EA028658B1 - МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗОУСТОЙЧИВАЯ Fc-СОДЕРЖАЩАЯ МОЛЕКУЛА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к модифицированной Fc-содержащей молекуле, устойчивой к протеолитическому расщеплению по сравнению с Fc-содержащей молекулой IgG1 дикого типа, которая содержит Fc-домен антитела с мутированным константным доменом IgG1, причем последовательность E233-L234-L235-G236 IgG1 человека заменена на P233-V234-A235 с делецией G236, как определено в соответствии с нумерацией по EU, и дополнительно содержит одну или более замен в последовательности IgG1 человека дикого типа, выбранных из S239D/I332E; K326A/E333A; E333A/K334A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; K326A/I332E/E333A; S239D/K326A/E333A; S267E/I332E и G237X/S239D/I332E, где X представляет собой A, D, P, Q или S. Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболеваний, характеризующихся нежелательной пролиферацией или миграцией клеток, которая содержит указанную молекулу. Изобретение также включает способ лечения заболевания, характеризующегося нежелательной пролиферацией или миграцией клеток, включающий введение пациенту указанной фармацевтической композиции.

Description

Настоящее изобретение относится к константным участкам человеческих антител 1дС. в частности к участкам Рс, мутированным таким образом, чтобы изменить сайты протеолитического расщепления, придавая устойчивость по отношению к эндогенным и имеющим патогенное происхождение протеазам, а также дополнительно измененным таким образом, чтобы специфически связывать рецепторы Рсу и активировать митогенные ответы иммунных клеток за счет опосредованной рецепторами Рс перекрестной сшивки или активации комплементарного каскада. Новые последовательности могут быть включены в терапевтические композиции антител, в которых необходима протеолитическая устойчивость и функциональные свойства цитотоксического эффектора.

Описание области применения

Изотип человеческих антител 1дС состоит из подтипов 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4, каждый из которых содержит два антигенсвязывающих плеча (РаЬ), соединенных с общим доменом Рс шарнирным участком. 1дС1, преобладающий подкласс, представленный в терапевтических моноклональных антителах, принято относить к стабильным молекулам с продолжительным периодом полужизни от 17,6 до 56,2 суток (8а1£е1й, Ыа! Вю!есЬпо1 25(12):1369-72, 2007 г.). Однако 1дС1 подвержен протеолизу в шарнирном участке под воздействием ряда физиологически значимых протеаз, связанных с инвазивным раком (например, матриксные металлопротеиназы) и патологическими микроорганизмами. Расщепление выше дисульфидных связей (центральный шарнир) между тяжелыми цепями высвобождает одновалентный РаЬ, а двустороннее расщепление ниже дисульфидных связей высвобождает двухвалентную структуру фрагмент Р(аЬ')₂. Некоторые металлопротеиназы, два бактериальных фермента глутамилэндопептидаза У8 81арЬу1ососсик аигеик (С1иУ8) и разлагающий иммуноглобулин фермент 8!гер!ососсик руодепек (Ие8), воздействуют на 1дО1 в нижнем шарнире (ниже дисульфидных связей (фиг. 1)) и в конечном счете приводят к образованию фрагментов Р(аЬ')₂ и Рс (Куап е! а1., Мо1. 1ттипо1 45 (7):1837-46, 2008 г.).

Если эффективность терапевтических моноклональных антител (тАЬ), направленных против поверхностных антигенов клетки, связана с уничтожением клетки-мишени, эффекторные функции антитела, которые ему придает домен Рс, несомненно, играют роль и имеют важное значение для терапевтического эффекта антитела в целом (ВШеаи е! а1., 1. СЬп. Опсо1. 27:1122-1129, 2009 г.; Сайгоп е! а1., В1оой 99:754-758, 2002 г. и МикоЬпо е! а1., 1. СЬп. Опсо1. 26:1789-1796, 2008 г.). Предполагается, что домен Рс антитела, взаимодействующий с гамма-рецепторами Рс (РсуК), экспрессируемыми на иммунных клетках, а также взаимодействие домена Рс с комплементом определяют воздействие нескольких моноклональных антител (тАЬ), направленных против поверхностных антигенов клетки. Эти взаимодействия могут привести к устранению клеток-мишеней тАЬ за счет антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЭСС), антителозависимого клеточноопосредованного фагоцитоза (АЭСР) и комплементзависимой цитотоксичности (СИС).

В настоящее время показано, что единичное протеолитическое расщепление в одном из полипептидов тяжелой цепи 1дС1 не нарушает связи цепей и, следовательно, сохраняет продолжительность антигенсвязывающей способности в организме, но приводит к утрате способности 1дС1 связывать РсуК и определять опосредованные Рс эффекторные функции (Вге/кО е! а1., Ргос Ыа!1 Асай δα И8А 106:1786417869, 2009 г.). Как единичные, так и множественные расщепления терапевтических моноклональных антител могут приводить к образованию компонентов, которые связываются с мишенью, но частично или полностью утратили эффективность. Таким образом, инженерия протеазоустойчивых платформ Рс с повышенной эффекторной функцией помимо других применений может обеспечить значительное преимущество, заключающееся в повышении эффективности противораковых и противоинфекционных терапевтических средств, когда необходимо устранение клеток-мишеней или тканей-мишеней.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение представляет композиции модифицированных константных доменов иммуноглобулина, используемых при инженерии терапевтических средств на основе антител или им подобных. Иммуноглобулины класса 1дС, используемые в качестве терапевтических средств, содержащих участок Рс и имеющих лиганды клеточной поверхности в качестве мишеней, являются конкретными кандидатами для модификации при использовании настоящих композиций. Модифицированные иммуноглобулины, составляющие предмет настоящего изобретения, устойчивы по отношению к протеолитическим ферментам среды, мишенью которых является антигенсвязывающий домен 1дС, например внутриопухолевой среды, содержащей антиген, сопутствующий раковым клеткам или сосудистой сети опухоли, однако при этом они сохраняют важные эффекторные функции, связанные с участком Рс антитела.

В соответствии с настоящим изобретением предложены способы получения протеазоустойчивых моноклональных антител !дС1 посредством введения мутаций в участок Рс !дС1, которые делают их

- 1 028658 протеазоустойчивыми. В дополнительном аспекте функциональная активность 1дС. содержащих такие мутации, может быть восстановлена за счет введения дополнительных изменений в последовательности аминокислот в дистальном положении в участке Рс.

Композиция, составляющая предмет настоящего изобретения, представляет собой протеазоустойчивое антитело Ι§01, содержащее измененную последовательность аминокислотных остатков в нижнем шарнире Ι§01, которые участвуют во взаимодействии Рс и РсуК. Кроме того, было установлено, что они являются сайтами физиологически значимого протеолитического расщепления. В одном аспекте остатки подкласса человеческого 1д01 заменяют соответствующими остатками нижнего шарнира человеческого Ι§02. В одном варианте осуществления последовательность Е233-Ь234-Ь235-О236 человеческого 1д01 заменяют на 1д02 Р233-У234-А235 с делецией 0236 (нумерация по ЕЙ (Ебе1шаи с1 а1., Ргос Νηΐΐ Асаб 8с1 и§А 63:78-85, 1969 г.)). В другом варианте осуществления остатки 1д01 Е233-Ь234-Ь235-0236-0237 заменяют на Р233-У234-А235 с делецией 0236, а 0237 заменяют аминокислотой, выбранной из А, Ό, Р, О или δ.

Во втором аспекте способность протеазоустойчивого мутанта 1д01, составляющего предмет настоящего изобретения, связывать РсуК и/или комплемент может восстанавливаться за счет введения дополнительных мутаций. Таким образом, без таких дополнительных замен протеазоустойчивый мутант 1д01, содержащий протеазоустойчивый шарнирный участок, содержащий Р233-У234-А235 с делецией 0236, отличается сниженной способностью связывать РсуК. Чтобы решить проблему утраты эффекторной функции, касающейся связывания РсК и Ску в константный участок, не относящийся к шарниру, вводят дополнительные мутации таким образом, чтобы модифицированная молекула 1д01 сохраняла измеримую или даже повышенную способность связывать РсуК по сравнению с человеческим 1д01 дикого типа. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения протеазоустойчивый 1д01 содержит такие молекулы, которые содержат домен Рс с последовательностью человеческого 1д01 в шарнирном участке и участке СН2 от приблизительно остатков 214 до приблизительно остатка 330 по системе ЕЙ, где, по меньшей мере, остатки 233-237 заменены на РУА/(делеция 0236), а также введены специальные замены, выбранные из δ239Ω/Ι332Η; К326А/Е333А; Н268Р^324Т/1332Е; Р243Е/К292Р/У300Ь; δ239^/Н268Р/δ324Т/I332Е; δ267Е/Н268Р/δ324Т/I332Е; Е333А/К334А;

0237А^239О/1332Е; а также 0237δ/δ239^/I332Е; δ298А/Е333А/К334А; δ239Ό/Κ326Α^333Α и δ267Е/I332Е. В конкретном варианте осуществления молекула 1д0, полученная на основе последовательностей константного участка 1д01 дикого типа, содержит δΞΟ ΙΌ N0:6. Таким образом, введение этих дополнительных мутаций обеспечивает функции Рс, сохраняя при этом протеазоустойчивость, а в некоторых случаях улучшает опосредованную Рс эффекторную функцию по сравнению с диким типом 1д01 как в анализах связывания РсуК ίη νίίτο, так и в клеточных анализах ίη νίίτο, таких как антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЭСС). Протеазоустойчивое моноклональное антитело с эффекторной функцией, включающее домен Рс, составляющий предмет настоящего изобретения, используется в качестве противоракового и противомикробного терапевтического средства, причем возможно расщепление 1д0 вследствие повышенного локального уровня протеазы в сайтах роста опухоли или инфекции.

В другом аспекте композиции, описанные в настоящем документе, находят применение в качестве компонентов молекул терапевтических средств, вводимых нуждающимся в них пациентам, например млекопитающим. В одном способе использования композиции антитело, содержащее последовательности человеческого 1д01 дикого типа и лигандсвязывающий домен, которое используется для лечения нуждающихся в этом пациентов, модифицировано для включения протеазоустойчивых шарнирных последовательностей Р233-У234-А235 с делецией 0236 и при необходимости включает модификации, восстанавливающие эффекторную функцию, выбранные из δ239Ω/Ι332Η; К326А/Е333А;

Н268Р^324Т/1332Е; Р243Е/К292Р/У300Е; К326А/1332Е/Е333А, δ239^/Κ326А/Е333А и δ267Е/I332Е δ239Ι)/Ι Ι268Ι·7δ324Τ/Ι332υ; δ267Е/Н268Р/δ324Т/I332Е; Е333А/К334А; 0237А^239Ш332Е; а также 0237δ/δ2390/Ι332Η. В одном варианте осуществления композицию мутанта 1д01 Рс используют при показаниях, когда для эффективности композиции важное значение имеет активация РсуК, связанная с иммунной и эффекторной функциями, такими как ί) антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЭСС), ίί) комплементзависимая цитотоксичность (СЭС), ίίί) антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз (АОСР) и ίν) опосредованная РсК клеточная активация (например, высвобождение цитокинов посредством перекрестной сшивки РсК), и ν) опосредованная РсК активация/элиминация тромбоцитов. В одном аспекте мутации 1д01 Рс вводят в терапевтические антитела или Рс-слитые поливалентные связующие, имеющие в качестве мишеней лиганды на клетках пролиферативных расстройств, таких как клетки опухоли; клетки сосудистой сети опухоли; фибробласты; активированные В-клетки или Т-клетки, или клетки патогенного хозяина, или клетки, полученные не от хозяина, в особенности бактериальные клетки.

В другом варианте осуществления мутант 1д01 Рс содержит фармацевтическую композицию. В другом варианте осуществления мутант 1д01 Рс содержит часть фармацевтически активной молекулы. Фармацевтические композиции, содержащие мутант 1д01 Рс или активные молекулы, содержащие му- 2 028658 тант 1дС1 Рс, используют для лечения заболеваний, характеризующихся нежелательной или неконтролируемой пролиферацией или миграцией клеток. В одном аспекте композиции настоящего изобретения с протеазоустойчивым константным доменом в комбинации с лигандсвязывающим доменом вводят нуждающемуся в них пациенту с использованием способа введения в ту часть организма, где были обнаружены одна или более протеаз, способных разлагать молекулы подкласса 1дС1, с использованием способов системной доставки или местной доставки.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено изображение антитела человеческого 1дС1, дополненное аминокислотной последовательностью, присутствующей в шарнирном участке, который имеет важное значение для взаимодействия РсуК и комплемента, а также с указанием точек расщепления протеазой.

На фиг. 2 представлено сопоставление аминокислотных последовательностей частей константных участков человеческого 1дС1 дикого типа (8Еф ΙΌ N0: 1) и 1дС2 (8Еф ГО N0: 2), сопоставленных с новыми конструкциями 2й 8239Ό/Ι332Ε (8Еф ΙΌ N0: 8) и 2й Е333А/К334А (8Еф ΙΌ N0: 9), с указанием соответствующей нумерации по системе ЕЙ для каждого остатка; где шарнирный участок как 1дС1, так и 1дС2 в обоих случаях содержит цистеиновые остатки при остатках ЕЙ 226 и 229, как и в новых конструкциях.

На фиг. 3А, В представлены анализы расщепления антител, содержащих различные изотипы 1дС (А) и их новые конструкции, как описано на фиг. 2, в присутствии протеазы Ие8 в различные моменты времени.

На фиг. 4АГО представлено расщепление конструкций 1дС в присутствии Ие8 (А), С1иУ8 (В), ММР-3 (С) и ММР-12 (Ό) через 24 ч инкубации (п=2).

На фиг. 5А-С представлены результаты анализа связывания РсуК с помощью А1рйа8сгееп® для групп протеазоустойчивых конструкций шАЬ: РсуК1 (А), РсуКПа (В и С), РсуКПЬ (Ό и Е) и РсуКШа (Р и С), где восстановление в % максимального сигнала отражает способность немеченой конструкции конкурировать с биотинилированным 1дС1 при связывании (п=2).

На фиг. 6А-С представлены графики отдельных анализов АЭСР, проведенных с протеазоустойчивыми конструкциями тАЬ и 1дС1 и 1дС2 дикого типа, где % фагоцитоза по оси Υ отражает общее число отобранных клеток.

На фиг. 7А-С представлены графики отдельных анализов ЛЭСС. проведенных с протеазоустойчивыми конструкциями тАЬ и 1§С1 и 1дС₂ дикого типа, где % лизиса по оси Υ определяется относительно 100% лизиса того же количества клеток под воздействием детергента (п=2).

На фиг. 8 представлен график анализа СОС, проведенного с протеазоустойчивыми конструкциями тАЬ и 1§С1 и 1дС₂ дикого типа, где % лизиса по оси Υ определяется относительно 100% лизиса того же количества клеток под воздействием детергента (п=2).

- 3 028658

Краткое описание списка последовательностей

5Е<2 Ю N0:	Описание
1	1д61 - Ес; человеческий 1д класса гамма, подкласс, шарнир, домены СН2 и СНЗ
2	1д62 - Ес; человеческий 1д класса гамма, подкласс 2, шарнир, домены СН2 и СНЗ
3	Шарнирный участок 1д61, ЕЮ 214-236
4	Шарнирный участок 1д62 (2 Нс), ЕЮ 214-235
5	Гибридный шарнирный участок 1д6 (2И), 1д62 ЕЮ 233-235
6	2Нс (Еи 214-447)
7	2Н (Еи 214-447)
8	2Н 3239Ώ/Ι332Ε
9	2Н Ε333Α/Κ334Α
10	2Н Е243Ь/Н292Р/У300Ь
11	2Н Η268Ε/3324Τ/Ι332Ε
12	2Н 3239Ώ/Η268Ε/3324Τ/Ι332Ε
13	2Н 3267Е/Н268Ε/3324Τ/Ι332Ε
14	2Н Κ326Α/Ε333Α
15	2Н 6237Χ/3239ϋ/Ι332Ε, где X представляет собой Α, ϋ, Ρ, 0 или 3
16	2Нс 3239Ώ/Ι332Ε
17	1д62 3239Ώ/Ι332Ε
18	2Н К326Α/Ι332Ε/Ε333Α
19	2Н 3239Ώ/Κ326А/ЕЗЗЗА
20	2Н 3267Ε/Ι332Ε

Подробное описание изобретения

Сокращения.

А1)СС антителозависимая клеточная цитотоксичность; А1)СР антителозависимый клеточный фагоцитоз; С1)С комплементзависимая цитотоксичность; РОСИ Рс-зависимое высвобождение цитокинов; РсуК или Рс-гамма-К=Рс-гамма рецептор; О1иУ8=глутамилэндопептидаза У8 51арЬу1ососси§ аитеиз; Ые5=разлагающий иммуноглобулин фермент 51гер1ососси§ руогенез; 1дС иммуноглобулин С; 1ТАМ=мотив активации иммунорецептора на основе тирозина; 1Т1М=мотив ингибирования иммунорецептора на основе тирозина; МаЪ=моноклональное антитело; ММР=матриксная металлопротеиназа; термин протеаза эквивалентен термину протеиназа, и они используются равнозначно; РК=протеазоустойчивый.

