EA047679B1

EA047679B1 - METHOD OF INOCULATING A PLANT

Info

Publication number: EA047679B1
Application number: EA202190490
Authority: EA
Inventors: Дэвид Дэнт; Иэн Кларк
Original assignee: Азотик Текнолоджиз Лтд
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2024-08-26

Description

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к способу инокуляции растений азотфиксирующими бактериями и к композициям и наборам, подходящим для применения в таком способе.The present invention relates to a method for inoculating plants with nitrogen-fixing bacteria and to compositions and kits suitable for use in such a method.

Уровень техникиState of the art

Азотфиксирующую бактерию Gluconacetobacter diazotrophicus, ранее известную под названием Acetobacter diazotrophicus (Gillis, M. et al. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:361-364; 1989), впервые выделили из корней и стеблей сахарного тростника (Cavalcante, V. A., et al. (1988) Plant Soil Vol. 108, p. 23-31). Путем введения ¹⁵N₂ было показано, что G. diazotrophicus фиксирует азот внутри растений сахарного тростника (Sevilla, M. et al. Mol. Plant Microbe Interact. 14:358-366; 2001; Boddey, R. M. et al. Plant Soil 252:139-149; 2003), и что данная бактерия способна экскретировать практически половину фиксированного азота в форме, которая потенциально доступная для растений (Cojho, E. H et al. Fed. Eur. Microbiol. Soc. Microbiol. Lett. 106:341-346; 1993). Данная бактерия проникает между клеток меристемы корней сахарного тростника и в точках роста боковых корней колонизирует межклеточное пространство, а также ксилему, без образования клубеньков (James, E. K. et al. J. Exp. Bot. 52:747-760; 2001). Были продемонстрированы условия, при которых может происходить внутриклеточная колонизация бактерией Gd, что обеспечивает возможность фиксации азота неклубеньковыми эндосимбионтами (EP-B-1422997 и Cocking, E.C., et al. (2006) In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant Vol. 42, No. 1, p. 74-82). В частности, бактерии вводят в среду роста растения, пока растение прорастает, или в пределах 7 дней после этого периода.The nitrogen-fixing bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus, previously known as Acetobacter diazotrophicus (Gillis, M. et al. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:361-364; 1989), was first isolated from the roots and stems of sugarcane (Cavalcante, VA, et al. (1988) Plant Soil Vol. 108, p. 23-31). By introducing ¹⁵ N ₂ , it has been shown that G. diazotrophicus fixes nitrogen inside sugarcane plants (Sevilla, M. et al. Mol. Plant Microbe Interact. 14:358-366; 2001; Boddey, RM et al. Plant Soil 252:139-149; 2003), and that this bacterium is able to excrete almost half of the fixed nitrogen in a form that is potentially available to plants (Cojho, E. H et al. Fed. Eur. Microbiol. Soc. Microbiol. Lett. 106:341-346; 1993). This bacterium penetrates between the cells of the meristem of sugarcane roots and colonizes the intercellular space and xylem at the growing points of lateral roots without forming nodules (James, EK et al. J. Exp. Bot. 52:747-760; 2001). Conditions have been demonstrated under which intracellular colonization by Gd can occur, allowing nitrogen fixation by non-nodulating endosymbionts (EP-B-1422997 and Cocking, EC, et al. (2006) In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant Vol. 42, No. 1, p. 74-82). Specifically, the bacteria are introduced into the plant growth medium while the plant is germinating or within 7 days of this period.

В WO 2011/144741 предполагается, что такие бактерии, как Gd, можно вводить в стебли сахарного тростника для улучшения фиксации азота. Понятно, что такая методика не единственная, которую можно использовать в какой-либо крупномасштабной сельскохозяйственной технологии.WO 2011/144741 suggests that bacteria such as Gd can be introduced into sugarcane stems to improve nitrogen fixation. It is clear that this is not the only technique that can be used in any large-scale agricultural technology.

Заявители установили, что растущие растения можно с успехом инокулировать азотфиксирующими бактериями.The applicants have found that growing plants can be successfully inoculated with nitrogen-fixing bacteria.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ инокуляции растения азотфиксирующими бактериями, при этом указанный способ включает введение азотфиксирующих бактерий в рану растущего растения.According to the present invention, a method is proposed for inoculating a plant with nitrogen-fixing bacteria, wherein said method comprises introducing nitrogen-fixing bacteria into a wound of a growing plant.

Было установлено, что при нанесении на рану, в частности, при нанесении на поверхность раны ткани растения, последующий рост растения улучшается. Например, может улучшаться показатель биомассы или урожайность и/или может увеличиваться число цветков. Это может быть обусловлено колонизацией ткани растения азотфиксирующими бактериями подобно тому, что описано, к примеру, в документе EP-B-1422997, хотя тот факт, что это может происходить при нанесении таким способом, является неожиданным. Азотфиксирующие бактерии, колонизировавшие ткань растения, могут быть источником внутриклеточного азота, который улучшает рост растения. Таким образом, способ по настоящему изобретению представляет собой полезное средство введения препарата, улучшающего рост растения, в растущие растения.It has been found that when applied to a wound, in particular when applied to the surface of a wound of plant tissue, subsequent growth of the plant is improved. For example, biomass or yield may be improved and/or the number of flowers may be increased. This may be due to colonisation of the plant tissue by nitrogen-fixing bacteria, such as described in, for example, EP-B-1422997, although the fact that this can occur when applied in this way is unexpected. Nitrogen-fixing bacteria colonised by the plant tissue may be a source of intracellular nitrogen which improves plant growth. The method of the present invention thus provides a useful means of introducing a plant growth improving preparation into growing plants.

Азотфиксирующие бактерии предпочтительно должны быть такими бактериями, которые могут локализоваться внутриклеточно в растительной клетке. В конкретном варианте осуществления ими являются внутриклеточно колонизирующие симбиотические азотфиксирующие бактерии Gluconacetobacter diazotrophicus (Gd), к примеру, Gluconacetobacter diazotrophicus штамм IMI 504998 (прежде IMI 501986) или IMI 504958 (прежде IMI 504853), каждый из которых депонировали в CABI (Великобритания) 21 сентября 2012 года и 22^го мая 2015 года, соответственно. Такие штаммы являются новыми и составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. В качестве альтернативы, азотфиксирующие бактерии могут представлять собой вид Herbaspirillum. Другие азотфиксирующие бактерии включают Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, Rhizobium, Klebsiella и Spirillum lipoferum.The nitrogen-fixing bacteria should preferably be those bacteria which can localise intracellularly in a plant cell. In a particular embodiment, they are the intracellularly colonising symbiotic nitrogen-fixing bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus (Gd), for example Gluconacetobacter diazotrophicus strain IMI 504998 (formerly IMI 501986) or IMI 504958 (formerly IMI 504853), each of which was deposited with CABI (UK) on 21 September 2012 and ²² May 2015, respectively. Such strains are novel and form a further aspect of the present invention. Alternatively, the nitrogen-fixing bacteria may be a Herbaspirillum species. Other nitrogen-fixing bacteria include Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, Rhizobium, Klebsiella, and Spirillum lipoferum.

В конкретном варианте осуществления азотфиксирующие бактерии вводят вместе или в комбинации со штаммом Terribacillus, что описано заявителями в находящейся одновременно на рассмотрении международной заявке на патент, которая заявляет приоритет в соответствии с заявкой на патент Великобритании № 1400840.3. Заявители установили, что такой штамм может улучшать активность азотфиксирующих бактерий. Подходящие штаммы Terribacillus включают Terribacillus saccharophilus, Terribacillus halophilus, Terribacillus goriensis или Terribacillus aidingensis, но, в частности, представляют собой штамм Terribacillus saccharophilus. Terribacillus вводят отдельно или в смеси с азотфиксирующими бактериями. Terribacillus, может находиться в виде однородной смеси с азотфиксирующими бактериями (и более того, IMI 501986 (теперь IMI 504998) был классифицирован как консорция Gd и Terribacillus), или ее можно вводить в форме совместной культуры или форме смешанной культуры.In a particular embodiment, the nitrogen-fixing bacteria are administered together with or in combination with a Terribacillus strain, as described by the applicants in a co-pending international patent application, which claims priority under UK Patent Application No. 1400840.3. The applicants have found that such a strain can improve the activity of nitrogen-fixing bacteria. Suitable Terribacillus strains include Terribacillus saccharophilus, Terribacillus halophilus, Terribacillus goriensis or Terribacillus aidingensis, but are in particular a Terribacillus saccharophilus strain. Terribacillus is administered alone or in combination with the nitrogen-fixing bacteria. Terribacillus may be present as a homogeneous mixture with nitrogen-fixing bacteria (and furthermore, IMI 501986 (now IMI 504998) has been classified as a consortium of Gd and Terribacillus), or it may be administered in the form of a co-culture or a mixed culture.

