ES2158048T5

ES2158048T5 - Mutaciones del gen ligado al cromosoma 17q, de susceptibilidad al cancer de mama y de ovario.

Info

Publication number: ES2158048T5
Application number: ES95305605T
Authority: ES
Inventors: Donna M. Shattuck-Eidens; Jacques Simard; Mitsuru Emi; Yusuke Nakamura; Francine Durocher
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 2009-11-04
Anticipated expiration: 2015-08-11
Also published as: CA2196797C; GR3036322T3; ES2158048T3; CA2196797A1; EP0705903B1; DE69521002T2; EP0705903B2; WO1996005306A2; EP0705903A1; NO970624L; ATE201445T1; WO1996005306A3; PT705903E; DE69521002T3; JP2002503943A; AU3321295A; AU686004B2; CN1172502A; NZ291621A; NO970624D0

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE GENERALMENTE AL CAMPO DE LA GENETICA HUMANA. ESPECIFICAMENTE LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS Y MATERIALES UTILIZADOS PARA AISLAR Y DETECTAR UN GEN HUMANO DE PREDISPOSICION AL CANCER DE OVARIOS Y MAMA (BRCA1), ALGUNOS ALELOS MUTANTES QUE CAUSAN LA SUSCEPTIBILIDAD AL CANCER, EN PARTICULAR CANCER DE MAMA Y OVARIOS. MAS ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A MUTACIONES DE LA LINEA GERMINAL EN EL GEN BRCA1 Y SU USO EN LA DIAGNOSIS DE LA PREDISPOSICION AL CANCER DE OVARIOS Y MAMA. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ADEMAS A MUTACIONES SOMATICAS EN EL GEN BRCA1 EN EL CANCER DE OVARIOS Y DE MAMA HUMANO Y SU USO EN LA DIAGNOSIS Y PROGNOSIS DE DICHO CANCER.

Description

Mutaciones del gen ligado al cromosoma 17q, de susceptibilidad al cáncer de mama y de ovario.

El presente invento se refiere de modo general al campo de la genética humana. De modo específico, el presente invento se refiere a un método para diagnosticar una predisposición para el cáncer de pecho y de ovario en un individuo humano que comprende determinar si hay una alteración en la línea germinal 185delAG\ding{212}ter39 en el gen BRCA1 en una muestra de tejido de dicho individuo, dicha alteración indica una predisposición a dicho cáncer. La presente invención además se relaciona con un método para diagnosticar una lesión de pecho o de ovario de un individuo humano para la neoplasia asociada con el locus del gen BCRA1 que comprende determinar si hay una mutación 185delAG\ding{212}ter39 en el gen BCRA1 en una muestra a partir de esa lesión. La presente invención también proporciona una sonda de ácido nucleico que tiene de 15 a 30 nucleótidos de SEQ ID NO:1 y que contiene la mutación 185delAG\ding{212}ter39 así como vectores y células hospedadoras tal como se define en las reivindicaciones.

Las publicaciones y otros materiales aquí utilizados para ilustrar los antecedentes del invento, y en particular, casos que proporcionan detalles adicionales con respecto a la practica, se incorporan aquí como referencia, y por comodidad, se citan con autor y fecha en el siguiente texto y son agrupados en orden relativo en la Lista de Referencias Bibliográficas que se adjunta.

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Antecedentes del invento

La genética del cáncer es complicada, e implica múltiples reguladores dominantes y positivos del estado transformado (oncogenes) así como múltiples reguladores recesivos y negativos (genes supresores de tumor). Se han caracterizado más de cien oncogenes. Se han identificado menos de una docena de genes supresores de tumor, pero se espera que el número aumente a más de cincuenta (Knudson, 1993).

La implicación de un número tan grande de genes acentúa la complejidad de los mecanismos de control del crecimiento que operan en las células para mantener la integridad del tejido normal. Esta complejidad se manifiesta de otra manera. Hasta la fecha, no se ha demostrado la existencia de un gen único que participe en el desarrollo de todos, o incluso de la mayoría de los cáncer humanos. Las mutaciones oncogénicas más comunes están en el gen H-ras, y se han encontrado en el 10-15% de todos los tumores sólidos (Anderson y col., 1992). Los genes supresores de tumor que mutan mas frecuentemente son el gen TP53, que se encontró delecionado con carácter homocigótico en aproximadamente el 50% de todos los tumores, y el gen CDKN2, que se encontró delecionado con carácter homocigótico en el 46% de las líneas de células tumorales examinadas (Kamb y col., 1994). Sin una diana que sea común para todas las células transformadas, es improbable realizar el sueño de una "bala mágica" capaz de destruir o revertir las células cancerosas cuando abandonan un tejido normal no dañado. La esperanza de encontrar una nueva generación de fármacos antitumorales, dirigidos de modo específico a una diana, puede depender de la capacidad para identificar genes supresores de tumor, o de oncogenes que desempeñan papeles generales en el control de la división
celular.

Los genes supresores de tumor que han sido clonados y caracterizados, influyen en la susceptibilidad a: 1) Retinoblastoma (RB1); 2) Tumor de Wilms (WT1); 3) Li-Fraumeni (TP53); 4) Poliposis adeno-matosa familiar (APC); 5) Neurofibromatosis de tipo 1 (NF1); 6) Neurofibromatosis de tipo 2 (NF2); 7) Síndrome de von Hippel-Lindau (VHL); 8) Neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN2A); y 9) Melanoma (CDKN2).

Loci supresores de tumor que han sido localizados en mapas genéticos pero que no han sido todavía aislados, incluyen los genes de: Neoplasia múltiple endocrina de tipo 1 (MEN1); Síndrome familiar de cáncer de Lynch 2 (LCFS2); Neuroblastoma (NB); Síndrome de nevus de células basales (BCNS); Síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS); Carcinoma de células renales (RCC); Esclerosis tuberosa 1 (TSC1); y Esclerosis tuberosa 2 (TSC2). Los genes supresores de tumor que han sido caracterizados hasta la fecha codifican productos que presentan similitudes con diversos tipos de proteínas, que incluyen proteínas de unión a DNA (WT1), reguladores ancilarios de la trascripción (RB1), proteínas activadoras de la GTPasa o GAP (NF1), componentes citoesqueléticos (NF2), quinasas de receptores unidos a membrana (MEN2A), reguladores del ciclo celular (CDKN2) y otros genes que no presentan similitudes obvias con proteínas conocidas (APC y VHL).

En muchos casos, se ha visto que el gen supresor de tumor, originalmente identificado mediante estudios genéticos, se ha perdido o ha mutado en algunos tumores esporádicos. Este resultado sugiere que regiones de aberración cromosómica pueden señalar la posición de genes supresores de tumor importantes, implicados tanto en la predisposición genética al cáncer como en cáncer esporádicos.

Uno de los distintivos de algunos genes supresores de tumor caracterizados hasta la fecha, es que se encuentran delecionados con una frecuencia alta en ciertos tipos de tumores. Las deleciones a menudo implican la perdida de un solo alelo, perdida denominada de heterocigosidad (LOH), pero pueden también implicar una deleción homocigótica de ambos alelos. En el caso de la LOH, el alelo que queda se presume que es no funcional, ya sea debido a una mutación heredada preexistente, o debido a una mutación esporádica secundaria.

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El cáncer de mama es una de las enfermedades mas importantes que afectan a las mujeres. En la tasa normal, las mujeres americanas presentan un riesgo de desarrollar cáncer de mama de 1 de cada 8 a los 95 años de edad (American Cáncer Society, 1992). El tratamiento de cáncer de mama en estadios tardíos suele ser inútil y desfigurante, lo que hace que la detección temprana sea de alta prioridad en el tratamiento medico de la enfermedad. El cáncer de ovario, aunque menos frecuente que el cáncer de mama, suele ser mortal de manera rápida y es la cuarta causa más común de mortalidad por cáncer en mujeres americanas. Los factores genéticos contribuyen a una proporción definida por la enfermedad, de la incidencia del cáncer de mama, que se estima que es de aproximadamente un 5% de todos los casos pero de aproximadamente un 25% de los casos diagnosticados antes de los 40 años. (Claus y col., 1991). El cáncer de mama se ha subdividido en dos tipos, de aparición a edad temprana y de aparición a edad tardía, sobre la base de una inflexión en la curva de incidencia específica de la edad, aproximadamente a los 50 años. La mutación de uno solo gen, el gen BRCA1, se cree que es responsable de aproximadamente el 45% del cáncer de mama familiar, y de al menos el 80% de las familias con ambos cáncer de mama y de ovario (Easton y col., 1993).

Se han realizado intensos esfuerzos para aislar el gen BRCA1 ya que su primera localización en mapa fue en 1990 (Hall y col., 1990; Narod y col., 1991). Un segundo locus, BRCA2, ha sido localizado recientemente en el cromosoma 13q (Wooster y col., 1994) y parece ser responsable de una proporción de cáncer de mama de aparición temprana, casi igual a la de BRCA1, pero confiere un riesgo menor de cáncer de ovario. La susceptibilidad restante a un cáncer de mama de aparición temprana se divide entre genes correspondientes a cáncer de tipo familiar, todavía no localizados, y mutaciones más raras asociadas a la línea germinal en genes como el TP53 (Malkin y col., 1990). Se ha sugerido también que individuos portadores heterocigóticos de formas defectivas del gen de la Ataxia-Telangectasia presentan un mayor riesgo de cáncer de mama (Swift y col., 1976; Swift y col., 1991). El cáncer de mama de aparición tardía también suele ser de tipo familiar aunque los riesgos en los parientes no son tan altos como los del cáncer de mama de aparición temprana (Cannon-Albright y col., 1994; Mettlin y col., 1990). Sin embargo, se desconoce el porcentaje de estos casos que es debido a una susceptibilidad genética.

Hace tiempo que se ha reconocido que el cáncer de mama es, en parte, una enfermedad de tipo familiar (Anderson, 1972). Numerosos investigadores han estudiado la evidencia de una herencia genética y han concluido que los datos están en su mayoría de acuerdo con una herencia dominante de un locus o loci principal de susceptibilidad (Bishop y Gardner, 1980; Go y col., 1983; Williams y Anderson, 1984; Bishop y col., 1988; Newman y col., 1988; Claus y col., 1991). Resultados recientes demuestran que existen al menos tres loci que conllevan la susceptibilidad al cáncer de mama así como a otros cáncer. Estos loci son el locus TP53 en el cromosoma 17p (Malkin y col., 1990), un locus de susceptibilidad ligado al cromosoma 17q y conocido como BRCA1 (Hall y col., 1990), y uno o mas loci responsables de los casos restantes no localizados en mapa. Hall y col. (1990) indicaron que la susceptibilidad heredada al cáncer de mama en grupos familiares (del ingles, "kindreds"), con aparición a edad temprana, esta ligada al cromosoma 17q21; sin embargo, estudios posteriores realizados por este grupo utilizando un modelo genético mas apropiado, refutaron en parte esta limitación al cáncer de mama de aparición temprana (Margaritte y col., 1992).

Muchas de las estrategias para clonar el gen causante de predisposición a cáncer de mama, ligado al cromosoma 17q (gen BRCA1), requieren estudios precisos de localización genética. El modelo mas sencillo del papel funcional de BRCA1, sostiene que los alelos del gen BRCA1 que causan predisposición al cáncer, son recesivos frente a los alelos de tipo salvaje; es decir, las células que contienen al menos un alelo BRCA1 de tipo salvaje no son cancerosas. Sin embargo, las células que contienen un alelo BRCA1 de tipo salvaje y un alelo que causa predisposición, pueden padecer ocasionalmente la perdida del alelo de tipo salvaje ya sea por mutación al azar o por perdida cromosómica durante la división celular (no-disyunción). Toda la progenie de esa célula mutante carece de la función de tipo salvaje de BRCA1 y puede dar lugar a tumores. De acuerdo con este modelo, los alelos BRCA1 que causan predisposición son recesivos, aunque la susceptibilidad al cáncer se hereda de una manera dominante: las mujeres que poseen un alelo causante de predisposición (y un alelo de tipo salvaje) están en riesgo de desarrollar cáncer, debido a que sus células epiteliales mamarias pueden perder de manera espontánea el alelo BRCA1 de tipo salvaje. Este modelo se aplica a un grupo de loci de susceptibilidad al cáncer, conocidos como genes supresores de tumor o antioncogenes, una clase de genes que incluye el gen de retinoblastoma y el gen de la neurofibromatosis. Por inferencia este modelo puede también explicar la función de BCRA1, de la manera recientemente sugerida (Smith y col., 1992).

Una segunda posibilidad es que los alelos BRCA1 causantes de predisposición sean en verdad dominantes; es decir, un alelo de tipo salvaje del gen BRCA1 no puede sobreponerse al papel formador de tumor del alelo de predisposición. Así, una célula que porta el alelo de tipo salvaje y el alelo mutante no perdería necesariamente la copia de tipo salvaje de BRCA1 antes de dar lugar a células malignas. En lugar de ello, las células mamarias de personas con predisposición experimentarían algún otro cambio(s) estocástico que conducirían al cáncer.

Si los alelos BRCA1 causantes de predisposición son recesivos, es de esperar que el gen BRCA1 se exprese en tejido mamario normal pero que no se exprese funcionalmente en tumores mamarios. Por el contrario, si los alelos BRCA1 causantes de predisposición son dominantes, el gen BRCA1 de tipo salvaje puede o no expresarse en tejido mamario normal. Sin embargo, el alelo causante de predisposición se expresaría probablemente en células tumorales de mama.

El ligamiento de BRCA1 al cromosoma 17q fue confirmado de manera independiente en tres de cinco grupos familiares que presentaban tanto cáncer de mama como cáncer de ovario (Narod y col., 1991). Estos estudios reivindicaron la localización del gen dentro de una región muy extensa, de 15 centiMorgan (cM), o aproximadamente 15 millones de pares de bases, situada a ambos lados del marcador ligado pCMM86 (D17S74). Sin embargo, intentos efectuados para definir aun mas la región con estudios genéticos, utilizando marcadores que circundan pCMM86, se mostraron infructuosos. Estudios posteriores indicaron que el gen se encontraba en una posición considerablemente más proximal (Easton y col., 1993) y que el análisis original era defectuoso (Margaritte y col., 1992). Hall y col., (1992) recientemente han localizado el gen BRCA1 en un intervalo de aproximadamente 8 cM (aproximadamente 8 millones de pares de bases), limitado por Mfd15 (D17S250) en el lado proximal, y por el gen GIP humano en el lado distal. Un intervalo ligeramente más estrecho para el locus BRCA1, basado en datos de publica disposición, fue acordado después del Encuentro sobre el Cromosoma 17, en Marzo de 1992 (Fain, 1992). El tamaño de estas regiones y incertidumbre asociada con ellas ha hecho excesivamente difícil diseñar e implementar estrategias de construcción de mapas físicos y/o de clonación para aislar el gen BRCA1.

La identificación de un locus de susceptibilidad a cáncer de mama permitiría la detección temprana de los individuos susceptibles y aumentaría enormemente la capacidad de comprender las etapas iniciales que conducen al cáncer. Debido a que los loci de susceptibilidad a menudo están alterados durante la progresión de un tumor, la clonación de estos genes podría ser también importante en el desarrollo de mejores productos de diagnóstico y pronóstico, así como de mejores terapias contra el cáncer.

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Sumario del invento

En un aspecto, el presente invento proporciona un método para diagnosticar una predisposición para el cáncer de pecho y de ovario en un individuo humano que comprende determinar si hay una alteración en la línea germinal 185delAG\ding{212}ter39 en el gen BRCA1 en una muestra de tejido de dicho individuo, dicha alteración indica una predisposición a dicho cáncer. La presente invención además se relaciona con un método para diagnosticar una lesión de pecho o de ovario de un individuo humano para la neoplasia asociada con el locus del gen BCRA1 que comprende determinar si hay una mutación 185delAG\ding{212}ter39 en el gen BCRA1 en una muestra a partir de esa lesión. La presente invención también proporciona una sonda de ácido nucleico que tiene de 15 a 30 nucleótidos de SEQ ID NO:1 y que contiene la mutación 185delAG\ding{212}ter39 así como vectores y células hospedadoras tal como se define en las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que muestra el orden de los loci que están próximos a BRCA1, según se determinó en el Encuentro sobre el Cromosoma 17. La Figura 1 es una reproducción procedente de Fain, 1992.

La Figura 2 es un mapa esquemático de YAC que define parte de la región Mfd15-Mfd188.

La Figura 3 es un mapa esquemático de STS, P1 y BAC en la región de BRCA1.

La Figura 4 es un mapa esquemático del cromosoma 17 humano. La región pertinente que contiene BRCA1 esta expandida para indicar las posiciones relativas de dos genes previamente identificados, CA125 y RNU2. BRCA1 abarca el marcador D17S855.

La Figura 5 muestra el alineamiento del dominio de dedo de zinc de BRCA1 con otros 3 dominios de dedo de zinc que tienen una valor más alto en el alineamiento de Smith-Waterman. RPT1 codifica una proteína que se ha visto que es un regulador negativo del receptor de IL-2 en ratón. RIN1 codifica una proteína de unión a DNA que incluye un motivo de ANILLO-dedo, relacionado con el dedo de zinc. RFP1 codifica un factor de transcripción putativo que es el dominio N-terminal del producto del oncogén RET. La línea inferior contiene la secuencia consenso de dedo de zinc C3HC4 que muestra las posiciones de las cisteínas y de una histidina que forman el bolsillo de unión del ion
zinc.

La Figura 6 es un diagrama del mRNA de BRCA1 que muestra las localizaciones de los intrones y las variantes del mRNA de BRCA1 producidas con un procesamiento alternativo. Las localizaciones de los intrones se muestran con triángulos negros y los exones están numerados debajo de la línea que representa el cDNA. El cDNA de la parte superior es la composición utilizada para generar la secuencia peptídica de BRCA1. En la parte inferior se muestran formas alternativas identificadas como clones de cDNA o clones de selección híbridos.

La Figura 7 muestra el patrón de expresión de BRCA1 en tejidos. La transferencia se obtuvo procedente de Clontech y contiene RNA de los tejidos indicados. Las condiciones de la hibridación fueron las recomendadas por el fabricante utilizando una sonda constituida por las posiciones de los nucleótidos 3631 a 3930 de BRCA1. Nótese que tanto la mama como los ovarios son tejidos heterogéneos y que el porcentaje de células epiteliales relevantes puede ser variable. Los estándar de pesos moleculares están en kilobases.

La Figura 8 es un diagrama de la región en 5' no traducida más el principio de la región traducida de BRCA1, que muestra las localizaciones de los intrones y las variantes del mRNA de BRCA1 producidas por procesamientos alternativos. Las localizaciones de los intrones se muestran con líneas de trazo discontinuo. Se muestran seis formas alternativas de corte y empalme.

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La Figura 9A muestra una mutación sin sentido en el grupo familiar K2082. P indica la persona originalmente escrutada, b y c son individuos portadores del haplotipo, a, d, e, f y g no portan el haplotipo de BRCA1. La mutación de C a T produce un codón de parada y crea un sitio para la enzima de restricción AvrlI. Los productos de la amplificación por PCR se cortan con esta enzima. Los individuos portadores son heterocigóticos con respecto al sitio y por consiguiente muestran tres bandas. Los individuos no portadores permanecen sin cortar.

La Figura 9B muestra una mutación y un análisis de cosegregación en grupos familiares que portan BRCA1. Los individuos portadores están representados como círculos y cuadrados oscuros en los diagramas de la genealogía. Mutación por desplazamiento del marco de lectura en el grupo familiar K1910. Las tres primeras pistas son muestras de control, de individuos no portadores. Las pistas marcadas 1-3 contienen secuencias de individuos portadores. La pista 4 contiene DNA de un miembro del grupo familiar que no porta la mutación de BRCA1. El rombo se utiliza para evitar la identificación del grupo familiar. El desplazamiento del marco de lectura producido por la C adicional es visible en las pistas marcadas 1, 2 y 3.

La Figura 9C muestra una mutación y un análisis de cosegregación en grupos familiares que portan BRCA1. Los individuos portadores están representados con círculos y cuadrados oscuros en los diagramas de la genealogía. Mutación reguladora inferida en el grupo familiar K2035. Análisis de ASO de individuos portadores y no portadores de 2 polimorfismos diferentes (PM1 y PM7) en los que se examinó la heterocigosidad en la línea germinal y se comparó con la heterocigosidad del mRNA de los linfocitos. Las 2 hileras superiores de cada conjunto contienen productos amplificados por PCR a partir de DNA genómico y las 2 hileras inferiores contienen productos de PCR amplificados a partir de cDNA. "A" y "G" son los dos alelos detectados por el análisis de ASO. Las manchas oscuras indican que un alelo particular está presente en la muestra. Las tres primeras pistas de PM7 representan los tres genotipos presentes en la población general.

Las Figuras 10A-10H muestra la secuencia genómica de BRCA1. Las letras minúsculas indican la secuencia de intrones mientras que las letras mayúsculas indican la secuencia de exones. Los intervalos indefinidos dentro de los intrones se designan con vvvvvvvvvvvvv. Los sitios polimórficos conocidos se muestran con caracteres subrayados y en negrilla.

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Descripción detallada del invento

La presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende la totalidad, o una parte, del locus BRCA1 o de un locus BRCA1 mutado, que tiene una longitud preferiblemente de al menos ocho bases y no más de aproximadamente 100 kb. Esos polinucleótidos pueden ser polinucleótidos antisentido. El presente invento también proporciona una construcción recombinante que comprende ese polinucleótido aislado, por ejemplo, una construcción recombinante adecuada para la expresión en una célula hospedadora transformada.

La presente descripción también proporciona métodos para preparar un polinucleótido, que comprenden polimerizar nucleótidos para producir una secuencia formada por al menos ocho nucleótidos consecutivos del locus BRCA1; y métodos para preparar un polipéptido que comprenden polimerizar aminoácidos para producir una secuencia que comprende al menos cinco aminoácidos codificados en el locus BRCA1.

El método de la invención pueden además comprender la etapa de amplificar una porción del locus BRCA1, y pueden además incluir una etapa de proporcionar un conjunto de polinucleótidos que son cebadores para la amplificación de dicha parte del locus BRCA1. El método es útil para identificar mutaciones 185delAG, para utilizar o en el diagnóstico de la predisposición al cáncer, o en el diagnóstico o pronóstico del cáncer.

El locus BRCA1 predispone a los individuos al cáncer de mama y al cáncer de ovario, es un gen que codifica una proteína BRCA1, que se ha encontrado que presenta una homología no significativa con secuencias de proteínas o secuencias de DNA conocidas. Este gen es aquí denominado BRCA1. Las mutaciones en el locus BRCA1, en la línea germinal, son indicativas de una predisposición a cáncer de mama o a cáncer de ovario. Finalmente, las mutaciones somáticas en el locus BRCA1 están también asociadas con cáncer de mama, cáncer de ovario y otros tipos de cáncer, y que dichas mutaciones representan un indicador de estos cáncer o del pronóstico de estos cáncer. Los eventos mutacionales del locus BRCA1 pueden incluir deleciones, inserciones y mutaciones puntuales dentro de la secuencia codificadora y de la secuencia no codificadora.

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Partiendo de una región situada en el brazo largo del cromosoma 17 humano del genoma humano, 17q, que tiene un tamaño estimado de aproximadamente 8 millones de pares de bases, se ha identificado una región que contiene un locus genético, el BRCA1, que produce una susceptibilidad al cáncer, incluyendo cáncer de mama y de ovario.

La región que contiene el locus BRCA1 se identificó utilizando diversas técnicas genéticas. Las técnicas de construcción de mapas genéticos, inicialmente definieron la región de BRCA1 en términos de recombinación con marcadores genéticos. Basándose en estudios de familias muy extensas (grupos familiares) que presentan múltiples casos de cáncer de mama (y casos de cáncer de ovarios en algunos grupos familiares), se ha señalado una región cromosómica que contiene el gen BRCA1 así como otros alelos de susceptibilidad putativos en el locus BRCA1. Se han descubierto dos puntos de rotura meióticos en el lado distal del locus BRCA1, los cuales son expresados como recombinantes entre marcadores genéticos y la enfermedad, y un recombinante situado en el lado proximal del locus BRCA1. Así pues, una región que contiene el locus BRCA1 está limitada físicamente por estos marcadores.

El empleo de marcadores genéticos proporcionados permitieron la identificación de clones que cubren la región, a partir de una biblioteca humana en cromosomas artificiales de levadura (YAC) (del ingles, "Yeast Artificial Chromosome") o a partir de una biblioteca humana en cromosomas artificiales de bacterias (BAC). También permitió la identificación y preparación de clones de más fácil manipulación en cósmidos, P1 y BAC, procedentes de esta región, y la construcción de un "contig" (solapamiento de clones contiguos) a partir de un subconjunto de clones. Estos cósmidos, P1, YAC y BAC proporcionan la base para clonar el locus BRCA1 y proporcionan la base para desarrollar reactivos efectivos, por ejemplo, en el diagnóstico y tratamiento de cáncer de mama y/u ovario. El gen BRCA1 y otros genes de susceptibilidad potenciales han sido aislados en esta región. El aislamiento se realizó utilizando una trampa en un soporte lógico (método de ordenador para identificar secuencias que es probable que contengan exones codificadores, a partir de secuencias contiguas o discontinuas de DNA genómico), técnicas de selección de híbridos y escrutinio directo, con insertos de cDNA totales o parciales, procedentes de cósmidos, P1 y BAC presentes en la región para escrutar bibliotecas de cDNA. Estos métodos fueron utilizados para obtener secuencias de loci expresados en tejido de mama y en otros tejidos. Estos loci candidatos se analizaron para identificar secuencias que confieren una susceptibilidad al cáncer. Los autores del invento han descubierto que existen mutaciones en la secuencia codificadora del locus BRCA1 en grupos familiares, que son responsables de la susceptibilidad al cáncer ligada a 17q, conocida como BRCA1. Este gen se desconocía que estuviera en esta región. El presente invento, no solamente facilita la detección temprana de determinados cáncer, tan vital para la supervivencia del paciente, sino que también permite la detección de los individuos susceptibles antes de que desarrollen un cáncer.