Определения и объяснение терминологии

Термины антителозависимая клеточная цитотоксичность, антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность или А1)СС относятся к такой форме цитотоксичности, при которой секретируемый 1д, связанный с рецепторами Рс (РсИ), которые присутствуют на определенных цитотоксических клетках (например, на клетках естественных киллерах (ΝΚ), нейтрофилах и макрофагах), способствует специфическому связыванию этих цитотоксических эффекторных клеток с клеткой-мишенью, которая является носителем антигена, с последующим уничтожением клетки-мишени цитотоксинами. Лигандспецифичные высокоаффинные антитела 1дС, нацеленные на поверхность клеток-мишеней, стимулируют цитотоксические клетки и совершенно необходимы для такого рода уничтожения. Лизис клетки-мишени имеет внеклеточную природу, требует прямого контакта клетка-клетка, и в данном процессе комплемент не задействован.

Можно проводить анализ способности любого конкретного антитела опосредовать лизис клеткимишени за счет А1)СС. Для оценки активности А1)СС анализируемое антитело добавляют к клеткаммишеням, имеющим целевой лиганд, в комбинации с иммунными эффекторными клетками, которые могут быть активированы комплексами антиген-антитело с последующим цитолизом клетки-мишени. Ци- 4 028658 толиз, по существу, обнаруживают по высвобождению метки (например, радиоактивных субстратов, флуоресцентных красителей или природных внутриклеточных белков) из лизированных клеток. Подходящие для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и клетки естественные киллеры (ΝΚ). Конкретные примеры анализов ίη νίΐτο АЭСС описаны в работах ХУЬссагосг е1 а1., 1985 г., 19:211; Вгиддетапп е1 а1., 1987 г., 1. Ехр Меб 166:1351; ХУШбпкоп е1 а1, 2001 г., 1. 1ттипо1 Мебюбк 258:183; Ра1е1 е1 а1., 1995 г., 1. 1ттипо1 Мебюбк 184:29 (каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки). В альтернативном варианте осуществления или дополнительно активность АЭСС рассматриваемого антитела может оцениваться ίη νίνο, например, в модели на животных, такой как описанная в работе С1упек е1 а1., 1998 г., ΡΝΑδ υδΑ 95:652, содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки. Если эффекторная клетка действует в основном посредством фагоцитоза, процесс может называться антителозависимым клеточным фагоцитозом (АЭСР).

Комплементориентированная цитотоксичность или СОС обозначает такую форму цитотоксичности, при которой каскад комплемента активируется связыванием компонента комплемента С1с| с антителом Рс.

Термин эффекторные функции включает такие взаимодействия Рс с Рс-гамма-рецепторами (РсуК), экспрессированными на иммунных клетках, а также взаимодействия домена Рс с комплементом, которые приводят к устранению экспрессирующей антиген клетки с помощью литических процессов или в ходе фагоцитоза эффекторными клетками и компонентами комплемента.

В настоящем документе термины Рс, Рс-содержащий белок или Рс-содержащая молекула обозначают мономерные, димерные или гетеродимерные белки, имеющие, по меньшей мере, домен СН2 и СН3 иммуноглобулина. Домены СН2 и СН3 могут образовывать по меньшей мере часть димерного участка белка/молекулы (например, антитела).

В настоящем документе термин антитело означает конкретную форму Рс-содержащего белка, содержащего по меньшей мере один лигандсвязывающий домен, который содержит или сохраняет значительную гомологию по отношению по меньшей мере к одной тяжелой или легкой цепи вариабельного домена антитела по меньшей мере одного вида антитела животных.

Константные последовательности человеческого подкласса 1дС дикого типа каталогизированы в базе данных ИтРгоТ которая доступна в режиме онлайн, под кодами Р01857 (1дС1), Р01859 (1дС2), Р01860 (1дС3) и Р01861 (1дС4). В настоящем документе термин участок человеческого 1дС1 Рс дикого типа означает участок человеческого 1дС Рс, который содержит аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 1 или ее фрагмент, который содержит от остатка К214 до остатка К447 тяжелой цепи человеческого 1дС в соответствии с нумерацией ЕЙ по КаЬаО Аминокислоты в константном участке нумеруются в соответствии с сопоставлением с антителом человеческого 1дС1 по ЕЙ (см. Сипшпдйат е1 а1., 1970 г., Вюсйет1к1гу, 9: 3161-70). Таким образом, тяжелая и легкая цепи антитела сопоставляются с тяжелой и легкой цепями ЕЙ для достижения максимальной идентичности аминокислотной последовательности, и каждой аминокислоте в антителе присваивается тот же номер, что и соответствующей аминокислоте в ЕЙ. Систему нумерации ЕЙ по общему соглашению принято использовать специалистами в данной области (см., в целом работу, КаЬа1 е1 а1., ^есщепсек о! Рто1еш о! 1ттипо1одюа1 1п1егек1, ΝΙΗ РиЬПсабоп №. 91-3242, И8 ЭераПтеШ о! Неа1Ш апб Нитап δе^ν^се5 (1991 г.)). В соответствии с соглашением при сопоставлении константного участка 1дС2 дикого типа и ЕЙ обнаруживается отсутствие аминокислот в положениях 221-223 и 236 (фиг. 2, δΞΟ ГО N0: 2).

Последовательности константного домена тяжелой цепи 1дС млекопитающих обозначаются в последовательности как СН1-шарнир-СН2-СН3. Шарнир, шарнирный участок или шарнирный домен 1дС, по существу, определяются как участок, включающий С1и216 и заканчивающийся на Рго230 человеческого 1дС1 по системе КаЬа1, но с функциональной точки зрения можно считать, что гибкая часть цепи содержит дополнительные остатки, которыми заканчиваются верхний и нижний участок шарнира, как, например, с С1и216 по С1у237 (Коих е1 а1. 1. 1ттипо1. 1998 г., 161:4083), а под нижним шарниром понимают участок Рс остатков 233-239, где, по существу, происходило связывание Рс-гамма-К. Шарнирные участки других изотипов 1дС могут сопоставляться с последовательностью 1дС1 с выравниванием первого и второго цистеиновых остатков, образующих сшивки δ-δ между тяжелыми цепями. Несмотря на возможное незначительное расхождение по границам в соответствии с нумерацией по системе КаЬа1, домен СН1 прилегает к домену УН, а аминоконец - к шарнирному участку тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, и включает первый (в основном аминоконец) домен в константном участке тяжелой цепи иммуноглобулина, например, приблизительно с положений ЕЙ 118-215. Домен Рс проходит от 231 до 447 аминокислотных остатков; домен СН2 - от приблизительно А1а231 до Ьук340 или С1у341, а СН3 - от приблизительно С1у341 или С1п342 до Ьук447. Остатки константного участка тяжелой цепи 1дС участка СН1 заканчиваются на Ьук.

Термин протеазоустойчивый означает способность молекулы, содержащей пептидные связи, противостоять гидролитическому расщеплению одной или более из своих пептидных связей в присутствии протеолитического фермента. Устойчивость к протеолитическим ферментам является относительным свойством и сопоставляется с молекулой, которая в меньшей степени способна противостоять гидроли- 5 028658 тическому расщеплению одной или более своих пептидных связей за указанный период времени и в указанных условиях, включая рН и/или температуру, при которых проверяется устойчивость к расщеплению. Один результат протеолитического расщепления, указывающий на то, что такой распад произошел, представляет собой создание более мелких фрагментов (с более низкой молекулярной массой) по сравнению с молекулярной массой интактной нерасщепленной материнской молекулы.

Термин терапевтически эффективное количество означает количество терапевтического агента, описанного в настоящем документе, содержащего домен Ре, который может представлять собой антитело, фрагмент антитела или его производное для лечения того или иного заболевания или расстройства у пациента.

Общее описание изобретения

Создание настоящего изобретения определено попытками определить домен Рс для использования при производстве терапевтических антител, слитых Рс и подобных биофармацевтических средств с повышенной устойчивостью к протеолизу ίη δίίπ и с сохраняющейся способностью вызывать высвобождение цитокинов, повреждать или уничтожать клетки-мишени, имеющие антиген, и ткани, окружающие клетки-мишени.

Протеазы подразделяются на пять основных групп в соответствии со структурой каталитического сайта и аминокислоты (как одной из составляющих), имеющей большое значение для их активности: сериновые протеиназы, треониновые протеиназы, цистеиновые (тиоловые) протеиназы, аспарагиновые протеиназы и металлопротеиназы.

Различные внеклеточные протеазы функционируют внутри организма и в отделах тела, осуществляя важные регулирующие и метаболические процессы. Кислотоустойчивые протеазы, секретируемые в желудок (такие как пепсин), и сериновые протеазы, присутствующие в двенадцатиперстной кишке (трипсин и химотрипсин), обеспечивают расщепление белков из пищи в желудочно-кишечном тракте; протеазы, присутствующие в крови или сыворотке (тромбин, плазмин, фактор Хагемана и т.п.), играют важную роль в процессах свертывания крови, а также лизиса тромбов и регуляции клеток иммунной системы. Протеазы присутствуют или высвобождаются в лейкоцитах (эластаза, катепсин О). Протеазы определяют время жизни других белков и, таким образом, играют важную роль в метаболизме. В отличие от гормонов, интерлейкинов или хемокинов механизм экспрессии белка не требует никакой внутриклеточной передачи или изменений, что делает протеолитический контроль одним из самых быстрых механизмов регуляторного переключения. Совместное действие протеаз, например, в каскадных реакциях дополнительно приводит к быстрой и эффективной амплификации отклика организма на физиологический сигнал.

Изотипы человеческого 1дО (подклассы зрелых антител гамма-глобулина класса О; 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4) показывают дифференцированную способность усиливать иммунные функции. Например, антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС) стимулируется 1дО1 и 1дО3, антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЭСР) стимулируется 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4, а комплементзависимая цитотоксичность (СЭС) стимулируется 1дО1 и 1дО3. Изотипспецифическое включение таких иммунных функций основано на селективности рецепторов Рс в отношении отдельных иммунных клеток и способности связывать С1ц. посредством этого активируя образование мембраноатакующего комплекса (МАС). Среди различных изотипов относительная аффинность к рецепторам Рсу, которые включают РсуК1, РсуКЛа/Ь/с и РсуКШа/Ь, является высокой для 1дО1 и 1дО3. Однако аффинность Рсу к 1дО2 значительно ниже, за исключением полиморфизма РсуКЛа Н131, и 1дО4 проявляет лишь измеряемую аффинность к РсуКЕ На основе сравнительного анализа последовательности и структур сокристаллизации ключевые контактные остатки для связывания рецептора сопоставлялись с аминокислотными остатками, входящими в участок нижнего шарнира и участок СН2 ((Не/егеЬ е! а1., I. νίτοί 75:12161-12168 2001 г.; §Ые1Й8 е! а1., I. ΒίοΙ СЬет 276:6591-6604, 2001 г.).

Во многих исследованиях, проведенных ранее, был сделан вывод о том, что замены в остатках нижнего шарнира 1дО2 (положения по ЕЙ 233-235) нарушают опосредованную РсуК функцию и активацию комплемента. В одной работе замена Ε233Ρ-Ε234ν-Ε235Α с делецией О236 в нижнем шарнире 1дО1 было одним вариантом панели конструкций Рс человеческого 1дО1, для которых была продемонстрирована утрата опосредованной Рс эффекторной функции (Агтоиг е! а1., 1999 г., Еиг ί. 1ттипо1 29:26132624). Эта информация показывает, что замена остатков в шарнире 1дО1 или рядом с ним на соответствующие остатки 1дО2 приводила к заметной утрате аффинности связывания с РсуКя и утрате способности влиять на фиксацию комплемента и уничтожение клеток.

Во-вторых, некоторые из указанных положений остатков относятся именно к тем, в которых протеазы расщепляют последовательность 1дО1 (фиг. 1) и которые заняты различными аминокислотами в более протеолитически устойчивой последовательности 1дО2, как продемонстрировано при сопоставлении человеческих 1дО1 и 1дО2 (фиг. 2). Авторы настоящего изобретения использовали эту информацию в качестве отправной точки для создания протеазоустойчивого 1дО-Рс, но с компетентной эффекторной функцией.

В настоящем изобретении впервые продемонстрированы замены во множестве положений кон- 6 028658 стантных участков Ι§Ο1 (Ре), которые неожиданным образом позволяют создать протеазоустойчивый и функциональный (Рс§К-связывающий) домен Рс. Специалистам в данной области будет понятно, что если известны свойства домена Рс, имеющего специфическую аминокислотную последовательность, информацию можно использовать для конструирования или модификации инженерии существующих антител или полипептидных слитых Рс. Протеазоустойчивость, которой обладают композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, распространяется, например, на протеазы, которые расщепляют у остатков 1§С1 при шарнирном участке, замененных на альтернативные аминокислоты, полученные у соответствующего остатка 1§С2, например ММР-3, ММР-7, ММР-12, ΗΝΕ, плазмин, катепсин С, пепсин, 1бе8 или глутамилэндопептидаза I 81арй аигеиз (фир. 1) (Куап е1 а1., 2008 г. зирга).

Замененные по множеству положений мутанты 1§С1 выбирали на основе их относительной аффинности к человеческим РсК (РсуК1, РсуКПа, РсуКПЪ, РсуКШа, оценку проводили по конкурентным анализам Л1рЪа8сгееп®). Эти мутанты дополнительно тестировали в соответствующих клеточных системах по их способности индуцировать ЛЭСС в присутствии РВМС и АЭСР в присутствии макрофагов, дифференцированных ίη νίίτο. В экспериментальных данных, представленных в настоящем документе, 1§С1 с указанными введенными мутациями (табл. 2) представляли собой рекомбинантные протеазоустойчивые шЛЬ, производные от 1§С1 с мутацией, усиливающей Рс.

Альтернативные композиции остатков 214-237 в шарнирном участке 1§С1 по системе нумерации Ευ (8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 3) получили с использованием человеческого 1§О1 дикого типа (^ί) (8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 1), а для обеспечения протеазоустойчивости производили замену всей последовательности 1§О2 (8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 4) шарнира или химерного шарнира (8Ε^ ГО ΝΟ: 5), причем, как показано в табл. 1, менялись только остатки 233-235.

Таблица 1

Название Ес	Каркас 1дС (Εϋ 214-447)	Шарнир/проксимальная СН2 (ЕЙ 214-236)
1дС1 аЕ (ϋηίΡΓοΕ Р01857, 96-329)	Н1дС1	КУЕРКЗСРКТНТСРРСРАРЕЬЬС (ЗЕО Ιϋ N0:3)
1дС2 аЕ (ϋηίΡΓοΕ Р01859, 97-326)	Н1дС2	ТУЕ ИКС СУЕ С Ρ Р С РАР ΡVА (ЗЕО ΙΌ N0:4)
2 Нс	Н1дС1 со всем шарнирным участком 1дС2	ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 4
2Н	Н1дС1	КУЕРКЗСРКТНТСРРСРАРРУА (ЗЕО ΙΡ N0:5)

Компенсирующие мутации в участках, усиливающих эффекторную функцию, как показано ниже в табл. 2, могут быть выбраны из ранее описанных замен.

Таблица 2

Мутации (нумерованные по положениям)	ЕЦ	Контроль
3239Ώ/Ι332Ε	1
Ε333Α/Κ334Α	5
Е243Ь/Н292Р/У300Ь	3
Η268Ε/3324Τ/Ι332Ε	4
3239Ώ/Η268Е/3324Т/I332Е	4
3267Е/Н268Е/3324Т/I332Е	4
Κ326Α/Ε333Α	2
К326Α/Ι332Ε/Ε333Α	1, 2
3239Ώ/Κ326А/ЕЗЗЗА	1, 2
3267Ε/Ι332Ε	1, 4
6237Χ/3239ϋ/Ι332Ε, где	X	1
представляет собой Α, ϋ, Р,	<2
или 3
3298Α/Ε333Α/Κ334Α	5

- 7 028658

Конструкции с повышенной функцией Рс ранее цитировались в следующих работах:

1) 1тыаг, Ргос Ναίΐ Асаб 8с И8А 103:4005-4010 (2006 г.),

2) 1бизод1е, I. 1ттипо1 166:2571-2575 (2001 г.),

3) 81ауепйадеп, Сапсег Кез 67(18):8882-90 (2007 г.),

4) Мооге, е! а1. МАЬз 2(2):181-189 (2010 г.),

5) 8ЫеЫз е! а1., I. Вю1. Сйет. 276:6591-6604 (2001 г.).