Рана может представлять собой результат случайного или естественного повреждения, причем доступность дополнительного азота может способствовать репаративному росту. Однако в конкретном варианте осуществления рана представляет собой результат повреждения, вызванного таким действием, как скашивание (газонная трава), срезание (силосные и сенокосные культуры), нарезка черенков (бананы, ананас, сахарный тростник, сорго, рис, голубиный горох, хлопчатник, абака, рами), обрезка (плодовые деревья, вьющиеся растения), поедание сельскохозяйственными животными или сбор урожая. Другие процессы, такие как боронование, в ходе которого растения могут непреднамеренно или не полноThe wound may be the result of accidental or natural injury, whereby the availability of additional nitrogen may promote reparative growth. However, in a particular embodiment, the wound is the result of injury caused by an action such as mowing (turf grass), cutting (silage and hay crops), cutting (banana, pineapple, sugarcane, sorghum, rice, pigeon pea, cotton, abaca, ramie), pruning (fruit trees, vines), grazing by farm animals, or harvesting. Other processes, such as harrowing, in which plants may be inadvertently or incompletely

- 1 047679 стью повреждаться, могут быть неподходящими в ряде случаев. В частности, раны могут быть обнаружены в 'наземной' части растения, такой как листья или стебли.- 1 047679 be damaged, may be unsuitable in some cases. In particular, wounds may be found in the 'above ground' part of the plant, such as leaves or stems.

Следовательно, способ по настоящему изобретению может дополнительно включать предварительную стадию нанесения 'повреждения' растению, в частности, путем скашивания, срезания, нарезки черенков, обрезки или сбора урожая. Азотфиксирующие бактерии соответствующим образом наносят в пределах относительно короткого периода времени после осуществления таких действий, например, в пределах 48 ч, например, в пределах 24 ч, как, например, в пределах 10 ч, и предпочтительно в пределах 1-2 ч с момента нанесения повреждения растению.Therefore, the method of the present invention may further comprise a preliminary step of causing 'injury' to the plant, in particular by mowing, cutting, cutting, pruning or harvesting. The nitrogen-fixing bacteria are suitably applied within a relatively short period of time after such actions have been carried out, for example within 48 hours, such as within 24 hours, such as within 10 hours, and preferably within 1-2 hours of causing injury to the plant.

Доставку бактерий осуществляют путем нанесения подходящего состава на раневой участок, в частности, на поверхность раны в форме композиции. Данная композиция может быть в форме жидкости, геля, пасты, которые можно наносить непосредственно или в разбавленной форме, или она может быть в форме твердой композиции, такой как порошковая или гранулированная композиция, которую растворяют в жидкости, такой как вода, перед использованием. В твердых композициях бактерии будут использоваться, как правило, в высушенной форме, например, в высушенной замораживанием форме, которые могут быть восстановлены путем добавления воды. При необходимости бактерии можно подвергнуть микроинкапсулированию с использованием известных из уровня техники способов для поддержания высокой жизнеспособности и устойчивости бактерий.The delivery of bacteria is carried out by applying a suitable composition to the wound site, in particular to the wound surface in the form of a composition. This composition can be in the form of a liquid, gel, paste, which can be applied directly or in a diluted form, or it can be in the form of a solid composition, such as a powder or granular composition, which is dissolved in a liquid, such as water, before use. In solid compositions, bacteria will be used, as a rule, in a dried form, for example, in a freeze-dried form, which can be reconstituted by adding water. If necessary, bacteria can be microencapsulated using known techniques in the art to maintain high viability and stability of bacteria.

В конкретном варианте осуществления данная композиция находится в форме, подходящей для нанесения распылением на растения, и, таким образом, будет представлять собой концентрат для разведения, который может быть в форме жидкости или твердого вещества, в частности, в форме жидкости, или она может представлять собой разбавленную водную композицию, которую можно непосредственно наносить распылением. В качестве альтернативы, композиция может представлять собой такую композицию, в которую можно погружать поверхность раны растения, к примеру, посредством окунания.In a particular embodiment, the composition is in a form suitable for spray application to plants and will thus be a concentrate for dilution, which may be in the form of a liquid or a solid, in particular in the form of a liquid, or it may be a diluted aqueous composition that can be directly applied by spraying. Alternatively, the composition may be such a composition in which the wound surface of the plant can be immersed, for example by dipping.

Количество азотфиксирующих бактерий, которые можно вводить, в любом конкретном случае будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как тип обрабатываемых семян, конкретный штамм используемых азотфиксирующих бактерий, требуемый уровень улучшения прорастания и способ введения, а также требуемый эффект. Однако, как правило, раствор, содержащий от 1 до 1х 10⁷ бактерий на миллилитр наносимой композиции, например, от 10 до 10 бактерий на миллилитр композиции, например, от 50 до 200 бактерий на миллилитр композиции, и, в частности, 100 бактерий на миллилитр композиции, вводят в раны растения. Такой раствор может быть получен путем культивирования бактерий до легко выявляемого уровня, например, путем измерения оптической плотности, с последующим соответствующим разбавлением раствора.The amount of nitrogen-fixing bacteria that can be administered in any particular case will vary depending on factors such as the type of seed being treated, the particular strain of nitrogen-fixing bacteria used, the level of germination enhancement required and the route of administration, as well as the effect desired. However, as a rule, a solution containing from 1 to 1 x 10 ⁷ bacteria per milliliter of the composition applied, such as from 10 to 10 bacteria per milliliter of the composition, such as from 50 to 200 bacteria per milliliter of the composition, and in particular 100 bacteria per milliliter of the composition, is administered to the wounds of the plant. Such a solution can be obtained by culturing the bacteria to a level that is readily detectable, such as by measuring the optical density, and then appropriately diluting the solution.

Заявители установили, к примеру, что в случае определенных бактерий эффекты по отношению к такому свойству, как показатель биомассы, находятся под влиянием количества бактерий, наносимых дозозависимым способом. Это означает, что можно вводить разные дозы в зависимости от цели обработки. Например, в случае трав может потребоваться максимальное увеличение биомассы для пастбищной травы, тогда как в случае газонной травы или рулонного травяного газона предпочтительным может быть медленный рост. В таких случаях количество вводимых бактерий будет выбираться с тем, чтобы обеспечить оптимальное получение биомассы целевых видов травы, что проиллюстрировано на примере ниже.The applicants have found, for example, that in the case of certain bacteria, the effects on a property such as biomass index are influenced by the amount of bacteria applied in a dose-dependent manner. This means that different doses can be applied depending on the treatment objective. For example, in the case of grasses, it may be desirable to maximise the biomass of pasture grass, whereas in the case of lawn grass or turf, slow growth may be preferred. In such cases, the amount of bacteria applied will be selected to ensure optimum biomass production of the target grass species, as illustrated in the example below.

В определенном варианте осуществления композиция дополнительно содержит питательное вещество для азотфиксирующих бактерий, например, данная композиция может содержать 3% вес/объем сахарозы, что описано в документе EP-B-1422997.In a particular embodiment, the composition further comprises a nutrient for nitrogen-fixing bacteria, for example the composition may comprise 3% w/v sucrose, as described in EP-B-1422997.

