EA036343B1

EA036343B1 - Увеличение биомассы трансгенных растений

Info

Publication number: EA036343B1
Application number: EA201791502A
Authority: EA
Inventors: Чуань-Инь У; Хан-Сук Ким; Джерард Магпантай; Фасун Чжоу; Джулисса Соса; Грег Надзан; Роджер И. Пеннелл; Мирсеа Эчирилоуи; Уи Ван
Original assignee: Серес, Инк.
Priority date: 2009-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2020-10-29
Also published as: AU2010276372B2; EA028373B1; EP2659771A1; BR112012001263A2; AU2010276372A1; CA3100454A1; CA2782251C; CN102573451A; EA201270181A1; WO2011011412A3; CA2782251A1; EP2461667A2; CA3208000A1; US20220056466A1; PL2659771T3; EA201791502A2; IN2012DN01454A; US11162108B2; US20180079789A1; EP2659771B1

Abstract

В описании изобретения раскрываются методы и материалы для модуляции уровней биомассы у растений. Например, в описании раскрываются нуклеиновые кислоты, которые кодируют модулирующие биомассу полипептиды, а также методы использования таких нуклеиновых кислот для трансформации растительных клеток. Также в описании раскрываются растения, имеющие увеличенный уровень биомассы, и растительные продукты, полученные из растений, имеющих увеличенный уровень биомассы.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки

В настоящей заявке изложены преимущества предварительной заявки США, серийный номер

61/226969, поданной 20 июля 2009 г. Раскрытие предварительной заявки включено путем ссылки в полном объеме.

Область техники

Настоящий документ касается методов и материалов, применяемых при модуляции уровня биомассы растений. В настоящем документе приведены примеры растений, увеличивших уровень биомассы, а также материалов и методов, с помощью которых было достигнуто увеличение биомассы растений и продуктов растительного происхождения.

Предпосылки создания изобретения

Изобретение относится к методам увеличения биомассы растений и самих растений, которые получены с их помощью. Растения с увеличенной биомассой и/или биомассой повышенной ценности пригодны для использования в сельском хозяйстве, садоводстве, в качестве биомассы для преобразования энергии, производства бумаги, производства продуктов растительного происхождения и других отраслей промышленности. В частности, существует потребность в увеличении биомассы отдельных сельскохозяйственных культур, используемых в качестве источника энергии, например Panicum virgatum L. (просо), Miscanthus х gigantus (мискантус), Sorghum sp. и Saccharum sp. (сахарный тростник). На протяжении истории человечества возможность использования растительной биомассы в качестве пищи и топлива имела существенное значение для поддержания и увеличения численности популяции. Ученые непрерывно ищут пути повышения ценности биомассы сельскохозяйственных культур. Большое количество исследований, относящихся к увеличению биомассы растений, в частности отдельных сельскохозяйственных культур, используемых в качестве источника энергии, свидетельствует об огромном значении, которое придается обеспечению населения надежными источниками энергии. Острая необходимость в создании надежных и стабильных источников растительной биомассы, используемой для получения энергии, диктуется текущими событиями, такими как рост цен на нефть. Объем биомассы, продуцируемой растениями, является количественным признаком, на который оказывает влияние ряд биохимических путей. Существует потребность в молекулярно-генетических методах более быстрого получения растений с увеличенной биомассой. Кроме того, существует необходимость в получении видов растений, которые растут более эффективно и продуцируют большее количество биомассы в различных географических и/или климатических условиях. Такие методы желательно применять к нескольким видам растений (Zhang et al., Plant Physiol. 135: 615-621 (2004)). Несмотря на определенный прогресс в молекулярногенетических методах, также существует необходимость в определении специфических генов и/или последовательностей, которые можно использовать для эффективного увеличения биомассы растений.

Краткое изложение

В настоящем документе приведены методы и материалы, относящиеся к растениям с модулированным уровнем биомассы. Например, в настоящем документе представлены трансгенные растения и растительные клетки с увеличенным уровнем биомассы, нуклеиновые кислоты, используемые для получения трансгенных растений и растительных клеток с увеличенным уровнем биомассы, методы увеличения биомассы растений и методы производства растительных клеток, которые можно использовать для получения растений с увеличенным уровнем биомассы. Такие растения и растительные клетки можно выращивать, например, для получения растений с увеличенной высотой, увеличенным количеством побегов или увеличенным сухим весом. Растения с увеличенной биомассой могут быть полезны для производства биомассы, которая может использоваться как в качестве пищи для человека, так и в качестве корма для животных. Растения с увеличенной биомассой могут быть полезны при превращении такой биомассы в жидкое топливо (например, этанол) или другие химические вещества либо могут использоваться в качестве термохимического топлива.

В настоящем документе представлены методы получения растений с увеличенной биомассой. С одной стороны, метод включает в себя выращивание растительной клетки с экзогенной нуклеиновой кислотой. Экзогенная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, которая функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид. Показатель аминокислотной последовательности полипептида по скрытой марковской модели (Hidden Markov Model, HMM) больше 130, 340, 530, 120, 635, 65, 100, 480, 145, 280 или 1000, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных, соответственно, на фиг. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Уровень биомассы растения отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, которое не содержит экзогенной нуклеиновой кислоты.

С другой стороны, метод включает в себя выращивание растительной клетки, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту. Экзогенная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, которая функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательностях SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117,

- 1 036343

118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 149, 151,

152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 185,

186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207, 209, 210, 212, 214, 216, 218,

220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,

253, 255, 257, 259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287, 289,

291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312, 314, 315, 317, 319,320,

321, 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 354,356,

357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 391, 393, 395,397,

399, 401, 403, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 429, 430,431,

433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 459,461,

463, 464, 466, 467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486, 488, 490, 492, 493, 495,497,

499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526, 528,529,

531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 563,565,

567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 598, 600, 602, 603,604,

605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633, 634,636,

637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669,670,

671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697. Растение, полученное из растительной клетки, может быть использовано для генерации растения, уровень биомассы которого отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота.

С другой стороны, метод включает в себя выращивание растительной клетки, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту. Экзогенная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, которая функционально связана с нуклеотидной последовательностью, имеющей идентичность последовательности 80% или более по отношению к нуклеотидной последовательности (или ее фрагменту), представленной в последовательностях SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187,

192, 197, 199, 201, 205, 208, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 240,252,

254, 256, 258, 260, 262, 265, 267, 270, 272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303, 307, 309,313,

316, 318, 322, 325, 328, 330, 333, 335, 339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362, 364, 366,368,

370, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410, 412, 414,419,

423, 425, 427, 432, 434, 441, 443, 445, 451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481, 485, 487,489,

491, 494, 496, 498, 505, 507, 510, 512, 514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544, 546, 548,553,

555, 557, 559, 561, 564, 566, 568, 570, 572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 599,601,

607, 612, 614, 617, 621, 624, 626, 628, 631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661, 663, 665,668,

678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 690, 692, 694 или 696. Уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота.

В настоящем документе представлены методы модуляции уровня биомассы растения. С одной стороны, метод заключается во введении в растительную клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, имеющей регуляторную область, которая функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид. Показатель аминокислотной последовательности полипептида НММ больше 130, 340, 530, 120, 635, 65, 100, 480, 145, 280 или 1000, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных, соответственно, на фиг. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Уровень биомассы растение, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 340, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 2, в которых полипептид содержит ДНК-связывающий домен цинковые пальцы, имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 130-192 последовательности SEQ ID NO: 263, или ДНК-связывающий домен цинковые пальцы, обозначенный в перечне последовательностей.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 530, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 3, в которых полипептид содержит домен фитохелатин-синтетаза, имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 44-208 последовательности SEQ ID NO: 117, или домены фитохелатин-синтетаза, обозначенные в перечне последовательностей.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 120, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 4, в которых полипептид содержит домен АР2, имеющий идентичность последова- 2 036343 тельности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 3283 последовательности SEQ ID NO: 1, или домены АР2, обозначенные в перечне последовательностей.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 635, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 5, в которых полипептид содержит домен аминотрансфераза класса I и II, имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 88-453 последовательности SEQ ID NO: 645, или домены аминотрансфераза класса I и II, обозначенные в перечне последовательностей.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 100, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 7, в которых полипептид содержит ДНК-связывающий домен семейства Myb, имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 13-62 последовательности SEQ ID NO: 323, или ДНК-связывающие домены семейства Myb, обозначенные в перечне последовательностей.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 480, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 8, в которых полипептид содержит домен альфа/бета-складки гидролазы, имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 35-257 последовательности SEQ ID NO: № 595.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 145, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 9, в которых полипептид содержит домен фактор быстрого подщелачивания (ФБП), имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 57-129 последовательности SEQ ID NO: 77, или домены ФБП, обозначенные в перечне последовательностей.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 280, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 10, в которых полипептид содержит домен белка (DUF640) с неизвестной функцией, имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 19-152 последовательности SEQ ID NO: 209, или домены DUF640, обозначенные в перечне последовательностей.

В некоторых вариантах показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида превышает 1000, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 11, в которых полипептид содержит домен семейства РОТ, имеющий идентичность последовательности не менее 60% (например, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100%) по отношению к остаткам 100-509 последовательности SEQ ID NO: 426, или домены семейства РОТ, обозначенные в перечне последовательностей.

С другой стороны, метод включает внедрение в растительную клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, которая содержит регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, с идентичностью последовательности 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательностях SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135,

137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166,168,

169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 185, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200,202,

203, 204, 206, 207, 209, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239,241,

242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271,273,

275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304,305,

306, 308, 310, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336, 337,338,

340, 342, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 354, 356, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 372, 374, 376,378,

380, 382, 384, 386, 388, 390, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 415, 416,417,

418, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 429, 430, 431, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447,448,

449, 450, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 459, 461, 463, 464, 466, 467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479,480,

482, 483, 484, 486, 488, 490, 492, 493, 495, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513,515,

516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526, 528, 529, 531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547,549,

550, 551, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585,587,

589, 591, 593, 595, 597, 598, 600, 602, 603, 604, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619,620,

622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652,653,

655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697. Уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота. По- 3 036343 липептид в любом из вышеуказанных методов может иметь аминокислотную последовательность, представленную в последовательностях SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25,

27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71,

72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117,

152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182, 184,185,

186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207, 209, 210, 212, 214, 216,218,

220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250,251,

253, 255, 257, 259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287,289,

671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697.

С другой стороны, метод включает внедрение в растительную клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, которая содержит регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая на 80% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в последовательностях SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192,

197, 199, 201, 205, 208, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 252,254,

256, 258, 260, 262, 265, 267, 270, 272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303, 307, 309, 313,316,

318, 322, 325, 328, 330, 333, 335, 339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362, 364, 366, 368,370,

373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410, 412, 414, 419,423,

425, 427, 432, 434, 441, 443, 445, 451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481, 485, 487, 489,491,

494, 496, 498, 505, 507, 510, 512, 514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544, 546, 548, 553,555,

557, 559, 561, 564, 566, 568, 570, 572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 599, 601,607,

612, 614, 617, 621, 624, 626, 628, 631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661, 663, 665, 668,678,

679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 690, 692, 694 или 696 или ее фрагменту. Уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота.

В настоящем документе приведены данные о растительных клетках, содержащих экзогенную нуклеиновую кислоту. С одной стороны, экзогенная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, которая функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид. Показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида больше 130, 340, 530, 120, 635, 65, 100, 480, 145, 280 или 1000, если использовать показатели НММ, полученные из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Уровень биомассы растения отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, которое не содержит экзогенной нуклеиновой кислоты. С другой стороны, экзогенная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, которая функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, с идентичностью последовательности 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147,

149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180,182,

184, 185, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207, 209, 210, 212,214,

216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248,249,

250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283,285,

287, 289, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312, 314, 315,317,

319, 320, 321, 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 349, 351,353,

354, 356, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 391,393,

395, 397, 399, 401, 403, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422, 424, 426, 428,429,

430, 431, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453, 454, 455, 456,457,

459, 461, 463, 464, 466, 467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486, 488, 490, 492,493,

- 4 036343

495, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526,

528, 529, 531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554, 556, 558, 560, 562,

563, 565, 567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 598, 600, 602,

603, 604, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633,

634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667,

669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697. Уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота.

С другой стороны, экзогенная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью с идентичностью последовательности 80% или более по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192, 197, 199, 201, 205, 208, 211, 213,

215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 265, 267,270,

272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303, 307, 309, 313, 316, 318, 322, 325, 328, 330, 333,335,

339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 373, 375, 377, 379, 381, 383,385,

387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410, 412, 414, 419, 423, 425, 427, 432, 434, 441, 443,445,

451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481, 485, 487, 489, 491, 494, 496, 498, 505, 507, 510,512,

514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544, 546, 548, 553, 555, 557, 559, 561, 564, 566, 568,570,

572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 599, 601, 607, 612, 614, 617, 621, 624, 626,628,

631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661, 663, 665, 668, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684,685,

686, 687, 688, 690, 692, 694 или 696 или ее фрагменту. Уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота. Также представлено трансгенное растение, содержащее такую растительную клетку. Кроме того, представлена растительная биомасса или семенная продукция. Данная продукция включает растительную или эмбриональную ткань трансгенного растения, описанного в настоящем документе.

Также представлены изолированные нуклеиновые кислоты. С одной стороны, изолированная нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидную последовательность, имеющую идентичность последовательности 80% или более по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательностях SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192, 197,

199, 201, 205, 208, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 252, 254,256,

258, 260, 262, 265, 267, 270, 272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303, 307, 309, 313, 316,318,

322, 325, 328, 330, 333, 335, 339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370,373,

375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410, 412, 414, 419, 423,425,

427, 432, 434, 441, 443, 445, 451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481, 485, 487, 489, 491,494,

496, 498, 505, 507, 510, 512, 514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544, 546, 548, 553, 555,557,

559, 561, 564, 566, 568, 570, 572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 599, 601, 607,612,

614, 617, 621, 624, 626, 628, 631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661, 663, 665, 668, 678,679,

680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 690, 692, 694 или 696. С другой стороны, изолированная нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий идентичность последовательности 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательностях SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147,

495, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523, 525,526,

528, 529, 531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554, 556, 558, 560,562,

563, 565, 567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 598, 600,602,

- 5 036343

669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697.

С другой стороны, представлены методы идентификации генетического полиморфизма, связанного с изменением уровня биомассы. Методы включают представление популяции растений и определение того, связаны ли с генетической точки зрения один или более генетических полиморфизмов с локусом полипептида, выбранного из группы полипептидов, показанных на фиг. 1-11, и их функциональными гомологами. Производится измерение корреляции между изменением уровня биомассы в тканях растений популяции и наличием одного или более генетических полиморфизмов у растений популяции, что позволяет определить, связаны ли один или более генетических полиморфизмов с таким изменением.

С другой стороны, представлены методы создания линии растений. Методы включают определение того, связаны ли один или более генетических полиморфизмов в популяции растений с локусом одного или нескольких полипептидов, показанных на фиг. 1-11, и функциональными гомологами таких полипептидов. В популяции определяется одно или несколько растений, у которых наличие как минимум одного генетического полиморфизма связано с изменением характеристики биомассы. Описанные выше шаги могут выполняться в любом порядке. Затем одно или несколько из определенных растений самовоспроизводятся или скрещиваются с другим растением для получения семян, как минимум одно потомственное растение, выращенное из такого семени, самовоспроизводится или скрещивается с другим растением. Шаги самоопыления и ауткроссинга повторяются у последующих поколений 0-5 для создания линии растений, у которых присутствует как минимум один полиморфизм. Характеристикой биомассы может служить выход сухого вещества, а в качестве популяции растений могут быть использованы растения проса.

В настоящем документе также описан метод изменения уровня биомассы у растения. Метод включает модификацию модулирущей биомассу эндогенной нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность с открытой рамкой считывания, имеющую идентичность последовательности 80% или более по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181,

183, 187, 192, 197, 199, 201, 205, 208, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235,237,

240, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 265, 267, 270, 272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303,307,

309, 313, 316, 318, 322, 325, 328, 330, 333, 335, 339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362,364,

366, 368, 370, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410,412,

414, 419, 423, 425, 427, 432, 434, 441, 443, 445, 451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481,485,

487, 489, 491, 494, 496, 498, 505, 507, 510, 512, 514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544,546,

548, 553, 555, 557, 559, 561, 564, 566, 568, 570, 572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594,596,

599, 601, 607, 612, 614, 617, 621, 624, 626, 628, 631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661,663,

665, 668, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 690, 692, 694 и 696. Уровень биомассы растения отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором нуклеиновая кислота не модифицирована. Модификацию можно осуществить путем проведения генетической модификации в локусе, содержащем нуклеиновую кислоту. Далее метод может включать отбор растений с измененной биомассой.

В некоторых вариантах эндогенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий идентичность последовательности 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 149,

151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182,184,

185, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207, 209, 210, 212, 214,216,

218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249,250,

251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285,287,

289, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312, 314, 315, 317,319,

320, 321, 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 349, 351, 353,354,

356, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 391, 393,395,

397, 399, 401, 403, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 429,430,

431, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453, 454, 455, 456, 457,459,

461, 463, 464, 466, 467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486, 488, 490, 492, 493,495,

497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526,528,

529, 531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554, 556, 558, 560, 562,563,

565, 567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 598, 600, 602,603,

604, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633,634,

- 6 036343

636, 637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669,

670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 и 697.

В некоторых вариантах эндогенная нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидную последовательность с открытой рамкой считывания и идентичностью последовательности 90% или более по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192, 197, 199, 201, 205, 208, 211, 213, 215,

217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 265, 267, 270,272,

274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303, 307, 309, 313, 316, 318, 322, 325, 328, 330, 333, 335,339,

341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385,387,

389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410, 412, 414, 419, 423, 425, 427, 432, 434, 441, 443, 445,451,

458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481, 485, 487, 489, 491, 494, 496, 498, 505, 507, 510, 512,514,

520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544, 546, 548, 553, 555, 557, 559, 561, 564, 566, 568, 570,572,

576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 599, 601, 607, 612, 614, 617, 621, 624, 626, 628,631,

635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661, 663, 665, 668, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685,686,

687, 688, 690, 692, 694 и 696.

В некоторых вариантах эндогенная нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидную последовательность с открытой рамкой считывания и идентичностью последовательности 95% или более по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192, 197, 199, 201, 205, 208, 211, 213, 215,

687, 688, 690, 692, 694 и 696.

В настоящем документе также описан метод получения растения. Метод включает выращивание растительной клетки, содержащей модифицированную эндогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, у которого показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида больше 65 (показатели НММ получены из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1-11), при котором уровень биомассы растения отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором нуклеиновая кислота не модифицирована.

С другой стороны, в настоящем документе приведено описание растительной клетки, содержащей модифицированную эндогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, у которого показатель НММ аминокислотной последовательности полипептида больше 65 (показатели НММ получены из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1-11), при котором уровень биомассы растения, полученного из растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором нуклеиновая кислота не модифицирована.

В настоящем документе также приведено описание растительной клетки, содержащей модифицированную эндогенную нуклеиновую кислоту, модулирующую биомассу. Нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность с открытой рамкой считывания и идентичностью последовательности 80% или более по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192, 197, 199,

201, 205, 208, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 252, 254, 256,258,

260, 262, 265, 267, 270, 272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303, 307, 309, 313, 316, 318,322,

325, 328, 330, 333, 335, 339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 373,375,

377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410, 412, 414, 419, 423, 425,427,

432, 434, 441, 443, 445, 451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481, 485, 487, 489, 491, 494,496,

498, 505, 507, 510, 512, 514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544, 546, 548, 553, 555, 557,559,

561, 564, 566, 568, 570, 572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 599, 601, 607, 612,614,

617, 621, 624, 626, 628, 631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661, 663, 665, 668, 678, 679,680,

681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 690, 692, 694 и 696. Уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором нуклеиновая кислота не модифицирована.

- 7 036343

У растительной клетки, описанной в настоящем документе, эндогенная нуклеиновая кислота может кодировать полипептид, имеющий идентичность последовательности 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135,

655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 и 697, и при этом уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором нуклеиновая кислота не модифицирована.

С другой стороны, в настоящем документе приведено описание метода модуляции уровня биомассы у растения. Метод включает интродукцию в растительную клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, при этом экзогенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид с активным ферментом Е.С. 2.6.1.83.

Также приведено описание растительной клетки, которая содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, при этом экзогенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид с активным ферментом Е.С. 2.6.1.83, в результате чего уровень биомассы растения, полученного из такой растительной клетки, отличается от соответствующего уровня биомассы контрольного растения, в котором отсутствует нуклеиновая кислота.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, как его обычно понимают специалисты с обычной квалификацией, работающие в области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то что при практическом использовании изобретения могут применяться методы и материалы, сходные с теми или аналогичные тем, которые описаны в настоящем документе, ниже приведено описание подходящих методов и материалов. Все публикации, заявки на патент, патенты и прочие ссылочные материалы, приведенные в настоящем документе, включены путем ссылки в полном объеме. В случае противоречия преимущественную силу имеет настоящее описание изобретения, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры носят исключительно иллюстративный характер и не устанавливают ограничений.

Детали одного или более вариантов осуществления изобретения изложены ниже в сопроводительных чертежах и описании. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут продемонстрированы в описании, чертежах и пунктах формулы изобретения. Слово включающий в пунктах формулы изобретения может быть заменено на состоящий главным образом из или состоящий из согласно общепринятой практике патентного права.

Описание чертежей

На фиг. 1 представлено выравнивание аминокислотной последовательности CW00733, соответствующей Ceres Clone: 1384304 (SEQ ID NO: 554) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями. На всех фигурах с линейной последовательностью, показанных в настоящем документе, тире в построенной в линию последовательности обозначает делецию, т.е. отсутствие аминокислоты в данном месте. Идентичные аминокислоты или консервативные заменители аминоскислот среди выровненных последовательностей обозначены прямоугольниками. Фиг. 1 и другие фигуры с линейной последовательностью, приведенные в настоящем документе, созданы с помощью программы MUSCLE версии 3.52;

на фиг. 2 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00319, соответствующей Ceres Annot: 544549 (SEQ ID NO: 263) с гомологическими и/или ортологическими последовательностями аминокислот;

на фиг. 3 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00710, соответствующей Ceres Annot: 1355066 (SEQ ID NO: 117) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 4 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00628, соответствующей анти- 8 036343 смысловой последовательности Os01g58420 (SEQ ID NO: 1) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 5 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00297, соответствующей Ceres

Clone: 625057 (SEQ ID NO: 645) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 6 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00604, соответствующей Ceres Clone: 1356785 (SEQ ID NO: 253) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 7 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00564, соответствующей Ceres Clone: 638126 (SEQ ID NO: 323) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 8 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00010, соответствующей Ceres Clone: 26006 (SEQ ID NO: 595) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 9 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00469, соответствующей Ceres Clone: 4831 (SEQ ID NO: 77) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 10 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00536, соответствующей Ceres Annot: 847799 (SEQ ID NO: 209) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями;

на фиг. 11 - выравнивание аминокислотной последовательности CW00191, соответствующей Ceres Annot: 878355 (SEQ ID NO: 426) с гомологическими и/или ортологическими аминокислотными последовательностями.

Подробное описание

В изобретении приведено описание методов и материалов, относящихся к модуляции уровня биомассы растений. В некоторых вариантах растения могут также иметь модулированный уровень, например, лигнина, модифицированную архитектуру корневой системы, модифицированную гербицидную устойчивость, модифицированный биосинтез каротеноидов или модулированный состав клеточной оболочки. Методы могут включать трансформацию растительной клетки, при которой нуклеиновая кислота кодирует модулирующий биомассу полипептид, в результате чего экспрессия полипептида приводит к модуляции уровня биомассы. Растительные клетки, продуцированные с использованием таких методов, могут выращиваться для получения растений с увеличенной или уменьшенной биомассой.