По различным показателям функции Рс, полученным на основе анализов т уйго, было определено несколько протеазоустойчивых последовательностей Рс, которые при введении в полную структуру 1дО (Н2Ь2) обеспечивали устойчивость по отношению к одной или более протеазам, действующим по остаткам нижнего шарнира (Εϋ232-237), сохраняя при этом способность связывать РсуК или вызывать цитолиз. Изменения активности, связанной с Рс, для выбранных конструкций, содержащих изменение в шарнире, а также в участке СН2, и подразделенных по аффинности рецептора и биологической активности т уйго, представлены в табл. 3.

Таблица 3

Способ получения молекул с измененным Рс-содержащим участком.

Сайты для замен выбирают в зависимости от необходимости получить композицию, имеющую структурные элементы нативного антитела Рс, сохранить стабильность, удерживать связывание РсК и способность стимулировать каскад комплемента, лизис клеток, фагоцитоз клеток или высвобождение цитокинов. Белки, в частности многомерные молекулы с длинными полипептидными цепями, с измененными или мутированными аминокислотами, удобно получать посредством модификации нуклеиновой кислоты в пределах вектора экспрессии, который кодирует материнскую последовательность для изменения соответствующего генетического кодона для необходимой аминокислоты. Генетический код и такие способы хорошо известны специалистам в данной области. При создании химерной последовательности, такой как Рс, составляющей предмет настоящего изобретения, содержащей части 1дО1 и части 1§О2, можно провести сплайсинг более крупных сегментов соответствующих кодирующих нуклеиновых кислот или замену сегментов с помощью стандартных методик клонирования.

Протеолитическое тестирование.

Чтобы определить, является ли та или иная Рс-содержащая композиция или антитело более протеазоустойчивой по сравнению с другой или композицией дикого типа, оцениваются скорость или степень расщепления различных выделенных Рс-содержащих композиций или антител в присутствии протеолитического фермента. После определенного периода времени измеряют расщепление различных композиций с помощью способа, позволяющего выявить непосредственное расщепление цепи, такое как образование уникальной структуры в сайте расщепления или измерение вновь образовавшихся фрагментов. В альтернативном варианте осуществления, если расщепление приводит к утрате активности, может проводиться функциональный анализ, включая анализ связывания.

Протеолитическое расщепление 1§О1 может проходить по любой из четырех полипептидных цепей димерной гетеродимерной структуры. Расщепление 1дО приводит к созданию хорошо охарактеризованных фрагментов, таких как РаЬ, (РаЬ')₂, и фрагментов Рс с приблизительными, но уникальными молекулярными массами. Разделение таких фрагментов, полученных в ходе эксперимента протеолиза, может достигаться с помощью эксклюзионной хроматографии (8ЕС), гель-электрофореза, анализов МАРИ1ТОР-М8 (время-пролетной масс-спектрометрии с матриксной лазерной десорбцией/ионизацией) после дегликозилирования с использованием ΡΝΟ-азе Р (пептид-Югликозидаза Р), как это было описано раньше (ЧО2007024743А2, ЧО2009045894А1).

Следовательно, под устойчивой к протеолитическому расщеплению Рс-содержащей композицией

- 8 028658 понимают то, что та или иная композиция с меньшей вероятностью будет расщепляться, утрачивать активность, утрачивать аффинность к связывающему Рс партнеру, такому как РсК, после воздействия протеолитического фермента по сравнению с сопоставимой молекулой, такой как дикий тип человеческого 1§О1.

Биологические характеристики мутантов.

Функциональность Рс-содержащих белков можно сравнивать при помощи нескольких хорошо известных анализов ίη νίίτο. В частности, представляет интерес аффинность к членам семейства РсуЫ, РсуКП и РсуКШ рецепторов Рсу. Данные измерения можно производить с использованием рекомбинантных растворимых форм рецепторов или клеточноассоциированных форм рецепторов. Кроме того, можно измерять аффинность к РсКп, рецептору, ответственному за продолжительный период полужизни 1дС. с помощью набора в виде лигандсвязанных гранул, такого как ΆΡΡΗΆδΟΚΕΕΝ с рекомбинантным растворимым РсКп. А1рйа8стееп®, используемый в скрининге с высокой пропускной способностью, представляет собой технологию гомогенного анализа, который позволяет регистрировать события на молекулярном уровне, такие как связывание. В основе технологии анализа Л1рйа8стееп® лежат гранулы донора и акцептора с покрытием. Анализ Л1рйа8стееп® с использованием гранул обеспечивается за счет взаимодействия гранул при сближении друг с другом, которое приводит к каскаду химических реакций, приводящих к значительно более амплифицированному сигналу. Например, при конкурентном связывании для оценки относительной аффинности или авидности белков могут применяться прямые или косвенные оценки.

В результате естественной эволюции изотипов человеческого 1дС (например, 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4) каждый из них показывает различный спектр способностей мобилизовать иммунные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС, например 1дО1 и ί§03), антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЭСР, например 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4) и комплементзависимая цитотоксичность (СОС, например 1дО1, ί§03). Изотипспецифическое включение данных функций основано на дифференцированной селективности к рецепторам Рс, которые находятся в различных иммунных клетках, и способности связывать СП] и активировать сборку мембраноатакующего комплекса (МАС) с последующими СОС и СОР (комплементзависимый фагоцитоз) посредством специфического рецепторного связывания компонентов комплемента на эффекторных макрофагах. Иерархия способности связывать исходный компонент, СП], каскада комплемента для человеческих изотипов выглядит следующим образом: ί§Ο1>ί§Ο3>ί§Ο2>ί§Ο4, причем способность ί§02 и 1дС4 активировать комплемент при микробных инфекциях подтверждена документально.

Функциональные клеточные анализы, такие как анализы АЭСС и СОС, дают представление о вероятных функциональных последствиях конкретных конструкционных структур. Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЭСС) представляет собой клеточноопосредованную реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Рс (РсК) (например, клетки естественные киллеры (ΝΚ), нейтрофилы и макрофаги), обнаруживают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. В одном варианте осуществления анализ АЭСС выполнен с возможностью присутствия ΝΚ-клеток в качестве первичной клетки-эффектора, что отражает функциональные эффекты воздействия на РсуКШа, который, как известно, является единственным активирующим рецептором Рсу-типа, экспрессируемым данными клетками.

Для сравнения иммунных эффекторных функций разных мутантов также можно использовать анализ фагоцитоза, а также анализы, измеряющие клеточные реакции, такие как высвобождение супероксида или медиатора воспаления. Также можно использовать модели ш νίνο, например, при использовании мутантов анти-СО3-антител для измерения активации Т-клеток у мышей - активности, которая зависит от связывания доменов Рс со специфическими лигандами, такими как рецепторы Рсу. Антителонаправленная активация макрофагов опосредует антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЭСР), в результате чего опсонизированные клетки-мишени поглощаются и перевариваются макрофагами. 1п νίίτο дифференцированные макрофаги, экспрессирующие высокие уровни РсК, могут дифференцироваться по фенотипу М1 под воздействием ίΝΤγ или ОМ-С8Р до экспрессированных повышенных уровней всех РсК (РсуЫ, РсуКПа, РсуКШа) по сравнению с моноцитами.

Получение мутантов антител.

Композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, представляют собой сложные белки, которые наиболее удобно получать в рекомбинантной клетке-хозяине. Как описано в настоящем документе, клетка-хозяин, выбранная для экспрессирования рекомбинантного Рс-содержащего белка или моноклонального антитела, оказывает большое влияние на конечную композицию, включая без ограничений вариацию в композиции окружающих белок фрагментов олигосахаридов в домене СН2 иммуноглобулина. Таким образом, один аспект настоящего изобретения включает выбор соответствующей клеткихозяина, несущей полинуклеотидные последовательности, которые кодируют конструкции, составляющие предмет настоящего изобретения, содержащие Рс, для применения в качестве продуктивной клетки, экспрессирующей необходимый терапевтический белок, или для создания такой клетки.

Клетка-хозяин может дополнительно происходить от млекопитающего или может быть выбрана из

- 9 028658 клеток СОЗ-1, СО8-7, НЕК293, ВНК21, СНО, В8С-1, Нер 02, 653, 8Р2/0, 293, НеЬа, клеток миеломы, лимфомы, дрожжей, клеток насекомых или растений или любых их производных, иммортализованных или трансформированных клеток.

В альтернативном варианте осуществления клетка-хозяин может быть выбрана из клеток видов или организмов, неспособных гликозилировать полипептиды, например прокариотических клеток или организмов, таких как природные или рекомбинантные бактерии вида Е. сой, К1еЬк1е11а или Ркеиботопак, клетки рекомбинантных растений или насекомых.

Гликозилирование при природном сайте гликозилирования в тяжелой цепи 1д0 (N297, нумерация по ЕЙ) также вносит вклад в аффинность связывания Рс к РсуК. Поскольку в зависимости от изотипа меняются константные участки, каждый изотип обладает отличительным набором Ν-связанных углеводных структур, которые по-разному влияют на сборку, секрецию и функциональную активность белка (АпдйГ А. и Моткоп, 8.Б., Ттепбк Вю!есй. 15:26-32 (1997 г.)). Структура присоединенного Ν-связанного углевода существенно меняется в зависимости от степени обработки и может включать остатки разветвленных и 2-антенарных сложных олигосахаридов с высоким содержанием маннозы и сиаловой кислоты (Ν-ацетилнейраминовая кислота или ΝΑΝΑ), фукозы, галактозы и 01сNΑс (Ν-ацетилглюкозамин) в качестве конечных сахаров. Отмечали воздействие на эффекторные функции клетки-хозяина и содержание олигосахаридов в антителах (Ьйе1у, М.К., е! а1., 1995 г., 01усоЬю1оду 5: 813-822; 1еГГег1к, К., е! а1., 1998 г., 1ттипо1 Кеу. 163: 59-76; АпдйГ А. и Моткоп, 8.Б., кирга; Ргек!а Ь., 2003 г., Сигг Орш 8!тис! Вю1. 13(4): 519-25). Более того, как известно, в отношении сахарной цепи в антителе добавление или модификация фукозы в проксимальном Ν-ацетилглюкозамине на восстанавливающем конце Ν-гликозид-связанной сахарной цепи антитела значительно изменяет АОСС-активность антитела (^О00/61739).

Относительный вклад галактозилирования 2-антенарных олигосахаридов, присутствие расщепляющей 01с№ю и фукозилирование дополнительно указывают на то, что нефукозилированные Май проявляют большую способность активизировать АОСС, как показывают оценки ίη уйго и ίη утуо, чем другие модификации Ν-связанных 2-антенарных олигосахаридных структур (ЗЫеМк, е! а1., 2002 г., 1. Вю1 Сйет. 277: 26733-40; №уа, е! а1., 2004 г., Сапсег Кек. 64: 2127-2133).

Экспрессия или производство протеазоустойчивых тАЬ, составляющих предмет настоящего изобретения, с помощью клетки-хозяина, способной, рекомбинантной (например, нокаутом или подавлением конкретных ферментов Зйшкауа, е! а1., 2003 г., 1. Вю1. Сйет., 278: 3466-3473; ЕР1176195А1) или индуцированной, например, с помощью контроля внешних условий или питания таким образом, чтобы вырабатывать тАЬ с низким содержанием фукозы, входит в объем настоящего изобретения.

Антитела, Рс и Рс-слитые белки.

Антителосвязывающий домен или его фрагменты могут быть получены с помощью способов, известных специалистам в данной области, и в комбинации с информацией, приведенной в настоящем документе, могут включать последовательности или быть получены от любого млекопитающего, такого как без ограничений человек, мышь, кролик, крыса, примат, коза или любая их комбинация. Такие антитела могут обеспечивать основные структуры и компоненты связывающих доменов для использования при производстве конструкций антител, составляющих предмет настоящего изобретения. В одном аспекте настоящего изобретения антителосвязывающие домены получают из гибридом, приготовленных посредством иммунизации мыши или другого животного целевыми пептидами, клетками или экстрактами тканей. Антитела могут быть получены с использованием любых гибридомных методик, хорошо известных специалистам в данной области, см., например, работу Наг1о\у и Ьапе, апйЬоФек, а ЬаЬога!огу Мапиа1, СоИ 8ртт§ НагЬог, ΝΥ (1989 г.), содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки, или посредством выбора продуцирующего антитела лимфоцита и клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие домены, с использованием методик, известных специалистам в данной области.

Настоящее изобретение относится к константному участку человеческого 1д0. Следовательно, в объем настоящего изобретения входят любое антитело или слитый белок, содержащие человеческий Рсдомен, для которых необходимо, чтобы конечная композиция проявляла как протеолитическую устойчивость (как описано в настоящем изобретении), так и способность связывать РсдК и стимулировать АОСС, АОСР и/или СЭС в анализах ш уйто.

Целевой фрагмент, включающий без ограничений Ρν антитела или единичный вариабельный домен, может при необходимости сливаться с Рс-структурой. Ρν содержит димер домена вариабельного участка одной тяжелой и одной легкой цепи, жестко связанных нековалентной связью. В результате фолдинга данных двух доменов возникает шесть гипервариабельных петель (3 петли, каждая из Н-и Ьцепи), которые предоставляют аминокислотные остатки для связывания антигена и обеспечивают специфичность связывания антитела с антигеном. Однако даже единичный вариабельный домен (или половина Ρν, содержащая только три СОК, специфичных по отношению к антигену) обладают способностью распознавать и связывать антиген, хотя часто с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания. Одноцепочечные Ρν, которые также сокращаются как κΡν или κοΡν, представляют собой фрагменты антитела, которые содержат домены антитела УН и УЬ, связанные в единую полипептидную цепь. Полипептид ксйу, по существу, содержит полипептидный линкер между УН и УБ. Целевой фрагмент также

- 10 028658 может быть выбран из паратопа антитела (связывающие остатки без ограничений из СОК или структур вариабельного домена); фермента; гормона; рецептора; цитокина; поверхностного антигена иммунной клетки; и адгезивной молекулы, в которой конструкцию получают полностью рекомбинантными способами. Целевой фрагмент также может иметь небелковую природу, как, например, углевод, липид, липополисахарид, органическая молекула или металл или комплекс металла. По существу, если вводится целевая молекула, она будет связана с Рс посредством линкера, который может представлять собой полипептид или неполипептид.

Рс-содержащие белки или Рс-фрагменты, описанные в настоящем документе, могут быть получены несколькими способами, хорошо известными в данной области. Антителосвязывающие домены или слитые Рс-белки или их компоненты и домены также могут быть получены из библиотек таких доменов или компонентов, как, например, библиотеки фагов. Библиотеку фагов можно создать при помощи вставки библиотеки случайных олигонуклеотидов или библиотеки полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес последовательности, такие В-клетки иммунизированного животного или человека (διηίΐΐι. С.Р., 1985 г., §с1еисе 228: 1315-1317). Библиотеки фагов антител содержат пары вариабельных участков тяжелой (Н) и легкой (Б) цепей в одном фаге, что позволяет экспрессировать фрагменты Ρν с одной цепью или фрагменты РаЬ (НоодепЬоот, е! а1., 2000 г., 1ттипо1. Тобау 21(8) 371-8). Разнообразие фагемидной библиотеки можно адаптировать для повышения и/или изменения иммунологических специфичностей моноклональных антител библиотеки для получения и последующей идентификации дополнительных необходимых моноклональных антител человека. Например, кодирующие гены тяжелой (Н) и легкой (Б) цепей молекулы иммуноглобулина могут быть случайным образом перемешаны (перетасованы), чтобы при сборке молекулы иммуноглобулина образовать новые пары НБ. Кроме того, кодирующие гены одной или обеих из Н- и Б-цепей могут быть мутированы в участок, определяющий комплементарность (СОК), вариабельного участка иммуноглобулинового полипептида с последующим скринингом необходимой аффинности и способности к нейтрализации. Библиотеки антител или Рс могут также создаваться синтетически посредством выбора одной или более человеческих каркасных последовательностей и введения коллекций кластеров СОК, полученных из репертуаров человеческих антител или посредством целенаправленной вариации (КгеЬксЬтаг и νоη Кибеп, 2000 г., Сиггеп! Ор1шоп ίη Вю!есЬпо1оду, 13: 598-602). Положения, определяющие разнообразие, не ограничиваются СОК, но могут также включать каркасные сегменты вариабельных участков или могут включать вариабельные участки, не относящиеся к антителу, такие как пептиды. В одном аспекте фаговая библиотека, способная обеспечивать дисплей димерных структур Рс, связанных с белком оболочки фага р1Х, как описано в направленной заявителями одновременно рассматриваемой заявке на патент США (№ 61/261767), может использоваться для выбора новых Рс-содержащих структур в соответствии с настоящим изобретением. Библиотеки связывающих компонентов-мишеней, которые могут включать связывающие компоненты-мишени, отличные от вариабельных участков, относящихся к антителу, могут включать библиотеки рибосомного дисплея, библиотеки дрожжевого дисплея и библиотеки бактериального дисплея. Рибосомный дисплей представляет собой способ трансляции мРНК в соответствующие белки с сохранением белка прикрепленным к РНК. Кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты определяют методом ОТ-ПЦР (МаНЬеакй. Б.С. е! а1., 1994 г., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ст. ИЗА 91, 9022). Дрожжевой дисплей основан на конструировании слитых белков связанного с мембраной альфа-агглютининового рецептора связывания дрожжей, ада1 и ада2, части системы типа спаривания (Вгобег, е! а1., 1997 г., Ыа!иге Вю!есЬпо1оду, 15: 553-7). Бактериальный дисплей основан на слиянии мишени с экспортированными бактериальными белками, которые связываются с клеточной мембраной или стенкой клетки (С1еп и Оеогдюи, 2002 г., Вю!ес1по1 Вюепд, 79: 496-503).