Азотфиксирующие бактерии могут быть единственным активным компонентом в данной композиции, или их могут объединять с дополнительными агрохимически активными компонентами, такими как инсектициды, фунгициды или регуляторы роста растений, если это необходимо.Nitrogen-fixing bacteria may be the only active component in the composition, or they may be combined with additional agrochemically active components such as insecticides, fungicides or plant growth regulators, if desired.

Композиция может дополнительно содержать добавки или вспомогательные средства, такие как загустители, диспергирующие средства, разбавители, увлажняющие средства, твердые носители и т. д., известные из уровня техники.The composition may further contain additives or auxiliaries such as thickeners, dispersants, diluents, wetting agents, solid carriers, etc., known from the prior art.

В определенном варианте осуществления данная композиция дополнительно содержит полисахарид или приемлемое для сельского хозяйства поверхностно-активное вещество или их комбинацию.In a particular embodiment, the composition further comprises a polysaccharide or an agriculturally acceptable surfactant or a combination thereof.

В определенном варианте осуществления данная композиция дополнительно содержит приемлемое для сельского хозяйства поверхностно-активное вещество. Наличие поверхностно-активного вещества придает композиции способность к относительно свободному течению по всей поверхности ран с тем, чтобы облегчать проникновение азотфиксирующих бактерий.In a particular embodiment, the composition further comprises an agriculturally acceptable surfactant. The presence of the surfactant imparts to the composition the ability to flow relatively freely over the entire surface of the wounds so as to facilitate the penetration of nitrogen-fixing bacteria.

Подходящие поверхностно-активные вещества или детергенты включают неионогенные детергенты, как, например, реализуемые под торговой маркой 'Tween®', например, Tween 80.Suitable surfactants or detergents include non-ionic detergents such as those sold under the trade name 'Tween®', e.g. Tween 80.

Tween 80 представляет собой неионогенный детергент; который на 70% состоит из жирной кислоты - олеиновой кислоты, а остальная часть представляет собой комбинацию линолевой, пальмитиновой и стеариновой кислот. Показатель pH 1% раствора находится в диапазоне от 5,5 до 7,2. Его широко используют для эмульгирования и диспергирования веществ в медицинских и пищевых продуктах. ЕгоTween 80 is a non-ionic detergent; 70% of which is made up of the fatty acid oleic acid, with the remainder being a combination of linoleic, palmitic and stearic acids. The pH of a 1% solution ranges from 5.5 to 7.2. It is widely used for emulsifying and dispersing substances in medical and food products.

- 2 047679 активность в качестве антибактериального средства незначительна или отсутствует (Dawson et al. (1986) Data for Biochemical Research, 3rd ed., Oxford University Press (New York, NY: 1986), p. 289).- 2 047679 little or no activity as an antibacterial agent (Dawson et al. (1986) Data for Biochemical Research, 3rd ed., Oxford University Press (New York, NY: 1986), p. 289).

Количество вводимого в рану растения поверхностно-активного вещества в комбинации с азотфиксирующими бактериями (а также необязательно с полисахаридом, что дополнительно описано ниже) должно быть достаточным для получения эффекта улучшенного роста растения. Количество будет варьироваться в зависимости от разных факторов, таких как определенное поверхностно-активное вещество, тип обрабатываемого растения, происхождение раны, конкретный штамм задействованной азотфиксирующей бактерии и способ введения. Однако, как правило, композиция содержит от 0,0005 до 10% объем/объем, как, например, от 0,0005 до 0,5% объем/объем, к примеру, от 0,0005 до 1% объем/объем, в том числе от 0,0005 до 0,2% объем/объем, например, от 0,0005 до 0,15% объем/объем, именно и, в частности, приблизительно 0,1% объем/объем.The amount of surfactant in combination with nitrogen-fixing bacteria (and optionally also with a polysaccharide, as further described below) administered to the plant wound should be sufficient to obtain the effect of improved plant growth. The amount will vary depending on various factors, such as the specific surfactant, the type of plant treated, the origin of the wound, the specific strain of nitrogen-fixing bacteria involved and the route of administration. However, as a rule, the composition contains from 0.0005 to 10% v/v, such as from 0.0005 to 0.5% v/v, for example from 0.0005 to 1% v/v, including from 0.0005 to 0.2% v/v, for example from 0.0005 to 0.15% v/v, namely and in particular about 0.1% v/v.

В дополнительном варианте осуществления данная композиция содержит полисахарид. Подходящие для использования в данной композиции полисахариды включают гидроколлоидные полисахариды, полученные из источников растительного, животного или микробного происхождения.In a further embodiment, the composition comprises a polysaccharide. Suitable polysaccharides for use in the composition include hydrocolloidal polysaccharides derived from plant, animal or microbial sources.

В частности, они включают выделяемые в виде камеди полисахариды, такие как аравийская камедь, камедь гхатти, камедь карайи и трагакантовая камедь, производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или микрокристаллическая целлюлоза, виды крахмала и их производные, включающие, к примеру, кукурузный крахмал, маниоковый крахмал, картофельный крахмал, рисовый крахмал, пшеничный крахмал и их модифицированные варианты, такие как прежелатинизированный крахмал, окисленный крахмал, этилированный крахмал, декстрины или мальтодекстрин из крахмала, пектин, полисахариды, полученные из морских водорослей, такие как агар, альгинаты, каррагинан и фурцелларан, камеди из семян, такие как гуаровая камедь и камедь бобов рожкового дерева, полисахариды, полученные путем микробиологической ферментации, такие как ксантановая камедь и геллановая камедь, а также азотсодержащие полисахариды, такие как хитозан; или их смесь.In particular, they include gum-extractable polysaccharides such as acacia, ghatti, karaya and tragacanth, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose or microcrystalline cellulose, starches and their derivatives including, for example, corn starch, tapioca starch, potato starch, rice starch, wheat starch and their modified versions such as pregelatinized starch, oxidized starch, ethylated starch, dextrins or maltodextrin from starch, pectin, polysaccharides derived from seaweeds such as agar, alginates, carrageenan and furcellaran, seed gums such as guar gum and locust bean gum, polysaccharides, obtained by microbiological fermentation, such as xanthan gum and gellan gum, and nitrogen-containing polysaccharides such as chitosan; or a mixture thereof.

В конкретном варианте осуществления полисахарид представляет собой выделяемый в виде камеди полисахарид, такой как аравийская камедь, камедь гхатти, камедь карайи или трагакантовая камедь. Конкретным примером полисахарида является аравийская камедь.In a particular embodiment, the polysaccharide is a gum-secreting polysaccharide such as gum acacia, gum ghatti, gum karaya, or gum tragacanth. A particular example of a polysaccharide is gum acacia.

Аравийская камедь представляет собой природную камедь, которую собирают в виде продуктов выделения разных видов акациевых деревьев (Fang et al. 2010 (2010) Biomolecules: 11, 1398-1405); она представляет собой сложный полисахарид, который интенсивно использовали в широком диапазоне отраслей промышленности, в том числе в лакокрасочной, клеевой, фармацевтической, текстильной и пищевой отраслях. Полагают, что аравийская камедь из дерева акации представляет собой разветвленный полимер галактозы, рамнозы, арабинозы и глюкуроновой кислоты в виде кальциевой, магниевой и калиевой солей с молекулярной массой примерно 250000. Было показано (Badar, K.V. et al. (2011) Recent Research in Science and Technology 3 (5) 6-7), что вымачивание семян определенных растений в 1% растворе аравийской камеди в течение 24 ч до проращивания оказывает эффект в отношении прорастания семян. Кроме того, в документе WO 02/058466 сообщается о том, что определенные композиции, содержащие комбинации полисахаридов и пептидов, могут увеличивать урожайность культур.Gum acacia is a natural gum that is collected as an exudate from various species of acacia trees (Fang et al. 2010 (2010) Biomolecules: 11, 1398–1405); it is a complex polysaccharide that has been extensively used in a wide range of industries, including paints, adhesives, pharmaceuticals, textiles, and food. Gum acacia from the acacia tree is believed to be a branched polymer of galactose, rhamnose, arabinose and glucuronic acid in the form of calcium, magnesium and potassium salts with a molecular weight of about 250,000. It has been shown (Badar, K.V. et al. (2011) Recent Research in Science and Technology 3 (5) 6-7) that soaking the seeds of certain plants in a 1% solution of gum acacia for 24 hours prior to germination has an effect on seed germination. In addition, WO 02/058466 reports that certain compositions containing combinations of polysaccharides and peptides can increase crop yields.