Такие растения и семена таких растений могут быть использованы, например, для производства биомассы, имеющей повышенную ценность, для использования в качестве исходного сырья для биотоплива.

I) Термины и определения.

Аминокислота относится к одной из двадцати аминокислот, встречающихся в природе, и к синтетическим аминокислотам, в том числе оптическим изомерам D- и L-форм.

Предпочтительный промотор клетки или предпочтительный промотор ткани относится к промотору, который преимущественно стимулирует экспрессию, соответственно, в клетке-мишени или ткани-мишени, однако также может привести к определенной транскрипции в клетках или тканях других типов.

Контрольное растение относится к растению, которое не содержит экзогенной нуклеиновой кислоты, присутствующей в рассматриваемом трансгенном растении, однако в остальном имеет такое же или подобное генетическое окружение, что и трансгенное растение. Подходящим контрольным растением может быть нетрансгенное растение дикого типа, нетрансгенный сегрегант, полученный в результате эксперимента по трансформации, или трансгенное растение, которое содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, отличающуюся от рассматриваемой экзогенной нуклеиновой кислоты.

Домены - это группы в основном заменимых аминокислот в полипептиде, которые могут быть использованы для описания семейств белков и/или частей белков. Такие домены имеют отпечаток пальцев или сигнатуру, которые могут включать в себя консервативную первичную последовательность, вторичную структуру и/или трехмерную конформацию. Как правило, домены связаны с деятельностью in vitro и/или in vivo. Длина домена может быть от 10 до 400 аминокислот, например 10-50 аминокислот, или 25-100 аминокислот, или 35-65 аминокислот, или 35-55 аминокислот, или 45-60 аминокислот, или 200-300 аминокислот, или 300-400 аминокислот.

Понижающая регуляция относится к регуляции, которая снижает продуцирование продуктов экспрессии (мРНК, полипептида или обоих) по отношению к базальному или нативному состоянию.

Экзогенный по отношению к нуклеиновой кислоте указывает на то, что нуклеиновая кислота является частью рекомбинантной структуры нуклеиновой кислоты или что она не находится в своей естественной среде. Например, экзогенная нуклеиновая кислота может быть последовательностью от одного вида, интродуцированной в другой вид, т.е. гетерологичной нуклеиновой кислотой. В основном такую экзогенную нуклеиновую кислоту интродуцируют в другие виды через рекомбинантную конструкцию нуклеиновой кислоты. Экзогенная нуклеиновая кислота может также быть последовательностью, кото- 9 036343 рая является нативной для какого-либо организма и которая реинтродуцируется в клетки этого организма. Экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую нативную последовательность, можно часто отличить от последовательности, образовавшейся естественным путем, по наличию неприродных последовательностей, присоединенных к экзогенной нуклеиновой кислоте, например ненативных регуляторных последовательностей, примыкающих к нативной последовательности в рекомбинантной структуре нуклеиновой кислоты. Кроме того, устойчиво трансформированные экзогенные нуклеиновые кислоты обычно интегрированы в места, которые отличаются от тех мест, где находится нативная последовательность. Следует иметь в виду, что экзогенные нуклеиновые кислоты могут быть интродуцированы в клетку-предшественник, а не в рассматриваемую клетку. Например, трансгенное растение, содержащее экзогенную нуклеиновую кислоту, может быть потомством от скрещивания между устойчиво трансформированным растением и нетрансгенным растением. Считается, что такое потомство содержит экзогенную нуклеиновую кислоту.

Экспрессия относится к процессу преобразования генетической информации полинуклеотида в РНК путем транскрипции, которая катализируется ферментом полимеразой РНК, и в белок путем трансляции мРНК на рибосомах.

Г етерологичный полипептид для целей настоящего документа относится к полипептиду, который не является естественным для растительной клетки полипептидом, например трансгенное растение Panicum virgatum, трансформированное с помощью кодирующей последовательности и экспрессирующее кодирующую последовательность для полипептида, обеспечивающего транспорт азота из растения Zea mays.

Изолированная нуклеиновая кислота для целей настоящего документа включает природную нуклеиновую кислоту, при условии что одна или обе последовательности, непосредственно примыкающие к данной нуклеиновой кислоте в ее природном геноме, удалены или отсутствуют. Таким образом, изолированная нуклеиновая кислота включает, помимо прочего, нуклеиновую кислоту, которая существует в виде очищенной молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты, включенной в вектор или вирус. Нуклеиновая кислота, существующая среди сотен и миллионов других нуклеиновых кислот, например, в библиотеках кДНК, геномных библиотеках или гелевых срезах, содержащих фрагменты рестрикции геномной ДНК, не должна рассматриваться как изолированная нуклеиновая кислота.

Модуляция уровня биомассы относится к изменению уровня биомассы, которое наблюдается в результате экспрессии или транскрипции экзогенной нуклеиновой кислоты в растительной клетке и/или растении. Изменение уровня измеряется относительно соответствующего уровня у контрольных растений.

Нуклеиновая кислота и полинуклеотид в настоящем документе являются взаимозаменяемыми и относятся как к РНК, так и к ДНК, в том числе кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК и ДНК или РНК, содержащим аналоги нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной (т.е. кодирующей цепью или антисмысловой цепью). Неограниченные примеры полинуклеотидов включают гены, фрагменты генов, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомальную РНК, синтетическую РНК, микроРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может содержать нестандартные или модифицированные нуклеотиды.

Функционально связанный относится к размещению регуляторной области и последовательности, транскрибируемой в нуклеиновой кислоте, с тем чтобы регуляторная область была эффективной для регулирования транскрипции или трансляции последовательности. Например, чтобы функционально связать кодирующую последовательность и регуляторную область, сайт инициации трансляции трансляционной рамки считывания кодирующей последовательности обычно располагают между первым и пятидесятым нуклеотидом нижележащей регуляторной области. Однако регуляторная область может быть расположена примерно на 5000 нуклеотидов выше сайта инициации трансляции или примерно на 2000 нуклеотидов выше сайта инициации транскрипции.

Полипептид для целей настоящего документа относится к соединению из двух или более субъединичных аминокислот, аналогов аминокислот или других пептидомиметиков, независимо от посттрансляционных модификаций, например фосфорилирования или гликозилирования. Субъединицы могут быть связаны пептидными связями или другими связями, такими как, например, сложноэфирные или простые эфирные связи. Данное определение охватывает полноразмерные полипептиды, усеченные полипептиды, точечные мутанты, инсерционные мутанты, сплайс-варианты, химерные белки и их фрагменты.

Потомство включает потомков определенного растения или линии растений. Потомство скороспелого растения включает семена, сформированные на растениях поколений F1, F2, F3, F4, F5, F6 и последующих поколений, или семена, сформированные на растениях поколений ВС1, ВС2, BC3 и последующих поколений, или семена, сформированные на растениях поколений F1BC1, F1BC2, F1BC3 и последующих поколений. Обозначение F1 относится к потомству от скрещивания двух родительских организмов с четко выраженными генетическими признаками. Обозначения F2, F3, F4, F5 и F6 относятся к последующим поколениям потомков растения F1, полученным в результате самоопыления или переопыления.

Регуляторная область относится к нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидные последовательности, которые оказывают влияние на инициацию и скорость транскрипции или трансляции, а также на

- 10 036343 стабильность и/или подвижность продукта транскрипции или трансляции. Регуляторные области включают, помимо прочего, последовательности промотора, последовательности генов-усилителей, ответные элементы, участки распознавания белка, индуцируемые элементы, белок-связывающие последовательности, нетранслируемые области 5' и 3', сайты инициации транскрипции, терминирующие последовательности, последовательности полиаденилирования, интроны и их сочетания. Регуляторная область обычно включает как минимум коровый (базальный) промотор. Регуляторная область также может включать как минимум один управляющий элемент, такой как последовательность генов-усилителей, вышележащий элемент или вышележащая область активации. Например, подходящим геном-усилителем является цисдействующий регуляторный элемент (от -212 до -154) от вышележащей области гена октопин-синтазы (ocs). Fromm et al., The Plant Cell, 1:977-984 (1989).

Повышающая регуляция относится к регуляции, которая повышает уровень продукта экспрессии (мРНК, полипептида или обоих) по отношению к базальному или нативному состоянию.

Вектор относится к репликону, такому как плазмид, фаг или космида, в который может быть введен другой сегмент ДНК, чтобы добиться репликации введенного сегмента. Как правило, вектор способен к репликации, когда он связан с соответствующими управляющими элементами. Термин вектор включат клонирующий и экспрессионный векторы, а также вирусные векторы и интегрирующие векторы. Экспрессионный вектор - это вектор, который включает регуляторную область.

II) Полипептиды.

Полипептиды, описанные в настоящем документе, включают модулирующие биомассу полипептиды. Модулирующие биомассу полипептиды могут быть эффективными для модуляции уровней биомассы при экспрессировании в растении или растительной клетке. Такие полипептиды обычно содержат как минимум один домен, указывающий на модулирующие биомассу полипептиды, как подробно описано в настоящем документе. Модулирующие биомассу полипептиды обычно имеют показатель НММ более 65, как подробно описано в настоящем документе. В некоторых вариантах модулирующие биомассу полипептиды более чем на 80% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142,

144, 145, 146, 147, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174,

176, 178, 180, 182, 184, 185, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207,

209, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245,

246, 247, 248, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279,

281, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311,

312, 314, 315, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345,

347, 349, 351, 353, 354, 356, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386,

388, 390, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422,

424, 426, 428, 429, 430, 431, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453,

454, 455, 456, 457, 459, 461, 463, 464, 466, 467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486,

488, 490, 492, 493, 495, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519,

521, 523, 525, 526, 528, 529, 531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554,

556, 558, 560, 562, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595,

597, 598, 600, 602, 603, 604, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627,

629, 630, 632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660,

662, 664, 666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697, как более подробно описано в настоящем документе.

А. Домены, указывающие на модулирующие биомассу полипептиды.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать ДНК-связывающий домен цинковые пальцы (zf-Dof), который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида. SEQ ID NO: 263 устанавливает аминокислотную последовательность клона Arabidopsis, обозначенного в настоящем документе как Ceres Annot: 544549 (SEQ ID NO: 262), которая, предположительно, кодирует полипептид, содержащий ДНК-связывающий домен цинковые пальцы. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать ДНК-связывающий домен цинковые пальцы, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 130-192 последовательности SEQ ID NO: 263. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать ДНКсвязывающий домен цинковые пальцы, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к ДНК-связывающему домену цинковые пальцы одного или нескольких полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320 или 321. ДНК-связывающие домены цинковые пальцы таких последовательностей приводятся в перечне последовательностей. Домены цинковые пальцы (Znf) представляют собой относительно небольшие белковые мотивы, которые связывают один или несколько атомов цинка и которые обычно содержат несколько пальцевидных ответвлений, которые устанавливают контакт со

- 11 036343 своей молекулой-мишенью. Ранее они обозначались как ДНК-связывающий мотив в факторе транскрипции TFIIIA из Xenopus laevis, однако в настоящее время определено, что они связывают ДНК, РНК, белок и/или липидные субстраты. Их связывающие свойства зависят от аминокислотной последовательности доменов цинковые пальцы и от линкера между пальцами, а также от структур более высокого порядка и количества пальцев. Домены цинковые пальцы (Znf) часто находятся в кластерах, у которых пальцы имеют различную связывающую специфику. Существует множество суперсемейств мотивов Znf, отличающихся как по последовательности, так и по структуре. Они демонстрируют многообразие режимов связывания (например, некоторые связывают ДНК, другие - белок), что указывает на то, что мотивы Znf являются стабильными структурными каркасами, которые развили специализированные функции. Например, функцию Znf-содержащих белков в транскрипции и трансляции генов, направленный перенос мРНК, формирование клеточного скелета, развитие эпителиальных тканей, клеточную адгезию, укладку белка, реконструкцию хроматина, распознавание цинка и многие другие. Цинксвязывающие мотивы являются стабильными структурами и редко подвергаются конформационным изменениям при связывании своей мишени. Ортологи DOF 1.3 могут содержать ДНК-связывающие домены цинковые пальцы.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать домен фитохелатин-синтетаза, который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида. SEQ ID NO: 117 устанавливает аминокислотную последовательность клона Arabidopsis, обозначенного в настоящем документе как Ceres Annot: 1355066 (SEQ ID NO: 116), которая, предположительно, кодирует полипептид, содержащий домен фитохелатин-синтетаза. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать домен фитохелатин-синтетаза, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 44-208 последовательности SEQ ID NO: 117. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать область с доменом фитохелатин-синтетаза, имеющим идентичность последовательности 60% или более по отношению к области с доменом фитохелатин-синтетаза одного или нескольких полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 152, 153, 154, 155,

156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 185, 186, 188, 189, 190,

191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206 или 207. Области с доменом фитохелатин-синтетаза таких последовательностей устанавливаются в перечне последовательностей. Белок фитохелатинсинтетаза может быть ферментом, ответственным за синтез связывающих тяжелые металлы пептидов (фитохелатинов) из глутатиона и родственных тиолов. Фермент обычно катализирует деглицинацию молекулы-донора глутатиона (GSH). Фермент обычно содержит каталитическую триаду остатков цистеина, гистидина и аспартата.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать домен АР2, который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида. SEQ ID NO: 1 устанавливает аминокислотную последовательность клона Oryza sativa, обозначенного в настоящем документе как Os01g58420, который, предположительно, кодирует полипептид, содержащий домен АР2. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать домен АР2 с идентичностью последовательности 60% или более по отношению к остаткам 32-83 последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать домен АР2 с идентичностью последовательности 60% или более по отношению к домену АР2 одного или нескольких полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74 или 75.

Домены АР2 таких последовательностей устанавливаются в перечне последовательностей. В некоторых вариантах в растении экспрессируется антисмысловая последовательность, которая модулирует биомассу, как описано в настоящем документе. Например, для модуляции биомассы в растении может быть экспрессирована антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты Os01g58420, такая как последовательность SEQ ID NO: 678. Остатки аминокислоты домена АР2 могут связываться с ДНК и обычно находятся в белках-факторах транскрипции.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать домен аминотрансферазы класса I и II, который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида.

Последовательность SEQ ID NO: 645 устанавливает аминокислотную последовательность клона Glycine max, обозначенного в настоящем документе как Ceres Clone: 625057 (SEQ ID NO: 644), который, предположительно, кодирует полипептид, содержащий домен аминотрансферазы класса I и II. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать домен аминотрансферазы класса I и II, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 88-453 последовательности SEQ ID NO: 645. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать домен аминотрансферазы класса I и II, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к домену аминотрансферазы класса I и II одного или нескольких полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677 или 689. Домены аминотрансферазы класса I и II таких последовательностей приведены в перечне последовательностей. Аминотрансферазы имеют определенные конст

- 12 036343 руктивные особенности, общие с другими пиридоксальфосфат-зависимыми энзимами, например ковалентное связывание пиридоксальфосфатной группы с остатками лизина. На основе сходства последовательностей эти разнообразные ферменты можно сгруппировать в класс I и класс II. Примерами полипептидов, содержащих домены аминотрансферазы класса I и II, могут быть полипептиды LL-DAP (ЕС 2.6.1.83) (Watanabe et al., Mechanism of Substrate Recognition and PLP-induced Conformational Changes in LL-Diaminopimelate aminotransferase from Arabidopsis thaliana. J. Mol. Biol. 384, 1314-1329 (2008)). Полипептид LL-DAP катализирует взаимное превращение LL-2,6-диаминогепmaндиоaтa и 2-оксоглютарата в ^)-2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилат, L-глютамат и воду.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать ДНК-связывающий домен семейства Myb, который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида.

Последовательность SEQ ID NO: 323 представляет аминокислотную последовательность клона Glycine max, обозначенного в настоящем документе как Ceres Clone: 638126 (SEQ ID NO: 321), который, предположительно, кодирует полипептид, содержащий ДНК-связывающий домен семейства Myb. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать ДНК-связывающий домен семейства Myb, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 13-62 последовательности SEQ ID NO: 323. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать ДНК-связывающий домен семейства Myb, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к ДНК-связывающему домену семейства Myb одного или нескольких полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336,

337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 354, 356, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 372, 374,

376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 415,

416, 417, 418, 420, 421, 422 или 424. ДНК-связывающие домены семейства Myb таких последовательностей представлены в перечне последовательностей. Семейство ДНК-связывающих доменов Myb включает в себя ДНК-связывающие домены из белков семейства Myb, а также семейство доменов SANT.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать домен альфа/бета-складки гидролазы, который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида.

Последовательность SEQ ID NO: 595 представляет аминокислотную последовательность клона Arabidopsis, обозначенного в настоящем документе как Ceres Clone: 26006 (SEQ ID NO: 594), который, предположительно, кодирует полипептид, содержащий домен альфа/бета-складки гидролазы. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать домен альфа/бета-складки гидролазы, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 35-257 последовательности SEQ ID NO: 595. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать область с доменом альфа/бета-складки гидролазы, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к домену альфа/бета-складки гидролазы одного или нескольких полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 595, 597, 598, 600, 602, 603, 604, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643 или 691. Домены альфа/бета-складок гидролазы таких последовательностей приведены в перечне последовательностей. Альфа/бета-складка гидролазы является общей для ряда гидролитических ферментов, имеющих самое разное филогенетическое происхождение и выполняющих каталитическую функцию. Сердцевиной каждого фермента является альфа/бета слой (нежели ствол), содержащий 8 цепей, соединенных спиралями. Считается, что ферменты произошли от общего предшественника, сохранив при этом строение каталитических остатков. Все они имеют каталитическую триаду, элементы которой зарождаются на петлях, являющихся лучшими консервативными структурными особенностями складки.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать домен фактор быстрого подщелачивания (ФБП), который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида. Последовательность SEQ ID NO: 77 представляет аминокислотную последовательность клона Arabidopsis, обозначенного в настоящем документе как Ceres Clone:4831 (SEQ ID NO: 76), который, предположительно, кодирует полипептид, содержащий домен ФБП. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать домен ФБП, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 57-129 последовательности SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать домен ФБП, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к домену ФБП одного или более полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 или 115. Домены ФБП таких последовательностей приведены в перечне последовательностей. Домены ФБП обычно находятся в распространенных пептидах 5 кДа в растениях, которые, как сообщается, играют роль в подавлении роста и развития корня у некоторых растений.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать домен DUF640, который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида. Последовательность SEQ ID NO: 209 приводит аминокислотную последовательность клона Arabidopsis, обозначенного в настоящем документе как Ceres Annot: 847799 (SEQ ID NO: 208), который, предположительно, кодирует полипептид, содержащий домен DUF640. Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать домен DUF640, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 19-152

- 13 036343 последовательности SEQ ID NO: 209. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать домен DUF640, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к домену DUF640 одного или нескольких полипептидов, приведенных в последовательностях SEQ ID NO: 209, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250 или 251. Домены DUF640 таких последовательностей представлены в перечне последовательностей.

Модулирующий биомассу полипептид может содержать домен семейства PTR2 РОТ, который, предположительно, характерен для модулирующего биомассу полипептида. Последовательность SEQ ID NO: 426 представляет аминокислотную последовательность клона Arabidopsis, обозначенного в настоящем документе как Ceres Annot: 878355 (SEQ ID NO: 425), который, предположительно, кодирует полипептид, содержащий домен семейства PTR2 РОТ.

Например, модулирующий биомассу полипептид может содержать домен семейства PTR2 РОТ, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к остаткам 100-509 последовательности SEQ ID NO: 426. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид может содержать домен семейства PTR2 РОТ, имеющий идентичность последовательности 60% или более по отношению к домену семейства PTR2 РОТ одного или более полипептидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 426, 428, 429, 430, 431, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448,

449, 450, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 459, 461, 463, 464, 466, 467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480,

482, 483, 484, 486, 488, 490, 492, 493, 495, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515,

516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526, 528, 529, 531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549,

550, 551, 552, 693, 695 или 697. Области с доменом семейства PTR2 РОТ таких последовательностей приведены в перечне последовательностей. Транспорт пептидов в клетки является биологическим феноменом, убедительно подтвержденным документальными доказательствами. Он осуществляется специфическими энергозависимыми переносчиками и присутствует в самых разнообразных организмах - от бактерий до человека. Семейство белков PTR отличается от ABC-транспортеров пептидов и было открыто с помощью секвенирования ряда недавно открытых транспортных белков для переноса пептидов. Представляется, что данные белки главным образом участвуют во введении небольших пептидов с сопутствующим поглощением протона. В некоторых вариантах белок РОТ, как описано в настоящем документе, может включать N-концевой сигнальный пептид. В некоторых вариантах сигнальный пептид может быть характерным для плазматической мембраны. В некоторых вариантах сигнальный пептид может быть характерным для мембраны эндоплазматической сети или хлоропластовой мембраны. Примеры сигнальных пептидов показаны в заявке, в перечне последовательностей. Для прогнозирования наличия и типа транзитных пептидов могут применяться методы биоинформатики. Такие методы не опираются исключительно на сходство последовательности. Поскольку ортологические белки чаще имеют одинаковую локализацию, степень сходства последовательности, необходимая для того, чтобы сделать вывод о со-локализации, выше, чем у аналогичной трехмерной структуры, а изоформы одного и того же белка могут иметь различную локализацию. Для прогнозирования сигнальных пептидов можно использовать программу для прогнозирования внутриклеточной локализации белка WoLF PSORT (Horton et al., 2007 WoLF PSORT: Protein Localization Predictor, Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkm259, 2007; Horton et al., 2006 Protein Subcellular Localization Prediction with WoLF PSORT, Proceedings of the 4th Annual Asia Pacific Bioinformatics Conference APBC06, Taipei, Taiwan. pp. 39-48, 2006). Примеры сигнальных пептидов можно получить из последовательностей, имеющихся в открытом доступе, с помощью анализа последовательности, выполненного программой WoLF PSORT, которая предоставляет данные о многочисленных ортологических сигнальных пептидах.

В эукариотных организмах присутствует несколько типов сигнальных пептидов и связанных с ними сортирующих сигналов, каждый из которых участвует в мембранной транслокации и/или инсерции. Как правило, сигнальные пептиды, специфические для эндоплазматического ретикулюма (ER), являются котрансляционными, в то время как сигнальные пептиды, специфические для митохондрий или хлоропластов, являются посттрансляционными, но не развернутыми шаперонами. Например, N-концевой сигнал с гидрофобной секцией переменной длины вызывает котрансляционный переход белков через или в мембрану эндоплазматического ретикулюма. N-концевые сигналы большей частью не зависят от белковносителей. Такие сигнальные пептиды обычно являются взаимозаменяемыми с различными белками, обычно расщеплены и обычно ограничиваются первыми приблизительно 90 аминокислотными остатками. Расщепление на N-конце и котрансляционное распознавание делают сигнальные пептиды типично ортогональными по отношению к функции белка, однако это является только общим сходством. В некоторых вариантах белок РОТ, как описано в настоящем документе, может включать С-концевой сортирующий сигнал. Примеры С-концевых сортирующих сигналов включают, в числе прочего, сигнал KDEL (растворение) или KKXX (мембранный белок) для удержания ER, SKL для пероксисомального воздействия (растворение), NPIR для вакуоли и LPXTG для стенки бактериальной клетки. В некоторых вариантах белок РОТ, как описано в настоящем документе, может включать внутренний сортирующий сигнал. Такие сигналы включают клеточные сигналы внутриядерной локализации, которые наблюдаются на поверхности белка со складчатой структурой, однако могут находиться в любом месте одноразмерной по

- 14 036343 следовательности. В некоторых вариантах белок РОТ, как описано в настоящем документе, может включать N-концевой сигнальный пептид длиной примерно 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 аминокислот, начинающийся с N-конца указанного белка РОТ. В некоторых вариантах в белке РОТ, как описано в настоящем документе, может отсутствовать весь N-концевой сигнальный пептид или его часть. В некоторых вариантах в белке РОТ, как описано в настоящем документе, Nконцевой сигнальный пептид может быть удален и заменен на другой N-концевой сигнальный пептид. Например, специалист в данной области может удалить или синтезировать последовательность без 45 аминокислот с N-концом последовательности SEQ ID NO: 426 и добавить методом слияния или синтеза другой сигнальный пептид, специфичный для такой же мембраны или другой мембраны мишени.