Настоящее изобретение также представляет нуклеиновые кислоты, кодирующие композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, в виде выделенных полинуклеотидов или частей векторов экспрессии, включая векторы, совместимые с экспрессией в прокариотических, эукариотических или нитчатых фагах, выделением и/или дисплеем композиций или их направленных мутагенов.

Использование Рс-содержащих молекул.

Композиции (антитело, Рс-слияния, Рс-фрагменты), полученные с использованием любых описанных выше способов, можно применять для диагностики, лечения, выявления или модуляции болезней человека или конкретных патологий в клетках, тканях, органах, жидкостях или, по существу, хозяине. Как описано в настоящем документе, модификация части Рс антитела, Рс-слитого белка или Рсфрагмента для снижения или исключения протеолитического расщепления при сохранении измеримого связывания с Рс-гамма-рецептором или указанных эффекторных функций могут комбинироваться со связывающим доменом, таким как паратоп антитела или лигандсвязывающий домен, который сохраняет исходную специфичность к мишени и биологическую активность. Примеры связывающих доменов представляют собой паратоп антитела, один или более СОК антитела или один или более вариабельных доменов антитела; фермента; гормона; рецептора; внеклеточный домен мембранного рецептора; цитокина; поверхностного антигена иммунной клетки; и адгезионной молекулы. Полученные конструкции придают антителам и Рс-конструкциям великолепный спектр активности, биофизических свойств, стабильность и способность сохраняться в организме хозяина.

- 11 028658

Открытые заявителями последовательности Рс с уникальным комбинациями устойчивости к физиологически важным протеазам и способности или неспособности связываться с одним или более Рсгамма-рецепторами и/или способности осуществлять лизис клеток посредством активации эффекторных клеток или комплемента, обеспечивают возможность целенаправленно ориентировать связывающую молекулу для максимальной эффективности при конкретных показаниях. Например, способность выбирать в качестве мишеней аберрантную клетку-хозяина, такую как задействованная в неоплазии или других нежелательных процессах пролиферации, таких как неадекватный ангиогенез, неадекватный фиброз, в наибольшей степени будет подходить для молекулы, содержащей эукариотический протеазоустойчивый Рс, составляющий предмет настоящего изобретения, способный к АНСС и АНСР. В отличие от этого бактериальные клетки легко уничтожаются комплементопосредованными механизмами. Следовательно, бактериальные инфекции можно лечить подходящими Рс-конструкциями, составляющими предмет настоящего изобретения, которые устойчивы к бактериальным протеазам и обладают способностью вызывать СОС.

Заявители определили способы выбора Рс, обладающих соответствующей комбинацией свойств, и представили действующие примеры целенаправленно модифицированных специфических Рссодержащих молекул. Молекулы, устойчивые к эукариотическим протеазам и способные проявлять одну или более функций, связанных с АЭСС, АЭСР и СОС, включают домен Рс, содержащий последовательность человеческого Ι§01 в шарнирном участке и участке СН2, от приблизительно ЕЙ остатка 214 до приблизительно остатка 330, где, по меньшей мере, остатки 233-237 заменены РУА/(делеция 0236), и дополнительно содержащий одно или более замен в домене СН2, причем молекула способна проявлять одну или более функций, связанных с АЭСС, АЭСР и СОС, и включает конструкции 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16 и 17. В конкретном варианте осуществления такие молекулы включают замены, выбранные из 1332Е в комбинации с другими заменами, такими как 8239Ό/Ι332Ε (5, 14), 8239Э/Н268Р/1332Е (не проводили), Н268Р/8324Т/1332Е (8), 8239О/Н268Р/8324Т/1332Е (9), 8267Е/Н268Р/8324Т/1332Е (10),

0237Χ/8239Ό/Ι332Ε, где X представляет собой А или 8 (12); К326АЛ332Е/Е333А (15) и 8267Е/1332Е (17).

Молекулы, устойчивые к прокариотическим протеазам и способные проявлять СОС, включают данные молекулы, содержащие домен Рс, имеющий последовательность человеческого 1д01 в шарнирном участке и участке СН2, от приблизительно ЕЙ остатка 214 до приблизительно остатка 330, где, по меньшей мере, остатки 233-237 заменены РУА/(делеция 0236), и дополнительно содержащий одна или более замен в домене СН2, выбранных из К326А/Е333А (11), 8267Е/Н268Р/8324Т/1332Е (10), К326А/1332Е/Е333А (15), 8239О/К326А/Е333А (16) и 8267Е/1332Е (17).

Молекулы, устойчивые к эукариотическим протеазам, но не способствующие лизису клетокмишеней, могут также эффективно использоваться для лечения заболевания или состояний, при которых целью является не устранение клеток-мишеней, а их модуляция, как, например, за счет использования антитела или другой Рс-конструкции, как описано в настоящем документе, которая отличается протеазоустойчивостью, но демонстрирует низкий уровень АЭСС, АЭСР или СОС по сравнению с 1д01 дикого типа. Молекулы, содержащие неприродный домен Рс не дикого типа, которые являются протеазоустойчивыми, включают данные молекулы, содержащие домен Рс с последовательностью человеческого 1д01 в шарнирном участке и участке СН2 от приблизительно ЕЙ остатков 214 до приблизительно остатка 330, где, по меньшей мере, остатки 233-237 заменены РУА/(делеция 0236).

Таким образом, на основании представленных в настоящем документе концепций и примеров получаемые в настоящем изобретении Рс-содержащие конструкции, демонстрирующие повышенную устойчивость к протеазам, присутствующим в организме млекопитающих, и необязательно обладающие способностью выбирать в качестве мишени клетку и антиген на клетке, обеспечивают более эффективные терапевтические молекулы по сравнению с терапевтической молекулой, которая не является протеазоустойчивой.

Введение.

Поскольку протеолитические ферменты локализуются в соответствии со скоростью образования или накопления, например пепсин в пищеварительном тракте, или матриксные металлопротеиназы (ММР) в участках, где происходит перестройка ткани или рост злокачественных образований, композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, в частности, подходят для применений, когда известно, что та или иная область организма содержит протеазы или отличается аномально высоким содержанием протеаз.

Настоящее изобретение представляет стабильные составы композиции протеазоустойчивого 1д0, такие как антитела, которые предпочтительно представляют собой водный фосфатно-буферный раствор или смешанный солевой раствор, а также растворы и составы с консервантами, составы с консервантами для многоразового использования, пригодные в фармацевтических или ветеринарных целях, содержащие по меньшей мере одно протеазоустойчивое антитело в фармацевтически приемлемом составе. Подходящие несущие среды и их состав с возможностью введения других белков человека, например сывороточный альбумин человека, описаны, например, в работе Кеш1п§1ои: ТЬе 8шепсе апб Ргасбсе οί РЬагшасу, 21 изд., под ред. Тгоу, Ό.Β., ЫртсоЦ АПЬатя апб ΑίΙΚίηχ. РЫ1абе1рЫа, РА 2006 г., ч. 5, РЬагшасеиЬса1 Мап- 12 028658 иГасктпд. с. 691-1092, см. особенно с. 958-989.

Протеазоустойчивая композиция 1дС с эффекторными функциями в стабильном или содержащем консерванты составах, как описано в настоящем документе или известно специалистам в данной области, может вводиться пациенту в соответствии с настоящим изобретением с помощью ряда способов доставки, включая введение внутривенно (в/в); внутримышечно (в/м); подкожно (п/к); трансдермально; через легкие; трансмукозально; с использованием состава в имплантате, осмотическом насосе, картридже, микронасосе; или с использованием другим средств, хорошо известных специалисту в данной области.

Возможно направленное введение в ту или иную часть тела или полость, такое как внутрисуставное введение, внутрь бронха, внутрибрюшинное, внутрь капсулы, хряща, полости, интрацелиальное, внутрь мозжечка, желудочка мозга, внутрь толстой кишки, шейки, желудка, печени, миокарда, внутрь кости, таза, перикарда, полости живота, плевры, простаты, легких, внутрь прямой кишки, внутрь почки, сетчатки, позвоночника, интрасуставно, грудной клетки, внутрь матки, мочевого пузыря, внутриочагово, вагинально, ректально, буккально, под язык, интраназально или трансдермально.

Заболевания или патологии, которые могут поддаваться лечению с помощью композиции, приведенной в настоящем изобретении, включают без ограничений заболевания, при которых неблагоприятной является нежелательная пролиферация, активация или миграция клеток, такая как злокачественные образования, гиперактивные или несбалансированные иммунные ответы, образование фиброзной ткани или инфекция, поскольку композиции обеспечивают активацию цитотоксического или цитолитического механизмов иммунной системы хозяина посредством механизмов, регулируемых ЕсуК. Такие заболевания включают злокачественные образования: лейкемия, острая лейкемия, острый лимфобластный лейкоз (ЛЬЕ), ЛЬЬ В-клеток, Т-клеток или ЕЛВ, острая миелоидная лейкемия (ЛМЬ), хроническая миелоцитарная лейкемия (СМЬ), хроническая лимфоцитарная лейкемия (СЬЕ), лейкоз ворсистых клеток, миелодиспластический синдром (МИ8), лимфопролиферативное заболевание, кожная Т-клеточная лимфома, болезнь Ходжкина, болезнь Кастлемана, глиома, глиобластома, астрацитома, злокачественная лимфома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома, саркома Капоши, колоректальная карцинома, панкреатическая карцинома, гипернефроидный рак, рак молочной железы, протоковая карцинома, липома, рак носоглотки, рак простаты, рак яичек, рак яичников, ретинобластома, злокачественный гистиоцитоз, гиперкальциемия злокачественного образования, плазмацитомы, хондросаркомы, саркомы, трабекулярный рак, гепатоклеточная карцинома, гепатома, рак базальных клеток, аденокарциномы, плоскоклеточный рак, саркомы (такие как саркома Юинга, Капоши, детская мягких тканей, взрослая), меланомы, метастатические меланомы, гемангиома, метастатическое заболевание, остеосаркома, рабдомиосаркома, тимома и тимическая карцинома, связанная с раком резорбция кости, рак тела матки, вагинальный рак, рак матки, опухоли Вильмса, связанная с раком боль в костях и т.п.

Целевые молекулы, способные связывать антигены на злокачественных лимфоцитах, включают антигены В-клеток, такие как СИ19, СЭ20 и СЭ22. Солидные опухоли, формирующиеся на эпидермальной ткани, часто демонстрируют и стимулируются связыванием лигандов с рецепторами эпидермального фактора роста, известными как ЕгЬВ1, ЕгЬВ2, ЕгЬВЗ и другими рецепторами, способными передавать сигнал или вызывать пролиферативный ответ или антиапоптозный ответ, приводящие к неконтролируемому росту опухоли. Другие распространенные антигены на солидных опухолях представляют собой тканевой фактор или ΚΟΝ.

При комбинации с соответствующим связывающим доменом с мишенью композиции также применяются для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых бактериальными (такими как 81гер1ососсик, 81арйу1ососсик и Е. сой.), вирусными (такими как грипп, СПИД, РСВ, ТОРС и вирус лихорадки Западного Нила), грибковыми (такими как аспергиллез, кокцидиоидомикоз, криптококкоз или кандидоз) или протозойными инфекциями (такими как трипаносомоз, токсоплазмоз, лямблия или малярия).

Композиции применяются для лечения общих иммунологических и аутоиммунных нарушений, включая без ограничений ревматические заболевания, псориаз и склеродерму.

Композиции применяются для лечения заболеваний, связанных с неадекватным ангиогенезом. Ангиогенез представляет собой процесс формирования новых капиллярных кровеносных сосудов, и он является следствием активированной пролиферации клеток эндотелия. Неоваскуляризация жестко регулируется и происходит только во время эмбрионального развития, перестройки ткани, заживления ран и периодического цикла развития желтого тела (Ео1ктап и Со1гаи, Ке1а1юп оГ уакси1аг ргоИГегайои 1о 1итог дго\\1к Ιηΐ. Кеу. Ехр. Ра1йо1., 16, 207-248 (1976 г.)). Пролиферация клеток эндотелия обычно происходит гораздо медленнее, чем у других видов клеток организма. Однако если скорость пролиферации данных клеток выходит из-под контроля, результатом может стать патологический ангиогенез. Патологический ангиогенез проявляется во многих заболеваниях. Например, сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как ангиома, ангиофиброма, сосудистая деформация, атеросклероз, синехия и эдемический склероз; а также офтальмологических заболеваниях, таких как неоваскуляризация после имплантации роговицы, неоваскулярная глаукома, диабетическая ретинопатия, ангиогенное заболевание роговицы, дегенерация желтого пятна, птеригиум, дегенерация сетчатки, ретролентальная фиброплазия и гранулярный конъюнктивит, связаны с ангиогенезом. Хронические воспалительные заболевания, такие как артрит; дерма- 1З 028658 тологические заболевания, такие как псориаз, телеангиэктазия, пиогенная гранулема, себорейный дерматит, варикозные язвы, угревая сыпь, розовые угри (розацеа или эритематоз), папилломы (бородавки), экзема, гемангиомы, лимфангиогенез, также зависят от ангиогенеза.

Диабетическая ретинопатия может иметь две формы, непролиферативную или пролиферативную. Пролиферативная ретинопатия характеризуется аномальным образованием новых сосудов (неоваскуляризация), которые растут на поверхности стекловидного тела или проходят внутрь полости стекловидного тела. Дегенерация желтого пятна также может иметь две формы, сухую и влажную. При экссудативной дегенерации желтого пятна (влажная форма), которая встречается гораздо реже, отмечается образование субретинальной сети хороидальной неоваскуляризации, часто связанной с интраретинальным кровотечением, субретинальной жидкости, эпителиальное отслоение пигмента и гиперпигментация. Неоваскулярная глаукома встречается у пациентов, страдающих диабетом или окклюзией центральной ретинальной вены, или при связанных с увеитом воспалительных выделениях, которые выдавливают радужную оболочку в верхний угол (гл. 99, ТНе Мегск Мапиа1, 17 изд., 1999 г.).

Ревматоидный артрит, воспалительное заболевание, также приводит к неадекватному ангиогенезу. Рост васкулярных клеток эндотелия в синовиальной полости активируется воспалительными цитокинами и приводит к повреждению хряща и замене на паннус в суставе (КосЬ А.К., РоКепш Р.1. и ЬеФоуюЬ δ.Ρ, АйЬ; 15 КЬеишт, 29, 471-479 (1986 г.); §1ираск Ό.Ο., 81отдатб С.М. и СЬегезЬ Ό.Α., Βπ-ιζ. 1. Меб. ΒίοΙ. Кез., 32, 578-581 (1999 г.); КосЬ А.К., АпНпИз КЬеит, 41, 951-962 (1998 г.)).

Композиции могут использоваться для лечения псориаза, который вызывается неконтролируемой пролиферацией клеток кожи. Быстрорастущие клетки нуждаются в достаточном притоке крови, и при псориазе индуцируется аномальный ангиогенез (Ро1ктап 1., 1. ПтуеЧ. Эегта1о1. 59, 40-48 (1972 г.)).

В процессах и явлениях, ведущих к ангиогенезу, задействован ряд факторов: молекулы клеточной адгезии, интегрины, фактор роста эндотелия сосудов (УБОР), Т№а1рЬа, ЬРОР и цитокины, включая 1Ь-6 и 1Ь-12. Например, было показано, что близкородственные, но различающиеся интегрины а1рЬаУЬе!а3 и аУЬ5 опосредуют различные пути ангиогенного процесса. Антитело, вырабатываемое против а1рЬаУЬе!а3, блокировало ангиогенез, индуцируемый основным фактором роста фибробластов (ЬРОР), тогда как антитело, специфичное к аУЬ5, ингибировало ангиогенез, индуцированный фактором роста эндотелия сосудов (УЕОР) (ЕНсет, е! а1., 1. С1ш. 1пуе8к103: 1227-1230 (1999 г.); Рпеб1апбег е! а1., 8с1епсе 270: 1500-1502 (1995 г.)). Следовательно, настоящее изобретение включает применение целевых связывающих доменов, ориентированных на данные мишени в композициях, составляющих предмет настоящего изобретения, для лечения заболеваний, при которых показано ингибирование ангиогенеза.