Количество вводимого в рану растения полисахарида должно быть достаточным для получения улучшенного эффекта улучшенной фиксации азота, если нанесение осуществляют в комбинации с азотфиксирующими бактериями и также необязательно с поверхностно-активным веществом. Оно будет варьироваться в зависимости от разных факторов, таких как используемый определенный полисахарид, тип обрабатываемого растения, происхождение раны, конкретный штамм задействованной азотфиксирующей бактерии и способ введения. Однако, как правило, используют композицию, содержащую от 0,1 до 1% вес/вес, например, от 0,1 до 0,5% вес/вес, и, в частности, приблизительно 0,3 %вес/вес полисахарида.The amount of polysaccharide administered to the plant wound should be sufficient to obtain the improved effect of improved nitrogen fixation, if the application is carried out in combination with nitrogen-fixing bacteria and also optionally with a surfactant. It will vary depending on various factors, such as the specific polysaccharide used, the type of plant treated, the origin of the wound, the specific strain of nitrogen-fixing bacteria involved and the route of administration. However, as a rule, a composition containing from 0.1 to 1% w/w, such as from 0.1 to 0.5% w/w, and in particular about 0.3% w/w of the polysaccharide is used.

В одном варианте осуществления композиция содержит как полисахарид, так и приемлемое для сельского хозяйства поверхностно-активное вещество. Было установлено, что в некоторых случаях эти компоненты улучшают эффект азотфиксирующих бактерий, и, по-видимому, действуют синергически с получением более значительного улучшения эффекта. Растения, обработанные композицией, содержащей эти компоненты, могут показывать увеличение темпов роста, что подтверждается увеличенным сухим весом обработанных растений.In one embodiment, the composition comprises both a polysaccharide and an agriculturally acceptable surfactant. These components have been found to improve the effect of nitrogen-fixing bacteria in some cases, and appear to act synergistically to produce a more significant improvement in effect. Plants treated with a composition containing these components may show an increase in growth rates, as evidenced by an increased dry weight of the treated plants.

Новые композиции, содержащие указанные выше компоненты, составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения предлагает приемлемую для сельского хозяйства композицию, содержащую азотфиксирующие бактерии, в частности, Gluconacetobacter diazotrophicus, и полисахарид, поверхностно-активное вещество или их комбинацию.The new compositions comprising the above components constitute a further aspect of the present invention. Thus, a further aspect of the present invention provides an agriculturally acceptable composition comprising nitrogen-fixing bacteria, in particular Gluconacetobacter diazotrophicus, and a polysaccharide, a surfactant or a combination thereof.

Азотфиксирующие бактерии, описанные выше, и, в частности, Gluconacetobacter diazotrophicus, подходящим образом присутствуют в описанных выше количествах. Аналогично, полисахарид представляет собой описанный выше полисахарид, такой как выделяемый в виде камеди полисахарид, к примеру, аравийскую камедь, и она включена в композицию в описанном выше количестве, к примеру, в концентрации от 0,1 до 1% вес/вес полисахарида. Кроме того, поверхностно-активное вещество предThe nitrogen-fixing bacteria described above, and in particular Gluconacetobacter diazotrophicus, are suitably present in the amounts described above. Similarly, the polysaccharide is a polysaccharide described above, such as a gum-secreting polysaccharide, for example, acacia, and is included in the composition in the amount described above, for example in a concentration of 0.1 to 1% w/w of the polysaccharide. In addition, the surfactant is

- 3 047679 ставляет собой предпочтительно поверхностно-активное вещество, описанное выше, в виде неионогенного детергента, к примеру, поверхностно-активное вещество, которое на 70% состоит из жирной кислоты - олеиновой кислоты, а остальная часть представляет собой комбинацию линолевой, пальмитиновой и стеариновой кислот. В конкретном варианте осуществления данная композиция будет содержать от 0,0005 до 10% объем/объем поверхностно-активного вещества, например, от 0,0005 до 0,2% объем/объем поверхностно-активного вещества.- 3 047679 is preferably a surfactant as described above in the form of a non-ionic detergent, for example a surfactant which is 70% oleic acid fatty acid and the remainder is a combination of linoleic, palmitic and stearic acids. In a particular embodiment, the composition will contain from 0.0005 to 10% v/v surfactant, for example from 0.0005 to 0.2% v/v surfactant.

В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение предлагает набор для получения приемлемой в сельском хозяйстве композиции, содержащей азотфиксирующие бактерии. В таких наборах азотфиксирующие бактерии и, в частности Gluconacetobacter diazotrophicus, могут храниться отдельно от других компонентов композиции, например, в отдельных контейнерах, или в упаковке или контейнере, состоящих из двух частей. Азотфиксирующие бактерии можно высушивать замораживанием. Другие компоненты могут быть в форме концентрата, для удобства хранения или транспортировки, готового к разведению, например, водой, перед использованием. Концентраты такой природы будут содержать те же самые компоненты, что в перечисленных выше композициях, но обычно в более высоких уровнях. Таким образом, например, концентрат может содержать от 1 до 10% вес/вес, например, от 1 до 5% вес/вес, и, в частности, приблизительно 3% вес/вес полисахарида, при этом десятикратное разбавление даст в результате композицию, подходящую для использования, например, в способе по настоящему изобретению. Аналогично, поверхностно-активное вещество может находиться в концентрате в количестве от 0,005 до 2% объем/объем. Другие компоненты, такие как, например, питательное вещество для азотфиксирующих бактерий, предпочтительно включены в концентрат в требуемой концентрации.In a still further aspect the present invention provides a kit for the preparation of an agriculturally acceptable composition comprising nitrogen-fixing bacteria. In such kits the nitrogen-fixing bacteria and in particular Gluconacetobacter diazotrophicus may be stored separately from the other components of the composition, for example in separate containers or in a two-part package or container. The nitrogen-fixing bacteria may be freeze-dried. The other components may be in the form of a concentrate, for ease of storage or transport, ready for dilution, for example with water, before use. Concentrates of this nature will contain the same components as in the above compositions, but typically at higher levels. Thus, for example, a concentrate may contain from 1 to 10% w/w, such as from 1 to 5% w/w, and in particular about 3% w/w of a polysaccharide, whereby a ten-fold dilution will result in a composition suitable for use, for example, in the method of the present invention. Likewise, the surfactant may be present in the concentrate in an amount of 0.005 to 2% v/v. Other components, such as, for example, a nutrient for nitrogen-fixing bacteria, are preferably included in the concentrate in the desired concentration.

Наборы такого типа можно использовать для получения композиции по настоящему изобретению, которую можно сразу же использовать. В частности, любой концентрат разбавят водой до соответствующего объема, после чего в него сразу добавят азотфиксирующие бактерии.Kits of this type can be used to obtain a composition according to the present invention that can be used immediately. In particular, any concentrate will be diluted with water to the appropriate volume, after which nitrogen-fixing bacteria will be immediately added to it.

Настоящее изобретение обеспечивает возможность нанесения на широкий диапазон культур и доставку в него внутриклеточных бактерий, осуществляющих фиксацию азота. В частности, эти культуры могут представлять собой многолетние, двухлетние или возобновляемые однолетние культуры, включающие без ограничения плодовые деревья и кустарники (например, растения черники, малины и чайного куста), вьющиеся растения, фуражные культуры (люцерну и траву для силосования, сенокоса или непосредственного поедания сельскохозяйственными животными), газонную траву и растения, образующие живые изгороди, лесные культуры, садовые культуры и травянистые растения (например, лукскороду, аспарагус, баклажан).The present invention provides the possibility of applying and delivering intracellular bacteria that fix nitrogen to a wide range of crops. In particular, these crops can be perennial, biennial or renewable annual crops, including, but not limited to, fruit trees and shrubs (e.g., blueberry, raspberry and tea bush plants), climbing plants, forage crops (alfalfa and grass for silage, hay or direct consumption by farm animals), lawn grass and plants that form hedges, forest crops, horticultural crops and herbaceous plants (e.g., onion, asparagus, eggplant).