В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид усекается в аминоконцевой или карбоксиконцевой области природного полипептида. Усеченный полипептид может удерживать определенные домены природного полипептида при отсутствии других. Таким образом, при вариантах, когда длина меньше или больше на 5 аминокислот, обычно показывают активность усеченного полипептида по модуляции биомассы. В некоторых вариантах усеченный полипептид является доминантным негативным полипептидом. Экспрессия в растении с таким усеченным полипептидом придает различие в уровне биомассы растения по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, у которого нет усеченного полипептида.

Б. Функциональные гомологи, определяемые с помощью программы Reciprocal BLAST.

В некоторых вариантах один или несколько функциональных гомологов эталонного модулирующего биомассу полипептида, определенного в одном или нескольких указанных выше описаниях базы данных по семействам белков (Pfam), пригодны для использования в качестве модулирующих биомассу полипептидов. Функциональный гомолог является полипептидом, который имеет сходство последовательности с эталонным полипептидом и который выполняет одну или несколько биохимических или физиологических функций эталонного полипептида. Функциональный гомолог и эталонный полипептид могут быть природными полипептидами, а сходство последовательности может быть вызвано конвергентными или дивергентными эволюционными событиями. В силу этого функциональные гомологи иногда обозначают в литературе как гомологи, или ортологи, или паралоги. Варианты природных функциональных гомологов, таких как полипептиды, закодированные мутантами кодирующей последовательности дикого типа, могут сами быть функциональными гомологами. Функциональные гомологи могут быть также созданы сайт-направленным мутагенезом кодирующей последовательности модулирующего биомассу полипептида или путем комбинирования доменов из кодирующих последовательностей для различных природных модулирующих биомассу полипептидов (перестановка доменов). Термин функциональный гомолог иногда применяется к нуклеиновой кислоте, которая кодирует функционально гомологичный полипептид.

Функциональные гомологи можно идентифицировать путем анализа выравнивания последовательностей нуклеотидов и полипептидов. Например, при выполнении поиска в базе данных последовательностей нуклеотидов и полипептидов можно определить гомологи модулирующих биомассу полипептидов. Анализ последовательностей может включать анализ всего банка данных с помощью программы BLAST, Reciprocal BLAST или PSIBLAST с использованием аминокислотной последовательности модулирующего биомассу полипептида в качестве эталонной последовательности. В некоторых случаях аминокислотная последовательность выводится из нуклеотидной последовательности. Те полипептиды в базе данных, которые имеют идентичность последовательности более 40%, являются кандидатами для дальнейшей оценки их пригодности для использования в качестве модулирующих биомассу полипептидов. Сходство аминокислотной последовательности допускает замену консервативных аминокислот, например замену одного гидрофобного остатка на другой или замену одного полярного остатка на другой. При желании можно выполнить проверку таких кандидатов вручную, чтобы сузить их количество для дальнейшей оценки. При проверке вручную можно выбрать тех кандидатов, у которых в модулирующих биомассу полипептидах, по-видимому, присутствуют домены, например консервативные функциональные домены.

Консервативные области можно определить путем локализации области в пределах первичной аминокислотной последовательности модулирующего биомассу полипептида, т.е. повторяющаяся последовательность образует некую вторичную структуру (например, спирали и складчатые бета-слои), устанавливает положительно или отрицательно заряженные домены или представляет собой белковый мотив или домен. Например, см. в Интернете веб-сайт базы данных по семействам белков (Pfam) с описанием консенсусных последовательностей для различных белковых мотивов и доменов на странице sanger.ac.uk/Software/Pfam/ и pfam.janelia.org/. Описание информации, включенной в базу данных Pfam, приведено в работах Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); и Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999). Консервативные области также можно определить путем выравнивания последовательностей одинаковых или родственных полипептидов от близкородственных видов. Близкородственные виды преимущественно относятся к одному семейству. В некоторых вариантах будет достаточным выравнивание последовательностей от двух разных видов.

Как правило, для определения консервативных областей пригодны полипептиды, показывающие идентичность аминокислотных последовательностей не менее 40%. Консервативные области родствен- 15 036343 ных полипептидов показывают идентичность аминокислотных последовательностей не менее 45% (например, идентичность аминокислотных последовательностей не менее 50%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90%). В некоторых вариантах консервативная область показывает идентичность аминокислотных последовательностей не менее 92, 94, 96, 98 или 99%.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 554, приведены на фиг. 1 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи содержат, например, CeresAnnot:564098 (SEQ ID NO: 556), CeresAnnot:1443290 (SEQ ID NO: 558), CeresClone:1042157 (SEQ ID NO: 560), CeresClone:1919714 (SEQ ID NO: 562), GI:157336039 (SEQ ID NO: 563), CeresAnnot: 8454153 (SEQ ID NO: 565), CeresAnnot:1722302 (SEQ ID NO: 567), CeresAnnot:8733140 (SEQ ID NO: 569), CeresAnnot:1452096 (SEQ ID NO: 571), CeresClone:1645639 (SEQ ID NO: 573), GI:157344920 (SEQ ID NO: 574), GI:115440865 (SEQ ID NO: 575), CeresClone:340925 (SEQ ID NO: 577), CeresAnnot:8669404 (SEQ ID NO: 579), CeresClone:100028078 (SEQ ID NO: 581), CeresAnnot:1503869 (SEQ ID NO: 583), CeresAnnot:1525651 (SEQ ID NO: 585), CeresClone:2031281 (SEQ ID NO: 587), CeresClone:483742 (SEQ ID NO: 589), CeresClone: 100802111 (SEQ ID NO: 591), CeresClone:1460255 (SEQ ID NO: 593). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 554 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 554.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 263, приведены на фиг. 2 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи содержат, например, GI:157355009 (SEQ ID NO: 264), CeresAnnot:1464457 (SEQ ID NO: 266), CeresClone:1584660 (SEQ ID NO: 268), GI:115474149 (SEQ ID NO: 269), CeresAnnot:8636233 (SEQ ID NO: 271), CeresClone:1777035 (SEQ ID NO: 273), CeresClone:1990929 (SEQ ID NO: 275), GI:194692166 (SEQ ID NO: 276), CeresAnnot:1458507 (SEQ ID NO: 278), GI:147780712 (SEQ ID NO: 279), CeresAnnot:8642924 (SEQ ID NO: 281), GI:115451001 (SEQ ID NO: 282), AAF87041 (SEQ ID NO: 283), CeresClone :1573856 (SEQ ID NO: 285), CeresAnnot:1476818 (SEQ ID NO: 287), CeresAnnot:1450024 (SEQ ID NO: 289), CeresAnnot:1503065 (SEQ ID NO: 291), GI:147866358 (SEQ ID NO: 292), CeresClone:230073 (SEQ ID NO: 294), (SEQ ID NO: 295), (SEQ ID NO: 296), GI:78708599 (SEQ ID NO: 297), GI:15451553 (SEQ ID NO: 298), GI:125542572 (SEQ ID NO: 299), GI:157342426 (SEQ ID NO: 300), CeresAnnot:538622 (SEQ ID NO: 302), CeresAnnot:8460661 (SEQ ID NO: 304), GI:15983797 (SEQ ID NO: 305), GI:115435804 (SEQ ID NO: 306), CeresClone:1599579 (SEQ ID NO: 308), CeresAnnot:1469831 (SEQ ID NO: 310), GI:9758342 (SEQ ID NO: 311), GI:21536859 (SEQ ID NO: 312), CeresClone: 113639 (SEQ ID NO: 314), GI:15232818 (SEQ ID NO: 315), CeresClone:1571328 (SEQ ID NO: 317), CeresClone:1868988 (SEQ ID NO: 319), GI:1669341 (SEQ ID NO: 320) или GI:157359317 (SEQ ID NO: 321). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 263 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 263.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 117, приведены на фиг. 3 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, GI:90657534 (SEQ ID NO: 118), CeresClone:1237946 (SEQ ID NO: 120), GI:118488472 (SEQ ID NO: 121), GI:38194917 (SEQ ID NO: 122), GI:157341292 (SEQ ID NO: 123), CeresClone:1957107 (SEQ ID NO: 125), CeresAnnot: 8640603 (SEQ ID NO: 127), CeresClone:829440 (SEQ ID NO: 129), CeresClone:285169 (SEQ ID NO: 131), GI:116790012 (SEQ ID NO: 132), GI:157356290 (SEQ ID NO: 133), CeresAnnot:1450186 (SEQ ID NO: 135), CeresClone:1804732 (SEQ ID NO: 137), CeresClone:1781794 (SEQ ID NO: 139), CeresAnnot:8656625 (SEQ ID NO: 141), GI:162462515 (SEQ ID NO: 142), CeresClone: 570485 (SEQ ID NO: 144), GI:125586664 (SEQ ID NO: 145), GI:116788824 (SEQ ID NO: 146), GI:115453531 (SEQ ID NO: 147), CeresClone:17250 (SEQ ID NO: 149), CeresAnnot:1363625 (SEQ ID NO: 151), GI:75133694 (SEQ ID NO: 152), GI:147780878 (SEQ ID NO: 153), GI:157341291 (SEQ ID NO: 154), GI:38194916 (SEQ ID NO: 155), GI:157356291 (SEQ ID NO: 156), CeresClone:1883580 (SEQ ID NO: 158), CeresClone:1848658 (SEQ ID NO: 160), CeresAnnot:1450185 (SEQ ID NO: 162), GI: 13477083 (SEQ ID NO: 163), GI:115463639 (SEQ ID NO: 164), CeresClone:98007 (SEQ ID NO: 166), CeresAnnot:1326475 (SEQ ID NO: 168), GI:115473243 (SEQ ID NO: 169), CeresAnnot:870466 (SEQ ID NO: 171), CeresClone:1806851 (SEQ ID NO: 173), GI:75133695 (SEQ ID NO: 174), CeresClone:1788775 (SEQ ID NO: 176), CeresClone:1546455 (SEQ ID NO: 178), CeresClone:1902642 (SEQ ID NO: 180), CeresAnnot:8632643 (SEQ ID NO: 182), CeresClone:236876 (SEQ ID NO: 184), GI:90657629 (SEQ ID NO: 185), GI:30090032 (SEQ ID NO: 186), CeresAnnot:8640602 (SEQ ID NO: 188), GI:115453533 (SEQ ID NO: 189), GI:162462330 (SEQ ID NO: 190), GI:38230578 (SEQ ID NO: 191), CeresAnnot:8632641 (SEQ ID NO: 193), GI:168016456 (SEQ ID NO: 194), GI:125532513 (SEQ ID NO: 195), GI:157354382 (SEQ ID NO: 196), CeresAnnot:1481980 (SEQ ID NO: 198), CeresAnnot:1535466 (SEQ ID NO: 200), CeresAnnot: 1297618 (SEQ ID NO: 202), GI:119040466 (SEQ ID NO: 203), GI:116310381 (SEQ ID NO: 204), CeresAnnot: 8702104 (SEQ ID

- 16 036343

NO: 206) или GI:157340500 (SEQ ID NO: 207). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID

NO: 117 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее

45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или

99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ

ID NO: 117.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 1, приведены на фиг. 4 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, GI:84795244 (SEQ ID NO: 2), CeresClone: 1725396 (SEQ ID NO: 4), CeresAnnot:8669118 (SEQ ID NO: 6), CeresClone:280241 (SEQ ID NO: 8), CeresClone: 1712594 (SEQ ID NO: 10), GI:190361125 (SEQ ID NO: 11), GI:4099921 (SEQ ID NO: 12), GI:147844573 (SEQ ID NO: 13), GI:67906426 (SEQ ID NO: 14), GI:57012757 (SEQ ID NO: 15), GI:56567583 (SEQ ID NO: 16), GI:84795246 (SEQ ID NO: 17), GI:84795248 (SEQ ID NO: 18), CeresClone: 1805203 (SEQ ID NO: 20), CeresClone:101497672 (SEQ ID NO: 22), CeresClone:224845 (SEQ ID NO: 24), GI:115464685 (SEQ ID NO: 25), CeresClone:1287030 (SEQ ID NO: 27), CeresAnnot:8733383 (SEQ ID NO: 29), GI:84795240 (SEQ ID NO: 30), CeresClone:1806017 (SEQ ID NO: 32), GI:84795242 (SEQ ID NO: 33), GI:84795238 (SEQ ID NO: 34), CeresClone: 1733772 (SEQ ID NO: 36), GI:37625037 (SEQ ID NO: 37), GI:37625035 (SEQ ID NO: 38), GI:147805535 (SEQ ID NO: 39), GI:157358724 (SEQ ID NO: 40), GI:4099914 (SEQ ID NO: 41), CeresAnnot:1520029 (SEQ ID NO: 43), CeresClone:1065091 (SEQ ID NO: 45), CeresClone: 1793792 (SEQ ID NO: 47), CeresClone: 1619220 (SEQ ID NO: 49), GI:57012875 (SEQ ID NO: 50), GI:147811787 (SEQ ID NO: 51), CeresClone:1842925 (SEQ ID NO: 53), GI:20340233 (SEQ ID NO: 54), CeresClone: 1657843 (SEQ ID NO: 56), CeresAnnot: 1455887 (SEQ ID NO: 58), GI:118490009 (SEQ ID NO: 59), CeresClone: 1381515 (SEQ ID NO: 61), CeresClone:22775 (SEQ ID NO: 63), GI:60459377 (SEQ ID NO: 64), CeresAnnot:1488231 (SEQ ID NO: 66), CeresClone:1884969 (SEQ ID NO: 68), CeresClone:1802100 (SEQ ID NO: 70), GI:156145802 (SEQ ID NO: 71), GI:28274832 (SEQ ID NO: 72), CeresClone:568399 (SEQ ID NO: 74) или GI:115460458 (SEQ ID NO: 75). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 1 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 1.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 645, приведены на фиг. 5 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, CeresClone:1925947 (SEQ ID NO: 647), CeresAnnot:1514501 (SEQ ID NO: 649), CeresAnnot:849672 (SEQ ID NO: 651), GI:157355942 (SEQ ID NO: 652), GI:115452503 (SEQ ID NO: 653), CeresClone:1790933 (SEQ ID NO: 655), CeresAnnot:8641620 (SEQ ID NO: 657), CeresClone:281497 (SEQ ID NO: 659), GI:168013851 (SEQ ID NO: 660), CeresClone:143214 (SEQ ID NO: 662), CeresClone:1781022 (SEQ ID NO: 664), CeresClone: 618639 (SEQ ID NO: 666), GI:118483001 (SEQ ID NO: 667), CeresClone:38404 (SEQ ID NO: 669), GI:3549670 (SEQ ID NO: 670), GI:37703720 (SEQ ID NO: 671), GI:152149571 (SEQ ID NO: 672), GI:125603687 (SEQ ID NO: 673), GI:108707679 (SEQ ID NO: 674), GI:157352390 (SEQ ID NO: 675), GI:159469820 (SEQ ID NO: 676), GI:145344081 (SEQ ID NO: 677) или Ceres Annot ID no. 1461228 (SEQ ID NO: 689). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 645 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 645.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 253, приведены на фиг. 6 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, CeresClone:951785 (SEQ ID NO: 255), CeresAnnot:1440346 (SEQ ID NO: 257), CeresClone:1085177 (SEQ ID NO: 259) или CeresClone: 157151 (SEQ ID NO: 261). В некоторых случаях функциональный гомолог с SEQ ID NO: 253 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 253.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 323, приведены на фиг. 7 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, GI:157340812 (SEQ ID NO: 324), CeresAnnot:1460824 (SEQ ID NO: 326), GI:145356202 (SEQ ID NO: 327), CeresClone:477814 (SEQ ID NO: 329), CeresClone:1914387 (SEQ ID NO: 331), GI:7981380 (SEQ ID NO: 332), CeresClone:1910072 (SEQ ID NO: 334), CeresClone:331755 (SEQ ID NO: 336), GI:124360540 (SEQ ID NO: 337), GI:157335318 (SEQ ID NO: 338), CeresAnnot:1503394 (SEQ ID NO: 340), CeresAnnot:1442707 (SEQ ID NO: 342), GI:147784500 (SEQ ID NO: 343), CeresAnnot:1514100 (SEQ ID NO: 345), CeresAnnot: 850366 (SEQ ID NO: 347), CeresAnnot:543794 (SEQ ID NO: 349), CeresAnnot:1495620 (SEQ ID NO: 351), CeresClone:1653552 (SEQ ID NO: 353), GI:147767321 (SEQ ID NO: 354), CeresAnnot: 1510450 (SEQ ID NO: 356), GI:110931736 (SEQ ID NO: 357), CeresClone:1916884 (SEQ ID NO: 359), CeresClone:1847251 (SEQ ID NO: 361), CeresAnnot:1457249

- 17 036343 (SEQ ID NO: 363), CeresClone: 1113584 (SEQ ID NO: 365), CeresClone:1927753 (SEQ ID NO: 367), CeresClone:857342 (SEQ ID NO: 369), CeresClone:100068619 (SEQ ID NO: 371), GI:145327247 (SEQ ID NO: 372), CeresAnnot: 8461532 (SEQ ID NO: 374), CeresClone:1722230 (SEQ ID NO: 376), CeresClone:1897493 (SEQ ID NO: 378), CeresAnnot:838426 (SEQ ID NO: 380), CeresAnnot:827713 (SEQ ID NO: 382), CeresClone:1763593 (SEQ ID NO: 384), CeresClone:143475 (SEQ ID NO: 386), CeresAnnot:8456508 (SEQ ID NO: 388), CeresClone:100002959 (SEQ ID NO: 390), GI:118137433 (SEQ ID NO: 391), CeresClone: 1523182 (SEQ ID NO: 393), CeresClone:1761808 (SEQ ID NO: 395), CeresClone:1069222 (SEQ ID NO: 397), CeresAnnot:8734209 (SEQ ID NO: 399), CeresAnnot:8461540 (SEQ ID NO: 401), CeresClone:1086604 (SEQ ID NO: 403), CeresClone:41695 (SEQ ID NO: 405), GI:112292440 (SEQ ID NO: 406), GI:116830269 (SEQ ID NO: 407), CeresClone:1775942 (SEQ ID NO: 409), CeresClone: 1723374 (SEQ ID NO: 411), CeresAnnot:1457230 (SEQ ID NO: 413), CeresAnnot:8667653 (SEQ ID NO: 415), GI:115465643 (SEQ ID NO: 416), GI:5091605 (SEQ ID NO: 417), GI:125553458 (SEQ ID NO: 418), CeresAnnot:1510435 (SEQ ID NO: 420), GI:115438765 (SEQ ID NO: 421), GI:112292438 (SEQ ID NO: 422) или CeresAnnot: 1770841 (SEQ ID NO: 424). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 323 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 323.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 595, приведены на фиг. 8 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, CeresClone:644331 (SEQ ID NO: 597), GI:15227859 (SEQ ID NO: 598), CeresAnnot:1504349 (SEQ ID NO: 600), CeresAnnot: 1265088 (SEQ ID NO: 602 (SEQ ID NO: 603), GI:125527987 (SEQ ID NO: 604), GI:14279437 (SEQ ID NO: 605), ES902065 (SEQ ID NO: 606), CeresClone:1065042 (SEQ ID NO: 608), GI:157329790 (SEQ ID NO: 609), GI: 15227861 (SEQ ID NO: 610), GI:146272407 (SEQ ID NO: 611), CeresClone: 95094 (SEQ ID NO: 613), CeresClone:1714893 (SEQ ID NO: 615), GI:157329890 (SEQ ID NO: 616), CeresAnnot:859635 (SEQ ID NO: 618), GI:115440397 (SEQ ID NO: 619), GI:40549303 (SEQ ID NO: 620), CeresAnnot:1457048 (SEQ ID NO: 622), GI:50401192 (SEQ ID NO: 623), CeresAnnot:1451281 (SEQ ID NO: 625), CeresAnnot:1510252 (SEQ ID NO: 627), CeresClone:1822691 (SEQ ID NO: 629), GI:197312921 (SEQ ID NO: 630), CeresAnnot:8456439 (SEQ ID NO: 632), EX096388 (SEQ ID NO: 633), GI:15028131 (SEQ ID NO: 634), CeresClone:270875 (SEQ ID NO: 636), GI:27754457 (SEQ ID NO: 637), GI:16648679 (SEQ ID NO: 638), GI:15227863 (SEQ ID NO: 639), CeresAnnot:1451282 (SEQ ID NO: 641), GI:53830670 (SEQ ID NO: 642), GI:146272405 (SEQ ID NO: 643) или CeresAnnot: 827940 (SEQ ID NO: 691). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 595 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 595.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 77, приведены на фиг. 9 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, CeresClone:1387948 (SEQ ID NO: 79), CeresClone:1937714 (SEQ ID NO: 81), GI:157345132 (SEQ ID NO: 82), CeresClone:464828 (SEQ ID NO: 84), CeresAnnot:1451368 (SEQ ID NO: 86), GI:37695575 (SEQ ID NO: 87), GI:116790033 (SEQ ID NO: 88), CeresClone:1346042 (SEQ ID NO: 90), CeresClone:1118610 (SEQ ID NO: 92), CeresClone:982000 (SEQ ID NO: 94), CeresClone:959670 (SEQ ID NO: 96), CeresClone: 952522 (SEQ ID NO: 98), CeresClone: 1914539 (SEQ ID NO: 100), CeresClone:668581 (SEQ ID NO: 102), CeresClone:1914939 (SEQ ID NO: 104), CeresClone:723694 (SEQ ID NO: 106), CeresAnnot:1456949 (SEQ ID NO: 108), CeresAnnot:1539918 (SEQ ID NO: 110), CeresAnnot:8456138 (SEQ ID NO: 112), CeresAnnot:1486506 (SEQ ID NO: 114) или GI:116786293 (SEQ ID NO: 115). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 77 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 77.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 209, приведены на фиг. 10 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, GI:116780542 (SEQ ID NO: 210), CeresClone:1848017 (SEQ ID NO: 212), CeresAnnot: 1466494 (SEQ ID NO: 214), CeresAnnot:1449022 (SEQ ID NO: 216), CeresAnnot:1482911 (SEQ ID NO: 218), CeresClone:1118987 (SEQ ID NO: 220), CeresClone:1073674 (SEQ ID NO: 222), CeresClone:1084747 (SEQ ID NO: 224), CeresClone:536345 (SEQ ID NO: 226), CeresClone:1650005 (SEQ ID NO: 228), CeresAnnot:8453882 (SEQ ID NO: 230), CeresAnnot:1373087 (SEQ ID NO: 232), CeresAnnot:8669372 (SEQ ID NO: 234), CeresClone:1048839 (SEQ ID NO: 236), CeresClone:281322 (SEQ ID NO: 238), GI:147795605 (SEQ ID NO: 239), CeresClone:2004419 (SEQ ID NO: 241), GI:125543059 (SEQ ID NO: 242), AT1G16910_LSH8 (SEQ ID NO: 243), AT1G78815_LSH7 (SEQ ID NO: 244), AT2G31160_LSH3 (SEQ ID NO: 245), AT2G42610_LSH10 (SEQ ID NO: 246), AT3G04510_LSH2 (SEQ ID NO: 247), AT3G23290_LSH4 (SEQ ID NO: 248), AT5G28490_LSH1 (SEQ ID NO: 249), AT5G58500_LSH5 (SEQ ID NO: 250) или Atlg07090_LSH6 (SEQ ID NO: 251). В некоторых случаях

- 18 036343 функциональный гомолог SEQ ID NO: 209 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70,

75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 209.