Заявители одновременно рассматриваемой опубликованной заявки на международный патент ^Θ2009023457Α1, которая включена в настоящую заявку путем ссылки, раскрывают стратегию восстановления эффекторной функции расщепленных 1§О с использованием моноклональных антител, специфичных к эпитопу, препятствующему расщеплению в сайте шарнира. Включение протеазоустойчивого и обладающего компетентной эффекторной функцией Рс в соответствии с настоящим изобретением с антишарнирным доменом для образования двухвалентного антитела позволит получить терапевтическое тАЬ, способное к восстановлению эффекторной функции Рс у расщепленных 1§О, обеспечивая при этом терапевтическую устойчивость к подавлению за счет протеолитического расщепления. Соответственно настоящее изобретение предусматривает включение протеазоустойчивого константного участка Рс, составляющего предмет настоящего изобретения, с противошарнирным вариабельным участком тАЬ, описанным выше.

Хотя настоящее изобретение описано выше в общих чертах, варианты осуществления настоящего изобретения будут дополнительно описаны в следующих примерах, которые никоим образом не ограничивают объем формулы изобретения.

Пример 1. Конструирование и тестирование мутантов Рс.

С использованием стандартной рекомбинантной технологии был получен набор конструкций (показанных на фиг. 2 и объединяющих шарнирный участок, представленный в табл. 1, с восстанавливающими активность мутациями в участке СН2, выбранными из табл. 2). Обозначение 2Ьс означает, что константный домен 1дО1, соответствующий по нумерации КаЬа! ЕЙ антитела (нумерация ЕЙ) от 214 до 236 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 3), был заменен соответствующей последовательностью 1§О2 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 4). Обозначение 2Ь означает, что остатки 1дО1 Е233-Р234-Ь235-О236 заменены соответствующими остатками 1дО2 Р233У234-А235 с делецией О235.

- 14 028658

Таблица 4

Конструк- ция	Обозначение/ конструкция	Каркас изотипа 1дС	Последова-	СР142	СР2 0
тельность 214-44	Еи
1	1дС1 мб	МдС1	5Е<2	Ю ΝΟ	1	X	X
2	1дС2 мб	МдС2	5Е<2	Ю ΝΟ	2	X	X
3	2 Ьс (все шарнирные остатки от 1дС2)	МдС1	5Е<2	Ю ΝΟ	6	X
4	2Ь	МдС1	5Е<2	Ю ΝΟ	7	X	X
5	2Ь 5239Ρ/Ι332Ε	МдС1	5Е<2	Ю ΝΟ	8	X	X
6	2Ь Ε333Α/Κ334Α	МдС1	5Е<2	Ю ΝΟ	9	X
7	2Ь Е243Ь/Р292Р/У300Ь	МдС1	5Е<2 10	Ю	ΝΟ:	X	X
8	2Ь Η268Ε/5324Τ/Ι332Ε	МдС1	5Е<2 11	Ю	ΝΟ:	X	X
9	2Ь 5239Ρ/Η268Ε/5324Τ/Ι 332Е	МдС1	5Е<2 12	Ю	ΝΟ:	X	X
10	2Ь 5267Ε/Η268Ε/5324Τ/Ι 332Е	МдС1	5Е<2 13	Ю	ΝΟ:	X	X
11	2Ь Κ326Α/Ε333Α	МдС1	5Е<2 14	Ю	ΝΟ:	X	X
12	2Ь С237Х/5239Р/1332Е, где X представляет собой Α, ϋ, Р, 0 или 5	МдС1	5Е<2 15	Ю	ΝΟ:	X
13	2Ьс 5239Ώ/Ι332Ε	МдС1	5Е<2 16	Ю	ΝΟ:	X
14	1дС2 5239Ρ/Ι332Ε	МдС2	5Е<2 17	Ю	ΝΟ:	X

Вариабельные участки одного набора конструкций антител связываются с СО142 (тканевой фактор), что позволяет тестировать Рс-зависимое уничтожение клеток антителам в клеточных анализах с использованием МОА-МВ-231 (АТСС, НТВ-26™), экспрессирующего тканевой фактор (Βιό/Αι е! а1., Ргос \аб Асаб 8с1 и8А 106:17864-17869, 2009 г.). Была подготовлена дополнительная панель с вариабельными участками, которые связываются с СЕ)20, что позволяло тестировать активность СЭС с помощью клеток \\'П,2-8, демонстрирующих СЭ20 (АТСС, СКЬ-8885) (ВгегзИ е! а1., Ргос Ж11 Асаб 8с1 и8А 106:17864-17869, 2009 г.). Все антитела промежуточно экспрессировали в клетках 293Т с помощью стандартных способов и процедур клонирования. Перед началом экспериментального анализа тАЬ очищали на колонках белка А до чистоты более 95%.

Протеазное расщепление конструкций тАЬ дикого типа.

Протеазное расщепление очищенных 1дС проводили при рН 7,5 в физиологическом растворе с фосфатно-буферным раствором (ФСБ) или в случае ММР (ММР-3, ММР-7, ММР-12 и ММР-13 получены от Еп/о РП’е 8с1епсе§) в физиологическом растворе с трис-буфером при 37°С. 1бе8 получали от Сепоνΐδ, а С1иУ8 получали от Р1егсе. СаС1₂ включали в реакции ММР в концентрации 5 мМ для всех тестированных ММР. Концентрации антитела составляли 0,5 мг/мл, и реакции инициировали добавлением фермента к 1дС в соотношении приблизительно 1-2% (в./в.), если не указано другое. Расщепление 1дС оценивали посредством анализа электрофорограмм после микрокапиллярного электрофореза Аубеп! Вгоч/тц (Аубеп! ТесЬпо1оу1е§). Все реакции расщепления проводили в двух повторностях.

Анализы конкурентного связывания А1рба8сгееп®.

Исследования конкурентного связывания проводили с половиной объема лунки в 96-луночных непрозрачных планшетах (Сопипу) в аналитическом буферном растворе (ФСБ, 0,05% В8А, 0,01% Т\уееп20) при рН 7,4. Все конкурентные исследования проводили для биотинилированного 1дС1 (1 1дС: 2 биотин с использованием ΕΖ Ьтк™ N 18-РС-биотина, Р1егсе) при фиксированной концентрации и конкурирующих конструкциях дикого типа и протеазоустойчивых конструкциях при последовательных 3кратных разбавлениях. Концентрации РсуК составляли 0,2 мкг/мл в конечной концентрации в анализах.

- 15 028658

Биотинилированный Ι§01 (конечная концентрация 0,2 мкг/мл) и антитела дикого типа и протеазоустойчивые (10 мкл) последовательно добавляли к каждому ряду 96-луночного планшета в двух повторностях. Затем добавляли заданные РсуК с последующим добавлением по 10 мкл разведенных 1/50 гранул акцептора хелата никеля (Νί) и гранул донора стрептавидина (ЗА). Непрозрачный планшет покрывали алюминиевой фольгой, чтобы исключить попадание света во время встряхивания на шейкере ОгЬйа1 в течение 30 мин. Затем фольгу снимали и регистрировали флуоресценцию на считывателе планшетов ΕΝνΙ3ΙΟΝ™ (Регк1пЕ1тег), снабженном соответствующим набором фильтров А1ркаЗсгееи® для спектров возбуждения/поглощения. Полученные данные обрабатывали программой СгарЬРаб ΡΚΙδΜ™ и нормализовали по максимальному сигналу, а также строили кривые конкуренции с помощью программы нелинейной регрессии для подгонки кривых.

Результаты.

Первоначальный интерес был связан с попытками определить чувствительность конструкций тАЬ к ряду физиологически важных протеаз, для которых ранее было показано расщепление Ι§01 в нижнем шарнирном участке; ММР-3, ММР-7, ММР-12, ММР-13, 01иУ8 и ИеЗ. Конструкции 1-5, 7, 9-11, 12 (С237А), 13-14 тестировали как СЭ142-связывающие антитела. В течение 24 ч протеазы демонстрировали различную степень расщепления Ι§01. Тогда как ММР-3, ММР-12, ИеЗ разрушали весь интактный 1дС1 (конструкция 1) в течение 24 ч, ММР-7 расщепляла приблизительно 30%, ММР-13 - приблизительно 40%, а 01иУ8 - приблизительно 60%. Конструкция 4 (2Н) и данные конструкции с 21ι модификацией нижнего шарнира в более-менее одинаковой степени проявляли устойчивость в отношении всех ММР. Конструкция 4 была устойчивой к 01ιιν8, но не к ИеЗ. Конструкция 2 была также более устойчивой к расщеплению 0й.А8.

Было показано, что ИеЗ расщепляет все изотипы человеческого 1дС (νοη РатеККаттшдеи е1 а1., ЕМВО 21:1607-1615, 2002 г.). Данные исследования зависимости от времени (фиг. 3А) показывают, что ИеЗ быстро трансформировала 1дС1 (1) и 1дС2 (2) во фрагмент Р(аЬ')₂ (в течение 5 мин инкубирования), тогда как проба 1дС1 21ι (4) в течение 120 мин образовывала интермедиат с единичным разрывом. Из всех тестированных конструкций 21ι 3239Ό/Ι332Ε (5) была наиболее протеазоустойчивой к ИеЗ (фиг. 3В), причем интактный 1§С обнаруживался даже после 24 ч инкубации (в других конструкциях антител интактный 1§С не обнаруживался уже через 5 мин). Мутация 3239Ό в (5), которая находится рядом с местом расщепления ИеЗ между 0236 и 0237, может способствовать дополнительной протеазоустойчивости по сравнению с 1д01 21ι (4).

Панель из 12 анти-СО142 конструкций антител (1-5, 7, 9-13 и 14) вместе с ее аналогами 1д01 и 1д02 дикого типа тестировали на предмет чувствительности к протеолизу ИеЗ, 01υν8, ММР-3 и ММР-12. Данные для интактного 1д0, остающегося спустя 24 ч после инкубации, рассчитывали на основе электрофорограмм и приведены на фиг. 4Λ-Ό.

Данные показали, что 1д01 ^1 (1), 1д02 ^1 (2), 2Ьс (3), 1д01 21ι (4), 2Ьс 3239Ό/Ι332Ε (13), 1д02 3239Ό/Ι332Ε (14) и 21ι К326А/Е333А (11) были подвержены протеолизу ИеЗ после 24 ч инкубации. В отличие от этого конструкции 2Н 8239Ό/Ι332Ε (5), 2Н 0237Λ/З239^/I332Ε (12), 2Н Р243Е/К292Р/У300Е (7), 2Н 3239Ό/Η268Ρ/3324Τ/Ι332Ε (9) и 2Н 3267Ε/Η268Ρ/3324Τ/Ι332Ε (10) были устойчивы к протеолизу с помощью ИеЗ. Неожиданно было обнаружено, что конструкции с большим числом замен шарнирного участка Ιβ02 (содержащие 8Ε0 ΙΌ ΝΟ:4) не были устойчивы к протеолизу ИеЗ. Конструкция Ιβ02 8239Ό/Ι332Ε содержала менее 40% интактного Ι§0 после 24 ч расщепления в присутствии ИеЗ.

Расщепление протеазой 0Ην8 из З1арй аигеик показало, что конструкции Ι§02 3239Ό/Ι332Ε (14), 21ι 3239Ό/Ι332Ε (5), 21ι 0237Λ/З239^/I332Ε (12) и 2Н Р243Е/К292Р/У300Е (7) обеспечивали сохранение интактного Ι§0, остающегося через 24 ч после расщепления, в диапазоне 40-60%, аналогично уровню расщепления, наблюдавшемуся для Ι§01 \\1 (1). Конструкции Ι§02 \\1 (2), 2Нс (3), 2Нс 3239Ό/Ι332Ε (14), Ι§01 2Ь (4), Ι§01 2Ь К326Λ/Ε333А (11), 2Н 3239Ό/Η268Ρ/3324Τ/Ι332Ε (9) и 2Н 3267Ε/Η268Ρ/3324Τ/Ι332Ε (10) продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу в присутствии 0Πν8 (во всех случаях оставалось более 75% интактного Ι§0) по сравнению с Ι§01 \\1.

ММР-3 и ММР-12 представляют собой два типа связанных с раком протеаз. Менее 5% интактного Ιβ01 \\1 было зарегистрировано после расщепления ММР-3 и ММР-12. В отличие от этого человеческий Ιβ02 \\1 и все тестированные конструкции проявляли повышенную протеазоустойчивость в отношении как ММР-3, так и ММР-12, что подтверждалось более чем 60% интактного Ι§0, остающегося после 24 ч расщепления.

Результаты связывания Рсу-рецептора.

Оценивали способность некоторых Рс-конструкций конкурировать за связывание с рецепторами Рсу-семейства с Ιβ01 \\1. Способность конструкций снижать максимальный сигнал биотинилированного Ι§01 показана на фиг. 5А-0.

Первоначальный скрининг включал конструкции 1-2, 4-6. В исходной группе тестированных конструкций Ι§02 (2), Ι§01 21ι (4) и 21ι Ε333Λ/К334А (6) не демонстрировали обнаружимое связывание к высокоаффинным РсуК1, тогда как дикий тип Ιβ01 демонстрировал устойчивое связывание. 21ι 3239Ό/Ι332Ε (5) демонстрировал обнаружимое, но пониженное связывание с РсуЫ по сравнению с Ι§01. Для Ιβ01 21ι

- 16 028658 (4) и 21ι Е333А/К334А (6) не демонстрировалось обнаружимое связывание с РсуКПа, тогда как конструкция 21 8239Ό/Ι332Ε (5) демонстрировала сопоставимое связывание с Ι§01 \\1 (фиг. 5В). Три конструкции: 1дС2 (2), Ι§01 21 (4) и 21 Е333А/К334А (6) не демонстрировали обнаружимое связывание с РсуКПЬ, тогда как Ι§01 (1) и 21 8239Ό/Ι332Ε (5) демонстрировали сопоставимое связывание (фиг. 5Ό). Ι§02 (2), Ι§01 21 (4) и 21 Е333А/К334А (6) демонстрировали сопоставимое, но пониженное связывание с РсуКШа по сравнению с Ι§01. Конструкция 21ι 8239Ό/Ι332Ε (5) проявляла наибольший уровень связывания с РсуКШа, даже больше, чем Ι§01 те! (фиг. 5Р).

Кроме того, конструкция 21ι 8239Ό/Η268Γ/8324Τ/Ι332Ε (9) проявляла сопоставимое связывание с Ιβ01, тогда как конструкция 21ι 8267Ε/Η268Γ/8324Τ/Ι332Ε (10) отличалась повышенным связыванием с РсуКПа по сравнению с Ι§01 те! (фиг. 5С). Обе конструкции 21ι 8239Ό/Η268Γ/8324Τ/Ι332Ε (9) и 21ι 8267Ε/Η268Γ/8324Τ/Ι332Ε (10) проявляли повышенное связывание с РсуКПЬ по сравнению с Ι§01 те! (фиг. 5Е). Конструкция 21ι К326А/Е333А (11) демонстрировала минимальное обнаружимое связывание как с РсуКПа (фиг. 5С), так и с РсуКПЬ (фиг. 5Е).

Конструкция 21ι 8267Е/Н268Р/8324ТД332Е (10) демонстрировала несколько пониженное связывание с РсуКШа по сравнению с Ι§01 те!, тогда как конструкция 21ι 8239Ο/Η268Ε/8324Τ/Ι332Ε (9) демонстрировала повышенное связывание с РсуКШа (фиг. 50). 21ι К326А/Е333А (11) проявляла слабое связывание с РсуКШа по сравнению с Ιβ01 те! (фиг. 50).

Сводная информация.

Данные результаты показывают, что протеазоустойчивые конструкции, содержащие 21ι 8239Ό/Ι332Ε (5), 21 8239П/Н268Р/8324ТД332Е (9) и 21 8267Е/Н268Р/8324ТД332Е (10), были способны в различной степени связывать РсуКПа, ПЬ и Ша, и каждая из трех данных конструкций проявляет повышенное связывание по отношению к одной мутации 21ι (4). Мутация остатков в нижнем шарнире Ιβ01 в комбинации с другими мутациями СН2, которые усиливают аффинность связывания РсуКПа по сравнению с Ι§01 те!, как и для конструкции 21ι 8267Е/Н268Р/8324ТД332Е (10), повышенная аффинность 21ι 8239О/Н268Р/8324Т/Е332Е (9) и 21 8267Е/Н268Р/8324ТД332Е (10) к РсуКПЬ, повышенная аффинность связывания РсуКШа по сравнению с Ι§01 те!, как и для конструкций 21ι 8239Ό/Ι332Ε (5) и 21ι 8239П/Н268Р/8324ТД332Е (9) - были неожиданными результатами.

Пример 2. Антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЭСР).

