de la célula se inspecciona pronto después de ello, típicamente al día siguiente. En ese momento, se observan dos características de fluorescencia celular: la intensidad y la localización sub-celular.

La intensidad deberá ser usualmente al menos tan fuerte como la de la GFP no fusionada en las células. Si no lo es, la secuencia o la calidad del ADN de sonda puede ser defectuosa, y se deberá comprobar con cuidado.

La localización sub-celular es una indicación de si la sonda es susceptible de comportarse bien. Si ésta se localiza, tal como se espera para el gen en cuestión, p.ej. es excluida del núcleo, puede pasar inmediatamente a ser sometida a un ensayo funcional. Si la sonda no es localizada pronto después del proceso de transfección, esto puede ser debido a una sobreexpresión en este momento, puesto que la célula habrá sido tomada entre muchísimas copias del plásmido, y la localización se desarrollará en un tiempo, p.ej. en el transcurso de unas pocas semanas, en el que disminuyan el número de copias de plásmidos y el nivel de expresión. Si no se produce la localización después de un período de tiempo prolongado, esto puede ser debido a que la fusión con la GFP ha destruido una función de localización, p.ej. ha enmascarado una secuencia de proteína esencial para la interacción con su proteína de anclaje celular normal. En este caso, la fusión opuesta puede trabajar, p.ej. si la de GenX-GFP no trabaja, la de GFP-GenX puede trabajar, puesto que dos partes diferentes del GenX serán afectadas por la proximidad a la GFP. Si ésta no trabaja, la proximidad de la GFP en cualquiera de los extremos puede ser un problema, y se podría intentar el recurso de aumentar la distancia por incorporación de un enlazador más largo entre el GenX y la GFP en la estructura artificial de ADN.

Si no existe un conocimiento previo de la localización, y no se observa la localización, esto puede ser debido a que la sonda no debería ser localizada en este punto, puesto que tal es la naturaleza de la proteína fusionada con la GFP. Entonces, la sonda se debería someter a un ensayo funcional.

En un ensayo funcional, las células que expresan la sonda son tratadas con por lo menos un compuesto que sea conocido por perturbar, usualmente por activación, a la ruta de señalización en la que se espera que la sonda se reporte redistribuyéndose por sí misma dentro de la célula. Si la redistribución es tal como se espera, p.ej. si el conocimiento previo hubiese señalado que ella se había translocado desde el sitio X al sitio Y, se ha pasado el primer ensayo crítico. En este caso se puede pasar a una caracterización y cuantificación ulteriores de la respuesta.

Si no se comporta tal como se espera, esto puede ser debido a que la célula carece de por lo menos un componente de la ruta de señalización, p.ej. un receptor superficial de células, o hay una incompatibilidad entre especies, p.ej. si la sonda se modela sobre una información de secuencias de un producto génico humano, y la célula se origina de un hámster. En ambos casos, se deberán identificar otros tipos de células para el proceso de ensayo en el que estos problemas potenciales no se produjesen.

Si no hay conocimiento previo acerca del modelo de redistribución, el análisis de la redistribución tendrá que hacerse en mayor profundidad para identificar cuáles son las características esenciales e indicativas, y cuando esto se ha puesto en claro, se puede pasar a una caracterización y cuantificación ulteriores de la respuesta. Si no se puede identificar un modelo característico de redistribución, el problema puede ser tal como antes se ha mencionado, y la sonda se deberá volver a ensayar en condiciones celulares más óptimas.

Si la sonda no se comporta en condiciones celulares óptimas se devuelve al panel de diseño.

Desarrollo de una técnica de análisis basada en imágenes

El proceso de desarrollar un análisis de la redistribución basada en imágenes comienza o bien con la observación experimental no planificada de que un fenómeno de redistribución puede ser visualizado, o con el diseño de una sonda para seguir de manera específica un fenómeno de redistribución que ya se conoce como realizado. En cualquier caso, la primera y mejor técnica de exploración consiste en que un científico o técnico entrenado observe el fenómeno. Incluso con los rápidos avances en la técnica de computación en ordenadores, la combinación de los ojos y del cerebro humanos es todavía el sistema más potente conocido de reconocimiento de modelos, y no requiere un conocimiento de antemano del sistema con el fin de detectar modelos potencialmente interesantes y útiles en datos en bruto. Esto es así especialmente si esos datos son presentados en la forma de imágenes, que son los "tipos de datos" naturales para el tratamiento visual humano. Puesto que el tratamiento visual humano funciona de la manera más efectiva en un intervalo de frecuencias relativamente estrecho, es decir, que los seres humanos no podemos observar cambios ni muy rápidos ni muy lentos en nuestro campo visual, puede ser necesario registrar los datos y reproducirlos o bien con dilación en el tiempo o con compresión en el tiempo.

Algunos fenómenos de luminiscencia no pueden ser observados directamente por el ojo humano. Ejemplos de ellos incluyen la polarización y el tiempo de vida de la fluorescencia. Sin embargo, con apropiados filtros o detectores, estas señales se pueden registrar como imágenes o secuencias de imágenes y representar visualmente a los seres humanos de la manera que se acaba de describir. De esta manera, los modelos se pueden detectar y se pueden aplicar los mismos métodos.

Una vez que se ha determinado que la redistribución es un fenómeno reproducible, se generan uno o más conjuntos de datos con la finalidad de desarrollar un proceso para extraer la información cuantitativa a partir de los datos. En paralelo, se determinan las condiciones biológicas y ópticas que proporcionarán los datos en bruto de la mejor calidad para el análisis. Esto puede convertirse en un proceso iterativo; puede ser necesario desarrollar un proceso cuantitativo con el fin de averiguar el efecto sobre el análisis de manipular las condiciones de análisis.

Los conjuntos de datos son examinados por una persona o por varias personas que tengan conocimiento del fenómeno biológico y experiencia en la aplicación de las técnicas de tratamiento de imágenes. La meta de este ejercicio es determinar, o por lo menos proponer, un método que reduzca la imagen. o la secuencia de imágenes que constituyen el registro de una "respuesta", a un valor que corresponda al grado de la respuesta. Usando ya sea un programa lógico de tratamiento interactivo de imágenes o una "caja de herramientas" para tratamiento de imágenes y un lenguaje de programación, el método es codificado como un proceso o algoritmo que toma como su entrada la imagen o las imágenes y genera el grado de respuesta (en cualesquiera unidades) como su salida. Algunos de los criterios para evaluar la validez de un proceso particular son:

\bullet

¿Varía el grado de la respuesta de una manera significativa biológicamente, es decir, éste muestra la dependencia conocida o putativa sobre la concentración del agente o la condición estimulante?

\bullet

¿Es reproducible el grado de la respuesta, es decir que la misma concentración o el mismo nivel del agente o de la condición estimulante da la misma respuesta con una varianza aceptable?

\bullet

¿Es suficiente el alcance dinámico de la respuesta para la finalidad del análisis?. Si no lo es, ¿puede un cambio en el proceso o de uno de sus parámetros mejorar el alcance dinámico?

\bullet

¿Exhibe el proceso cualesquiera "patologías" manifiestas, es decir proporciona valores ridículos para la respuesta si hay imperfecciones que aparezcan corrientemente en el proceso de reproducción en imágenes? ¿Se pueden eliminar, controlar o tomar en cuenta estas patologías?

\bullet

¿Puede el proceso abordar la variación normal en el número y/o en el tamaño de las células en una imagen?.

En algunos casos el método puede ser evidente; en otros, se pueden sugerir automáticamente un cierto número de procesos posibles. Incluso si un método aparece como claramente superior a otros, se puede requerir una optimización de parámetros. Los diversos procesos se aplican al conjunto de datos y se determinan los criterios antes sugeridos, o el proceso singular se aplica repetidamente con ajuste del parámetro o de los parámetros hasta que se llegue a la combinación más satisfactoria de señal, ruido, alcance, etc. Esto es equivalente a la calibración de cualquier tipo de sensor de un único canal.

El número de maneras de extraer un único valor a partir de una imagen es extremadamente grande, y por lo tanto se debe adoptar un enfoque inteligente para la operación inicial de reducir este número a un número finito y pequeño de posibles procesos. Esto no quiere decir que el proceso al que se haya llegado sea necesariamente el proceso óptimo - pero una investigación global en cuanto al proceso óptimo está simplemente fuera de consideración debido al número cabal de posibilidades implicadas.

Los análisis basados en imágenes no son diferentes de otras técnicas de análisis en el hecho de que su utilidad está caracterizada por parámetros tales como la especificidad para el componente deseado de la muestra, el alcance dinámico, la varianza, la sensibilidad, el intervalo de concentraciones en el que el análisis trabajará, y otros parámetros de este tipo. Aunque no es necesario caracterizar todos y cada uno de éstos antes de usar el análisis, ellos representan la única manera de comparar un análisis con otro.

Ejemplo Desarrollo de un análisis cuantitativo acerca de la translocación de GLUT4

La GLUT4 es un miembro de la clase de moléculas transportadoras de glucosa que son importantes en la recogida celular de glucosa. Se conoce translocar a la membrana plasmática en ciertas condiciones de estimulación de la recogida de glucosa. La capacidad de visualizar la respuesta a la recogida de glucosa de una manera no invasiva, sin medir realmente la recogida de glucosa, constituiría un análisis muy útil para cualquiera que buscase, por ejemplo, tratamientos para la diabetes del tipo II.

Una línea de células CHO que expresaba establemente al receptor humano de insulina se usó como la base para una nueva línea celular que expresase establemente una fusión entre GLUT4 y GFP. Se esperaba que esta línea celular mostrase la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática tal como se visualiza por el movimiento de la GFP. La translocación se podría observar de una manera definida en la forma de la aparición de aumentos locales en la fluorescencia en regiones de la membrana plasmática que tenían una forma o un modelo característico. Esto se muestra en la Figura 12.

Estos objetos se conocieron como "marañas" y el fenómeno de su aparición como "enmarañamiento". Con el fin de cuantificar su aparición se ha de encontrar un método con el fin de aislarlos como objetos en el campo de imagen, y luego contarlos, medir su área o determinar algún cierto parámetro acerca de ellos, que se correlacione de una manera dependiente de la dosis con la concentración de insulina a la que las células habían sido expuestas. Con el fin de separar las "marañas", se aplicó un proceso de binarización, en el que una copia de la imagen nivelada con un núcleo gaussiano relativamente severo (sigma = 2,5) se restó de otra copia a la que se había aplicado solamente una nivelación gaussiana relativamente ligera (sigma = 0,5). La imagen resultante se volvió a cambiar de escala a su intervalo mínimo/máximo, y se aplicó un umbral automático para dividir la imagen en dos niveles. La imagen comparada con un umbral contiene un fondo de un valor de objeto totalmente encontrado con otro valor. Los objetos encontrados fueron primeramente filtrados a través de un filtro para eliminar los objetos demasiado grandes y demasiado pequeños para ser "marañas". Los objetos remanentes, que representan "marañas" y otras aberraciones procedentes de la imagen aproximadamente con el mismo tamaño y las mismas características de intensidad que las "marañas", se hacen pasar a un proceso de clasificación que ha sido entrenado previamente con muchas imágenes de "marañas" para reconocer las "marañas" y excluir las otras aberraciones. El resultado de este proceso es una imagen binaria que muestra solamente las "marañas" encontradas en la medida en el que el proceso de clasificación puede identificarlos con exactitud. El área total de las "marañas" se suma luego y este valor es la medida cuantitativa del grado de "enmarañamiento" para esa
imagen.

Definiciones

En la memoria descriptiva y en las reivindicaciones presentes, el término "una influencia" cubre cualquier influencia a la que la respuesta celular comprenda una redistribución. Así, p.ej., las de calentamiento, enfriamiento, alta presión, baja presión, humidificación o desecación, son influencias sobre la respuesta celular en las que se puede cuantificar la redistribución resultante, pero como antes se ha mencionado, posiblemente las influencias más importantes son las influencias de poner en contacto o incubar la célula o las células con sustancias que sean conocidas por, o sospechosas de, ejercer una influencia sobre la respuesta celular que implica una contribución a la redistribución. En otra realización del invento, la influencia podría ser la de sustancias procedentes de una biblioteca de fármacos de compuestos.

