[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

EA030139B1 - Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата - Google Patents

Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата Download PDF

Info

Publication number
EA030139B1
EA030139B1 EA201650048A EA201650048A EA030139B1 EA 030139 B1 EA030139 B1 EA 030139B1 EA 201650048 A EA201650048 A EA 201650048A EA 201650048 A EA201650048 A EA 201650048A EA 030139 B1 EA030139 B1 EA 030139B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
conjugation
urea
oxidation
copolymer
ethylene piperazine
Prior art date
Application number
EA201650048A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201650048A1 (ru
Inventor
Аркадий Васильевич НЕКРАСОВ
Темури Мусаевич КАРАПУТАДЗЕ
Сергей Алексеевич МЕДВЕДЕВ
Александр Владимирович КОЗЮКОВ
Нино Темуриевна КАРАПУТАДЗЕ
Original Assignee
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" filed Critical ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм"
Publication of EA201650048A1 publication Critical patent/EA201650048A1/ru
Publication of EA030139B1 publication Critical patent/EA030139B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/02—Suppositories; Bougies; Bases therefor; Ovules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A61K31/787—Polymers containing nitrogen containing heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F26/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C08F26/06—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/02—Alkylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/06—Oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментных препаратов, в частности к получению и использованию нового активного конъюгата фермента с полимерным носителем. Конъюгат обладает свойствами препарата Лонгидаза и подавляет гиперплазию соединительной ткани, а также обладает противовоспалительным действием и может быть использован для производства стабильных, активных и безопасных в применении лекарственных препаратов пролонгированного действия в форме суппозитория, мази, инъекции или косметического крема, а также для получения ветеринарных лекарственных средств. Способ заключается в конъюгации гиалуронидазы с водорастворимым сополимером карбодимидным или азидным методом. Для конъюгации используют сополимер N-оксида 1,4-этиленпиперазина, (N-карбоксиметилметил)-1,4-этиленпиперазиния или его гидразида и 1,4-этиленпиперазина общей формулыгде n - от 40 до 90% от общего количества звеньев, m - от 3 до 40% от общего количества звеньев, n + m + l = 100%.