Для тестирования способности протеазоустойчивых тАЬ опосредовать Рс-зависимое уничтожение клеток ίη уйго проводили анализы АЭСР. В данном анализе фагоцитарные клетки воздействуют на клетку-мишень, несущую антиген, посредством связывания антитела, и измеряется уничтожение клетокмишеней.

Процедура.

РВМС были выделены из образцов от здоровых человеческих доноров с помощью центрифугирования в градиенте Ртсо11. Моноциты СЭ14роз выделяли из РВМС методом отрицательной элиминации с помощью набора СЭ14 Пок-Нюи при котором не происходит элиминация моноцитов СЭ16роз (8!ет Се11 Тес1то1ощез). Моноциты высевали по 0,1х10⁶ клеток/см² в среде Х-У1УО-10 (Ьоща), содержащей 10% РВ8 и 20 нг/мл 0М-С8Р (К&Э 8уз!етз), и выдерживали в течение 7 суток. В последние 24 ч дифференцирования добавляли 100 нг/мл ГР^ (К&Э 8уз!етз). Клетки-мишени для анализа АЭСР представляли собой ОРР-экспрессирующие клетки МОА-МВ-231. Выделенные макрофаги инкубировали с ОРРэкспрессирующими МОА-МВ-231 в соотношении 4:1 в течение 4 ч в присутствии или в отсутствие конструкций тАЬ дикого типа и протеазоустойчивых конструкций в 96-луночном планшете с И-образным дном лунок. После инкубирования клетки удаляли из 96-луночных планшетов с использованием Асси!азе (81дта). Макрофаги идентифицировали анти-СЭ11Ь и анти-СЭ14 антителами (оба средства от ВО Вюзшепсез), связанными с А1ехаР1иог 647 ДпуНгодеп), после чего клетки отделяли на РАС8 СаЛЬиг (ВО Вюзшепсез). Данные анализировали с помощью программного обеспечения Р1о1о 8оПтеаге (Тгее 81аг). Процент фагоцитоза определяли по следующему уравнению: (клетки ОРРроз, СЭ11Ьроз, СЭ14роз)/(клетки ОРРроз, СЭ11Ьроз, СЭ14роз плюс только клетки ОРРроз) х 100%.

Выделенные моноциты дифференцировали ш уйго с использованием ОМ-С8Р и как описано в настоящем документе. Как было показано в других работах, дифференцированные макрофаги экспрессировали весь набор РсуК (РсуШ, РсуКПа, РсуКПЬ и РсуКШа) (данные не показаны).

Результаты.

Данные, представленные на фиг. 6А, показывают, что Ι§01 те! (1) и 21 8239Ό/Ι332Ε (5) обеспечивали достижение самых высоких уровней АЭСР. Способность к АЭСР для Ι§02 те! (2), Ι§01 21 (4) и 21 Е333А/К334А (6) была низкой, но обнаружимой. Эти результаты показывают, что протеазоустойчивая конструкция 21 8239Ό/Ι332Ε (5) была способна к фагоцитозу клеток опухоли на уровне, сопоставимом с Ιβ01 те!. В отдельном эксперименте дополнительную панель конструкций СН2, содержащих шарнирный участок Ιβ01 21, тестировали на способность к АЭСР (фиг. 6В). В данной группе конструкции 21 8239Ό/Ι332Ε (5), 21 Р243Р/К292Р/¥300Ь (7) и 21 8239П/Н268Р/8324ТД332Е (9) проявляли уровень АЭСР, аналогичный Ι§01 те! (1), тогда как конструкции 21 8267Е/Н268Р/8324ТД332Е (10), 21

- 17 028658

Н268Р/8324Т/1332Е (8) и 2Ь Ο237Λ/δ239Ό/Ι332Ε (12) демонстрировали несколько сниженный максимальный фагоцитоз по сравнению с 1дО1 и!. Конструкции 2Ь К326А/Е333А (11) проявляли низкий, но обнаружимый уровень АЭСР, аналогичный 1дО2 и! (2) и 1дО1 2Ь (4). Наконец, конструкции, содержащие полный шарнир 1дО2, также тестировали на АЭСР. Конструкция 1дО2 δ239Ό/Ι332Ε (14) проявляла уровень АЭСР, аналогичный 1дО1 и!, тогда как конструкции 2Ьс (3) и 2Ьс δ239Ό/Ι332Ε (13) проявляли низкий, но обнаружимый уровень АЭСР.

Пример 3. Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС).

В этом анализе мононуклеарные клетки воздействуют на клетку-мишень, несущую антиген, и измеряется устранение клеток-мишеней.

Процедура.

Анализы АЭСС проводили, как описано в предшествующей работе (Ьса11оп е! а1., Мо1. 1ттипо1 44: 1524-1534, 2007 г.). Иными словами, РВМС выделяли из человеческой крови с использованием градиента Рюо11 и использовали в качестве эффекторных клеток для анализа АЭСС. Клетки карциномы молочной железы человека МОА-МВ-231 (АТСС НТВ-26) использовали в качестве клеток-мишеней в соотношении 1 клетка-мишень к 50 эффекторным клеткам. Клетки-мишени предварительно метили ВАТОА (Регк1пЕ1тег) в течение 20 мин при 37°С, дважды промывали и повторно растворяли в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, 10% термоинактивированной РВδ, 2 мМ Ь-глутамина (все производства 1пу1!годеп). Клетки-мишени (1х 10⁴ клеток) и эффекторные клетки (0,5х10⁶ клеток) объединяли и добавляли 100 мкл клеток к лункам 96-луночного планшета с И-образным дном. Добавляли дополнительные 100 мкл в присутствии или в отсутствие конструкций тАЬ дикого типа и протеазоустойчивых конструкций. Все пробы были представлены в двух повторностях. Планшеты центрифугировали при 200 д в течение 3 мин, инкубировали при 37°С в течение 2 ч, а затем вновь центрифугировали при 200 д в течение 3 мин. Отбирали по 20 мкл супернатанта из каждой лунки и измеряли лизис клеток посредством добавления 200 мкл реагента ОЕЬРША на основе европия (РегкшЕ1тег). Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью Епуыоп 2101 МиШ1аЬе1 Кеайег (Регк1пЕ1тег). Данные нормализовали по максимальной цитотоксичности с 0,67% ТгПоп Х-100 (δίβΐηη А1йпсЬ) и минимальному контролю, которые определяли по высвобождению ВАТОА из клеток-мишеней в отсутствие любого антитела. Данные аппроксимировали сигмоидной моделью эффекта дозы с помощью ОгарЬРай Рпкт. версия 5.

Результаты.

Данные отображались на графике таким образом, чтобы уровень лизиса клеток был представлен на оси Υ как функция концентрации антитела. Данные, представленные на фиг. 7А, показывают, что конструкция 2Ь δ239^/I332Ε (5) демонстрировала самый высокий уровень АЭСС, что соответствовало приблизительно восьмикратному (как свидетельствует сдвиг в наблюдаемой ЕС₅₀) улучшению по сравнению с 1дО1 и! в представленном анализе.

В другом эксперименте сопоставляли способность к АЭСС расширенной панели конструкций. На фиг. 7В представлены кривые, построенные на основе данных. Три конструкции (2Ь δ239^/I332Ε (5), 2Ь Р243Ь/К292Р^300Ь (7) и 2Ь δ239^/Н268Р/δ324Т/I332Ε (9)) проявляли повышенную способность к АЭСС по сравнению с 1дО1 и!. Конструкции 2Ь Ο237Λ/δ239^/I332Ε (12) и 2Ь Н268Р^324Т/1332Е (8) демонстрировали несколько повышенный уровень АЭСС по сравнению с 1дО1 и!, тогда как конструкции 2Ь К326А/Е333А (11) и 2Ь δ267Е/Н268Р/δ324Т/I332Ε (10) демонстрировали обнаружимый, но пониженный уровень АЭСС по сравнению с 1дО1 и!. На фиг. 7С представлены результаты АЭСС для панели конструкций, которые содержали полный шарнирный участок 1дО2. Конструкция 1дО2 δ239^/I332Ε (14) демонстрировала более низкий уровень ЕС₅₀ по сравнению с 1дО1 и!, но также и более низкий уровень максимального лизиса. Конструкции 2Ьс (3) и 2Ьс δ239^/I332Ε (13) демонстрировали обнаружимый уровень АЭСС выше 1дО2 и!, но ниже 1дО1 и!. В совокупности эти результаты показывают, что мутация важнейших остатков в нижнем шарнире для восстановления АЭСС и РсуК-связывания может компенсироваться рядом мутаций СН2. Однако не все проанализированные мутации СН2 в главной цепи 1дО1 2Ь (3) были способны восстановить/повысить уровень АЭСС по сравнению с 1дО1 и!.

Эти результаты согласуются с анализом связывания РсуКШа (фиг. 5Р-О), демонстрирующим повышенную аффинность 2Ь δ239^/I332Ε (5) и 2Ь δ239^/Н268Р/δ324Т/I332Ε (9), поскольку экспрессирующие РсуКШа ΝΚ-клетки считаются компетентными эффекторными клетками в АЭСС.

Пример 4. Комплементозависимая цитотоксичность (СОС).

В данном анализе компоненты комплемента воздействуют на клетки-мишени, несущие антиген, и оценивается разрушение клеток-мишеней.

Процедура.

Анализы СОС проводили, как описано в предшествующей работе (Вге/кк| е! а1. 1 1ттипо1. 181(5): 3183-3192, 2008 г.). Клетки \νΐ42-δ использовали в качестве клеток-мишеней при анализах СОС. 50 мкл клеток добавляли в 96-луночные планшеты до конечной концентрации 8х10⁴ клеток на лунку в КРМ1, 5% термоинактивированной РВδ, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия (все производства 1пуйгодеп). Дополнительные 50 мкл добавляли в лунки в присутствии или в отсутствие антител, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. В лунки добавляли 50 мкл 10% ком- 18 028658 племента кролика (1пуПгодеп) и планшеты инкубировали в течение 20 мин при 37°С. Все пробы были представлены в двух повторностях. Планшеты центрифугировали при 200д в течение 3 мин и переносили 50 мкл супернатанта в отдельные планшеты, после чего измеряли СОС с помощью набора измерения цитотоксичности БПН (КосЬе). Поглощение измеряли на 8рес1га тах Р1и8 384 (Регк1пЕ1тег). Данные нормализовали по максимальной цитотоксичности с ТгЪоп Х-100 (81дта АИпсЬ) и минимальному контролю, содержащему только клетки и один лишь комплемент. Данные аппроксимировали сигмоидной моделью эффекта дозы с использованием ОгарЬРаД РгЕт. версия 5.

Результаты.

Данные, представленные на фиг. 8, показывают, что конструкции 2Ь 8267Е/Н268Р/8324Т/1332Е (10) и 2Ь К326А/Е333А (11) обеспечивали уровни лизиса клеток, аналогичные 1дС1 \\1. Конструкции 1дС1 2Ь (4), 2Ь 8239Ό/Ι332Ε (5), 2Ь Р243Ь/К292Р/¥300Ь (7) и 2Ь 8239Ό/Η268Ρ/8324Τ/Ι332Ε (9) обладали минимальной способностью к СОС, что было аналогично измерениям для 1дС2 \\1 (2).

Пример 5. Дополнительные протеазоустойчивые конструкции.

Только две мутации СН2 в комбинации с Е233Р/Б234У/Б235А с делецией С236 демонстрировали СОС активность, сопоставимую с 1дС1 а именно 2Ь К326А/К334А (11) и 2Ь

8267Е/Н268Р/8324Т/1332Е (10). Однако 2Ь К326А/К334А (11) проявляла минимальную активность по АЭСС и АЭСР, а 2Ь 8267Е/Н268Р/8324Т/1332Е (10) демонстрировала пониженную активность по АЭСС по сравнению с 1дС1 \\1. Важное значение имела бы возможность создавать протеазоустойчивые конструкции, которые бы проявляли все три вида активности (АПСС, АЭСР и СОС). Для одних только мутаций Н268Р/8324Т ранее было продемонстрировано отсутствие увеличения аффинности к РсуКк (Мооге е1 а1.), тогда как конструкция 2Ь Н268Р/8324Т/1332Е проявляла повышенную активность по АЭСС по сравнению с 2Ь. Следовательно, мутация 1332Е отдельно может восстановить активность по АЭСС у шарнирной протеазоустойчивой конструкции 2Ь. Следовательно, будут созданы конструкции, которые сочетают восстановление активности как по АОСС/АОСР, так и по СОС для материнской шарнирной конструкции 2Ь, включая 2Ь К326А/1332Е/Е333А (15) (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18), 8239О/К326А/Е333А (8ЕО ГО ΝΟ: 19) (16) и 8267Е/1332Е (17) (8ЕО ГО ΝΟ: 20).

Три конструкции тестировали с использованием материалов и способов, описанных в примере 1. Три конструкции проявляли устойчивость в отношении ММР-3 и ММР-12 по сравнению с 1дС1 \\1. Как было показано ранее, 1дС2 \\1 (2) был устойчив к О1иУ8, тогда как в случае 1дС1 \\1 (1) через 24 ч после расщепления оставалось менее 60% интактного 1дС. Три конструкции проявляли повышенную устойчивость к О1иУ8 по сравнению с 1дС1 \\1. Однако конструкции 2Ь К326А/1332Е/Е333А (15) и 2Ь 8267Е/1332Е (17) отличались пониженной устойчивостью к С1иУ8 по сравнению с 1дС2 \\1, тогда как 2Ь 8239Э/К326А/Е333А (16) проявляла устойчивость, сопоставимую с 1дС2 \\1. Полученные данные свидетельствуют о том, что мутации, которые вводят дополнительный О1и в СН2 в комбинации с мутацией нижнего шарнирного участка, формируют новый сайт расщепления для О1иУ8 (например, 2Ь 8239О/1332Е (5), 2Ь К326А/1332Е/Е333А (15) и 2Ь 8267Е/1332Е (17)), тогда как мутации, которые не вводят О1и в СН2, демонстрируют устойчивость к О1иУ8, аналогичную 1дС2 \\1 (например, 2Ь К326А/Е333А (11) и 2Ь 8239О/К326А/Е333А (16)).

Как 1дС1 \\1, так и 1дС2 \\1 были подвержены протеолизу под воздействием Ие8. В случае двух конструкций 2Ь К326А/1332Е/Е333А (15) и 2Ь 8267ЕЛ332Е (17) оставалось более 90% интактного 1дС после 24 ч инкубации в Ие8, тогда как в случае конструкции 2Ь 8239П/К326А/Е333А (16) оставалось менее 20% интактного 1дС. Данные результаты показывают, что добавление О1и в СН2 в комбинации с мутацией в нижнем шарнире увеличивает протеазоустойчивость к Ие8 - свойство, которое не способна обеспечить одна мутация нижнего шарнира, 2Ь (4).

Три конструкции тестировали на способность проявлять активность по АЭСР, АЭСС и СОС. Три конструкции отличались повышенной активностью по АЭСР по сравнению с 1дС2 \\1 и 2Ь (4), но пониженным максимумом по АЭСР по сравнению с 1дС1 \\1. Две конструкции 2Ь К326А/1332Е/Е333А (15) и 2Ь 8239Э/К326А/Е333А (16) отличались несколько повышенной активностью по АЭСС по сравнению с 1дС1 \\1. Конструкция 2Ь 8267Е/1332Е (17) отличалась пониженной активностью АЭСС по сравнению с 1дС1 \\1, но повышенным уровнем АЭСС по сравнению с 1дС2 \\1 и 2Ь (4). Все три конструкции демонстрировали повышенный уровень СОС по сравнению с 1дС2 \\1 и 2Ь (4); однако уровень СОС для всех трех конструкций был несколько ниже по сравнению с 1дС1 \\1.

Пример 6. Сводная информация по благоприятным мутациям.

Было показано, что следующие одиннадцать вариантов Рс обеспечивают композицию антитела, устойчивую к одной или более протеазам, способным расщеплять 1дС1 в нижнем шарнире, сохраняя при этом одну или более эффекторных функций, показанных диким типом человеческого 1дС1. Символом 2Ь обозначается 1дС1 с Е233Р/Р234У/Ь235А - делецией С236.