En el presente contexto, el término "proteína fluorescente verde" (GFP) está destinado a indicar una proteína que, cuando es expresada por una célula, emite fluorescencia al ser expuesta a una luz con la longitud de onda de excitación correcta (compárese [(Chalfie y colaboradores 1994)]). En lo sucesivo, una GFP en la que uno o más aminoácidos han sido reemplazados, introducidos o suprimidos, se denomina con la máxima frecuencia "GFP modificada". El término "GFP", como se usa aquí, incluye una GFP de tipo salvaje, derivada de la medusa Aequorea victoria, y modificaciones de la GFP, tales como la variante fluorescente azul descrita por Helm y colaboradores (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12501, y otras modificaciones que cambian las propiedades espectrales de la fluorescencia de GFP, o modificaciones que exhiben una fluorescencia aumentada cuando son expresadas en células a una temperatura por encima de 30ºC, como se describe en el documento de PCT/DK96/00051, publicado como WO 97/11094 el 27 de Marzo de 1997 y que se incorpora a la presente por su referencia, y que comprende una proteína fluorescente derivada de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) de Aequorea o cualquier compuesto análogo funcional a ésta, en que el aminoácido situado en posición 1 secuencia arriba desde el cromóforo, ha sido mutado para proporcionar un aumento de la intensidad de fluorescencia cuando la proteína fluorescente del invento es expresada en células. Las variantes preferidas de GFP son F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP y F64L-S65T-GFP. Una variante de GFP especialmente preferida para usarse en todos los aspectos de este invento es la EGFP (el ADN que codifica la EGFP que es una variante F64L-S65T con codones optimizados para su expresión en células de mamíferos, está disponible de Clontech, Palo Alto, acerca de los plásmidos que contienen la secuencia de ADN de la EGFP, compárense los números de acceso al GenBank U55762 y U55763).

Los términos "ruta de señalización intracelular" y "ruta de transducción de señales" están destinados a indicar los procesos intracelulares coordinados con los que una célula viva transduce una señal externa o interna a la forma de respuestas celulares. Dicha transducción de señales implicará una reacción enzimática, dichas enzimas incluyen, pero no están limitadas a, cinasas de proteínas, GTPasas, ATPasas, fosfatasas de proteínas y fosfolipasas. Las respuestas celulares incluyen, pero no están limitadas a, transcripción de genes, secreción, proliferación, actividad mecánica, actividad metabólica y muerte celular.

El término "segundo mensajero" se usa para indicar un componente de bajo peso molecular que está implicado en los sucesos tempranos de rutas de transducción de señales intracelulares.

El término "luminóforo" se usa para indicar una sustancia química que tiene la propiedad de emitir luz ya sea inherentemente o después de una estimulación con medios químicos o físicos. Esto incluye, pero no se limita a, fluorescencia, bioluminiscencia, fosforescencia y quimioluminiscencia.

El término "célula viva, mecánicamente intacta" se usa para indicar una célula que es considerada como viva de acuerdo con los criterios clásicos para ese tipo particular de célula, tales como el mantenimiento del potencial de membrana, del metabolismo de energía y de la capacidad proliferativa normales, y no ha experimentado ningún tipo de tratamiento físicamente invasivo proyectado para introducir sustancias externas en la célula, tal como microinyección.

El término "fisiológicamente relevante", cuando se aplica a una redistribución determinada experimentalmente de un componente intracelular, tal como se mide por el cambio en las propiedades o la distribución de luminiscencia, se usa para indicar que dicha redistribución puede ser explicada en términos del fenómeno biológico no derivado que da lugar a la redistribución.

Los términos "tratamiento de imágenes" y "análisis de imágenes" se usan para describir una gran familia de técnicas para el análisis de datos digitales o una combinación de dichas técnicas, que reducen los conjuntos ordenados de números (imágenes) a una información cuantitativa que describe estos conjuntos ordenados de números. Cuando dichos conjuntos ordenados de números representan valores medidos de un proceso físico, la información cuantitativa obtenida de ellos es por lo tanto una medida del proceso físico.

El término "sonda fluorescente" se usa para indicar un polipéptido de fusión fluorescente que comprende una GFP o cualquier parte funcional de ésta que está fusionada en el extremo terminal de N o de C con un polipéptido biológicamente activo como aquí se define, opcionalmente a través de un enlazador de péptidos que consta de uno o más residuos de aminoácidos, en donde el tamaño del péptido enlazador por sí mismo no es crítico, siempre y cuando que se mantenga la deseada funcionalidad de la sonda fluorescente. Una sonda fluorescente de acuerdo con el invento es expresada en una célula e imita básicamente el comportamiento fisiológico del resto de polipéptido biológicamente activo del polipéptido de fusión.

El término "célula de mamífero" está destinado a indicar cualquier célula viva originada de un mamífero. La célula puede ser una línea celular establecida muchas de las cuales están disponibles de The American Type Culture Collection [La Colección Americana de Cultivos Tipo] (ATCC, Virginia, EE.UU.) o una célula primaria con un intervalo de vida limitado, que se deriva de un tejido de mamífero, inclusive tejidos derivados de un animal transgénico, o una línea celular inmortal recientemente establecida que se derive de un tejido de mamífero, inclusive tejidos transgénicos, o una célula o línea celular híbrida que se obtiene por fusión de diferentes tipos de células originadas de un mamífero, p.ej. líneas celulares de hibridomas. Las células pueden expresar opcionalmente uno o más productos de genes no nativos, p.ej. receptores, enzimas, substratos de enzimas, antes de, o además de, la sonda fluorescente. Las líneas celulares preferidas incluyen, pero no se limitan a, las que tienen origen de fibroblastos, p.ej. BHK, CHO, BALB, o son de origen endotelial, p.ej. HUVEC, BAE (de bovine artery endothelial = endotelial de arteria de bovino), CPAE (de cow pulmonary artery endothelial = endotelial de arteria pulmonar de vaca) o de origen pancreático, p.ej. RIN, INS-1, MIN6, bTC3, aTC6, bTC6, HIT, o de origen hematopoyético, p.ej. con origen en adipocitos, p.ej. 3T3-L1, con origen neuronal o neuroendocrino, p.ej. AtT20, PC12, GH3, con origen en músculos, p.ej. SKMC, A10, C2C12, con origen renal, p.ej. HEK 293, LLC-PK1.

Se pretende que el término "polipéptido híbrido" indique un polipéptido que es una fusión de por lo menos una porción de cada una de dos proteínas, en este caso por lo menos una porción de la proteína fluorescente verde, y de por lo menos una porción de un dominio catalítico y/o regulador de una cinasa de proteínas. Además, se pretende que un polipéptido híbrido indique un polipéptido de fusión que comprende una GFP o por lo menos una porción de la proteína fluorescente verde que contiene un fluoróforo funcional, y por lo menos una porción de un polipéptido biológicamente activo como aquí se define, con la condición de que dicha fusión no sea las PKC\alpha-GFP, PKC\gamma-GFP y PKC\varepsilon-GFP descritas por Schmidt y colaboradores y por Sakai y colaboradores, respectivamente. Por lo tanto, una GFP puede ser aplicada como marca en el extremo terminal de N o C a un polipéptido biológicamente activo, opcionalmente a través de una porción de enlazador o de un péptido enlazador que consta de una secuencia de uno o más aminoácidos. El polipéptido híbrido o el polipéptido de fusión puede actuar como una sonda fluorescente en células vivas intactas que llevan una secuencia de ADN que codifica el polipéptido híbrido en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido híbrido.

El término "cinasa" está destinado a indicar una enzima que es capaz de fosforilar a un componente celular.

El término "cinasa de proteínas" está destinado a indicar una enzima que es capaz de fosforilar a serina y/o treonina y/o tirosina en péptidos y/o proteínas.

El término "fosfatasa" está destinado a indicar una enzima que es capaz de desfosforilar a fosfo-serina y/o fosfo-treonina y/o fosfo-tirosina en péptidos y/o proteínas.

En el presente contexto, el término "polipéptido biológicamente activo" está destinado a indicar un polipéptido que afecta a procesos intracelulares después de su activación, tal como una enzima que es activa en procesos intracelulares, o una porción de ella, que comprende una deseada secuencia de aminoácidos que tiene una función biológica o ejerce un efecto biológico en un sistema celular. En el polipéptido se pueden haber suprimido, introducido o reemplazado uno o varios aminoácidos con el fin de alterar su función biológica, p.ej. haciendo inactivo a un sitio catalítico. Preferiblemente, el polipéptido biológicamente activo se selecciona entre el grupo que consta de proteínas que toman parte en una ruta de señalización intracelular, tales como enzimas implicadas en los procesos de fosforilación y desfosforilación intracelulares, inclusive cinasas, así como cinasas y fosforilasas de proteínas como aquí se definen, pero también las proteínas que constituyen el citoesqueleto desempeñan cometidos importantes en la transducción de señales intracelulares, y por lo tanto se incluyen en el significado de "polipéptido biológicamente activo" que aquí se considera. Más preferiblemente, el polipéptido biológicamente activo es una proteína que, de acuerdo con su estado como activado o no activado, cambia de localización dentro de la célula, preferiblemente como un componente intermedio en una ruta de transducción de señales. Se incluyen en este grupo preferido de polipéptidos biológicamente activos las cinasas A de proteínas dependientes de cAMP.

El término "una sustancia que tiene actividad biológica" está destinado a indicar cualquier muestra que tenga una función biológica o ejerza un efecto biológico en un sistema celular. La muestra puede ser una muestra de un material biológico, tal como una muestra de un fluido corporal inclusive sangre, plasma, saliva, leche, orina, o un extracto microbiano o vegetal, una muestra ambiental que contenga contaminantes inclusive metales pesados o toxinas, o puede ser una muestra que contenga un compuesto o una mezcla de compuestos que se hayan preparado por síntesis orgánicas o técnicas genéticas.

La frase "cualquier cambio en la fluorescencia" significa cualquier cambio en las propiedades de absorción, tales como longitud de onda e intensidad, o cualquier cambio en las propiedades espectrales de la luz emitida, tal como un cambio de longitud de onda, tiempo de vida de la fluorescencia, intensidad o polarización, o cualquier cambio en la localización intracelular del fluoróforo. Éste se puede localizar por lo tanto en un componente celular específico (p.ej. orgánulo, membrana, citoesqueleto o estructura molecular) o se puede distribuir uniformemente por toda la célula o por partes de la célula.

El término "organismo" tal como se usa en el presente contexto, indica cualquier organismo unicelular o multicelular que se origine preferiblemente del reino animal, inclusive protozoos, pero también se incluyen en esta definición organismos que son miembros del reino vegetal tales como algas, hongos, briofitos y plantas vasculares.

El término "ácido nucleico" está destinado a indicar cualquier tipo de secuencia de ácidos poli- u oligo-nucleicos tales como una secuencia de ADN, una secuencia de ADNc o una secuencia de ARN.

El término "biológicamente equivalente", en cuanto que se relaciona con proteínas, está destinado a significar que una primera proteína es equivalente a una segunda proteína si las funciones celulares de las dos proteínas pueden sustituirse unas a otras, p.ej. si las dos proteínas son isoformas relacionadas estrechamente, codificadas por genes diferentes, si son variantes por empalme, o son variantes alélicas derivadas del mismo gen, si éstas desarrollan funciones celulares idénticas en diferentes tipos de células, o en especies diferentes. El término "biológicamente equivalente" en cuanto que se relaciona con un ADN, está destinado a significar que una primera secuencia de ADN que codifica un polipéptido es equivalente a una segunda secuencia de ADN que codifica un polipéptido, si las proteínas funcionales codificadas por los dos genes son biológicamente equivalentes.

La frase "retro-seguimiento de una ruta de transducción de señales" está destinada a indicar un proceso con el fin de definir con mayor exactitud a qué nivel es afectada una ruta de transducción de señales, o bien por la influencia de compuestos químicos o por un estado morboso en un organismo. Se considera una específica ruta de transducción de señales representada por los péptidos bioactivos A - B - C - D, con transducción de señales desde A hacia D. Cuando se investigan todos los componentes de esta ruta de transducción de señales, se puede considerar que los compuestos o estados morbosos, que influyen sobre la actividad o la redistribución solamente de D, actúan sobre C o secuencia abajo de C, mientras que se puede considerar que los compuestos o estados morbosos que influyen sobre la actividad o la redistribución de C y D, pero no sobre la de A y B, actúan secuencia abajo de B.