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Recursos poblacionales

Grupos familiares de Utah, grandes y bien documentados, son especialmente importantes en cuanto a proporcionar buenos recursos para estudios genéticos en seres humanos. Cada grupo familiar grande proporciona de manera independiente el poder para detectar si un alelo BRCA1 de susceptibilidad se esta segregando en esa familia. Individuos recombinantes informativos para la localización y aislamiento del locus BRCA1 podrían obtenerse solamente a partir de grupos familiares lo suficientemente grandes para confirmar la presencia de un alelo de susceptibilidad. Los grupos de individuos consanguíneos son especialmente importantes para estudiar el cáncer de mama, ya que la penetrancia del alelo BRCA1 de susceptibilidad se reduce tanto con la edad como con el sexo, lo que hace que grupos informativos de individuos consanguíneos sean difíciles de encontrar. Además, grandes grupos de individuos consanguíneos son esenciales para construir haplotipos de individuos fallecidos por inferencia de los haplotipos de sus parientes cercanos.

Mientras que otras poblaciones también pueden proporcionar una información beneficiosa, esos estudios generalmente requieren un esfuerzo mucho mayor, y las familias suelen ser mucho más pequeñas y por ello menos informativas. La incidencia del cáncer de mama ajustada por edades en Utah es 20% menor que la tasa media en EE.UU. La menor incidencia en Utah es probablemente debida en gran medida a una edad temprana del primer embarazo, lo que aumenta la probabilidad de que los casos encontrados en los grupos familiares de Utah porten una predisposición genética.

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Construcción de mapas genéticos

Dado un conjunto de familias informativas, los marcadores genéticos son esenciales para ligar una enfermedad a una región de un cromosoma. Esos marcadores incluyen polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) (Botstein y col., 1980), marcadores con un número variable de repeticiones en tandem (VNTR) (Jeffreys y col., 1985; Nakamura y col., 1987), y una clase abundante de polimorfismos de DNA basados en repeticiones cortas en tándem (STR) (del ingles, "Short Tandem Repeats"), especialmente repeticiones de CpA (Weber y May, 1989; Litt y col., 1989). Para generar un mapa genético, se seleccionan marcadores genéticos potenciales y se ensayan utilizando DNA extraído de miembros de los grupos familiares que están siendo estudiados.

Los marcadores genéticos útiles en la búsqueda de un locus genético asociado con una enfermedad pueden ser seleccionados sobre una base ad hoc, cubriendo densamente un cromosoma específico, o mediante un análisis detallado de una región específica de un cromosoma. Un método preferido para seleccionar marcadores genéticos ligados con una enfermedad incluye evaluar el grado de capacidad de aportar información de los grupos familiares para determinar la distancia ideal entre los marcadores genéticos de un grado determinado de polimorfismo, seleccionar luego marcadores procedentes de mapas genéticos que están espaciados de manera ideal para una máxima eficiencia. La capacidad de aportar información de los grupos familiares se mide por la probabilidad de que los marcadores sean heterocigóticos en individuos no emparentados. También es mas eficiente utilizar marcadores con STR que se detectan mediante la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana utilizando PCR; estos marcadores son altamente informativos, fáciles de ensayar (Weber y May, 1989), y pueden ser ensayados simultáneamente utilizando estrategias multíplices (Skolnick y Wallace, 1988), reduciendo enormemente el número de experimentos requerido.

Una vez establecido el ligamiento, es necesario encontrar marcadores que flanquean el locus de la enfermedad, es decir, uno o más marcadores en posición proximal con respecto al locus de la enfermedad y uno o más marcadores en posición distal con respecto al locus de la enfermedad. Cuando es posible, los marcadores candidatos pueden ser seleccionados en un mapa genético conocido. Cuando no se conoce ninguno, pueden identificarse marcadores nuevos mediante la técnica de las STR, como se muestra en los Ejemplos.

La construcción de mapas genéticos es usualmente un procedimiento iterativo. Se comenzó definiendo marcadores genéticos flanqueantes alrededor del locus BRCA1, después reemplazando estos marcadores flanqueantes con otros marcadores que estaban sucesivamente mas cerca del locus BRCA1. Como etapa inicial, eventos de recombinación, definidos en grupos familiares muy extensos, ayudó específicamente a localizar el locus BCRA1 en posición distal o proximal con respecto a un marcador genético especifico (Goldgar y col. 1994).

La región que circunda BRCA1 no estaba bien localizada en mapas y existían pocos marcadores. Por lo tanto, se analizaron secuencias repetitivas cortas en cósmidos subclonados en YAC, que habían sido localizadas en mapas físicos, con el fin de desarrollar nuevos marcadores genéticos. Utilizando esta estrategia, se descubrió uno de los marcadores,el 42D6, que reemplazo a pCMM86 como marcador flanqueante distal de la región de BRCA1. Debido a que 42D6 está a aproximadamente 14 cM de pCMM86, la región de BRCA1 quedaba así reducida en aproximadamente 14 centiMorgan (Easton y col., 1993). Se comenzó de este modo encontrando un marcador flanqueante distal de la región BRCA1, ligado de manera mucho más cercana. Después se descubrió que BRCA1 estaba en una posición distal con respecto al marcador genético Mfd15. Por lo tanto, se puso de manifiesto que BRCA1 se encontraba en una región de 6 a 10 millones de bases, limitada por Mfd15 y 42D6. Posteriormente se descubrió que el marcador Mfd191 estaba en posición distal con respecto a Mfd15 y en posición proximal con respecto a BRCA1. Por lo tanto, Mfd15 fue reemplazado con Mfd191 como marcador genético proximal más cercano. De manera similar, se descubrió que el marcador genético Mfd188 podría reemplazar al marcador genético 42D6, estrechando la región que contiene el locus BRCA1 hasta aproximadamente 1,5 millones de bases. Después el marcador Mfd191 fue reemplazado con tdj1474 como marcador proximal, y Mfd188 fue reemplazado con U5R como marcador distal, estrechando aún más la región de BRCA1 hasta una región lo suficientemente pequeña para permitir el aislamiento y caracterización del locus BRCA1 (véase la Figura 3), utilizando procedimientos conocidos en la técnica y que aquí se describen.

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Construcción de mapas físicos

Se emplearon tres métodos distintos para construir el mapa físico de la región. El primero fue utilizar cromosomas artificiales de levaduras (YAC) para clonar la región que está flanqueada por tdj1474 y U5R. El segundo fue la creación de un conjunto de clones en P1, BAC y en cósmidos que cubren la región que contiene el locus BRCA1.

Cromosomas Artificiales de Levaduras (YAC). Una vez identificada una región pequeña que contiene el locus BRCA1, se procedió al aislamiento físico del DNA de la región, identificando un conjunto de YAC solapantes que cubren la región. Los YAC útiles pueden ser aislados de bibliotecas conocidas, tales como las bibliotecas en YAC de St. Louis y de CEPH, que están ampliamente distribuidas y contiene aproximadamente 50.000 YAC cada una de ellas. Los YAC aislados procedieron de estas bibliotecas de acceso publico y pueden obtenerse procedentes de varias fuentes que incluyen el Michigan Genome Center. Evidentemente, otras personas que tengan acceso a estos YAC, sin la presente descripción, no sabrían el valor de los YAC específicos que se seleccionaron, ya que no sabrían cuáles de los YAC estaban dentro, y cuáles estaban fuera de la región más pequeña que contenía el locus BRCA1.

Clones en cósmidos, P1 y BAC. En la presente descripción, es ventajoso empezar obteniendo clones que cubren esta región, en cósmidos, P1 y BAC. El tamaño más pequeño de estos insertos, comparado con el de los insertos en YAC, los hace mas útiles como sondas de hibridación específicas. Además, tener el DNA clonado en células bacterianas, en lugar de en células de levadura, aumenta enormemente la facilidad con la que el DNA de interés puede ser manipulado, y mejora la relación señal-ruido de los ensayos de hibridación. Para los subclones de YAC en cósmidos, el DNA es parcialmente digerido con la enzima de restricción Sau3A, y se clona en el sitio BamHI del cósmido vector pWE15 (Stratagene, nº de catálogo 1251201). Los cósmidos que contienen secuencias humanas se someten a escrutinio mediante hibridación con un DNA humano repetitivo (p. ej., el DNA Humano C_{o}t-1, de Gibco/BRL, nº de catálogo 5279SA), y después se obtiene su huella genética mediante diversas técnicas, como se detalla en los Ejemplos.

Los clones en P1 y BAC se obtienen escrutando bibliotecas construidas a partir del genoma humano total, con sitios señalados con secuencias específicas (STS) (del ingles, "specific Sequence Tagged Sites") derivados de los YAC, cósmidos o P1 y BAC aislados como aquí se describe.

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Estos clones en P1, BAC, y en cósmidos pueden compararse mediante una PCR de las secuencias repetitivas interpuestas (IRS), y/o por digestiones con enzimas de restricción, seguidas de electroforesis en gel y comparación de los fragmentos de DNA resultantes (huella genética) (Maniattis y col 1982). Los clones pueden también ser caracterizados por la presencia de STS. Las huellas genéticas se utilizan para definir un conjunto de clones contiguos solapantes que cubre la región pero que no es excesivamente redundante, aquí denominado "camino embaldosado mínimo". Ese "camino embaldosado mínimo" constituye la base de experimentos posteriores para identificar cDNA que pueden originarse a partir del locus BRCA1.

Cobertura del espacio con clones en P1 y BAC. Para cubrir todos los espacios existentes en el "contig" de BRCA1, entre los cósmidos que se ha identificado que llevan clones genómicos, se utilizaron clones en vectores P1 y BAC que contienen insertos de DNA genómico, casi dos veces tan grandes como los de cósmidos en el caso de P1 e incluso más grandes todavía en el caso de los BAC (Sternberg, 1990; Sternberg y col., 1990; Pierce y col., 1992; Shizuya y col., 1992). Los clones en P1 fueron aislados por Genome Sciences utilizando cebadores para PCR proporcionados por los autores del invento para el escrutinio. Los BAC se obtuvieron por técnicas de hibridación en el laboratorio del Dr. Mel Simon. La estrategia consistente en utilizar clones en P1 permitió también la cobertura de la región genómica con un conjunto independiente de clones no derivados de YAC. Esto defiende frente a la posibilidad de otras deleciones en los que no han sido detectadas. Estas nuevas secuencias derivadas de los clones en P1 proporcionan el material para nuevos escrutinios de los genes candidatos, como se describe más adelante.

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Aislamiento de genes

Existen muchas técnicas para ensayar en clones genómicos la presencia de secuencias que son probables candidatas de ser la secuencia codificadora de un locus que se esta intentando aislar, que incluyen pero que no se limitan a las siguientes:

a.: Transferencias de DNA de especies animales

b.: identificación de islotes HTF

c.: trampa de exones

d.: hibridación de cDNA con cósmidos o YAC

e.: realización de escrutinios en bibliotecas de cDNA

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(a) Transferencias de DNA de especies animales. La primera técnica consiste en hibridar cósmidos con transferencias Southerns para identificar secuencias de DNA que se han conservado evolutivamente, y que por lo tanto proporcionan señales de hibridación positivas con DNA procedente de especies con grados variables de parentesco con seres humanos (tales como mono, vaca, pollo, cerdo, ratón y rata). Transferencias Southern que contienen esos DNA de diversas especies se encuentran comercialmente disponibles (Clonetech, Cat. 7753-1).

(b) Identificación de islotes HTF. La segunda técnica comprende encontrar regiones ricas en los nucleótidos C y G, que con frecuencia se presentan cerca o dentro de secuencias codificadoras. Esas secuencias se denominan HTF (del inglés, "Hpal Tiny Fragment") o islotes CpG, ya que enzimas de restricción específicas de sitios que contienen dímeros de CpG, cortan frecuentemente en estas regiones (Lindsay y col., 1987).

(c) Trampa de exones. La tercera técnica es la trampa de exones, método que identifica secuencias de DNA genómico que contienen juntas de corte y empalme y que por lo tanto es probable que comprendan secuencias codificadoras de genes. La amplificación de exones (Buckler y col., 1991) se utiliza para seleccionar y amplificar exones procedentes de los clones de DNA anteriormente descritos. La amplificación de exones se basa en la selección de secuencias de RNA que están flanqueadas por sitios funcionales de corte y empalme en 5' y/o 3'. Los productos de la amplificación de exones se utilizan para escrutar bibliotecas de cDNA de mama para identificar un numero manejable de genes candidatos para su posterior estudio. La trampa de exones puede también realizarse en segmentos pequeños de DNA secuenciado, utilizando programas de ordenador o mediante trampas en un sistema
lógico.

(d) Hibridación de cDNA con cósmidos, P1, BAC o YAC. La cuarta técnica es una modificación de la técnica de enriquecimiento selectivo que utiliza la hibridación de cDNA con cósmidos, P1, BAC o YAC, y permite que secuencias transcritas sean identificadas en el DNA genómico clonado, y sean recuperadas a partir del mismo (Kandpal y col., 1990). La técnica de enriquecimiento selectivo, modificada para el presente propósito, incluye unir DNA procedente de la región de BRCA1, presente en un YAC, a una matriz contenida en una columna, y seleccionar los cDNA procedentes de las bibliotecas relevantes que se hibridan con el DNA unido, seguido de la amplificación y purificación del DNA unido, obteniéndose como resultado un gran enriquecimiento de cDNA en la región representada por el DNA genómico clonado.

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(e) Identificación de cDNA. La quinta técnica consiste en identificar los cDNA que corresponden al locus BRCA1. Sondas de hibridación que contienen secuencias codificadoras putativas, seleccionadas utilizando cualquiera de las técnicas anteriores, se utilizan para escrutar diferentes bibliotecas, incluyendo bibliotecas de cDNA de tejido mamario, bibliotecas de cDNA de ovarios, y cualquier otras bibliotecas necesarias.

Otra variación sobre el tema de la selección directa de los cDNA se utilizó también para encontrar genes candidatos a ser BRCA1 (Lovett y col., 1991; Futreal, 1993). Este método utiliza como sonda DNA de cósmidos, P1 o BAC. El DNA de la sonda se digiere con una enzima de restricción que corta extremos romos, tal como HaeIII. A continuación se ligan al DNA adaptadores bicatenarios, y sirven como sitios de unión para cebadores en posteriores reacciones de amplificación por PCR que utilizan cebadores biotinilados. El cDNA diana se genera a partir del mRNA derivado de muestras de tejido, p. ej., de tejido de mama, mediante la síntesis de la primera cadena ya sea cebada al azar o cebada con oligo (dT), seguida de la síntesis de la segunda cadena. Los extremos del cDNA se hacen romos y se ligan a adaptadores bicatenarios. Estos adaptadores sirven como sitios de amplificación para la PCR. Las secuencias diana y las secuencias sonda se desnaturalizan y se mezclan con DNA C_{o}t-1 humano para bloquear las secuencias repetitivas. La hibridación en disolución se lleva a cabo con valores altos de C_{o}t-1/2 para asegurar la hibridación de moléculas raras de cDNA diana. El material reasociado se captura después sobre bolitas de avidina, se lava en condiciones de alta rigurosidad y los cDNA retenidos se eluyen y amplifican por PCR. El cDNA seleccionado se somete a nuevas rondas de enriquecimiento antes de ser clonado en un vector plasmídico para su análisis.

Ensayos de cDNA para la búsqueda de candidatos

La prueba de que el cDNA corresponde al locus BRCA1 se obtiene encontrando secuencias en el DNA extraído de miembros afectados de un grupo familiar, que crean productos anormales del gen BRCA1 o niveles anormales del producto del gen BRCA1. Esos alelos BRCA1 de susceptibilidad se cosegregarán junto con la enfermedad en grupos familiares de gran tamaño. Estarán también presentes con una frecuencia mucho más alta en individuos no pertenecientes a un grupo familiar, que presentan cáncer de mama y ovario, que en individuos de la población general. Por último, ya que los tumores frecuentemente mutan en células somáticas en loci que en otras circunstancias están mutados en la línea germinal, se espera encontrar alelos BRCA1 normales de la línea germinal, mutados dentro de secuencias que son idénticas o similares a los alelos BRCA1 de susceptibilidad, en DNA extraído de tejido tumoral. Ya se estén comparando secuencias de BRCA1 procedentes de tejido tumoral, con alelos BRCA1 procedentes de la línea germinal de los mismos individuos, o se estén comparando alelos BRCA1 de la línea germinal, procedentes de casos de cáncer, con los procedentes de individuos no afectados, la clave está en encontrar mutaciones lo suficientemente importantes para causar una alteración obvia en la función normal del producto génico. Estas mutaciones pueden tomar varias formas. Las formas más graves serían mutaciones por desplazamiento del marco de lectura o grandes deleciones que harían que el gen codificase una proteína anormal, o una mutación que alterase significativamente la expresión de la proteína. Mutaciones que causarían una alteración menos graves incluirían pequeñas deleciones en el marco de lectura y sustituciones no conservativas de pares de bases, que tendrían un efecto importante en la proteína producida, tales como cambios a, o de, un residuo de cisteína, de un aminoácido básico a un aminoácido ácido o viceversa, de un aminoácido hidrófobo a uno hidrófilo o viceversa, u otras mutaciones que afectarían a la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de la proteína. Las mutaciones silentes o aquellas mutaciones que producen como resultado sustituciones conservativas de aminoácidos, en general no se espera que alteren la función de la proteína.

De acuerdo con el método de diagnóstico y pronóstico del presente invento, se detecta la alteración 185delGA del locus BRCA1 de tipo salvaje. Además, el método puede realizarse detectando el locus BRCA1 de tipo salvaje y confirmando la falta de una predisposición al cáncer en el locus BRCA1. "Alteración de un gen de tipo salvaje" generalmente abarca todas las formas de mutaciones que incluyen deleciones, inserciones y mutaciones puntuales en regiones codificadoras y no codificadoras. Las deleciones pueden ser de todo el gen o solamente de una parte del mismo. Las mutaciones puntuales pueden producir codones de parada, mutaciones por desplazamiento del marco de lectura o sustituciones de aminoácidos. Las mutaciones somáticas son aquellas que tienen lugar sólo en determinados tejidos, p. ej., en el tejido tumoral, y no se heredan en la línea germinal. Las mutaciones en la línea germinal pueden encontrarse en cualquiera de los tejidos del organismo y se heredan. Cuando sólo uno solo de los alelos está mutado somáticamente, se anuncia un estado neoplásico temprano. Sin embargo, cuando ambos alelos están mutados somáticamente, en ese caso se anuncia un estado neoplásico tardío. El hallazgo de mutaciones en BRCA1 proporciona por lo tanto una información tanto de diagnóstico como de pronóstico. Un alelo BRCA1 que no está delecionado (p. ej., un alelo encontrado en el cromosoma hermano de un cromosoma que porta una deleción de BRCA1) puede escrutarse para buscar otras mutaciones, tales como inserciones, deleciones pequeñas y mutaciones puntuales. Se piensa que muchas mutaciones encontradas en tejidos tumorales serán aquellas que conducen a una expresión disminuida del producto del gen BRCA1. Sin embargo, las mutaciones que conducen a productos génicos no funcionales, también conducirían a un estado canceroso. Los eventos mutacionales puntuales pueden tener lugar en regiones reguladoras, tales como en el promotor del gen, conduciendo a la perdida o disminución de la expresión del mRNA. Las mutaciones puntuales también pueden suprimir un procesamiento adecuado del RNA, conduciendo a la perdida de expresión del producto del gen BRCA1, o a una disminución en la estabilidad del mRNA o en la eficacia de la traducción.

Técnicas de diagnostico útiles incluyen, pero no se limitan a ellas, la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), secuenciación directa de DNA, análisis de PFGE, análisis de transferencia Southern, análisis conformacional de cadena sencilla (SSCA) (del ingles, "Single Stranded Conformation Arialysis"), ensayo de protección frente a RNasas, técnica del oligonucleótido alelo-específico (ASO) (del ingles, "Allele-Specific Oligonucleotide"), análisis de transferencia puntual y PCR-SSCP, según se comentan con detalle mas adelante.

La predisposición al cáncer, tal como al cáncer de mama u ovario, y a los otros cáncer aquí identificados, puede ser descubierta ensayando un tejido cualquiera de un ser humano con respecto a mutaciones del gen BRCA1. Por ejemplo, una persona que ha heredado una mutación BRCA1 de la línea germinal, estaría predispuesta a desarrollar cáncer. Esto puede determinarse ensayando el DNA procedente de un tejido cualquiera del cuerpo de esa persona. De manera más simple, se puede sacar sangre y extraer el DNA de las células de la sangre. Además, puede realizarse un diagnostico prenatal ensayando células fetales, células de placenta o células de líquido amniótico con respecto a mutaciones del gen BRCA1. La alteración de un alelo BRCA1 de tipo salvaje, ya sea por ejemplo mediante mutación puntual o mediante deleción, puede ser detectada por cualquiera de los medios que aquí se describen.

Existen varios métodos que pueden utilizarse para detectar una variación en la secuencia de DNA. La secuenciación directa de DNA, ya sea secuenciación manual o secuenciación automática con fluorescencia, es capaz de detectar una variación en la secuencia. Para un gen tan grande como el BRCA1, la secuenciación manual requiere mucho trabajo, pero en condiciones óptimas, raramente se pierden mutaciones en la secuencia codificadora de un gen. Otra estrategia es el análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCA) (del ingles, "Single-Stranded Conformation Assay") (Orita y col., 1989). Este método no detecta todos los cambios de secuencia, en especial si el tamaño del fragmento de DNA es mayor que 200 pb, pero puede optimizarse para que detecte la mayoría de las variaciones de secuencia del DNA. La sensibilidad reducida de la detección es un inconveniente, pero el rendimiento aumentado posible utilizando SSCA lo convierte en una alternativa viable para dirigir la secuenciación para la detección de mutaciones al nivel de investigación científica. Los fragmentos que presentan un cambio de movilidad en geles de SSCA son luego secuenciados para determinar la naturaleza exacta de la variación en la secuencia de DNA. Otras estrategias basadas en la determinación de desapareamientos entre las dos cadenas de DNA complementarias, incluyen electroforesis en geles desnaturalizantes fijados (CDGE) (del inglés, "Clamped Denaturing Gel Electrophoresis") (Sheffield y col., 1991), análisis de los heterodúplex (HA) (White y col., 1992) y escisión química de desapareamientos (CMC) (del inglés, "Chemical Mistmatch Cleavage") (Grompe y col., 1989). Ninguno de los métodos anteriormente descritos detectan deleciones, duplicaciones o inserciones de gran tamaño, ni tampoco detectan una mutación en elementos reguladores que afecta a la transcripción o traducción de la proteína. Otros métodos que podrían detectar esta clase de mutaciones, tales como un ensayo de truncamiento de proteínas o el ensayo asimétrico, detectan solamente tipos específicos de mutaciones y no detectarían mutaciones erróneas. Una revisión de los métodos actualmente disponibles para detectar una variación en la secuencia de DNA pueden encontrarse en una reciente revisión de Grompe (1993). Una vez conocida una mutación, puede utilizarse una estrategia de detección alelo-específica, tal como una hibridación con un oligonucleótido alelo-especifico (ASO), para escrutar con rapidez grandes cantidades de otras muestras para buscar esa misma mutación.

Con el fin de detectar la alteración del gen BRCA1 de tipo salvaje en un tejido, es útil aislar el tejido, liberándolo de tejidos normales circundantes. En la técnica se conocen medios para el enriquecimiento de una preparación de tejido de células tumorales. Por ejemplo, el tejido puede aislarse en secciones de parafina o criostato. Las células cancerosas pueden también separarse de las células normales mediante citometría de flujo. Estos procedimientos, así como otros procedimientos para separar células tumorales de células normales, son muy conocidos en la técnica. Si el tejido tumoral está altamente contaminado con células normales, la detección de las mutaciones es más
difícil.

Un análisis preliminar rápido para detectar polimorfismos en secuencias de DNA puede realizarse observando una serie de transferencias Southern de DNA cortado con una o más enzimas de restricción, preferiblemente con un gran número de enzimas de restricción. Cada transferencia contiene una serie de individuos normales y una serie de casos de cáncer, tumores o ambos. Las transferencias Southern que muestran fragmentos que han hibridado (que difieren en longitud del DNA de control cuando se hibridan con secuencias cercanas al locus BRCA1 o que lo incluyen) indican una posible mutación. Cuando se utilizan enzimas de restricción que producen fragmentos de restricción de gran tamaño, se emplea una electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) (del ingles, "Pulsed Field Gel Electrophoresis").

La detección de mutaciones puntuales puede llevarse a cabo mediante clonación molecular del alelo(s) BRCA1 y secuenciación del alelo(s) utilizando procedimientos muy conocidos en la técnica. Como alternativa, las secuencias génicas pueden amplificarse directamente a partir de una preparación de DNA genómico procedente de tejido tumoral, utilizando técnicas muy conocidas. La secuencia de DNA de las secuencias amplificadas puede ser entonces determinada.

Existen seis métodos muy conocidos para un ensayo más completo, aunque aún indirecto, para confirmar la presencia de un alelo de susceptibilidad: 1) el análisis conformacional de cadena sencilla (SSCA) (Orita y col., 1989); 2) electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE) (Wartell y col., 1990; Sheffield y col., 1989); 3) ensayos de protección frente a RNasas (Finkelstein y col., 1990; Kinszler y col., 1991); 4) oligonucleótidos alelo-específicos (ASO) (Conner y col., 1983); 5) el empleo de proteínas que reconocen desapareamientos de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. coli (Modrich, 1991); y 6) PCR alelo-especifica (Rano y Kidd, 1989). Para la PCR alelo-específica, se utilizan cebadores que se hibridan por sus extremos 3' con una mutación BRCA1 particular. Si la mutación BRCA1 particular no esta presente, no se observa un producto de la amplificación. También puede utilizarse un sistema de amplificación refractario a mutaciones (ARMS) (del inglés, "Amplification Refractory Mutation System"), como se describe en la Publicación de solicitudes de Patentes europeas No. 0332435 y en Newton y col., 1989. Las inserciones y deleciones de genes pueden detectarse también por clonación, secuenciación y amplificación. Además, pueden utilizarse sondas de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) correspondientes al gen o a genes marcadores circundantes, para valorar la alteración de un alelo o una inserción en un fragmento polimórfico. Este método es particularmente útil para escrutar en familiares de un individuo afectado la presencia de la mutación BRCA1 encontrada en ese individuo. Pueden utilizarse otros procedimientos para detectar inserciones y deleciones según se conocen en la técnica.