Примеры аминокислотных последовательностей функциональных гомологов полипептида, представленного в последовательности SEQ ID NO: 426, приведены на фиг. 11 и в перечне последовательностей. Такие функциональные гомологи включают, например, CeresAnnot:1472338_Pb (SEQ ID NO: 428), GI:157344683_Vv (SEQ ID NO: 429), GI:87240677_Mt (SEQ ID NO: 430), GI:115448297_Os (SEQ ID NO: 431), CeresClone:1844568_Pv (SEQ ID NO: 433), CeresClone:797829_Tm (SEQ ID NO: 435), GI:168033816_Pp (SEQ ID NO: 436), GI:116788004_Ps (SEQ ID NO: 437), GI:149900503_Ha (SEQ ID NO: 438), GI:41O2839_Sl (SEQ ID NO: 439), GI:31088360_Vf (SEQ ID NO: 440), CeresAnnot:8681236_Sb (SEQ ID NO: 442), CeresAnnot:8519531_Gm (SEQ ID NO: 444), CeresAnnot: 8631372_Zm (SEQ ID NO: 446), GI:151426449_Hv (SEQ ID NO: 447), GI:192757675_Br (SEQ ID NO: 448), GI:2655098 (SEQ ID NO: 449), GI:194690746 (SEQ ID NO: 450), CeresClone:752925 (SEQ ID NO: 452), GI:125540898 (SEQ ID NO: 453), GI:26451333 (SEQ ID NO: 454), GI:2160144 (SEQ ID NO: 455), GI:30696666 (SEQ ID NO: 456), GI:125556922 (SEQ ID NO: 457), CeresAnnot:1529287 (SEQ ID NO: 459), CeresClone:1806748 (SEQ ID NO: 461), CeresAnnot: 8755095 (SEQ ID NO: 463), GI:147827175 (SEQ ID NO: 464), CeresClone: 1888865 (SEQ ID NO: 466), GI:157337163 (SEQ ID NO: 467), GI:115434472 (SEQ ID NO: 468), CeresAnnot:6252512 (SEQ ID NO: 470), CeresAnnot:1569074_Mt (SEQ ID NO: 472), CeresAnnot:1475845 (SEQ ID NO: 474), CeresAnnot:1501483 (SEQ ID NO: 476), CeresAnnot:8755079 (SEQ ID NO: 478), GI:115470147 (SEQ ID NO: 479), GI:15240905 (SEQ ID NO: 480), CeresAnnot:8755085 (SEQ ID NO: 482), GI:147853446 (SEQ ID NO: 483), GI:157346087 (SEQ ID NO: 484), CeresAnnot:1538867 (SEQ ID NO: 486), CeresAnnot:8755091 (SEQ ID NO: 488), CeresAnnot:1492702 (SEQ ID NO: 490), CeresClone:325604 (SEQ ID NO: 492), GI:108707040 (SEQ ID NO: 493), CeresAnnot: 1302517_At (SEQ ID NO: 495), CeresAnnot:1355964 (SEQ ID NO: 497), CeresAnnot:8755104 (SEQ ID NO: 499), GI:147802380 (SEQ ID NO: 500), GI:510238 (SEQ ID NO: 501), GI:157341962 (SEQ ID NO: 502), GI:6635838 (SEQ ID NO: 503), GI:4455276 (SEQ ID NO: 504), CeresAnnot:8642246 (SEQ ID NO: 506), CeresAnnot:8633032 (SEQ ID NO: 508), GI:157337654 (SEQ ID NO: 509), CeresAnnot: 8642241 (SEQ ID NO: 511), CeresAnnot:1520085 (SEQ ID NO: 513), CeresAnnot:1514979 (SEQ ID NO: 515), GI:147858202 (SEQ ID NO: 516), GI:125545538 (SEQ ID NO: 517), GI:115451771 (SEQ ID NO: 518), GI:125587732 (SEQ ID NO: 519), CeresAnnot:1516968 (SEQ ID NO: 521), CeresClone:350844 (SEQ ID NO: 523), CeresAnnot:8658700 (SEQ ID NO: 525), GI:157346088 (SEQ ID NO: 526), CeresClone:1926916 (SEQ ID NO: 528), GI:15226861 (SEQ ID NO: 529), CeresClone:816960 (SEQ ID NO: 531), GI:15232435 (SEQ ID NO: 532), CeresAnnot:8643789 (SEQ ID NO: 534), CeresAnnot:8631367 (SEQ ID NO: 536), GI:157339093 (SEQ ID NO: 537), CeresAnnot:8633031 (SEQ ID NO: 539), GI:125543029 (SEQ ID NO: 540), GI:115454995 (SEQ ID NO: 541), CeresAnnot:8755090 (SEQ ID NO: 543), CeresAnnot:8755097 (SEQ ID NO: 545), CeresAnnot:8755098 (SEQ ID NO: 547), CeresAnnot:8755099 (SEQ ID NO: 549 (SEQ ID NO: 550 (SEQ ID NO: 551 (SEQ ID NO: 552), CeresAnnot: 6086224 (SEQ ID NO: 693), CeresClone: 476769 (SEQ ID NO: 695) или CeresClone: 15650 (SEQ ID NO: 697). В некоторых случаях функциональный гомолог SEQ ID NO: 426 имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 426.

Определение консервативных областей в модулирующем биомассу полипептиде облегчает продуцирование вариантов модулирующих биомассу полипептидов. Варианты модулирующих биомассу полипептидов обычно имеют 10 или менее консервативных аминокислотных замен в первичной аминокислотной последовательности, например 1 или менее консервативных аминокислотных замен, 5 или менее консервативных аминокислотных замен или от 1 до 5 консервативных замен. Полезный вариант полипептида можно составить на основе одного из выравниваний, показанных на фиг. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11, и/или гомологов, указанных в перечне последовательностей. Такой полипептид включает консервативные области, расположенные в порядке, показанном на фигуре, от аминоконцевой до карбоксиконцевой области. Такой полипептид может также включать ноль, одну или более одной аминокислоты в положениях, обозначенных тире. При отсутствии аминокислот в положениях, обозначенных тире, длина такого полипептида равна сумме аминокислотных остатков во всех консервативных областях. При наличии аминокислот в положении, обозначенном тире, длина такого полипептида равна сумме аминокислотных остатков во всех консервативных областях и всех тире.

В. Функциональные гомологи, определяемые с использованием программного обеспечения HMMER.

В некоторых вариантах полезные модулирующие биомассу полипептиды включают полипептиды, которые совпадают с профилями скрытых марковских моделей на основе полипептидов, показанных на фиг. 1-11. Скрытая марковская модель (Hidden Markov Model, НММ) представляет собой статистическую модель консенсусной последовательности для группы функциональных гомологов. См. Durbin et al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press,

- 19 036343

Cambridge, UK (1998). НММ генерируется программой HMMER 2.3.2 с установленными по умолчанию параметрами и с использованием последовательностей группы функциональных гомологов в качестве входных данных. Множественное выравнивание последовательностей генерируется программой ProbCons (Do et al., Genome Res., 15(2):330-40 (2005)) версии 1.11 с использованием набора параметров по умолчанию: -c, --consistency REPS из 2; -ir, --iterative-refinement REPS из 100; -pre, --pre-training REPS из 0. Программа ProbCons - это общедоступное программное обеспечение, предоставленное Стэнфордским университетом.

Для построения НММ (hmmbuild) по умолчанию используются следующие параметры: параметр по умолчанию architecture prior (archpri), используемый при формировании структуры MAP (белков, ассоциированных с микротрубочками), равен 0,85; порог отсечения (idlevel) по умолчанию, используемый для определения действительного номера последовательности, равен 0,62. Программа HMMER 2.3.2 была выпущена 3 октября 2003 года под универсальной общедоступной лицензией в рамках проекта по свободному распространению программного обеспечения и доступна в Интернете на различных сайтах, таких как hmmer.janelia.org, hmmer.wustl.edu и fr.com/hmmer232/. Выходные данные модели Hmmbuild представлены в виде текстового файла.

НММ для группы функциональных гомологов можно использовать для определения вероятности того, что отбираемая последовательность модулирующего биомассу полипептида лучше соответствует конкретной НММ, чем нулевая НММ, генерированная с использованием группы последовательностей, не связанных структурно или функционально. На вероятность того, что отбираемая последовательность полипептида лучше соответствует НММ, чем нулевая НММ, указывает показатель НММ - число, генерируемое, когда отбираемая последовательность соответствует профилю НММ, который используется программой HMMER hmmsearch. При выполнении программы hmmsearch по умолчанию используются следующие параметры: значение отсечения (Е) по умолчанию 10,0; показатель отсечения (Т) по умолчанию - минус бесконечность; количество последовательности в базе данных (Z) по умолчанию равно реальному количеству последовательностей в базе данных; значение отсечения (Е) по умолчанию для упорядоченного списка совпадений на каждый домен (domE) - минус бесконечность и показатель отсечения для упорядоченного подоменного списка совпадений (domT) - минус бесконечность. Высокий показатель НММ указывает на более высокую вероятность того, что отбираемая последовательность выполняет одну или несколько биохимических или физиологических функций полипептидов, используемых для генерирования НММ. Высоким показателем НММ считается показатель не менее 20, а часто даже выше. Небольшие колебания показателя НММ конкретной последовательности могут происходить вследствие некоторых факторов, таких как порядок обработки последовательностей множественными алгоритмами выравнивания последовательностей, как, например, в программе ProbCons. Однако такие колебания показателя НММ незначительны.

Модулирующие биомассу полипептиды, рассматриваемые ниже, соответствуют указанным НММ по показателю НММ, превышающему 65 (например, более 70, 80, 90, 100, 120, 140, 200, 300, 500, 1000, 1500 или 2000). В некоторых вариантах показатель НММ модулирующего биомассу полипептида, рассматриваемого ниже, составляет приблизительно 50, 60, 70, 80, 90 или 95% от показателя НММ функционального гомолога, представленного в перечне последовательностей настоящей заявки. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид, рассматриваемый ниже, соответствует указанной НММ с показателем НММ, превышающим 210, и включает домен, указывающий на модулирующий биомассу полипептид. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид, рассматриваемый ниже, соответствует указанной НММ с показателем НММ, превышающим 210, и имеет идентичность последовательности 65% или более (например, идентичность последовательности 75, 80, 85, 90, 95 или 100%) по отношению к аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1-11.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 130 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 1 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 554, 556, 558, 560, 562, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591 или 593.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 340 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 2 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320 или 321.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 530 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 3 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129,

131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162,

163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 185, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195,

- 20 036343

196, 198, 200, 202, 203, 204, 206 или 207.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 120 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 4 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74 или 75.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 635 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 5 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677 или 689.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 65 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 6 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 255, 257, 259 или 261.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 100 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 7 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336,

416, 417, 418, 420, 421, 422 или 424.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 480 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 8 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 595, 597, 598, 600, 602, 603, 604, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643 или 691.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 145 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 9 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 или 115.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 280 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 10 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 209, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250 или 251.

В перечне последовательностей показаны примеры полипептидов, у которых показатель НММ превышает 1000 при сопоставлении с НММ, генерированной из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 11 и указанных в перечне последовательностей настоящей заявки. К таким полипептидам относятся, например, последовательности SEQ ID NO: 426, 428, 429, 430, 431, 433, 435, 436,

437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 459, 461, 463, 464,466,

467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486, 488, 490, 492, 493, 495, 497, 499, 500,501,

502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526, 528, 529, 531, 532,534,

536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 693, 695 или 697.

Г. Процент идентичности.

В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотным последовательностям, представленным в последовательностях SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145,

146, 147, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176,178,

180, 182, 184, 185, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207, 209,210,

212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246,247,

248, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281,282,

283, 285, 287, 289, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312,314,

315, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 326, 327, 329, 331, 332, 334, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347,349,

351, 353, 354, 356, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388,390,

- 21 036343

391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422, 424, 426,

428, 429, 430, 431, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453, 454, 455,

456, 457, 459, 461, 463, 464, 466, 467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486, 488, 490,

492, 493, 495, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523,

525, 526, 528, 529, 531, 532, 534, 536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554, 556, 558,

560, 562, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 598,

600, 602, 603, 604, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627, 629, 630,

632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664,

666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697. Полипептиды с таким процентом идентичности последовательности часто содержат домен, указывающий на моделирующий биомассу полипептид, и/или имеют показатель НММ, превышающий 65, как отмечалось выше. Аминокислотные последовательности моделирующих биомассу полипептидов, имеющих идентичность последовательности не менее 80% по отношению к аминокислотным последовательностям, представленным в последовательностях SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86, 87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127, 129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 152, 153, 154,

155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 185, 186, 188, 189,

190, 191, 193, 194, 195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207, 209, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224,

226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 253, 255, 257,

259, 261, 263, 264, 266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 294,

295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 321, 323, 324,

326, 327, 329, 331, 332, 334, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 354, 356, 357, 359, 361,

363, 365, 367, 369, 371, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403,

405, 406, 407, 409, 411, 413, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 429, 430, 431, 433, 435, 436,

437, 438, 439, 440, 442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 459, 461, 463, 464, 466,

467, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486, 488, 490, 492, 493, 495, 497, 499, 500, 501,

502, 503, 504, 506, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526, 528, 529, 531, 532, 534,

536, 537, 539, 540, 541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 563, 565, 567, 569, 571,

573, 574, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 598, 600, 602, 603, 604, 605, 606, 608,

609, 610, 611, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697, представлены на фиг. 1-11 и в перечне последовательностей.

Процент идентичности последовательности относится к степени идентичности какой-либо заданной эталонной последовательности, например SEQ ID NO: 1, с отбираемой модулирующей биомассу последовательностью. Длина отбираемой последовательности обычно составляет от 80 до 200% длины эталонной последовательности, например 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200% длины эталонной последовательности. Процент идентичности какой-либо отбираемой нуклеиновой кислоты или полипептида по отношению к эталонной нуклеиновой кислоте или полипептиду можно определить следующим образом. Эталонная последовательность (например, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность) сравнивается с одной или несколькими отбираемыми последовательностями с помощью компьютерной программы ClustalW (версия 1.83, параметры по умолчанию), которая позволяет выполнять выравнивание последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептида по всей длине (глобальное выравнивание). Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003).

Программа ClustalW вычисляет лучшее совпадение между эталонной и одной или несколькими отбираемыми последовательностями и сопоставляет их таким образом, чтобы можно было определить идентичность, сходства и различия. Для максимального выравнивания последовательностей делеции в одном или нескольких остатках можно вставить в эталонную последовательность, отбираемую последовательность или в обе последовательности. Для быстрого парного выравнивания последовательностей нуклеиновой кислоты используются следующие параметры по умолчанию: разрядность: 2; размер окна: 4; метод количественной оценки: процентное соотношение; количество верхних диагоналей: 4; штраф за делецию: 5. Для множественного выравнивания последовательностей нуклеиновых кислот используются следующие параметры: штраф за открытие делеции: 10,0; штраф за продолжение делеции: 5,0; вес перехода: да. Для быстрого парного выравнивания белковых последовательностей используются следующие параметры: разрядность: 1; размер окна: 5; метод количественной оценки: процентное соотношение; количество верхних диагоналей: 5; штраф за делецию: 3. Для множественного выравнивания белковых последовательностей используются следующие параметры: матрица веса: blosum; штраф за открытие делеции: 10,0; штраф за продолжение делеции: 0,05; гидрофильные делеции: on; гидрофильные остатки: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg и Lys; штрафы за остатки в области делеции: on. Выходные данные программы ClustalW представляются в виде выравнивания последовательности, которое отражает связи между последовательностями. Программу ClustalW можно запустить в Интернете, например на поисковом

- 22 036343 узле веб-сайта Медицинского колледжа Бэйлора (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) и на веб-сайте Европейского института биоинформатики (ebi.ac.uk/clustalw).

Для определения процента идентичности отбираемой нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности по отношению к эталонной последовательности, последовательности выравниваются с помощью программы ClustalW, количество идентичных совпадений в выравнивании делится на длину эталонной последовательности и результат умножается на 100. Следует отметить, что значение процента идентичности можно округлить до ближайшей десятой доли. Например, 78,11, 78,12, 78,13 и 78,14 округляются до 78,1, в то время как 78,15, 78,16, 78,7, 78,18 и 78,19 округляются до 78,2.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 554. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 554, приведены на фиг. 1 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 263. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 263, приведены на фиг. 2 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 117. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 117, приведены на фиг. 3 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 1. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 1, приведены на фиг. 4 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 645. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 645, приведены на фиг. 5 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 253. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 253, приведены на фиг. 6 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 323. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 323, приведены на фиг. 7 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 595. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду,

- 23 036343 представленному в последовательности SEQ ID NO: 595, приведены на фиг. 8 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 77. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 77, приведены на фиг. 9 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 209. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 09, приведены на фиг. 10 и в перечне последовательностей.

В некоторых случаях модулирующий биомассу полипептид имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 45%, например идентичность последовательности 50, 52, 56, 59, 61, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 426. Аминокислотные последовательности полипептидов, имеющие идентичность последовательности более 45% по отношению к полипептиду, представленному в последовательности SEQ ID NO: 426, приведены на фиг. 11 и в перечне последовательностей.

Д. Прочие последовательности.

Следует отметить, что модулирующий биомассу полипептид может включать дополнительные аминокислоты, которые не участвуют в модуляции биомассы, и поэтому такой полипептид может быть длиннее, чем обычно. Например, модулирующий биомассу полипептид может включать метку очистки, транзитный пептид хлоропласта, митохондриальный транзитный пептид, пептид аминопласта или лидерную последовательность, добавленную к аминоконцевой или карбоксиконцевой области. В некоторых вариантах модулирующий биомассу полипептид включает аминокислотную последовательность, которая выполняет функцию репортера, например зеленый флуоресцентный белок или желтый флуоресцентный белок.

III) Нуклеиновые кислоты.

Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем документе, включают нуклеиновые кислоты, которые эффективны для модуляции уровней биомассы при транскрибировании в растении или растительной клетке. Такие нуклеиновые кислоты в том числе включают те нуклеиновые кислоты, которые кодируют модулирующий биомассу полипептид, и те, которые могут быть использованы для ингибирования экспрессии модулирующего биомассу полипептида нуклеиновой кислотой.

А. Нуклеиновые кислоты, которые кодируют модулирующие биомассу полипептиды.

В настоящем документе описаны нуклеиновые кислоты, которые кодируют модулирующие биомассу полипептиды. Примерами таких нуклеиновых кислот являются последовательности SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192, 197, 199, 201, 205, 208, 211, 213, 215,

687, 688, 690, 692, 694 или 696, как более подробно описано ниже. Нуклеиновая кислота также может быть фрагментом, который составляет не менее 40% (например, не менее 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%) длины полноразмерной нуклеиновой кислоты, приведенной в последовательностях SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177, 179, 181, 183, 187, 192, 197, 199, 201, 205, 208, 211,

213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 265,267,

270, 272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293, 301, 303, 307, 309, 313, 316, 318, 322, 325, 328, 330,333,

335, 339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 373, 375, 377, 379, 381,383,

385, 387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 408, 410, 412, 414, 419, 423, 425, 427, 432, 434, 441,443,

- 24 036343

445, 451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475, 477, 481, 485, 487, 489, 491, 494, 496, 498, 505, 507, 510,

512, 514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538, 542, 544, 546, 548, 553, 555, 557, 559, 561, 564, 566, 568,

570, 572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 599, 601, 607, 612, 614, 617, 621, 624, 626,

628, 631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656, 658, 661, 663, 665, 668, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684,

685, 686, 687, 688, 690, 692, 694 или 696.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 553. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 553. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 553.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 262. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 262. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 262.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 116. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 116. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 116.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 678. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 678. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 678.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 644. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 644. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 644.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 252. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 252. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 252.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 322. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 322. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 322.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 594. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 594. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 594.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последователь- 25 036343 ность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 76. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 76. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 76.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 208. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 208. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 208.

Модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 425. Или же модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может быть вариантом нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 425. Например, модулирующая биомассу нуклеиновая кислота может иметь нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 80%, например идентичность последовательности 81, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 425.

Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены стандартными способами. Например, для получения изолированной нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, описанную в настоящем документе, можно использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР можно использовать для амплификации специфических последовательностей как ДНК, так и РНК, в том числе последовательностей всей геномной ДНК или всей клеточной РНК. Различные методы ПЦР описаны, например, в праймере для ПЦР: А Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Как правило, для конструирования олигонуклеотидных праймеров, которые в последовательности идентичны или подобны противолежащим цепям амплифицируемой матрицы, используется информация о последовательности от концов области, представляющей интерес, или из участков, находящихся за ее пределами. Также имеются различные стратегии с применением ПЦР, посредством которых сайт-специфичные модификации нуклеотидных последовательностей могут быть интродуцированы в матричную нуклеиновую кислоту. Изолированные нуклеиновые кислоты также могут быть синтезированы химическим путем или в виде отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, фосфорамидитным методом с использованием автоматического синтеза ДНК в направлении от 3' к 5), или в виде серии олигонуклеотидов. Например, может быть синтезирована одна или несколько пар длинных олигонуклеотидов (например, >100 нуклеотидов), которые содержат требуемую последовательность, при этом каждая пара содержит короткий комплементарный участок (например, приблизительно 15 нуклеотидов), в котором при отжиге пары олигонуклеотидов формируется дуплекс. Для вытягивания олигонуклеотидов используется ДНК-полимераза, и в результате на каждой паре олигонуклеотидов формируется отдельная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая затем может быть лигирована в вектор. Изолированные нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению можно получить путем мутагенеза, например природной ДНК.

Б. Использование нуклеиновых кислот для модуляции экспрессии полипептидов.

i) Экспрессия модулирующего биомассу полипептида.

Нуклеиновая кислота, кодирующая один из модулирующих биомассу полипептидов, которые описаны в настоящем документе, может быть использована для экспрессии полипептида в изучаемом виде растения, как правило, путем трансформирования растительной клетки с помощью нуклеиновой кислоты, имеющей кодирующую последовательность полипептида, функционально связанную в смысловой ориентации с одной или более регуляторными областями. Следует иметь в виду, что из-за вырожденности генетического кода ряд нуклеиновых кислот может кодировать определенный модулирующий биомассу полипептид; т.е. для многих аминокислот существует более чем один нуклеотидный триплет, который служит кодоном аминокислоты. Таким образом, для получения оптимальной экспрессии в определенном виде растения можно модифицировать кодоны в кодирующей последовательности заданного модулирующего биомассу полипептида, используя соответствующие таблицы статистического отклонения от равномерности в использовании кодонов для данного вида.

В некоторых случаях экспрессия модулирующего биомассу полипептида ингибирует одну или несколько функций эндогенного полипептида. Например, нуклеиновую кислоту, которая кодирует доминантно-негативный полипептид, можно использовать для ингибирования функции белка. Доминантнонегативный полипептид обычно мутирован или усечен по сравнению с эндогенным полипептидом дикого типа, и его присутствие в клетке ингибирует одну или несколько функций полипептида дикого типа в данной клетке, т.е. доминантно-негативный полипептид является генетически доминантным и передает потерю функции. Механизм, посредством которого доминантно-негативный полипептид передает такой

- 26 036343 фенотип, может быть различным, однако часто может включать белок-белковое взаимодействие или взаимодействие белок-ДНК. Например, доминантно-негативный полипептид может быть ферментом, усеченным по сравнению с нативным ферментом дикого типа, так что усеченный полипептид удерживает домены, участвующие в связывании первого белка, однако испытывает нехватку доменов, задействованных в связывании второго белка. Поэтому усеченный полипептид не способен правильно модулировать деятельность второго белка. См., например, патентную заявку US 2007/0056058. Другой пример: точечная мутация, при которой происходит замена неконсервативных аминокислот в каталитическом домене, может привести к появлению доминантно-негативного полипептида. См., например, патентную заявку US 2005/032221. Еще один пример: доминантно-негативный полипептид может являться фактором транскрипции, усеченным по сравнению с нативным фактором транскрипции дикого типа, так что усеченный полипептид удерживает ДНК-связывающий домен(ы), однако испытывает нехватку домена(ов) активации. Такой усеченный полипептид может ингибировать связывание ДНК фактором транскрипции дикого типа, ингибируя тем самым активацию транскрипции.

ii) Ингибирование экспрессии модулирующего биомассу полипептида.