El término "células fijas" se usa para significar células tratadas con un agente fijador citológico tal como glutaraldehído o formaldehído, cuyos tratamientos sirven para reticular químicamente y estabilizar proteínas solubles e insolubles dentro de la estructura de la célula. Una vez que se encuentran en este estado, dichas proteínas no se pueden perder desde la estructura de la célula, que ahora está muerta.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Células CHO, que expresan la proteína híbrida PKAc-F64L-S65T-GFP, se han tratado en un medio F-12 de HAM con forskolina 50 mM a 37ºC. Las imágenes de la fluorescencia de GFP en estas células se han tomado a diferentes intervalos de tiempo después de un tratamiento, que eran de: a) 40 segundos, b) 60 segundos, c) 70 segundos, d) 80 segundos. La fluorescencia cambia de un punteado a una distribución más uniforme dentro del citoplasma (no nuclear).

Figura 2. Análisis de los intervalos de tiempo de la redistribución de PKAc-F64L-S65T-GFP inducida por forskolina. Células CHO, que expresan la proteína de fusión PKAc-F64L-S65T-GFP, se analizaron por microscopia de fluorescencia a intervalos de tiempo. Se adquirieron micrografías de fluorescencia a intervalos regulares desde 2 min antes de la adición de un agonista hasta 8 min después de esta adición. Las células se estimularon con forskolina 1 mM inmediatamente después de que se hubo adquirido la imagen izquierda superior (t = 0). Se recogieron fotogramas en los siguientes momentos: i) 0, ii) 1, iii) 2, iv) 3, v) 4 y vi) 5 minutos. Barra de escala 10 mm.

Figura 3. Análisis de los intervalos de tiempo de la redistribución de PKAc-F64L-S65T-GFP como respuesta a diversos agentes agonistas. Los efectos de forskolina 1 mM (A), forskolina 50 mM (B), dbcAMP 1 mM (C) e IBMX 100 mM (D) (las adiciones son indicadas por flechas huecas) sobre la localización de la proteína de fusión PKAc-F64L-S65T-GFP se analizaron por microscopía de fluorescencia a intervalos de tiempo de células CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP. El efecto de la adición de forskolina 10 mM (flecha hueca), seguida breve tiempo después por lavado repetido con un tampón (flecha maciza), sobre la localización de la proteína de fusión PKAc-F64L-S65T-GFP, se analizó (E) en las mismas células. En un experimento en paralelo, se analizó (F) el efecto de la adición de forskolina 10 mM e IBMX 100 mM (flecha hueca) seguida por un lavado repetido con un tampón que contenía IBMX 100 mM (flecha maciza). La retirada de la forskolina dio lugar a que la proteína de fusión PKAc-F64L-S65T-GFP volviese a los agregados citoplasmáticos, mientras que esto es impedido por la presencia continuada de IBMX (F). El efecto de glucagón 100 nM (Figura 3G, flecha hueca) sobre la localización de la proteína de fusión PKAc-F64L-S65T-GFP es mostrado también por células BHK/GR, PKAc-F64L-S65T-GFP. El efecto de norepinefrina 10 mM (H), flecha maciza, sobre la localización de la proteína de fusión PKAc-F64L-S65T-GFP, se analizó similarmente en células CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP, transfectadas transitoriamente, previamente tratadas con forskolina 10 mM, flecha hueca, para aumentar la concentración [cAMP]_{i}. Observación: en la Figura 3H el eje de las x cuenta los números de imágenes, transcurriendo 12 segundos entre imágenes. Los datos en bruto de cada experimento constaban de 60 micrografías de fluorescencia adquiridas a intervalos reguladores inclusive varias imágenes adquiridas antes de la adición de un tampón o agente agonista. Los diagramas (A-G) muestran en cada caso una cuantificación de la respuesta observada en la totalidad de las 60 imágenes, realizada tal como se describe en el método de análisis 2. El cambio en el área total de los agregados muy fluorescentes, en relación con el área inicial de los agregados fluorescentes se representa gráficamente como las ordenadas en todos los gráficos en la Figura 3, en función del tiempo para cada experimento. Barra de escala
10 mm.

Figura 4. Curva de respuesta a la dosis (dos experimentos) para la redistribución inducida por forskolina de la fusión PKAc-F64L-S65T-GFP.

Figura 5. Tiempo que transcurre desde la iniciación de una respuesta a una redistribución semimáxima (t_{1/2max}) y máxima (t_{max}) de PKAc-F64L-S65T-GFP. Los datos se extrajeron a partir de curvas tales como la que se muestra en la "Figura 2". Todos los valores t_{1/2max} y t_{max} se dan como media \pm DT [desviación típica] y están basados en un total de 26-30 células procedentes de 2-3 experimentos independientes para cada concentración de forskolina. Puesto que la redistribución observada se mantiene en el curso del tiempo, los valores de t_{max} se tomaron en el momento más temprano en el que se alcanza la redistribución completa. Obsérvese que los valores no se relacionan con el grado de redistribución.

Figura 6. Análisis paralelos de respuesta a las dosis de la elevación de cAMP y la redistribución de PKAc-F64L-S65T-GFP, inducidas por forskolina. Los efectos de un tampón o de 5 concentraciones crecientes de forskolina sobre la localización de la proteína de fusión PKAc-F64L-S65T-GFP en células CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP, que han crecido en una placa de 96 pocillos, se analizaron tal como antes se describe. El cálculo de la relación de las DT's de micrografías de fluorescencia tomadas en el mismo campo de células, antes de, y 30 minutos después de, la adición de forskolina dieron una medida reproducible de la redistribución de PKAc-F64L-S65T-GFP. El gráfico muestra las 48 mediciones individuales y una pista de sus valores de media \pm etm (error típico de la media) con cada concentración de forskolina. Como comparación, los efectos de un tampón o de 8 concentraciones crecientes de forskolina sobre la [cAMP]_{i} se analizó por un análisis de la proximidad de escintilación en células que han crecido en las mismas condiciones. El gráfico muestra una pista de la media \pm etm de 4 experimentos, expresada en unidades
arbitrarias.

Figura 7. Células BHK se transfectaron establemente con el receptor muscarínico humano (hM1) y con la fusión PKCa-F64L-S65T-GFP. El carbacol (100 mM, añadido a 1,0 segundo) indujo una redistribución transitoria de la PKCa-F64L-S65T-GFP desde el citoplasma hacia la membrana plasmática. Las imágenes se tomaron en los siguientes momentos: a) 1 segundo antes de la adición de carbacol, b) 8,8 segundos después de la adición y c) 52,8 segundos después de la adición.

Figura 8. Células BHK, transfectadas establemente con el receptor hM1 y la fusión PKCa-F64L-S65T-GFP, se trataron con carbacol (1 mM, 10 mM, 100 mM). En células individuales, la [Ca^{2+}] intracelular se vigiló simultáneamente con la redistribución de PKCa-F64L-S65T-GFP. La línea de trazos indica los momentos de la adición del carbacol. El panel superior muestra los cambios en la concentración intracelular de Ca^{2+} de células individuales en función del tiempo para cada tratamiento. El panel central muestra los cambios en la fluorescencia de GFP citoplasmática media para células individuales en función del tiempo para cada tratamiento. El panel inferior muestra los cambios en la fluorescencia de la periferia de células individuales, dentro de regiones que incluyen específicamente el borde circunferencial de una célula, como se observa en proyección normal, que son las regiones que ofrecen la óptima oportunidad para vigilar los cambios en la intensidad de fluorescencia de la membrana
plasmática.

Figura 9. a) La fusión hERK1-F64L-S65T-GFP se expresó en células HEK293 tratadas con 100 mM del agente inhibidor de MEK1, PD98059, en F-12 de HAM (sin suero) durante 30 minutos a 37ºC. Los núcleos se vaciaron de fluorescencia durante este tratamiento.

b) Las mismas células que en a) después del tratamiento con 10% de suero de ternero fetal durante 15 minutos a 37ºC.

c) Perfiles de tiempo para la redistribución de la fluorescencia de GFP en células HEK293 después de un tratamiento con diversas concentraciones de EGF en el tampón Hepes (el F-12 de HAM se reemplaza por el tampón Hepes directamente antes del experimento). La redistribución de la fluorescencia se expresa como el cambio en el valor de la relación entre zonas en el núcleo y en el citoplasma de células individuales. Cada perfil de tiempo es la media para los cambios observados en seis células individuales.

d) Diagrama de barras para las mediciones de punto final, a los 600 segundos después del comienzo de los tratamientos con EGF, del cambio de fluorescencia (núcleo: citoplasma) como consecuencia de diversas concentraciones de EGF.

Figura 10

a) La fusión SMAD2-EGFP se expresó en células HEK293 dejadas en ayunas de suero durante una noche en el F-12 de HAM. El F-12 de HAM se reemplazó luego por el tampón Hepes de pH 7,2 inmediatamente antes del experimento. La barra de escala es de 10 mm.

b) Células HEK293 que expresan la fusión SMAD2-EGFP tratadas con las diversas concentraciones de TGF-beta que se indican, y se vigiló la redistribución de la fluorescencia en función del tiempo. Las representaciones gráficas de los perfiles de tiempo representan aumentos en la fluorescencia dentro del núcleo, normalizados a valores iniciales en cada célula medida. Cada pista es el perfil en el tiempo para un único núcleo de célula.

c) Un diagrama de barras que representa el cambio del punto final en la fluorescencia dentro de los núcleos (después de 850 segundos de tratamiento) para diferentes concentraciones de TGF-beta. Cada barra es el valor para un único núcleo en cada tratamiento.

Figura 11. La fusión VASP-F64L-S65T-GFP en células CHO se transfectó establemente con el receptor de insulina humana. Las células se dejaron en ayunas durante dos horas en un F-12 de HAM sin suero, luego se trataron con 10% de suero de ternero fetal. La imagen muestra la redistribución resultante de la fluorescencia después de un tratamiento durante 15 minutos. La fluorescencia de GFP resulta localizada en estructuras identificadas como adhesiones focales a lo largo de la longitud de fibras con estrés por actinas.

Figura 12. Intervalo de tiempo en que se registra la redistribución de GLUT4-GFP en células CHO-HIR. El tiempo indica los minutos después de la adición de insulina 100 nM.

Ejemplo 1 Construcción, ensayo e implementación de un análisis acerca de cAMP basado en la activación por una PKA en tiempo real dentro de células vivas

Son útiles para vigilar la actividad de rutas de señalización que conducen a concentraciones alteradas de cAMP, p.ej. la activación de receptores acoplados a proteínas G, que se acoplan a proteínas G de la clase G_{s} o G_{l}.

La subunidad catalítica de la cinasa de proteínas (PKAc) dependiente de cAMP, murina, se fusionó en el extremo terminal de C a un derivado F64L-S65T de GFP. La fusión resultante (PKAc-F64L-S65T-GFP) se usó para vigilar in vivo la translocación y con ello la activación de la PKA.

Construcción de la fusión PKAc-F64L-S65T-GFP

Se introdujeron sitios convenientes para endonucleasas de restricción en los ADNc's que codifican la PKAc murina (número de acceso al GenBank: M12303) y F64L-S65T-GFP (secuencia descrita en el documento WO 97/11094) mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las reacciones PCR se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos clásicos con los siguientes cebadores:

1

El producto de amplificación de la PKAc se digirió luego con el HindIII+AscI y el producto F64L-S65T-GFP se digirió con AscI+XhoI. Los dos productos de PCR digeridos se ligaron subsiguientemente dentro de un plásmido digerido con HindIII+XhoI (vector de expresión de mamífero pZeoSV7, Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.). La resultante estructura artificial de fusión (SEQ ID NO: 68 & 69) estaba bajo el control del promotor SV40.