Description

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментных препаратов, в частности к получению и использованию нового активного конъюгата фермента с полимерным носителем. Конъюгат обладает свойствами препарата Лонгидаза и подавляет гиперплазию соединительной ткани, а также обладает противовоспалительным действием и может быть использован для производства стабильных, активных и безопасных в применении лекарственных препаратов пролонгированного действия в форме суппозитория, мази, инъекции или косметического крема, а также для получения ветеринарных лекарственных средств. Способ заключается в конъюгации гиалуронидазы с водорастворимым сополимером карбодимидным или азидным методом. Для конъюгации используют сополимер Ν-оксида 1,4-этиленпиперазина, (Νкарбоксиметилметил)-1,4-этиленпиперазиния или его гидразида и 1,4-этиленпиперазина общей формулы
где η - от 40 до 90% от общего количества звеньев, т - от 3 до 40% от общего количества звеньев, η + т + 1 = 100%.
030139
Изобретение относится к созданию технологических процессов получения иммобилизованных ферментных препаратов. Оно может быть широко использовано в различных отраслях, особенно в фармацевтической промышленности, для производства стабильных, активных и безопасных в применении лекарственных препаратов пролонгированного действия.
Наиболее эффективным способом стабилизации соединений белкового или иного характера в физиологическом растворе является химическая конъюгация на высокомолекулярных носителях [Ратуееп 8., 8а1юо 8.К., С1ш РЬаттасоктеГ 2006; 45(10), с. 965; Эппсам К., РЕСу1а1ей Рго1ет Этидк: Ва81С 8с1еисе апб СПшса1 ЛррБсайопз. Ей:. ВикЬаикет Ва§е1 2009; Наптк ЕМ., СЬе88 КВ. ЕГГес! о! редйайоп оп РйаттасеиОса15//№ц Кеу Эгид Э18соу, 2003, 2(3), с. 214.
Ковалентное связывание лекарственных белков с полимерным носителем многократно повышает конформационную стабильность белковых молекул и устойчивость к действию протеаз и специфических ингибиторов, что позволяет создавать макромолекулярные физиологически активные препараты пролонгированного действия на их основе [Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Иммунология, 2006; 27(2), с. 1].
На сегодняшний день известно множество полимерных носителей для получения конъюгатов с белковыми и небелковыми соединениями. Наиболее хорошо известны различные конъюгаты на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ), которые используются в качестве лекарственных препаратов [Бейлон П.С., Паллерони А.В./Конъюгаты интерферона, патент РФ 2180595. Бург Й, Хильгер Б., Йозель Х.-П., патент КИ 2232163; Курочкин С.Н., Парканский А.А., патент КИ 2298560].
Известны водорастворимые полимерные гетероциклические амины, например производные Νоксида поли-1,4-этиленпиперазина. Полимерные амины уникальны по своим свойствам и применимости в качестве полимерного носителя для конъюгации. Сополимер Ν-оксида 1,4-этиленпиперазина и (Νкарбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний галогенида (полиоксидоний) нетоксичен, обладает антирадикальными и детоксикационными свойствами, биодеградируемый за счет Ν-оксидных групп. Сополимер разрешен к применению в медицинской практике и используется как иммуномодулятор, адъювант или полимерный носитель [Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Иванова А.С. Производные поли-1,4этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной, антибактериальной активностями. Патент КИ № 2073031]. Это делает актуальным и важным направления по разработке доступных и простых технологических процессов производства полимерных носителей, отвечающим всем предъявляемым к ним требованиям, и различных процессов конъюгации на их основе.
В патенте КИ 2185388 (опубликован 20.07.2002) описывается окисление поли-1,4этиленпиперазина в водном растворе, содержащем растворитель и окислитель, способном образовывать атомарный кислород в нормальных условиях. В качестве окислителя целесообразно использовать органические и неорганические перекиси и гидроперекиси, соли кислородсодержащих галогенокислот, озон, кислород, полученный электролизом воды.
В качестве кислотного растворителя можно использовать, например, концентрированный водный раствор уксусной кислоты.
Окисление целесообразно проводить путем смешивания поли-1,4-этиленпиперазина (ПЭП) с водным раствором уксусной кислоты (УК) и пероксида водорода (ПВ) в мольном соотношении: ПЭП:УК:ПВ=1:0,45:0,7. Процесс окисления проводят в гетерогенной среде до достижения полного растворения полимера. Затем проводят алкилирование полученного Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина в присутствии алкилирующего агента которое осуществляют в водной среде. В качестве алкилирующего агента рекомендуется использовать вещества, ковалентно связывающиеся с атомом третичного азота в полимерной цепи в условиях температур 30-100°С, например галогенокислоты или их эфиры циклического или ациклического строения.
Предпочтительно в качестве алкилирующего агента использовать этиловый эфир бромуксусной кислоты.
Полученный в процессе алкилирования раствор сополимера Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина и Щ-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида (С-ПНО) после очистки, например, ультрафильтрацией может быть использован для дальнейшего синтеза высокомолекулярных водорастворимых биогенных соединений, в частности конъюгатов или комплексов с биологически активными веществами.
В патенте КИ 2556378 (опубликован 10.07.2015) описывается конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, и его способ получения. Способ включает окисление полиэтиленпиперазина до Ν-оксида и алкилирование бромуксусной кислотой с получением сополимера Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина и Щ-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний бромида), а также очистку полученного сополимера. Конъюгацию сополимера с эритропоэтином проводят карбодиимидным или гидразидным методом.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является изобретение, описанное в патенте КИ 2112542 (опубликован 10.06.1998). Патент относится к препарату, содержащему конъюгат фермента гиалуронидаза, для лечении патологических состояний соединительных тканей. В патенте описывается способ получения конъюгата фермента гиалуронидаза с высокомолекулярным носителем - сополимером Νоксида поли-1,4-этиленпиперазина и Щ-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида (полиоксидонием), мол.мас. 40000-100000 Д и соотношением фермент:носитель 1:(1-5), соответствующим общей фор- 1 030139
муле
где К - фермент гиалуронидаза;
η = 300-700 - количество элементарных звеньев; ς = 0,2-0,4 - количество алкилированных звеньев; ζ = 0,4-0,8 - количество окисленных звеньев.
При этом в качестве фермента в препарате может быть использована гиалуронидаза, выделенная из семенников крупного рогатого скота. Способ заключается в конъюгации гиалуронидазы с полиоксидонием с использованием азидного метода, либо метода активированных сукцинимидных эфиров. При использовании азидного метода конъюгат получают в две стадии: на первой - из полиоксидония получают гидразид полиоксидония, а на второй - получают конъюгат реакцией конденсации азида полиоксидония с ферментом. При использовании метода активированных эфиров вначале получают сукцинимидный эфир полиоксидония, а затем конъюгируют с ферментом. Конъюгированный препарат назван в описании как Лонгидаза. Способ получения сополимера Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина и (Ν-карбоксиэтил)1,4-этиленпиперазиний бромида в патенте не описывается.
Востребованность препаратов со свойствами препарата Лонгидаза на фармацевтическом рынке, экономические и экологические требования послужили причиной усовершенствования используемого в производстве процесса с целью исключения в нем определенных недостатков и повышения производительности.
Во всех вышеперечисленных патентах не рассматривается распределение молекулярных звеньев в структуре сополимера или конъюгата, полученного на его основе.