En los tres primeros métodos (SSCA, DGGE y el ensayo de protección frente a RNasas), aparece una nueva banda electroforética. El SSCA detecta una banda que migra de manera diferente debido a que el cambio en la secuencia produce una diferencia en el apareamiento intramolecular de bases, en una sola cadena. La protección frente a RNasas implica la escisión del polinucleótido mutante en dos o más fragmentos más pequeños. La DGGE detecta diferencias en las velocidades de migración de las secuencias mutantes en comparación con las secuencias de tipo salvaje, utilizando un gel desnaturalizante en gradiente. En un ensayo de oligonucleótido alelo-específico, se diseña un oligonucleótido que detecta una secuencia específica, y el ensayo se realiza detectando la presencia o ausencia de una señal de hibridación. En el ensayo con la proteína mutS, ésta se une solamente a secuencias que contienen un desapareamiento de nucleótidos en un heterodúplex formado entre la secuencia mutante y la de tipo
salvaje.

Los desapareamientos son dúplex de ácidos nucleicos hibridados en los que las dos cadenas no son complementarias al 100%. La falta de una homología completa puede deberse a deleciones, inserciones, inversiones o sustituciones. La detección de desapareamientos puede utilizarse para detectar mutaciones puntuales en el gen o en su mRNA producto. Mientras que estas técnicas son menos sensibles que la secuenciación, son más sencillas de realizar en un número grande de muestras de tumores. Un ejemplo de una técnica de escisión de desapareamientos es el método de protección frente a RNasas. En la práctica del presente invento, el método implica el empleo de una ribosonda marcada, que es complementaria a la secuencia codificadora del gen BRCA1 humano de tipo salvaje. La ribosonda y mRNA o DNA aislado del tejido tumoral, se reasocian (se hibridan) entre sí y posteriormente se digieren con la enzima RNasa A que es capaz de detectar algunos desapareamientos en una estructura de RNA dúplex. Si la RNasa A detecta un desapareamiento, esta enzima escinde por el sitio del desapareamiento. Asó, cuando la preparación de los RNA reasociados se separa sobre una matriz electroforética de un gel, si se ha detectado un desapareamiento y la RNasa A lo ha escindido, se podrá observar un producto de RNA que es más pequeño que el RNA dúplex de longitud completa correspondiente a la ribosonda y al mRNA o al DNA. La ribosonda no necesita tener la longitud completa del mRNA de BRCA1 o del gen BRCA1 sino que puede ser un segmento de cualquiera de ambos. Si la ribosonda comprende solamente un segmento del mRNA de BRCA1 o del gen BRCA1, será conveniente utilizar varias de estas sondas para escrutar la secuencia completa del mRNA para buscar desaparea-
mientos.

De manera similar, pueden utilizarse sondas de DNA para detectar desapareamientos, a través de una escisión enzimática o química. Véanse, p. ej., Cotton y col., 1988; Shenk y col., 1975; Novack y col., 1986. Como alternativa, los desapareamientos pueden ser detectados por cambios en la movilidad electroforética de los dúplex desapareados con respecto a los dúplex apareados. Véase, p. ej., Cariello, 1988. Tanto con las ribosondas como con las sondas de DNA, el mRNA o el DNA celular que pudiera contener una mutación, puede ser amplificado utilizando una PCR (véase más adelante) antes de la hibridación. También pueden detectarse cambios en el DNA del gen BRCA1 utilizando una hibridación Southern, especialmente si los cambios son grandes reordenaciones, tales como deleciones e
inserciones.

Las secuencias de DNA del gen BRCA1 que han sido amplificadas mediante el empleo de una PCR, también pueden ser escrutadas utilizando sondas alelo-específicas. Estas sondas son oligómeros de ácido nucleico, y cada una de ellas contiene una región de la secuencia del gen BRCA1 que alberga una mutación conocida. Por ejemplo, un oligómero puede tener aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, que corresponden a una porción de la secuencia del gen BRCA1. Mediante el empleo de una batería de esas sondas alelo-específicas, los productos de la amplificación por PCR pueden ser escrutados para identificar la presencia de una mutación previamente identificada en el gen BRCA1. La hibridación de sondas alelo-específicas con secuencias de BRCA1 amplificadas puede llevarse a cabo, por ejemplo, sobre un filtro de nilón. La hibridación con una sonda particular en condiciones de rigurosidad de la hibridación, indica la presencia de la misma mutación en el tejido tumoral que en la sonda alelo-
específica.

El ensayo más definitivo para detectar mutaciones en un locus candidato es comparar directamente las secuencias genómicas de BRCA1 procedentes de pacientes con cáncer con las procedentes de una población de control. Como alternativa, se podría secuenciar el RNA mensajero después de la amplificación, p. ej., mediante PCR, eliminando de este modo la necesidad de determinar la estructura de los exones del gen candidato.

Las mutaciones de pacientes con cáncer que caen fuera de la región codificadora de BRCA1, pueden ser detectadas examinando las regiones no codificadoras, tales como intrones y secuencias reguladoras que se encuentran cerca o en el interior del gen BRCA1. Una indicación temprana de que las mutaciones en regiones no codificadoras son importantes, puede provenir de experimentos de transferencia Northern que revelan moléculas de RNA mensajero de un tamaño o abundancia anormales en pacientes con cáncer en comparación con individuos de control.

La alteración de la expresión del mRNA del BRCA1 puede detectarse mediante cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen análisis de transferencia Northern, amplificación por PCR y protección frente a RNasas. La expresión disminuida de mRNA indica una alteración del gen BRCA1 de tipo salvaje. La alteración de los genes BRCA1 de tipo salvaje también puede detectarse mediante un escrutinio para buscar una alteración de la proteína BRCA1 de tipo salvaje. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con BRCA1, para realizar el escrutinio en un tejido. La ausencia de un antígeno afín indicaría una mutación en BRCA1. Anticuerpos específicos de productos de alelos mutantes podrían también utilizarse para detectar un producto del gen BRCA1 mutante. Estos ensayos inmunológicos pueden realizarse en cualquiera de los formatos convenientes conocidos en la técnica. Esos formatos incluyen transferencias Western, ensayos inmunohistoquímicos y ensayos de ELISA. Cualquiera de los medios existentes para detectar una proteína BRCA1 alterada, puede utilizarse para detectar una alteración de los genes BRCA1 de tipo salvaje. Pueden utilizarse ensayos funcionales, tales como determinaciones de unión a proteínas. Además, pueden utilizarse ensayos que detectan la función bioquímica de BRCA1. El que se encuentre un producto del gen BRCA1 mutante indica una alteración de un gen BRCA1 de tipo salvaje.

Genes BRCA1 mutantes o productos de los genes BRCA1 mutantes pueden también detectarse en otras muestras del organismo humano, tales como suero, heces, orina y esputos. Las mismas técnicas anteriormente comentadas para la detección de genes BRCA1 mutantes o de productos de los genes en tejidos, pueden aplicarse a otras muestras corporales. Las células cancerosas se desprenden de los tumores, y aparecen en esas muestras corporales. Además, el propio producto del gen BRCA1 puede ser secretado en el espacio extracelular y encontrarse en estas muestras corporales incluso en ausencia de células cancerosas. Realizando un escrutinio en esas muestras corporales, puede conseguirse un diagnóstico temprano y sencillo de muchos tipos de cáncer. Además, el progreso de una quimioterapia o radioterapia puede seguirse más fácilmente ensayando esas muestras corporales con respecto a genes BRCA1 mutantes o a los productos génicos.

Los métodos de diagnóstico del presente invento son aplicables a cualquier tumor en el que la mutación 185delGA en BRCA1 desempeña un papel en la tumorigénesis. El método de diagnóstico del presente invento es útil para los médicos, de manera que pueden decidir sobre un modo de tratamiento apropiado.

Los pares de cebadores de la presente descripción son útiles para la determinación de las secuencias de nucleótidos de un alelo BRCA1 particular utilizando PCR. Los pares de cebadores de DNA monocatenarios pueden reasociarse con secuencias que están dentro o que circundan el gen BRCA1 en el cromosoma 17q21, con el fin de prepararla síntesis amplificante de DNA del propio gen BRCA1. Un conjunto completo de estos cebadores permite la síntesis de todos los nucleótidos de las secuencias codificadoras de BRCA1, es decir, de los exones. El conjunto de cebadores preferiblemente permite la síntesis de secuencias tanto de intrones como de exones. También pueden utilizarse cebadores alelo-específicos. Esos cebadores se reasocian solamente con alelos BRCA1 mutantes particulares, y de este modo solamente amplificaran un producto en presencia de un alelo mutante que hace de molde.

Con el fin de facilitar la posterior clonación de secuencias amplificadas, los cebadores pueden llevar secuencias de sitios para enzimas de restricción añadidas a sus extremos 5'. Así, todos los nucleótidos de los cebadores derivan de secuencias de BRCA1 o de secuencias adyacentes a BRCA1, a excepción de los pocos nucleótidos necesarios para formar un sitio para enzimas de restricción. Estas enzimas y estos sitios se conocen bien en la técnica. Los propios cebadores pueden ser sintetizados utilizando procedimientos que son muy conocidos en la técnica. En general, los cebadores pueden prepararse utilizando máquinas sintetizadoras de oligonucleótidos que se encuentran comercialmente disponibles. Dada la secuencia del marco de lectura abierto de BRCA1, que se muestra en la SEQ ID NO:1, el diseño de cebadores particulares está dentro de la experiencia en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico proporcionadas por el presente invento son útiles para varios fines. Pueden utilizarse en la hibridación Southern con DNA genómico y en el método de protección frente a RNasas para detectar mutaciones puntuales, como ya se ha descrito anteriormente. Las sondas pueden utilizarse para detectar los productos de amplificación por PCR. Pueden también utilizarse para detectar desapareamientos con el gen BRCA1 o con mRNA de BRCA1 utilizando otras técnicas.

Se ha descubierto que individuos que llevan el gen BRCA1 de tipo salvaje no presentan el cáncer que se produce como resultado del alelo BRCA1. Sin embargo, en la patogénesis del cáncer están implicadas mutaciones que interfieren con la función de la proteína BRCA1. Así pues, la presencia de un gen BRCA1 alterado (o de un gen BRCA1 mutante), que produce una proteína que presenta una pérdida de función, o una función alterada, se correlaciona directamente con un riesgo aumentado de cáncer. Con el fin de detectar una mutación en el gen BRCA1, se prepara una muestra biológica y se analiza para buscar una diferencia entre la secuencia del alelo BRCA1 que está siendo analizado y la secuencia del alelo BRCA1 de tipo salvaje. Los alelos BRCA1 mutantes pueden identificarse inicialmente mediante cualquiera de las técnicas anteriormente descritas. Los alelos mutantes se secuencian luego para identificar la mutación específica del alelo mutante particular. Como alternativa, los alelos BRCA1 mutantes pueden identificarse inicialmente identificando proteínas BRCA1 mutantes (alteradas), utilizando técnicas convencionales. Los alelos mutantes se secuencian luego para identificar la mutación específica de cada alelo. La mutación 185delAG, que conduce a una función alterada de la proteína BRCA1, se utiliza luego para los métodos de diagnóstico y de pronóstico del presente invento.

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Definiciones

El presente invento utiliza las siguientes definiciones:

La "amplificación de polinucleótidos" utiliza métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación mediante ligación (o reacción en cadena de la ligasa, LCR) y métodos de amplificación basados en el empleo de la Q-beta-replicasa. Estos métodos son muy conocidos y ampliamente practicados en la técnica. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202 e Innis y col., 1990 (para PCR); y Wu y col., 1989a (para la LCR). Los reactivos y el sistema de soporte físico para llevar a cabo una PCR, se encuentran comercialmente disponibles. Los cebadores útiles para amplificar secuencias de la región de BRCA1 son preferiblemente complementarios a secuencias de la región de BRCA1 o de regiones que flanquean una región diana contenida en ella, y que se hibridan específicamente con dichas secuencias. Las secuencias de BRCA1 generadas mediante amplificación pueden secuenciarse directamente. Como alternativa, pero menos deseable, la secuencia(s) amplificada puede clonarse antes del análisis de la secuencia(s). Un método para la clonación directa y el análisis de la secuencia de segmentos genómicos amplificados enzimáticamente ha sido descrito por Scharf, 1986.

"Polinucleótido analito" y "cadena de analito" se refieren a un polinucleótido monocatenario o bi-catenario del que se sospecha que contiene una secuencia diana, y que puede estar presente en diversos tipos de muestras, incluyendo muestras biológicas.

"Pareja de unión" se refiere a una molécula capaz de unirse a una molécula de ligando con una elevada especificidad, como por ejemplo, un antígeno y un anticuerpo específico del antígeno, o una enzima y su inhibidor. En general, las parejas de unión específica deben unirse con la suficiente afinidad para inmovilizar el dúplex formado por la copia del analito/cadena complementaria (en el caso de una hibridación de polinucleótidos) en las condiciones del aislamiento. En la técnica se conocen parejas de unión específica e incluyen, por ejemplo, biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, las numerosas y conocidas parejas de receptor-ligando y cadenas de polinucleótidos complementarios. En el caso en el que las parejas de unión son polinucleótidos complementarios, las parejas normalmente tienen una longitud al menos de aproximadamente 15 bases, y pueden tener una longitud al menos de 40 bases. Los polinucleótidos pueden estar compuestos por DNA, RNA o pueden ser análogos sintéticos de nucleótidos.

Una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o de fluido de la que se sospecha que contiene un polinucleótido analito o un polipéptido analito procedente de un individuo, que incluye, pero sin estar limitado a ello, p. ej., plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, secciones externas de piel, de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, células sanguíneas, tumores, órganos, tejidos y muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro.

Según aquí se utilizan, los términos "diagnostico" o "pronóstico", utilizados en el contexto de una neoplasia, se utilizan para indicar 1) la clasificación de lesiones como neoplasias, 2) la determinación de la gravedad de la neoplasia, o 3) el seguimiento de la progresión de la enfermedad, antes, durante o después del tratamiento.

"Codifica". Se dice que un polinucleótido "codifica" un polipéptido si, en su estado natural o cuando se manipula mediante métodos muy conocidos por los expertos en la técnica, puede transcribirse y/o traducirse para producir el mRNA correspondiente al polipéptido o a uno de sus fragmentos y/o el polipéptido o uno de sus fragmentos. La cadena antisentido es el complemento de ese ácido nucleico, y la secuencia codificadora puede deducirse a partir de ella.

"Aislado" o "sustancialmente puro". Un ácido nucleico "aislado" o "sustancialmente puro" (p. ej., un RNA, DNA o un polímero mixto) es un ácido nucleico que se separa sustancialmente de otros componentes celulares que acompañan en la naturaleza a una secuencia o proteína humana natural, p. ej., ribosomas, polimerasas, muchas otras secuencias del genoma humano y proteínas. El término o la expresión abarca una secuencia de ácido nucleico o una proteína, que ha sido extraída de su entorno natural, e incluye materiales aislados de DNA recombinante o clonado, y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos.

"Alelo BRCA1" se refiere a los alelos normales del locus BRCA1 así como a los alelos que portan variaciones que predisponen a los individuos a desarrollar un cáncer de muchas localizaciones que incluyen, por ejemplo, cáncer de mama, ovario, colorectal y de próstata. Esos alelos causantes de predisposición son también denominados "alelos BRCA1 de susceptibilidad".

"Locus BRCA1", "Gen BRCA1", "Ácidos Nucleicos BRCA1" o "Polinucleótido BRCA1" se refieren cada una de las expresiones a polinucleótidos, que se encuentran todos ellos en la región de BRCA1, que tienen probabilidad de ser expresados en tejidos normales, de los cuales, algunos alelos predisponen a un individuo a desarrollar cáncer de mama, ovario, colorectal y de próstata. Las mutaciones en el locus BRCA1 pueden estar implicadas en la iniciación y/o progresión de otros tipos de tumores. El locus está señalado en parte por mutaciones que predisponen a los individuos a desarrollar cáncer. Estas mutaciones caen dentro de la región de BRCA1 descrita infra. El locus BRCA1 se entiende que incluye secuencias codificadoras, secuencias interpuestas y elementos de regulación que controlan la transcripción y/o traducción. El locus BRCA1 se entiende que incluye todas las variaciones alélicas de la secuencia de
DNA.

Estos términos y expresiones, cuando se aplican a un ácido nucleico, se refieren a un ácido nucleico que codifica un polipéptido, fragmento, homólogo o variante de BRCA1, incluyendo, p. ej., fusiones o deleciones de proteínas. Los ácidos nucleicos de la presente descripción poseen una secuencia que o bien deriva de, o es sustancialmente similar a, un gen que codifica BRCA1 natural, o un gen que presenta una homología sustancial con un gen que codifica BRCA1 natural, o una de sus porciones. La secuencia codificadora de un polipéptido BRCA1 se muestra en la SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO:2.

Las composiciones de polinucleótidos de esta descripción incluyen RNA, cDNA, DNA genómico, formas sintéticas y polímeros mixtos, tanto cadenas con sentido como sin sentido, y pueden estar química o bioquímicamente modificadas, o pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivadas, como apreciaran fácilmente los expertos en la técnica. Esas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o mas de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces con grupos no cargados (p. ej., metil-fosfonatos, fosfotrieósteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), enlaces con grupos cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (p. ej., polipéptidos), agentes intercalantes (p. ej., acridina, psoralen, etc.), agentes quelantes, agentes alquilantes, y enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc). También se incluyen moléculas sintéticas que mimetizan polinucleótidos en su capacidad para unir una secuencia diseñada a través de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Esas moléculas son conocidas en la técnica, e incluyen, por
ejemplo, moléculas en las que enlaces de fosfato sustituyen a enlaces peptídicos en la cadena principal de la molécula.

El presente invento proporciona ácidos nucleicos recombinantes que son vectores replicativos de clonación que comprenden dichas sondas de ácidos nucleicos de la región de BRCA1. La construcción recombinante puede ser capaz de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora. Como alternativa, la construcción recombinante puede llegar a integrarse en el DNA cromosómico de la célula hospedadora. Esos polinucleótidos recombinantes comprenden un polinucleótido de origen genómico, de cDNA, semisintético o sintético, el cual, en virtud de su origen o manipulación, 1) no está asociado con la totalidad o con una parte de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; 2) está enlazado a un polinucleótido diferente al polinucleótido con el que está enlazado en la naturaleza; o 3) no está presente en la naturaleza.

Por lo tanto, este invento proporciona ácidos nucleicos recombinantes que comprenden secuencias de otro modo no presentes en la naturaleza. Aunque puede utilizarse la secuencia de tipo salvaje, con frecuencia será alterada, p. ej., por deleción, sustitución o inserción.

Pueden realizarse escrutinios en bibliotecas de cDNA o en bibliotecas genómicas de diferentes tipos, consideradas como fuentes naturales de los ácidos nucleicos de la presente descripción, o bien esos ácidos nucleicos pueden obtenerse por amplificación de secuencias que residen en el DNA genómico o en otras fuentes naturales, p. ej., por PCR. La elección de las bibliotecas de cDNA normalmente corresponde a una fuente de un tejido que tiene abundancia de los mRNA de las proteínas deseadas. Normalmente son preferidas las bibliotecas en fagos, pero también pueden utilizarse otros tipos de bibliotecas. Los clones de una biblioteca se extienden en placas, se transfieren a un sustrato adecuado para realizar el escrutinio, se desnaturalizan y se hibridan con sondas para detectar la presencia de las secuencias deseadas.

Las secuencias de DNA utilizadas en este invento usualmente comprenden al menos aproximadamente cinco codones (15 nucleótidos), más usualmente al menos aproximadamente 7-15 codones, y más preferiblemente, al menos aproximadamente 35 codones. También pueden estar presentes uno o más intrones. Este número de nucleótidos usualmente es aproximadamente la longitud mínima requerida para una sonda correcta que se hibride específicamente con una secuencia codificadora de BRCA1.

Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos se encuentran descritas de manera general, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989 o en Ausubel y col., 1992. Los reactivos útiles en la aplicación de estas técnicas, tales como enzimas de restricción y reactivos similares, son ampliamente conocidos en la técnica y se encuentran comercialmente disponibles procedentes de casas comerciales tales como New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega Biotec, Biochemicals U.S., New England Nuclear, y varias otras fuentes.

"Región de BRCA1" se refiere a una porción del cromosoma humano 17q21, limitada por los marcadores tdj1474 y U5R. Esta región contiene el locus BRCA1, que incluye el gen BRCA1.

Según aquí se utiliza, las expresiones "locus BRCA1", "alelo BRCA1" y "región de BRCA1" se refieren todas ellas a un DNA bicatenario que comprende el locus, el alelo o la región, así como a cualquiera de los DNA monocatenarios que comprenden el locus, el alelo o la región.

Según aquí se utiliza, una "porción" del locus BRCA1 o de la región BRCA1 o del alelo BRCA1, viene definida por tener un tamaño mínimo al menos de aproximadamente ocho nucleótidos, o preferiblemente de aproximadamente 15 nucleótidos, o más preferiblemente de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, y puede tener un tamaño mínimo de al menos aproximadamente 40 nucleótidos.

"Operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una interrelación que los permite actuar de la manera requerida. Por ejemplo, un promotor esta operativamente enlazado a una secuencia codificadora si el promotor afecta a su transcripción o expresión.

"Sondas". Los polimorfismos de polinucleótidos asociados con alelos BRCA1, que predisponen a determinados cáncer o están asociados con muchos cáncer, se detectan por hibridación con una sonda polinucleotídica que forma un híbrido estable con el polinucleótido de la secuencia diana, en condiciones de hibridación y de lavado desde rigurosas hasta moderadamente rigurosas. Si se espera que las sondas sean perfectamente complementarias a la secuencia diana, se utilizaran condiciones de rigurosidad. La rigurosidad de la hibridación puede ser rebajada si se espera la existencia de desapareamientos, por ejemplo, si se espera la existencia de variantes, lo que da como resultado que la sonda no sea completamente complementaria. Se escogen condiciones que excluyen uniones inespecíficas/adventicias, es decir, condiciones que minimizan el ruido. Ya que estas indicaciones identifican polimorfismos neutros de DNA así como mutaciones, estas indicaciones necesitan un análisis posterior para demostrar la detección de un alelo BRCA1 de susceptibilidad.

Las sondas para los alelos BRCA1 pueden derivar de las secuencias de la región de BRCA1 ó de sus cDNA. Las sondas 185delAG tendrán de 15 a 30 nucleótidos, que abarcan una porción de la región de BRCA1 y que permiten una hibridación específica con la región de BRCA1. Si la secuencia diana contiene una secuencia idéntica a la de la sonda, el híbrido será relativamente estable incluso en condiciones de rigurosidad. Si con la sonda se espera que exista cierto grado de desapareamiento, es decir, si se sospecha que la sonda se hibridará con una región variante, puede emplearse una sonda mas larga que se hibride con la secuencia diana con la especificidad requerida.

Las sondas incluirán un polinucleótido aislado unido a un marcador o a una molécula reportera, y pueden utilizarse para aislar otras secuencias de polinucleótidos, que presentan similitud en las secuencias mediante métodos estándar. En cuanto a las técnicas para preparar y marcar sondas, véase, p. ej., Sambrook y col., 1989 ó Ausubel y col., 1992. Otros polinucleótidos similares pueden ser seleccionados utilizando polinucleótidos homólogos. Como alternativa, polinucleótidos que codifican estos polipéptidos o polipéptidos similares pueden sintetizarse o seleccionarse mediante el empleo de la redundancia en el código genético. Pueden introducirse distintas sustituciones de codones, p. ej., mediante cambios silentes (produciendo con ello diferentes sitios de restricción) o para optimizar la expresión de un sistema particular. Pueden introducirse mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, quizá para cambiar las afinidades de unión a ligandos, afinidades intercatenarias, o la tasa de degradación o de recambio del
polipéptido.

Las sondas del presente invento que comprenden oligonucleótidos sintéticos u otros polinucleótidos pueden derivar de polinucleótidos presentes en la naturaleza o recombinantes, monocatenarios o bicatenarios, o pueden ser sintetizados químicamente. Las sondas también pueden marcarse mediante traslado de cortes, reacción de rellenado de huecos con la enzima Klenow, u otros métodos conocidos en la técnica.

Como sondas 185delAG se prefieren porciones de la secuencia polinucleotídica que tienen de 15 a 30 nucleótidos procedentes de una secuencia que codifica BRCA1. Las sondas también pueden utilizarse para determinar si el mRNA que codifica BRCA1 está presente en una célula o tejido.

"Ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico que no está presente en la naturaleza, o que se prepara mediante la combinación artificial de dos segmentos de la secuencia, que de otro modo son independientes. Esta combinación artificial se suele llevar a cabo mediante medios de síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, p. ej., mediante técnicas de ingeniería genética. Esto se hace usualmente para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservado, al tiempo que típicamente se introduce o se elimina un sitio de reconocimiento de la secuencia. Como alternativa, esto se realiza para reunir segmentos de ácidos nucleicos de funciones deseadas, para generar una combinación de funciones
deseada.

"Secuencias de regulación" se refiere a las secuencias que normalmente están a unas 100 kb de la región codificadora de un locus, pero también pueden estar mas distantes de la región codificadora, que afectan a la expresión del gen (incluyendo la transcripción del gen, y la traducción, procesamiento, estabilidad o demás funciones del RNA mensajero).

"Homología o similitud sustancial". Un ácido nucleico o uno de sus fragmentos es "sustancialmente homologo" ("o sustancialmente similar") a otro si, cuando está alineado de manera optima (con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas) con el otro ácido nucleico (o con su cadena complementaria), existe una identidad en las secuencias de nucleótidos en al menos aproximadamente un 60% de las bases nucleotídicas, usualmente en al menos aproximadamente un 70%, más usualmente en al menos aproximadamente un 80%, preferiblemente en al menos aproximadamente un 90%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente 95-98% de las bases nucleotídicas.