Condiciones de transfección y cultivo de células

Células de ovario de hámster chino (CHO, de Chinese Hamster Ovary) se transfectaron con el plásmido que contenía la fusión PKAc-F64L-S65T-GFP usando el método de precipitación con fosfato de calcio en una solución salina tamponada con HEPES (Sambrook y colaboradores, 1989). Se seleccionaron transfectantes estables usando 1.000 mg de Zeocin/ml (Invitrogen) en el medio de crecimiento (DMEM con 1.000 mg de glucosa/l, 10% de suero de bovino fetal (FBS, de Fetal Bovine Serum), 100 mg de una mezcla de penicilina y estreptomicina ml^{-1}, 2 mM de L-glutamina adquirida de Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.). Se usaron como testigo células CHO no transfectadas. Para averiguar el efecto del glucagón sobre la translocación de la proteína de fusión, la fusión PKAc-F64L-S65T-GFP fue expresada establemente en células de riñón de hámster cachorro que sobreexpresan el receptor de glucagón humano (células BHK/GR, de Baby Hamster Kidney/Glucagon Receptor). Se usaron como testigo células BHK/GR no transfectadas. La expresión del GR se mantuvo con 500 mg de G418/ml (marcador Neo) y la de PKAc-F64L-S65T-GFP se mantuvo con 500 mg de Zeocin/ml (marcador Sh ble). Células CHO se co-transfectaron también simultáneamente con vectores que contenían la fusión PKAc-F64L-S65T-GFP y el adrenoceptor a2a humano (hARa2a).

Para efectuar la microscopía de fluorescencia, se dejó que las células se adhiriesen a cubreobjetos provistos de cámaras Lab-Tek (Nalge Nunc Int., Naperville, IL. EE.UU.) durante al menos 24 horas y se cultivaron a una confluencia de aproximadamente 80%. Antes de los experimentos, las células se cultivaron durante una noche sin presión de selección en el medio F-12 de HAM con glutamax (Life Technologies), 100 mg de una mezcla de penicilina y estreptomicina ml^{-1} y 0,3% de FBS. Este medio tenía una baja auto-fluorescencia que hacía posible la microscopia por fluorescencia de células directamente desde la incubadora.

Vigilancia de la actividad de actividad de PKA en tiempo real

Las adquisiciones de imágenes de células vivas se recogieron usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert 135M equipado con un objetivo en inmersión en aceite Fluar 40X, NA: 1,3 y acoplado a una cámara de dispositivo acoplado por cargas (CCD) Photometrics CH250. Las células fueron iluminadas con una lámpara de arco HBO de 100 W. En la trayectoria de la luz había un filtro de excitación a 470 \pm 20 nm, un espejo dicroico a 510 nm y un filtro de emisión a 515 \pm 15 nm para el fondo de imagen mínima. Las células se mantuvieron y vigilaron para que estuviesen a 37ºC con un calentador en etapas hecho por encargo.

Las imágenes se trataron y analizaron de la siguiente manera:

Método 1

Proceso escalonado para la cuantificación de la translocación de PKA

1. La imagen se corrigió para corriente oscura realizando una resta de pixel por pixel de una imagen oscura (una imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real, excepto que el obturador de la cámara no se dejó abrir).

2. La imagen se corrigió en cuanto a falta de uniformidad de la iluminación realizando una relación de pixel por pixel con una imagen de corrección en campo liso (es decir, una imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real de una muestra uniformemente fluorescente).

3. Se calculó el histograma de imagen, es decir la frecuencia de aparición de cada valor de intensidad de la imagen.

4. Se calculó una segunda derivada suavizada del histograma y se determinó el segundo cero. Este cero corresponde al punto de inflexión del histograma en el lado alto del pico principal que representa la cantidad principal de los valores de pixeles de imagen.

5. El valor determinado en la operación 4 se restó de la imagen. Se desecharon todos los valores negativos.

6. Se determinó la varianza (cuadrado de la desviación típica) de los remanentes valores de pixeles. Este valor representa la "respuesta" para esa imagen.

7. Análisis de la proximidad de escintilación (SPA, de Scintillation Proximity Assay) para la cuantificación independiente de cAMP.

Método 2

Método alternativo para la cuantificación de la redistribución de PKA

1. Los agregados fluorescentes son segmentados a partir de cada imagen usando un umbral encontrado automáticamente, basado en la maximización de la medida de información entre el objeto y el fondo. La entropía a priori del histograma de imagen se usa como la medida de información.

2. El área de cada imagen ocupada por los agregados se calcula contando los pixeles en las zonas segmentadas.

3. El valor obtenido en la operación 2 para cada imagen en una serie, o un par en tratamiento, se normaliza para el valor encontrado para la primera imagen (no estimulada) recogida. Un valor de cero (0) indica ninguna redistribución de fluorescencia desde la condición de partida. Un valor de uno (1) obtenido por este método es igual a la redistribución completa.

Las células se cultivaron en un medio F-12 de HAM como antes se describe, pero en placas de 96 pocillos. El medio se intercambió con un tampón Ca^{2+}-HEPES que incluía IBMX 100 mM y las células se estimularon con concentraciones diferentes de forskolina durante 10 min. Las reacciones se detuvieron con la adición de NaOH a 0,14 M y se midió la cantidad de cAMP producido con el estuche cAMP-SPA kit, RPA538 (Amersham) tal como se describe por el fabricante.

Manipulación de los niveles intracelulares de cAMP para ensayar la fusión PKAc-F64L-S65T-GFP

Se usaron los siguientes compuestos para hacer variar los niveles de cAMP: forskolina, que es un agente activador de la adenilato-ciclasa; dbcAMP, que es un compuesto análogo a cAMP permeable a membranas que no es degradado por fosfodiesterasas; IBMX, que es un agente inhibidor de fosfodiesterasas.

Las células CHO que expresan establemente la PKAc-F64L-S65T-GFP, mostraron una espectacular translocación de la proteína de fusión desde una distribución punteada a una distribución uniforme por todo el citoplasma después de una estimulación con forskolina 1 mM (n=3), forskolina 10 mM (n=4) y forskolina 50 mM (n=4) (Figura 1), o con dbcAMP a 1 mM (n=6).

La Figura 2 muestra la progresión de la respuesta en el curso del tiempo después de un tratamiento con forskolina 1 mM.

La Figura 3 presenta una comparación de los perfiles temporales medios de la redistribución de una proteína de fusión y una medida de la extensión de cada respuesta a las tres concentraciones de forskolina (Figuras 3A, E, B), y a la dbcAMP 1 mM (Figura 3C) que causó una respuesta similar pero más lenta, y a la adición de IBMX 100 mM (n=4, Figura 3D) que causó también una respuesta lenta, incluso en la ausencia de estimulación por adenilato-ciclasa. La adición de un tampón (n=2) no tuvo ningún efecto (no se muestran datos).

Como un testigo para el comportamiento de la proteína de fusión, se expresó F64L-F65T-GFP a solas en células CHO y a éstas se les añadió también forskolina 50 mM (n=5); la característica de distribución difusa uniforme de GFP en estas células no fue afectada por dicho tratamiento (datos no mostrados).

La translocación de PKAc-F64L-S65T-GFP inducida por forskolina mostró una cierta relación de respuesta a dosis (Figuras 4 y 6), véanse los procesos cuantitativos anteriores.

Reversibilidad de la translocación de PKAc-F64L-S65T-GFP

La liberación de la sonda de PKAc a partir de sus "puntos calientes" (de valores grandes) de anclaje citoplasmático era reversible. El recurso de lavar repetidamente las células (5-8 veces) con un tampón después del tratamiento con forskolina 10 \muM restauró completamente el modelo punteado en el transcurso de 2-5 min (n=2, Figura 3E). De hecho, la proteína de fusión volvió a un modelo de agregados citoplasmáticos fluorescentes que era indistinguible virtualmente del observada antes de la estimulación con forskolina.

Para ensayar si el retorno de la proteína de fusión a los agregados citoplasmáticos reflejaba una [cAMP]_{i} disminuida, las células se trataron con una combinación de forskolina 10 mM e IBMX 100 mM (n=2) y luego se lavaron repetidamente (5-8 veces) con un tampón que contenía IBMX 100 mM (Figura 3F). En estos experimentos, la proteína de fusión no vuelve a su localización de antes de la estimulación después de la eliminación de forskolina.

Ensayo de la sonda de PKA-F64L-S65T-GFP con agentes fisiológicamente relevantes

Para ensayar la respuesta de la sonda a la activación por receptores de la adenilato-ciclasa, células BHK transfectadas establemente con el receptor de glucagón y la sonda de PKA-F64L-S65T-GFP, se expusieron a estimulación con glucagón. El receptor de glucagón se acopla a una proteína G_{s} que activa a la adenilato-ciclasa, aumentando con ello el nivel de cAMP. En estas células. la adición de glucagón 100 nM (n=2) causó la liberación de la sonda de PKA-F64L-S65T-GFP a partir de los agregados citoplasmáticos y una translocación resultante de la proteína de fusión a una distribución citoplasmática más uniforme en el transcurso de 2-3 min (Figura 3G). Se observaron efectos similares, pero menos pronunciados, a menores concentraciones de glucagón (n=2), datos no mostrados. La adición de un tampón (n=2) no tenía ningún efecto en el transcurso del tiempo (datos no mostrados).

Células CHO transfectadas transitoriamente, que expresaban hARa2a, y la sonda de PKA-F64L-S65T-GFP se trataron con forskolina 10 mM durante 7,5 minutos, y luego, en la presencia continuada de forskolina, se expusieron a norepinefrina 10 mM para estimular a los adrenorreceptores exógenos que se acoplan a una proteína G_{i}, que inhibe a la adenilato-ciclasa. Este tratamiento condujo a la aparición renovada de fluorescencia en los agregados citoplasmáticos, que es indicativa de una disminución en la [cAMP]_{i} (Figura 3H).

Translocación de la proteína de fusión correlacionada con la [cAMP]_{i}

Como antes se describe, el tiempo que se necesitó para que una respuesta pasase a completarse era dependiente de la dosis de forskolina (Figura 5). Además, el grado de respuestas era también dependiente de la dosis. Para ensayar la translocación de la proteína de fusión PKA-F64L-S65T-GFP en un sistema de caudal semi-alto, células CHO transfectadas establemente con la fusión PKA-F64L-S65T-GFP se estimularon con un tampón y con 5 dosis crecientes de forskolina (n=8). Usando el algoritmo de análisis de imágenes antes descrito (Método 1), se observó una relación de respuesta a dosis en el intervalo de 0,01-50 mM de forskolina (Figura 6). Se observó una estimulación semimáxima con aproximadamente 2 mM de forskolina. En paralelo, las células se estimularon con un tampón y con 8 concentraciones crecientes de forskolina (n=4) en el intervalo de 0,01-50 mM. La cantidad producida de cAMP se midió en un análisis por SPA. Se observó un aumento pronunciado en unas concentraciones de forskolina entre 1 y 5 mM, coincidente con la parte más pronunciada de la curva para la translocación de la proteína de fusión (véase también la Figura 6).

Ejemplo 2 Cuantificación de la redistribución en tiempo real dentro de células vivas

Sonda para la detección de la actividad de PKC en tiempo real dentro de células vivas:

Construcción de la fusión PKC-GFP

La sonda se construyó ligando dos productos de amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) tratados con enzimas de restricción del ADNc, para PKC\alpha murina (número de acceso al GenBank: M25811) y F64L-S65T-GFP (secuencia descrita en el documento WO 97/11094) respectivamente. Se usaron para la PCR una polimerasa Taq® y los siguientes cebadores de oligonucleótidos:

2

La hebra de ADN híbrido se insertó dentro del vector de expresión de mamífero pZeoSV7 como una casete para HindIII-XhoI como se describe en el Ejemplo 1.

Cultivo de células

Células BHK que expresan el receptor M1 humano bajo el control del promotor de metalotioneína inducible, y mantenidas con el marcador dihidrofolato-reductasa, se transfectaron con la sonda de PKC\alpha-F64L-S65T-GFP usando el método de precipitación con fosfato de calcio en una solución salina tamponada con HEPES (HBS [pH 7,10]). Se seleccionaron los transfectantes estables usando 1.000 \mug Zeocin®/ml en el medio de crecimiento (DMEM con 1.000 mg de glucosa/l, 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 mg de una mezcla de penicilina y estreptomicina ml^{-1}, e I-glutamina 2 mM). El receptor hM1 y la proteína de fusión PKC\alpha-F64L-S65T-GFP se mantuvieron con metotrexato 500 nM y con 500 \mug de Zeocin®/ml respectivamente. 24 horas antes de cualquier experimento, las células se transfirieron al medio F-12 de HAM con glutamax, 100 \mug de una mezcla de penicilina y estreptomicina ml^{-1} y 0,3% de FBS. Este medio alivia la presión de selección, proporciona una baja inducción de rutas de transducción de señales y tiene una baja auto-fluorescencia a la longitud de onda relevante, que hace posible la microscopía por fluorescencia de células directamente desde la incubadora.