- 19 028658

Таблица 5

Конструкция	Сокращение (№)
1дС1	2Ь	3239Β/Ι332Ε	2Ь	ϋΕ (	5)
1д61	2Ь	Е243Б/Н292Р/У300Б	2Ь	БРБ (	7)
1д61	2Ь	Η268Ε/3324Τ/Ι332Ε	2Ь	ЕТЕ	(8)
1дС1	2Ь	3239Β/Η268Ε/3324Τ/Ι332Ε	2Ь	БЕТЕ	(9)
1дС1	2Ь	5267Ε/Η268Ε/5324Τ/Ι332Ε	2Ь	ЕЕТЕ	(Ю)
1дС1	2Ь	Κ326Α/Ε333Α	2Ь	АА (	11)
1д61	2Ь	6237Α/3239Β/Ι332Ε	2Ь	ХБЕ	(12)
1дС2	3239Β/Ι332Ε	1дС2 ВЕ	(14)
1дС1	2Ь	К326А/Ι332Ε/Ε333Α	2Ь	АЕА	(15)
1дС1	2Ь	3239В/К326А/ЕЗЗЗА	2Ь	ВАА	(16)
1дС1	2Ь	3267Ε/Ι332Ε	2Ь	ЕЕ (	17)

При достаточном объеме данных ниже представлены значения ЕС₅₀, которые используются в качестве приближения для оценки различных эффекторных функций и рассчитываются в тех случаях, когда при анализе ш υιΙιό уничтожение клеток было полным или практически полным. Данные, приведенные в табл. 6А и 6В, получены в идентичных условиях, однако источник донорских РВМС был разным. Следовательно, для стандартизации относительной биологической активности в каждом эксперименте использовали кратность изменения по сравнению с 1дО1 ^! (1).

Таблица 6А

Конст- рукция (№)	АВСС ЕС50 (нг/мл)	Крат- ность	АВСР ЕС50 (нг/мл)	Крат- ность	СБС ЕС50 (нг/мл)	Крат- ность
1д61 мБ (1)	4,8	1	27	1	96	1
2К ВЕ (5)	0,53	9	54	0,5	н/д	н/д
2К 6237А/ВЕ (13)	0,47	10	24	1,1	не опред.	не опред.

2Ь БРБ (7)	0,31	15	30	0, 9	н/д	н/д
2Ь АА (11)	21	0,2	н/д	н/д	157	0, 6
2Ь БЕТЕ (9)	0,70	7	34	0, 8	н/д	н/д
2Ь ЕЕТЕ (Ю)	н/д	н/д	44	0, 6	77	1,2

- 20 028658

Таблица 6В

Конструкция (№)	АОСС ЕС50 (нг/мл)	Крат- ность	АОСР ЕС50 (нг/мл)	Крат- ность	СОС ЕС50 (нг/мл)	Крат- ность
1дС1 аЕ	0, 42	1	186	1	114	1
2 0 АЕА (15)	0, 17	2,5	44*	4,2	202	0,56
2Н ΌΑΑ (16)	0, 14	3,4	42*	4,4	308	0,37
20 ЕЕ (17)	5,6	0, 08	52*	3,6	592	0,19

н/д=нет данных (недостаточно данных на кривой связывания для определения ЕС₅₀), * достигнут субмаксимальный лизис; не опред.=не определено; кратность=ЕС50 1дО1 а1/ЕС50 конструкции.

Влияние на ЛЭСС и АСЭР дополнительной модификации в 0237 в нижнем шарнире в дополнение к 8239Ώ/Ι332Ε и 233РУА/236 анализировали с использованием конструкций, перечисленных ниже в табл. 7. Тестировали конструкцию О237А, и было установлено, что она обладает устойчивостью к ММР, ЫеЗ и О1иУ8. В анализах расщепления другие конструкции не оценивали. Приведенные данные показывают, что в положении 237 допустимо использовать А1а(А) и 8ег (8), но они не увеличивают цитолитическую активность Рс сверх той, которую проявляла материнская молекула, 2И ΏΕ (5).

Таблица 7

Конструкция	АОСС	АОСР
1дС1 20 ΌΕ	++++++	+ + + + +

1дС1 20 ΑϋΕ	++++++	+ + + +
1дС1 20 ϋϋΕ	+	+
1дС1 20 ΡϋΕ	+ +	+
1дС1 20 ζ)ΟΕ	+	+
1дС1 20 5РЕ	+ + + + +	+ +

В табл. 8 представлена сводная информация относительно комбинированной протеазоустойчивости (РК) к конкретным физиологически важным протеазам, а также результаты ΐη νίίτο для приблизительных анализов, указывающих на потенциальную эффекторную функцию (АЭСС, АЭСР и СЭС), где эти конструкции с комбинированной протеазоустойчивостью и одной или более демонстрируемыми эффекторными функциями представлены белым.

Таблица 8

Изотип/конструкция	РН ММР	РН 13е3	РН 61иУ8	АОСС	АОСР	СОС
1д61 мЕ (1)	-	-	+	+ + + + +	+ + + + +	+++++
1д62 мЕ (2)	+ + + + +	-	+ + + + +	-	+ +	-
1д61 2Ос (3)	+ + + + +	-	+ + + + +	+	+ +	не опред.
1д61 2Ос ϋΕ (13)	+ + + + +	-	+ + + + +	+	+ +	не опред.
1д61 20 (4)	+ + + + +	-	+ + + + +	+	+ +	-
1д61 20 ϋΕ (5)	+ + + + +	+ + + +	+ +	++++++	+ + + + +	-
1д61 20 ЬРЬ (7)	+ + + + +	+ + + +	+ +	++++++	+ + + + +	-
1д61 20 ЕТЕ (8)	+ + + + +	+ + + +	+ + + + +	++++++	+ + +	-
1д61 20 ΏΕΤΕ (9)	+ + + + +	+ + + + +	+ + + +	++++++	+ + + + +	-
1д61 20 ЕЕТЕ (10)	+ + + + +	+ + + +	+ + + +	+	+ + + +	+ + + + +
20 АА (11)	+ + + + +	-	+ + + + +	+ + +	+ +	+ + + + +
20 ΑΏΕ (12)	+ + + + +	+ + + +	+ +	++++++	+ + + +	не опред.
1д62 ϋΕ (14)	+ + + + +	+ + +	+ +	++++++	+ + + +	не опред.
20 АЕА (15)	+ + + +	+ + + + +	+ + +	++++++	+ + +	+ + + +
20 ΌΑΑ (16)	+ + + +	+	+ + + + +	+ + + + +	+ + +	+ + + +
20 ЕЕ (17)	+ + + +	+ + + + +	+ + +	+	+ + +	+ + + +

- 21 028658

Сводная информация о результатах.

Исследование конструкций Рс, представленных в настоящем документе, продемонстрировало, что замены остатков по ЕЙ 233-236 на ΡνΑ/ сайтов, где, как известно, протеазы расщепляют молекулу 1дО1, позволяет получить Рс, которые устойчивы к ММР-3, ММР-12 и О1иУ8; протеазам, которые расщепляют молекулу между остатками 232 и 234 (фиг. 1). В комбинации с данными заменами дополнительные модификации обеспечивали устойчивость к протеазе §1арЬу1ососси8 Ие8 независимо от того, проводилась ли модификация положений замененных остатков в предполагаемом сайте расщепления (ЕЙ 236-237) или в более дистальном положении.

Одна только замена остатков ЕЙ 233-236 на ΡνΑ/ (2Ь, конструкция 4) приводило к утрате цитолитических функций, что оценивали по анализу ίη νίΐΓΟ, описанному для АЭСС, АЭСР и СОС. Что касается комбинации модификаций 1дО1 Рс, которые, как утверждали ранее, усиливали одну или более эффекторных функций (табл. 2), замена нижнего шарнира ΡνΑ/ неожиданно восстанавливало один или более аспектов цитолитической активности ίη νίίτο. Таким образом, ни одна из конструкций не проявляла как протеазоустойчивость, так и заметную или повышенную активность в отношении всех трех эффекторных функций, которые оценивали по уничтожению клеток ίη νίίτο или анализам на лизис клеток для АЭСС, АЭСР и СОС.

1. Восемь конструкций обладали протеазоустойчивостью и повышенной или сопоставимой активностью по АЭСС по сравнению с 1дО1 \\1: 5, 7, 8, 9, 12, 14, 15 и 16. Шесть из данных конструкций содержали замену 1332Е, включая 1§О1 2Ь ЦЕ (5), 1§О1 2Ь РТЕ (8), 1§О1 2Ь ОРТЕ (9), 1§О1 2Ь АЭЕ (12), 1§О2 ЦЕ (14) и 1§О1 2Ь АЕА (15).

2. Три конструкции РК демонстрировали аналогичную активность по АОСР по сравнению с 1дО1 щ!, включая 1дО1 2Ь ЦЕ (5), 1дО1 2Ь ЕРЬ (7) и 1дО1 2Ь ЭРТЕ (9). Три конструкции проявляли несколько пониженную активность по АОСР по сравнению с 1дО1 щ!, включая 1дО1 2Ь РТЕ (8), 1дО1 2Ь ЕРТЕ (10), 1§О1 2Ь АОЕ (12) и 1§О2 ЦЕ (14).

3. Пять мутаций РК обеспечивали восстановление активности по СОС, 1дО1 2Ь АА (11), 1дО 2Ь ЕРТЕ (10), 2Ь АЕА (15), 2Ь ЭАА (16) и 2Ь ЕЕ (17). Кроме того, все пять мутаций отличались обнаружимой, но пониженной активностью по АЭСР по сравнению с 1дО1 щ!. Два варианта, 2Ь АЕА (15), 2Ь ЭАА (16), также демонстрировали повышенную активность по АЭСС по сравнению с 1дО1 щ! (1).

Две конструкции (8 и 9), содержащие мутации Н268Р/8324Т, не проявляли восстановленную активность по СЭС при наличии протеазоустойчивого шарнира. Мутация 8267Е (ЕРТЕ (10)) восстанавливала СЭС, но снижала связывание с РсуКШа (также указано в работе Μοοκ е! а1. тАЬз, 2010 г., 2(2): 181.) Мутация 8267Е повышала аффинность к РсуКПЬ.

- 22 028658

Список последовательностей <110> Дапззеп ВЬоТесЬ, 1пс.

ВгегзкЬ, КапйаП Догдап, ЕоЬегТ ЗЬгоЫ, »1111» <120> МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗОУСТОЙЧИВАЯ ГС-СОДЕРЖАЩАЯ МОЛЕКУЛА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ <130> СЕИ5304ИОРСТ <140> Подлежит уточнению <141> Приложение к документу <150> 61/426619 <151> 2010-12-23 <150> 61/540882 <151> 2011-09-29 <160> 20

<170> <210> <211> <212> <213> <400> Ьуз Уа1 1

РаЪеьМп, версия

3.5 Суз

Азр

Ьуз

ТЬг 10

Ηίβ

ТЬг

Суз

Рго

Рго 15

Суэ

1 234 РРТ Ното зар1епя 1 С1и Рго Ьуз 5

Зег

Рго А1а

Рго

С1и 20

Ьеи

Ьеи

С1у

С1у

Рго 25

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе 30

Рго

Рго

Ьуз Рго

Ьуз 35

Азр

ТЬг

Ьеи

МеТ

11е 40

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и 45

Уа1

ТЬг

Суз

νβΐ νβΐ 50

Уа1

Азр

νθι

Зег

Нгз 55

С1и

Азр

Рго

С1и

νβΐ 60

Ьуз

РЬе

Агп

Тгр

Туг Уа1 65

Азр

<31у

ναΐ

С1и 70

Уа1

ΗΪ5

Азп

А1а

Ьуз 75

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и 80

С1и С1п

Туг

Азп

Зег 85

ТЬг

Туг

Агд

УаЬ

Уа1 90

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1 95

Ьеи

Нгз С1п

Азр

Тгр 100

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и 105

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1 110

Зег

Азп

Ьуз А1а

Ьеи 115

Рго

А1а

Рго

11е

61и 120

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз 125

А1а

Ьуз

С1у

- 23 028658

С1п Рго Агд 130	С1и	Рго С1п	Уа1 135	Туг ТЬг Ьеи Рго	Рго Зег Агд Азр 140	С1и
Ьеи ТЬг Ьуз	Азп	С1п ’/а!	Зег	Ьеи ТЬг Суз Ьеи	Уа1 Ьуз Е1у РЬе	Туг
145		150		155		160
Рго Зег Азр	11е	А1а Уа1	С1и	Тгр С1и Зег Азп	С1у С1п Рго С1и	Азп
		165		170	175
Азп Туг Ьуз	ТЬг	ТЬг Рго	Рго	Уа1 Ьеи Азр Зег	Азр 61у Зег РЬе	РЬе
	180			185	190
Ьеи Туг Зег	Ьуз	Ьеи ТЬг	Уа1	Азр Ьуз Зег Агд	Тгр 61п С1п С1у	Азп
195				200	205
Уа1 РЬе Зег	Суз	Зег Уа1	МеЕ	Ηΐ3 С1и А1а Ьеи	Н13 Азп Н13 Туг	ТЬг
210			215		220
С1п Ьу5 Зег	Ьеи	Зег Ьеи	Зег	Рго С1у Ьуз
225		230
<210> 2
<211> 230
<212> РКТ
<213> Ното	зархепз

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПОЛОЖЕНИЯ <222> (5)..(5) <223> Начало шарнира, остаток ЕО 218 <220>

<221> ДОМЕН <222> (5)..(5) <400> 2

ТЬг Уа1 С1и Агд Ьуз Суз Суз Уа1 С1и Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго 15 10 15

Рго ’7а1 А1а С1у Рго Зег 7з1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 20 25 30

ТЬг Ьеи МеЕ Не Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз 7а 1 Уа1 Уа1 Азр 35 40 45

Уа1 Зег Нтз С1и Азр Рго С1и Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у 50 55 60

Уа1 С1и Уа1 Ηΐ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп

Зег ТЬг РНе Агд \7а1 Уа1 5ег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 1/а1 Ηΐ3 С1п Азр Тгр 85 90 95

Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго 100 105 110

А1а Рго Не 61и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз ТНг Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и 115 120 125

Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеЬ ТНг Ьуз Азп 130 135 140

С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уэ1 Ьуз 61у РНе Туг Рго Зег Азр 11е 145 150 155 160

Зег \7а1 С1и Тгр С1и Зег Азп 61у 61п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг 165 170 175

ТНг Рго Рго Меб Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз 180 185 190

Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз 195 200 205

Зег Уа1 Меб Нгз С1и А1а Ьеи НЬз Азп Ньз Туг ТНг 61п Ьуз Зег Ьеи 210 215 220

Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 225 230 <210> 3 <211> 23 <212> РРТ <213> Ното заргепз <400> 3

Ьуз ’7а1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у 20

<210>	4
<211>	19
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	4

- 25 028658

ТЬг УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз Суз УаЬ СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго 15 10 15

Рго УаЬ АЬа <210> 5 <211> 22 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Человеческая последовательность происхождения 1дС <400> 5

Ьуз УаЬ 61и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Ηΐ3 ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго УаЬ АЬа 20 <210> 6 <211> 230 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерная последовательность человеческого 1дС <400> 6

ТЬг УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз Суз УаЬ 1 5

СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго 10 15

Рго УаЬ АЬа СЬу Рго Зег УаЬ РЬе 20

Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 25 30

ТЬг Ьеи МеЬ ЬЬе 5ег Агд ТЬг Рго 35 40

СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр 45

УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ 50 55

Ьуз РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу 60

УаЬ СЬи УаЬ Εΐ3 Азп АЬа Ьуз ТЬг 65 70

Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп 75 80

Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ 85

Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи Ηίε СЬп Азр Тгр 90 95

Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз ЬОО

Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго 105 110

- 26 028658

А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и 115 120 125

Рго С1ь Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз Азп 130 135 140

С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не 145 150 155 160

А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг 165 ' 170 175

ТЬг Рго Рго \Га1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз 180 185 190

Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз 195 200 205

Зег Уа1 МеЬ Нгз О1и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи 210 215 220

Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 225 230 <210> 7 <211> 233 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 7

Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Нгз ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 20 25 30

Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеГ 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 35 40 45

Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нгз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг 50 55 60

Уа1 Азр С1у Уа1 01и Уа1 Нгз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и 65 70 75 80

С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нгз

- 27 028658

61п Азр

А1а Ьеи

Рго Агд 130

ТЬг Ьуз 145

Зег Азр

Туг Ьуз

Туг Зег

РЬе Зег 210

Ьуз Зег 225 <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

90 95

Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз 100 105 110

Рго А1а Рго Не 61и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу С1п 115 120 125

С1и Рго С1п 7а1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи 135 140

Азп 61л Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Ή1 Ьуз 61у РЬе Туг Рго 150 155 160

11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп 165 ПО 175

ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи 180 185 190

Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 61η 61п С1у Азп ’7э1 195 200 205

Суз Зег Уа1 Мер НЬз С1и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТЬг 61п 215 220

Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз 230

233

РКТ

Искусственная последовательность

Вариант последовательности константного участка человеческого 1д6

Ьу5 Уа1 61и Рго Ьуз Бег Суз Азр Ьуз ТЬг Нгз ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго 7а1 АЬа С1у Рго Авр 7а1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 20 25 30

Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мер Не Зег Агд ТЬг Рго 61и 7а 1 ТЬг Суз 7а 1 35 40 45

Уа1 1/а1 Азр УаЬ Зег Нгз С1и Азр Рго 61и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг 50 55 60