Como alternativa, existe una homología o (similitud) sustancial cuando un ácido nucleico o uno de sus fragmentos se híbrida con otro ácido nucleico (o con su cadena complementaria) en condiciones de hibridación selectivas, con una cadena o con su complemento. Existe selectividad de la hibridación cuando tiene lugar una hibridación que es sustancialmente más selectiva que la falta total de especificidad. Típicamente, una hibridación selectiva tendrá lugar cuando existe una homología al menos de aproximadamente un 55% a lo largo de una extensión al menos de aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente una homología de al menos aproximadamente un 65%, más preferiblemente de al menos aproximadamente un 75%, muy preferiblemente de al menos aproximadamente un 90%. Véase, Kaneisha, 1984. La longitud de la comparación en homología, según se describe, puede ser de extensiones más largas, y en determinadas realizaciones con frecuencia será a lo largo de una extensión al menos de aproximadamente nueve nucleótidos, usualmente al menos de aproximadamente 20 nucleótidos, más usualmente de aproximadamente 24 nucleótidos, tópicamente al menos de aproximadamente 28 nucleótidos, más tópicamente al menos de aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente al menos de aproximadamente 36 o más
nucleótidos.

La hibridación de ácidos nucleicos se verá afectada por condiciones tales como la concentración de sales, temperatura o disolventes orgánicos, además de por la composición de bases, la longitud de las cadenas complementarias, y el número de desapareamientos de bases nucleotídicas entre los ácidos nucleicos que se hibridan, como apreciaran fácilmente los expertos en la técnica. Las condiciones de rigurosidad de la temperatura incluirán por lo general temperaturas superiores a 30ºC, típicamente superiores a 37ºC, y preferiblemente superiores a 45ºC. Las condiciones de rigurosidad de la concentración de sales de ordinario serán de una concentración menor que 1000 mM, tópicamente menor que 500 mM, y preferiblemente menor que 200 mM. Sin embargo, la combinación de los parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, p. ej., Wetmur y Davidson, 1968.

Las secuencias de las sondas pueden también hibridarse específicamente con DNA dúplex en determinadas condiciones para formar tríplex u otros complejos de DNA de orden superior. La preparación de esas sondas y las condiciones de hibridación adecuadas se conocen muy bien en la técnica.

Las expresiones "homología sustancial" o "identidad sustancial", cuando se refieren a polipéptidos, indican que el polipéptido o la proteína en cuestión exhibe una identidad de al menos aproximadamente 30% con una proteína completa presente en la naturaleza o con una de sus porciones, usualmente una identidad de al menos aproximadamente un 70%, y preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente un 95%.

"Función sustancialmente similar" se refiere a la función de un ácido nucleico modificado o de una proteína modificada, con referencia al ácido nucleico BRCA1 de tipo salvaje o al polipéptido BRCA1 de tipo salvaje. El polipéptido modificado será sustancialmente homólogo al polipéptido BRCA1 de tipo salvaje y tendrá sustancialmente la misma función. El polipéptido modificado puede tener una secuencia de aminoácidos alterada y/o puede contener aminoácidos modificados. En adición a la similitud de función, el polipéptido modificado puede tener otras propiedades útiles, tales como una semivida más larga. La similitud de función (actividad) del polipéptido modificado puede ser sustancialmente la misma que la actividad del polipéptido BRCA1 de tipo salvaje. Como alternativa, la similitud de función (actividad) del polipéptido modificado puede ser mayor que la actividad del polipéptido BRCA1 de tipo salvaje. El polipéptido modificado se sintetiza utilizando técnicas convencionales, o es codificado por un ácido nucleico modificado y producido utilizando técnicas convencionales. El ácido nucleico modificado se prepara mediante técnicas convencionales. Un ácido nucleico con una función sustancialmente similar a la función del gen BRCA1 de tipo salvaje produce la proteína modificada anteriormente descrita.

La homología, en el caso de polipéptidos, se mide típicamente utilizando programas en soporte lógico de análisis de secuencias. Véase, p. ej., el "Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group", University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. Los programas de análisis de proteínas emparejan secuencias similares utilizando la medida de homología asignada a distintas sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservadas típicas incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Un "fragmento", "porción" o "segmento" de un polipéptido es una extensión de residuos de aminoácidos al menos aproximadamente de cinco a siete aminoácidos contiguos, con frecuencia al menos aproximadamente de siete a nueve aminoácidos contiguos, típicamente al menos de nueve a trece aminoácidos contiguos, más preferiblemente, al menos aproximadamente de 20 a 30 o más aminoácidos contiguos.

Los polipéptidos, si son solubles, pueden ir acoplados a un soporte de fase sólida, p. ej., nitrocelulosa, nilón, materiales de empaquetamiento de columnas) (p. ej., bolitas de Sepharose), bolitas magnéticas, lana de vidrio, plástico, metal, geles poliméricos, células u otras sustancias. Estos soportes pueden tomar la forma, por ejemplo, de bolitas, pocillos, varillas o membranas.

"Región diana" se refiere a una región del ácido nucleico que es amplificada y/o detectada. La expresión "secuencia diana" se refiere a una secuencia con la que una sonda o un cebador forman un híbrido estable en las condiciones deseadas.

La práctica del presente invento emplea, a no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, DNA recombinante, genética e inmunología. Véanse, p. ej., Maniatis y col., 1982; Sambrook y col., 1989; Ausubel y col., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie y Fink, 1991. Una descripción general de las técnicas y materiales para la construcción de mapas genéticos humanos, incluyendo la construcción del mapa del cromosoma 17q humano, se proporciona, p. ej., en White y Lalouel, 1988.

Preparación de ácidos nucleicos recombinantes o químicamente sintetizados; vectores, transformación, células hospedadoras

Pueden producirse grandes cantidades de sondas del presente invento mediante replicación en una célula hospedadora adecuada. Fragmentos polinucleotídicos naturales o sintéticos se incorporarán en construcciones de polinucleótidos recombinantes, usualmente construcciones de DNA, capaces de ser introducidas en una célula procariota o eucariota y de replicarse en ella. Usualmente las construcciones de polinucleótidos serán adecuadas para replicarse en un hospedador unicelular, tal como levaduras o bacterias, pero también pueden estar destinadas a su introducción (con o sin integración en el genoma) en líneas celulares de mamíferos o vegetales u otras células eucariotas en cultivo. La purificación de los ácidos nucleicos producidos por los métodos del presente invento se describe, p. ej., en Sambrook y col., 1989 o Ausubel y col., 1992.

Las sondas del presente invento también pueden producirse mediante síntesis química, p. ej., mediante el método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers, 1981 o mediante el método de los triéster según Matteucci y Caruthers, 1981, y puede llevarse a cabo con sintetizadores de oligonucleótidos, comerciales y automáticos. Puede obtenerse un fragmento bicatenario a partir del producto monocatenario de síntesis química, ya sea sintetizando la cadena complementaria y reasociando las cadenas entre sí en las condiciones apropiadas, o añadiendo la cadena complementaria utilizando DNA-polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.

Las construcciones de polinucleótidos preparadas para ser introducidas en un hospedador procariota o eucariota, pueden comprender un sistema de replicación reconocido por el hospedador, que incluye el fragmento polinucleotídico requerido que codifica el polipéptido deseado, y preferiblemente incluirá también secuencias de regulación de la iniciación de la transcripción y traducción, unidas operativamente al segmento que codifica el polipéptido. Los vectores de expresión pueden incluir, por ejemplo, un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (ARS) y secuencias de control de la expresión, un promotor, una secuencia estimuladora y sitios de información necesarios para el procesamiento tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de RNA, sitios de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias de estabilización del mRNA. También pueden incluirse señales de secreción en donde se considere apropiado, ya sean de una proteína BRCA1 natural o de otros receptores o de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, que permiten a la proteína cruzar las membranas celulares y/o alojarse en ellas, y de este modo conseguir su topología funcional, o ser secretadas por la célula. Estos vectores pueden prepararse por medio de procedimientos recombinantes estándar, muy conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989 o Ausubel y col., 1992.

Un promotor apropiado y otras secuencias necesarias del vector se seleccionarán de manera que sean funcionales en el hospedador, y pueden incluir, cuando se considere apropiado, aquellas secuencias que están asociadas de forma natural con los genes BRCA1. Ejemplos de combinaciones viables de líneas celulares y vectores de expresión, se encuentran descritos en Sambrook y col., 1989 o Ausubel y col., 1992; véase también, p. ej., Metzger y col., 1988. En la técnica se conocen muchos vectores útiles y pueden obtenerse procedentes de casas comerciales tales como Stratgene, New England Biolabs, Promega Biotech, y otras. En hospedadores procariotas pueden utilizarse promotores tales como los promotores trp, lac y promotores de fagos, promotores de tRNA y promotores de enzimas glicolíticas. Promotores útiles de levaduras incluyen regiones promotoras de la metalotioneóna, 3-fosfoglicerato-quinasa u otras enzimas glicolíticas tales como enolasa o glicerhaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa, y otras enzimas. Vectores y promotores adecuados para utilizar en una expresión en levaduras se encuentran más ampliamente descritos en Hitzeman y col., documento EP 73.675A. Promotores apropiados de mamífero, no naturales, podrán incluir los promotores temprano y tardío de SV40 (Fiers y col., 1978) o promotores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney, virus de tumores de ratón, los virus de sarcoma aviar, adenovirus II, virus del papiloma bovino o polioma. Además, la construcción puede ir unida a un gen amplificable (p. ej., DHFR) de manera que pueden hacerse múltiples copias del gen. En cuanto a elementos estimuladores de la transcripción apropiados y demás secuencias de control de la expresión, véase también Enhancers and Eukaryotic Gene Expressison, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1983).

Mientras que esos vectores de expresión pueden replicarse de manera autónoma, también pueden replicarse siendo insertados en el genoma de la célula hospedadora, por medio de métodos que se conocen muy bien en la técnica.

Los vectores de expresión y clonación contendrán probablemente un marcador seleccionable, un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula hospedadora transformada con el vector. La presencia de este gen asegura el crecimiento de exclusivamente las células hospedadoras que expresan los insertos. Los genes de selección típicos codifican proteínas que a) confieren resistencia a antibióticos o a otras sustancias tóxicas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato, etc.; b) complementan deficiencias auxotróficas, o c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, p. ej., el gen que codifica D-alanina-racemasa para Bacilli. La elección del marcador de selección apropiado dependerán de la célula hospedadora, y en la técnica se conocen muy bien marcadores apropiados para diferentes hospedadores.

Los vectores que contienen los ácidos nucleicos de interés pueden transcribirse in vitro, y el RNA resultante puede introducirse en la célula hospedadora mediante métodos muy conocidos, p. ej., mediante inyección (véase, Kubo y col., 1988), o los vectores pueden ser introducidos directamente en las células hospedadoras mediante métodos muy conocidos en la técnica, que varían dependiendo del tipo de hospedador celular, incluyendo electroporación; transfección utilizando cloruro cálcico, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; infección (cuando el vector es un agente infeccioso, tal como un genoma retroviral); y otros métodos. Véanse, de modo general, Sambrook y col., 1989 y Ausubel y col., 1992. La introducción de los polinucleótidos en la célula hospedadora mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, que incluyen, inter alia, los anteriormente descritos, serán aquí denominados "transformación". Las células en las que se han introducido los ácidos nucleicos anteriormente descritos se entiende que también incluyen la progenie de esas células.

Pueden prepararse grandes cantidades de los ácidos nucleicos del presente invento que expresen porciones de ácidos nucleicos BRCA1 en vectores u otros vehículos de expresión en células hospedadoras compatibles, procariotas o eucariotas. Los hospedadores procariotas más comúnmente utilizados son cepas de Escherichia coli, aunque también pueden utilizarse otros procariotas, como Bacillus subtilis o Pseudomonas.

Los clones se seleccionan utilizando marcadores que dependen del modo de la construcción del vector. El marcador puede estar en la misma molécula de DNA o en una molécula de DNA diferente, preferiblemente en la misma molécula de DNA. En hospedadores procariotas, el transformante puede seleccionarse, p. ej., por la resistencia a ampicilina, tetraciclina o a otros antibióticos. La producción de un producto particular que se basa en la sensibilidad a la temperatura puede también servir como marcador apropiado.

Las células procariotas o eucariotas transformadas con los polinucleótidos del presente invento son útiles no sólo para la producción de los ácidos nucleicos del presente invento, sino también, por ejemplo, para el estudio de las características de los polipéptidos BRCA1.

Las secuencias polinucleotídicas antisentido son útiles para prevenir y disminuir la expresión del locus BRCA1, como apreciarían los expertos en la técnica. Por ejemplo, los vectores polinucleotídicos que contienen la totalidad o una porción del locus BRCA1 u otras secuencias de la región de BRCA1 (en particular las que flanquean el locus BRCA1), pueden situarse bajo el control de un promotor en una orientación antisentido y ser introducidas en la célula. La expresión de esa construcción antisentido en una célula interferirá con la transcripción y/ traducción y/o replicación de BRCA1.

Las sondas y cebadores basados en las secuencias del gen BRCA1 que aquí se describen, se utilizan para identificar secuencias homologas del gen BRCA1 y de proteínas BRCA1 en otras especies. Estas secuencias del gen BRCA1 y estas proteínas BRCA1 se utilizan en los métodos de diagnóstico/pronóstico, terapéuticos y de escrutinio de fármacos que aquí se describen para las especies de las que dichas secuencias se han aislado.

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Métodos de utilización: Diagnóstico de ácidos nucleicos y kits de diagnóstico

Con el fin de detectar la presencia de un alelo BRCA1 que predispone a un individuo al cáncer, se prepara una muestra biológica tal como sangre y en ella se analiza la presencia o ausencia de los alelos de susceptibilidad de
BRCA1. Con el fin de detectar la presencia de una neoplasia, la progresión hacia la malignidad de una lesión precursora, o como un indicador de pronóstico, se prepara una muestra biológica y en ella se analiza la presencia o ausencia de alelos mutantes de BRCA1. Los resultados de estos ensayos y la información sobre la interpretación de los mismos se devuelven al sanitario para su comunicación al individuo ensayado. Estos diagnósticos pueden realizarse en laboratorios de diagnóstico, o, como alternativa, pueden fabricarse kits de diagnóstico y venderse a los sanitarios o a individuos privados para su autodiagnóstico.

Inicialmente, el método de escrutinio implica la amplificación de las secuencias BRCA1 relevantes. En otras realizaciones preferidas del invento, el método de escrutinio implica una estrategia no basada en PCR. Estos métodos de escrutinio incluyen metodologías de amplificación en dos etapas utilizando un marcador, que son muy conocidas en la técnica. Tanto las estrategias de escrutinio basadas en PCR como las no basadas en PCR son capaces de detectar secuencias diana con un alto nivel de sensibilidad.

El método mas popular hoy día utilizado es la amplificación de dianas. En este documento, la secuencia del ácido nucleico diana se amplifica con polimerasas. Un método particularmente preferido que utiliza una amplificación conducida por polimerasa es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa y otros ensayos de amplificación conducidos por polimerasas pueden alcanzar un aumento de más de un millón de veces en el número de copias a través del empleo de ciclos de amplificación conducidos por polimerasas. Una vez amplificado, el ácido nucleico resultante puede ser secuenciado o utilizado como sustrato para sondas de DNA.

Cuando las sondas se utilizan para detectar la presencia de las secuencias diana (por ejemplo, en el escrutinio de la susceptibilidad al cáncer), la muestra biológica que ha de ser analizada, tal como sangre o suero, puede tratarse, si se desea, para extraer los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos de la muestra pueden prepararse de varias maneras para facilitar la detección de la secuencia diana; p. ej., desnaturalización, digestión con enzimas de restricción, electroforesis o análisis de hibridación por transferencia puntual. La región específica del ácido nucleico analito usualmente debe estar al menos parcialmente en forma monocatenaria para formar híbridos con la secuencia diana de la sonda. Si la secuencia es monocatenaria en su estado natural, no se requerirá la desnaturalización. Sin embargo, si la secuencia es bicatenaria, la secuencia probablemente necesitaría ser desnaturalizada. La desnaturalización puede llevarse a cabo por diferentes procedimientos conocidos en la técnica.

El ácido nucleico analito y la sonda se incuban en condiciones que promueven la formación de híbridos estables de la secuencia diana presente en la sonda con la secuencia específica putativa presente en el analito. La región de las sondas que se utiliza para que se una al analito puede hacerse totalmente complementaria a la región específica del cromosoma humano 17q. Por lo tanto, son convenientes unas condiciones de alta rigurosidad con el fin de prevenir falsos positivos. Sin embargo, las condiciones de alta rigurosidad solamente se utilizan cuando las sondas son complementarias a las regiones del cromosoma que son únicas en el genoma. La rigurosidad de la hibridación viene determinada por varios factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, que incluyen, temperatura, fuerza iónica, composición de bases, longitud de las sondas y concentración de formamida. Estos factores aparecen descritos en, p. ej., Maniatis y col., 1982 y en Sambrook y col., 1989. Bajo determinadas circunstancias, la formación de híbridos de orden superior, tales como tríplex, quadruplex, etc., puede ser conveniente para proporcionar los medios para detectar secuencias diana.

La detección, en caso de haberla, de los híbridos resultantes se lleva a cabo usualmente mediante el empleo de sondas marcadas. Como alternativa, la sonda puede estar no marcada, pero puede ser detectable mediante unión específica con un ligando que esto marcado, ya sea directa o indirectamente. En la técnica se conocen marcadores adecuados, y métodos para marcar sondas y ligandos, e incluyen, p. ej., marcadores radiactivos que pueden ser incorporados mediante métodos conocidos (p. ej., traslado de cortes, cebado al azar o tratamiento con quinasa), biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (p. ej., dioxetanos, en particular dioxetanos inducidos), enzimas, anticuerpos y marcadores similares. En la técnica se conocen variaciones de este esquema básico, e incluyen las variaciones que facilitan la separación entre los híbridos que han de ser detectados y materiales extraños, y/o que amplifican la señal procedente del resto marcado. Algunas de estas variaciones de encuentran revisadas en, p. ej., Matthews y Kricka, 1988; Landegren y col., 1988; Mittlin, 1989; Patente de EE.UU 4.868.105 y en el documento de Publicación de EPO No. 225.807.

Como se ha indicado anteriormente, en este invento también están contemplados ensayos de escrutinio no basados en PCR. En el Ejemplo 11 se proporciona un ejemplo de un procedimiento no basado en PCR. Este procedimiento híbrida una sonda de ácido nucleico (o un análogo, tal que una cadena principal de metil-fosfonato que reemplaza el fosfodiéster normal), con el DNA diana presente a un nivel bajo. Esta sonda puede llevar un enzima unida covalentemente a la sonda, de manera que el enlace covalente no interfiere con la especificidad de la hibridación. Este complejo de conjugado enzima-sonda - ácido nucleico diana puede luego ser separado y aislado del conjugado enzima-sonda libre, y se añade un sustrato para la detección de la enzima. La actividad enzimática se observa en forma de un cambio en el desarrollo de color o la producción de luminiscencia que produce un aumento en sensibilidad de 10^{3}-10^{6}.Como ejemplo relativo a la preparación de conjugados de oligodesoxinucleótido-fosfatasa alcalina y a su utilización como sondas de hibridación, véase Jablonski y col., 1986.

Las metodologías de amplificación en dos etapas, que utilizan un marcador, son muy conocidas en la técnica. Estos ensayos trabajan sobre el principio de que un ligando pequeño (tal como digoxigenina, biotina o un ligando similar) se une a una sonda de ácido nucleico capaz de unirse específicamente con BRCA1. En la Tabla 9 de esta solicitud de patente se proporcionan ejemplos de sondas, y adicional-mente incluyen la sonda de ácido nucleico correspondiente a las posiciones 3631-3930 de la SEQ ID NO:1. Sondas alelo-específicas se contemplan también dentro del alcance de este ejemplo, y ejemplos de sondas alelo-específicas incluyen sondas que abarcan las mutaciones causantes de predisposición resumidas en las Tablas 11 y 12 de esta solicitud de patente.

En uno de los ejemplos, el pequeño ligando unido a la sonda de ácido nucleico es reconocido de manera específica por un conjugado anticuerpo-enzima. En una de las realizaciones de este ejemplo, la digoxigenina está unida al ácido nucleico sonda. La hibridación se detecta mediante un conjugado anticuerpo-fosfatasa alcalina que se convierte en un sustrato quimioluminiscente. Con respecto a métodos para el marcaje de sondas de ácidos nucleicos, véase Martín y col., 1990. En una segunda muestra, el ligando pequeño es reconocido por un segundo conjugado ligando-enzima que es capaz de formar un complejo de manera específica con el primer ligando. Una realización muy conocida de este ejemplo es el tipo de interacciones biotina-avidina. En cuanto a métodos para marcaje de sondas de ácidos nucleicos y su utilización en ensayos basados en biotina-avidina, véanse Rigby y col., 1977 y Nguyen y col., 1992.

También se contempla dentro del alcance de este invento que la sonda de ácido nucleico de este invento será empleada en un cóctel de sondas de ácido nucleico capaces de detectar BRCA1. Así, en un ejemplo para detectar la presencia de BRCA1 en una muestra de células, se utiliza más de una sonda complementaria a BRCA1, y en particular el número de sondas diferentes es de manera alternativa de 2, 3 úo 5 secuencias diferentes de sondas de ácido nucleico. En otro ejemplo, para detectar la presencia de mutaciones en la secuencia del gen BRCA1 en un paciente, se utiliza más de una sonda complementaria a BRCA1, cuando el cóctel incluye sondas capaces de unirse a mutaciones alelo-específicas identificadas en poblaciones de pacientes con alteraciones en BRCA1. En esta realización, pueden utilizarse cualquier número de sondas, y preferiblemente incluirán sondas que corresponden a las mutaciones génicas principales, que se ha identificado que predisponen a un individuo a cáncer de mama. Algunas sondas candidatas y contempladas dentro del alcance de la presente descripción incluyen sondas que incluye las mutaciones alelo-específicas identificadas en las Tablas 11 y 12, y aquellas que tienen las regiones BRCA1 correspondientes a la SEQ ID NO.1, tanto en 5' como en 3' respecto al sitio de la mutación.

La presente descripción está soportada por los Ejemplos. Se utilizaron procedimientos estándar muy conocidos en la técnica o las técnicas que se describen mas delante de manera específica.

Ejemplo 1 Indagación y estudio de grupos familiares que tienen probabilidad de poseer un locus de susceptibilidad a cáncer de mama ligado a 17q

Grupos familiares con predisposición a un cáncer extensivo fueron indagados en una población definida que proporciona un gran conjunto de grupos familiares de gran tamaño, con múltiples casos de cáncer de mama y con muchos parientes disponibles para el estudio. El gran número de meiosis presentes en los grupos familiares grandes, proporcionó el poder para detectar si el locus BRCA1 se estaba segregando, y aumentó la oportunidad de que se produjeran recombinantes informativos dentro de la pequeña región que estaba siendo investigada. Esto mejoró enormemente las oportunidades de establecer ligamiento con la región de BRCA1, y facilita enormemente la reducción de la región de BRCA1 a un tamaño manejable, que permite la identificación del propio locus BRCA1.

Cada uno de los grupos familiares se amplió a todos los parientes contactados disponibles, y a todos los parientes informativos de primer grado de cada probando o de cada caso de cáncer. En estos grupos familiares, se identificaron casos adicionales de cáncer de mama e individuos con cáncer en otras localizaciones de interés (p. ej., en ovario) que también aparecían en los grupos familiares, a través de archivos relacionados con un registro de tumores. Todos los cáncer de mama reportados en el grupo familiar que no estaban confirmados en el Utah Cáncer Registry fueron reinvestigados. Se obtuvieron archivos médicos o certificados de defunción para la confirmación de todos los cáncer. Cada uno de los individuos clave que conectaba un individuo y todos los individuos informativos, eran invitados a participar proporcionando una muestra de sangre de la que se extraía DNA. También se tomaron muestras de consortes y parientes de casos de fallecidos de manera que el genotipo de los casos de fallecidos podía inferirse de los genotipos de sus parientes.

Diez grupos familiares que presentaban tres o más casos de cáncer con genotipos inferibles se seleccionaron para los estudios de ligamiento a marcadores de 17q a partir de un conjunto de 29 grupos familiares originariamente indagados en la base de datos relacionada, para un estudio de la enfermedad proliferativa de mama y de cáncer de mama (Skolnick y col., 1990). El criterio de selección de estos grupos familiares fue la presencia de dos hermanas o de una madre y su hija con cáncer de mama. Adicionalmente, se incluyeron dos grupos familiares que habían sido estudiados desde 1980 como parte de nuestros estudios de ligamiento de cáncer de mama (K1001, K9018), seis grupos familiares encontrados en la base de datos relacionada, por la presencia de agrupaciones génicas de cáncer de mama y/o de ovario (K2019, K2073, K2079, K2080, K2039, K2082) y un grupo familiar autoreferido con un cáncer de mama de aparición temprana (K2035). Estos grupos familiares se investigaron y expandieron en el estudio clínico de los autores del invento de la manera anteriormente descrita. La Tabla 1 presenta las características de estos 19 grupos familiares que son el sujeto de los posteriores ejemplos. En la Tabla 1, de cada grupo familiar se informa sobre el número total de individuos en la base de datos, el número de individuos tipificados, y la edad mínima, media y máxima en el momento del diagnóstico del cáncer de mama y ovario. Los grupos familiares se clasifican en orden ascendente de edad mediana en el momento del diagnóstico del cáncer de mama. Cuatro mujeres diagnosticadas con ambos cáncer de mama y ovario fueron contadas en ambas categorías.