Vigilancia de la actividad de PKC en tiempo real

Imágenes digitales de células vivas se recogieron usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert 135M equipado con un objetivo en inmersión en aceite 40X, NA: 1,3 y acoplado a una cámara de dispositivo acoplado por cargas (CCD) Photometrics CH250. Las células se iluminaron con una lámpara de arco de 100 W. En la trayectoria de luz había un filtro de excitación a 470 \pm 20 nm, un espejo dicroico a 510 nm y un filtro de emisión a 515 \pm 15 nm para un fondo de imagen mínima. Las células se mantuvieron y vigilaron para que estuviesen a 37ºC con un calentador en etapas hecho por encargo.

Las imágenes se analizaron usando el paquete de programas lógicos software IPLab para Macintosh.

Después de estimulación con carbacol de las células M1-BHK que expresan establemente la fusión PKC\alpha-F64L-S65T-GFP los autores del invento hemos observado una translocación transitoria dependiente de la dosis desde el citoplasma a la membrana plasmática (Figuras 7a, b, c). La medición simultánea de la concentración de calcio libre citosólico muestra que la movilización del calcio inducida por carbacol precede a la translocación (Figura 8).

Proceso escalonado para la cuantificación de la translocación de PKC

1. La imagen se corrigió para corriente oscura realizando una resta de pixel por pixel de una imagen oscura (una imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real, excepto que el obturador de la cámara no se dejó abrir).

2. La imagen se corrigió en cuanto a falta de uniformidad de la iluminación realizando una relación de pixel por pixel con una imagen de corrección en campo liso (es decir, una imagen tomada en las mismas condiciones que la imagen real de una muestra uniformemente fluorescente).

3. Se hizo una copia de la imagen en la que los bordes se identifican. Los bordes de la imagen son encontrados por un proceso clásico de detección de los bordes - convolucionando la imagen con un núcleo que elimina cualesquiera componentes que no cambian a gran escala (es decir, el fondo) y acentúa cualesquiera cambios a pequeña escala (es decir, los bordes nítidos). Esta imagen se convirtió luego en una imagen binaria por comparación con un umbral. Los objetos existentes en la imagen binaria, que son demasiado pequeños para representar los bordes de células, se desecharon. Una dilatación de la imagen binaria se realizó para cerrar cualesquiera intersticios en los bordes de imágenes. Cualesquiera objetos de bordes en la imagen que estaban en contacto con los rebordes de la imagen se desechan. Esta imagen binaria representa la máscara de borde.

4. Se hizo otra copia de imagen por medio del procedimiento expuesto en la etapa 3. Esta copia se trató adicionalmente para detectar objetos que encierran "agujeros" y ajustando todos los pixeles dentro de los agujeros al valor binario del borde, es decir uno. Esta imagen representa la máscara de célula entera.

5. La imagen original se enmascaró con la máscara de borde procedente de la operación 3 y se determinó la suma total de todos los valores de pixeles.

6. La imagen original se enmascaró con la máscara de célula entera procedente de la operación 4 y se determinó la suma total de todos los valores de pixeles.

7. El valor procedente de la operación 5 se dividió por el valor procedente de la operación 6 para dar el resultado final, a saber la fracción de la intensidad de fluorescencia en las células que se localizó en los bordes.

Ejemplo 3 Sondas para la detección de la redistribución de la cinasa de proteínas Erk1 activadas por mitógenos

Son útiles para vigilar rutas de señalización que implican a una MAPK, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La Erk1, que es una cinasa de proteínas, de serina/treonina, es un componente de una ruta de señalización que es activada p.ej. por muchos factores de crecimiento.

Sondas para la detección de la actividad de ERK-1 en tiempo real dentro de células vivas

La cinasa regulada por señales extracelulares (ERK-1, de Extracellular signal Regulated Kinase, una cinasa de proteínas activada por mitógenos, MAPK, de Mitogen Activated Protein Kinase) se fusiona en el extremo terminal de N o C a un derivado de GFP. Las fusiones resultantes expresadas en diferentes células de mamífero se usan para vigilar in vivo la translocación nuclear, y de este modo la activación de ERK1 en respuesta a estímulos que activan la ruta de MAPK.

a) Construcción de la fusión ERK1-F64L-S65T-GFP de murino

Convenientes sitios de restricción con endonucleasas se introducen en los ADNc's que codifican ERK1 de murino (número de acceso al GenBank: Z14249) y F64L-S65T-GFP (secuencia descrita en el documento WO 97/11094) por una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las reacciones PCR se realizan de acuerdo con protocolos clásicos con los siguientes cebadores:

3

Para generar la fusión mERK1-F64L-S65T-GFP (SEQ ID NO: 56 & 57), el producto de la amplificación de ERK1 se digiere con HindIII+AscI y el producto F64L-S65T-GFP se digiere con AscI+XhoI. Para generar la fusión F64L-S65T-GFP-mERK1, el producto de amplificación de ERK1 se digiere luego con HindIII+Bsu36I y el producto F64L-S65T-GFP se digiere con Bsu36I+XhoI. Los dos pares de productos de PCR digeridos se ligan subsiguientemente dentro de un plásmido digerido con HindIII+XhoI (vector de expresión de mamífero pZeoSV7, Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.). Las resultantes estructuras artificiales de fusión están bajo el control del promotor de SV40.

b) El gen de Erk1 humano (número de acceso al GenBank: X60188) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos normalizados, con los cebadores Erk1-superior (SEQ ID NO: 9) y Erk1-inferior/+detención (SEQ ID NO: 10). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-Erk1 (SEQ ID NO: 38 & 39) bajo el control de un promotor de CMV (citomegalovirus).

El plásmido que contiene la fusión EGFP-Erk1 se transfectó dentro de células HEK293 empleando el reactivo para transfección FUGENE (de Boehringer Mannheim). Antes de los experimentos, las células se hicieron crecer a una confluencia de 80%-90% en cámaras de 8 pocillos en un medio DMEM con 10% de FCS. Las células se lavaron en el medio F-12 de HAM puro (sin FCS) y luego se incubaron durante 30-60 minutos en el medio F-12 de HAM (sin FCS) puro con PD98059 100 micromolar, que es un agente inhibidor de MEK1, una cinasa que activa a la Erk1; esta operación vacía de manera efectiva al núcleo de EGFP-Erk1. Justamente antes de comenzar el experimento, el F-12 de HAM se reemplazó con el tampón Hepes a continuación de un lavado con el tampón Hepes. Esto elimina al agente inhibidor PD98059; si todavía se desea un bloqueo de MEK1 (p.ej. en experimentos testigos) el agente inhibidor es incluido en el tampón Hepes.

El ajuste experimental del microscopio era tal como se describe en el Ejemplo 1.

Se recogieron 60 imágenes con 10 segundos entre cada una, y añadiéndose el compuesto de ensayo después de la imagen número 10.

La adición de EGF (1-100 nM) causó en el transcurso de unos pocos minutos una redistribución de EGFP-Erk1 desde el citoplasma al núcleo (Figuras 9a, b).

La respuesta se cuantificó tal como se describe seguidamente y se encontró una relación dependiente de la dosis entre la concentración de EGF y la translocación nuclear de EGFP-Erk1 (Figuras 9c, d). La redistribución de la fluorescencia de GFP es expresada en este ejemplo como el cambio en el valor de la relación entre zonas en compartimientos nucleares frente a zonas en compartimientos citoplasmáticos de la célula. Cada perfil de tiempo es la media de las relaciones de nucleares a citoplasmáticos de seis células en cada tratamiento.

Ejemplo 4 Sondas para la detección de la redistribución de Erk2

Son útiles para vigilar las rutas de señalización que implican a la MAPK, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La Erk2, que es una cinasa de proteínas, serina / treonina, está estrechamente relacionada con la Erk1 pero no es idéntica; es un componente de una ruta de señalización que es activada p.ej. por muchos factores de crecimiento.

a) El gen de Erk2 de rata (número de acceso al GenBank: M64300) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Erk2-superior (SEQ ID NO: 11) y Erk2-inferior / +detención (SEQ ID NO: 13). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-Erk2 (SEQ ID NO: 40 & 41) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de Erk2 de rata (número de acceso al GenBank: M64300) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Erk2-superior (SEQ ID NO: 11) y Erk2-inferior / -detención (SEQ ID NO: 12). El producto de la PCR se digirió con enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión Erk2-EGFO (SEQ ID NO: 58 & 59) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectaron dentro de células CHO y células BHK. Las células se hicieron crecer en condiciones normalizadas. Antes de los experimentos, las células se dejaron en ayunas en medios sin suero durante 48-72 horas. Esto condujo a una localización predominantemente citoplasmática de ambas sondas, especialmente en células BHK. Se añadió suero de ternero fetal al 10% a las células y se registró la fluorescencia de las células tal como se explica en el Ejemplo 3. La adición del suero hizo que las muestras se redistribuyesen dentro del núcleo en el transcurso de unos pocos minutos desde la adición del suero.

Ejemplo 5 Sondas para la detección de la redistribución de Smad2

Son útiles para vigilar las rutas de señalización activadas por algunos miembros de la familia de factor de crecimiento en transformación - beta, p.ej. para identificar los compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

\newpage

El Smad2, que es un transductor de señales, es un componente de una ruta de señalización que es inducido por algunos miembros de la familia TGFbeta de citocinas.

a) El gen de Smad2 humano (número de acceso al GenBank: AF027964) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Smad2-superior (SEQ ID NO: 24) y Smad2-inferior / +detención (SEQ ID NO: 26). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y Acc65I, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech; Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y Acc65I. Esto produce una fusión EGFP-Smad2 (SED ID NO: 50 & 51) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de Smad2 humano (número de acceso al GenBank: AF027964) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Smad2- superior (SEQ ID NO: 24) y Smad2-inferior / -detención (SEQ ID NO: 25). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y Acc65I, y se ligó dentro de pEGFP:N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y Acc65I. Esto produce una fusión Smad2-EGFP (SEQ ID NO: 74 & 75) bajo el control de un promotor de CMV.

El plásmido que contenía la fusión EGFP-Smad2 se transfectó dentro de células HEK293, en donde mostró una distribución citoplasmática. Antes de los experimentos, las células se hicieron crecer en cámaras Nunc de 8 pocillos en un medio de DMEM con 10% de FCS a una confluencia de 80% y se dejaron en ayunas durante una noche en el medio F-12 de HAM sin FCS.

Para los experimentos, el medio F-12 de HAM se reemplazó con el tampón Hepes de pH 7,2.

El ajuste experimental del microscopio fue tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Se recogieron 90 imágenes con 10 segundos entre cada una, y añadiéndose el compuesto de ensayo después de la imagen número 5.

Después del ayuno sin suero de las células, cada núcleo contiene menos fluorescencia de GFP que el citoplasma circundante (Figura 10a). La adición de TGFbeta causó en el transcurso de unos pocos minutos una redistribución de la EGFP-Smad2 desde el citoplasma al núcleo (Figura 10b).

La redistribución de fluorescencia dentro de las células tratadas se cuantificó simplemente como el aumento fraccionario en la fluorescencia nuclear normalizado al valor de partida de la fluorescencia de GFP en el núcleo de cada célula no estimulada.

Ejemplo 6 Sonda para la detección de la redistribución de VASP

Es útil para vigilar las rutas de señalización que implican la redisposición de elementos del citoesqueleto, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La VASP, que es una fosfoproteína, es un componente de las estructuras del citoesqueleto, que se redistribuye como respuesta a señales que afectan a adhesiones focales.

a) El gen de VASP humano (número de acceso al GenBank: Z46389) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores VASP-superior (SEQ ID NO: 94) y VASP-inferior / +detención (SEQ ID NO: 95). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Hind3 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech; Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Hind3 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-VASP (SEQ ID NO: 124 & 125) bajo el control de un promotor de CMV.