Ранее сообщили о том, что Gd может улучшать урожай культур, богатых сахарозой, таких как сахарная свекла или сахарный тростник (WO 2010/022517). Однако заявители установили, что при использовании препарата по настоящему изобретению улучшение наблюдали для культур, богатых сахарозой, что составляет конкретный вариант осуществления настоящего изобретения.It has been previously reported that Gd can improve the yield of sucrose-rich crops such as sugar beet or sugar cane (WO 2010/022517). However, the applicants have found that when using the preparation of the present invention, an improvement was observed for sucrose-rich crops, which is a specific embodiment of the present invention.

В конкретном варианте осуществления способ и композицию по настоящему изобретению применяют по отношению к траве, такой как газонная трава, рулонный травяной газон или пастбищная трава, сразу или вскоре после скашивания. Использование этого препарата приводит к улучшению роста травы, что подтверждается увеличенным сухим весом инокулированной травы в сравнении с неинокулированной. Очевидно, что азотфиксирующие бактерии способны проникать в траву через раны, являющиеся результатом процедуры скашивания, и колонизируют травы внутриклеточно, приводя к улучшенным ростовым характеристикам.In a particular embodiment, the method and composition of the present invention are applied to grass, such as lawn grass, rolled grass lawn or pasture grass, immediately or shortly after mowing. The use of this preparation results in improved grass growth, as evidenced by the increased dry weight of the inoculated grass compared to the non-inoculated grass. It is evident that nitrogen-fixing bacteria are able to penetrate the grass through the wounds resulting from the mowing procedure and colonize the grass intracellularly, resulting in improved growth characteristics.

Кроме того, было установлено, что колонизация с использованием Gd может повышать уровни хлорофилла в растениях и, в частности, в видах травы, таких как пастбищная, газонная трава или рулонный травяной газон. Повышение уровня хлорофилла связано не только с содержанием азота, но также и с уровнем зелености растений, причем данное свойство является особенно желательным в таких применениях, как в отношении газонной травы, у которой высокие уровни зелености являются полезными.In addition, it has been found that colonization with Gd can increase chlorophyll levels in plants and in particular in grass species such as pasture, lawn or turf grass. The increase in chlorophyll levels is related not only to nitrogen content but also to the greenness level of the plants, a property that is particularly desirable in applications such as turf grass, where high levels of greenness are beneficial.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Далее настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью примеров со ссылкой на прилагаемые диаграммы, на которых:The present invention will now be described in more detail by means of examples with reference to the accompanying diagrams, in which:

фиг. 1 представляет собой график, на котором показаны средние значения сухого веса (г) неинокулированной и инокулированной срезанной травы;Fig. 1 is a graph showing the average dry weight (g) of uninoculated and inoculated grass cuttings;

фиг. 2 представляет собой график, на котором показаны показатели сухого веса наземной части инокулированной срезанной травы, обработанной Gd и сахарозой, Tween и/или аравийской камедью или их комбинациями;Fig. 2 is a graph showing the dry weight values of the above-ground portion of inoculated grass cuttings treated with Gd and sucrose, Tween and/or gum arabic or combinations thereof;

на фиг. 3 изображен пример подготовки к вегетативному размножению чайного куста, где на (A) изображен удаленный черенок, а на (B) в виде диаграммы представлены отрезки каждого черенка, отобранного для выделения ДНК;Fig. 3 shows an example of preparation for vegetative propagation of a tea bush, where (A) shows a removed cutting, and (B) shows in the form of a diagram sections of each cutting selected for DNA extraction;

на фиг. 4 показано изображение геля с продуктами ПЦР, полученными из образцов чайного куста, которые инокулировали с использованием Gd; все продукты из полосы, соответствующих контрольным растениям, подвергали секвенированию и подтверждали в виде неспецифического связывания. Секвенированные продукты из полосы, соответствующие инокулированным растениям, подтверждали как отноFig. 4 shows a gel image of PCR products obtained from tea bush samples inoculated with Gd; all products from the band corresponding to control plants were sequenced and confirmed as non-specific binding. The sequenced products from the band corresponding to inoculated plants were confirmed as relative

- 4 047679 сящиеся к Gluconacetobacter diazotrophicus;- 4 047679 associated with Gluconacetobacter diazotrophicus;

фиг. 5 представляет собой график, на котором показаны эффекты разных препаратов в отношении показателей биомассы срезанной травы;Fig. 5 is a graph showing the effects of different preparations on the biomass indices of cut grass;

на фиг. 6 показаны результаты теста для определения эффекта Gd в отношении числа цветочных головок у травы; и фиг. 7 представляет собой график, на котором показаны результаты обработок разными композициями в отношении показателей биомассы срезанной травы.Fig. 6 shows the results of the test for determining the effect of Gd on the number of flower heads in grass; and Fig. 7 is a graph showing the results of treatments with different compositions on the biomass indices of cut grass.

Однако специалисту в данной области будет очевидно, что точные подробности не требуются для практической реализации настоящего изобретения. Следующие описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения представлены для целей иллюстрации и описания. Они не предназначены для того, чтобы быть исчерпывающими или ограничивать настоящее изобретение точными раскрытыми формами. Очевидно, что возможны многие модификации и вариации в свете вышеописанных идей. Варианты осуществления показаны и описаны для того, чтобы наилучшим образом объяснить принципы настоящего изобретения и его практического применения, чтобы тем самым дать возможность другим специалистам в данной области техники наилучшим образом использовать настоящее изобретение и различные варианты осуществления с различными модификациями, которые подходят для конкретного намеченного использования.However, it will be obvious to one skilled in the art that the precise details are not required to practice the present invention. The following descriptions of specific embodiments of the present invention are presented for purposes of illustration and description. They are not intended to be exhaustive or to limit the present invention to the precise forms disclosed. Obviously, many modifications and variations are possible in light of the above teachings. The embodiments are shown and described in order to best explain the principles of the present invention and its practical application, thereby enabling others skilled in the art to best utilize the present invention and the various embodiments with various modifications that are suitable for the particular intended use.

Пример 1.Example 1.

Нанесение на срезанную траву.Application to cut grass.

Методика.Methodology.

Культивирование G. diazotrophicus:Cultivation of G. diazotrophicus:

G. diazotrophicus штамм IMI 501986 (теперь IMI 50998) с плазмидой pRGS561, экспрессирующей GUS, культивировали на среде ATGUS, [0,8% (вес/объем) агар, дрожжевой экстракт (2,7 г л^-1), глюкоза (2,7 г л^-1), маннит (1,8 г л^-1), буфер MES (4,4 г л^-1 K2HPO4 (4,8 г л^-1) и KH2PO₄ (0,65 г л^-1), pH 6,5] согласно требованиям. Экспрессию гена b-глюкуронидазы (gusA) тестировали путем посева на среду ATGUS, содержащую X-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-О-глюкуроновой кислоты циклогексиламмонийную соль) при 50 мг л^-1; образование темно-синих колоний указывало на экспрессию гена gusA.G. diazotrophicus strain IMI 501986 (now IMI 50998) with the GUS expression plasmid pRGS561 were grown on ATGUS medium [0.8% (w/v) agar, yeast extract (2.7 g L ^-1 ), glucose (2.7 g L ^-1 ), mannitol (1.8 g L ^-1 ), MES buffer (4.4 g L ^-1 K2HPO4 (4.8 g L ^-1 ) and KH2PO ₄ (0.65 g L ^-1 ), pH 6.5] as required. Expression of the b-glucuronidase gene (gusA) was tested by plating on ATGUS medium containing X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-O-glucuronic acid cyclohexylammonium salt) at 50 mg l ^-1 ; the formation of dark blue colonies indicated the expression of the gusA gene.