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Ejemplo 2 Selección de grupos familiares que están ligados al cromosoma 17q y localización de BRCA1 en el intervalo Mfd15-Mfd188

De cada muestra recogida en estos 19 grupos familiares, se extrajo el DNA de la sangre (o en dos casos se extrajo de bloques de tejido incluido en parafina) utilizando protocolos estándar de laboratorio. La determinación de los genotipos en este estudio se restringió a marcadores con repeticiones cortas en tándem (STR) (del ingles, "Short Tandem Repeats") debido a que, en general, estos marcadores presentan una elevada heterocigosidad y los métodos de PCR ofrecen una rápida ejecución de los ciclos cuando se utilizan cantidades muy pequeñas de DNA. Para ayudar en esta tarea, cuatro de estos marcadores con STR en el cromosoma 17, se desarrollaron escrutando una biblioteca en un cósmido específico de cromosomas para buscar clones CA-positivos. Tres de estos marcadores se localizaron en el brazo largo: (46E6, Easton y col., 1993); (42D6, Easton y col., 1993); 26C2 (D17S514, Oliphant y col., 1991), mientras que el otro marcador, 12G6 (D17S513, Oliphant y col., 1991) se localizo en el brazo corto cerca del locus p53 supresor de tumores. Dos de estos marcadores, 42D6 y 46E6, fueron remitidos al "Breast Cáncer Linkage Consortium" para la tipificación de las familias con cáncer de mama, realizada por investigadores del mundo entero. Las secuencias oligonucleotídicas de los marcadores no desarrollados en el laboratorio, se obtuvieron a partir de informes publicados, o como parte del "Breast Cáncer Linkage Consortium", o procedentes de otros investigadores. Todas las películas para la realización de las tipificaciones genotípicas se valoraron a ciegas con un marcador estándar de las pistas, utilizado para mantener la codificación concordante de los alelos. Las muestras clave en los cuatro grupos familiares que aquí se presentan, experimentaron tipificaciones por duplicado de todos los marcadores relevantes. Se determinó el tipo de los 19 grupos familiares con respecto a dos marcadores polimórficos con repeticiones CA: 42D6(D17S588), una repetición CA aislada en el laboratorio, y Mfd15 (D17S250), una repetición CA proporcionada por J. Weber (Weber y col., 1990). Se utilizaron varias fuentes de sondas para crear marcadores genéticos en el cromosoma 17, específicamente en bibliotecas que contienen el cromosoma 17, en el fago lambda y en cósmidos, creadas a partir de cromosomas clasificados por "Los Alamos National Laboratories" (van Dilla y col., 1986).

Los valores de LOD de cada uno de los grupos familiares con estos dos marcadores (42D6, Mfd15) y con un tercer marcador, Mfd188 (D17S579, Hall y col., 1992), localizado casi a mitad de camino entre estos dos marcadores, fueron calculados para dos valores de la fracción de recombinación, 0,001 y 0,1. (Para el cálculo de los valores de LOD, véase Oh, 1985). Se computaron las semejanzas con el modelo derivado de Claus y col., 1991, que asume una frecuencia génica estimada de 0,003, un riesgo del tiempo de vida en individuos portadores del gen de aproximadamente 0,80, y riesgos específicos de la edad basados en la población, de padecer cáncer de mama en individuos no portadores del gen. Las frecuencias alélicas de los tres marcadores utilizadas para los cálculos de los valores de LOD se calcularon a partir de las tipificaciones obtenidas en el laboratorio, de individuos no emparentados en el conjunto de CEPH (White y Lalouel, 1988). La Tabla 2 muestra los resultados del análisis de ligamiento por pares de cada grupo familiar con los tres marcadores 42D6, Mfd188 y Mfd15.

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Utilizando un criterio para el ligamiento a 17q de un valor de LOD > 1,0 para al menos uno de los locus aplicando el modelo CASH (Claus y col., 1991), cuatro de los 19 grupos familiares resultaron estar ligados a 17q (K1901, K1925, K2035, K2082). Varios de los grupos familiares adicionales mostraron cierta evidencia de ligamiento pero en ese momento no pudieron ser asignados de manera definitiva a la categoría ligada. Estos incluían los grupos familiares K1911, K2073, K2039 y K2080. Tres de los grupos familiares ligados a 17q tenían individuos recombinantes informativos en esta región y estos grupos familiares se describen con detalle más adelante.

El grupo familiar K2082 es la familia de mayor tamaño con cáncer de mama ligado a 17q, descrita hasta la fecha por algún grupo. El grupo familiar contiene 20 casos de cáncer de mama, y 10 casos de cáncer de ovario. Dos casos presentan cáncer de mama y cáncer de ovario. La evidencia de ligamiento a 17q en esta familia es abrumadora; el valor de LOD con el haplotipo ligado es de más de 6,0, a pesar de la existencia de tres casos de cáncer de mama que parecen ser esporádicos, es decir, estos casos no comparten parte alguna del haplotipo ligado entre Mfd15 y 42D6. En estos tres casos esporádicos se diagnosticó un cáncer de mama a las edades de 46, 47 y 54 años. En grupos familiares más pequeños, los cáncer esporádicos de este tipo confunden enormemente el análisis de ligamiento y la identificación correcta de los individuos recombinantes clave. La recombinante clave en el grupo familiar K2082 es una mujer que desarrolló cáncer de ovario a los 45 años y cuya madre y tía tuvieron cáncer de ovario a los 58 y 66 años respectivamente. Ella heredó la porción ligada del haplotipo tanto para Mfd188 como para 42D6, al mismo tiempo que heredaba alelos no ligados en Mfd15; este evento de recombinación situó BRCA1 en posición distal con respecto a Mfd15.

El grupo familiar K1901 es tópico de los grupos familiares con cáncer de mama de aparición temprana. El grupo familiar contiene 10 casos de cáncer de mama con una edad media en el momento del diagnostico de 43,5 años de edad; cuatro casos fueron diagnosticados antes de los 40 años. El valor de LOD de este grupo familiar con el marcador 42D6 es 1,5, dando como resultado una probabilidad posterior de ligamiento a 17q de 0,96. El examen de los haplotipos en este grupo familiar identificó un haplotipo recombinante en un hombre portador obligado y en su hija afectada a la que se diagnosticó cáncer de mama a los 45 años. Su alelo ligado con respecto al marcador Mfd15 difiere del encontrado en todos los otros casos del grupo familiar (excepto en un caso que no pudo inferirse de manera completa a partir de su descendencia). Los dos haplotipos son idénticos con respecto a Mfd188 y 42D6. De acuerdo con esto, los datos obtenidos del grupo familiar K1901 situarían también el locus BRCA1 en posición distal con respecto a
Mfd15.

El grupo familiar K2035 es similar al K1901 en el fenotipo de la enfermedad. La edad media de diagnóstico de los ocho casos de cáncer de mama en este grupo familiar es de 37 años. Uno de los casos tuvo también cáncer de ovario a los 60 años. Los casos de cáncer de mama en esta familia descendieron a partir de dos hermanas ambas de las cuales no fueron afectadas por cáncer de mama hasta su muerte en la década de los ochenta años. Cada rama contiene cuatro casos de cáncer de mama, teniendo cada rama al menos un caso de aparición marcadamente temprana. Este grupo familiar tiene un valor de LOD de 2,34 con Mfd15. Los haplotipos que se segregan con cáncer de mama en las dos ramas comparten un alelo idéntico a Mfd15 pero difieren con respecto a los loci distales Mfd188 y NM23 (un marcador tipificado como parte del consorcio que esta localizado justo en posición distal a 42D6 (Hall y col., 1992)). Aunque los dos haplotipos son concordantes con respecto al marcador 42D6, es probable que los alelos se compartan idénticos por estado (el mismo alelo pero derivado de diferentes ancestros) más que se compartan idénticos por herencia (derivados de un ancestro común) ya que el alelo compartido es el segundo alelo más común observado en este locus. En contraste a esto, el alelo ligado, compartido en Mfd15, tiene una frecuencia de 0,04. Este es un recombinante clave en nuestro conjunto de datos ya que es el único recombinante en el que BRCA1 se segrega con la porción proximal del haplotipo, fijando así el límite distal para la región de BRCA1. Para que este evento no sea un recombinante clave, se requiere que un segundo gen BRCA1 mutante esté presente en uno de los consortes casado dentro del grupo familiar que también comparte el alelo Mfd15 raro que se segrega con el cáncer de mama en ambas ramas del grupo familiar. Este evento tiene una probabilidad menor que uno en mil. La evidencia obtenida de este grupo familiar situó el locus BRCA1 en posición proximal con respecto a Mfd188.

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Ejemplo 3 Creación de un mapa de estructura fina y refinamiento de la región de BRCA1 con respecto a Mfd191-Mfd188 utilizando polimorfismos de STR adicionales

Con el fin de mejorar la caracterización de los recombinantes y definir los marcadores flanqueantes más cercanos, se requirió un mapa denso de esta región relativamente pequeña situada en el cromosoma 17q. El Encuentro sobre el Cromosoma 17 ha producido un mapa de consenso de esta región (Figura 1) basado en una combinación de estudios de construcción de mapas genéticos y de mapas físicos (Fain, 1992). Este mapa contiene polimorfismos de STR altamente polimórficos y varios genes expresados de manera no polimórfica. Debido a que este mapa no proporcionaba detalles sobre la evidencia para este orden, ni daba ninguna medida de soporte local para las inversiones en el orden de los loci adyacentes, se considero esto como una guía poco eficaz para obtener recursos que utilizar en el desarrollo de nuevos marcadores y en la construcción de mapas genéticos y físicos detallados, realizados por los autores del invento, de una pequeña región que contiene BRCA1. La estrategia consistió en analizar marcadores con STR ya existentes, proporcionados por otros investigadores y todos los marcadores recién desarrollados en el laboratorio de los autores del invento, tanto con respecto a un conjunto de puntos de rotura meióticos (genéticos), identificados utilizando DNA procedente de familias CEPH de referencia, como con respecto a un conjunto de híbridos de células somáticas (puntos de rotura físicos) construidos para esta región. Estos marcadores incluyeron el 26C2, desarrollado en el laboratorio de los autores del invento, y que construye el mapa de la zona proximal a Mfd15, el Mfd191 (proporcionado por James Weber), el THRA1 (Futreal y col., 1992a), y tres polimorfismos amablemente proporcionados por el Dr. Donald Black, NM23 (Hall y col., 1992), SCG40 (D17S181), y 6C1 (D17S293).

Localización genética de marcadores. Con el fin de localizar genéticamente nuevos marcadores dentro de la región de interés, se han identificado varios puntos de rotura meióticos clave dentro de la región, tanto en el conjunto de referencia de CEPH como en el gran grupo familiar con cáncer de mama (K2082). Dada la pequeña distancia genética en esta región, es probable que exista solamente un conjunto relativamente pequeño de recombinantes que pueden ser utilizados para este propósito, y es probable que agrupen marcadores en conjuntos. El orden de los marcadores dentro de cada conjunto puede determinarse solamente mediante la construcción de mapas físicos. Sin embargo el número de las tipificaciones genotípicas necesarias para situar un nuevo marcador se minimiza. Estos puntos de rotura se ilustran en las Tablas 3 y 4. Utilizando esta estrategia, ha sido posible ordenar genéticamente los marcadores THRA1, 6C1, SCG40 y Mfd191. Como puede observarse en las Tablas 3 y 4, ambos marcadores THRA1 y Mfd191 se sitúan en el mapa dentro de la región Mfd15-Mfd188 que previamente se había identificado que contiene el locus BRCA1. En las Tablas 3 y 4, M/P indica un recombinante maternal o paternal. "1" indica que el alelo heredado proviene en origen del abuelo, mientras que "0" indica una procedencia en origen de la abuela, y "-" indica que el locus estaba sin tipificar o era no informativo.

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Análisis de los marcadores Mfd15, Mfd188, Mfd191 y THRA1 en las familias recombinantes. Mfd15, Mfd188, Mfd191 y THRA1 se tipificaron en las familias recombinantes y se examinaron con respecto a información adicional para localizar el locus BRCA1. En el grupo familiar K1901, el Mfd15 recombinante fue recombinante para THRA1 pero fue no informativo para Mfd191, situando asó a BRCA1 en posición distal con respecto a THRA1. En K2082, el recombinante con Mfd15 también fue recombinante con Mfd191, situando así el locus BRCA1 en posición distal con respecto a Mfd191 (Goldgar y col., 1994). El examen de THRA1 y Mfd191 en el grupo familiar K2035 no proporcionó información adicional sobre localizaciones ya que las dos ramas fueron concordantes para ambos marcadores. Sin embargo, SCG40, y 6C1 ambos mostraron el mismo patrón que Mfd188, aumentando así la confianza en la información sobre localizaciones proporcionada por el Mfd188 recombinante en esta familia. El locus BRCA1, ó al menos una porción del mismo, está situado por lo tanto en un intervalo limitado por Mfd191 en el lado proximal y por Mfd188 en el lado distal.

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Ejemplo 4 Desarrollo de recursos genéticos y físicos en la región de interés

Para aumentar el número de loci altamente polimórficos en la región Mfd191-Mfd188, se desarrollaron varios marcadores con STR en el laboratorio a partir de cósmidos y YAC para construir el mapa físico de la región. Estos marcadores permitieron redefinir aún mas la región.

Las STR se identificaron en genes que se sabe que se encuentran en la región deseada para identificar los YAC que contienen estos loci, y se utilizaron luego para identificar subclones en cósmidos, P1 ó BAC. Estos subclones fueron después escrutados con respecto a la presencia de una repetición CA en tándem utilizando un oligonucleótido (CA)_{n} (Pharmacia). Los clones que proporcionaban una señal fuerte se seleccionaron preferentemente, ya que estos clones tenían más probabilidad de representar repeticiones CA con un mayor número de repeticiones, y/o de presentar una fidelidad casi perfecta con el patrón de (CA)_{n}. Se sabe que estas dos características aumentan la probabilidad de un polimorfismo (Weber, 1990). Estos clones se secuenciaron directamente a partir del vector para localizar la repetición. Se obtuvo una secuencia única en uno de los lados de la repetición CA utilizando un cebador de un conjunto de posibles cebadores complementarios al extremo de una repetición CA, tal como (GT)ioT. Sobre la base de esta secuencia única, se elaboró un cebador para hacer la secuenciación inversa sobre la repetición en la otra dirección, obteniendo una secuencia única para el diseño de un segundo cebador que flanquea la repetición CA. Las STR se sometieron a escrutinio con respecto a polimorfismo en un pequeño grupo de individuos no emparentados, y se ensayaron frente al conjunto de híbridos para confirmar su localización física. Nuevos marcadores que satisfacieron estos criterios se sometieron luego a tipificación en un grupo de 40 individuos no emparentados procedentes de familias de Utah y de familias CEPH para obtener las frecuencias alélicas apropiadas para el estudio de la población. Muchos de los otros marcadores de los que se informa en este estudio, fueron ensayados en un grupo más pequeño de individuos del CEPH no emparentados para obtener de modo similar las frecuencias alélicas apropiadas.

Utilizando el procedimiento anteriormente descrito, un total de ocho STR polimórficas se encontraron en estos YAC. De los loci identificados de esta manera, cuatro fueron loci polimórficos y localizados en la región de BRCA1. Cuatro marcadores no se localizaron en el cromosoma 17, lo que refleja la naturaleza quimérica de los YAC utilizados. Los cuatro marcadores que se encontraron en la región fueron designados AA1, ED2, 4-7 e YM29. AA1 y ED2 se desarrollaron a partir de YAC positivos al gen RNU2, 4-7 se desarrolló a partir de YAC positivos a EPB3, e YM29 se desarrolló a partir de un cósmido que se localizó en la región por medio del conjunto de híbridos. Una descripción del número de alelos, de la heterocigosidad y de la fuente de estos cuatro y del resto de polimorfismos de STR, analizados en los grupos familiares con cáncer de mama, se proporciona más adelante en la Tabla 5.

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Los cuatro polimorfismos con STR que se localizaron en el mapa físico en la región (4-7,ED2,AA1,YM29) se analizaron en el conjunto de puntos de rotura meiótica, mostrado inicialmente en las Tablas 3 y 4. Las Tablas 6 y 7 contienen los datos relevantes de CEPH y los datos del grupo familiar K2082 para la localización de estos cuatro marcadores. En las tablas, M/P indica un recombinante materno o paterno. "1" indica que el alelo heredado proviene en origen del abuelo, mientras que "0" indica una procedencia en origen de la abuela, y "-" indica que el locus estaba sin tipificar o era no informativo.

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7

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A partir de la CEPH 1333-04, se observa que AA1 e YM29 deben estar situados en posición distal con respecto a Mfd191. De 13292 puede inferirse que tanto AA1 como ED2 están en posición proximal con respecto a 4-7, YM29 y Mfd188. Los recombinantes encontrados en K2082 proporcionan alguna información adicional sobre la ordenación. Tres observaciones independientes (individuos nº 22, 40 y 63) sitúan AA1,ED2,4-7,eYM29, y Mfd188 en posición distal con respecto a Mfd191, mientras que ID125 situó a 4-7, YM29 y Mfd188 en posición proximal con respecto a SCG40. Del análisis de los recombinantes genéticos no se obtuvo información genética alguna sobre la ordenación relativa dentro de los dos grupos de marcadores AA1/ED2 y 4-7/YM29/Mfd188. Aunque la ordenación de loci con respecto a híbridos que se sabe que contienen "agujeros" en los que pueden haberse perdido pequeñas porciones de DNA humano intersticial es problemática, los patrones de los híbridos indican que 4-7 está situado delante de YM29 y de Mfd188.

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Ejemplo 5 Análisis genéticos de cáncer de mama Grupos familiares con los marcadores AA1, 4-7, ED2 e YM29

Además de los tres grupos familiares que contienen individuos recombinantes clave, que han sido descritos previamente, por medio de análisis de los marcadores STR recién desarrollados, se mostró que el grupo familiar K2039 estaba ligado a la región y que contenía un recombinante útil.

La Tabla 8 define los haplotipos (que se muestran en forma codificada) de los grupos familiares en términos de los alelos marcador-específicos de cada locus y sus frecuencias respectivas. En la Tabla 8, los alelos se listan en orden de frecuencia decreciente; las frecuencias de los alelos 1-5 para cada locus se proporcionan en la Tabla 5. Los haplotipos con la codificación H son haplotipos asociados a BRCAl, P designa un haplotipo H parcial, y una R indica un haplotipo recombinante observable. Como se evidencia en la Tabla 8, no todos los grupos familiares fueron tipificados con respecto a todos los marcadores; además, no todos los individuos pertenecientes a un grupo familiar fueron tipificados con respecto a un grupo de marcadores idénticos, especialmente en K2082. Con una sola excepción, solamente se muestran los haplotipos heredados de miembros del grupo familiar, afectados o en riesgo; los haplotipos de consortes casados dentro del grupo familiar no se describen. Así en un grupo de individuos consanguíneos determinado, la aparición de haplotipos X e Y indica que ambos haplotipos de los individuos afectados/en riesgo fueron vistos y ninguno de ellos era un haplotipo asociado con cáncer de mama.

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8

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En el grupo familiar K1901, los nuevos marcadores no mostraron recombinación observable con la susceptibilidad a cáncer de mama, lo que indica que el evento de recombinación en este grupo familiar probablemente tuvo lugar entre THRA1 y ED2. Por lo tanto, no se obtuvo nueva información sobre la localización de BRCAl, basada en el estudio de los cuatro marcadores nuevos en este grupo familiar. En el grupo familiar K2082, el individuo recombinante clave ha heredado los alelos ligados ED2, 4-7, AA1 e YM29, y era recombinante para tdj1474, lo que indica que el evento de recombinación tuvo lugar en este individuo entre tdj1474 y ED2/AA1.

Existen tres haplotipos de interés en el grupo familiar K2035, H1, H2 y R2, mostrados en la Tabla 8. H1 está presente en los cuatro casos y en un portador varón obligado, que desciende del individuo 17, mientras que H2 esta presente o se infiere en dos casos y en dos portadores varones obligados, en descendientes del individuo 10. R2 es idéntico a H2 con respecto a los loci situados entre Mfd15 y SCG40 e incluyendo a éstos, pero se ha recombinado entre SCG40 y 42D6. Ya que ha sido establecido que BRCA1 está en posición proximal con respecto a 42D6, esta diferencia de H2/R2 no añade información adicional sobre la localización. H1 y R2 comparten un alelo idéntico en Mfd15, THRA1, AA1 y ED2 pero difieren en los loci que se suponen distales a ED2, esto es, 4-7, Mfd188, SCG40 y 6C1. Aunque los dos haplotipos coinciden en el quinto alelo del marcador YM29, un marcador que en un mapa físico se sitúa entre 4-7 y Mfd188, es probable que los alelos se compartan idénticos por estado en vez de idénticos por herencia ya que este alelo es el alelo más común en este locus, con una frecuencia estimada en padres CEPH de 0,42. En contraste a esto, los alelos ligados compartidos en los loci Mfd15 y ED2 tienen frecuencias de 0,04 y 0,09 respectivamente. También comparten mas alelos comunes en Mfd191 (frecuencia = 0,52), THRA1 y AA1 (frecuencia 0,28). Este es el recombinante clave en el grupo ya que es el único recombinante en el que el cáncer de mama se segrega con la porción proximal del haplotipo, fijando así el límite distal. La evidencia obtenida de este grupo familiar sitúa por lo tanto el locus BRCA1 en situación proximal a 4-7.

El evento de recombinación en el grupo familiar K2082 que sitúa BRCA1 en posición distal a tdj1474, es el único de los cuatro eventos descritos que puede inferirse directamente; es decir, el genotipo afectado de la madre puede ser inferido a partir de su consorte y de su descendencia, y el haplotipo recombinante puede observarse en su hija afectada. En esta familia las disparidades a favor de los individuos afectados que portan alelos BRCA1 de susceptibilidad son extremadamente altas; las únicas interpretaciones posibles de los datos son que BRCA1 es distal con respecto a Mfd191 ó como alternativa que el recombinante propuesto es un caso esporádico de un cáncer de ovario a los 44 años. Más que de un recombinante directamente observable o inferido, la interpretación del grupo familiar K2035 depende de la observación de diferentes haplotipos de 17q que se segregan en ramas diferentes del grupo familiar y a veces lejanamente emparentadas. La observación de que porciones de estos haplotipos tienen alelos en común para algunos marcadores, mientras que difieren en otros marcadores, sitúa el locus BRCA1 en la región compartida. La confianza en esta colocación depende de varios factores: del parentesco entre los individuos que portan los respectivos haplotipos, la frecuencia del alelo compartido, la certidumbre con la que puede de mostrarse que los haplotipos se segregan con el locus BRCA1, y la densidad de los marcadores en la región que define el haplotipo. En el caso del grupo familiar K2035, las dos ramas están estrechamente relacionadas, y cada una de las ramas tiene un número de casos de aparición temprana que portan el haplotipo respectivo. Aunque dos de los alelos compartidos son comunes, (Mfd191, THRA1), las frecuencias estimadas de los alelos compartidos en Mfd15, AA1 y ED2 son 0,04, 0,28 y 0,09 respectivamente. Es por lo tanto altamente probable que estos alelos sean idénticos por herencia (que deriven de un ancestro común) en vez de que sean idénticos por condición (que sea el mismo alelo pero derivado de la población general).

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Ejemplo 6 Estudios de construcción de mapas físicos refinados sitúan el gen BRCA1 en una región flanqueada por tdj1474 y U5R

Desde su localización inicial en el cromosoma 17q en 1990 (Hall y col., 1990), una gran cantidad de esfuerzo se ha invertido en localizar el gen BRCA1 en una región lo suficientemente pequeña para permitir la ejecución de estrategias efectivas de clonación posicional para aislar el gen. El locus BRCA1 se localizó por vez primera en el intervalo Mdf15 (D17S250)-42D6 (D17S588) mediante un análisis de ligamiento multipuntual (Easton y col., 1993) en el conjunto de datos del Breast Cáncer Linkage Consortium colaborador, constituido por 214 familias reunidas por todo el mundo. Los posteriores refinamientos de la localización se han basado en eventos de recombinación individuales, ocurridos en familias específicas. La región THRA1-D17S183 fue definida por Bowcock y col., 1993; y la región THRA1-D17S78 fue definida por Simard y col., 1993.

Se demostró además que el locus BRCA1 debe estar situado en posición distal con respecto al marcador Mfd191 (D17S776) (Goldgar y col., 1994). Este marcador se sabe que está situado en posición distal con respecto a THRA1 y RARA. La región más pequeña publicada para el locus BRCA1 está por lo tanto entre D17S776 y D17S78. Esta región todavía contiene aproximadamente 1,5 millones de bases de DNA, lo que hace que el aislamiento y el ensayo de todos los genes de la región sea una tarea muy difícil. Se han acometido por lo tanto las tareas de construir un mapa físico de la región, aislar un conjunto de marcadores STR polimórficos localizados en la región, y analizar estos nuevos marcadores en un conjunto de familias informativas, para refinar la localización del gen BRCA1 a un intervalo manejable.

Cuatro familias proporcionan una importante evidencia genética para la localización de BRCA1 en una región lo suficientemente pequeña para la aplicación de estrategias posicionales de clonación. Dos familias (K2082, K1901) proporcionan datos relativos al límite proximal de BRCA1 y las otras dos familias (K2035, K1813) fijan el límite distal. Estas familias se describen con detalle mas adelante. Un total de 15 marcadores con repeticiones terminales cortas (marcadores STR), ensayables por PCR, se utilizaron para redefinir esta localización en las familias estudiadas. Estos marcadores incluyen DS17S7654, DS17S975, tdj1474 y tdj1239. Las secuencias de los cebadores para estos marcadores se proporcionan en las secuencias SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 para DS17S754; en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 para DS17S975; en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8 para tdj1474; y en SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10 para tdj1239.