Как показали исследования, распределение молекулярных звеньев в структуре сополимера оказывает влияние на свойства получаемого конъюгата, а именно на степень конъюгации, выходы целевого продукта и стабильность конъюгированных препаратов.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения конъюгата фермента гиалуронидаза с полимерным носителем, содержащим сополимер Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина и ^-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний бромида, обладающего одновременно свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, пригодных для лечения патологических состояний соединительных тканей с улучшенными свойствами и повышенным выходом способа.
Решение поставленной задачи достигается способом получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1,4-этиленпиперазина и (№карбоксиметил)-1,4этиленпиперазиний галогенид с использованием карбодимидного или азидного метода конъюгации, очистки и лиофильной сушки. Для конъюгации используют водорастворимый сополимер, который представляет собой сополимер Ν-оксида 1,4-этиленпиперазина, (№карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния или его гидразидное производное и 1,4-этиленпиперазина общей формулы (I)
где η - от 40 до 90% от общего количества звеньев, т - от 3 до 40% от общего количества звеньев, η + т + 1 =100%,
полученный из поли-1,4-этиленпиперазина с использованием стадий окисления окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, алкилирования низшей галогеналкановой кислотой или ее алкиловым эфиром и, в случае азидного метода, гидразинолиза.
Мочевину на стадии окисления добавляют в количестве 1-10 мас.%, предпочтительно 3-6% мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
Для конъюгации используют гиалуронидазу из семенников животного происхождения семенников крупного рогатого скота.
Очистку осуществляют поэтапно путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа.
Используемый сополимер является статистическим полимером, звенья в структуре молекулы которого расположены неупорядоченно и могут быть в любом порядке и сочетании.
От характера распределения функциональных групп зависит реакционная способность полимерно- 2 030139
го носителя в реакции конъюгации, а также стабильность сополимера и получаемых на его основе конъюгатов.
Полученный разными способами сополимер с одними и теми же количественными характеристиками с идентичными активными группами (Ν-оксидные и карбоксильные группы) проявляет совершенно разную реакционную способность в реакциях конъюгации. Это объясняется тем, что карбоксильные группы могут быть малодоступны по стерическим причинам и/или не быть активированы при наличии рядом находящихся Ν-оксидных групп. Использование полимерного носителя с малореакционноспособными карбоксильными группами приводит к существенному снижению выходов и степени конъюгации, ухудшает молекулярно-массовое распределение получаемых конъюгатов. До настоящего изобретения гетероциклический Ν-оксидный полимерный носитель не имел нужного количества реакционноспособных групп (карбоксильных или гидразидных), что не позволяло получать гарантированно высокую степень конъюгации с ферментом гиалуронидазой карбодиимидным или гидразидным методом конъюгации. Разработанные в настоящем изобретении способы производства позволяют получать препараты гиалуронидазы со степенью конъюгации не менее 90% даже в промышленных масштабах.
Наличие больших участков молекулы сополимера, содержащих только Ν-оксидные группы, делает полимерную молекулу малостабильной. Изучение стабильности показало, что конъюгаты на основе таких полимерных молекул со временем подвержены деструкции. Скорость деструкции полимерного носителя с неравномерным распределением Ν-оксидных групп не постоянна, деструкция происходит гораздо быстрее в первые месяцы хранения. Напротив, полимерный носитель с равномерным распределением Ν-оксидных групп намного более стабилен, скорость деструкции меньше и постоянна. Стабильность конъюгата и равномерность распределения Ν-оксидных групп в полимерном носителе также зависит от условий способа получения сополимера для конъюгации (см. табл. 1 и 2).
Предлагаемое изобретение, относящееся к способу производства конъюгатов гиалуранидазы, позволяет получать полимерный носитель не только с заданными количественными характеристиками (количество различных звеньев в полимере), но с необходимым распределением звеньев, что качественно меняет свойства как самого полимерного носителя, так и конъюгата с ферментом на его основе.
Изобретение делает возможным выпускать безопасный, высокоэффективный и стабильный лекарственный препарат обладающий одновременно свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, представляющий собой конъюгат гиалуронидазы (терапевтического фермента, выделенного из семенников крупного рогатого скота) и водорастворимого сополимера общей формулы (I).
В случае азидного метода конъюгации алкилирование проводят алкиловым эфиром галогеналкановой кислоты, и стадии алкилирования и гидразинолиза совмещены. Конъюгацию с гиалуронидазой проводят азидным методом при температуре от 0 до 25°С.
Очистка представляет собой трехкратную поэтапную отмывку очищенной водой на полупроницаемых кассетах (с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа) после завершения стадий окисления, алкилирования и гидразинолиза и конъюгации.
Для конъюгации используют водорастворимый сополимер общей формулы (I), содержащий в своей цепи гидразидные группы от 3- 20%.
В случае карбодиимидного метода конъюгации поли-1,4-этиленпиперазин сначала алкилируют, а затем подвергают окислению в водной среде. При этом алкилирование проводят галогеналкановой кислотой.
Очистку при карбодиимидном методе (осуществляют поэтапно путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах (с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа) после завершения стадии получения сополимера и конъюгации.
Для конъюгации используют водорастворимые сополимеры Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина, общей формулы (I), содержащие в своей цепи до 25% карбоксильных групп, и используют любые водорастворимые карбодиимиды в количестве от 3 до 50% от взятого в реакции сополимера.
Объектом изобретения также является активная субстанция конъюгата, обладающая свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, полученная любым из предлагаемых способов для приготовления лекарственного средства в виде лекарственной формы, выбранной из суппозитория, мази, инъекций или косметического крема, в том числе лекарственных средств для ветеринарии.
Ниже приводится подробное описание предлагаемого способа с использованием азидного и карбодиимидного методов конъюгации производства лонгидазы с конкретными свойствами, подробно описанными в 10 примерах и представленными в табл. 1.
В условиях предлагаемой технологии получения полимерного носителя и конъюгатов гиалуронидазы, как было обнаружено происходит необходимое распределение функциональных звеньев в структуре сополимера, при которых полимерный носитель и конъюгаты на его основе получаются устойчивыми в процессе длительного хранения. Указанный результат достигается тем, что осуществляют реакцию окисления полиэтиленпиперазина в диссоциирующих условиях путем добавления мочевины. При этом разрушаются нековалентные межмолекулярные связи полиэтиленпиперазина, в реакциях участвуют отдель- 3 030139
ные молекулы полимера, а не молекулы в составе мицеллы, и достигается необходимое равномерное распределение функциональных групп по цепи полимера, повышается ферментативная активность (на 30-65%, см. табл. 1), степень конъюгации и выходы целевого продукта (на 15-20%, см. табл. 1), а также стабильность конъюгата гиалуронидазы. Ферментативная активность препаратов лонгидазы при хранении при температуре 2-8°С в течение 1 года падала на 4-6% для образцов, полученных с использованием мочевины и на 24-27% без применения мочевины (табл. 1, примеры 4 и 9).
Получение конъюгата осуществляют двумя способами: способом производства конъюгата гиалуронидазы с использованием азидного метода конъюгации и способом производства конъюгата гиалуронидазы с использованием карбодиимидного метода конъюгации.
В качестве исходного сырья для всех способов производства используется поли-1,4этиленпиперазин (ПЭП) с молекулярной массой от 20 до 60 кДа.