Процедуры инокуляции.Inoculation procedures.

Вводную суспензию G. diazotrophicus готовили с получением оптической плотности при 600 нм в 1,1, что соответствует приблизительно 10⁹ колониеобразующих единиц (CFU) на миллилитр. Число CFU определяли посредством серийного разведения, осуществляя посева на среду ATGUS (с добавлением при необходимости антибиотиков) и подсчета колоний бактерий после 4 дней инкубации в чашках Петри (28°C, в темноте). Суспензию разбавляли до 10^-4 с получением раствора, содержащего примерно 100 бактерий на мл, готового для нанесения распылением, что описано ниже.An inoculum of G. diazotrophicus was prepared to give an optical density at 600 nm of 1.1, corresponding to approximately ¹⁰⁹ colony forming units (CFU) per milliliter. The CFU number was determined by serial dilution, plating on ATGUS medium (with antibiotics if necessary) and counting the bacterial colonies after 4 days of incubation in Petri dishes (28°C, in the dark). The suspension was diluted to ^10-4 to give a solution containing approximately 100 bacteria per ml, ready for spray application as described below.

Стандартную навеску из 0,5 г семян травы Lolium perenne сорта Cassiopeia высевали в кассеты для рассады с компостом John Innes № 1 и слегка накрывали компостом.A standard 0.5 g sample of Lolium perenne Cassiopeia seeds was sown into seedling trays with John Innes No. 1 compost and lightly covered with compost.

Отдельные кассеты помещали в кассеты большего размера и обеспечивали соответствующим количеством воды в комнате для выращивания при цикле день/ночь 21°C/15°C, 16/8 ч. в течение 20 дней. После этого траву срезали на высоте 2 см над уровнем почвы с использованием ножниц (обрезки удаляли) и следующие препараты наносили с использованием бытового ручного мелкокапельного распылителя.Individual cassettes were placed into larger cassettes and provided with appropriate amounts of water in a growth room under a day/night cycle of 21°C/15°C, 16/8 h for 20 days. The grass was then cut to 2 cm above the soil using scissors (the clippings were discarded) and the following treatments were applied using a household hand-held fine mist sprayer.

Эксперимент 1. Препараты.Experiment 1. Preparations.

Контроль с водой + 3% сахарозы.Control with water + 3% sucrose.

Gd + вода + 3% сахарозы.Gd + water + 3% sucrose.

Эксперимент 2. Препараты.Experiment 2. Drugs.

Gd + вода.Gd + water.

Gd + вода + 3% сахарозы.Gd + water + 3% sucrose.

Gd + вода + 0,1% Tween.Gd + water + 0.1% Tween.

Gd + вода + 0,3% аравийской камеди.Gd + water + 0.3% acacia.

Gd + вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween.Gd + water + 3% sucrose + 0.1% Tween.

Gd + вода + 3% сахарозы + 0,3% аравийской камеди.Gd + water + 3% sucrose + 0.3% acacia.

Gd + вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди.Gd + water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% acacia.

Сухой вес ростков.Dry weight of sprouts.

Ростки извлекали из агара пинцетом, и весь оставшийся на корнях агар отмывали. Каждый росток помещали в бумажный мешок и помещали в печь при 80°C на 48 ч, а затем взвешивали.The shoots were removed from the agar with tweezers and any remaining agar on the roots was washed off. Each shoot was placed in a paper bag and placed in an oven at 80°C for 48 h and then weighed.

Результаты эксперимента 1 и эксперимента 2 показаны на фиг. 1 и 2 соответственно.The results of Experiment 1 and Experiment 2 are shown in Fig. 1 and 2, respectively.

Результаты на фиг. 1 показывают существенное увеличение среднего значения сухого веса травы (на графике: 0,09676 г для неинокулированной и 0,1276 г для инокулированной). Эти показатели сухого веса значимо различались при P<0,01. Таким образом, инокуляция посредством такого способа отчетливо приводит к значительному улучшению роста.The results in Fig. 1 show a significant increase in the average dry weight of the grass (graphed: 0.09676 g for non-inoculated and 0.1276 g for inoculated). These dry weight values were significantly different at P<0.01. Thus, inoculation by this method clearly leads to a significant improvement in growth.

Результаты, показанные на фиг. 2, показывают значимое различие (P<0,001) между Gd/S/T/GA и следующими наивысшими показателями сухого веса (Gd/T и Gd/S/T), демонстрируя синергический эффект комбинации из трех компонентов. Gd и Gd/S значимо не различались при P=0,05.The results shown in Fig. 2 show a significant difference (P<0.001) between Gd/S/T/GA and the next highest dry weight values (Gd/T and Gd/S/T), demonstrating the synergistic effect of the combination of the three components. Gd and Gd/S were not significantly different at P=0.05.

- 5 047679- 5 047679

Пример 2.Example 2.

Колонизация чайного куста (Camellia sinensis) с использованием Gluconacetobacter diazotroyhicus (Azoticus).Colonization of tea bush (Camellia sinensis) using Gluconacetobacter diazotroyhicus (Azoticus).

Вегетативное размножение из стеблевого черенка.Vegetative propagation from stem cuttings.

Стандартным способом вегетативного размножения клонов чайного куста является использование однолистового черенка. Из более крупных стеблей, содержащих примерно от четырех до шести узлов и апикальные клетки, части стебля и листья отбирали исходя из состояния тканей (т. е. отсутствия насекомых и заболеваний). Участки, выбранные для отрезания, находились между участками красной и зеленой древесины, как рекомендовано в Yamasaki et al. Soil and Crop Management, (2008) SCM-23. Было установлено, что недавно созревшие побеги, содержащие слегка окрашенную в красный цвет кору, прилегающую к зрелым листьям с активно развивающимися пазушными почками, являются наилучшими с точки зрения укоренения.The standard method for vegetative propagation of tea bush clones is the use of single leaf cuttings. From larger stems containing approximately four to six nodes and apical cells, stem sections and leaves were selected based on tissue condition (i.e., freedom from insects and diseases). The sections selected for cuttings were located between the redwood and greenwood sections as recommended in Yamasaki et al. Soil and Crop Management, (2008) SCM-23. Newly matured shoots containing slightly reddish-colored bark adjacent to mature leaves with actively developing axillary buds were found to be the best for rooting.

Из предпочтительных частей отбирали образцы, содержащие часть стебля длиной 3-5 см и один здоровый лист. Каждую часть стебля вырезали путем осуществления диагонального надреза (1) примерно на 0,5 см выше листа (2) и другого диагонального надреза ниже листа вблизи междоузлия (3), избегая сдавливания или сплющивания раневого участка (см. фиг. 3A).Samples containing a 3-5 cm long stem section and one healthy leaf were selected from the preferred sections. Each stem section was excised by making a diagonal cut (1) approximately 0.5 cm above the leaf (2) and another diagonal cut below the leaf near an internode (3), avoiding squeezing or flattening the wound site (see Fig. 3A).

Нижнюю часть каждого стеблевого черенка чайного куста погружали в 1% раствор индолилмасляной кислоты и высаживали в отдельные горшки; при этом черенки высаживали таким образом, чтобы стебель принимал прямое или незначительно наклоненное положение, не касаясь листом почвы. Каждый горшок содержал смесь для черенков из песка и компоста John Innes номер 1 в соотношении 4:1, пропитанную водой. На отрезанные верхушки каждого черенка наносили 20 мкл воды или 20 мкл Gd при 2,5 х 10 CFU/мл в воде, при этом влажность для каждого образца поддерживали посредством накрывания каждого горшка пластиковым листом и обрызгивания небольшим количеством воды.The lower part of each tea plant stem cutting was dipped in 1% indolebutyric acid and planted in individual pots, with the stem erect or slightly inclined, with the leaf not touching the soil. Each pot contained a cuttings mix of sand and John Innes No. 1 compost in a ratio of 4:1, soaked in water. The cut tips of each cutting were treated with 20 µl of water or 20 µl of Gd at 2.5 x 10 CFU/ml in water, the humidity of each sample being maintained by covering each pot with a plastic sheet and misting with a small amount of water.