Grupo familiar K2082

El grupo familiar K2082 es la familia con cáncer de mama/ovario ligado a BRCA1 más extensa estudiada hasta la fecha. Tiene un valor de LOD de 8,6, el cual proporciona una evidencia inequívoca de ligamiento a 17q. Esta familia ha sido descrita con anterioridad y se ha visto que contiene un recombinante crítico que sitúa BRCA1 en posición distal con respecto a Mfd191 (D17S776). Este recombinante se produjo en una mujer diagnosticada con cáncer de ovario a los 45 años, cuya madre había tenido cáncer de ovario a los 63 años. La madre afectada había fallecido; sin embargo, de su progenie pudo inferirse que tenia el haplotipo ligado presente en los otros 30 casos ligados en la familia, en la región entre Mfd15 y Mfd188. Su hija afectada recibió el alelo ligado en los loci ED2, 4-7, y Mfd188, pero recibió el alelo en el cromosoma que no porta BRCA1 en Mfd15 y Mfd191. Con el fin de localizar aun más este punto de rotura de la recombinación, se ensayaron en los miembros clave de esta familia los siguientes marcadores derivados de recursos de mapas físicos: tdj1474, tdj1239, CF4, D17S855. Para los marcadores tdj1474 y CF4, la hija afectada no recibió el alelo ligado. Para el locus tdj1239, con STR, sin embargo, pudo inferirse que la madre era informativa y que su hija sí recibió el alelo asociado con BRCA1. D17S855 fue no informativo en esta familia. Sobre la base de este análisis, el orden es: centrómero de 17q-Mfd191-17HSD-CF4-tdj1474-tdj1239-D17S855-ED2-4-7-Mfd188-telómero de 17q. El recombinante descrito anteriormente sitúa por lo tanto BRCA1 distal con respecto a tdj1474, y el punto de rotura se localiza en el intervalo entre tdj1474 y tdj1239. La única explicación alternativa de los datos en esta familia, diferente de la de que BRCA1 se está localizando distal a tdj1474, es que el cáncer de ovario presente en el individuo recombinante está causado por razones independientes del gen BRCA1. Dado que el cáncer de ovario diagnosticado antes de los 50 años es raro, esta explicación alternativa es excesivamente improbable.

Grupo familiar K1901

El grupo familiar K1901 es una familia con cáncer de mama de aparición temprana, con 7 casos de cáncer de mama diagnosticados antes de los 50 años, 4 de los cuales se diagnosticaron antes de los 40 años. Además, había tres casos de cáncer de mama diagnosticados entre los 50 y 70 años de edad. Uno de los casos de cáncer de mama tuvo también cáncer de ovario a los 61 años. Esta familia normalmente tiene un valor de LOD de 1,5 con D17S855. Dada esta evidencia de ligamiento y dada la presencia de al menos un caso de cáncer de ovario, esta familia tiene una probabilidad posterior de que el cáncer sea debido a BRCA1 demás de 0,99. En esta familia, la recombinación proviene del hecho de que un individuo que es hermano del caso de cáncer de ovario del que descienden la mayoría de los otros casos, solamente comparte una porción del haplotipo que se está cosegregando con los otros casos en la familia. Sin embargo, este individuo pasó su haplotipo parcial a su hija que desarrolló cáncer de mama a los 44 años. Si este caso es debido al gen BRCA1, solo la parte del haplotipo compartido entre este hermano y su hermana, puede contener el gen BRCA1. La dificultad en la interpretación de esta clase de información es que mientras que se puede estar seguro de los marcadores que no son compartidos y que por lo tanto no son recombinantes, los marcadores que son concordantes pueden ser compartidos porque son no recombinantes, o porque sus padres son homocigotos. Sin los datos genotípicos de los padres es imposible discriminar entre estas alternativas. La inspección del haplotipo en K1901, muestra que no comparte el alelo ligado a Mfd15 (D17S250), THRA1, CF4 (D17S1320) y tdj1474 (17DS1321). Sí comparte el alelo ligado a Mfd191 (D17S776), ED2 D17S1327) tdj1239 (D17S1328) y Mfd188 (D17S579). Aunque el alelo compartido en Mfd191 es relativamente raro (0,07), se podría presumir que los padres eran homocigotos ya que ellos son recombinantes con marcadores localizados cerca en cada lado, y un evento de doble recombinación en esta región sería extremadamente improbable. Debido a ello la evidencia en esta familia situaría también el locus BRCA1 en posición distal con respecto a tdj1474. Sin embargo, el límite inferior de este punto de rotura es imposible de determinar sin información del genotipo de los padres. Es intrigante que el punto de rotura recombinante clave en esta familia confirma el resultado en el grupo familiar K2082. Como en el caso anterior, la información sobre localización en esta familia tiene sentido solo si el cáncer de mama fue debido al gen BRCA1. Sin embargo, su edad de diagnóstico relativamente temprana (44 años) lo hace parecer muy probable ya que el riesgo de cáncer de mama antes de los 45 años en la población general es bajo (de aproximadamente 1%).

Grupo familiar K2035

Esta familia es similar al K1901 en que la información sobre los eventos de recombinación críticos no se observa directamente sino que se infiere de la observación de que los dos haplotipos que se están cosegregando con el cáncer de mama de aparición temprana en las dos ramas de la familia se muestran idénticos con respecto a los marcadores localizados en la porción proximal de la región de BRCA1 de 17q, pero difieren en los loci más distales. Cada uno de estos dos haplotipos se presenta en al menos cuatro casos de cáncer de mama de aparición temprana o de cáncer de mama bilateral. El valor global de LOD con ED2 en esta familia es 2,2, y considerando que existe un caso de cáncer de ovario en la familia (lo que indica una probabilidad anterior de ligamiento con BRCA1 del 80%), la probabilidad posterior resultante de que esta familia está ligada a BRCA1 es de 0,998. Los haplotipos son idénticos para los marcadores Mfd15, THRA1, Mfd191, ED2, AA1, D17S858 y D17S902. El alelo común en Mfd15 y ED2 es bastante raro en ambos casos, lo que indica que este haplotipo se comparte idéntico por herencia. Los haplotipos son discordantes, sin embargo, para CA375, 4-7 y Mfd188, y para algunos marcadores más distales. Esto indica que el locus BRCA1 debe estar situado antes del marcador CA-375. Este marcador está localizado aproximadamente 50 kb después de D17S78, por lo que sirve principalmente como una confirmación adicional de este límite inferior previo, descrito en Simard y col., (1993).

Grupo familiar K1813

El grupo familiar K1813 es una familia pequeña con cuatro casos de cáncer de mama diagnosticados antes de los 40 años, cuya madre tuvo cáncer de mama diagnosticado a los 45 años y cáncer de ovario a los 61 años. Esta situación se complica en cierto modo por el hecho de que los cuatro casos resultan tener tres padres diferentes, de los cuales a solamente uno de ellos se le ha determinado el genotipo. Sin embargo, realizando la tipificación de varios marcadores diferentes en la región de BRCA1 así como de marcadores altamente polimórficos en otros lugares del genoma, la paternidad de toda la progenie de la familia se ha determinado con cierto grado de certidumbre. Esta familia produce un valor de LOD multipuntual máximo de 0,60 con marcadores de 17q y, dado que hay al menos un caso de cáncer de ovario, da como resultado una probabilidad posterior de ser una familia ligada a BRCA1 de 0,93. Esta familia contiene un evento de recombinación observable en el individuo 18 (véase la Figura 5 en Simard y col., Human Mol. Genet. 2:1193-1199 (1993)), el cual desarrolló cáncer de mama a los 34 años. El genotipo de su madre afectada en los loci relevantes de 17q, puede ser inferido a partir de sus genotipos, de los genotipos de las hermanas afectadas y de los genotipos de otros 3 hermanos no afectados. El individuo 18 hereda los alelos ligados a BRCA1 correspondientes a los siguientes loci: Mfd15, THRA1, D17S800, D17S855, AA1 y D17S931. Sin embargo, de los marcadores situados después de D17S931, es decir, U5R, vrs31, D17S858 y D17S579, ha heredado los alelos localizados en el cromosoma no portador de la enfermedad. La evidencia proporcionada por esta familia por lo tanto situaría el locus BRCA1 en posición proximal con respecto al marcador U5R. Debido a la temprana edad que tenía en el momento del diagnóstico (34 años) es extremadamente improbable que el cáncer del individuo recombinante no sea debido al gen responsable de los otros casos de cáncer de mama/ovario en esta familia; la duda que se presenta en esta familia proviene de la cantidad de evidencia algo más pequeña de que el cáncer de mama en esta familia es debido a BRCA1 en lugar de a un segundo locus de susceptibilidad a cáncer de mama, hasta ahora no localizado en el mapa.

Tamaño de la región que contiene BRCA1

Sobre la base de los datos genéticos descritos con detalle en lo que antecede, el locus BRCA1 debe estar situado en el intervalo entre los marcadores tdj1474 y U5R, ambos de los cuales se han aislado en el laboratorio de los autores del invento. Basándose en los mapas físicos que se muestran en las Figuras 2 y 3, se ha tratado de realizar una estimación de la distancia física entre estos dos loci. La distancia ocupa aproximadamente 14 clones en P1, que tienen un tamaño medio del inserto de aproximadamente 80 kb, para abarcar la región. Sin embargo, debido a que todos estos P1 solapan en cierto grado que no se conoce, la región física probablemente es mucho más pequeña que 14 veces 80 kb. Basándose en mapas de restricción de los clones que cubren la región, se ha estimado que el tamaño de la región que contiene BRCA1 es de aproximadamente 650 kb.

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Ejemplo 7 Identificación de clones de cDNA candidatos al locus BRCA1, mediante análisis genómico de la región de los "contigs"

Escrutinio completo de la región posible. El primer método para identificar los cDNA candidatos, aunque muy laborioso, utilizó técnicas conocidas. El método comprendió el escrutinio de cósmidos y de clones en P1 y BAC en el "contig", para identificar secuencias codificadoras putativas. Los clones que contienen secuencias codificadoras putativas se utilizaron luego como sondas en filtros de bibliotecas de cDNA para identificar clones de cDNA candidatos para futuros análisis. En los clones se escrutaron secuencias codificadoras putativas por cualquiera de los dos métodos.

Transferencias génicas de DNA de animales (del ingles, "Zoo blots"). El primer método para identificar secuencias codificadoras putativas fue realizando escrutinios en clones en cósmidos y en P1, con respecto a secuencias conservadas durante la evolución a través de varias especies. Esta técnica se denomina "análisis de transferencia génica de DNA de animales" y se encuentra descrita en Mónaco, 1986. Concretamente, DNA procedente de vaca, pollo, cerdo, ratón y rata fue digerido con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII (8 \mug de DNA por enzima). Los DNA digeridos se separaron durante la noche sobre un gel al 0,7%, a 20 voltios, durante 16 horas (gel de 14 cm), y el DNA se transfirió a membranas de nilón utilizando técnicas estándar de transferencia Southern. Por ejemplo, el filtro para la "transferencia génica de DNA de animales" se trató a 65ºC en 0,1xSSC, SDS al 0,5% y Tris 0,2 M, pH 8,0, durante 30 minutos, y luego se bloqueó durante la noche a 42ºC en 5xSSC, PEG 8000 al 10%, NaPO_{4} 20 mM,pH 6,8,DNA de esperma de salmón en una concentración de 100 \mug/ml, 1x disolución de Denhardt, formamida al 50%, SDS al 0,1% y DNA C_{o}t-1 en una concentración de 2 \mug/ml.

Los clones en cósmidos y en P1 que tenían que ser analizados, se digirieron con una enzima de restricción para liberar el DNA humano del DNA del vector. El DNA se separó en un gel de agarosa al 0,5%, de 14 cm, que se dejó correr durante la noche a 20 voltios durante 16 horas. Las bandas de DNA humano se separaron cortándolas del gel y se electroeluyeron de la cuña del gel a 100 voltios durante al menos dos horas en 0,5x tampón de Tris-acetato (Maniatis y col., 1982). El DNA eluido y digerido con NotI (\sim de 15 kb a 25kb) se digirió luego con la enzima de restricción EcoRI para obtener fragmentos mas pequeños (\sim de 0,5 kb a 5,0 kb) que se derriten por separado con mas facilidad para la siguiente etapa de marcaje del DNA con radionucleótidos. Los fragmentos de DNA se marcaron mediante el método de marcaje aleatorio de cebadores hexámeros (Boehringer-Mannheim, nº de catalogo 1004760). El DNA marcado se precipitó con espermina (se añaden 100 \mul de TE, 5 \mul de espermina 0,1 M y 5 \mul de DNA de esperma de salmón en una concentración de 10 mg/ml) para separar los radionucleótidos no incorporados. El DNA marcado se resuspendió luego en 100 \mul de TE, NaCl 0,5 M a 65ºC durante 5 minutos y después se bloqueó con DNA C_{o}t-1 humano durante 2-4 horas, según las instrucciones del fabricante (Gibco/BRL, nº de Catalogo 5279SA). La sonda de Cot-1 bloqueada se incubo sobre los filtros de las transferencias génicas de DNA de animales en la disolución de bloqueo, durante la noche a 42ºC. Los filtros se lavaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en 2xSSC, SDS al 0,1%, y luego en el mismo tampón durante 30 minutos a 55ºC. Los filtros se expusieron luego de 1 a 3 días a -70ºC a una película Kodak XAR-5 con un filtro intensificador. Asó, las transferencias génicas de DNA de animales se hibridaron, o bien con el material reunido de fragmentos EcoRI procedentes del inserto, o bien con cada uno de los fragmentos de manera individual.

Análisis de islotes HTF. El segundo método para identificar cósmidos para utilizar como sondas en las bibliotecas de cDNA fue el análisis de islotes HTF. Ya que el mapa de campos pulsados puede revelar islotes HTF, los cósmidos que se localizan en mapa en estas regiones de islotes HTF, se analizaron con prioridad. Los islotes HTF son segmentos de DNA que contienen una frecuencia muy alta de dinucleótidos CpG no metilados (Tonilo y col., 1990) y se ponen de manifiesto por medio de agrupaciones de sitios para enzimas de restricción cuyas secuencias de reconocimiento incluyen dinucleótidos CpG. Las enzimas que se sabe que son útiles en el análisis de islotes HTF son AscI, NotI, BssHII, EagI, SaccII, NaeI, NarI, SmaI y MluI (Anand, 1992). Se creo un mapa de campos pulsados utilizando las enzimas NotI, NruI, EagI, SacII y SalI, y se encontraron dos islotes HTF. Estos islotes están localizados en el extremo distal de la región, uno distal con respecto al locus GP2B, y el otro proximal con respecto al mismo locus, y ambos fuera de la región de BRCA1. Los cósmidos derivados de los YAC que cubren estas dos localizaciones se analizaron para identificar los que contenían estos sitios de restricción, y con ello los islotes HTF.

Escrutinio de los cDNA. Los clones que contienen islotes HTF o muestran hibridación con DNA de otras especies además de la especie humana, es probable que contengan secuencias codificadoras. El DNA humano procedente de estos clones se aisló en forma de un inserto completo o en forma de fragmentos EcoRI y se marco de la manera anteriormente descrita. El DNA marcado se utilizo para escrutar filtros de distintas bibliotecas de cDNA en las mismas condiciones que las transferencias génicas de DNA de animales, excepto en que los filtros de cDNA experimentan un lavado de mayor rigurosidad, de 0,1xSSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 30 minutos, dos veces.

La mayoría de las bibliotecas de cDNA utilizadas hasta la fecha en los estudios de los autores del invento (bibliotecas de tejido mamario normal, de tejido mamario de una mujer en el octavo mes de embarazo, y de una malignidad de mama) fueron preparadas en Clonetech, Inc. La biblioteca de cDNA generada a partir de tejido mamario de una mujer en el octavo mes de embarazo se encuentra disponible procedente de Clonetech (nº de Catálogo HL1037a) en el vector Lambda gt-10, y se desarrolla en células hospedadoras bacterianas C600 Hfl. Muestras de tejido mamario normal y de tejido mamario maligno se aislaron procedentes de una mujer caucasiana de 37 años de edad, y un gramo de cada tejido se envió a Clontech para el procesamiento del mRNA y la construcción de la biblioteca de cDNA. Estas dos últimas bibliotecas se generaron utilizando tanto la técnica de cebado al azar como de cebado con oligo dT, con una selección por tamaños de los productos finales que luego se clonaron en el vector Lambda ZapII, y se desarrollaron en la cepa XL1-azul de las bacterias, de la manera descrita por el fabricante. Bibliotecas de cDNA adicionales, específicas de tejido, incluyen bibliotecas de cDNA de cerebro fetal humano (Stratagene, nº de Catálogo 936209), testículo humano (Clonetech, nº de Catálogo HL3024), timo humano (Clonetch, nº de Catálogo HL1127n), cerebro humano (Clontech, nº de Catálogo HL11810), placenta humana (Clonetech nº de Catálogo 1075b) y músculo esquelético humano (Clontech nº de Catalogo HL1124b).

Las bibliotecas de cDNA se sembraron junto con sus células hospedadoras en placas NZCYM, y de cada placa se realizan por duplicado levantamientos del filtro, como se describe en Maniatis y col. (1982). El DNA del inserto (DNA humano), procedente de los clones genómicos candidatos, se purificó y se marcó radiactivamente con una actividad específica alta. El DNA radiactivo se hibridó luego con los filtros de cDNA para identificar los cDNA que corresponden a los genes localizados en el clon candidato del cósmido. Los cDNA identificados por este método, se recogieron, se resembraron y se escrutaron de nuevo con el inserto marcado del clon o con su DNA derivado de un fragmento EcoRI, para comprobar su estatus de positivo. Los clones que dieron un resultado positivo después de esta segunda vuelta de escrutinio, se hicieron luego crecer y su DNA se purifico por análisis de transferencia Southern y se secuencio. Los clones, o bien se purificaron en forma de plásmidos a través de una excisión in vivo del plásmido procedente del vector Lambda, de la manera descrita en los protocolos de los fabricantes, o bien se aislaron a partir del vector Lambda en forma de un fragmento de restricción y se clonaron en un vector plasmídico.

El análisis de transferencia Southern se realizó por duplicado, uno de los análisis utilizando como sonda el DNA del inserto genómico original, para comprobar que el inserto de cDNA contiene secuencias que hibridan. La segunda transferencia se hibridó con DNA del inserto de cDNA, procedente del clon de cDNA de mayor tamaño, para identificar que clones representan el mismo gen. Todos los cDNA que se hibridan con el clon genómico y son únicos se secuenciaron, y el DNA se analizó para determinar si las secuencias representan genes conocidos o únicos. Todos los clones de cDNA que resultaron ser únicos se analizaron de nuevo como loci BRCA1 candidatos. En concreto, los clones se hibridan con transferencias Northern para buscar una expresión específica y una expresión diferencial de mama en RNA normales frente a RNA de tumor mamario. También se analizaron por PCR en clones de la región de BRCA1 para comprobar su localización. Para determinar en el mapa la extensión del locus, se aislaron cDNA de longitud completa y sus secuencias se utilizaron como sondas para la PCR en los YAC y los clones que rodean e incluyen los clones de identificación originales. Los límites entre intrón-exón se definen luego aún más a través del análisis de las secuencias.

Se han escrutado bibliotecas de cDNA de mama normal, de mama de una mujer en el 8º mes de gestación y de cerebro fetal, con fragmentos EcoRI que dan positivo en las transferencias génicas de DNA de animales, procedentes de clones de la región en cósmidos, BAC y P1. Los clones potenciales del cDNA de BRCA1 se identificaron en las tres bibliotecas. Los clones se recogieron, se resembraron y se escrutaron de nuevo con la sonda original para comprobar que eran positivos.

Análisis de los cDNA de los híbridos seleccionados. Los fragmentos de cDNA obtenidos por selección directa se comprobaron mediante una hibridación por transferencia Southern frente a la sonda de DNA, para comprobar que se habían originado a partir del "contig". Los fragmentos que pasaron este ensayo fueron secuenciados en su totalidad. El conjunto de las secuencias de DNA obtenido de este modo, fueron comprobadas de nuevo unas frente a otras para encontrar los clones independientes que solapaban. Por ejemplo, los clones 694-65, 1240-1 y 1240-33 se obtuvieron de manera independiente y posteriormente se vio que derivaban de la misma secuencia de cDNA contigua que ha sido denominada EST:489:1.

Análisis de los clones candidatos. Uno o más de los genes candidatos, generados a partir de lo anterior, se secuenciaron, y la información se utilizó para la identificación y clasificación de cada uno de los genes expresados. Las secuencias de DNA se compararon con las de genes conocidos mediante comparaciones de secuencias de nucleótidos y mediante traslado en todos los marcos de lectura seguido de una comparación con secuencias de aminoácidos conocidas. Esto se realizo utilizando el programa "Genetic Data Environment" (GDE), versión 2.2 y la serie "Basic Local Alignement Search Tool" (Blast) de los paquetes de programas cliente/servidor (p. ej., BLASTIN 1,3,13MP), para una comparación de las secuencias frente a las bases de datos tanto de secuencias locales como remotas (p. ej., GenBank), desarrolladas en "Sun SPARC workstations". Se han generado secuencias reconstruidas a partir de colecciones de clones de cDNA identificados con los cósmidos y los P1. Todos los genes candidatos que representaban secuencias nuevas fueron analizados de nuevo para ensayar su candidatura para el locus BRCA1 putativo.

Escrutinio de mutaciones. Para escrutar mutaciones en las genealogías afectadas, se siguieron dos estrategias diferentes. Primero, DNA genómico aislado de miembros de la familia que se sabe que portan el alelo de susceptibilidad de BRCA1, se utilizó como molde para la amplificación por PCR de secuencias de genes candidatos. Si los cebadores de la PCR flanquean o solapan un limite de intrón/exón, el fragmento amplificado será más grande que lo pronosticado a partir de la secuencia de cDNA o no estará presente en la mezcla amplificada. Mediante una combinación de estos experimentos de amplificación y secuenciación de los clones en P1, BAC o cósmidos, utilizando el conjunto de cebadores diseñados, es posible establecer la estructura de intrón/exón, y finalmente obtener las secuencias de DNA del DNA genómico de las genealogías.

Una segunda estrategia que es mucho más rápida si la estructura de intrón/exón del gen candidato es compleja, implica secuenciar fragmentos amplificados procedentes de cDNA de linfocitos de las genealogías. El cDNA sintetizado a partir de mRNA de linfocitos, extraído de sangre de las genealogías, se utilizó como sustrato para la amplificación por PCR utilizando el conjunto de cebadores diseñados. Si el gen candidato se expresa en un grado importante en los linfocitos, estos experimentos usualmente producen fragmentos amplificados que pueden ser secuenciados directamente sin conocimiento de las juntas intrón/exón.

Los productos de estas reacciones de secuenciación se analizaron por electroforesis para determinar posiciones en la secuencia que contienen o bien mutaciones tales como deleciones o inserciones, o bien sustituciones de pares de bases que producen cambios de aminoácidos u otros efectos perjudiciales.

Cualquier secuencia dentro de la región de BRCA1 que se expresa en mama, se considera que es un gen candidato para BRCA1. Una evidencia forzosa de que un gen candidato determinado corresponde a BRCA1 proviene de una demostración de que las familias de las genealogías contienen alelos defectuosos del candidato.

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Ejemplo 8 Identificación de BRCA1

Identificación de BRCA1. Utilizando varias estrategias, se elaboro un mapa detallado de transcritos correspondientes a la región de 600 kb de 17q21 entre D17S1321 y D17S1324. Las secuencias candidatas expresadas se definieron como secuencias de DNA obtenidas de: 1) escrutinio directo de bibliotecas de cDNA de mama, cerebro fetal o linfocitos, 2) selección de híbridos de cDNA de mama, linfocitos u ovarios, o 3) secuenciación al azar de DNA genómico y predicción de exones codificadores por XPOUND (Thomas y Skolnick, 1994). Estas secuencias expresadas en muchos casos fueron ensambladas en "contigs" compuestos por varias secuencias identificadas independientemente. Los genes candidatos pueden comprender más de una de estas secuencias candidatas expresadas. Sesenta y cinco secuencias candidatas expresadas, situadas en esta región, fueron identificadas por selección de híbridos, por escrutinio directo de bibliotecas de cDNA, y por secuenciación al azar de subclones en P1. Las secuencias expresadas se caracterizaron por el tamaño del transcrito, secuencia de DNA, comparación con bases de datos, patrón de expresión, estructura genómica y, de modo más importante, por análisis de las secuencias de DNA en individuos de grupos familiares que segregan la susceptibilidad a cáncer de mama y de ovario, ligada a 17q.

Se aislaron tres "contigs" independientes de una secuencia expresada, 1141:1 (649 pb), 695:5 (213 pb) y 754:2 (1079 pb) y finalmente se mostró que representan porciones de BRCA1. Cuando los EST de estos "contigs" se utilizaron como sondas de hibridación para un análisis Northern, se observó un transcrito único, de aproximadamente 7,8 kb, en mRNA normal de mama, lo que sugiere que codifican diferentes porciones de un gen único. Escrutinios de bibliotecas de cDNA de mama, cerebro fetal, timo, testículos, linfocitos y placenta y experimentos de PCR con mRNA de mama, ligaron los "contigs" 1141:1, 694:5 y 754:2. Experimentos de 5' RACE con mRNA de timo, testículos y mama extendieron el "contig" al extremo 5' putativo, proporcionando una secuencia compuesta de longitud completa. La PCR y la secuenciación directa de los P1 y BAC en la región, se utilizaron para identificar la localización de intrones y permitieron la determinación de sitios de corte y empalme dadores y aceptores. Estas tres secuencias expresadas se unieron en una unidad de transcripción única que en el análisis final demostró ser BRCA1. Esta unidad de transcripción está localizada adyacente a D17S855 en el centro de la región de 600 kb (Fig. 4).