ПЭП получают в результате катионной полимеризации, которая является эффективным методом синтеза монодисперсных высокомолекулярных соединений с заранее заданной молекулярной массой и структурой.
1. Способ производства конъюгата с использованием азидного метода конъюгации.
Способ производства состоит из основных этапов технологического процесса: окисления в присутствии мочевины, алкилирования, гидразинолиза, проведение конъюгации азидным методом.
Окисление поли-1,4-этиленпиперазина проводят в кислой среде пероксидом водорода в присутствии мочевины при температуре 45-55°С в течение 12-24 ч в реакторе с водяной рубашкой. Затем реакционную смесь разбавляют, фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,45 нм, проводят диафильтрацию на ультрафильтрационной установке с кассетами, имеющим нижний предел отсекания частиц 5 кДа, и фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,22 нм. Далее лиофильно высушивают, анализируют на соответствие требованиям НД и сдают на склад.
На втором этапе полученный Ν-оксид поли-1,4-этиленпиперазина алкилируют эфиром галогеноалкановой кислоты в водно-органическом растворе (смесь вода и Ν-метилформамид) при перемешивании в интервале температур 35-50°С в течение 4-6 ч и проводят гидразинолиз алкильного производного полиэтиленпиперазина обработкой гидразингидратом при температуре 2-8°С. Реакционную массу фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с 0,45 нм, проводят очистку на ультрафильтрационной установке с кассетами, имеющим нижний предел отсекания частиц 10 кДа (количеств гидразингидрата не более 0,001%), проводят стерилизующую фильтрацию на патронном фильтре и разливают во флаконы. Анализируют на соответствие требованиям НД и сдают на склад.
На последнем третьем этапе процесс конъюгации гиалуронидазы с гидразидным производным карбоксиметилсодержащего Ν-оксида полиэтиленпиперазина, содержащим в своей цепи более 3% гидразидных групп, проводят азидным методом путем обработки нитритом натрия при рН 0-1 и последующей конъюгацией азидного производного с гиалуронидазой в течение 18-22 ч при комнатной температуре. Конъюгат гиалуронидазы фильтруют, очищают отмывкой на ультрафильтрационной установке (кассеты с нижним пределом отсекания частиц 5 кДа), стерилизуют фильтрацией и лиофильно высушивают. Результаты анализов приведены в табл. 1 (примеры 1-3).
Предлагаемым способом производства, включающим этапы алкилирования, окисления, но без добавления мочевины, гидразинолиз, конъюгацию азидным методом и процедуру очистки, получают образец лонгидазы. Результаты анализов последнего представлены в табл. 1 (пример 4). Сравнительные исследования показывают, что добавление мочевины увеличивает ферментативную активность, степень конъюгации и выход целевого продукта, а также стабильность конъюгата (табл. 1).
Полученный лиофилизат расфасовывают во флаконы и сдают на склад в виде активной субстанции конъюгата с активностью, которой обладает Лонгидаза®.
В дальнейшем полученную лекарственную субстанцию используют для получения инъекционной формы препарата в жидком или лиофилизованном виде. Для этого раствор разбавляют с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора ферментативная активность составила 3000 МБ (терапевтическая доза) и анализируют по всем параметрам на соответствие требованиям НД на готовую лекарственную форму. После этого раствор можно лиофильно высушить (лиофилизованная форма препарата) или, не высушивая, укупоривают, этикетируют жидкую лекарственную форму и контролируют по всем параметрам на соответствие требованиям НД на готовую лекарственную форму.
Предлагаемый согласно настоящему изобретению карбодиимидный метод позволяет провести процесс без органических растворителей и вредных реагентов, улучшить качество и повысить стабильность конечного препарата -конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина.
2. Способ производства лонгидазы с использованием карбодиимидного метода конъюгации.
Последовательная технология производства состоит из основных этапов технологического процесса: алкилирования, окисления в присутствии мочевины, проведение конъюгации карбодиимидным методом.
Используют поли-1,4-этиленпиперазин с заданными свойствами (см. выше), который алкилируют бромуксусной кислотой в водной среде при температуре 40-95°С при весовом соотношении (85:15)- 4 030139
(70:30) соответственно. Смесь перемешивают при температуре 50-70°С в течение 3 ч, затем в реакционную массу добавляют мочевину, уксусную кислоту и пероксид водорода, после этого при непрерывном перемешивании оставляют на 18-22 ч. Далее проверяют полноту протекания реакции окисления при помощи аммиачного теста (аналогично примеру 1). Реакционную массу фильтруют на патронном фильтре, снабженным фильтрующим элементом с размером пор 0,45 нм, полимер очищают отмывкой на ультрафильтрационной установке с нижним пределом отсекания частиц 5 кДа до содержания пероксида водорода не более 0,001% (тест на перекись водорода). Раствор концентрируют до 10-15%, содержание карбоксильных групп в полимере должно быть не менее 6%. В реакционную среду при перемешивании вводят рассчитанное количество гиалуронидазы и доводят рН среды до значения 4,8.
Продолжая перемешивание добавляют водорастворимый карбодиимид с таким расчетом, чтобы его количество составляло 25-50% от введенной гиалуронидазы (в пересчете на белок). Реакционную смесь выдерживают при температуре 0-25°С в течение 1-1,5 ч, после чего проводят контроль степени конъюгации, которая должна быть не ниже 95%. При положительном результате реакционную смесь отмывают очищенной водой, подщелачивают до значения рН 6,8-7,0 и фильтруют на дисковом фильтре, снабженном глубинным фильтром марки АР-15. После предварительной фильтрации реакционную смесь продолжают очищать отмывкой очищенной водой на Пелликон-кассете с таким расчетом, чтобы общее количество воды составляло бы не менее 200 л на 1 кг сухих веществ. Затем раствор субстанции с активностью Лонгидаза® концентрируют, стерильно фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующей мембраной с размером пор 0,22 нм, и расфасовывают во флаконы в виде жидкой субстанции. Также можно полученный стерильный концентрат лиофильно высушить, получая при этом субстанцию с активностью, которой обладает препарат Лонгидаза® в сухом виде. Проводят контроль на соответствие требованиям НД и сдают на склад готовой продукции. Результаты анализов субстанции приведены в табл. 1 (примеры 6-8).
Предлагаемым способом производства, включающим этапы алкилирования, окисления, но без добавления мочевины, конъюгацию карбодиимидным методом и процедуру очистки, получен образец лонгидазы, результаты анализов которого представлены в табл. 1 (пример 9). Так же, как и в случае способа производства лонгидазы с использованием азидного метода конъюгации, добавление мочевины увеличивает ферментативную активность, степень конъюгации и выход целевого продукта, а также стабильность конъюгата (табл. 1, 2).
Стерильный раствор конъюгата гиалуронидазы используют по назначению. Полученную лекарственную субстанцию используют для приготовления инъекционных форм в жидком или лиофилизованном виде. Для этого раствор разбавляют с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора ферментативная активность составила 3000 МЕ (терапевтическая доза) и разливают во флаконы и лиофильно высушивают (лиофилизованная форма препарата) или, не высушивая, укупоривают, этикетируют жидкую лекарственную форму и контролируют по всем параметрам на соответствие требованиям НД на готовую лекарственную форму.
В процессе получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина используют ультрафильтрационную очистку на кассетах с отсечением 1-30 кДа для удаления технологических примесей. Отмывку проводят после завершения стадий алкилирования и окисления, а также в конце технологического процесса. Предложенный карбодиимидный способ конъюгации осуществляют исключительно в водной среде.