El plásmido resultante se transfectó dentro de células CHO que expresan el receptor de insulina humana usando el método de transfección con fosfato de calcio. Antes de los experimentos, las células se hicieron crecer en cámaras Nunc de 8 pocillos y se dejaron en ayunas durante una noche en un medio sin FCS.

Los experimentos se realizan en un ajuste de microscopio como se describe en el Ejemplo 1.

Se añadió 10% de FCS a las células y se recogieron imágenes. La fusión EGFP-VASP se redistribuyó desde una distribución algo uniforme cerca de la periferia a estructuras más localizadas, identificadas como puntos de adhesión focal (Figura 11).

Se han hecho un gran número de otras fusiones con GFP o están en el proceso de hacerse, tal como resulta evidente en los siguientes Ejemplos 7-22 que también sugieren apropiadas células hospedantes y sustancias para la activación de las rutas de señalización celulares que se han de vigilar y analizar.

Ejemplo 7 Sonda para la detección de la redistribución de actina

Es útil para vigilar rutas de señalización que implican la redisposición o la formación de filamentos de actina, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de rutas que conducen a las redisposiciones del citoesqueleto en células vivas.

La actina es un componente de estructura del citoesqueleto, que se redistribuye como respuesta a muchísimas señales celulares.

El dominio de fijación a actina del gen de alfa-actinina humana (número de acceso al GenBank X15804) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores ABD-superior (SEQ ID NO: 90) y ABD-inferior/-detención (SEQ ID NO: 91). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Hind3 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, número de acceso al GenBank U55762) digerido con Hind3 y BamH1. Esto produjo una fusión de dominio de fijación a actina-EGFP (SEQ ID NO: 128 & 129) bajo el control de un promotor de CMV.

El plásmido resultante se transfectó dentro de células CHO que expresan el receptor de insulina humana. Las células se estimularon con insulina, lo que dio lugar a que la sonda de dominio de fijación a actina-EGFP resultase redistribuida a estructuras asociadas a membranas, morfológicamente distinguibles.

Ejemplo 8 Sondas para la detección de la redistribución de p38

Útiles para vigilar rutas de señalización que responden a diversas situaciones de estrés celular p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas, o como una contra-pantalla.

La p38, que es una cinasa de proteínas, serina / treonina, es un componente de una ruta de señalización inducida por estrés que es activada por muchos tipos de estrés celular, p.ej. por TNFalfa, anisomicina, UV y mitomicima C.

a) El gen de p38 humano (número de acceso al GenBank: L35253) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores p38-superior (SEQ ID NO: 14) y p38-inferior / +detención (SEQ ID NO: 16). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión EGFP-p38 (SEQ ID NO: 46 & 47) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de p38 humano (número de acceso al GenBank: L35253) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores p38-superior (SEQ ID NO: 13) y p38-inferior / -detención (SEQ ID NO: 15). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión p38-EGFP (SEQ ID NO: 64 & 65) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una línea celular apropiada, p.ej. la HEK293, en la que la sonda de EGFP-p38 y la sonda de p38-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde predominantemente citoplasmática a nuclear en el transcurso de unos pocos minutos como respuesta a una activación de la ruta de señalización p.ej. con anisomicina.

Ejemplo 9 Sondas para la detección de la redistribución de Jnk1

Útiles para vigilar las rutas de señalización que responden a diversas situaciones de estrés celular, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas, o como una contra-pantalla.

La Jnk1, que es una cinasa de proteínas, serina / treonina, es un componente de una ruta de señalización inducida por estrés que es diferente de la p38 antes descrita, aunque también es activada por muchos tipos de estrés celular, p.ej. TNFalfa, anisomicina y UV.

a) El gen de Jnk1 humano (número de acceso al GenBank: L26318) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Jnk-superior (SEQ ID NO: 17) y Jnk-inferior / +detención (SEQ ID NO: 19). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión EGFP-Jnk1 (SEQ ID NO: 44 & 45) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de Jnk1 humano (número de acceso al GenBank: L26318) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Jnk-superior (SEQ ID NO: 17) y Jnk-inferior / -detención (SEQ ID NO: 18). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión Jnk1-GFP (SEQ ID NO: 62 & 63) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. HEK293, en que la sonda de EGFP-Jnk1 y/o la sonda de Jnk1-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde predominantemente citoplasmática a nuclear como respuesta a una activación de la ruta de señalización p.ej. con anisomicina.

Ejemplo 10 Sondas para la detección de la redistribución de PKG

Útiles para vigilar las rutas de señalización que implican cambios en los niveles de GMP cíclico, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La PGK, que es una cinasa de proteínas, serina / treonina, dependiente de cGMP, media en la señal de guanilil-ciclasa/cGMP.

a) El gen de PKG humano (número de acceso al GenBank: Y07512) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores PKG-superior (SEQ ID NO: 81) y PKG-inferior / +detención (SEQ ID NO: 83). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-PKG (SEQ ID NO: 134 & 135) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de PKG humano (número de acceso al GenBank: Y07512) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores PKG-superior (SEQ ID NO: 81) y PGK-inferior / -detención (SEQ ID NO: 82). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión PKG-EGFP (SEQ ID NO: 136 & 137) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la A10, en que la sonda de EGFP-PKG y/o la sonda de PKG-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde citoplasmática a una asociada con elementos del citoesqueleto en el transcurso de unos pocos minutos como respuesta a un tratamiento con agentes que aumentan los niveles de óxido nítrico (NO).

Ejemplo 11 Sondas para la detección de la redistribución de la cinasa IkappaB

Útiles para vigilar rutas de señalización que conducen a la activación de NFkappaB, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La cinasa IkappaB, que es una cinasa de serina/treonina, es un componente de una ruta de señalización que es activada por una diversidad de inductores que incluyen citocinas, linfocinas, factores de crecimiento y estrés.

a) La subunidad alfa del gen de cinasa de IkappaB humano (número de acceso al GenBank: AF009225) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores IKK-superior (SEQ ID NO: 96) e IKK-inferior /
+detención (SEQ ID NO: 98). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y Acc65I, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y Acc65I. Esto produce una fusión EGFP-cinasa de IkappaB (SEQ ID NO: 120 & 121) bajo el control de un promotor de CMV.

b) La subunidad alfa del gen de cinasa de IkappaB humano (número de acceso al GenBank: AF009225) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores IKK-superior (SEQ ID NO: 96) e IKK-inferior /
-detención (SEQ ID NO: 97). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y Acc65I, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y Acc65I. Esto produce una fusión cinasa de IkappaB-EGFP (SEQ ID NO: 122 & 123) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una línea celular apropiada, p.ej. la Jurkat, en que la sonda de EGFP-cinasa de IkappaB y/o la sonda de cinasa de IKappaB - EGFP deberían conseguir una distribución más citoplasmática en el transcurso de unos pocos segundos a continuación de una estimulación p.ej. con TNFalfa.

Ejemplo 12 Sondas para la redistribución de CDK2

Útiles para vigilar las rutas de señalización del ciclo celular, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La CDK2, que es una cinasa de serina / treonina dependiente de ciclina, es un componente del sistema de señalización que regula el ciclo celular.

a) El gen de CDK2 humano (número de acceso al GenBank: X61622) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores CDK2-superior (SEQ ID NO: 102) y CDK2-inferior / +detención (SEQ ID NO: 104). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-CDK2 (SEQ ID NO: 114 & 115) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de CDK2 humano (número de acceso al GenBank: X61622) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores CDK2-superior (SEQ ID NO: 102) y CDK2-inferior / -detención (SEQ ID NO: 103). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión CDK2-EGFP (SEQ ID NO: 112 & 113) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una línea celular apropiada, p.ej. la HEK293, en la que la sonda de EGFP-CDK2 y/o la sonda de CDK2-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde citoplasmática en células inhibidas de entrar en contacto, a una localización nuclear como respuesta a una activación con un cierto número de factores de crecimiento, p.ej. IGF.

Ejemplo 13 Sondas para la detección de la redistribución de Grk5

Útiles para vigilar las rutas de señalización que implican una desensibilización de receptores acoplados a la proteína G, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La Grk5, que es una cinasa de receptor acoplado a la proteína G, es un componente de rutas de señalización que implican a receptores acoplados a la proteína G unidos a membranas.

a) El gen de Grk5 humano (número de acceso al GenBank: L15388) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Grk5-superior (SEQ ID NO: 27) y Grk5-inferior / +detención (SEQ ID NO: 29). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-Grk5 (SEQ ID NO: 42 & 43) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de Grk5 humano (número de acceso al GenBank: L15388) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Grk5-superior (SEQ ID NO: 27) y Grk5-inferior / -detención (SEQ ID NO: 28). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión Grk5-EGFP (SEQ ID NO: 60 & 61) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la HEK293, que expresa un receptor D1A de dopamina de rata, en que la sonda de EGFP-Grk5 y/o la sonda de Grk5-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde predominantemente citoplasmática a periférica como respuesta a una activación de la ruta de señalización p.ej. con dopamina.

Ejemplo 14 Sondas para la detección de la redistribución de Zap70

Útiles para vigilar las rutas de señalización que implican al receptor de células T, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La Zap70, que es una cinasa de tirosina, es un componente de rutas de señalización que es activa, p.ej., para la diferenciación de células T.

a) El gen de Zap70 humano (número de acceso al GenBank: L05148) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Zap70-superior (SEQ ID NO: 105) y Zap70-inferior / +detención (SEQ ID NO: 107). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-Zap70 (SEQ ID NO: 108 & 109) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de Zap70 humano (número de acceso al GenBank: L05148) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Zap70-superior (SEQ ID NO: 105) y Zap70-inferior / -detención (SEQ ID NO: 106). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión Zap70-EGFP (SEQ ID NO: 110 & 111) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la Jurkat, en que la sonda de EGFP-Zap70 y/o la sonda de Zap70-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde citoplasmática a asociada con membranas en el transcurso de unos pocos segundos como respuesta de la activación de la ruta de señalización de receptor de células T p.ej. con anticuerpos para CD3epsilón

Ejemplo 15 Sondas para la detección de la redistribución de p85

Útiles para vigilar las rutas de señalización que implican a la cinasa de PI-3, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La p85alfa es la subunidad reguladora de la cinasa de PI3, que es un componente de muchas rutas que implican a los receptores de cinasas de tirosina, unidos a membranas y los receptores acoplados a la proteína G.

a) El gen de p85alfa humano (número de acceso al GenBank: M61906) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores p85-superior-C (SEQ ID NO: 22) y p85-inferior / +detención (SEQ ID NO: 23). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Bgl2 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Bgl2 y BamH1. Esto produjo una fusión EGFP-p85alfa (SEQ ID NO: 48 & 49) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de p85alfa humano (número de acceso al GenBank: M61906) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores p85-superior-N (SEQ ID NO: 20) y p85-inferior / -detención (SEQ ID NO: 21). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produjo una fusión p85alfa-EGFP (SEQ ID NO: 66 & 67) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la CHO, que expresa el receptor de insulina humano, en que la sonda de EGFP-p85 y la sonda de p85-EGFP pueden cambiar su distribución celular desde citoplasmática a asociada con membranas en el transcurso de unos pocos minutos como respuesta de la activación del receptor con insulina.

Ejemplo 16 Sondas para la detección de la redistribución de fosfatasa de proteína-tirosina

Útiles para vigilar las rutas de señalización que implican cinasas de tirosina, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La fosfatasa de proteína-tirosina 1C, que es una fosfatasa específica para tirosina, es un componente inhibidor en rutas de señalización que implican p.ej. a algunos factores de crecimiento.

a) El gen de fosfatasa de proteína-tirosina 1C humano (número de acceso al GenBank: X62055) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores PTP-superior (SEQ ID NO: 99) y PTP-inferior /
+detención (SEQ ID NO: 101). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y EcoR1. Esto produce una fusión EGFP-PTP (SEQ ID NO: 116 & 117) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de fosfatasa de proteína-tirosina 1C humano (número de acceso al GenBank: M62055) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores PTP-superior (SEQ ID NO: 99) y PTP-inferior / -detención (SEQ ID NO: 100). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y EcoR1. Esto produce una fusión PTP-EGFP (SEQ ID NO: 118 & 119) bajo el control de un promotor de
CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la MCF-7, en que la sonda de EGFP-PTP y/o la sonda de PTP-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde citoplasmática a la membrana plasmática en el transcurso de unos pocos minutos como respuesta a una activación de la ruta de señalización inhibidora del crecimiento p.ej. con somatostatina.