La combinación de secuencias obtenidas de clones de cDNA, secuencias de selección de híbridos y productos amplificados por PCR, permitió la construcción de un cDNA compuesto y de longitud completa, de BRCA1 (SEQ ID NO:1). La secuencia del cDNA de BRCA1 (hasta el codón de parada) ha sido también depositada en el GenBank y se le ha asignado el número de registro U-14680. Esta secuencia depositada se incorpora aquí como referencia. El clon de cDNA que más lejos se extiende en dirección 3', contiene un tramo de poli(A) precedido por una señal de poliadenilación. Una traducción conceptual del cDNA reveló un único y largo marco de lectura abierto de 208 kilodalton (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO:2), con un potencial codón de iniciación flanqueado por secuencias que se parece a la secuencia consenso de Kozak (Kozak, 1987). Las búsquedas de Smith-Waterman (Smith y Waterman, 1981) y de BLAST (Altschul y col., 1990) identificaron una secuencia cerca del aminoácido terminal con una considerable homología con los dominios de los dedos de zinc (Fig. 5). Esta secuencia contiene residuos de cisteína e histidina presentes en el motivo consenso C3HC4 de dedo de zinc y comparte otros muchos residuos con las proteínas de dedo de zinc recogidas en las bases de datos. El gen BRCA1 se compone de 23 exones codificadores dispuestos a lo largo de mas de 100 kb de DNA genómico (Fig. 6). Transferencias Northern utilizando fragmentos de cDNA de BRCA1 como sondas, identificaron un transcrito único de aproximadamente 7,8 kb, presente de manera muy abundante en mama, timo y testículos, y también presente en ovario (Fig. 7). Se observaron cuatro productos procesados de una manera alternativa en forma de clones independientes de cDNA; tres de estos productos se detectaron en mRNA de mama y 2 en mRNA de ovario (Fig. 6). Un estudio de las PCR de los cDNA de los tejidos, apoya también la idea de que existe una heterogeneidad considerable cerca del extremo 5' de los transcritos de este gen; la base molecular de la heterogeneidad implica la elección diferencial del primer sitio de corte y empalme dador, y todos los cambios detectados alteran el transcrito en la región 5' del codón de iniciación identificado. Se han detectado seis dadores potenciales de corte y empalme alternativos en esta región en 5' que no se traduce, siendo la deleción más larga de 1.155 pb. La forma predominante de la proteína BRCA1 en mama y ovario carece del exón 4. La secuencia de nucleótidos del exón 4 de BRCA1 se muestra en la SEQ ID NO:11, y la secuencia de aminoácidos prevista se muestra en la SEQ ID NO:12.

Una secuencia adicional en 5' del DNA genómico de BRCA1 se expone en la SEQ ID NO:13. La G en la posición 1 representa el sitio de iniciación potencial en testículo. La A de la posición 140 representa el sitio de iniciación potencial en tejidos somáticos. Existen seis formas de procesamiento alternativo de esta secuencia en 5', mostrados en la Figura 8. La G de la posición 366 representa el primer sitio canónico dador. La G de la posición 444 representa el primer sitio de procesamiento dador en dos de los clones (testóculo1ytestóculo 2). La G de la posición 889 representa el primer sitio de procesamiento dador en el timo 3. Un cuarto sitio de procesamiento dador es la G de la posición 1230. La T de la posición 1513 representa el sitio de procesamiento aceptor de todos los anteriores sitios de procesamiento dadores. Una quinta forma de procesamiento alternativo tiene un primer sitio de procesamiento dador en la posición 349, teniendo un primer sitio aceptor en la posición 591, y tiene un segundo sitio de procesamiento dador en la posición 889 y un segundo sitio aceptor en la posición 1513. Una sexta forma alternativa está no procesada en esta región en 5'. La A de la posición 1532 es el sitio de iniciación canónico, que aparece en la posición 120 de la SEQ ID NO:1. Secuencias parciales de DNA genómico, determinadas para BRCA1, se exponen en las Figuras 10A-10H y en las secuencias SEQ ID Números:14-34. Las letras minúsculas (de las Figuras 10A-10H) indican secuencia de intrones mientras que las letras mayúsculas indican secuencia de exones. Los intervalos no definidos del interior de los intrones se indican con vvvvvvvvvvvv en las Figuras 10A-10H. Las juntas intrón/exón se muestran en la Tabla 9. El CAG encontrado en el extremo 5' de los exones 8 y 14 se encuentra en unos cDNA pero no en otros. En las Figuras 10A-10H, en negrilla y subrayados, se muestran sitios polimórficos conocidos. Los polimorfosmos conocidos se enumeran en las Tablas 18 y 19.

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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\cr}

9

10

Transferencias realizadas en condiciones de baja rigurosidad, en las que DNA genómico procedente de organismos de diversos orígenes filogenéticos, se hibridaron con secuencias de BRCA1 que carecen de la región de los dedos de zinc, reveló la existencia de unos fragmentos que hibridaban fuertemente en seres humanos, mono, oveja y cerdo, y señales de hibridación muy débiles en roedores. Este resultado indica que, salvo en el dominio de dedos de zinc, BRCA1 se conserva solamente a un nivel moderado a lo largo de la evolución.

Mutaciones BRCA1 asociadas a la línea germinal en grupos familiares ligados a 17q. El ensayo más riguroso para los genes candidatos a BRCA1 es la búsqueda de mutaciones que potencialmente causan alteración en individuos portadores procedentes de grupos familiares que segregan la susceptibilidad a cáncer de mama y ovario ligada a 17q. Esos individuos deben contener alelos BRCA1 que difieren de la secuencia de tipo salvaje. El conjunto de secuencias de DNA utilizadas en este análisis consistían en DNA de individuos representativos de 8 grupos familiares diferentes que portan BRCA1 (Tabla 10).

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TABLA 10 Descripciones de los grupos familiares y valores de LOD asociados

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El logaritmo de los valores (LOD) dispares en estos grupos familiares varió desde 9,49 hasta -0,44 para un conjunto de marcadores presentes en 17q21. Cuatro de las familias presentan valores de LOD que demuestran la existencia de un ligamiento, y 4 presentan valores de LOD poco positivos o negativos. Estos grupos familiares últimos se incluyeron porque demuestran un haplotipo que se comparte en el cromosoma 17q21 en al menos 3 miembros afectados. Además, todos los grupos familiares del conjunto presentan una edad temprana de aparición del cáncer de mama y 4 de los grupos familiares incluyen al menos un caso de cáncer de ovario, ambos marcas distintivas de los grupos familiares que portan BRCA1. Uno de los grupos familiares, el K2082, presenta una incidencia de cáncer de mama y de ovario casi igual, un hecho inusual dada la rareza relativa de cáncer de ovario en la población. Todos los grupos familiares excepto dos fueron encontrados en Utah. El K2035 procede del medio oeste. El K2099 es un grupo familiar afroamericano que procede del sur de EE.UU.

En el escrutinio inicial de las mutaciones en BRCA1 que producen predisposición, en cada uno de los grupos familiares se ensayó el DNA de un individuo que porta el haplotipo de predisposición. Los 23 exones codificadores y las juntas de corte y empalme asociadas se amplificaron o bien a partir de muestras de DNA genómico o bien a partir de cDNA preparado a partir de mRNA de linfocitos. Cuando las secuencias de DNA amplificadas se compararon con la secuencia de tipo salvaje, se encontró que 4 de las 8 muestras de los grupos familiares, contenían variantes de la secuencia (Tabla 11).

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TABLA 11 Mutaciones que causan predisposición

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Las cuatro variantes de la secuencia son heterocigotas y cada una de ellas aparece en sólo uno de los grupos familiares. El grupo familiar K2082 contiene una mutación sin sentido en el exón 11 (Fig. 9A), el grupo familiar K1910 contiene la inserción de un único nucleótido en el exón 20 (Fig. 9B), y el grupo familiar K2099 contiene una mutación errónea en el exón 21, dando como resultado una sustitución Met \ding{212} Arg. Las mutación por desplazamiento en el marco de lectura y la mutación sin sentido probablemente alteran la función del producto de BRCA1. El péptido codificado por el alelo que lleva el desplazamiento en el marco de lectura en el grupo familiar K1910 contendría una secuencia de aminoácidos alterada que comienza a 108 residuos del extremo C-terminal del tipo salvaje. El péptido codificado por el alelo que lleva el desplazamiento en el marco de lectura en el grupo familiar K1901 contendría una secuencia de aminoácidos alterada que comienza con el residuo 24º desde el extremo N-terminal del tipo salvaje. El alelo mutante en el grupo familiar K2082 codificaría una proteína que ha perdido 551 residuos desde el extremo C-terminal. La sustitución errónea observada en el grupo familiar K2099 es potencialmente causa de alteración ya que produce el reemplazamiento de un pequeño aminoácido hidrófobo (Met) por un residuo grande y cargado (Arg). También se identificaron 11 polimorfismos comunes, 8 en la secuencia codificadora y 3 en intrones.

El individuo estudiado en el grupo familiar K2035 evidentemente contiene una mutación reguladora en BRCA1. En su cDNA, un sitio polimórfico (A\ding{212}G en la base 3667) apareció homocigoto, mientras que su DNA genómico reveló heterocigosidad en esta posición (Fig. 9C). Una posible explicación para esta observación es que el mRNA de su alelo BRCA1 mutado está ausente debido a una mutación que afecta a su producción o a su estabilidad. Esta posibilidad se exploró más ampliamente examinando 5 sitios polimórficos en la región que codifica BRCA1, que están separadas por una cantidad de como mucho 3,5 kb en el transcrito de BRCA1. En todos los casos en los que su DNA genómico se mostró heterocigoto para un polimorfismo, el cDNA se mostró homocigoto. En individuos de otros grupos familiares y en individuos no portadores del haplotipo en el grupo familiar K2035, estos sitios polimórficos podrían observarse como heterocigotos en el cDNA, lo que implica que la amplificación del cDNA no fue sesgada a favor de uno de los alelos. Este análisis indica que una mutación de BRCA1 en el grupo familiar K2035 o previene la transcripción o produce inestabilidad o un procesamiento aberrante del transcrito de BRCA1.

Cosegregación de las mutaciones de BRCA1 con los haplotipos de BRCA1 y análisis de frecuencias en la población. Además de una función que potencialmente altera la proteína, se deben satisfacer dos criterios para que una variante de la secuencia se califique como una mutación candidata a ser causante de predisposición. La variante debe: 1) estar presente en individuos del grupo familiar que portan el haplotipo de BRCA1 causante de predisposición, y estar ausente en otros miembros de grupo familiar, y 2) ser rara en la población general.

En cada mutación se ensayó la cosegregación con BRCA1. Para la mutación por desplazamiento del marco de lectura en el grupo familiar K1910, se secuenciaron otros dos haplotipos portadores y un haplotipo no portador (Fig. 9B). Únicamente los individuos portadores exhibieron la mutación por desplazamiento del marco de lectura. El cambio de C a T en el grupo familiar K2082 creó un nuevo sitio de restricción AvrII. Otros individuos portadores y no portadores del grupo familiar se ensayaron con respecto a la presencia del sitio de restricción (Fig. 9A). Un oligonucleótido alelo-específico (ASO) se diseñó para detectar la presencia de la variante de la secuencia en el grupo familiar K2099. Varios individuos del grupo familiar, unos que se sabe que portan el haplotipo asociado con el alelo que causa predisposición, y otros que se sabe que no portan el haplotipo asociado, se escrutaron mediante la técnica de ASO con respecto a la mutación previamente detectada en el grupo familiar. En cada grupo familiar, el alelo mutante correspondiente se detectó en individuos que portan el haplotipo asociado a BRCA1, y no se detectó en individuos no portadores. En el caso de la mutación reguladora potencial observada en el individuo del grupo familiar K2035, cDNA y DNA genómico procedente de individuos portadores del grupo familiar se comparó con respecto a la heterocigosidad de sitios polimórficos. En todos los casos, se demostró que el alelo extinguido en la muestra de cDNA está situado en el cromosoma que porta el alelo BRCA1 causante de predisposición (Fig. 9C).

Para excluir la posibilidad de que las mutaciones fueran simplemente polimorfismos comunes en la población, para cada una de las mutaciones se utilizaron técnicas de ASO para realizar un escrutinio en un grupo de muestras de DNA normales. Las estimaciones de las frecuencias génicas en individuos caucasianos estaban basadas en muestras obtenidas al azar procedentes de la población de Utah. Las estimaciones de las frecuencias génicas en individuos afroamericanos estaban basadas en 39 muestras proporcionadas por M. Peracek-Vance, que tenían su origen en individuos afroamericanos utilizados en sus estudios sobre el ligamiento en 20 individuos afroamericanos recién nacidos de Utah. Ninguna de las 4 mutaciones potenciales causantes de predisposición, se encontraron en la población de control apropiada, lo que indica que son mutaciones raras en la población general. Asó, dos requerimientos importantes para los alelos BRCA1 de susceptibilidad fueron satisfechos por las mutaciones causantes de predisposición candidatas: 1) la cosegregación del alelo mutante con la enfermedad, y 2) la ausencia del alelo mutante en los controles, lo que indica una frecuencia génica baja en la población general.

Expresión fenotípica de mutaciones BRCA1. El efecto de las mutaciones sobre la proteína BRCA1 se correlaciona con diferencias en la expresión fenotípica observada en los grupos familiares que portan BRCA1. La mayoría de los grupos familiares que portan BRCA1 presentan un riesgo moderadamente aumentado de cáncer de ovario, y un subgrupo más pequeño presenta altos riesgos de cáncer de ovario, comparables con los del cáncer de mama (Easton y col., 1993). Tres de los cuatro grupos familiares en los que se detectaron mutaciones en BRCA1 caen dentro de la primera categoría, mientras que el cuarto grupo familiar (el K2082) cae dentro del grupo de alto riesgo de cáncer de ovario. Debido a que la mutación sin sentido en BRCA1, encontrada en el K2082 está situada más cerca de los extremos terminales de los aminoácidos que las otras mutaciones detectadas, podría esperarse que tuvieran un fenotipo diferente. De hecho, la mutación que porta el grupo familiar K2082 presenta una incidencia alta de cáncer de ovario, y una edad media más tardía en el momento del diagnóstico de casos cáncer de mama que los otros grupos familiares (Goldgar y col., 1994). Esta diferencia en la edad de la aparición puede deberse a un sesgo en la indagación en las familias más pequeñas, con una penetrancia más alta, o pudiera reflejar diferencias específicas de tejido en el comportamiento de las mutaciones BRCA1. Los otros 3 grupos familiares que segregan mutaciones BRCA1 conocidas, tienen como media un solo caso de cáncer de ovario por cada 10 casos de cáncer de mama, pero presentan una alta proporción de casos de cáncer de mama diagnosticados a los veinte años tardíos o a los 30 años tempranos. El grupo familiar K1910 que presenta una mutación por desplazamiento del marco de lectura, no es valioso, ya que tres de las cuatro personas afectadas presentan cáncer de mama bilateral, y en cada uno de los casos, el segundo tumor fue diagnosticado en el plazo de un año de la primera presentación. Podría también esperarse que el grupo familiar K2035, que segrega una mutación BRCA1 reguladora potencial, tenga un fenotipo muy marcado. El ochenta por ciento de los casos de cáncer de mama en este grupo familiar tienen lugar antes de los 50 años. Esta cifra es igual de alta que todas las del grupo, lo que sugiere un alelo BRCA1 mutante de alta penetrancia (Tabla 10).

Aunque las mutaciones anteriormente descritas son claramente deletéreas, causando cáncer de mama en mujeres en edades jóvenes, cada uno de los cuatro grupos familiares con mutaciones incluye al menos una mujer que porta la mutación, que vivió hasta la edad de 80 años sin desarrollar una malignidad. Será de suma importancia en los estudios que vienen a continuación, identificar otros factores genéticos o medioambientales que puedan mejorar los efectos de las mutaciones BRCA1.

En cuatro de los ocho grupos familiares putativos ligados a BRCA1, no se encontraron mutaciones potenciales causantes de predisposición. Tres de estas cuatro mutaciones presentan valores de LOD correspondientes a marcadores ligados a BRCA1 menores que 0,55. Asó, estos grupos familiares pueden en realidad no segregar alelos BRCA1 causantes de predisposición. Como alternativa, las mutaciones en estos cuatro grupos familiares pueden estar situadas en regiones de BRCA1 que, por ejemplo, afectan el nivel del transcrito y por ello han escapado hasta el momento a la detección.

Papel de BRCA1 en el cáncer. La mayoría de los genes supresores de tumores identificados hasta la fecha dan lugar a productos proteicos cuya función está ausente, son no funcionales o tienen una función disminuida. La mayoría de las mutaciones TP53 son mutaciones erróneas; algunas de ellas se ha visto que producen moléculas p53 anormales que interfieren con la función del producto de tipo salvaje (Shaulian y col., 1992; Srivasta y col., 1993). Se ha propuesto un mecanismo de acción similar, dominante y negativo, para algunos alelos de la colipoliposis adenomatosa (APC) que producen moléculas truncadas (Su y col., 1993), y para mutaciones puntuales en el gen responsable del tumor de Wilm (WT1) que altera la unión de DNA a la proteína (Little y col., 1993). La naturaleza de las mutaciones observadas en la secuencia codificadora de BRCA1 esta de acuerdo con la producción de proteínas dominantes negativas o de proteínas no funcionales. La mutación reguladora inferida en el grupo familiar K2035 no puede ser dominante y negativa; más bien, esta mutación probablemente produce una reducción o la pérdida completa de la expresión de BRCA1 por parte del alelo afectado.

La proteína BRCA1 contiene un dominio C3HC4 de dedos de zinc, similar a los encontrados en numerosas proteínas de unión a DNA e implicados en la unión a ácidos nucleicos dependiente de zinc. Los primeros 180 aminoácidos de BRCA1 contienen cinco residuos básicos más que residuos ácidos. En contraste a esto, el resto de la molécula es muy ácida, con un exceso neto de 70 residuos ácidos. La carga negativa en exceso se concentra de manera particular cerca del extremo C-terminal. Así pues, una posibilidad es que BRCA1 codifica un factor de transcripción con un dominio N-terminal de unión a DNA y con un dominio C-terminal de transactivación "burbuja ácida". Curiosamente, otro gen familiar supresor de tumores, el gen WT1, contiene también un motivo de dedos de zinc (Haber y col., 1990). Muchas mutaciones en WT1, que causan predisposición al cáncer, alteran los dominios de los dedos de zinc (Little y col., 1992; Haber y col., 1990; Little y col., 1992). WT1 codifica un factor de transcripción, y un procesamiento alternativo de exones que codifican partes del dominio de dedos de zinc, altera las propiedades de unión a DNA de WT1 (Bickmore y col., 1992). Algunas formas de procesamiento alternativo del mRNA de WT1 generan moléculas que actúan como represores de la transcripción (Drummond y col., 1994). Algunas variantes de procesamiento de BRCA1 pueden alterar el motivo de dedos de zinc, suscitando la posibilidad de que un mecanismo regulador similar al que tiene lugar en WT1, pueda aplicarse a BRCA1.

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Ejemplo 9 Análisis de tumores correspondientes a mutaciones BRCA1

Para centrar el análisis sobre los tumores que tienen mayor probabilidad de contener mutaciones BRCA1, carcinomas primarios de mama y de ovario se sometieron a una determinación de los tipos de LOH en la región de BRCA1. Tres marcadores altamente polimórficos, con una única repetición en tándem, se utilizaron para determinar LOH: los marcadores D17S1323 y D17S855, que son intragénicos con respecto a BRCA1, y el marcador D17S1327, que está situado a aproximadamente 100 kb de distancia de BRCA1 en posición distal. La frecuencia de LOH combinada en los casos informativos (esto es, en los casos en los que la línea germinal era heterocigota) fue de 32/72 (44%) para los carcinomas de mama y de 12/21 (57%) para los carcinomas de ovario, lo que coincide con anteriores medidas de LOH en esa región (Futreal y col., 1992b); Jacobs y col., 1993; Sato y col., 1990; Eccles y col., 1990; Cropp y col., 1994). El análisis definió por lo tanto un conjunto de 32tumores de mama y 12tumores de ovario, de razas y edades de aparición mezcladas, para su examen con respecto a mutaciones BRCA1. La región codificadora completa, de 5.589 pb, y las secuencias de los límites entre intrón/exón en el gen, se escrutaron en este conjunto de tumores mediante solo secuenciación directa o mediante una combinación de un análisis conformacional de una cadena (SSCA) (del inglés, "Single-Strand Conformation Analysis") y secuenciación directa.

Se encontraron un total de seis mutaciones (de las cuales dos son idénticas), una en un tumor de ovario, cuatro en tumores de mama y una en un varón portador que tiene el haplotipo no afectado (Tabla 12). Una de las mutaciones, la Glu1541Ter, introdujo un codón de parada que crearía una proteína truncada que habría perdido 323 aminoácidos en el extremo carboxilo terminal. Además, se identificaron dos mutaciones erróneas. Estas mutaciones son Ala1708Glu y Met1775Arg e implican sustituciones de residuos hidrófobos pequeños por residuos cargados. Los pacientes 17764 y 19964 pertenecen a la misma familia. En el paciente OV24 el nucleótido 2575 está delecionado y en los pacientes 17764 y 19964 los nucleótidos 2993-2996 están delecionados.

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TABLA 12 Mutaciones causantes de predisposición

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Varias líneas de evidencia sugieren que las cinco mutaciones representan alelos BRCA1 de susceptibilidad:

(i) todas las mutaciones están presentes en la línea germinal;

(ii) todas las mutaciones están ausentes en poblaciones de control apropiadas, lo que sugiere que no son polimorfismos comunes;

(iii) cada alelo mutante está conservado en el tumor, como es el caso en tumores de pacientes pertenecientes a los grupos familiares que segregan alelos BRCA1 de susceptibilidad (Smith y col., 1992; Kelselly col., 1993) (si las mutaciones representaban polimorfismos neutros deberían conservarse en sólo el 50% de los casos);

(iv) la edad de aparición en los cuatro casos de cáncer de mama con mutaciones varió entre los 24 y 42 años, que está de acuerdo con la edad temprana de aparición de cáncer de mama en personas con alelos BRCA1 de susceptibilidad; de manera similar, los casos de cáncer de ovario se diagnosticaron a los 44 años una edad que cae dentro del 13% más joven de todos los casos de cáncer de ovario; y por último,

(v) tres de los cinco casos tienen historias familiares positivas de cáncer de mama y ovario encontrados retrospectivamente en sus archivos médicos, aunque el grupo de tumores no se seleccionó con respecto a este criterio.

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A BT106 se le diagnosticó un cáncer de mama a los 24 años. Su madre tuvo cáncer de ovario, su padre tuvo melanoma, y su abuela paterna también tuvo cáncer de mama. La paciente MC44, afroamericana, tuvo cáncer de mama bilateral a los 42 años. Esta paciente tuvo una hermana que falleció de cáncer de mama a los 34 años, otra hermana que falleció de linfoma, y otro hermano que falleció de cáncer de pulmón. Su mutación (Met1775Arg) había sido detectada previamente en el grupo familiar K2099, una familia afroamericana que segrega un alelo BRCA1 de susceptibilidad, y estaba ausente en controles afroamericanos y caucasianos. La paciente MC44, por lo que se sabe, no es pariente del grupo familiar K2099. La detección de un alelo mutante raro, una vez en un grupo familiar que lleva BRCA1 y una vez en la línea germinal de un caso de cáncer de mama de aparición temprana, aparentemente no emparentado, sugiere que el cambio Met1175Arg puede ser una mutación común causante de predisposición en individuos afroamericanos. En su conjunto, estas observaciones indican que las cuatro mutaciones BRCA1 en tumores representan alelos de susceptibilidad; no se detectaron mutaciones somáticas en las muestras analizadas.

La escasez de mutaciones BRCA1 somáticas es inesperada, dada la frecuencia de LOH en 17q, y el papel usual de los genes de susceptibilidad como supresores de tumores en la progresión del cáncer. Existen tres posibles explicaciones para este resultado: (i) algunas mutaciones BRCA1 en secuencias codificadoras se perdieron debido al procedimiento de escrutinio; (ii) las mutaciones BRCA1 somáticas están situadas principalmente fuera de los exones codificadores; y (iii) los eventos en LOH en 17q no reflejan mutaciones BRCA1 somáticas.

Si las mutaciones BRCA1 somáticas son verdaderamente raras en carcinomas de mama y ovario, esto tendría importantes implicaciones para la biología de BRCA1. La evidente ausencia de mutaciones BRCA1 somáticas implica que deben existir algunas diferencias fundamentales en la génesis de tumores en individuos portadores de BRCA1 genéticamente predispuestos, en comparación con la génesis de tumores en la población general. Por ejemplo, las mutaciones en BRCA1 pueden tener un efecto solamente sobre la formación de tumores en un estadio específico en una fase temprana del desarrollo de mama y ovario. Esta posibilidad está de acuerdo con una función primaria de BRCA1 en el cáncer de mama pre-menopáusico. Este modelo del papel de BRCA1 en el cáncer de mama y ovario predice una interacción entre hormonas de la reproducción y la función BRCA1. Sin embargo, no se han descrito diferencias clínicas o patológicas en tumores de mama y ovario familiares en comparación con los esporádicos, más que la edad de aparición (Lynch y col., 1990). Por otra parte, el reciente descubrimiento de un aumento en la mutación TP53 y una inestabilidad de microsatélites en tumores de mama de pacientes con una historia familiar de cáncer de mama (Glebov y col., 1994) puede reflejar alguna diferencia en tumores que aparecen en personas genéticamente predispuestas. La implicación de BRCA1 en este fenómeno puede ahora acometerse de manera directa. De manera alternativa, la ausencia de mutaciones BRCA1 somáticas puede ser resultado de la existencia de múltiples genes que actúan en la misma ruta de supresión de tumores que BRCA1, pero que colectivamente representan una diana más favorecida para una mutación en tumores esporádicos. Debido a que la mutación de un solo elemento en una ruta genética generalmente es suficiente para alterar la ruta, BRCA1 podría mutar con una tasa que es bastante más baja que la suma de las tasas mutacionales de los otros elementos.