Полинуклеотиды и рекомбинантные структуры, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для ингибирования экспрессии модулирующего биомассу полипептида в изучаемом виде растения. См., например, Matzke and Birchler, Nature Reviews Genetics 6:24-35 (2005); Akashi et al., Nature Reviews Mol. Cell Biology 6:413-422 (2005); Mittal, Nature Reviews Genetics 5:355-365 (2004) и Nature Reviews RNA interference collection, Oct. 2005 в Интернете на веб-сайте nature.com/reviews/focus/mai. Известен ряд методов ингибирования экспрессии генов в растениях с помощью нуклеиновых кислот, в том числе расщепление антисмысловой РНК и рибозим-направляемой РНК, посттранскрипционное подавление активности гена (PTGS), например РНК-интерференция (РНКи) и транскрипционное подавление активности гена (TGS). Подходящие полинуклеотиды включают полноразмерные нуклеиновые кислоты, которые кодируют модулирующие биомассу полипептиды, или фрагменты таких полноразмерных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах может быть использован комплемент полноразмерной нуклеиновой кислоты или ее фрагмент. Обычно фрагмент включает не менее 10 нуклеотидов, например не менее 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 нуклеотидов или более. В целом, для компенсации более короткой последовательности может быть использована гомология более высокого уровня.

Один из общеизвестных методов - это антисмысловая технология. В данном методе нуклеиновая кислота репрессируемого гена клонируется и функционально связывается с регуляторной областью и терминирующей транскрипцию последовательностью таким образом, что происходит транскрибирование антисмысловой цепи РНК. Затем происходит изменение рекомбинантной структуры в растениях, как описано в настоящем документе, и продуцируется антисмысловая цепь РНК. Нуклеиновая кислота не должна быть всей последовательностью репрессируемого гена, однако, как правило, она будет существенным дополнением, по меньшей мере, к участку смысловой цепи репрессируемого гена.

В другом методе нуклеиновая кислота может быть транскрибирована в рибозим или каталитическую РНК, которая влияет на экспрессию мРНК. См. патент США № 6423885. Рибозимы могут быть сконструированы в виде особой пары фактически с любой РНК-мишенью, и они могут расщепить фосфодиэфирный остов в конкретном месте, функционально инактивируя таким образом РНК-мишень. Гетерологичные нуклеиновые кислоты могут кодировать рибозимы, сконструированные для расщепления конкретных транскриптов мРНК, предотвращая таким образом экспрессию полипептида. Для разрушения конкретных мРНК применяются рибозимы типа головка молотка, хотя могут быть использованы и различные рибозимы, которые расщепляют мРНК в сайт-специфичных последовательностях распознавания. Рибозимы типа головка молотка расщепляют мРНК в местах, определяемых фланкирующими областями, которые формируют комплементарные пары оснований с мРНК-мишенью. Единственное требование состоит в том, что РНК-мишень должна содержать нуклеотидную последовательность 5'-UG-3'.

Конструирование и продуцирование рибозимов типа головка молотка в данной отрасли знаний известны. См., например, патент США № 5254678 и документ WO 02/46449, а также приведенные в них материалы, использованные при экспертизе заявки. Для повышения эффективности расщепления in vivo в стабильную РНК, такую как транспортная РНК (тРНК), можно внедрить последовательности рибозимов типа головка молотка. Perriman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (13) :6175-6179 (1995); de Feyter and Gaudron, Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Chapter 43, Expressing Ribozymes in Plants, Edited by Turner P.C., Humana Press Inc., Totowa, NJ. Могут быть использованы описанные эндорибонуклеазы РНК, например встречающиеся в природе в Tetrahymena thermophila. См., например, патенты США № 4987071 и 6423885.

Для ингибирования экспрессии гена может быть также использовано, например, посттранскрипционное подавление активности гена (PTGS). Например, можно подготовить конструкцию, включающую последовательность, которая транскрибируется в РНК и может вызвать самоотжиг, например, с образованием двухцепочечной РНК, имеющей структуру типа стебель-петля. В некоторых вариантах одна цепь стволового участка двухцепочечной РНК включает последовательность, подобную или идентичную смысловой кодирующей последовательности (или ее фрагменту) модулирующего биомассу полипептида

- 27 036343 длиной приблизительно от 10 до 2500 нуклеотидов. Длина последовательности, подобной или идентичной смысловой кодирующей последовательности, может быть от 10 до 500 нуклеотидов, от 15 до 300 нуклеотидов, от 20 до 100 нуклеотидов или от 25 до 100 нуклеотидов. Другая цепь стволового участка двухцепочечной РНК включает последовательность, подобную или идентичную антисмысловой цепи (или ее фрагменту) кодирующей последовательности модулирующего биомассу полипептида, и может иметь длину короче, такую же или больше, чем длина соответствующей смысловой последовательности. В некоторых случаях одна цепь стволового участка двухцепочечной РНК включает последовательность, подобную или идентичную нетранслируемой области 3' или 5' (или ее фрагменту) мРНК, которая кодирует модулирующий биомассу полипептид, а другая цепь стволового участка двухцепочечной РНК включает последовательность, подобную или идентичную последовательности, которая является, соответственно, дополнением нетранслируемой области 3' или 5'(или ее фрагмента) мРНК, которая кодирует модулирующий биомассу полипептид. В других вариантах одна цепь стволового участка двухцепочечной РНК включает последовательность, подобную или идентичную последовательности интрона (или его фрагменту) в пре-мРНК, которая кодирует модулирующий биомассу полипептид, а другая цепь стволового участка включает последовательность, подобную или идентичную последовательности, которая является дополнением к последовательности интрона (или его фрагменту) в пре-мРНК.

Петлевой участок двухцепочечной РНК может включать от 3 до 5000 нуклеотидов, например от 3 до 25 нуклеотидов, от 15 до 1000 нуклеотидов, от 20 до 500 нуклеотидов или от 25 до 200 нуклеотидов. Петлевой участок РНК может включать интрон или его фрагмент. Двухцепочечная РНК может иметь ноль, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более структур с петлевыми участками.

Структура, включающая последовательность, которая функционально связана с регуляторной областью и терминирующей транскрипцию последовательностью и которая транскрибируется в РНК, которая может формировать двухцепочечную РНК, трансформируется в растениях, как описано в настоящем документе. Специалистам в данной отрасли знаний известны методы использования РНКи для ингибирования экспрессии гена. См., например, патенты США № 5034323, 6326527, 6452067, 6573099, 6753139 и 6777588. См. также документы WO 97/01952, WO 98/53083, WO 99/32619, WO 98/36083 и публикации патентов США 20030175965, 20030175783, 20040214330 и 20030180945.

Структуры, которые содержат регуляторные области, функционально связанные с молекулами нуклеиновой кислоты в смысловой ориентации, могут быть также использованы для ингибирования экспрессии гена. Продукт транскрипции может быть подобен или идентичен смысловой кодирующей последовательности (или ее фрагменту) модулирующего биомассу полипептида. Продукт транскрипции может быть также неполиаденилированным, в нем может отсутствовать 5'кэп-структура, или он может содержать несплайсируемый интрон. Методы ингибирования экспрессии гена с использованием полноразмерной кДНК, а также частичной последовательности кДНК, известны в данной отрасли знаний. См., например, патент США № 5231020.

В некоторых вариантах структура с нуклеиновой кислотой, имеющей как минимум одну цепь, которая является матрицей и для смысловой, и для несмысловой последовательностей, комплементарных друг другу, используется для ингибирования экспрессии гена. Смысловая и антисмысловая последовательности могут быть частью большей молекулы нуклеиновой кислоты или могут быть частью отдельных молекул нуклеиновой кислоты, последовательности которых не являются комплементарными. Смысловая или антисмысловая последовательность может быть последовательностью, которая идентична (или комплементарна) последовательности мРНК, нетранслируемой областью 3' или 5'мРНК, или интрона в пре-мРНК, которая кодирует модулирующий биомассу полипептид, или фрагменту таких последовательностей. В некоторых вариантах смысловая или несмысловая последовательность идентична или комплементарна последовательности регуляторной области, которая стимулирует транскрипцию гена, кодирующего модулирующий биомассу полипептид. В каждом случае смысловая последовательность является последовательностью, комплементарной антисмысловой последовательности.

Длина смысловой и антисмысловой последовательностей может быть больше примерно 10 нуклеотидов (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более нуклеотидов). Например, антисмысловая последовательность может быть длиной 21 или 22 нуклеотида. Обычно смысловая и антисмысловая последовательности имеют длину примерно от 15 до 30 нуклеотидов, например примерно от 18 до 28 нуклеотидов или примерно от 21 до 25 нуклеотидов.

В некоторых вариантах антисмысловая последовательность является последовательностью, комплементарной последовательности мРНК (или ее фрагменту), которая кодирует модулирующий биомассу полипептид, описанный в настоящем документе. Смысловая последовательность, комплементарная антисмысловой последовательности, может являться последовательностью, присутствующей в мРНК кодирующего биомассу полипептида. Как правило, смысловая и антисмысловая последовательности сконструированы таким образом, чтобы соответствовать 15-30 нуклеотидной последовательности мРНКмишени для того, чтобы понизить уровень мРНК-мишени.

В некоторых вариантах для ингибирования экспрессии гена может быть использована структура с нуклеиновой кислотой, имеющей как минимум одну цепь, которая является матрицей для нескольких

- 28 036343 смысловых последовательностей (например, для 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более смысловых последовательностей). Аналогичным образом, для ингибирования экспрессии гена может быть использована структура с нуклеиновой кислотой, имеющей как минимум одну цепь, которая является матрицей для нескольких антисмысловых последовательностей (например, для 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более антисмысловых последовательностей). Например, конструкция может содержать нуклеиновую кислоту, имеющую как минимум одну цепь, которая является матрицей и для двух смысловых последовательностей, и для двух антисмысловых последовательностей. Множественные смысловые последовательности могут быть идентичными или различными, и множественные антисмысловые последовательности могут быть идентичными или различными. Например, конструкция может иметь нуклеиновую кислоту, имеющую одну цепь, которая является матрицей для двух идентичных смысловых последовательностей и двух идентичных антисмысловых последовательностей, которые комплементарны двум идентичным смысловым последовательностям. Или же изолированная нуклеиновая кислота может иметь одну цепь, которая является матрицей для (1) двух идентичных смысловых последовательностей длиной 20 нуклеотидов, (2) одной антисмысловой последовательности, комплементарной двум идентичным смысловым последовательностям длиной 20 нуклеотидов, (3) смысловой последовательности длиной 30 нуклеотидов и (4) трех идентичных антисмысловых последовательностей, комплементарных смысловой последовательности длиной 30 нуклеотидов. Конструкции, приведенные в настоящем документе, могут быть составлены таким образом, чтобы они были пригодны для смысловых или антисмысловых последовательностей. Например, за двумя идентичными смысловыми последовательностями могут следовать две идентичные антисмысловые последовательности, или их можно расположить между двумя идентичными антисмысловыми последовательностями.

Нуклеиновая кислота, имеющая как минимум одну цепь, которая является матрицей для одной или нескольких смысловых и/или антисмысловых последовательностей, может быть функционально связана с регуляторной областью для стимуляции транскрипции молекулы РНК, содержащей смысловую и/или антисмысловую последовательность(и). Кроме того, такая нуклеиновая кислота может быть функционально связана с терминирующей транскрипцию последовательностью, такой как терминатор гена нопалинсентазы (nos). В некоторых случаях две регуляторные области могут направлять транскрипцию двух транскриптов: одну из верхней цепи и одну из нижней цепи. См. например, Yan et al., Plant Physiol., 141:1508-1518 (2006). Две регуляторные области могут быть одинаковыми или различными. Два транскрипта могут образовывать молекулы двухцепочечной РНК, которые индуцируют деградацию РНКмишени. В некоторых случаях нуклеиновую кислоту можно расположить в пределах Т-ДНК или выделенной из растения перенесенной ДНК (пахитенной ДНК) таким образом, чтобы последовательности левой и правой границы Т-ДНК или последовательности левой и правой пахитенной ДНК прилегали к нуклеиновой кислоте или находились на одной из сторон нуклеиновой кислоты. См. патентную заявку US 2006/0265788. Последовательность нуклеиновой кислоты между двумя регуляторными областями может быть длиной примерно от 15 до 300 нуклеотидов. В некоторых вариантах последовательность нуклеиновой кислоты между двумя регуляторными областями имеет длину примерно от 15 до 200 нуклеотидов, примерно от 15 до 100 нуклеотидов, примерно от 15 до 50 нуклеотидов, примерно от 18 до 50 нуклеотидов, примерно от 18 до 40 нуклеотидов, примерно от 18 до 30 нуклеотидов или примерно от 18 до 25 нуклеотидов.

В некоторых методах ингибирования экспрессии гена у растений, основанных на использовании нуклеиновой кислоты, подходящей нуклеиновой кислотой может быть аналог нуклеиновой кислоты. Аналоги нуклеиновой кислоты можно модифицировать на базовом компоненте, сахарном компоненте или фосфатном остове, например для улучшения стабильности, гибридизации или растворимости нуклеиновой кислоты. Модификации на базовом компоненте включают превращения дезоксиуридина в дезокситимидин, а также 5-метил-2'-дезоксицитидин и 5-бромо-2'-дезоксицитидин в дезоксицитидин. Модификации на сахарном компоненте включают превращении 2' гидроксила сахара рибозы в форму сахаров 2'-O-метил или 2'-O-аллил. Можно модифицировать фосфатный остов дезоксирибозы для продуцирования морфолинонуклеиновых кислот, у которых каждый базовый компонент связан с шестичленным морфолиновым кольцом, или пептидных нуклеиновых кислот, у которых остов дезоксифосфата заменен на псевдопептидный остов, а четыре основания сохраняются. См., например, Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7:187-195 (1997); Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem., 4:5-23 (1996). Кроме того, остов дезоксифосфата можно заменить, например, на фосфоротиоат или остов фосфородитиоата, фосфороамидит или остов алкилфосфотриэфира.

В. Конструкции/векторы.

Рекомбинантные конструкции, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для трансформации растений или растительных клеток с целью модулирования уровней биомассы. Как описано в настоящем документе, рекомбинантная конструкция нуклеиновой кислоты может включать нуклеиновую кислоту, которая кодирует модулирующий биомассу полипептид, функционально связанный с регуляторной областью, пригодной для того, чтобы экспрессировать модулирующий биомассу полипептид в растении или клетке. Таким образом, нуклеиновая кислота может включать кодирующую последовательность, которая кодирует модулирующие биомассу полипептиды, как описано в последовательно- 29 036343 стях SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 38,

39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 64, 66, 68, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 84, 86,

87, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 125, 127,

129, 131, 132, 133, 135, 137, 139, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 160,

162, 163, 164, 166, 168, 169, 171, 173, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 185, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 194,

195, 196, 198, 200, 202, 203, 204, 206, 207, 209, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230,232,

234, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263,264,

266, 268, 269, 271, 273, 275, 276, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 294, 295, 296, 297,298,

299, 300, 302, 304, 305, 306, 308, 310, 311, 312, 314, 315, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 326, 327, 329,331,

332, 334, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 354, 356, 357, 359, 361, 363, 365, 367,369,

371, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 406, 407,409,

411, 413, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 429, 430, 431, 433, 435, 436, 437, 438, 439,440,

442, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 459, 461, 463, 464, 466, 467, 468, 470,472,

474, 476, 478, 479, 480, 482, 483, 484, 486, 488, 490, 492, 493, 495, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504,506,

508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 521, 523, 525, 526, 528, 529, 531, 532, 534, 536, 537, 539,540,

541, 543, 545, 547, 549, 550, 551, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 574, 575,577,

579, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 593, 595, 597, 598, 600, 602, 603, 604, 605, 606, 608, 609, 610, 611,613,

615, 616, 618, 619,620, 622, 623, 625, 627, 629, 630, 632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 641, 642, 643, 645, 647, 649, 651, 652, 653, 655, 657, 659, 660, 662, 664, 666, 667, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 689, 691, 693, 695 или 697. Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих модулирующие биомассу полипептиды, приведены в последовательностях SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 19, 21, 23, 26, 28, 31, 35, 42, 44, 46, 48, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 69, 73, 76, 78, 80, 83, 85, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 116, 119, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 143, 148, 150, 157, 159, 161, 165, 167, 170, 172, 175, 177,

179, 181, 183, 187, 192, 197, 199, 201, 205, 208, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231,233,

235, 237, 240, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 265, 267, 270, 272, 274, 277, 280, 284, 286, 288, 290, 293,301,

303, 307, 309, 313, 316, 318, 322, 325, 328, 330, 333, 335, 339, 341, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 358,360,

362, 364, 366, 368, 370, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404,408,

410, 412, 414, 419, 423, 425, 427, 432, 434, 441, 443, 445, 451, 458, 460, 462, 465, 469, 471, 473, 475,477,

481, 485, 487, 489, 491, 494, 496, 498, 505, 507, 510, 512, 514, 520, 522, 524, 527, 530, 533, 535, 538,542,

544, 546, 548, 553, 555, 557, 559, 561, 564, 566, 568, 570, 572, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590,592,

594, 596, 599, 601, 607, 612, 614, 617, 621, 624, 626, 628, 631, 635, 640, 644, 646, 648, 650, 654, 656,658,

661, 663, 665, 668, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 690, 692, 694 или 696 или в перечне последовательностей. Модулирующий биомассу полипептид, закодированный рекомбинантной нуклеиновой кислотой, может быть нативным модулирующим биомассу полипептидом или может быть гетерологичным по отношению к клетке. В некоторых случаях рекомбинантная конструкция содержит нуклеиновую кислоту, которая ингибирует экспрессию модулирующего биомассу полипептида, функционально связанного с регуляторной областью. Примеры подходящих регуляторных областей описаны в разделе Регуляторные области.

Также представлены векторы, содержащие конструкции рекомбинантных нуклеиновых кислот, аналогичных тем, которые описаны в настоящем документе. Подходящими остовами векторов являются, например, те, которые обычно используются в данной отрасли, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, искусственные бактериальные хромосомы, искусственные дрожжевые хромосомы или искусственные хромосомы Р1. Подходящими экспрессионными векторами являются в том числе плазмиды и вирусные векторы, полученные, например, из бактериофагов, бакуловирусов и ретровирусов. Многочисленные векторы и экспрессирующие системы доступны для приобретения в таких корпорациях, как Novagen® (Мэдисон, штат Висконсин), Clontech® (Пало-Альто, штат Калифорния), Stratagene® (Ла-Хойя, штат Калифорния) и Invitrogen/Life Technologies® (Карлсбад, штат Калифорния).

Векторы, приводимые в настоящем документе, также могут включать, например, области начала репликации, области прикрепления к скелету и/или маркеры.

Маркерный ген может передавать растительной клетке селектируемый фенотип. Например, маркер может передавать устойчивость к биоцидам, такую как устойчивость к антибиотикам (например, канамицину, G418, блеомицину или гигромицину), или к гербицидам (например, глифосату, хлорсульфурону или фосфинотрицину). Кроме того, экспрессионный вектор может включать маркерную последовательность, предназначенную для облегчения манипуляции с экспрессируемыми полипептидами или их обнаружения (например, очистки или локализации). Маркерные последовательности, такие как люцифераза, β-глюкуронидаза (GUS), зеленый флуоресцентный белок (GFP), глютатион S-трансфераза (GST), полигистидин, c-myc, гемагглютинин или маркер Flag™ (Kodak, Нью-Хейвен, штат Коннектикут), обычно экспрессируются в форме слияния с кодированным полипептидом. Такие маркеры можно вставлять в любом месте полипептида, в том числе в аминоконцевой или карбоксиконцевой области.

Г. Регуляторные области.

Выбор регуляторных областей для включения в рекомбинантную конструкцию зависит от несколь- 30 036343 ких факторов, в том числе от эффективности, селективности, способности к индуцированию, желательного уровня экспрессии и преимущественно клеточной или тканевой экспрессии. Для специалиста в данной области обычным делом является модулирование экспрессии кодирующей последовательности путем соответствующего подбора и расположения регуляторных областей в кодирующей последовательности. Транскрипцию нуклеиновой кислоты можно модулировать аналогичным образом.

Некоторые подходящие регуляторные области инициируют транскрипцию только или преимущественно в клетках определенных типов. Методы идентификации и определения характеристик регуляторных областей в геномной ДНК растения известны и описаны в том числе в следующих ссылочных материалах: Jordano et al., Plant Cell, 1:855-866 (1989); Bustos et al., Plant Cell, 1:839-854 (1989); Green et al., EMBO J., 7:4035-4044 (1988); Meier et al., Plant Cell, 3:309-316 (1991); и Zhang et al., Plant Physiology, 110:1069-1079 (1996).

Примеры различных классов регуляторных областей описаны ниже. Некоторые регуляторные области, указанные ниже, а также дополнительные регуляторные области более подробно описаны в заявках на патент США с серийными номерами 60/505689; 60/518075; 60/544771; 60/558869; 60/583691; 60/619181; 60/637140; 60/757544; 60/776307; 10/957569; 11/058689; 11/172703; 11/208308; 11/274890; 60/583609; 60/612891; 11/097589; 11/233726; 11/408791; 11/414142; 10/950321; 11/360017;

PCT/US05/011105; PCT/US05/23639; PCT/US05/034308; PCT/US05/034343; а также PCT/US06/038236; PCT/US06/040572 и PCT/US07/62762.

Например, последовательности регуляторных областей р326, YP0144, YP0190, р13879, YP0050, р32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, РТ0848, РТ0633, YP0128, YP0275, РТ0660, РТ0683, РТ0758, РТ0613, РТ0672, РТ0688, РТ0837, YP0092, РТ0676, РТ0708, YP0396, YP0007, YP0111, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120, YP0374, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0137, YP0285, YP0212, YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, PT0650, PT0695, PT0723, PT0838, PT0879, PT0740, PT0535, PT0668, PT0886, PT0585, YP0381, YP0337, PT0710, YP0356, YP0385, YP0384, YP0286, YP0377, PD1367, PT0863, PT0829, PT0665, PT0678, YP0086, YP0188, YP0263, PT0743 и YP0096 приведены в перечне последовательностей PCT/US06/040572; последовательность регуляторной области РТ0625 приведена в перечне последовательностей PCT/US05/034343; последовательности регуляторных областей РТ0623, YP0388, YP0087, YP0093, YP0108, YP0022 и YP0080 приведены в перечне последовательностей в заявке на патент США с серийным номером 11/172703; последовательность регуляторной области PR0924 приведена в перечне последовательностей PCT/US07/62762; и последовательности регуляторных областей р530с10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102 и pOsYp285 приведены в перечне последовательностей PCT/US06/038236.

Следует иметь в виду, что регуляторная область может удовлетворять критериям одной классификации, исходя из ее действия в растениях одного вида, и одновременно удовлетворять критериям другой классификации, исходя из ее действия в растениях другого вида.

i) Экспрессирующие промоторы широкого спектра действия.

Можно сказать, что промотор имеет широкий спектр действия, когда он способствует транскрипции во многих, но необязательно всех, растительных тканях. Например, экспрессирующий промотор широкого спектра действия может способствовать транскрипции функционально связанной последовательности в одном или нескольких побегах, верхушке побега (апексе) и листьях, однако слабо способствует или совсем не способствует транскрипции в таких тканях, как корни или стебли. Другой пример: экспрессирующий промотор широкого спектра действия может способствовать транскрипции функционально связанной последовательности в одном или нескольких стеблях, побегах, верхушке побега (апексе) и листьях, однако может слабо способствовать или совсем не способствовать транскрипции в таких тканях, как репродуктивные ткани цветов и развивающиеся семена. Неограниченные примеры экспрессирующих промоторов широкого спектра действия, которые могут быть включены в конструкции нуклеиновой кислот, приведенных в настоящем документе, включают промоторы р326, YP0144, YP0190, р13879, YP0050, р32449, 21876, YP0158, YP0214, YP0380, РТ0848 и РТ0633.