Ejemplo 17 Sondas para la detección de la redistribución de Smad4

Útiles para vigilar rutas de señalización que implican a la mayor parte de los miembros de la familia del factor beta de crecimiento en transformación, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

El Smad4, que es un transductor de señales, es un componente corriente de rutas de señalización inducidas por diversos miembros de la familia TGFbeta de citocinas.

a) El gen de Smad4 humano (número de acceso al GenBank: U44378) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Smad4-superior y Smad4-inferior / +detención (SEQ ID NO: 35). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-Smad4 (SEQ ID NO: 52 & 53) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de Smad4 humano (número de acceso al GenBank: U44278) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Smad4-superior (SEQ ID NO: 33) y Smad4-inferior / -detención (SEQ ID NO: 34). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con EcoR1 y BamH1. Esto produjo una fusión Smad4-EGFP (SEQ ID NO: 76 & 77) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una línea celular, p.ej. la HEK293, en que la sonda de EGFP-Smad4 y/o la sonda de Smad4-EGFP deberían cambiar su distribución celular en el transcurso de unos pocos minutos desde citoplasmática a nuclear como respuesta a una activación de la ruta de señalización p.ej. con TGFbeta.

Ejemplo 18 Sondas para la detección de la redistribución de Stat5

Útiles para vigilar rutas de señalización que implican a la activación de cinasas de tirosina de la familia Jak, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

El Stat5, que es un transductor de señales y activador de la transcripción, es un componente de rutas de señalización que son inducidas p.ej. por muchas citocinas y muchos factores de crecimiento.

a) El gen de Stat5 humano (número de acceso al GenBank: L41142) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Stat5-superior (SEQ ID NO: 30) y Stat5-inferior / +detención (SEQ ID NO: 32). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Bgl2 y Acc65I, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Bgl2 y Acc65I. Esto produjo una fusión EGFP-Stat5 (SEQ ID NO: 54 & 55) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de Stat5 humano (número de acceso al GenBank: L41142) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores Stat5-superior (SEQ ID NO: 30) y Stat5-inferior / -detención (SEQ ID NO: 31). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Bgl2 y Acc65I, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Bgl2 y Acc65I. Esto produjo una fusión Stat5-EGFP (SEQ ID NO: 78 & 79) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la MIN6, en la que la sonda EGFP-Stat5 y/o la sonda Stat5-EGFP deberán cambiar su distribución celular desde citoplasmática a nuclear en el transcurso de unos pocos minutos como respuesta a la activación de la ruta de señalización, p.ej. con prolactina.

Ejemplo 19 Sondas para la detección de la redistribución de NFAT

Útiles para vigilar las rutas de señalización que implican a una activación de NFAT, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

El NFAT, que es un activador de la transcripción, es un componente de las rutas de señalización que está implicado p.ej. en respuestas inmunitarias.

a) El gen de NFAT1 humano (número de acceso al GenBank: U43342) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores NFAT-superior (SEQ ID NO: 84) y NFAT-inferior / +detención (SEQ ID NO: 86). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y AcoR1. Esto produce una fusión EGFP-NFAT (SEQ ID NO: 130 & 131) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de NFAT humano (número de acceso al GenBank: U43342) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores NFAT-superior (SEQ ID NO: 84) y NFAT-inferior / -detención (SEQ ID NO: 85). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y EcoR1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y EcoR1. Esto produce una fusión NFAT-EGFP (SEQ ID NO: 132 & 133) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la Jurkat, en que la sonda de EGFP-NFAT y/o la sonda de NFAT-EGFP deberán cambiar su distribución celular desde citoplasmática a nuclear en el transcurso de unos pocos minutos como respuesta a una activación de la ruta de señalización, p.ej. con anticuerpos para CD3epsilón.

Ejemplo 20 Sondas para la detección de la redistribución de NFKkappaB

Útiles para vigilar rutas de señalización que conducen a la activación de NFkappaB, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

El NFkappaB, que es un activador de la transcripción, es un componente de rutas de señalización que son capaces de responder a una diversidad de inductores inclusive citocinas, linfocinas y algunos agentes supresores de inmunidad.

a) El gen de la subunidad p65 de NFkappaB humano (número de acceso al GenBank: M62399) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores NFkappaB-superior (SEQ ID NO: 87) y NFkappaB-inferior / +detención (SEQ ID NO: 89). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-NFkappaB (SEQ ID NO: 142 & 143) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de la subunidad p65 de NFkappaB humano (número de acceso al GenBank: M62399) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores NFkappaB-superior (SEQ ID NO: 87) y NFkappaB-inferior / -detención (SEQ ID NO: 88). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión NFkappaB-EGFP (SEQ ID NO: 140 & 141) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la Jurkat, en que la sonda de EGFP-NFkappaB y la sonda de NFkappaB-EGFP deberían cambiar su distribución celular desde citoplasmática a nuclear como respuesta a una activación de la ruta de señalización, p.ej. con TNFalfa.

Ejemplo 21 Sonda para la detección de la redistribución de RhoA

Útil para vigilar las rutas de señalización que implican a la RhoA, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La RhoA, que es una GTPasa pequeña, es un componente de muchas rutas de señalización que son capaces de responder a una diversidad de inductores, p.ej. redisposiciones en el citoesqueleto inducidas por LPA.

El gen de RhoA humano (número de acceso al GenBank: L25080) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores RhoA-superior (SEQ ID NO: 92) y RhoA-inferior / +detención (SEQ ID NO: 93). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Hind3 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Hind3 y BamH1. Esto produjo una fusión EGFP-RhoA (SEQ ID NO: 126 & 127) bajo el control de un promotor de CMV.

El plásmido resultante se transfecta dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la Swiss3T3, en que la sonda de EGFP-RhoA debería cambiar su distribución celular desde una distribución razonablemente homogénea a una distribución periférica en el transcurso de unos pocos minutos desde la activación de la ruta de señalización, p.ej. con LPA.

Ejemplo 22 Sondas para la detección de la redistribución de PKB

Útiles para vigilar las rutas de señalización que implican a la PKB, p.ej. para identificar compuestos que modulan la actividad de la ruta en células vivas.

La PKB, que es una cinasa de serina / treonina, es un componente en diversas rutas de señalización, muchas de las cuales son activadas por factores de crecimiento.

a) El gen de PKB humano (número de acceso al GenBank: M63167) se amplifica usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores PKB-superior (SEQ ID NO: 36) y PKB-inferior / +detención (SEQ ID NO: 80). El producto de la PCR se digiere con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se liga dentro de pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55763) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produce una fusión EGFP-PKB (SEQ ID NO: 138 & 139) bajo el control de un promotor de CMV.

b) El gen de PKB humano (número de acceso al GenBank: M63167) se amplificó usando una PCR de acuerdo con protocolos clásicos con los cebadores PKB-superior (SEQ ID NO: 36) y PKB-inferior / -detención (SEQ ID NO: 37). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción Xho1 y BamH1, y se ligó dentro de pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto; número de acceso al GenBank U55762) digerido con Xho1 y BamH1. Esto produjo una fusión PKB-EGFP (SEQ ID NO: 70 & 71) bajo el control de un promotor de CMV.

Los plásmidos resultantes se transfectan dentro de una apropiada línea celular, p.ej. la CHO, que expresa el receptor de insulina humana, en que la sonda de EGFP-PKB y/o la sonda de PKB-EGFP describen un ciclo entre situaciones citoplasmáticas y de membranas durante el proceso de activación y desactivación a continuación de la adición de insulina. La transición debería ser evidente en el transcurso de unos pocos minutos.

Referencias

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Blobe, G.C., Stribling, D.S., Fabbro, D., Stabel, S & Hannun, Y.A. (1996) J. Biol. Chen. 271, 15823-15830

Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W. & Prasher, D.C. (1994) Science 263, 802-805

Cossette, L.J., Hoglinger, O., Mou, L.J. & Shen, S.H. (1997) Exp. Cell Res. 223, 459-466

DeBernardi, M.A. & Brooker, G. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4577-4582

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Fulop Jr., T., Leblanc, C., Lacombe, G. & Dupuis, G. (1995) FEBS Lett. 375, 69-74

Godson, C., Masliah, E., Balboa, M.A., Ellisman, M.H. & Insel, P.A. (1996) Biochem. Biophys. Acta 1313, 63-71

Khalil, R.A., Lajoie, C., Resnick, M.S. & Morgan, K.G. (1992) American Physiol. Society c, 714-719

Sano, M., Kohno, M. & Iwanaga, M. (1995) Brain Res. 688, 213-218

Bastiaens, P.I.H. & Jovin, T.M. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8407-8412

Schmidt, D.J., Ikebe, M., Kitamura, K., & Fay, F.S. (1997) FASEB J. 11, 2924 (Resumen)

Sakai. N., Sasaki, K., Hasegawa, C., Ohkura, M., Suminka, K., Shirai, Y. & Saito, N. (1996) Soc. Neuroscience 22, 69P (Resumen)

Sakai. N., Sasaki, K., Hasegawa, C., Ohkura, M., Sumioka., Shirai, Y. & Naoaki, S. (1997) Japanese Journal of Pharmacology 73, 69P (Resumen de un Congreso celebrado el 22-23 de Marzo).

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: NovoNordisk, Biolmage

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Un método para detectar la translocación celular de polipéptidos biológicamente activos utilizando imágenes fluorescentes

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 143

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: NovoNordisk, Biolmage

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Mo rkojbygade 28

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Soborg

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: DK

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: DINAMARCA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 2860

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: FastSEQ for Windows Versión 2.0

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: PV & PR

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(8)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGACACAA GCTTTGGACA CGGCGCGCCA TGAGTAAAGG AGAAGAACTT TTC

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCTTCT CGAGTCTTAC TCCTGAGGTT TGTATAGTTC ATCCATGCCA TGT

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGACACAA GATTTGGACA CCCTCAGGAT ATGGGCAACG CCGCCGCCGC CAAG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCTTCT CGAGTCTTTC AGGCGCGCCC AAACTCAGTA AACTCCTTGC CACAC

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGACACAA GCTTTGGACA CCCTCAGGAT ATGGCTGACG TTTACCCGGC CAACG

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCTTCT CGAGTCTTTC AGGCGCGCCC TACTGCACTT TGCAAGATTG GGTGC

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGACACAA GCTTTGGACA CCCTCAGGAT ATGGCGGCGG CGGCGGCGGC TCCGGGGGGC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCTTCT CGAGTCTTTC AGGCGCGCCC GGGGCCCTCT GGCGCCCCTG GCTGG

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGAATTCAA CCATGGCGGC GGCGGCGGCG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGATCCCT AGGGGGCCTC CAGCACTCC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACTCGAGTA ACCATGGCGG CGGCGGCGGC G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGATCCAT AGATCTGTAT CCTGG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGATCCTT AAGATCTGTA TCCTGG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTCGAGGG AAAATGTCTC AGGAGAGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGATCCTC GGACTCCATC TCTTCTTG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGATCCTC AGGACTCCAT CTCTTCTTG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCCAGCC ATCATGAGCA GAAGCAAG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCCA CTGCTGCACC TGTGCTA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCTC ACTGCTGCAC CTGTGCTA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGAATTCC GCCACCATGA GTGCTGAGGG GTACCAGTAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCT GTCGCCTCTG CTGTGCATAT AC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: p85-top-C

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGATCTA TGAGTGCTGA GGGGTACCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCGGATCC TCATCGCCTC TGCTGTGCAT ATAC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCGA CCATGTCGTC CATCTTGCCA TTC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCCA TGACATGCTT GAGCAACGCA C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCTT ATGACATGCT TGAGCAACGC AC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCCA TGAGAGGGAG CCTCTGGCAG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCTC ATGAGAGGGA GCCTCTGGCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCAA CCATGGACAA TATGTCTATT ACG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCCA GTCTAAAGGT TGTGGGTCTG C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCTC AGTCTAAAGG TTGTGGGTCT GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCGAGGC ACCATGAGCG ACGTGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGATCCGA GGCCGTGCTG CTGGCCG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD. 1896 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1891