После 3 месяцев выращивания, с целью подтверждения успешной колонизации стеблевых черенков при использовании Gd неинокулированные и инокулированные стеблевые черенки извлекали из горшков. Каждый черенок затем разделяли на части, которые представляли собой (a) верхушку побега, включающую участок инокуляции (4) (фиг. 3B), (b) узловую часть (5) на фиг. 3B и (C) нижнюю часть побега, включающую любую ткань корня, (6) на фиг. 3B. Эти части затем подвергали быстрой заморозке в жидком азоте.After 3 months of growth, to confirm successful colonization of stem cuttings using Gd, uninoculated and inoculated stem cuttings were removed from the pots. Each cutting was then divided into pieces that represented (a) the shoot apex including the inoculation site (4) (Fig. 3B), (b) the nodal portion (5) in Fig. 3B, and (C) the lower portion of the shoot including any root tissue (6) in Fig. 3B. These pieces were then flash frozen in liquid nitrogen.

Выделение ДНК из каждой части черенка (т.е. 4, 5 и 6 на фиг. 3B) осуществляли с использование реагента TRIzol согласно протоколу производителя и проводили ПЦР. Реакцию ПЦР проводили в виде двухстадийной реакции, описанной в публикации Tian et. al, (2009); на первой стадии использовали GDI25F (5'-TAGTGGCGGACGGGTGAGTAACG-3') и GDI-923R (5'-CCTTGCGGGAAACAGCCATCTC-3'), которые при амплификации давали продукт размером 899 п.о., содержащий ампликон для праймеров GDI139F (5'TGAGTAACGCGTAGGGATCTG-3') и GDI916R (5'-GGAAACAGCCATCTCTGACTG-3'), причем последние конструировали на основе информации о последовательности 16S рДНК, доступной в базе данных GenBank. После начальной стадии денатурации при 95°C в течение 3 мин следующий температурный профиль повторяли 32 раза: денатурация в течение 20 с при 95°C, отжиг в течение 45 с при 55°C и удлинение в течение 20 с при 72°C с конечной стадией удлинения в течение 5 мин при 12°C один микролитр этого продукта ПЦР отбирали и использовали в качестве матрицы для второй стадии ПЦР с использованием GDI39F и GDI916R. Модификации параметров на втором раунде включали повышение температуры отжига до 62°C в течение 15 с и увеличение числа циклов до 39. Продукты амплификации ПЦР анализировали в 1% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия, а также секвенировали для подтверждения идентичности продукта (фиг. 4).DNA extraction from each part of the scion (i.e. 4, 5 and 6 in Fig. 3B) was performed using TRIzol reagent according to the manufacturer's protocol and PCR was performed. The PCR reaction was performed as a two-step reaction described in Tian et. al, (2009); In the first step, GDI25F (5'-TAGTGGCGGACGGGTGAGTAACG-3') and GDI-923R (5'-CCTTGCGGGAAACAGCCATCTC-3') were used, which, when amplified, yielded a product of 899 bp containing an amplicon for primers GDI139F (5'TGAGTAACGCGTAGGGATCTG-3') and GDI916R (5'-GGAAACAGCCATCTCTGACTG-3'), the latter being constructed based on the 16S rDNA sequence information available in the GenBank database. After an initial denaturation step at 95°C for 3 min, the following temperature profile was repeated 32 times: denaturation for 20 s at 95°C, annealing for 45 s at 55°C, and extension for 20 s at 72°C with a final extension step of 5 min at 12°C. One microliter of this PCR product was collected and used as template for a second round of PCR using GDI39F and GDI916R. Modifications to the parameters in the second round included increasing the annealing temperature to 62°C for 15 s and increasing the number of cycles to 39. The PCR amplification products were analyzed on a 1% agarose gel stained with ethidium bromide and sequenced to confirm product identity (Fig. 4).

Интересно, что AzGd не выявляли в части 4 черенка чайного куста, что указывало на то, что AzGd перемещалась базипетально от раневого участка после инокуляции, но при этом выявляли в частях 5 и 6, соответственно.Interestingly, AzGd was not detected in part 4 of the tea plant cutting, indicating that AzGd moved basipetally from the wound site after inoculation, but was detected in parts 5 and 6, respectively.

Секвенирование и последующие результаты, полученные с помощью BLAST, подтвердили, что полосы, видимые для части 1 контрольных растений, являлись результатом неспецифического связывания используемого набора праймеров, при этом 4 полосы, наблюдаемые для частей 2 и 3 инокулированной ткани, были идентифицированы как относящиеся к Gluconacetobacter diazotrophicus Pal5 (при 100% идентификации, покрытии 86% и E-величине 7е-04). Данные результаты свидетельствуют о том, что AzGd, даже при низком числе копий в инокулированной ткани, успешно колонизировала Camellia sinensis после инокуляции в раневой участок. Вероятно, это является первым примером колонизации многолетнего растения при использовании Gd.Sequencing and subsequent BLAST results confirmed that the bands seen for part 1 of the control plants were the result of non-specific binding of the primer set used, while the 4 bands seen for parts 2 and 3 of the inoculated tissue were identified as belonging to Gluconacetobacter diazotrophicus Pal5 (with 100% identification, 86% coverage and an E-value of 7e-04). These results indicate that AzGd, even at low copy number in the inoculated tissue, successfully colonized Camellia sinensis after wound site inoculation. This is likely the first example of colonization of a perennial plant using Gd.

Пример 3.Example 3.

Исследование эффекта препарата в отношении показателей биомассы травы.Study of the effect of the drug on grass biomass indices.

Траву выращивали в камере для выращивания растений (Fitotron®) (23°C/15°C при влажности 65%) в кассетах для рассады с использованием компоста John Innes № 1 в течение 2 недель. Траву затем срезали на высоте 8 см и на нее сразу же наносили распылением 10 мл препарата, состав которого изложен ниже, с использованием бытового распылителя.The grass was grown in a growth chamber (Fitotron®) (23°C/15°C at 65% humidity) in seedling trays using John Innes No. 1 compost for 2 weeks. The grass was then cut at 8cm and immediately sprayed with 10ml of the formulation described below using a household sprayer.

- 6 047679- 6 047679

Препараты.Medicines.

1. Вода.1. Water.

2. 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди.2. 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% acacia.

3. Вода+ Gd (2,5x105 CFU/мл).3. Water + Gd (2.5x105 CFU/ml).

4. Вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x 10³ CFU/мл).4. Water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% gum arabic + Gd (2.5x 10 ³ CFU/ml).

5. Вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x 10⁴ CFU/мл).5. Water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% gum arabic + Gd (2.5x 10 ⁴ CFU/ml).

6. Вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x 10⁵ CFU/мл).6. Water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% gum arabic + Gd (2.5x 10 ⁵ CFU/ml).

7. Вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x 10⁶ CFU/мл).7. Water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% gum arabic + Gd (2.5x 10 ⁶ CFU/ml).

8. Вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x 10⁷ CFU/мл).8. Water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% gum arabic + Gd (2.5x 10 ⁷ CFU/ml).

Траву помещали обратно в Fitotron на следующие 2 недели при аналогичных ростовых условиях. 5 растений, выбранных случайным образом, срезали на уровне почвы для составления одного образца и взвешивали. Это повторяли еще пять раз с получением в целом шести образцов, соответствующих каждому препарату.The grass was placed back into the Fitotron for a further 2 weeks under similar growing conditions. Five plants, selected at random, were cut at soil level to form one sample and weighed. This was repeated five more times, yielding a total of six samples corresponding to each treatment.

Эти образцы высушивали в печи в течение 48 ч и взвешивали.These samples were oven dried for 48 h and weighed.