Дополнительные примеры включают промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, промотор маннопин-синтазы (MAS), промоторы 1' или 2', полученные из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, промотор вируса мозаики норичника 34S, актиновые промоторы, такие как актиновый промотор риса, и убиквитиновые промоторы, такие как промотор убиквитин-1 кукурузы. В некоторых случаях промотор CaMV 35S исключается из категории экспрессирующих промоторов широкого спектра действия.

ii) Корневые промоторы.

Активные промоторы роста корней осуществляют транскрипцию в ткани корня, например в тканях эндодермы корня, эпидермиса корня или проводящей системы корня. В некоторых вариантах активные корневые промоторы являются преимущественно корневыми промоторами, т.е. такими, которые осуществляют транскрипцию только или преимущественно в ткани корня. Преимущественно тканевые промоторы включают промоторы YP0128, YP0275, РТ0625, РТ0660, РТ0683 и РТ0758. Другие преимущественно корневые промоторы включают промоторы РТ0613, РТ0672, РТ0688 и РТ0837, которые способствуют транскрипции главным образом в ткани корня и в меньшей степени - в семяпочках и/или семенах. Другие примеры преимущественно корневых промоторов включают корнеспецифические субдомены промо- 31 036343 тора CaMV 35S (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7890-7894 (1989)), специфические промоторы корневой клетки, о которых сообщается в работе Conkling et al., Plant Physiol., 93:1203-1211 (1990), и промотор табака RD2.

iii) Промоторы вызревающего эндосперма.

В некоторых вариантах могут быть полезны промоторы, которые способствуют транскрипции в вызревающем эндосперме. Транскрипция от промотора вызревающего эндосперма обычно начинается после оплодотворения, происходит главным образом в ткани эндосперма во время развития семени и обычно достигает высшей точки на этапе целлюляризации. Наиболее подходящими являются промоторы, активные, главным образом, в вызревающем эндосперме, хотя иногда могут быть полезны и промоторы, активные в других тканях. Неограниченные примеры промоторов вызревающего эндосперма, которые могут быть включены в конструкции нуклеиновой кислоты, приведенные в настоящем документе, включают промотор напина, промотор арселина-5, промотор фазеолина (Bustos et al., Plant Cell, l(9):839853 (1989)), промотор соевых ингибиторов трипсина (Riggs et al., Plant Cell, 1(6):609-621 (1989)), промотор АЦП (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2):255-267 (1993)), промотор стеароил-ацп десатуразы (Slocombe et al., Plant Physiol., 104(4):167-176 (1994)), промотор сои подгруппы α'β-конглицинина (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8560-8564 (1986)), промотор олеозина (Hong et al., Plant Mol. Biol., 34 (3):549-555 (1997)) и промоторы зеинов, таких как промотор зеинов 15 кД, промотор зеинов 16 кД, промотор зеинов 19 кД, промотор зеинов 22 кД и промотор зеинов 27 кД. Также пригодны промотор Osgt-1 из гена глютелин-1 риса (Zheng et al., Mol. Cell Biol., 13:5829-5842 (1993)), промотор β-амилазы и промотор хордеина ячменя. Прочие промоторы вызревающего эндосперма включают промоторы YP0092, РТ0676 и РТ0708.

iv) Промоторы ткани завязи.

Также могут быть полезны промоторы, активные в тканях завязи, таких как стенка семяпочки и мезокарпий, например промотор полигалактуронидазы, промотор TRX банана, промотор актина дыни, YP0396 и РТ0623. Примерами промоторов, активных главным образом в семяпочках, являются YP0007, YP0111, YP0092, YP0103, YP0028, YP0121, YP0008, YP0039, YP0115, YP0119, YP0120 и YP0374.

v) Промоторы зародышевого мешка/раннего этапа развития эндосперма.

Для достижения экспрессии в зародышевом мешке/на раннем этапе развития эндосперма могут быть использованы регуляторные области, активные в полярных ядрах и/или главной клетке, или в предшественниках полярных ядер, но не в яйцеклетках или предшественниках яйцеклеток. Наиболее подходящими являются промоторы, которые способствуют экспрессии только или преимущественно в полярных ядрах или их предшественниках и/или в главной клетке. Паттерн транскрипции, которая проходит от стадии полярных ядер до раннего этапа развития эндосперма, может также находиться в промоторах зародышевого мешка/раннего этапа развития эндосперма, хотя обычно транскрипция в значительной степени понижается на поздних этапах развития эндосперма во время и после этапа целлюляризации. С промоторами зародышевого мешка/раннего этапа развития экспрессии в зиготе или в развивающемся эмбрионе эндосперма обычно не происходит.

Подходящими могут быть промоторы, которые получены из следующих генов: Arabidopsis viviparous-1 (см. GenBank No. U93215); Arabidopsis atmycl (см. Urao, Plant Mol. Biol., 32:571-57 (1996); Conceicao, Plant, 5:493-505 (1994)); Arabidopsis FIE (GenBank No. AF129516); Arabidopsis MEA; Arabidopsis FIS2 (GenBank No. AF096096) и FIE 1.1 (патент США 6906244). Другими подходящими промоторами могут быть те, которые получены из следующих генов: ген кукурузы МАС1 (см. Sheridan, Genetics, 142:10091020 (1996)); ген кукурузы Cat3 (см. GenBank No. L05934; Abler, Plant Mol. Biol., 22:10131-1038 (1993)). К другим промоторам относятся следующие промоторы Arabidopsis: YP0039, YP0101, YP0102, YP0110, YP0117, YP0119, YP0137, DME, YP0285 и YP0212. К другим промоторам, которые могут быть полезны, относятся следующие промоторы риса: р530с10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102 и pOsYp285.

vi) Промоторы зародышей.

Регуляторные области, которые главным образом способствуют транскрипции в зиготных клетках после оплодотворения, могут обеспечивать экспрессию преимущественно на стадии зародыша. Наиболее подходящими являются промоторы, которые главным образом способствуют транскрипции в зародышах на ранних этапах развития до стадии образования сердцевины, однако также пригодна экспрессия в зародышах на более поздних этапах вызревания. Промоторы преимущественно для стадии зародыша включают промотор липид-переносящих белков (Ltp1) ячменя (Plant Cell Rep 20:647-654 (2001)), YP0097, YP0107, YP0088, YP0143, YP0156, РТ0650, РТ0695, РТ0723, РТ0838, РТ0879 и РТ0740.

vii) Промоторы фотосинтетических тканей.

Промоторы, активные в фотосинтетических тканях, осуществляют транскрипцию в зеленых тканях, таких как листья и стебли. Наиболее подходящими являются промоторы, которые способствуют экспрессии только или преимущественно в таких тканях. Примерами таких промоторов являются промоторы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (RbcS), такие как промотор RbcS из лиственницы американской (Larix laricina), промотор сосны cab6 (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol., 35:773-778 (1994)), промотор Cab-1 из пшеницы (Fejes et al., Plant Mol. Biol., 15:921-932 (1990)), промотор CAB-1 из шпината (Lub- 32 036343 berstedt et al., Plant Physiol., 104:997-1006 (1994)), промотор cablR из риса (Luan et al., Plant Cell, 4:971981 (1992)), промотор пируват-ортофосфатдикиназы (PPDK) из кукурузы (Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9586-9590 (199з)), промотор Lhcbl*2 табака (Cerdan et al., Plant Mol. Biol., 33:245-255 (1997)), промотор Arabidopsis thaliana SUC2 симпортера сахарозы-Н+ (Truernit et al., Planta, 196:564-570 (1995)) и промоторы белков тилакоидных мембран из шпината (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Другие промоторы фотосинтетических тканей включают РТ0535, РТ0668, РТ0886, YP0144, YP0380 и РТ0585.

viii) Промоторы проводящих тканей.

Примерами промоторов, которые имеют высокую или преимущественную активность в сосудистых пучках, являются YP0087, YP0093, YP0108, YP0022 и YP0080. К другим промоторам, которые преимущественно активны в проводящих тканях, относятся промотор GRP 1.8 богатой глицином клеточной стенки белка GRP 1.8 (Keller and Baumgartner, Plant Cell, 3 (10):1051-1061 (1991)), промотор вируса желтой крапчатости коммелины (CoYMV) (Medberry et al., Plant Cell, 4(2):185-192 (1992)) и промотор палочковидного тунгро-вируса риса (RTBV) (Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (2):687-692 (2004)).

ix) Индуцируемые промоторы.

Индуцируемые промоторы осуществляют транскрипцию под влиянием внешних стимуляторов, таких как химические вещества, или стимуляторов, связанных с окружающей средой. Например, индуцируемые промоторы могут осуществлять транскрипцию под влиянием гормонов, таких как гиббереллиновая кислота или этилен, или под влиянием света или засухи. Примерами индуцируемых засухой промоторов являются YP0380, РТ0848, YP0381, YP0337, РТ0633, YP0374, РТ0710, YP0356, YP0385, YP0396, YP0388, YP0384, РТ0688, YP0286, YP0377, PD1367 и PD0901. Примерами индуцируемых азотом промоторов являются РТ0863, РТ0829, РТ0665 и РТ0886. Примерами индуцируемых тенью промоторов являются PR0924 и РТ0678. Примером промотора, индуцируемого солью, служит rd29A (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech 17: 287-291).

x) Базальные промоторы.

Базальный промотор является минимальной последовательностью, необходимой для сборки транскрипционного комплекса, требуемого для инициации транскрипции. Базальные промоторы часто включают элемент ТАТА-бокс, который может быть расположен между примерно 15 и примерно 35 нуклеотидами вышележащей области от сайта инициации транскрипции. Базальные промоторы могут также включать элемент ССААТ-бокс (как правило, последовательность ССААТ) и/или последовательность GGGCG, которая может быть расположена между примерно 40 и примерно 200 нуклеотидами, обычно примерно между 60 и примерно 120 нуклеотидами вышележащей области от сайта старта транскрипции.

xi) Промоторы стебля.

Промотор стебля может быть специфичным для одной или нескольких тканей стебля или специфичным для стебля и других частей растения. Промоторы стебля могут иметь высокую или преимущественную активность, например, в эпидермисе и кортексе, сосудистом камбии, прокамбии или ксилеме. К примерам промоторов стебля относится YP0018, о котором сообщено в US 20060015970, CryIA(b) и CryIA(c) (Braga et al., 2003, Journal of New Seeds 5:209-221).

xii) Прочие промоторы.

Другие классы промоторов включают, в числе прочего, промоторы, преферентные для побегов, каллюса, клеток трихомы, замыкающих клеток, таких как РТ0678, клубней, паренхимных клеток и для старения. Также могут быть полезны промоторы, обозначенные YP0086, YP0188, YP0263, РТ0758, РТ0743, РТ0829, YP0119 и YP0096, как описано в вышеуказанных заявках на патент.

xiii) Прочие регуляторные области.

В конструкции нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, может быть включена нетранслируемая область 5' (UTR). Нетранслируемая область 5' транскрибируется, но не транслируется, лежит между сайтом старта транскрипции и кодоном инициации трансляции и может включать +1 нуклеотид. Нетранслируемая область 3' может находиться между терминирующим трансляцию кодоном и концом транскрипции. Нетранслируемые области могут выполнять специфические функции, такие как увеличение стабильности мРНК или ослабление трансляции. К примерам нетранслируемых областей 3' относятся в числе прочего сигналы полиаденилирования и терминирующие транскрипцию последовательности, например терминирующую нопалинсентазу последовательность.

Следует понимать, что в рекомбинантном полинуклеотиде может присутствовать более одной регуляторной области, например интроны, энхансеры, вышележащие области активации, терминаторы транскрипции и индуцируемые элементы. Таким образом, к примеру, более чем одна регуляторная область может быть функционально связана с последовательностью полинуклеотида, который кодирует моделирующий биомассу полипептид.

Регуляторные области, такие как промоторы эндогенных генов, могут быть получены путем химического синтеза или путем субклонирования из геномной ДНК, которая включает такую регуляторную область. Нуклеиновая кислота, содержащая такую регуляторную область, может также включать примыкающие последовательности, которые содержат сайты рестрикционных ферментов, облегчающих последующую манипуляцию.

- 33 036343

IV) Трансгенные растения и растительные клетки.

А. Трансформация.

В изобретении также представлены трансгенные растительные клетки и растения, содержащие как минимум одну рекомбинантную конструкцию нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем документе. Растение или растительная клетка могут быть трансформированы путем интеграции конструкции в их геном, т.е. они могут быть устойчиво трансформированными. Устойчиво трансформированные клетки обычно удерживают интродуцированную нуклеиновую кислоту при каждом делении клетки. Растение или растительная клетка могут быть также трансформированы временно таким образом, чтобы конструкция не интегрировалась в их геном. Временно трансформированные клетки обычно полностью или частично теряют интродуцированную конструкцию нуклеиновой кислоты при каждом делении клетки, так что после значительного количества делений клеток интродуцированную нуклеиновую кислоту обнаружить в дочерних клетках невозможно. И временно трансформированные, и устойчиво трансформированные трансгенные растения и растительные клетки могут быть полезны при использовании методов, описанных в настоящем документе.

Трансгенные растительные клетки, которые используются в методах, описанных в настоящем документе, могут составлять часть растения или растение целиком. Такие растения могут выращиваться пригодным для рассматриваемых видов способом - в ростовой камере, теплице или в поле. Трансгенные растения при желании можно разводить для определенных целей, например для интродуцирования рекомбинантных нуклеиновых кислот в другие линии, для переноса рекомбинантной нуклеиновой кислоты в другие виды или для дальнейшей селекции желаемых признаков. Или же трансгенные растения можно размножать вегетативно, применительно к видам, восприимчивым к таким технологиям. Для целей настоящего документа трансгенное растение также относится к потомству исходного трансгенного растения при условии, что потомство наследует трансген. Семена, полученные от трансгенного растения, могут выращиваться и затем самовоспроизводиться (или скрещиваться с сортами других линий и самовоспроизводиться) для получения семян, гомозиготных по конструкции нуклеиновой кислоты.

Трансгенные растения можно выращивать в суспензионной культуре, или ткани, или культуре органов. Для целей настоящего изобретения могут быть использованы методы выращивания тканевой культуры на жидкой и/или твердой питательной основе. При использовании твердой среды трансгенные растительные клетки можно помещать непосредственно в среду или можно разместить на фильтре, который затем помещают в среду. При использовании жидкой среды трансгенные растительные клетки можно помещать на флотационное устройство, например на пористую мембрану, которая находится в контакте с жидкой средой. Твердой средой может быть, например, агар с питательной средой МурасигеСкуга (MS) с подходящей концентрацией ауксина, например 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4D), и подходящей концентрацией цитокинина, например кинетина.

При использовании временно трансформированных растительных клеток последовательность репортера, которая кодирует полипептид репортера, имеющий активность репортера, может быть включена в процедуру трансформации, и испытание активности или экспрессии репортера можно выполнить в подходящее время после трансформации. Подходящее время для проведения испытания может обычно составлять примерно 1-21 день после трансформации, например примерно 1-14 дней, примерно 1-7 дней или примерно 1-3 дня. Промежуточные испытания особенно удобны для проведения экспресс-анализов у различных видов или для подтверждения экспрессии гетерологичного модулирующего биомассу полипептида, экспрессия которого в определенных клетках-реципиентах не была подтверждена ранее.

Способы интродукции нуклеиновых кислот в однодольные и двудольные растения в данной отрасли знаний известны и включают, помимо прочего, агробактериальную трансформацию, трансформацию с помощью вирусных векторов, трансформацию с помощью электропорации и генных пушек, например, патенты США 5538880; 5204253; 6329571 и 6013863. Если для трансформации в качестве тканиреципиента используется клетка или культура ткани, выращенная в питательной среде, при желании растения могут быть регенерированы из трансформированных культур способами, которые известны специалистам в данной области.

Б. Скрининг/отбор.

Можно провести скрининг популяции трансгенных растений и/или отбор в ней тех представителей популяции, у которых признаки или фенотип передаются путем экспрессии трансгена. Например, можно провести скрининг популяции потомков отдельного объекта трансформации по тем растениям, которые показывают необходимый уровень экспрессии модулирующего биомассу полипептида или нуклеиновой кислоты. Для определения уровней экспрессии можно использовать физические и биохимические методы. Они включают саузерн-блоттинг или ПЦР-амплификацию для обнаружения полинуклеотида; нозернблоттинг, защиту от S1 РНКазы, метод удлинения затравки или амплификацию ОТ-ПЦР для определения транскриптов РНК; ферментные анализы для определения активности ферментов или рибозимов полипептидов и полинуклеотидов; электрофорез белкового геля, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммуноферментный анализ для определения полипептидов. Другие способы, такие как гибридизация in situ, окрашивание ферментов и иммуноокрашивание, могут быть также использованы для определения наличия или экспрессии полипептидов и/или полинуклеотидов. Способы выполнения всех упо

- 34 036343 мянутых приемов известны. В качестве варианта можно провести скрининг популяции растений с независимыми событиями трансформации по тем растениям, которые показывают необходимый признак, такой как модулированный уровень биомассы. Отбор и/или скрининг можно проводить по одному и/или нескольким поколениям и/или по нескольким географическим местам. В некоторых случаях можно выращивать трансгенные растения и производить их отбор в условиях, которые индуцируют желаемый фенотип или же необходимы для получения желаемого фенотипа у трансгенного растения. Кроме того, отбор и/или скрининг можно применять во время определенной стадии развития, на которой ожидается, что растение проявит фенотип. Отбор и/или скрининг можно проводить для отбора трансгенных растений, имеющих статистически достоверную разницу в уровне биомассы по сравнению с контрольным растением, у которого трансген отсутствует. Отобранные или прошедшие скрининг трансгенные растения имеют измененный фенотип по сравнению с соответствующим контрольным растением, как описано в разделе Фенотипы трансгенных растений настоящего документа.

В. Виды растений.

Полинуклеотиды и векторы, описанные в настоящем документе, можно использовать для трансформации ряда однодольных и двудольных растений и систем растительных клеток, в том числе видов одного из следующих семейств: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae или Vitaceae.

Подходящие виды могут включать представителей родов Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solarium, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis и Zea.

Подходящие виды включают Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (бородач), Pennisetum purpureum (слоновая трава), Phalaris arundinacea (канареечник трубковидный), Cynodon dactylon (бермудская трава), Festuca arundinacea (овсяница высокая), Spartina pectinata (спартина гребенчатая), Medicago sativa (люцерна), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива), Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale (тритикум гибрид пшеницы и ржи) и бамбук.

Подходящие виды также включают Helianthus annuus (подсолнечник), Carthamus tinctorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина обыкновенная), Elaeis guineensis (гвинейская масличная пальма), Linum usitatissimum (лен посевной) и Brassica juncea.

Подходящие виды также включают Beta vulgaris (сахарная свекла) и Manihot esculenta (маниок съедобный).

Подходящие виды также включают Lycopersicon esculentum (помидор), Lactuca sativa (салат), Musa paradisiaca (банан райский), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (капуста спаржевая, цветная капуста, капуста брюссельская), Camellia sinensis (чай китайский), Fragaria ananassa (земляника садовая), Theobroma cacao (дерево какао), Coffea arabica (кофейное дерево аравийское), Vitis vinifera (виноград винный), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (перец горький и сладкий), Allium сера (лук репчатый), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква крупноплодная), Cucurbita moschata (тыква мускатная), Spinacea oleracea (шпинат огородный), Citrullus lanatus (арбуз обыкновенный), Abelmoschus esculentus (окра) и Solanum melongena (баклажан).

Подходящие виды также включают Papaver somniferum (мак снотворный), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sangumaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii и Tanacetum parthenium.

Подходящие виды также включают Parthenium argentatum (гваюла серебристая), Hevea spp. (гевея бразильская), Mentha spicata (мята колосовая), Mentha piperita (мята перечная), Bixa orellana и Alstroemeria spp.

Подходящие виды также включают Rosa spp. (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика садовая), Petunia spp. (петуния) и Poinsettia pulcherrima (пуансеттия).

- 35 036343

Подходящие виды также включают Nicotiana tabacum (табак), Lupinus albus (люпин белый), Uniola paniculata (униола метельчатая), полевица (Agrostis spp.), Populus tremuloides (тополь осинообразный),

Pinus spp. (сосна), Abies spp. (пихта), Acer spp. (клен), Hordeum vulgare (ячмень посевной), Poa pratensis (мятлик луговой), Lolium spp. (плевел) и Phleum pratense (тимофеевка луговая).

В некоторых вариантах подходящими видами могут быть дикие, сорные или культивированные виды Pennisetum, такие как Pennisetum alopecuroides, Pennisetum arnhemicum, Pennisetum caffrum, Pennisetum clandestinum, Pennisetum divisum, Pennisetum glaucum, Pennisetum latifolium, Pennisetum macrostachyum, Pennisetum macrourum, Pennisetum orientale, Pennisetum pedicellatum, Pennisetum polystachion, Pennisetum polystachion ssp. Setosum, Pennisetum purpureum, Pennisetum setaceum, Pennisetum subangustum, Pennisetum typhoides, Pennisetum villosum или их гибриды (например, Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum).

В некоторых вариантах подходящими видами могут быть дикие, сорные или культивированные виды и/или разновидности Miscanthus, такие как Miscanthus x giganteus, Miscanthus sinensis, Miscanthus x ogiformis, Miscanthus floridulus, Miscanthus transmorrisonensis, Miscanthus oligostachyus, Miscanthus nepaiensis, Miscanthus sacchariflorus, Miscanthus x giganteus Amuri, Miscanthus x giganteus Nagara, Miscanthus x giganteus Illinois, Miscanthus sinensis вар. Goliath, Miscanthus sinensis вар. Roland, Miscanthus sinensis вар. Africa, Miscanthus sinensis вар. Fern Osten, Miscanthus sinensis вар. gracillimus, Miscanthus sinensis вар. variegates, Miscanthus sinensis вар. purpurascens, Miscanthus sinensis вар. Malepartus, Miscanthus sacchariflorus вар. Robusta, Miscanthus sinensis вар. Silberfedher (он же Silver Feather), Miscanthus transmorrisonensis, Miscanthus condensatus, Miscanthus yakushimanum, Miscanthus вар. Alexander, Miscanthus вар. Adagio, Miscanthus вар. Autumn Light, Miscanthus вар. Cabaret, Miscanthus вар. Condensatus, Miscanthus вар. Cosmopolitan, Miscanthus вар. Dixieland, Miscanthus вар. Gilded Tower (патент США № PP14,743), Miscanthus вар. Gold Bar (патент США № PP15,193), Miscanthus вар. Gracillimus, Miscanthus вар. Graziella, Miscanthus вар. Grosse Fontaine, Miscanthus вар. Hinjo aka Little Nicky ™, Miscanthus вар. Juli, Miscanthus вар. Kaskade, Miscanthus вар. Kirk Alexander, Miscanthus вар. Kleine Fontaine, Miscanthus вар. Kleine Silberspinne (он же Little Silver Spider), Miscanthus вар. Little Kitten, Miscanthus вар. Little Zebra (патент США № PP13,008), Miscanthus вар. Lottum, Miscanthus вар. Malepartus, Miscanthus вар. Morning Light, Miscanthus вар. Mysterious Maiden (патент США № РР16,176), Miscanthus вар. Nippon, Miscanthus вар. November Sunset, Miscanthus вар. Parachute, Miscanthus вар. Positano, Miscanthus вар. Puenktchen (он же Little Dot), Miscanthus вар. Rigoletto, Miscanthus вар. Sarabande, Miscanthus вар. Silberpfeil (он же Silver Arrow), Miscanthus вар. Silverstripe, Miscanthus вар. Super Stripe (патент США № PP18,161), Miscanthus вар. Strictus или Miscanthus вар. Zebrinus.