Таким образом, сутью предлагаемого способа является новый подход в технологии получения иммобилизованных соединений на полимерном носителе нового класса в виде водорастворимых производных ПЭП по азидному и карбодиимидному методам. Сополимер получают химической модификацией из ПЭП в присутствии мочевины, что в процессе конъюгации способствует значительному повышению гиалуронидазной активности, степени конъюгации, выходу препарата с активностью лонгидазы и ее стабильности при хранении.
Анализ результатов получения конъюгатов гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина, приведенные в табл. 1 (примеры 1-10) свидетельствуют о высоком выходе целевого продукта и высоком качестве конечного продукта, при этом технологический процесс с использованием карбодиимидного метода обеспечивает более высокую степень конъюгации и активность конечного продукта, и процесс осуществляется исключительно в водной среде.
Изобретательский уровень разработанных способов производства конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина подтверждается отсутствием в данном направлении деятельности технологических процессов непрерывного характера и тем, что получение Ν-оксида полиэтиленпиперазина проводилось с использованием мочевины. При промышленном применении карбодиимидного метода последний является более предпочтительным, чем азидный метод. Применение разработанных способов в производстве пролонгированных форм соединений различного назначения позволяет улучшить производство нового препарата с активностью превышающей активность препарата Лонгидаза®.
Изучение деструкции сополимеров Ν-оксида 1,4-этиленпиперазина, Щ-карбоксиметил)-1,4этиленпиперазиния и 1,4-этиленпиперазина показало, что при температурах не выше 70°С в водной сре- 5 030139
де с рН не более 9 деструкция происходит исключительно по Ν-оксидным звеньям. Термическое разложение Ν-оксидов протекает посредством перегруппировки Мезенгеймера
Сополимер, имеющий равномерное распределение различных звеньев, не может иметь большие участки, состоящие только из одного вида звеньев. Так, при содержании 50% и более Ν-оксидных звеньев и их равномерном распределении по полимерной цепочке сополимер не должен иметь большие участки, состоящие только из незамещенных звеньев 1,4-этиленпиперазина (звенья 1). Основываясь на этом, был разработан метод качественной и количественной оценки равномерности распределения звеньев, содержащих Ν-оксидные группы по цепочке сополимера. Метод заключается в контролируемой деструкции сополимера с последующим физико-химическим анализом получаемых фрагментов. Было установлено, что при использовании в процессе окисления мочевины продукты деструкции не содержат низкомолекулярный полимер с содержанием одного вида звеньев
где 1 = 3 и выше.
Наличие этого вещества в продуктах деструкции сополимера говорит о большой неравномерности распределения Ν-оксидных звеньев в исходном сополимере.
При анализе сополимера серии 111114 методом деструкции было выделено вещество
где 1 = от 4 до 6.
Проанализировав количество и качественный состав этого вещества, можно качественно и количественно судить о характере распределения Ν-оксидных групп в исследуемом сополимере. Однако разработанный метод измерения требует много времени (контролируемая деструкция сополимера по Νоксидным группам занимает 5 недель) и большого количества вещества для анализа. С учетом этого был разработан качественный метод быстрой оценки равномерности распределения звеньев.
В исследованиях разных образцов сополимеров методом ДСК (дифференциальной сканирующей калориметрии) было показано, что полимеры данного типа интенсивно разлагаются при температуре около 160°С с выделением тепла. При этом наблюдаются разные формы экзотермического пика разложения у образцов, полученных с применением мочевины и без. Так, были исследованы 2 образца полимерного носителя с одинаковыми количественными показателями - молекулярный вес, молекулярномассовое распределение, количество карбоксильных и Ν-оксидных групп, полученные с применением мочевины на стадии окисления и без. При этом конъюгаты, полученные на одном полимерном носителе, были стабильными, на другом носителе нет.
Кривые ДСК сополимеров приведены на фиг. 1 и 2.
На кривых ДСК (фиг. 1 и 2) наблюдается значительное различие соотношения интенсивностей пиков в интервале 150-170°С. Полученные результаты указывают на связь структуры полимера (характер распределения звеньев) с его термической устойчивостью. Полученные результаты были подтверждены исследованиями других носителей и демонстрируют возможность различать образцы полимерных носителей с разной устойчивостью, обусловленной характером распределения функциональных групп в молекуле полимерного носителя.
Ниже приведены, конкретные параметры, которые сведены в табл. 1 и представлены в примерах 1-3 и 6-8. В табл. 1 также указаны результаты промышленных серий (примеры 5 и 10). В примерах 4 и 9 приведены данные, подтверждающие преимущества способа производства в присутствии мочевины.
Пример 1. Способ производства конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина с использованием азидного метода конъюгации.
Берут 200 г стружки поли-1,4-этиленпиперазина с молекулярной массой 50 кДа, предварительно измельченной и очищенной по методу четырехкратной отмывки очищенной водой. Стружку окисляют в смеси 50 мл уксусной кислоты, 140 мл 30%-го раствора перекиси водорода в воде в присутствии 50 г мочевины. Количество воды добавляют таким образом, чтобы концентрация по ПЭПу была 15 мас.%, т.е. объем реакционной среды должен составлять 1,5 л. Реакционную смесь нагревают до 50°С и при непрерывном перемешивании выдерживают в течение 24 ч. Полноту окисления проверяют с помощью аммиачного теста. Аммиачный тест состоит в следующем: к 1 мл реакционной смеси добавляют 10 мл 25% раствора аммиака. Положительным результатом считается отсутствие мути в растворе после выдержки в течение 20 мин. При положительном результате реакционную смесь разбавляют, фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,45 нм, очищают и концентрируют на ультрафильтрационной установке с кассетами, имеющим нижний предел отсекания частиц 5 кДа, и
- 6 030139
фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с размером пор 0,22 нм. Далее лиофильно высушивают и получают 204 г Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина в виде лиофилизата, который анализируют на соответствие требованиям НД и сдают на склад.
Полученный Ν-оксид поли-1,4-этиленпиперазина растворяют в 1500 мл дистилированной воды и добавляют 6000 мл Ν-метилформамида. В полученный раствор добавляют 275 мл эфира бромалкановой кислоты и при перемешивании выдерживают при температуре 35-50°С в течение 4-6 ч. Затем реакционную массу охлаждают до 2-8°С и при перемешивании добавляют 250 мл гидразингидрата. Реакционную смесь разбавляют очищенной водой в 10 раз, фильтруют на патронном фильтре, снабженном фильтрующим элементом с 0,45 нм и очищают ппромывкой на Пиликон-кассетах (с нижним пределом отсекания частиц 10 кДа) до содержания следовых количеств гидразингидрата (не более 0,001%). Далее реакционную смесь концентрируют до 10-12% (по целевому веществу), стерильно фильтруют и разливают во флаконы. Получают 2200 мл раствора гидразидного производного Ν-оксида поли-1,4-этиленпиперазина, который анализируют на соответствие требованиям НД и сдают на склад.
В полученный на предыдущей стадии раствор охлаждают до 2-6°С и при перемешивании и охлаждении добавляют соляную кислоту до рН 0-1. Затем при перемешивании и охлаждении порциями добавляют 360 г нитрита натрия и выдерживают реакционную массу 1,5 ч. После этого реакционную среду подщелачивают сухим поташом до рН 6,8-7 и при температуре до 10°С при перемешивании добавляют 10%-й раствор, содержащий 65 г препарата гиалуронидазы (70% белка). Реакционную смесь продолжают перемешивать в течение 1,5 ч, затем отбирают пробу для контроля степени конъюгации. При положительном результате степени конъюгации (не ниже 70%) реакционную массу фильтруют на дисковом фильтре, снабженном глубинным фильтром марки АР-15, и отмывают 50 л очищенной воды на ультрафильтрационной установке с кассетами имеющим нижний предел отсекания частиц 5 кДа. Раствор концентрируют, стерильно фильтруют и фасуют в стерильные флаконы (жидкая субстанция). Стерильный раствор также лиофильно высушивают и фасуют в стерильные флаконы (лиофилизованная субстанция). Получают 231 г, выход 86%. Результаты анализа полученной субстанции конъюгата представлены в табл. 1 (пример 1). Полученная субстанция используется для приготовления готового лекарственного средства с видом активности идентичным активности известного препарата "Лонгидаза" в виде суппозитория вагинального и ректального 3000 МЕ.