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

4

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 631 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1818 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1815

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

11

12

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1818 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1815

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

14

15

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 605 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIST1CAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2529 bares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2526

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

20

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 842 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1902 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1,..1899

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 633 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1824 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1821

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 607 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2907 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2904

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

39

40

41

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 968 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO Dé MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

43

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2160 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2157

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

46

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 719 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2418

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 806 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3120 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...3117

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

61

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1039 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTER1STICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1875 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1872

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

67

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 624 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1815 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1811

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

73

74

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 604 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2511 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2508

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 836 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

84

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1893 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1890

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 630 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

91

92

93

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1821 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1818

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

94

95

96

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 606 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2913 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2910

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

100

101

102

103

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 970 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

105

106

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ 1D NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1788 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1785

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

108

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 595 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

111

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2181 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2178

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

113

114

115

116

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 726 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

118

119

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2751 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2748

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

120

121

122

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 916 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

125

126

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2157 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2154

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

128

129

130

131

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 718 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

132

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2397 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2394

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

135

136

137

138

139

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 796 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interna

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

140

141

142

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3138 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...3135

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

143

144

145

146

147

148

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1045 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

149

150

151

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGATCCTC AGGCCGTGCT GCTGGCCG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCGAGGG AGCATGGGCA CCTTGCG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGATCCGA GAAGTCTATA TCCCATC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGATCCTT AGAAGTCTAT ATCCCATC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCGAGCC ATGAACGCCC CCGAGCGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCTC GTCTGATTTC TGGCAGGAGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCTT TACGTCTGAT TTCTGGCAGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCGAGCC ATGGACGAAC TGTTCCCCCT CATC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCAA GGAGCTGATC TGACTCAGCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCTT AGGAGCTGAT CTGACTCAGA AG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCCTAAGC TTATCATGGA CCATTATGAT TC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCCTGGAT CCCTGCGCAG GATGATCGTC CAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATGGAAGC TTCAATGGCT GCCATCCGGA AGAAACTGGT GATTG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATGGGGAT CCTCACAAGA CAAGGCAACC AGATTTTTTC TTCCC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAAGCTTC CATGAGCGAG ACGGTCATC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGGATCCT CAGGGAGAAC CCCGCTTC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCGA CCATGGAGCG GCCCCCGGGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCCA TTCTGTTAAC CAACTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCTC ATTCTGTTAA CCAACTCC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCGAGAG ATGCTGTCCC GTGGGTGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCGC TTCCTCTTGA GGGAACC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCAC TTCCTCTTGA GGGAACC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 102:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCGAGCC ATGGAGAACT TCCAAAAGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCCA GAGTCGAAGA TGGGGTAC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCTC AGAGTCGAAG ATGGGGTAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAATTCGG CGATGCCAGA CCCCGCGGCG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCCA GGCACAGGCA GCCTCAGCCT TC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 107:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCCTC AGGCACAGGC AGCCTCAGCC TTC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2616 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2613

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SED ID NO: 108:

152

153

154

155

156

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 871 aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

157

158

159

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2598 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2595

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SED ID NO: 110:

160

161

162

163

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 865 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 111:

164

165

166

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1635 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1632

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SED ID NO: 112:

167

168

169

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 544 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interna

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 113:

170

171

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1635 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1632

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 114:

172

173

174

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 544 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

176

177

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2532 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2529

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 116:

178

179

180

181

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 843 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 117:

182

183

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2562 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2559

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118:

184

185

186

187

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 853 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119:

189

190

191

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2994 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2991

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 120:

\vskip1.000000\baselineskip

192

193

194

195

196

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(a)

LONGITUD: 997 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 121:

198

199

200

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2991 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2988

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 122:

201

202

203

204

205

206

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 996 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 123:

\vskip1.000000\baselineskip

207

208

209

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1908 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1905

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 124:

210

211

212

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 125:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 635 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 125:

214

215

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1329 pares da bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1326

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 126:

216

217

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 127:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 442 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: Interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 127:

\vskip1.000000\baselineskip

219

220

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 128:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1140 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...1137

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 128:

\vskip1.000000\baselineskip

221

222

223

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 129:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 379 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 129:

\vskip1.000000\baselineskip

224

225

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 130:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3516 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...3513

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 130:

\vskip1.000000\baselineskip

226

227

228

229

230

231

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 131:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 131:

\vskip1.000000\baselineskip

233

234

235

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 132:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3546 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...3543

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 132:

\vskip1.000000\baselineskip

236

237

238

239

240

241

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 133:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1181 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 133:

\vskip1.000000\baselineskip

242

243

244

245

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 134:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2802 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2799

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 134:

\vskip1.000000\baselineskip

246

247

248

249

250

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 135

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 933 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 135:

251

252

253

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 136:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2799 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2795

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 136:

\vskip1.000000\baselineskip

254

255

256

257

258

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 137:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 932 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 137:

259

260

261

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 138:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2184 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2181

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 138:

262

263

264

265

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 139:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 727 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 139:

266

267

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 140:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2394 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2391

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 140:

268

269

270

271

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 141:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 797 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 141:

\vskip1.000000\baselineskip

272

273

274

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 142:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2394 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2391

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 142:

275

276

277

278

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 143:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 797 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 143:

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279

280

281

Claims (29)

1. Un programa de escrutinio que comprende un método para la identificación de una sustancia biológicamente activa que influye directa o indirectamente sobre la translocación de un polipéptido biológicamente activo, siendo el polipéptido biológicamente activo un polipéptido que afecta a procesos intracelulares después de una activación de una ruta de señalización intracelular, siendo la ruta de señalización intracelular los procesos intracelulares coordinados por los que una célula viva transduce una señal interna o externa a la forma de respuestas celulares, implicando la ruta de señalización intracelular una reacción enzimática, comprendiendo el método:

(a)

cultivar una o más células que expresan establemente un ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido que comprende un fluoróforo, codificado por un ácido nucleico, enlazado al polipéptido biológicamente activo o a una parte de éste, en unas condiciones que permiten una expresión de la secuencia de nucleótidos,

(b)

incubar la por lo menos una célula con una sustancia que se ha de escrutar en cuanto a la función biológica o al efecto biológico, y

(c)

medir la luz emitida a partir del fluoróforo en la por lo menos una célula incubada y registrar un resultado o una variación con respecto a la luz emitida a partir de dicho fluoróforo, realizándose que dicho resultado o dicha variación es indicativo/a de una translocación del polipéptido biológicamente activo en dicha por lo menos una célula.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sustancia biológicamente activa es un medicamento.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sustancia biológicamente activa es una sustancia tóxica.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la operación (c) se realiza extrayendo información cuantitativa en relación con la translocación de dicho polipéptido biológicamente activo por registro de la variación en la luz distribuida en el espacio, emitida a partir de dicho fluoróforo, siendo dicha variación indicativa de la translocación del polipéptido biológicamente activo en dicha por lo menos una célula.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la información cuantitativa es extraída a partir del registro o de los registros de acuerdo con una calibración previamente determinada, basada en respuestas o resultados, registradas/os de la misma manera, a grados conocidos de una influencia específica relevante.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el polipéptido biológicamente activo comprende la porción de la secuencia de aminoácidos que tiene una función biológica o ejerce una función biológica en un sistema celular.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la operación (c) se realiza en un único momento después de una aplicación de la sustancia.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la operación (c) se realiza en dos momentos, estando un momento antes de la aplicación de la sustancia, y el otro momento después de esta aplicación de la sustancia.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la luz emitida por la por lo menos una célula se mide antes de la incubación de la por lo menos una célula con dicha sustancia, y el resultado o la variación que se ha determinado en la operación (c) es un cambio en la luz emitida, comparada con la luz emitida, que se ha medido antes de la incubación de la por lo menos una célula con dicha sustancia.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la operación (c) se realiza en una serie de momentos, y en el que la aplicación de la influencia se produce algún tiempo después del primer momento en la serie de registros, realizándose los registros, p.ej., con un espaciamiento en el tiempo previamente determinado de desde 0,1 segundos a 1 hora, preferiblemente desde 1 a 60 segundos, más preferiblemente desde 1 a 30 segundos, en particular desde 1 a 10 segundos, durante un intervalo de tiempo de desde 1 segundo a 12 horas, tal como desde 10 segundos a 12 horas, p.ej., desde 10 segundos a una hora, tal como desde 60 segundos a 30 minutos o 20 minutos.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la por lo menos una célula está fijada en un momento después de la aplicación de la sustancia, en el que la respuesta ha sido predeterminada como significante, y un registro se hace en un momento posterior arbitrario.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el fluoróforo es un fluoróforo que es capaz de ser translocado de una manera que es fisiológicamente relevante para el grado de influencia de la sustancia.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el fluoróforo es un fluoróforo que es capaz de ser translocado de una manera que está correlacionada con el grado de la influencia de la sustancia.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-13, en el que el resultado de la variación con respecto a la luz distribuida en el espacio que ha sido emitida por el fluoróforo se detecta por un cambio en la transferencia de energía de resonancia entre el fluoróforo y otra entidad luminiscente capaz de suministrar energía al fluoróforo, cada uno de los cuales se ha seleccionado o tratado por ingeniería genética para resultar parte de, unido a, o asociado con, componentes particulares de la ruta de señalización intracelular, y uno de los cuales experimenta una translocación como respuesta a la influencia, cambiando con ello la cantidad de transferencia de energía de resonancia, siendo medido el cambio en la transferencia de energía de resonancia como un cambio en la intensidad de emisión procedente del fluoróforo.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el registro del resultado de la variación se realiza registrando una propiedad de la luz emitida, seleccionada entre el grupo que consta de la intensidad, el tiempo de vida de la fluorescencia, la polarización y el desplazamiento de longitud de onda.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la propiedad de la luz que se está registrando es la intensidad.

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14, en el que el cambio en la intensidad de la luz emitida a partir del fluoróforo es percibido por un único fotodetector de canales, que responde solamente a la intensidad media del luminóforo de una manera no resuelta en el espacio.

18. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-17, en el que el registro de la luz distribuida en el espacio se realiza usando un sistema de registro, que registra la distribución en el espacio de una propiedad registrable de la luz en la forma de un conjunto ordenado de valores.

19. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-17, en el que el registro de la distribución en el espacio de la propiedad registrable se realiza usando un dispositivo de transferencia de cargas, tal como un conjunto de CCD o un dispositivo de tubo de vacío tal como un tubo vidicón.

20. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la operación (c) se realiza por microscopía de fluorescencia.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-20, en el que el registro de la variación o del resultado con respecto a la luz emitida a partir del fluoróforo se realiza registrando la luz distribuida en el espacio como una o más imágenes digitales, y el tratamiento de la variación registrada para reducirlo a uno o más números representativos del grado de la redistribución comprende un proceso de tratamiento de imágenes digitales o una combinación de procesos de tratamiento de imágenes digitales.

22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido híbrido es una fusión de por lo menos una porción de la proteína fluorescente verde, y de por lo menos una porción de un dominio catalítico y/o regulador de una cinasa de proteínas.

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el fluoróforo es una Proteína Fluorescente Verde (GFP).

24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la GFP se selecciona entre el grupo de las GFP's que tienen la mutación F64L.

25. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la GFP es una variante de GFP seleccionada entre el grupo que consta de F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP, F64L-S65T-GFP y EGFP.

26. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la por lo menos una célula es una célula de mamífero que, durante el período de tiempo a lo largo del que observa la influencia, es incubada a una temperatura de 30ºC o superior, preferiblemente a una temperatura de desde 32ºC a 39ºC, más preferiblemente a una temperatura de desde 35ºC a 38ºC, y lo más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37ºC.

27. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la por lo menos una célula es parte de una matriz de células idénticas o no idénticas.

28. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la por lo menos una célula es seleccionada entre el grupo que consta de una célula fúngica, tal como una célula de levadura; una célula de invertebrado, inclusive una célula de insecto; y una célula de vertebrado, tal como una célula de mamífero.

29. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-28, en el que el polipéptido biológicamente activo se selecciona entre el grupo que consta de una cinasa de proteínas, una fosfatasa, un factor de transcripción y una proteína asociada con la red citoesquelética que cambia de localización celular después de una activación.