В некоторых вариантах подходящими видами могут быть дикие, сорные или культивированные виды и/или разновидности сорго, такие как Sorghum almum, Sorghum amplum, Sorghum angustum, Sorghum arundinaceum, Sorghum bicoior (такие как двуцветное, гвинейское, хвостатое, кафрское и зерновое), Sorghum brachypodum, Sorghum bulbosum, Sorghum burmahicum, Sorghum controver sum, Sorghum drummondii, Sorghum ecarinatum, Sorghum exstans, Sorghum grande, Sorghum halepense, Sorghum interjectum, Sorghum intrans, Sorghum laxiflorum, Sorghum leiocladum, Sorghum macrospermum, Sorghum matarankense, Sorghum miliaceum, Sorghum nigrum, Sorghum nitidum, Sorghum piumosum, Sorghum propinquum, Sorghum purpureosericeum, Sorghum stipoideum, Sorghum sudanensese, Sorghum timorense, Sorghum trichocladum, Sorghum versicolor, Sorghum virgatum, Sorghum vulgare или гибриды, такие как Sorghum x almum, Sorghum x суданская трава или Sorghum x drummondii.

Таким образом, методы и составы можно использовать в широком диапазоне видов растений, в том числе видов из родов двудольных растений Brassica, Carthamus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Jatropha, Parthenium, Populus и Ricinus; родов однодольных растений Elaeis, Festuca, Hordeum, Lolium, Oryza, Panicum, Pennisetum, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Sorghum, Triticosecale, Triticum и Zea. В некоторых вариантах растение является представителем видов Panicum virgatum (просо), Sorghum bicoior (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискантус), Saccharum sp. (сахарный тростник), Populus balsamifera (тополь бальзамический), Zea mays (маис), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопчатник обыкновенный), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник однолетний), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла) или Pennisetum glaucum (просо африканское).

В некоторых вариантах полинуклеотиды и векторы, описанные в настоящем документе, можно использовать для трансформации ряда однодольных и двудольных растений и систем растительных клеток в тех случаях, когда такие растения являются гибридами различных видов или разновидностей конкретного вида (например, Saccharum sp. X Miscanthus sp., Sorghum sp. X Miscanthus sp., например: Panicum virgatum x Panicum amarum, Panicum virgatum x Panicum amarulum и Pennisetum purpureum x Pennisetum typhoidum).

Г. Фенотипы трансгенных растений.

В некоторых вариантах растение, у которого модулируется экспрессия модулирующего биомассу

- 36 036343 полипептида, может иметь повышенный уровень биомассы. Например, модулирующий биомассу полипептид, описанный в настоящем документе, может быть экспрессирован в трансгенном растении, что приводит к увеличению уровня вегетативной ткани. Уровень биомассы может быть увеличен минимум на 2%, например на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более 60% по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не экспрессирует трансген. В некоторых вариантах растение, у которого модулируется экспрессия модулирующего биомассу полипептида, может иметь пониженный уровень семенной продуктивности. Уровень может быть уменьшен минимум на 2%, например на 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более 35% по сравнению с соответствующим уровнем семенной продуктивности контрольного растения, которое не экспрессирует трансген.

Увеличение семенной продуктивности у таких растений может обеспечить повышение доступности питания в географических регионах, где потребление пищевых продуктов часто недостаточно, или обеспечить производство биотоплива. В некоторых вариантах уменьшение биомассы у таких растений может быть полезным, если вегетативные ткани не являются основной частью растения, которую получают для потребления человеком или животными (например, сбор семян).

В некоторых вариантах растение, у которого модулируется экспрессия модулирующего биомассу полипептида, может иметь повышенный или пониженный уровень биомассы в одной или нескольких тканях, например в вегетативных тканях, репродуктивных тканях или тканях корня. Например, уровень биомассы может быть увеличен минимум на 2%, например на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более 60% по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не экспрессирует трансген. В некоторых вариантах растение, у которого модулируется экспрессия модулирующего биомассу полипептида, может иметь пониженный уровень биомассы в одной или нескольких растительных тканей. Уровень биомассы может быть уменьшен минимум на 2%, например на 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более 35% по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не экспрессирует трансген.

Увеличение биомассы у таких растений может обеспечить улучшение качества пищи или повышенную энергетическую продуктивность. Уменьшение биомассы может обеспечить более эффективное распределение питательных веществ по частям растений, которые выращивают для потребления человеком или животными.

Как правило, разница в количестве биомассы у трансгенного растения или трансгенной клетки по сравнению с контрольным растением или клеткой считается статистически достоверной при значении р<0,05 при применении параметрических или непараметрических методов статистической оценки, таких как проверка на соответствие по критерию хи-квадрат, t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни или F-критерий Фишера. В некоторых вариантах разница в количестве биомассы является статистически достоверной при р<0,01, р<0,005 или р<0,001. Статистически достоверная разница, например, в количестве биомассы у трансгенного растения по сравнению с ее количеством у контрольного растения показывает, что присутствие рекомбинантной нуклеиновой кислоты в трансгенном растении приводит к изменению уровня биомассы.

Фенотип трансгенного растения оценивается в сравнении с контрольным растением. Считается, что растение не экспрессирует полипептид, когда в растении обнаруживается менее 10%, например менее 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,01 или 0,001% количества полипептида или мРНК, кодирующей полипептид, обнаруживаемый в рассматриваемом растении. Экспрессию можно оценить такими методами, как, например, ОТ-ПЦР, нозерн-блоттинг, защита от S1 РНКазы, удлинение затравки, вестерн-блоттинг, электрофорез белкового геля, иммунопреципитация, иммуноферментный анализ, иммунопреципитация хроматина и масс-спектрометрия. Следует отметить, что, если полипептид экспрессируется под контролем промотора, преимущественно активного в определенных тканях, или промотора широкого спектра действия, экспрессию можно оценить во всем растении или в выбранной ткани. Аналогичным образом, если полипептид экспрессируется в определенное время, например на определенном этапе развития или во время индукции, экспрессию можно оценить выборочно в требуемый период времени.

Биомасса может включать собираемые ткани растений, такие как листья, стебли и репродуктивные структуры, или все растительные ткани, такие как листья, стебли, корни и репродуктивные структуры. В некоторых вариантах биомасса включает только надземные части растений. В некоторых вариантах биомасса включает только стеблевые части растений. В некоторых вариантах биомасса включает только надземные части растений, за исключением соцветий и семенных частей растений. Биомассу можно измерять способами, описанными в разделе Примеры. Биомассу количественно можно выразить в виде выхода сухого вещества, что является массой полученной биомассы (обычно выраженной в т/акр), если из массы свежей продукции вычесть воду. Выход сухого вещества (DMY) вычисляется с использованием массы свежей продукции (FMW) и измерения весового процента влаги (М) по следующему уравнению:

DMY=((100-M)/100)-FMW.

Биомассу количественно можно выразить в виде массы свежей продукции, т.е. массы биомассы (обычно выраженной в т/акр), полученной непосредственно после выращивания, которая включает массу

- 37 036343 влаги.

V) Модификация эндогенных нуклеиновых кислот, которые кодируют модулирующие биомассу полипептиды.

В настоящем документе также представлены растительные клетки и растения, в которых эндогенная модулирующая биомассу нуклеиновая кислота, описанная в настоящем документе, была модифицирована (например, были модифицированы регуляторная область, интрон или кодирующая область модулирующей биомассу нуклеиновой кислоты). Биомасса таких растений изменена по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, в котором эндогенная нуклеиновая кислота не модифицирована. Такие растения рассматриваются в настоящем документе как модифицированные растения, и они могут быть использованы, например, для получения увеличенного количества биомассы.

Эндогенная нуклеиновая кислота может быть модифицирована методом гомологической рекомбинации. Например, специфические для последовательности эндонуклеазы (например, нуклеазы белкового домена цинковые пальцы (ZFN)) и мегануклеазы можно использовать для стимуляции гомологических рекомбинаций в эндогенных генах растений. См., например, Townsend et al., Nature 459:442-445 (2009); Tovkach et al., Plant J., 57:747-757 (2009); и Lloyd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:2232-2237 (2005). В частности, нуклеазы белкового домена цинковые пальцы, сконструированные для создания парных разрывов двухцепочечной ДНК в конкретных локусах, можно использовать для направленных изменений последовательностей в эндогенных генах растений. Например, эндогенный ген растения может быть заменен вариантом с одной или несколькими мутациями (например, полученными с использованием сайт-направленного мутагенеза или направленной эволюции).

В некоторых вариантах эндогенные нуклеиновые кислоты можно модифицировать путем метилирования или деметилирования, при которых изменяется экспрессия модифицированной эндогенной нуклеиновой кислоты. Например, можно использовать двухцепочечную РНК для активации экспрессии гена путем направленного воздействия на некодирующие регуляторные области в промоторах генов. См. Shibuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(5): 1660-1665 (2009); и Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (46):17337-42 (2006).

В некоторых вариантах эндогенные нуклеиновые кислоты можно модифицировать путем введения меток активации. Например, для активации эндогенного гена можно использовать вектор, содержащий несколько копий элемента энхансера от конститутивно активного промотора гена вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S. См. Weigel et al., Plant Physiology, 122:1003-1013 (2000).

В некоторых вариантах эндогенные нуклеиновые кислоты можно модифицировать путем интродукции сконструированного фактора транскрипции, участвующего в активации/репрессии (например, фактора транскрипции белка цинковые пальцы или ZFP TF. См., например, в Интернете sangamo.com/tech/tech_plat_over.html#whatarezfp). Сконструированный фактор транскрипции, участвующий в активации/репрессии (например, ZFP TF), может активировать, репрессировать или запускать экспрессию целевого эндогенного гена, связанного с ростом биомассы, путем связывания особым образом эндогенного гена с областью промотора или кодирующей областью.

В некоторых вариантах эндогенные нуклеиновые кислоты можно модифицировать путем мутагенеза. Интродукцию генетических мутаций в регенерируемых растительных тканях можно произвести с помощью одного или более мутагенных агентов. Подходящими мутагенными агентами являются, например, этилметансульфонат (EMS), ^нитрозо-Ы-этилмочевина (ENU), метил-нитрозогуанидин (MNNG), бромид этидия, диэпоксибутан, ионизирующее излучение, рентгеновское излучение, ультрафиолетовое излучение и другие мутагены, известные в данной отрасли знаний. Подходящие типы мутаций включают, например, вставки или делеции нуклеотидов и транзиции или трансверсии в последовательности эндогенных нуклеиновых кислот. В одном варианте для получения растений, имеющих модифицированную эндогенную нуклеиновую кислоту, можно использовать TILLING-метод (метод индуцированного мутагенеза).

TILLING-метод объединяет мутагенез высокой интенсивности с методами высокопроизводительного скрининга. См., например, McCallum et al., Nat. Biotechnol., 18: 455-457 (2000); reviewed by Stemple, Nat. Rev. Genet., 5(2):145-50 (2004).

В некоторых вариантах эндогенную нуклеиновую кислоту можно модифицировать путем подавления активности гена. См., например, раздел настоящего документа Ингибирование экспрессии модулирующего биомассу полипептида.

Можно провести скрининг популяции растений и/или отбор в ней тех представителей популяции, которые имеют модифицированную нуклеиновую кислоту. Можно провести скрининг популяции растений и/или отбор в ней тех представителей популяции, у которых признак или фенотип передаются путем экспрессии модифицированной нуклеиновой кислоты. В качестве варианта можно провести скрининг популяции тех растений, которые проявляют желаемый признак, такой как модулированный уровень биомассы. Например, можно провести скрининг популяции потомков тех растений, которые имеют желаемый уровень экспрессии модулирующего биомассу полипептида или нуклеиновой кислоты. Для определения модифицированных нуклеиновых кислот и/или уровней экспрессии можно использовать физические и биохимические методы, как указывалось при описании трансгенных растений. Отбор и/или

- 38 036343 скрининг можно проводить по одному и/или нескольким поколениям, а также по одному и/или нескольким географическим местам. В некоторых случаях можно выращивать растения и производить их отбор в условиях, индуцирующих желаемый фенотип или необходимых для получения желаемого фенотипа у модифицированного растения. Кроме того, отбор и/или скрининг можно применять во время определенной стадии развития, на которой у растения ожидается проявление фенотипа. Отбор и/или скрининг можно проводить для выбора модифицированных растений, имеющих статистически достоверную разницу в уровне биомассы по сравнению с контрольным растением, у которого нуклеиновая кислота не была модифицирована. Отобранные или прошедшие скрининг модифицированные растения имеют измененный фенотип по сравнению с соответствующим контрольным растением, как описано в разделе Фенотипы трансгенных растений настоящего документа.

Несмотря на то что растение или растительная клетка, у которых эндогенная модулирующая биомассу нуклеиновая кислота была модифицирована, не являются трансгенными для данной конкретной нуклеиновой кислоты, следует понимать, что такое растение или такая растительная клетка может содержать трансгены. Например, модифицированное растение может содержать трансген для других признаков, таких как устойчивость к гербицидам или насекомым. Другой пример: модифицированное растение может содержать один или несколько трансгенов, что в сочетании с модификациями одной или нескольких эндогенных нуклеиновых кислот проявляется в увеличении биомассы.

Как и в случае с трансгенными растительными клетками, модифицированные растительные клетки могут составлять часть растения или растение целиком. Такие растения можно выращивать таким же способом, который описан для трансгенных растений, и можно разводить и размножать таким же способом, который описан для трансгенных растений.

VI) Селекция растений.

Генетический полиморфизм, полезный при использовании таких методов, включает простые повторения последовательностей (SSR, или микросателлиты), быструю амплификацию полиморфной ДНК (RAPD), однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), полиморфизмы длины амплификационных фрагментов (ПДАФ) и полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Полиформизмы с простыми повторениями последовательностей (SSR) можно идентифицировать, например, с помощью сайтспецифических зондов и амплификации матричной ДНК от отдельных представителей популяции, представляющей интерес, путем ПЦР. Например, метод ПЦР можно использовать для ферментативной амплификации генетического маркера, связанного с нуклеотидной последовательностью, которая передает конкретный признак (например, нуклеотидные последовательности, описанные в настоящем документе). ПЦР можно использовать для амплификации конкретных последовательностей ДНК и РНК, в том числе последовательностей всей геномной ДНК или всей клеточной РНК. При использовании РНК в качестве матрицы для синтезирования нитей комплементарной ДНК (кДНК) можно использовать обратную транскриптазу. Различные методы ПЦР описаны, например, в праймере для ПЦР: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995.

Как правило, для конструирования олигонуклеотидных праймеров, которые в последовательности идентичны или подобны противолежащим цепям амплифицируемой матрицы, используется информация от полинуклеотидов, примыкающих к представляющей интерес области, или из участков, находящихся за ее пределами. Праймеры обычно имеют длину 14-40 нуклеотидов, однако могут быть длиной от 10 нуклеотидов до нескольких сотен нуклеотидов. Для отделения двойной цепи матрица или амплифицированная ДНК многократно денатурируется при высокой температуре, затем охлаждается, чтобы можно было произвести отжиг праймеров и протянуть нуклеотидные последовательности через микросателлиты, и в результате нарабатывается соответствующая ДНК, достаточная для определения продуктов ПЦР. Если зонды в популяции примыкают к маркеру SSR, вырабатываются продукты ПЦР различных размеров. См., например, патент США 5766847.

Произвести качественный и количественный анализ продуктов ПЦР можно несколькими способами. Например, продукты ПЦР можно пометить флуоресцирующей молекулой (например, PicoGreen® или OliGreen®) или определить в растворе с помощью спектрофотометрии или капиллярного электрофореза. В некоторых случаях продукты ПЦР можно отделить в гелевой матрице (например, агарозе или полиакриламиде) путем электрофореза, а фракционированные по размеру полосы белков, содержащие продукты ПЦР, можно сделать видимыми путем окрашивания нуклеиновых кислот. Подходящие красители могут флуоресцировать в ультрафиолетовом свете (например, бромид этидия, GR Safe, SYBR® Green или SYBR® Gold). Результаты можно сделать видимыми с помощью просвечивания или эпииллюминации, а изображение флуоресцирующего паттерна можно получить, например, с помощью фотоаппарата или сканера. Изображение можно обработать и проанализировать с помощью специального программного обеспечения (например, программы ImageJ), чтобы произвести измерение и сравнение интенсивности представляющей интерес полосы с калибровочной пробой, загруженной в тот же гель.

Или же полиморфизмы с простыми повторениями последовательностей (SSR) можно идентифицировать, используя продукт(ы) ПЦР в качестве зонда в сопоставлении с саузерн-блотами от разных представителей в популяции. См. U.H. Refseth et al., (1997) Electrophoresis 18: 1519. Если говорить коротко,

- 39 036343 продукты ПЦР разделяются по длине путем гель-электрофореза и переносятся на мембрану. Микросателлитные ДНК-зонды, такие как олигонуклеотид, помеченные радиоактивными, флуоресцирующими или хромогенными молекулами, подаются на мембрану и гибридизируются, чтобы связать продукты

ПЦР с комплементарной нуклеотидной последовательностью. Паттерн гибридизации можно сделать видимым, например, с помощью авторадиографии или проявления цвета на мембране.

В некоторых случаях можно определить количество продуктов ПЦР, используя термоциклер с системой детекции в режиме реального времени.

Например, при количественном ПЦР-анализе в режиме реального времени можно использовать флуоресцентный краситель, который образует комплекс краситель-ДНК (например, SYBR® Green) или помеченный флуорофором ДНК-зонд, такой как одноцепочечные олигонуклеотиды, ковалентно связанные с флуоресцентным репортером или флуорофором (например, 6-карбоксифлуоресцеин или тетрахлор-флуоресцеин), и тушитель флуоресценции (например, тетраметилродамин или дигидроциклопирролоиндол-трипептид молекулы, связывающиеся с малой бороздкой ДНК). Флуоресцентный сигнал позволяет определить амплифицированный продукт в режиме реального времени, при этом указывая на присутствие представляющей интерес последовательности и позволяя провести количественный анализ числа копий рассматриваемой последовательности в клеточной ДНК или уровень экспрессии рассматриваемой последовательности от клеточной мРНК.

Идентификация полиморфизмов длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) рассматривается, например, в работах Alonso-Blanco et al. (Methods in Molecular Biology, vol.82, Arabidopsis Protocols, pp. 137-146, J.M. Martinez-Zapater and J. Salinas, eds., c. 1998 by Humana Press, Totowa, NJ); Burr (Mapping Genes with Recombinant Inbreds, pp. 249-254, in Freeling, M. and V. Walbot (Ed.), The Maize Handbook, с 1994 by Springer-Verlag New York, Inc.: New York, NY, USA; Berlin Germany; Burr et al. Genetics (1998) 118: 519 и Gardiner, J. et al., (1993) Genetics 134: 917). Например, чтобы создать библиотеку для ПДРФ, расширенную однокопийными или малокопийными экспрессированными последовательностями, всю ДНК можно расщепить чувствительными к метилированию ферментами (например, PstI). Расщепленную ДНК можно разделить по размеру на препаративном геле. Фрагменты полинуклеотидной цепи (от 500 до 2000 п.о.) могут быть отделены, извлечены и клонированы в плазмидный вектор (например, pUC18). Саузерн-блоттинг плазмидных дайджестов можно зондировать со всей дегидратированной в результате гидродинамического сдвига ДНК для отбора клонов, которые гибридизируются в однокопийные или малокопийные последовательности. Для увеличения числа обнаруженных полиморфизмов можно провести тестирование дополнительных рестрикционных эндонуклеаз.

Идентификация ПДАФ рассматривается, например, в Европейском патенте 0534858 и в патенте США № 5878215. В целом, вся клеточная ДНК расщепляется с помощью одного или более рестрикционных ферментов. Полусайт-специфические адаптеры рестрикции лигируются во все фрагменты рестрикции, и эти фрагменты селективно амплифицируются двумя праймерами для ПЦР, которые имеют соответствующий адаптер и последовательности сайт-специфической рестрикции. Продукты ПЦР можно визуализировать после фракционирования по размеру, как описано выше.

В некоторых вариантах методы направлены на селекцию линии растений. В таких методах используются генетические полиморфизмы, определяемые описанным выше способом в программе скрещивания с использованием маркера, для облегчения выведения линий, которые имеют желаемые изменения в характеристике биомассы. При определении подходящего генетического полиморфизма, связанного с вариацией признаков, определяется одно или несколько отдельных растений, которые обладают полиморфной аллелью, коррелирующей с желаемой вариацией. Затем такие растения используют в программе разведения, чтобы объединить полиморфную аллель с многочисленными другими аллелями в других локусах, которые коррелируют с желаемой вариацией. Способы, пригодные для использования в программах селекции растений, известны в данной отрасли знаний и включают в том числе обратное скрещивание, массовую селекцию, селекционное разведение, смешанную селекцию, скрещивание с другой популяцией и периодическую селекцию. В селекционной программе данные способы можно использовать по отдельности или в сочетании с одним или несколькими другими способами. Таким образом, происходит самовоспроизводство каждого определенного растения или его скрещивание с другим растением для получения семян, которые затем проращиваются и формируют потомственные растения. Затем по меньшей мере одно из таких потомственных растений самовоспроизводится и скрещивается с другим растением для формирования последующего поколения потомков. В программе разведения при необходимости можно повторять шаги самовоспроизводства или ауткроссинга для получения дополнительно от 0 до 5 поколений, чтобы достичь желаемого единообразия и стабильности получаемой в результате линии растений, которая сохраняет полиморфную аллель. В большинстве программ разведения анализ конкретной полиморфной аллели проводится в каждом поколении, хотя при желании анализ можно проводить в чередующихся поколениях.

В некоторых случаях также проводится селекция по другим полезным признакам, например селекция по устойчивости к грибкам или бактериям. Селекцию по таким другим признакам можно проводить до, во время или после идентификации отдельных растений, которые обладают требуемой полиморфной аллелью.

- 40 036343

VII) Изделие.

Трансгенные растения, приведенные в настоящем документе, находят различное применение в сельском хозяйстве и в отраслях, связанных с выработкой энергии. Например, трансгенные растения, описанные в настоящем документе, можно использовать для производства кормов для животных и пищевых продуктов. Такие растения при этом часто особенно полезны в качестве исходного сырья для производства энергии.

Трансгенные растения, описанные в настоящем документе, часто дают более высокий урожай зерна и/или выход биомассы на гектар по сравнению с контрольными растениями, в которых отсутствует экзогенная нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах такие трансгенные растения обеспечивают эквивалентный или даже более высокий урожай зерна и/или выход биомассы на гектар по сравнению с контрольными растениями при выращивании в условиях уменьшенного потребления, например, удобрений и/или воды. Таким образом, такие трансгенные растения можно использовать для обеспечения стабильного урожая при более низкой производственной себестоимости и/или в тяжелых условиях окружающей среды, таких как засуха. В некоторых вариантах состав растений, описанных в настоящем документе, обеспечивает их более эффективную переработку в свободные сахара и затем в этанол с целью производства энергии. В некоторых вариантах такие растения обеспечивают более высокий выход этанола, бутанола, диметилового эфира, других молекул биотоплива и/или полученных из сахара побочных продуктов на килограмм растительного материала по сравнению с контрольными растениями. При такой эффективной переработке из растения извлекаются в том числе материалы, содержащие глюкан, целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. Обеспечивая более высокий выход по биомассе при эквивалентных или даже уменьшенных издержках производства, трансгенные растения, описанные в настоящем документе, повышают рентабельность фермерских хозяйств и перерабатывающих предприятий, а также снижают затраты потребителей.

Семена трансгенных растений, описанных в настоящем документе, можно приводить в определенное состояние и упаковывать в пакеты способами, известными в данной отрасли, для формирования изделия. Упаковочный материал, такой как бумага и ткань, хорошо известны в данной отрасли. На пакете с семенами может быть маркировка, например этикетка или бирка, прикрепленная к упаковочному материалу, этикетка, напечатанная на упаковочном материале, или вложенная в пакет этикетка с описанием происхождения семян, находящихся в нем.