Пример 2.
Проводят аналогично примеру 1, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 40 кДа и на стадии окисления используют 60 г мочевины. Получают 227 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата "Лонгидаза" в виде лиофилизата, выход 84%. Результаты анализа представлены в табл. 1, пример 2.
Полученная субстанция используется для приготовления крема и мазей для наружного применения, 1000 МЕ.
Пример 3.
Проводят аналогично примеру 1, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 55 кДа и на стадии окисления используют 80 г мочевины. Получают 235 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата "Лонгидаза" в виде лиофилизата, выход 87%. Результаты анализа представлены в табл. 1, пример 3.
Субстанции используется для приготовления инъекционной формы.
Пример 4.
Проводят аналогично примеру 1, с той разницей, что на стадии окисления не добавляют мочевину. Получают 215 г субстанции с активностью Лонгидазы® в виде лиофилизата, выход 74%. Результаты анализа Лонгидазы® представлены в табл. 1, пример 4.
Субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата "Лонгидаза" используется для приготовления инъекционной формы.
Пример 5.
Проводят аналогично примеру 1, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 4000 г с молекулярной массой 45 кДа, а также тем, что на стадии окисления добавляют 2000 г мочевины. Получают 4700 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата "Лонгидаза" в виде лиофилизата, выход 87%. Результаты анализа представлены в табл. 1 (пример 5).
Дозируя требуемое количество полученной субстанции в суппозиторные, мазевые или кремовые основы, получают соответственно суппозитории, кремы, мази, содержащие активную субстанцию. Также субстанция используется для приготовления инъекционной формы.
Пример 6. Способ с использованием карбодиимидного метода конъюгации.
Поли-1,4-этиленпиперазин 200 г с молекулярной массой 30 кДа добавляют в 1,2 л кипящего водного раствора, содержащего 58 г бромуксусной кислоты, и продолжают нагревать при 70°С в течение 3 ч при непрерывном перемешивании. Затем в реакционную массу добавляют 40 мл уксусной кислоты, 140 мл 30%-го водного раствора пероксида водорода, 50 г мочевины и перемешивают при температуре 3842°С в течение 18-20 ч. Далее проводят проверку на полноту степени окисления с помощью аммиачного
- 7 030139
теста (тест описан выше). При положительном результате реакционную смесь разбавляют до концентрации 1-2% и фильтруют на патронном фильтре, содержащем фильтрующий элемент с размерами пор 0,45 нм, очищают отмывкой очищенной водой на Пиликон-кассете с нижним пределом пропускания частиц 5 кДа. В процессе отмывания раствор подщелачивают до значения рН 11,0-11,5 с целью полной очистки от следов низкомолекулярных органических кислот. Очистку продолжают до количества пероксида водорода не более 0,001% (тест на пероксид водорода) и концентрируют до 10% по целевому веществу. Полученный раствор подкисляют соляной кислотой до значения рН 4,8-4,9, после чего вводят 50 г гиалуронидазы. Производят корректировку значения рН, оно должно быть 4,8-4,9. В реакционную смесь при перемешивании вводят раствор, содержащий 2,1 г Ы-(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимида гидрохлорида в 210 мл воды в течение 1,5-2 ч. Реакцию конъюгации проводят при температуре 2-25°С. После введения последней порции раствора конденсирующего агента, реакционную массу выдерживают при перемешивании 30 мин при заданной температуре и отбирают пробу для определения степени конъюгации. При положительном результате степень конъюгации должна быть не менее 90%, реакционную массу выдерживают в течение 18-20 ч, подщелачивают сухим поташом до значения рН 6,8-7,0, отмывают и фильтруют на дисковом фильтре с фильтрующим материалом в виде глубинного фильтра марки АР-15. Затем реакционную массу очищают ультрафильтрацией на Пиликон-кассете с нижним пределом отсекания частиц 5 кДа очищенной водой. Очищенный раствор концентрируют до концентрации 810% и стерильно фильтруют на патронном фильтре, содержащим фильтрующий элемент с размером пор 0,22 нм. Полученный раствор конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина можно разбавлять до концентрации, содержащей в одном миллилитре раствора 3000 МЕ ферментативной активности и получить в конечном итоге инъекционную форму (в жидком виде) или лиофильно высушить (в лиофилизованном виде). При лиофильном высушивании получают 261 г субстанции с с видом активности идентичным активности известного препарата Лонгидаза®, выход 97%. Результаты анализа представлены в табл. 1, пример 6.
Дозируя требуемое количество субстанции в суппозиторную основу, получают соответственно суппозитории.
Пример 7.
Проводят аналогично примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 38 кДа и на стадии окисления используют 60 г мочевины. Получают 265 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата Лонгидазы® в виде лиофилизата, выход 98%. Результаты анализов представлены в табл. 1, пример 7.
Субстанции используется для приготовления мази.
Пример 8.
Проводят аналогично примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 26 кДа и на стадии окисления используют 40-70 г мочевины. Получают 264 г субстанции, с видом активности идентичным активности известного препарата Лонгидаза® в виде лиофилизата, выход 98%. Результаты анализов представлены в табл. 1, пример 8.
Субстанции используется для приготовления инъекционной формы.
Пример 9.
Проводят аналогично примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 200 г с молекулярной массой 26 кДа на стадии окисления не добавляют мочевину. Получают 217 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата "Лонгидаза" в виде лиофилизата, выход 82%. Результаты анализа представлены в табл. 1, пример 9.
Субстанции используется для приготовления инъекционной формы содержащей Лонгидазу.
Пример 10.
Проводят аналогично примеру 6, с той разницей, что используют измельченный и очищенный ПЭП в количестве 4000 г с молекулярной массой 36 кДа, а также тем, что на стадии окисления добавляют 1500 г мочевины. Получают 5130 г субстанции с видом активности идентичным активности известного препарата "Лонгидаза" в виде лиофилизата, выход 95%. Результаты анализа представлены в табл. 1 (пример 10).
Дозируя требуемое количество полученной субстанции в суппозиторные, мазевые или кремовые основы, получают соответственно суппозитории, кремы, мази, содержащие активную субстанцию. Также используется для приготовления инъекционной формы.
Предлагаемый непрерывный карбодиимидный метод позволяет исключить из процесса органические растворители позволяет упростить технологический процесс, повысить качество и выход целевого продукта, достичь высокого значения степени конъюгации, повысить устойчивость Лонгидазы® (в лиофилизованном и жидком виде) при воздействии на нее различных внешних факторов в процессе переработки и хранения.
Предлагаемые способы позволяют улучшить технологические процессы производства конъюгатов пролонгированного действия на основе носителей нового класса соединений в виде водорастворимых производных гетероциклических алифатических аминополимерных Ν-оксидов, содержащих в цепи
- 8 030139
азидные или карбоксильные группы, и нестабильных соединений белкового или иного характера, содержащих в своем составе активные аминные группы. Способ имеет большое практическое значение в обеспечении фармацевтического производства пролонгированными медицинскими препаратами, которые широко востребованы на рынке медицинских препаратов, а также может быть использован для приготовления ветеринарных лекарственных средств. Разработанные технологические процессы в перспективе могут быть широко использованы для решения многих насущных проблем в различных отраслях народного хозяйства страны в целом.