Результаты показаны на фиг. 5. Данные результаты указывают на то, что при условии наличия некоторого количества сахарозы которая обеспечивает поддержание роста Gd, биомасса травы увеличивалась при добавлении Gd в зависимости от состава. Более того, увеличение было дозозависимым, при этом оптимальный рост наблюдали при 2,5x 10 CFU/мл. Таким образом, такая доза может быть полезной, если подлежащая обработке трава представляет собой пастбищную траву, в случае которой максимальное количество биомассы является полезным. Однако, если подлежащая обработке трава представляет собой газонную траву или рулонный травяной газон, более низкий показатель биомассы с улучшенной зеленостью может быть полезным в плане улучшения внешнего вида без возрастания потребности в дополнительном срезании или скашивании. В данном случае можно использовать дозировку, составляющую либо менее, либо более 2,5x10 CFU/мл.The results are shown in Fig. 5. These results indicate that, provided some sucrose is available to support the growth of Gd, the grass biomass increased with the addition of Gd in a formulation-dependent manner. Furthermore, the increase was dose-dependent, with optimal growth observed at 2.5x 10 CFU/ml. Thus, such a dose may be beneficial if the grass being treated is a pasture grass, in which case the maximum amount of biomass is beneficial. However, if the grass being treated is a turf grass or a rolled turf, a lower biomass with improved greenness may be beneficial in terms of improved appearance without increasing the need for additional cutting or mowing. In this case, a dose of either less or more than 2.5x10 CFU/ml may be used.

Пример 4.Example 4.

Полевое испытание.Field test.

Состав, содержащий воду + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x10 CFU/мл), наносили на отдельный участок срезанной травы площадью 1 м² (стандартный газон на основе плевела Lolium perenne) по сравнению с участком неинокулированной срезанной травы площадью 1 м², который обрабатывали только водой травы площадью 1 м², который обрабатывали только водой (контроль).A formulation containing water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% acacia + Gd (2.5x10 CFU/ml) was applied to a separate 1 ^m2 patch of clippings ⁽ standard Lolium perenne lawn) compared to a 1 ^m2 patch of uninoculated clippings treated with water only (control).

Состав и воду наносили в пределах 30 мин после скашивания травы, используя для работы бытовой мелкокапельный распылитель. Контрольный участок ограждали от обрабатываемого участка посредством пластиковой перегородки. Нанесение осуществляли ближе к вечеру в безветренную погоду.The composition and water were applied within 30 minutes after mowing the grass, using a household fine-droplet sprayer. The control area was fenced off from the treated area using a plastic partition. The application was carried out closer to evening in windless weather.

На участках площадью 1 м формировали подвыборки с использованием проволочной сетки с квадратами площадью 20 см путем подсчета числа полностью вытянувшихся и сформировавшихся цветочных головок.In 1 m2 plots, sub-samples were formed using a wire mesh with 20 cm2 squares by counting the number of fully extended and formed flower heads.

Результаты для каждого квадрата площадью 20 см на каждом участке усредняли, и данные результаты показаны на фиг. 6. Очевидно, что препарат на основе Gd, наносимый таким способом, в значительной степени оказывает воздействие на рост соцветий.The results for each 20 cm square in each plot were averaged and these results are shown in Fig. 6. It is evident that the Gd-based preparation applied in this manner has a significant effect on inflorescence growth.

Пример 5.Example 5.

Сравнение компонентов композиции.Comparison of composition components.

Способ из примера 3 повторяли с использованием разных композиций, включающих отдельные компоненты композиции, использованной в том эксперименте. Более конкретно, в данном эксперименте использовали следующие композиции:The method of Example 3 was repeated using different compositions that included individual components of the composition used in that experiment. More specifically, the following compositions were used in this experiment:

Препараты.Medicines.

1. Вода.1. Water.

2. Вода + Gd (2,5x105 CFU/мл).2. Water + Gd (2.5x105 CFU/ml).

3. Вода + 3% сахарозы + 0,1% Tween + 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x 10⁵ CFU/мл).3. Water + 3% sucrose + 0.1% Tween + 0.3% gum arabic + Gd (2.5x 10 ⁵ CFU/ml).

4. 0,3% аравийской камеди + Gd (2,5x 10 CFU/мл) 5. 3% сахарозы + Gd (2,5x 10⁵ CFU/мл).4. 0.3% gum arabic + Gd (2.5x 10 CFU/ml) 5. 3% sucrose + Gd (2.5x 10 ⁵ CFU/ml).

6. 0,1% Tween + Gd (2,5x 10⁵ CFU/мл).6. 0.1% Tween + Gd (2.5x 10 ⁵ CFU/ml).

Траву AberGlyn выращивали в почве с компостом John Innes № 1 в течение 2 недель в камере для выращивания растений (Fitotron®) при 23/15°C, влажности 80%. Траву срезали на высоте 8 см с использованием ножниц, удаляли обрезки и на траву сразу же наносили распылением 10 мл препарата с использованием бытового распылителя. Траву обратно помещали в камеру для выращивания растений и оставляли на следующие две недели.AberGlyn grass was grown in soil with John Innes No. 1 compost for 2 weeks in a growth chamber (Fitotron®) at 23/15°C, 80% humidity. The grass was cut at 8cm using scissors, the cuttings removed and the grass immediately sprayed with 10ml of the product using a household sprayer. The grass was returned to the growth chamber and left for a further 2 weeks.

Случайным образом отбирали пять растений из кассеты, их объединяли для получения одного образца и взвешивали. Это повторяли еще пять раз с тем, чтобы в целом получить шесть образцов, соответствующих одному препарату. Траву сушили в течение 48 ч при 80°C, а затем взвешивали.Five plants were randomly selected from the cassette, pooled to form one sample and weighed. This was repeated five more times to obtain a total of six samples corresponding to one preparation. The herb was dried for 48 h at 80°C and then weighed.

Результаты показаны на фиг. 7. Этот эксперимент показал, что используемый компонент оказывал эффект в отношении роста травы. В этом примере поверхностно-активное вещество обеспечивало наиThe results are shown in Fig. 7. This experiment showed that the component used had an effect on grass growth. In this example, the surfactant provided the most

- 7 047679 больший прирост сухого веса. Аравийская камедь показала лишь незначительное улучшение по сравнению с контролем, предположительно вследствие того факта, что поверхностно-активное вещество может являться необходимым для содействия распространению Gd по растению и помогает жидкости проникать в раны травы (хотя в этом случае комбинация не показала ожидаемого улучшения). Снова же, эффективность препарата вода + Gd была подобной контролю, что указывает на то, что для колонизации ран Gd требует добавления по меньшей мере некоторых из данных компонентов.- 7 047679 greater dry weight gain. Gum acacia showed only a slight improvement over the control, presumably due to the fact that the surfactant may be necessary to aid in the dissemination of Gd throughout the plant and help the liquid penetrate into the grass wounds (although in this case the combination did not show the expected improvement). Again, the efficacy of water + Gd was similar to the control, indicating that Gd requires the addition of at least some of these components to colonize the wounds.

Claims

1. A method for introducing Gluconacetobacter diazotrophicus bacteria that provide nitrogen fixation into a growing plant, comprising causing a wound on the above-ground portion of the growing plant at a preliminary stage that does not involve introducing nitrogen-fixing bacteria into the plant, and at a stage following this preliminary stage, introducing nitrogen-fixing bacteria into the plant wound obtained at the preliminary stage by spraying a composition containing Gluconacetobacter diazotrophicus bacteria.

2. The method according to claim 1, wherein causing a wound to a plant comprises causing a wound to a stem or leaf of the plant.

3. The method according to claim 1 or 2, wherein the wounding of the plant is the result of mowing, cutting, trimming, eating by farm animals or harvesting.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the nitrogen-fixing bacteria are the only active component in the composition or kit that is introduced into the plant.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the plant is an agricultural plant, a crop plant, a forest plant or a garden plant.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the plant is a fruit tree, a shrub, a climbing plant, a forage crop, a herbaceous plant or a grass.

7. The method according to claim 6, wherein the plant is a grass that is a lawn grass, pasture grass or a rolled grass lawn.