- 28 028658

Уа1 65	Азр СЬу УаЬ СЬи	УаЬ 70	НЬз	Азп А1а	Ьуз	ТЬг Ьуз 75	Рго	Агд	61и	СЬи 80
С1п	Туг Азп Зег ТЬг 85	Туг	Агд	УаЬ УаЬ	Зег 90	’7а1 Ьеи	ТНг	УаЬ	Ьеи 95	НЬз
С1п	Азр Тгр Ьеи Азп 100	СЬу	Ьуз	СЬи Туг 105	Ьуз	Суз Ьуз	УаЬ	Зег 110	Азп	Ьуэ
Д1а	Ьеи Рго АЬа Рго 115	СЬи	СЬи	Ьуз ТЬг 120	Не	Зег Ьуз	АЬа 125	Ьу5	СЬу	СЬп
Рго	Агд СЬи Рго С1п 130	Уа1	Туг 135	ТЬг Ьеи	Рго	Рго Зег 140	Агд	Азр	СЬи	Ьеи
ТЬг 145	Ьуз Азп СЬп УаЬ	Зег 150	Ьеи	ТЬг Суз	Ьеи	7а1 Ьуз 155	СЬу	РЬе	Туг	Рго 160
Зег	Азр Не АЬа УаЬ 165	СЬи	Тгр	СЬи Зег	Азп 170	СЬу СЬп	Рго	81и	Азп 175	Азп
Туг	Ьуз ТЬг ТЬг РГО 180	Рго	Уа1	Ьеи Азр 185	Зег	Азр СЬу	Зег	РЬе 190	РЬе	Ьеи
Туг	Зег Ьуз Ьеи ТЬг 195	УаЬ	Азр	Ьуз Зег 200	Агд	Тгр СЬп	СЬп 205	СЬу	Аэп	УаЬ
РЬе Зег Суз Зег УаЬ Мер НЬз СЬи АЬа Ьеи 210 215 Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз 225 230 <210> 9 <211> 233 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность	Н1з Азп 220	Нгз	Туг	ТЬг	СЬп

<220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 9

- 29 028658

40 45

УаЬ УаЬ Азр Уа1

Зег

Н15

СЬи 55

Азр

Рго С1и УаЬ

Ьуз 60

РЬе

Азп

Тгр

Туг

50

УаЬ

Азр

СЬу

УаЬ

СЬи

Уа1

НЬз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

СЬи

СЬи

65

70

75

80

СЬп

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

УаЬ

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Ьеи

Ньз

85

90

95

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

СЬи

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

УаЬ

Зег

Азп

Ьуз

100

105

110

АЬа

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

Не

АЬа

АЬа

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬу

СЬп

115

120

125

Рго

Агд

СЬи

Рго

СЬп

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

СЬи

Ьеи

130

135

140

ТЬг

Ьуз

Азп

СЬп

УаЬ

Еег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

УаЬ

Ьуз

СЬу

РЬе

Туг

Рго

145

150

155

160

Зег

Азр

Не

АЬа

Уа1

<31и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

СЬп

Рго

СЬи

Азп

Азп

165

170

175

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

гае

РЬе

Ьеи

180

185

190

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

СЬп

СЬп

СЬу

Азп

УаЬ

195

200

205

РЬе

Зег

Суз

Зег

УаЬ

НеИ

НЬз

СЬи

А1а

Ьеи

НЬз

Азп

НЬз

Туг

ТЬг

СЬп

210

215

220

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

СЬу

Ьуз

225

230

<210>

10

<211> :

233

<212>

РЕТ

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 10

Ьуз Уа1 СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Нгз ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

- 30 028658

Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а С1у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи Ьеи Рго Рго Ьуз 20 25 30

Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи Меб Не Зег Агд ТНг Рго С1и УаЬ ТНг Суз Уа1 35 40 45 ’1а1 УаЬ Азр Уа1 Зег Нгз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг 50 55 60

УаЬ Азр С1у УаЬ <31и 7а1 Н1з Азп АЬа Ьуз ТНг Ьуз Рго Рго С1и СЬи 65 70 75 80

С1п Туг Азп Зег ТНг Ьеи Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Нгз 85 90 95

01п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз νβ! Зег Азп Ьуз 100 105 110

А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е 51и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п 115 120 125

Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи 130 135 140

ТНг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз <31у РНе Туг Рго 145 150 155 160

Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп 165 170 175

Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи 180 185 190

Туг Зег Ьу5 Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 195 200 205

РНе Зег Суз Зег Уа1 Меб Нгз С1и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТНг С1п 210 215 220

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 225 230 <210> 11 <211> 233 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС

- З1 028658

- 32 028658 <211> 233 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 12

Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТНг Нтз ТНг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а <31у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз 20 25 30

Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеЕ 11е Зег Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 35 40 45

Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег РНе С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг 50 55 60

Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Нтз Азп А1а Ьуя ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и 65 70 75 80

С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Нтз 85 90 95

С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 ТНг Азп Ьуз 100 105 110

А1а Ьеи Рго А1а Рго С1и С1и Ьуз ТНг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз 61у С1п 115 120 125

Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи 130 135 140

ТНг Ьуз Азп С1п Уа1 Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго 145 150 155 160

Бег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Аэп Азп 165 170 175

Туг Ьуз ТЬг ТНг Рго Рго ’/а1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи 180 135 190

Туг Бег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п <31п 61у Азп Уа1 195 200 205

РЬе Бег Суз Бег Уа1 МеЕ Нтз С1и А1а Ьеи Нтз Азп Нтз Туг ТНг С1п 210 215 220

- 33 028658

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз 225 230 <210> 13 <211> 233 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1д6 <400> 13

Ьуз 7а1 Е1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго 7а1 А1а 61у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 20 25 30

Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Ме! 11е Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз УаЬ 35 40 45

Уа1 Уа1 Азр Уа1 61и РЬе 61и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг 50 55 60

7а1 Азр С1у 7а1 61и 7а1 Нгз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 61и 61и 65 70 75 80

С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Шз 85 90 95

С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуэ Уа1 ТЬг Азп Ьуэ 100 105 110

А1а Ьеи Рго АЬа Рго 61и С1и Ьуз ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у <31п 115 120 125

Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр 61и Ьеи 130 135 140

ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго 145 150 155 160

Зег Аэр 11е А1а Уа1 С1и Тгр Е1и Зег Аэп С1у 61п Рго С1и Азп Азп 165 170 175

Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи 180 185 190

Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п 61п С1у Азп Уа!

- 34 028658

195

200

205

РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС Шз С1и А1а Ьеи Шз Азп Ηΐ3 Туг ТЬг С1п 210 215 220

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 225 230 <210> 14 <211> 233 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 14

Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуэ ТЬг Ньз ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго 7а1 А1а С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 20 25 30

Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз ”а1 35 40 45

Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Ньз С1и Азр Рго С1и 7а1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг 50 55 60

Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Нгз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и 65 70 75 80

С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд 7а1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нгз 85 90 95

С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз \Га1 Зег Азп А1а 100 105 110

А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е А1а Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз 61у С1п 115 120 125

Рго Агд 61и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи 130 135 140

ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 01у РЬе Туг Рго 145 150 155 160

Зег Азр 11е А1а Уа1 61и Тгр 61и Зег Азп С1у (31п Рго С1и Азп Азп 165 170 175

- 35 028658

<220>

<221> МУТАГЕН <222> (23) . . (23) <223> X может быть А1а, Азр, Рго, С1п или Зег <400> 15

Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр 1 5

Ьуз ТНг Ηί3 ТНг Суз Рго Рго Суэ 10 15

Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а Хаа Рго 20

Азр Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз 25 30

Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеТ 11е Зег 35 40

Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суэ Уа1 45

Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нгз <31 и Азр 50 55

Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг 60

Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Нгз Азп 65 70

А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и 75 80

С1п Туг Азп Зег ТНг Туг Агд 7а1 85

Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг 7а 1 Ьеи НЬз 90 95

С1п Азр Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз 61и 100

Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз 105 110

А1а Ьеи Рго А1а Рго С1и С1и Ьуз 115 120

ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п 125

- 36 028658

Рго Агд СЬи Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи 130 135 140

ТЬг Ьуз Азп СЬп Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго 145 150 155 160

Зег Азр Не АЬа 'Ή1 СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп 165 ПО 175

Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи 180 185 190

Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп УаЬ 195 200 205

РЬе Зег Суз Зег УаЬ МеЬ Н1з СЬи А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг СЬп 210 215 220

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз 225 230 <210> 16 <211> 230 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 16

ТЬг УаЬ С1и Агд Ьуз Суз Суз УаЬ 61и Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго 15 10 15

Рго УаЬ А1а СЬу Рго Азр УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Аэр 20 25 30

ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр 35 40 45

УаЬ Зег Нхз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьу5 РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу 50 55 60

УаЬ СЬи УаЬ Ηΐ3 Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи 61и С1п Туг Азп 65 70 75 80

Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи Н13 СЬп Азр Тгр 85 90 95

Ьеи Азп СЬу Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго

- 37 028658

ТНг УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз Суз Уа! СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго 15 10 15

Рго УаЬ АЬа СЬу Рго Азр УаЬ РНе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 20 25 30

ТЬг Ьеи Мер Не Зег Агд ТЬг Рго С1и УаЬ ТЬг СуЕ УаЬ УаЬ УаЬ Азр 35 40 45

УаЬ Зег Н13 СЬи Азр Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу 50 55 60

УаЬ СЬи УаЬ Ηιε Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп 65 70 75 30

- 38 028658

Зег ТЬг

РЬе Агд

УаЬ 85

УаЬ

5ег УаЬ

Ьеи ТЫ УаЬ 90

УаЬ

Нхз

СЬп

Азр 95

Тгр

Ьеи

Азп

СЬу

Ьуз

СЬи

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

УаЬ

Зег

Азп

Ьуз

СЬу

Ьеи

Рго

100

105

110

АЬа

Рго

СЬи

СЬи

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

ТНг

Ьуз

СЬу

СЬп

Рго

Агд

СЬи

115

120

125

Рго

СЬп

УаЬ

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

СЬи

СЬи

Мер

ТНг

Ьуз

Азп

130

135

140

СЬп

УаЬ

Зег

Ьеи

ТЫ

Суз

Ьеи

УаЬ

Ьуз

СЬу

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

145

150

155

160

Зег

УаЬ

СЬи

Тгр

СЬи

Зег

Азп

СЬу

СЬп

Рго

СЬи

Авп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

165

170

175

ТЬг

Рго

Рго

МеР

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

180

185

190

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

СЬп

СЬп

СЬу

Азп

УаЬ

РЬе

Зег

Суз

195

200

205

Зег

УаЬ

Мер

НХ5

СЬи

АЬа

Ьеи

Нхз

Азп

Нхз

Туг

ТНг

СЬп

Ьу5

Зег

Ьеи

210

215

220

Зег

Ьеи

Зег

Рго

СЬу

Ьуз

225

230

<210> 18 <211> 233 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 18

Ьуз УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Нхз ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго УаЬ АЬа СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 20 25 30

Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мер Не Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ 35 40 45

УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег Нхз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр Туг

- 39 028658

55 60

Уа1 Азр С1у Уа1 61и 7а1 Шз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд О1и С1и 65 70 75 80

С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд 7а1 νβΐ Зег 7а 1 Ьеи ТЬг 7а1 Ьеи Шз 85 90 95

61п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз 7а1 Зег Азп А1а 100 105 110

А1а Ьеи Рго А1а Рго С1и А1а Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п 115 120 125

Рго Агд С1и Рго С1п ’7а1. Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи 130 135 140

ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи 7а 1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго 145 150 155 160

Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп 165 170 175

Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи 180 185 190

Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 195 200 205

РЬе Зег Суз Зег 7а1 Мер Шз С1и А1а Ьеи Шз Азп Шз Туг ТЬг СЬп 210 215 220

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 225 230 <210> 19 <211> 233 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого 1дС <400> 19

Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Шз ТЬг Суз Рго Рго Суз 15 10 15

Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а С1у Рго Азр '7 а 1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуэ 20 25 30

- 40 028658

Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ 35 40 45

УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег нЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр Туг 50 55 60

УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи 65 70 75 80

СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи Нгз 85 90 95

СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп АЬа 100 105 110

А1а Ьеи Рго АЬа Рго 1Ье АЬа Ьуз ТЬг Ые Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп 115 120 125

Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи 130 135 140

ТЬг Ьуз Азп СЬп Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго 145 150 155 160

Зег Азр Г1е А1а Уа1 СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп 165 170 175

Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи 130 185 190

Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп С1у Азп УаЬ 195 200 205

РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеГ Нгз С1и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТЬг СЬп 210 215 220

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз 225 230 <210> 20 <211> 233 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Вариант последовательности константного участка человеческого ХдС <400> 20

Ьуз УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Нгз ТЬг Суз Рго Рго Суз

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Модифицированная Рс-содержащая молекула, устойчивая к протеолитическому расщеплению по сравнению с Рс-содержащей молекулой 1дС1 дикого типа человека, содержащая Рс-домен антитела с мутированным константным доменом 1дС1, в котором шарнирная последовательность Ε233-ϋ234-Ε235С236 1дС1 дикого типа заменена на Р233-У234-А235 с делецией С236, как определено в соответствии с нумерацией по Ευ, и дополнительно содержащая одну или более замен по сравнению с последовательностью Ι§01 дикого типа, выбранных из 8239Ό/Ι332Ε; Κ326А/Ε333А; Ε333А/Κ334А;

   Η268Р/8324Τ/I332В; Р243Ь/К292Р/¥300Ь; 8239^/Η268Р/8324Τ/I332В; 8267Ε/Η268Р/8324Τ/I332Ε;

   Κ326А/I332В/В333А; 8239^/Κ326А/В333А; 8267Ε/Ι332Ε и 0237Χ/8239Ό/Ι332Ε, где X представляет собой А, Ό, Р, О или 8.
2. 2. Рс-содержащая молекула по п.1, которая устойчива к расщеплению протеазой, способной разлагать молекулу Ιβ01 между остатками 222-237 (нумерация по Ευ).
3. 3. Рс-содержащая молекула по п.2, которая устойчива к расщеплению ММР-3, ММР-7, ММР-12, ММР-13, ΗΝΕ, плазмином, катепсином С, пепсином, разлагающим иммуноглобулин ферментом 81гер. Ругопдепек (Ие8) или глутамилэндопептидазой Ι 81арй. аигеик (О1иУ8) по сравнению с Ι§01 дикого типа.
4. 4. Рс-содержащая молекула по п.3, которая устойчива к расщеплению ММР-3, ММР-7, Ие8 или О1иУ8 по сравнению с Ιβ01 дикого типа.
5. 5. Рс-содержащая молекула по п.1, которая способна стимулировать антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз (АОСР), измеренный в присутствии мононуклеарных клеток крови СЭ14 рок и/или СЭ11Ь рок, содержащая последовательность, выбранную из группы 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8, 10-15 и 17-20.
6. 6. Рс-содержащая молекула по п.5, содержащая шарнирный домен Ιβ01 дикого типа, замененный на Р233-У234-А235 с делецией С236, как определено в соответствии с нумерацией по Ευ, или с дополнительной заменой Ι332Ε, как определено в соответствии с нумерацией по Ευ.
7. 7. Рс-содержащая молекула по п.1, которая способна стимулировать АОСС, измеренный в присутствии мононуклеарных клеток крови.
8. 8. Рс-содержащая молекула по п.1, которая способна стимулировать комплементзависимую цитотоксичность (СОС), измеренную по лизису клеток в присутствии комплемента.
9. 9. Рс-содержащая молекула по п.1, которая способна связывать Рсу-рецептор с сопоставимой или большей аффинностью, чем Рс-домен Ιβ02 дикого типа.
10. 10. Рс-содержащая молекула по п.1, которая способна связывать Рсу-рецептор с сопоставимой или большей аффинностью, чем Рс-домен Ιβ01 дикого типа.
11. 11. Рс-содержащая молекула по п.5, содержащая 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8.
12. 12. Рс-содержащая молекула по любому из пп.1-11, которая представляет собой антитело или Рс-слитый белок.
13. 13. Антитело по п.12, которое связывается с СГО20. ΕγΕΒ1. ΕιΈΒ2. ΕγΕΒ3. УБОР, ΚΟΝ или тканевым фактором.
14. 14. Рс-содержащая молекула по п.1, в которой последовательность Рс-домена по меньшей мере на 90% идентична Ιβ01 человека дикого типа с остатка 214 до приблизительно остатка 340 по системе нумерации Ευ.
15. 15. Рс-содержащая молекула по п.1, в которой Рс включает замены, выбранные только из Ι332Ε или в комбинации с другими заменами, такими как 8239Ό/Ι332Ε, 8239П/Н268РЛ332В, 8239^/Η268Р/8324Τ/I332Ε, 8267В/Η268Р/8324Τ/I332В, 0237Χ/8239Ό/Ι332Ε, где X представляет собой А или 8.
16. 16. Рс-содержащая молекула по п.1, в которой Рс включает замены, выбранные только из 8239Ό или в комбинации с другими заменами, такими как 8239Ό/Ι332Ε, 8239^/Η268Р/I332В,