Un estudio independiente para analizar la presencia de mutaciones BRCA1 en tumores, se ha realizado en Japón. Un conjunto de 103 pacientes que representan casos de aparición temprana (de <35 años de edad) (46 pacientes), miembros de familias con muchos miembros afectados (12 pacientes), y/o pacientes que habían desarrollado cáncer de mama bilateral (59 pacientes), se escrutaron para buscar mutaciones en BRCA1. Tumores primarios de mama procedentes de estos pacientes se escrutaron para buscar mutaciones en exones codificadores de BRCA1 utilizando análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP). Para el exón 11, que tiene una longitud de 3425 pb, se diseñaron cebadores de PCR para amplificar por separado 11 segmentos solapantes de este exón. Cada uno de los otros 22 exones se amplificaron individualmente en una sola PCR. De este modo se llevaron a cabo 33 análisis de PCR-SSCP para cada caso. Se detectaron mutaciones en tumores procedentes de cuatro pacientes, todos los cuales habían desarrollado cáncer de mama bilateral (Tabla 12A). Una de las mutaciones produjo un desplazamiento en el marco de lectura, debido a una deleción de 2 pb (deleción de AA) en el codón 797. Esto dio lugar a una proteína truncada que había perdido 1065 aminoácidos en el extremo COOH terminal. Una segunda mutación fue una mutación sin sentido en el codón 1214 debida a una transversión G \ding{212} T del primer nucleótido del codón. Esto produce un codón de parada prematuro en lugar de ácido glutámico en este sitio y da como resultado una proteína truncada que ha perdido 649 aminoácidos en el extremo COOH terminal. También había dos mutaciones erróneas. Una mutación era una transición G \ding{212} A en el primer nucleótido del codón 271, que produce una sustitución Val \ding{212} Met. La segunda mutación estaba en el codón 1150 (una transición C \ding{212} T en el primer nucleótido del codón), y produce una sustitución Pro \ding{212} Ser, un reemplazamiento de un aminoácido hidrófobo no polar por un aminoácido polar no cargado. Se encontró que todas estas mutaciones eran mutaciones de la línea germinal. La edad media de aparición en estos cuatro pacientes fue de 49 años. Estos estudios también encontraron un polimorfismo neutro común de C o T en el primer nucleótido del codón 771.

TABLA 12A Mutaciones causantes de predisposición

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Aunque los pacientes 98 y 7 muestran la misma mutación, no están emparentados entre sí.

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Ejemplo 10 Análisis del gen BRCA1

La estructura y función del gen BRCA1 se determinan conforme a los siguientes métodos.

Estudios biológicos. Se construyen vectores de expresión en mamíferos, que contienen cDNA de BRCA1, y se transfieren a células apropiadas de carcinoma de mama, con lesiones en el gen. Se utilizan cDNA de BRCA1 de tipo salvaje y cDNA de BRCA1 alterado. El cDNA de BRCA1 alterado puede obtenerse procedente de alelos BRCA1 alterados o producidos como se describe más adelante. Se estudia la reversión fenotípica en cultivos (p. ej., morfología celular, tiempo de duplicación, crecimiento independiente del anclaje) y en animales (p. ej., la tumorigenicidad). Los estudios emplean formas de tipo salvaje y formas mutantes (Sección B) del gen.

Estudios de genética molecular. Se realiza una mutagénesis in vitro para construir mutantes por deleción y mutantes erróneos (por sustituciones de un único par de bases en codones individuales y en grupos cargados \ding{212} mutagénesis por barrido de alanina). Los mutantes se utilizan en estudios biológicos, bioquímicos y biofísicos.

Estudios de los mecanismos. Se estudia la capacidad de la proteína BRCA1 para unirse a secuencias de DNA conocidas y no conocidas. Su capacidad para transactivar promotores se analiza mediante sistemas de expresión transitoria de genes reporteros en células de mamífero. Se utilizan procedimientos convencionales tales como la captura de partículas y el sistema de dos híbridos en levaduras para descubrir e identificar todos los patrones funcionales. La naturaleza y funciones de los patrones se caracterizan. Estos patrones a su vez son dianas para el descubrimiento de fármacos.

Estudios estructurales. En E. coli, levaduras, células de insectos y/o mamíferos se producen proteínas recombinantes, y se utilizan en estudios cristalográficos y de NMR. También se utiliza la elaboración de modelos moleculares de las proteínas. Estos estudios facilitan el diseño de estructuras dirigido a fármacos.

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Ejemplo 11 Ensayo en dos pasos para detectar la presencia de BRCA1 en una muestra

La muestra del paciente se procesa conforme al método descrito por Antonarakis y col., (1985), se separa a través de un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nilón para un análisis de transferencia Southern. Las membranas se someten a formación de enlaces cruzados por acción de luz UV, a 150 mJ, utilizando un GS Gene Linker (Bio-Rad). Una sonda para BRCA1 que corresponde a las posiciones de los nucleótidos 3631-3930 de la SEQ ID NO:1 se subclona en pTZ18U. Los fagómidos se transforman en E. coli MV1190 infectada con el fago auxiliar M13KO7 (Bio-Rad, Richmond, CA). Se aísla DNA monocatenario conforme a procedimientos estándar (véase Sambrook y col., 1989).

Las transferencias se prehibridan durante 15-30 min a 65ºC en dodecilsulfato sódico (SDS) al 7% en NaPO4 0,5 M. Los métodos siguen los descritos por Nguyen y col., 1992. Las transferencias se hibridan durante la noche a 65ºC en SDS al 7%, NaPO4 0,5 M con una sonda de DNA monocatenario a una concentración de 25-50 ng/ml. Los lavados posteriores a la hibridación consistieron en dos lavados de 30 min en SDS al 5% NaPO_{4} 40 mM a 65ºC, seguidos de dos lavados de 30 min en SDS al 1%, NaPO_{4} 40 mM a 65ºC.

A continuación las transferencias se lavan con disolución salina tamponada con fosfato (pH 6,8) durante 5 min a temperatura ambiente y se incuban con caseína al 2% durante 30-60 minutos a temperatura ambiente y se lavan en PBS durante 5 min. Las transferencias se preincuban luego durante 5-10 minutos en un baño de agua con agitación 45ºC, con un tampón de hibridación constituido por urea 6 M, NaCl 0,3 M y 5X disolución de Denhart (véase Sambrook y col., 1989). El tampón se extrae y se reemplaza con tampón de hibridación de nueva aportación, 50-75 \mul/cm^{2}, más una concentración 2,5 nM del conjugado de oligonucleótidos reticulados de manera covalente-fosfatasa alcalina con la secuencia de nucleótidos complementaria al sitio del cebador universal (UP-AP, Bio-Rad). Las transferencias se hibridan durante 20-30 minutos a 45ºC y los lavados posthibridación se incuban a 45ºC, como dos lavados de 10 min en urea 6M, 1x disolución salina estándar con citrato (SSC) (del inglés, "Standar Saline Citrate"), SDS al 0,1% y un lavado de 10 min en 1xSSC, Tritón^{1}® X-100 al 0,1%. Las transferencias se aclararon durante 10 min a temperatura ambiente con 1xSSC.

Las transferencias se incuban 10 min a temperatura ambiente con agitación en el tampón del sustrato constituido por dietanolamina 0,1 M, MgCl_{2} 1 mM, azidasodica al 0,02%, pH 10,0. Las transferencias individuales se ponen en bolsas sellables por calor, con tampón de sustrato y AMPPD (3-(2'-espiroademantano)-4-metoxi-4-(3'-fosforiloxi)fenil-1,2-dioxetano, sal disódica, Bio-Rad) 0,2 mM. Después de una incubación de 20 min a temperatura ambiente con agitación, la disolución de AMPPD en exceso se separa. La transferencia se expone a una película para rayos X durante la noche. Las bandas positivas indican la presencia de BRCA1.

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Ejemplo 12 Generación de un anticuerpo policlonal contra BRCA1

Segmentos de la secuencia codificadora de BRCA1 se expresaron en forma de una proteína de fusión en E. coli. La proteína sobreexpresada se purifico mediante elución en gel y se utilizo para inmunizar conejos y ratones utilizando un procedimiento similar al descrito por Harlow y Lane, 1988. Se ha demostrado que este procedimiento genera Abs contra otras varias proteínas (por ejemplo, véase Kraemer y col., 1993).

Brevemente expuesto, una extensión de la secuencia codificadora de BRCA1 se clonó en forma de una proteína de fusión en el plásmido PET5A (Novagen, Inc, Madison, WI). La secuencia de BRCA1 incorporada incluye los aminoácidos correspondientes a los números 1361-1554 de la SEQ ID NO: 2. Después de la inducción con IPTG, la sobreexpresión de una proteína de fusión con el peso molecular esperado se verificó por SDS/PAGE. La proteína de fusión se purificó desde el gel por electroelución. La identificación de la proteína como el producto de fusión con BRCA1 se verifico mediante secuenciación de proteínas por el extremo N-terminal. Seguidamente, la proteína purificada se utilizó como inmunógeno en conejos. Los conejos se inmunizaron con 100 \mug de la proteína en adyuvante completo de Freund y recibieron dos inmunizaciones de refuerzo a intervalos de 3 semanas, primero con 100 \mug de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund seguido de 100 \mug de inmunógeno en PBS. Dos semanas más tarde se recogió el suero que contiene el anticuerpo.

Este procedimiento se repite para generar anticuerpos contra las formas mutantes del gen BRCA1. Estos anticuerpos, junto con los anticuerpos contra BRCA1 de tipo salvaje, se utilizaron para detectar la presencia y el nivel relativo de las formas mutantes en diferentes tejidos y fluidos biológicos.

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Ejemplo 13 Generación de anticuerpos monoclonales específicos de BRCA1

Se generan anticuerpos monoclonales conforme al siguiente protocolo. Se inmunizaron ratones con un inmunógeno que comprende BRCA1 intacto o pépticos BRCA1 (de tipo salvaje o mutante) conjugado con hemocianina de la lapa "keyhole", utilizando glutaraldehído o EDC de la manera conocida.

El inmunógeno se mezcla con un adyuvante. Cada ratón recibe cuatro inyecciones de 10 a 100 \mug de inmunógeno y después de la cuarta inyección las muestras se recogen de los ratones para determinar si el suero contiene anticuerpo contra el inmunógeno. El título del suero se determina por ELISA o RIA. Los ratones con sueros que indican la presencia de anticuerpo contra el inmunógeno se seleccionan para la producción de los hibridomas.

Los bazos se extraen procedentes de los ratones inmunes y se preparan suspensiones de células aisladas (véase Harlow y Lane, 1988). Las fusiones celulares se realizan esencialmente de la manera descrita por Kohler y Milstein, 1975. Brevemente expuesto, células de mieloma P3,65,3 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se fusionan con células de los bazos inmunes utilizando polietilenglicol de la manera descrita por Harlow y Lane, 1988. Las células se siembran con una densidad de 2x10^{5} células/pocillo en placas de 96 pocillos para cultivo de tejidos. En los pocillos individuales se examina el crecimiento y los sobrenadantes de los pocillos con crecimiento se ensayan con respecto a la presencia de anticuerpos específicos de BRCA1 por ELISA o RIA utilizando proteína diana BRCA1 de tipo salvaje o BRCA1 mutante. Las células presentes en los pocillos positivos se expanden y subclonan para establecer y confirmar la monoclonalidad.

Los clones con las especificidades adecuadas se expanden y se cultivan en forma de ascitis en ratones o en un sistema de fibra hueca para producir cantidades suficientes de anticuerpo para su caracterización y para el desarrollo del ensayo.

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Ejemplo 14 Ensayo en sándwich de BRCA1

El anticuerpo monoclonal se adhiere a una superficie sólida tal como una placa, tubo, bolita o partícula. Preferiblemente, el anticuerpo se adhiere a la superficie de un pocillo de una placa de 96 pocillos para ELISA. Cien \mul de muestra (p. ej., suero, orina, citosol tisular) que contiene péptido/proteína BRCA1 (de tipo salvaje o mutante) se añade al anticuerpo adherido en la fase sólida. La muestra se incuba 2 h a temperatura ambiente. A continuación el fluido de la muestra se decanta, y la fase sólida se lava con tampón para separar el material no unido. Cien/l de un segundo anticuerpo monoclonal (contra un determinante diferente presente en el péptido/proteína BRCA1) se añaden a la fase sólida. Este anticuerpo esta marcado con una molécula de detección (p. ej., ^{125}I, enzima, fluoróforo un cromóforo) y la fase sólida con el segundo anticuerpo se incuba durante 2 h a temperatura ambiente. El segundo anticuerpo se decanta y la fase sólida se lava con tampón para separar el material no unido.

La cantidad de marcador unido, que es proporcional a la cantidad de péptido/proteína BRCA1 presente en la muestra, es cuantificada. Se realizan ensayos independientes utilizando anticuerpos monoclonales que son específicos para el BRCA1 de tipo salvaje asó como anticuerpos monoclonales específicos para cada una de las mutaciones identificadas en BRCA1.

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Ejemplo 15 Análisis de mutaciones BRCA1

Las muestras de DNA que se escrutaron para buscar mutaciones BRCA1, se habían extraído de muestras de sangre o de tumores procedentes de pacientes con cáncer de mama u ovario (o procedentes de individuos que se sabe son portadores por análisis de los haplotipos), que participaban en estudios de investigación científica sobre la genética del cáncer de mama. Todos los sujetos firmaron el consentimiento informado pertinente. La Tabla 13 detalla el número de muestras, los criterios de indagación y los métodos de escrutinio para cada conjunto de muestras escrutadas.

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Aunque las mutaciones originales descritas en Miki y col., 1994, fueron detectadas por medio de un escrutinio de cDNA, se utilizaron 25 pares de cebadores de PCR intrónicos para amplificar la secuencia codificadora completa y las juntas de corte y empalme a partir del DNA genómico correspondiente a la mayoría de las muestras restantes. Información actualizada sobre los cebadores se encuentra públicamente disponible vía ftp anónimo en morgan.med.utah.edu en el directorio pub/BRCA1. En los casos en los que fue posible, las variaciones de la secuencia de DNA se ensayaron con relación a la cosegragación con el cáncer de mama u ovario en la familia. Una evidencia más de un papel causal de una secuencia variable en el cáncer se proporcionó demostrando la ausencia de la mutación putativa en un grupo de individuos de control. El escrutinio de mutaciones específicas, previamente identificadas, en grupos grandes de muestras seleccionadas se realizó utilizando una hibridación con ASO.

La Tabla 14 describe muchas de las mutaciones encontradas escrutando la secuencia codificadora de BRCA1 completa así como los límites entre intron/exon y encontrando sitios polimórficos en el DNA genómico que se reducen a sitios monomórficos en el cDNA. Se encontraron dos mutaciones comunes y sus frecuencias en otras muestras se estudiaron mediante análisis de ASO (Tabla 15). Las Tablas 16 y 17 describen respectivamente la distribución de las mutaciones por tipo y por localización dentro de la secuencia codificadora de BRCA1. En mucho, la mayoría de las mutaciones identificadas fueron desplazamientos en el marco de lectura. Globalmente, no se encontró un apartamiento estadístico significativo con respecto a la distribución aleatoria a lo largo de la secuencia codificadora de BRCA1 x^{2}=2,00 , 2 grados de libertad, p=0,37) entre las distintas mutaciones encontradas en la secuencia codificadora de BRCA1 hasta la fecha.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 15 Frecuencia de dos mutaciones BRCA1 comunes

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TABLA 16 Frecuencia observada de diferentes tipos de mutaciones

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TABLA 17 Distribución de Mutaciones identificadas en una secuencia que codifica BRCA1

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Se han encontrado mutaciones en muchas regiones diferentes del gen. Se han encontrado mutaciones fenotípicamente graves tanto en el extremo 5' de BRCA1 como en la porción del extremo 3' del gen. Una de estas mutaciones encontrada en una familia con siete casos de cáncer de mama de aparición temprana produce una proteína que pierde solamente los 10 aminoácidos terminales, lo que indica que esta región de BRCA1 desempeña un papel en la función normal del gen. Es importante destacar que la aplastante mayoría de alteraciones en BRCA1 han sido o mutaciones por desplazamiento del marco de lectura o mutaciones sin sentido, que dan como resultado un producto proteico inestable o truncado.

En BRCA1, hasta la fecha, dos mutaciones parecen ser relativamente comunes. La mutación 5382 ins Cde BRCA1, situada en el codón 1756, y la mutación 185 del AG, situada en el codón 23, se identificaron por secuenciación directa en siete (10%) y ocho (12%) respectivamente de los 68 probandos estudiados en los estudios iniciales en los que se identificaron las mutaciones. Además de estas mutaciones comunes, se han encontrado mutaciones adicionales en más de una familia, por medio de un escrutinio completo del cDNA. Muchos de los probandos escrutados para buscar mutaciones BRCA1, fueron seleccionados por tener una alta probabilidad previa de presentar esas mutaciones. Por lo tanto, las mutaciones encontradas en este grupo pueden no ser representativas de aquellas mutaciones que hubieran sido identificadas en otros grupos de pacientes. Sin embargo, las mutaciones BRCA1 más frecuentes (5382 ins C y 185 del AG) se han encontrado muchas veces en escrutinios dirigidos en grupos de probandos que habían sido o no seleccionados por su historia familiar o indagados con una historia familiar mínima.

Además de las mutaciones anteriormente mostradas, se detectaron también muchos polimorfismos durante el escrutinio de las muestras. Estos polimorfismos están listados en las Tablas 18 y 19).

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Utilidad industrial

Como se ha descrito anteriormente, el presente invento proporciona materiales y métodos para utilizar en el ensayo de alelos BRCA1 de un individuo y una interpretación de la naturaleza normal o causante de predisposición de los alelos. Los individuos con un riesgo mayor de lo normal podrían modificar sus estilos de vida de manera apropiada. En el caso de BRCA1, el factor de riesgo no genético más significativo es el efecto protector de un embarazo a término en edad temprana. Por lo tanto, las mujeres que presentan riesgo podrían considerar tener descendencia a edad temprana o una terapia diseñada para estimular los efectos hormonales de un embarazo a término a edad temprana. Las mujeres que presentan un riesgo elevado procuraran hacer una detección temprana y estarían más altamente motivadas a aprender y practicar el autoexamen de mama. Estas mujeres estarían también altamente motivadas a hacerse mamografías regulares, comenzando quizás a una edad más temprana que la población general. El escrutinio de ovarios también podría acometerse con una frecuencia más alta. Los métodos de diagnóstico basados en el análisis de secuencias del locus BRCA1 también podrían aplicarse a la detección y clasificación de tumores. El análisis de secuencias podrá utilizarse para diagnosticar lesiones precursoras.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Con la evolución del método y la acumulación de información sobre BRCA1 y otros loci causantes, podrá llegar a ser posible separar los cáncer benignos y malignos.

Las mujeres con cáncer de mama pueden seguir diferentes procedimientos quirúrgicos en caso de estar predispuestas, y por lo tanto es más probable que tengan cáncer adicionales que si no están predispuestas. Pueden desarrollarse otras terapias, utilizando tanto péptidos como moléculas pequeñas (diseño racional de fármacos). Los péptidos podrían ser el propio producto del gen perdido o una porción del producto del gen perdido. Como alternativa, el agente terapéutico podrá ser otra molécula que mimetiza la función deletérea del gen, ya sea un péptido o una molécula no peptídica que busca contrarrestar el efecto deletéreo del locus heredado. La terapia podría ser también génica, a través de la introducción de un alelo BRCA1 normal en los individuos, para fabricar una proteína que contrarreste el efecto del alelo deletéreo. Estas terapias génicas pueden tomar muchas formas y pueden dirigirse ya sea a prevenir la formación del tumor, curar un cáncer una vez que ha aparecido o detener la metastatización de un cáncer.

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Lista de patentes y aplicación de patentes

U.S. Patent No. 3,817,837

U.S. Patent No. 3,850,752

U.S. Patent No. 3,939,350

U.S. Patent No. 3,996,345

U.S. Patent No. 4,275,149

U.S. Patent No. 4,277,437

U.S. Patent No. 4,366,241

U.S. Patent No. 4,376,110

U.S. Patent No. 4,486,530

U.S. Patent No. 4,683,195

U.S. Patent No. 4,683,202

U.S. Patent No. 4,816,567

U.S. Patent No. 4,868,105

U.S. Patent No. 5,252,479

EPO Publication No. 225,807

European Patent Application Publication No. 0332435

Geysen; H., PCT published application WO 84/03564, published 13 September 1984

Hitzeman et al., EP 73,675A

PCT published application WO 93/07282

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: MYRIAD GENETICS INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 300 WAKARA WAY

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: SALT LAKE CITY

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: UTAH

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 84108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: CENTRE DU RECHERCHE DU CHUL

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 2705 LAURIER BOULEVARD

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: SAINTE-FOY

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: QUEBEC

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: CANADA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: G1V 4G2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: CÁNCER INSTITUTE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1-31-1, KAMI-IKEBUKURO, TOSHIMO-KU

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: TOKYO

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: JAPÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 170

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITULO DEL INVENTO: MUTACIONES IN VIVO Y POLIMORFISMOS EN EL GEN DE SUSCEPTIBILIDAD A CÁNCER DE MAMA Y OVARIO, LIGADO A 17q.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 85

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release n.º1.0, Versión n.º1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5914 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 120....5711

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

26

28

29

30

31

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1864 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: s754 A

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCCTGGG CAACAAACGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: s754 B

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGGAAGCA GGAATGGAAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: s754 A

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGAGATGG ATTATTGGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: S975B

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCAACTTT GCAATGAGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: tdj1474 A

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAGTGAGA CCTTGTCTCA AA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: tdj1474 B

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTGCAAAC ACCTTAAACT CAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: tdj1239 A

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCTGGAAG GCAGAGGTTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: tdj1239 B

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGTACCTG CTAAGCAGTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2.....111

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1534 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1924 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 631 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 481 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 522 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 465 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 513 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6769 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

53

54

55

56

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4249 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 710 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 473 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 997 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 639 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 922 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 867 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 561 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 567 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 633 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 470 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 517 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 434 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATAAATTAA AACTGCGACT GCGCGGCGTG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGTAGAGT CCCGGGAAAG GGACAGGGGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATATAT GTTTTTCTAA TGTGTTAAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTCAGC ACAAGAGTGT ATTAATTTGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCTTTTTC TCCCCCCCCT ACCCTGCTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTTTGA ATGTGTTATG TGGCTCCATT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTACTTTT TTTTTTTTTT TTTGAGACAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTGCAC ACCACCATAT CCAGCTAAAT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTGTTCTT TCTTTCTTTA TAATTTATAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATATAATT TGGTAATGAT GCTAGGTTGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTGTGTTT CTCAAACAAT TTAATTTCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTGTTG AATATCCCAA GAATGACACT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACATAATG TTTTCCCTTG TATTTTACAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACCAT TTGTTTTCTT CTTCTTCTTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTTGACTG TTCTTTACCA TACTGTTTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGGGTCT CAGGTTTTTT AAGTATTTAA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATTTATTT TTTGGGGGGA AATTTTTTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 52

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAGTCAAA GAGAACCTTT GTCTATGAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTTATTAGG ACTCTGTCTT TTCCCTATAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAATGGCAA AGTTTGCCAA CTTAACAGGC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTACCTTG TTATTTTTGT ATATTTTCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTGGAAC CAGGTTTTTG TGTTTGCCCC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATCTGAAC CTCTGTTTTT GTTATTTAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTAAAAAG CGTGTGTGTG TGTGCACATG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTTTCTTG GTACCATTTA TGCTTTTTGA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTGTATTG TTGGCCAAAC ACTGATATCT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTAGATTTG TTTTCTCATT CCATTTAAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGAAACA TCAATGTAAA GATGCTGTGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGTTTTCT CCTTCCATTT ATCTTTCTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(IX): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAATATTTC ATCTGCTGTA TTGGAACAAA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAATTAA ACTTCTCCCA TTCCTTTCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAGTGTAT CCATATGTAT CTCCCTAATG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGATAATGG AATATTTGAT TTAATTTCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATACCAAG AACCTTTACA GAATACCTTG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAATCCTTT GAGTGTTTTT CATTCTGCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTATAA TACTATTTCT CCCCTCCTCC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAACCTGT CTTTTCTATG ATCTCTTTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTACTT GATGTTACAA ACTAACCAGA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGATGGG TTGTGTTTGG TTTCTTTCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAGCTCC CTCCCTCAAG TTGACAAAAA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTCCCTCT CTCTTCCTCT CTTCTTCCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGAGCCT GGGAGAACCC CAGAGTTCCA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGATTTTA CATGTAAATG TCCATTTTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTATTG GGTGCCCTGT CAGTGTGGGA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAATGCTC TTTCCTTCCT GGGGATCCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGGTGCC TCGCATGTAC CTGTGCTATT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAATCTCTG CTTGTGTTCT CTGTCTCCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): LONGITUD: 42 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:

\vskip1.000000\baselineskip

78

Claims

1. Un método diagnosticar una predisposición a cáncer de mama y de ovario en un individuo humano, que comprende determinar si hay una alteración en la línea germinal 185delAG\ding{212}ter39 en el gen BRCA1 una muestra de tejido de dicho individuo, indicando dicha alteración una predisposición a dicho cáncer.

2. Un método diagnosticar una lesión de mama y de ovario de un individuo humano para la neoplasia asociada al locus del gen BCRA1 que comprende determinar si hay una mutación 185delAG\ding{212}ter39 en el gen BCRA1 en una muestra a partir de dicha lesión.

3. Un método según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende analizar mRNA de dicha muestra para determinar si un producto de expresión se muestra indicativo de la expresión de un alelo BRCA1 mutante, donde dicho mRNA de dicha muestra se pone en contacto con una sonda oligonucleotídica del gen BCRA1, siendo específica de alelo para dicha alteración/mutación, en condiciones adecuadas para la hibridación de dicha sonda con un RNA correspondiente a dicho gen BCRA1 y se determina la hibridación de dicha sonda.

4. Un método según la reivindicación 1 i la reivindicación 2, donde una sonda oligonucleotídica del gen BCRA1, siendo específica del alelo para dicha alteración/mutación, se pone en contacto con DNA genómico aislado de dicha muestra en condiciones adecuadas para la hibridación de dicha sonda con dicho gen y se determina la hibridación de dicha sonda.

5. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde se emplean los cebadores oligonucleotídicos que son específicos para el alelo BCRA1 mutante tal como se define en la reivindicación 1 para determinar si dicho alelo está presente en dicha muestra por amplificación de ácidos nucleicos.

6. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde todo o parte del gen BCRA1 en dicha muestra es amplificado.

7. Una sonda de ácido nucleico que tiene de 15 a 30 nucleótidos de SEQ ID NO:1 y que contiene la mutación 185delAG\ding{212}ter39.

8. Un vector de clonación replicativo que comprende un ácido nucleico aislado según la reivindicación 7 y un replicón operativo en una célula hospedadora para dicho vector.

9. Células hospedadoras transformadas in vitro con un vector tal como se reivindica en la reivindicación 8.