Далее изобретение будет далее описано на следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанного в патентной формуле.

VIII. Примеры.

Пример 1. Трансгенные растения риса.

Применительно к трансформации риса используются следующие условные обозначения: T0: растение, регенерированное из трансформированной культуры ткани; T1: потомство первого поколения самоопыленных растений T₀; T2: потомство второго поколения самоопыленных растений T1; T3: потомство третьего поколения самоопыленных растений T2.

Ниже приведен перечень нуклеиновых кислот, выделенных из растений Arabidopsis thaliana: CeresAnnot: 544549 (SEQ ID NO: 262), CeresAnnot: 1355066 (SEQ ID NO: 116), CeresClone: 1356785 (SEQ ID NO: 252), CeresClone: 26006 (SEQ ID NO: 594), CeresClone: 4831 (SEQ ID NO: 7 6),CeresAnnot: 847799 (SEQ ID NO: 208) и CeresAnnot: 878355 (SEQ ID NO: 425). Приведенные ниже нуклеиновые кислоты выделены из растений Zea mays: CeresClone: 1384304 (SEQ ID NO: 553). Приведенные ниже нуклеиновые кислоты выделены из растений Oryza saliva: антисмысловая последовательность (SEQ ID NO: 678). CeresClone: 638126 (SEQ ID NO: 322) выделена из растений Glycine max.

Каждая изолированная нуклеиновая кислота, описанная выше, была клонирована в плазмидный вектор Ti, содержащий ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы, который передает трансформированным растениям устойчивость к гербициду Finale™. Конструкции составлялись с использованием вышеупомянутых нуклеиновых кислот, каждая из которых содержала в себе функционально связанный с ней промотор 326, введенный в клетки каллуса риса сорта Kitaake по протоколу агробактериальной трансформации. В результате каждой трансформации было получено приблизительно 20-30 независимых трансгенных растений T₀, в том числе для контрольной плазмиды (пустого вектора).

Предварительный анализ фенотипа продемонстрировал, что трансформанты T₀ не показали какихлибо существенных фенотипических аномалий в вегетативных органах, за небольшими исключениями, когда некоторые растения оказались маленькими, с пониженной фертильностью, наиболее вероятно, вследствие воздействия культуры тканей.

Растения T0 выращивались в теплице, что обеспечивало самоопыление и сбор семян T1. Растения T1 и T2 выращивались в поле. Наличие каждой конструкции подтверждалось ПЦР.

Перед весенним прорастанием семена риса вымачивались в течение 3-4 дней и приблизительно через один месяц пересаживались в поле в г. Лангфан, Китай. Расстояние между рядами составляло 25 см, расстояние между растениями составляло 15 см. Непосредственно перед посадкой было внесено комплексное удобрение (16Н-16Р-161<) из расчета 25 кг/му (666,7 м²). В период вегетации до развития метелки в два приема вносилась мочевина из расчета 12,5 кг/му.

- 41 036343

В одном ряду на каждый трансгенный объект росло десять растений. Измерения выполнялись только в тех рядах, где визуально было заметно отличие от контрольных растений. Высота растений измерялась по достижении зрелости.

Данные измерений биомассы (сухая масса) CW00733, CW00710, CW00628, CW00604, CW00564, CW00469 и CW00536 снимались с выращенных растений T1. Стебли с листьями и листовыми влагалищами, но без метелок, высушивались в теплице не менее месяца, и затем производилось взвешивание каждого растения (все побеги каждого растения взвешивались вместе). Данные по измерениям CW00191, CW00297 и CW00319 снимались с выращенных растений T₂.

Стебли с листьями и листовыми влагалищами, но с отделенными метелками высушивались в помещении не менее месяца, и затем производилось взвешивание каждого растения (все побеги каждого растения взвешивались вместе). Количество побегов подсчитывалось после 4 месяцев роста.

Пример 2. Результаты по объектам риса CW00733, Ceres Clone:1384304, (SEQ ID NO: 553).

Анализ семени T1 от одного объекта CW00733, содержащего CeresClone: 1384304, проводился, как описано в примере 1. Высота растения, биомасса и масса метелки трансгенных растений T1 в сравнении с растениями, не содержащими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 1. Данные каждой строки таблицы соответствуют ряду в поле. Данные результатов обработки представляют средние показатели по 10 трансгенным растениям (1 ряд одного объекта) и средние показатели 40 контрольных растений (4 ряда). Увеличение биомассы, высоты и массы метелки показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

Таблица 1

Высота растения, см	Биомасса, г/растение	Масса метелки, г/растение
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
72,41	80,30	16,70	27,45	21,56	28,89
				24,58	23,42

Высота растений (см), урожайность (измеряется в г/метелки 16 растений) и биомасса (измеряется в г только стебель (без соцветия или корня)) трансгенных растений T₂ CW00733 в сравнении с растениями, не содержащими трансген и выращенными (МАССА) в том же месте, показаны в табл. 2. Результаты по объектам CW00604 (пример 7) также показаны в табл. 2. Наблюдалось увеличение высоты и биомассы.

Таблица 2. Растения Т2 от объектов CW00733 и CW00604

	Отчет	МАССА	CW00604	CW00733
Высота, см	Отчет I	80,3	81,3	85, 0
Отчет II	73,3	79, 7	84,5
Отчет III	77,2	79, 1	82,9
Средний	76, 9	80, 0	84,1
Урожайность	Отчет I	395, 4	357,0	356, 8
Отчет II	385, 0	324,0	348,5
Отчет III	361, 6	309, 0	345, 3
Средний	380,7	330, 0	350,2
Биомасса	Отчет I	16, 6	24,8	19, 3
Отчет II	20, 0	20, 8	17,7
Отчет III	16, 6	19, 8	19, 7
Средний	17,7	21,8	18,9

Пример 3. Результаты по объектам риса CW00319, Ceres Annot:544549 (SEQ ID NO: 262).

Анализ биомассы растений, выращенных из семян T₂ и T₃ от одного объекта CW00319, содержащего Ceres Annot: 544549, проводился, как описано в примере 1. Среднее количество биомассы трансгенных растений T₂ и T3 в сравнении с растениями, не содержащими трансген и выращенными в том же месте, показано в табл. 3. Делянки с низким содержанием азота и контрольные делянки повторялись 3 раза по схеме рандомизированных блоков, при этом были представлены трансгенные растения в виде нескольких объектов и контрольные группы. Каждая делянка содержала 40 растений. По одному объекту CW00319 проводилось измерение десяти растений на каждой делянке. Каждое значение биомассы в табл. 3 представляет собой среднюю величину по 30 измеренным растениям. Результаты показывают увеличение измеренной биомассы у трансгенных растений, выращенных в условиях низкого содержания азота в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

- 42 036343

Таблица 3

Биомасса, г/растение (нормальное)	Биомасса, г/растение (низкое содержание азота)
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
14, 6	14,38	16, 01	17,44

Пример 4. Результаты по объектам риса CW00710, Ceres Annot: 1355066 (SEQ ID NO: 116).

Анализ семени T₁ от одного объекта CW00710, содержащего Ceres Annot: 1355066, проводился, как описано в примере 1.

Высота растений, биомасса и масса метелки трансгенных растений T 1 в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 4. Данные в строках таблицы соответствуют ряду в поле. Данные результатов обработки представляют средние показатели по 10 трансгенным растениям (1 ряд одного объекта) и средние показатели 40 контрольных растений (4 ряда). Увеличение биомассы и высоты показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

Таблица 4

Высота растения, см	Биомасса, г/растение	Масса метелки, г/растение
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
72,20	85,60	14,51	24,15	19,38	18,70

Пример 5. Результаты по объектам риса CW00628 (SEQ ID NO: 678).

Анализ семени T1 от одного объекта CW00628, содержащего РНК-интерференцию с SEQ ID NO: 678, проводился, как описано в примере 1. Высота растений, биомасса и масса метелки трансгенных растений T₁ в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 5. Данные в строках таблицы соответствуют ряду в поле. Данные результатов обработки представляют средние показатели по 10 трансгенным растениям (1 ряд одного объекта) и средние показатели 40 контрольных растений (4 ряда). Увеличение биомассы и высоты показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

Таблица 5

Высота растения, см	Биомасса,	г/растение	Масса метелки, г/растение
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
75,30	81,60	15,92	29,96	24,53	20,38

Пример 6. Результаты по объектам риса CW00297, Ceres Clone:625057 (SEQ ID NO: 644).

Анализ биомассы растений, выращенных из семян T₂ и T₃ от одного объекта CW00297, содержащего Ceres Clone: 625057, проводился, как описано в примере 1. Среднее количество биомассы трансгенных растений T₂ и T₃ в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 6. Делянки с низким содержанием азота и контрольные делянки повторялись 3 раза по схеме рандомизированных блоков, при этом были представлены трансгенные растения в виде нескольких объектов и контрольные группы. Каждая делянка содержала 40 растений. По одному объекту CW00297 проводилось измерение десяти растений на каждой делянке. Каждое значение биомассы в табл. 6 представляет собой среднюю величину по 30 измеренным растениям. Результаты показывают увеличение измеренной биомассы у трансгенных растений, выращенных в условиях нормального и низкого содержания азоте в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

Таблица 6

Биомасса, г/растение (нормальное)	Биомасса, г/растение (низкое содержание азота)
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
14, 6	15, 93	16, 01	17,35

Пример 7. Результаты по объектам риса CW00604, Ceres Clone:1356785 (SEQ ID NO: 252).

Анализ семени T1 от одного объекта CW00604, содержащего Ceres Clone: 1356785, проводился, как описано в примере 1. Высота растений, биомасса и масса метелки трансгенных растений T₁ в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 7. Данные каждой строки таблицы соответствуют ряду в поле. Данные результатов обработки представляют средние показатели по 10 трансгенным растениям (1 ряд одного объекта) и средние показатели 40 контрольных растений (4 ряда). Увеличение биомассы, высоты и массы метелки показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген. Также наблюдалось увеличение высоты и биомассы у растений T₂. См. табл. 2.

- 43 036343

Таблица 7

Высота растения, см	Биомасса, г/растение	Масса г/растение	метелки,
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
72,53	81,25	16,40	28,68	22,21	29,91
73,70	82,30

Пример 8. Результаты по объектам риса CW00564, Ceres Clone: 638126 (SEQ ID NO: 322).

Анализ семени T1 от одного объекта CW00564, содержащего Ceres Clone: 638126, проводился, как описано в примере 1. Высота растений, биомасса и масса метелки трансгенных растений T 1 в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 8. Данные в строках таблицы соответствуют ряду в поле. Данные результатов обработки представляют средние показатели по 10 трансгенным растениям (1 ряд одного объекта) и средние показатели 40 контрольных растений (4 ряда). Увеличение биомассы, высоты и массы метелки показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

Таблица 8

Высота растения, см	Биомасса, г/растение	Масса метелки, г/растение
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
72,88	85,44	18,11	36, 47	22,56	37,47

Высота растения (см), урожайность (измеряется в г/метелки 16 растений) и биомасса (измеряется в г только стебель (без соцветия или корня)) трансгенных растений T₂ CW00564 в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными (МАССА) в том же месте, показаны в табл. 9. Результаты по объектам CW00469 (пример 10) также показаны в табл. 9. Наблюдалось увеличение высоты, урожайности и биомассы.

Таблица 9. Растения Т2 от объектов CW00564 и CW00469

	Отчет	МАССА	CW00469	CW00564
Высота, см	Отчет I	77,3	117,1	90,7
Отчет II	76, 9	117,7	91,5
Отчет III	77,4	113, 1	92,7
Средний	77,2	115, 9	91, 6
Урожайность	Отчет I	356, 9	426, 0	406, 8
Отчет II	343,2	378,8	423, 6
Отчет III	366, 7	398,0	-
Средний	355, 6	400, 9	415, 2
Биомасса	Отчет I	17,1	29, 7	25, 2
Отчет II	15, 1	26,5	25, 1
Отчет III	14, 6	27,1	24,4
Средний	15, 6	27,7	24,9

Пример 9. Результаты по объектам риса CW00010, Ceres Clone: 26006 (SEQ ID NO: 594).

Анализ семени T1 от трех объектов CWCW00010, содержащих Ceres Clone: 26006, проводился, как описано в примере 1. Высота растений, биомасса, количество побегов, период цветения и масса метелки трансгенных растений T1 в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 10-12. Данные результатов обработки представляют средние показатели по 10 трансгенным растениям (1 ряд одного объекта) и средние показатели 40 контрольных растений (4 ряда). Увеличение биомассы, высоты, количества побегов и массы метелки показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

- 44 036343

Таблица 10. Объект 1

	Процентное увеличение	Значение р	Количество измеренных растений
Биомасса	9	0,307	11
Высота растения	7	0, 028	11
Количество побегов	27	0, 002	10
Период цветения	10	0, 048	11
Масса метелки	16	0, 012	39

Таблица 11. Объект 17

	Процентное увеличение	Значение р	Количество измеренных растений
Высота растения	3	0, 004	7
Количество побегов	34		1
Масса метелки	4	0,591	7

Таблица 12. Объект 2

	Процентное увеличение	Значение р	Количество измеренных растений
Высота растения	2	0,007	15
Количество побегов	27	0,013	10
Масса метелки	16	0, 011	14

Пример 10. Результаты по объектам риса CW00469, Ceres Clone: 4831 (SEQ ID NO: 76).

Анализ семени T₁ от одного объекта CW00469, содержащего Ceres Clone: 4831, проводился, как описано в примере 1. Высота растений, биомасса и масса метелки трансгенных растений T 1 в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 13. Данные в строках таблицы соответствуют ряду в поле.

Данные результатов обработки представляют средние показатели по 10 трансгенным растениям (1 ряд одного объекта) и средние показатели 40 контрольных растений (4 ряда). Увеличение биомассы, высоты и массы метелки показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген. Увеличение высоты, урожайности и биомассы показано у растений T₂ (см. табл. 9).

Таблица 13

Высота растения, см	Биомасса, г/растение	Масса метелки, г/растение
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
76,54	112,22	25,44	56, 06	32,63	62,70

Пример 11. Результаты по объектам риса CW00536, Ceres Annot: 847799, (SEQ ID NO: 208).

Анализ семени T1 от 16 объектов CW00536, содержащего Ceres Annot: 847799, проводился, как описано в примере 1. Высота растений и масса метелки трансгенных растений T 1 в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показана в табл. 14 и 15. Данные результатов обработки представляют средние показатели по 16 объектам с 15 трансгенным растениями на каждый объект и средние показатели нескольких сотен контрольных растений. Увеличение высоты и массы метелки показано в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

- 45 036343

Таблица 14

Таблица 15

Высота растения, см
Объект	Процентное увеличение по сравнению с контрольным
CW00536-03	7,79
CW00536-05	5, 66
CW00536-11	8,71
CW00536-12	8,47
CW00536-20	8,77

Пример 12. Результаты по объектам риса SR05004, CW00191, CeresAnnot: 878355 (SEQ ID NO: 425).

Анализ биомассы растений, выращенных из семян T2 и T₃ от одного объекта CW00191, содержащего Ceres Annot: 878355, проводился, как описано в примере 1. Среднее количество биомассы трансгенных растений T2 и T3 в сравнении с растениями, не содержавшими трансген и выращенными в том же месте, показаны в табл. 16. Делянки с низким содержанием азота и контрольные делянки повторялись 3 раза по схеме рандомизированных блоков, при этом были представлены трансгенные растения в виде нескольких объектов и контрольные группы. Каждая делянка содержала 40 растений. По одному объекту CW00191 проводилось измерение десяти растений в каждой делянке. Каждое значение биомассы в табл. 16 представляет собой среднюю величину по 30 измеренным растениям. Результаты показывают увеличение измеренной биомассы у трансгенных растений, выращенных в условиях нормального и низкого содержания азота в сравнении с растениями, не содержавшими трансген.

Таблица 16

Биомасса, г/растение (нормальное)	Биомасса, г/растение (низкое содержание азота)
Контрольное	Трансгенное	Контрольное	Трансгенное
14, 6	16, 75	16, 01	19, 64

Пример 13. Определение функциональных гомологов с помощью программы Reciprocal BLAST.

Отбираемая последовательность рассматривалась как функциональный гомолог эталонной последовательности, если отбираемая и эталонная последовательности, которые кодировали белки, выполняли аналогичную функцию и/или действие. Для определения потенциальных последовательностей функциональных гомологов в базах данных всех общедоступных и запатентованных пептидных последовательностей, в том числе всего банка данных Национального центра биотехнологической информации, а также синтеза пептидов из клонов Ceres, использовался так называемый процесс Reciprocal BLAST (двусторонний процесс поиска с помощью программы BLAST) (Rivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:62396244 (1998)).

Перед запуском процесса Reciprocal BLAST был произведен поиск специфического эталонного полипептида по всем полипептидам из исходных видов с использованием средства поиска основного локального выравнивания (BLAST) с целью определения полипептидов, имеющих идентичность последовательности согласно программе BLAST 80% или более по отношению к эталонному полипептиду и длину выравнивания 85% или больше вдоль более короткой последовательности в линии. Эталонный полипептид и прочие упомянутые выше идентифицированные полипептиды были обозначены как кластер.

Для определения в банке данных идентичности последовательностей и значения Е была использована программа BLASTP версии 2.0 Вашингтонского университета, Сент-Луис, штат Миссури, США. Параметры программы BLASTP версии 2.0 следующие: 1) предельное значение Е: 1.0е-5; 2) разрядность: 5; 3) опция - postsw. Идентичность последовательностей согласно программе BLAST вычислялась, исходя из выравнивания первых BLAST HSP (пар сегментов с максимальным сходством), идентифицированных потенциальных последовательностей функциональных гомологов с конкретным эталонным полипептидом. Число однозначно совпавших остатков при выравнивании BLAST HSP (пар сегментов с максимальным сходством) делилось на длину HSP и затем умножалось на 100 для получения идентичности последовательностей BLAST. Длина пар сегментов с максимальным сходством (HSP) обычно включала разрывы в последовательности, однако в некоторых случаях разрывы исключались.

Основной процесс Reciprocal BLAST состоит из двух этапов: поиска в банке данных с помощью

- 46 036343 программы BLAST в прямом направлении и поиска в обратном направлении. Во время поиска в прямом направлении производилось сравнение эталонной последовательности полипептида - полипептида А из исходных видов SA со всеми белковыми последовательностями из представляющего интерес вида. Максимальные совпадения определялись с использованием предельного значения Е 10-5 и предельного значения идентичности последовательности 35%. Среди максимальных совпадений последовательность с наименьшим значением Е обозначалась как лучшее совпадение и рассматривалась как потенциальный функциональный гомолог или ортолог. Любое другое максимальное совпадение, при котором идентичность последовательности была 80% или более по отношению к лучшей последовательности или к эталонному полипептиду, также рассматривалось как потенциальный функциональный гомолог или ортолог. Данный процесс повторялся для всех представляющих интерес видов.

Во время поиска в обратном направлении производилось сравнение максимальных совпадений, обнаруженных при поиске в прямом направлении, из всех видов, со всеми белковыми последовательностями из исходных видов SA. Максимальное совпадение из результатов поиска в прямом направлении, которое возвращало полипептид из вышеупомянутого кластера как лучшее совпадение, также рассматривалось как потенциальный функциональный гомолог.

Функциональные гомологи идентифицировались путем проверки вручную последовательностей потенциальных функциональных гомологов. Репрезентативные функциональные гомологи последовательностей SEQ ID NO: 554, 263, 117, 1, 645, 253, 323, 595, 77, 209 и 426 показаны, соответственно, на фиг. 1-11. Дополнительные примеры гомологов взаимосвязаны с определенными фигурами в перечне последовательностей.

Пример 14. Определение функциональных гомологов с помощью скрытой марковской модели.

Скрытые марковские модели (НММ) создавались программой HMMER 2.3.2. Для создания каждой модели НММ использовались параметры программы HMMER 2.3.2 по умолчанию, сконфигурированные для глобального выравнивания.

Модель НММ создавалась с использованием в качестве входных данных последовательностей, показанных на фиг. 1. Данные последовательности согласовывались с моделью, а репрезентативный показатель НММ для каждой последовательности показан в перечне последовательностей. Дополнительные последовательности согласовывались с моделью, а репрезентативные показатели НММ для каких-либо дополнительных последовательностей показаны в перечне последовательностей. Результаты показали, что данные дополнительные последовательности являются функциональными гомологами последовательности SEQ ID NO: 554.

Указанная выше процедура была повторена, и была создана модель НММ для каждой группы последовательностей, показанных на фиг. 2-11, с использованием последовательностей, показанных на каждом чертеже в качестве входных данных для этой модели НММ. Репрезентативный показатель по каждой последовательности показан в перечне последовательностей. Дополнительные последовательности согласовывались с определенными моделями НММ, а репрезентативные показатели НММ для таких дополнительных последовательностей показаны в перечне последовательностей. Результаты показывают, что данные дополнительные последовательности являются функциональными гомологами последовательностей, использованных для создания данной модели HMM.

Другие варианты.

Следует понимать, что, хотя описание изобретения дано в сочетании с его полным описанием, вышеизложенное описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Прочие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах следующей формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения растения с повышенным уровнем биомассы, который включает выращивание растения из растительной клетки, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, которая содержит регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, модулирующий уровень биомассы растения, последовательность которого на 85% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 209, и отбор растения с повышенным уровнем биомассы по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не содержит указанной экзогенной нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п.1, где последовательность указанного полипептида на 90% или более идентична остаткам 19-152 последовательности SEQ ID NO: 209.
3. Способ получения растения с повышенным уровнем биомассы, включающий выращивание растения из растительной клетки, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, которая содержит регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая на 80% или более идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 208, которая кодирует полипептид, модулирующий уровень биомассы, и отбор растения с повышенным уровнем биомассы по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не содержит указанной экзогенной

- 47 036343 нуклеиновой кислоты.
4. Способ повышения уровня биомассы у растения, включающий введение в растительную клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, модулирующий уровень биомассы растения, последовательность которого на 85% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 209, и где отбирают растение, выращиваемое из указанной растительной клетки, с повышенным уровнем биомассы по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не содержит указанной нуклеиновой кислоты.
5. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, где последовательность указанного полипептида представляет собой SEQ ID NO: 209.
6. Способ повышения уровня биомассы растения, включающий введение в растительную клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, которая содержит регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая на 80% или более идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 208, которая кодирует полипептид, модулирующий уровень биомассы растения, и где отбирают растение, выращиваемое из указанной растительной клетки, с повышенным уровнем биомассы по сравнению с соответствующим уровнем контрольного растения, которое не содержит указанной нуклеиновой кислоты.
7. Растительная клетка, включающая экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, модулирующий уровень биомассы растения, последовательность которого на 85% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 209, где растение, выращиваемое из указанной растительной клетки, имеет повышенный уровень биомассы растения по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не содержит указанной нуклеиновой кислоты.
8. Растительная клетка, включающая экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая на 80% или более идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 208, которая кодирует полипептид, модулирующий уровень биомассы растения, и где растение, выращиваемое из указанной растительной клетки, имеет повышенный уровень биомассы по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не содержит указанной нуклеиновой кислоты.
9. Трансгенное растение, содержащее растительную клетку по п.7 или 8, где указанное растение имеет повышенный уровень биомассы по сравнению с соответствующим уровнем биомассы контрольного растения, которое не содержит указанную нуклеиновую кислоту.
10. Трансгенное растение по п.9, выбранное из группы, включающей Panicum virgatum (просо), Sorghum bicolor (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискантус), Saccharum sp. (сахарный тростник), Populus balsamifera (тополь бальзамический), Zea mays (маис), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопчатник обыкновенный), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник однолетний), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла) или Pennisetum glaucum (просо африканское).
11. Трансгенное растение по п.9, содержащее полипептид, модулирующий уровень биомассы растения, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209.
12. Семя трансгенного растения по п.11.
13. Семя, которое дает трансгенное растение по п.9.