Claims (10)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1,4-этиленпиперазина, с использованием карбодимидного или азидного метода конъюгации, очистки и лиофильной сушки, отличающийся тем, что для конъюгации используют водорастворимый сополимер Ν-оксида 1,4-этиленпиперазина, (Ы-карбоксиметилметил)-1,4-этиленпиперазиния или его гидразида и 1,4-этиленпиперазина общей формулы
где η - от 40 до 90% от общего количества звеньев, т - от 3 до 40% от общего количества звеньев, η + т + 1 = 100%,
полученный из поли-1,4-этиленпиперазина путем окисления, алкилирования и в случае азидного метода гидразинолиза, причем окисление проводят окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, а алкилирование проводят низшей галогеналкановой кислотой или ее алкиловым эфиром.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию окисления проводят с добавлением 1-10%, предпочтительно 3-6 мас.% мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для конъюгации используют гиалуронидазу из семенников животного происхождения.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют поэтапную очистку путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа.
5. Способ получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1,4-этиленпиперазина, с использованием азидного метода конъюгации, очистки, концентрирования и разбавления или лиофильного высушивания, отличающийся тем, что для конъюгации используют водорастворимый сополимер Ν-оксида 1,4-этиленпиперазина, гидразид (Ы-карбоксиметил)-1,4этиленпиперазиния и 1,4-этиленпиперазина общей формулы
где η - от 40 до 90% от общего количества звеньев, т - от 3 до 20% от общего количества звеньев, η + т + 1 = 100%,
полученный из поли-1,4-этиленпиперазина путем окисления, алкилирования и гидразинолиза, причем окисление проводят окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, алкилирование проводят алкиловым эфиром галогеналкановой кислоты, где стадии алкилирования и гидразинолиза совмещены.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что стадию окисления проводят с добавлением 1-10%, предпочтительно 3-6 мас.% мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что очистка представляет собой трехкратную поэтапную отмывку очищенной водой на полупроницаемых кассетах с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа после завершения стадий окисления, алкилирования и гидразинолиза и конъюгации.
8. Способ по п.5, отличающийся тем, что для конъюгации используют водорастворимый сополимер, содержащий в своей цепи гидразидные группы в количестве 3-20%.
- 9 030139
используют водорастворимый сополимер Ν-оксида 1,4-этиленпиперазина, (К-карбоксиметил)-1,4этиленпиперазиния и 1,4-этиленпиперазина общей формулы
где η - от 40 до 90% от общего количества звеньев, т - от 3 до 40% от общего количества звеньев, η + т + 1 = 100%,
полученный из поли-1,4-этиленпиперазина путем алкилирования и окисления в водной среде, причем окисление проводят окислителем, способным образовывать атомарный кислород в нормальных условиях в присутствии мочевины, а алкилирование проводят галогеналкановой кислотой.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадию окисления проводят с добавлением 1-10%, предпочтительно 3-6 мас.% мочевины в расчете на общую массу реакционной смеси, включая воду.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что очистку осуществляют поэтапно путем отмывки очищенной водой на полупроницаемых кассетах с нижним пределом отсекания частиц от 1 до 30 кДа после завершения стадии получения сополимера и конъюгации.
13. Способ по п.10, отличающийся тем, что в процессе используют водорастворимый сополимер, содержащий в своей цепи до 25% карбоксильных групп.
14. Способ по п.10, отличающийся тем, что на стадии конъюгации используют водорастворимые карбодиимиды в количестве от 3 до 50 мас.% от взятого в реакции белка.
15. Лекарственное средство, обладающее свойствами подавления гиперплазии соединительной ткани и противовоспалительным действием, полученное способом по любому из пп.1-14, в форме суппозитория, мази, инъекции или косметического крема.
Таблица 1
Результаты аналитического контроля серий конъюгата гиалуронидазы с сополимером Ν-оксида 1,4этиленпиперазина и ^-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний галогенида, полученные в примерах 1-10
Технологическ ий способ получения Ферментативная активность на момент получения, МЕ/мг препарата Ферментативная активность после 1 года хранения *\ МЕ/мг препарата Падение ферментативн ой активности в течение 1 года, % Степень конъюгаци и, % Выход целевого продукта, % Полученные лекарственные формы с Лонгидазой ПРИМЕР 1 221 212 4 85 86 суппозитории ПРИМЕР 2 230 219 5 84 84 крем, мазь ПРИМЕРЗ 242 230 5 86 87 инъекции ПРИМЕР 4 без мочевины 168 123 27 65 74 инъекции ПРИМЕР 5 промышленная серия 4 кг 235 221 6 85 87 суппозитории инъекции крем, мазь ПРИМЕР 6 265 254 4 96 97 суппозитории ПРИМЕР 7 280 266 5 99 98 крем ПРИМЕР 8 275 264 4 99 98 инъекции ПРИМЕР 9 без мочевины 175 133 24 85 82 инъекции ПРИМЕР 10 промышленная серия 4 кг 289 272 6 97 95 суппозитории инъекции крем, мазь
*) Хранение при 2-8°С.
9. Способ по п.5, отличающийся тем, что конъюгацию проводят при температуре от 0 до 25°С.
10. Способ получения активного конъюгата фермента гиалуронидазы с сополимером, содержащим Ν-оксид 1,4-этиленпиперазина, с использованием карбодиимидного метода конъюгации, очистки, концентрирования, разбавления или лиофильного высушивания, отличающийся тем, что для конъюгации
- 10 030139
Таблица 2
Изучение стабильности при длительном хранении лонгидазы, полученной с использованием мочевины (примеры 3 и 8) и без использования мочевины (пример 9), по показателю свободный белок
Т ехно логический способ получения ПРИМЕР 3 ПРИМЕР 8 Свободный белок, % На момент получения 14 1 3 месяца 15 1 6 месяцев 16 2 9 месяцев 16 2 12 месяцев 17 3 ПРИМЕР 9 (без мочевины) 15 26 30 32 33
Кривая ДСК образца сополимера серии 050614 (более стабильный образец и конъюгаты на его основе) в атмосфере чистого азота.
Сополимер получали с использованием мочевины на стадии окисления
Кривая ДСК образца сополимера серии 111114 (менее стабильный образец) в атмосфере чистого азота. Полимер получали без использования мочевины на стадии окисления
EA201650048A 2015-12-04 2016-11-28 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата EA030139B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015152036A RU2616528C1 (ru) 2015-12-04 2015-12-04 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201650048A1 EA201650048A1 (ru) 2017-06-30
EA030139B1 true EA030139B1 (ru) 2018-06-29

Family

ID=58642685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201650048A EA030139B1 (ru) 2015-12-04 2016-11-28 Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата

Country Status (19)

Country Link
US (1) US11364283B2 (ru)
EP (1) EP3384917B1 (ru)
JP (1) JP6683827B2 (ru)
KR (2) KR102358980B1 (ru)
CN (1) CN108697732B (ru)
AR (1) AR108562A1 (ru)
CA (1) CA3007389C (ru)
EA (1) EA030139B1 (ru)
GE (1) GEP20207131B (ru)
HK (1) HK1259290A1 (ru)
HU (1) HUE056845T2 (ru)
LT (1) LT3384917T (ru)
MD (1) MD4637C1 (ru)
RS (1) RS62659B1 (ru)
RU (1) RU2616528C1 (ru)
SI (1) SI3384917T1 (ru)
TR (1) TR201807851T1 (ru)
UA (1) UA121425C2 (ru)
WO (1) WO2017095264A1 (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019006398A2 (en) * 2017-06-29 2019-01-03 University Of Washington MONOMERS OF N-OXIDE AND ECTOIN, POLYMERS, COMPOSITIONS THEREOF, AND RELATED METHODS
RU2737271C2 (ru) * 2018-06-27 2020-11-26 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения
CN111978404A (zh) * 2020-08-11 2020-11-24 西北大学 基于Halo-tag特异性脱卤反应的蛋白质一步定向固定化方法
KR102481458B1 (ko) 2021-12-15 2022-12-27 홍재혁 문신기구

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
US5811100A (en) * 1993-09-10 1998-09-22 Petrovax, Inc. Compounds for the prevention and treatment of helmith infections
RU2185388C2 (ru) * 2000-06-28 2002-07-20 Карапутадзе Темури Мусаевич Способ получения поли-1,4-этиленпиперазина и его производных

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2801723B2 (ja) 1990-01-26 1998-09-21 花王株式会社 新規ベタイン及びそれを含有する分散剤
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
NZ601248A (en) * 2008-04-14 2014-06-27 Halozyme Inc Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
RU2417097C2 (ru) * 2008-04-24 2011-04-27 Валерия Леонидовна Багирова Фармацевтическая композиция, содержащая гиалуронидазу и липосомы для наружного применения
RU2428991C9 (ru) 2010-06-24 2011-12-27 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Сополимеры гетероцепных алифатических поли-n-оксидов, вакцинирующие и лекарственные средства на их основе
RU2556378C2 (ru) * 2013-07-11 2015-07-10 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" Конъюгат гликопротеина, обладающего активностью эритропоэтина, с производными n-оксида поли-1,4-этиленпиперазина (варианты), фармацевтическая композиция и способ получения конъюгата

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811100A (en) * 1993-09-10 1998-09-22 Petrovax, Inc. Compounds for the prevention and treatment of helmith infections
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
RU2185388C2 (ru) * 2000-06-28 2002-07-20 Карапутадзе Темури Мусаевич Способ получения поли-1,4-этиленпиперазина и его производных

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019501217A (ja) 2019-01-17
HK1259290A1 (zh) 2019-11-29
CN108697732A (zh) 2018-10-23
RU2616528C1 (ru) 2017-04-17
WO2017095264A1 (ru) 2017-06-08
LT3384917T (lt) 2021-11-25
UA121425C2 (ru) 2020-05-25
KR102358980B1 (ko) 2022-02-08
KR20200131355A (ko) 2020-11-23
MD4637B1 (ru) 2019-06-30
EP3384917B1 (en) 2021-09-15
EP3384917A4 (en) 2019-09-04
MD20180043A2 (ru) 2018-11-30
SI3384917T1 (sl) 2022-01-31
JP6683827B2 (ja) 2020-04-22
CA3007389A1 (en) 2017-06-08
HUE056845T2 (hu) 2022-03-28
EP3384917A1 (en) 2018-10-10
GEP20207131B (en) 2020-07-10
RS62659B1 (sr) 2021-12-31
CA3007389C (en) 2021-01-12
CN108697732B (zh) 2021-02-26
TR201807851T1 (tr) 2018-06-21
KR20180090339A (ko) 2018-08-10
US20180344815A1 (en) 2018-12-06
AR108562A1 (es) 2018-09-05
MD4637C1 (ru) 2020-01-31
US11364283B2 (en) 2022-06-21
EA201650048A1 (ru) 2017-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030139B1 (ru) Способ получения конъюгата гиалуронидазы с производными полиэтиленпиперазина и применение полученного конъюгата
RU2558847C9 (ru) Стерилизация биоразлагаемых гидрогелей
DE2247163A1 (de) Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung
JP2019501217A5 (ru)
Moise et al. Physicochemical study for characterization of lyophilized collagens irradiated with gamma radiation and for optimization of medical device manufacturing process
EP2207819B1 (en) Anti-microbial polymers and their compositions
Dambrova et al. EPR investigation of in vivo inhibitory effect of guanidine compounds on nitric oxide production in rat tissues
JP6247687B2 (ja) 疎水性タンパク質の新規放出システム
Heer et al. Novel excipients as different polymers: a review
JP3097247B2 (ja) アルギン酸・トロンビン固定化物、その製法および止血剤
RU2791737C1 (ru) Лиофилизированная композиция ингибитора РНК полимеразы для лечения инфекционного перитонита кошек, вызываемого кошачьим коронавирусом
SU523908A1 (ru) -Окись полиэтиленпиперазина
Vukajlovic et al. Mathematical modelling of genipin-bovine serum albumin interaction using fluorescence intensity measurements
US3262847A (en) Calcium salt of dextran for treating cattle delivery paresis
SU561725A1 (ru) Полимерные производные 5-(5-оксотетрагидрофурил-3-метил)-имидазола дл использовани в качестве препаратов м-холиномиметического действи
Urinova et al. Study of immobilization of bolaform ions on polymethacrylic acid
JPS58121792A (ja) 分子内架橋高分子ウロキナ−ゼ及びその製造法
KR100280938B1 (ko) 헤모글로빈 변성체를 함유하는 뇌졸증 치료제
Dan et al. Study on some characteristics of fish scale collagen modified by UV irradiation
CN118772440A (zh) 一种缓释l-肌肽的生物水凝胶的制备工艺和应用
EP4096639A1 (en) Hyperbranched polyester polyol derivative as drug solubilizer
CN1568308A (zh) 胍盐衍生物及其药物制剂组成
JPH01269490A (ja) 安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ
NL8105788A (nl) Werkwijze ter bereiding van een anti-tetanusvaccin.
CN109897112A (zh) 一种表皮生长因子活性肽及其制备与应用