EA024152B1 - Композиция для местного введения для лечения или профилактики рака кожи - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к композиции для местного введения для лечения или предотвращения рака кожи, содержащей а) 3-ангелат ингенола; b) усиливающее проникновение вещество; с) консервант; d) гелеобразующее вещество; е) буфер; при этом композиция имеет кажущееся значение рН от 3 до 4 включительно. Настоящее изобретение предоставляет стабильный состав ангелата ингенола для местного применения.

Description

Настоящее изобретение относится к композициям соединений, получаемых из видов ЕирЬотЫа и пригодных для лечения или предотвращения злокачественных опухолей кожи.

Соединение ангелата ингенола можно выделять из различных видов ЕирЬотЫа, в частности из ЕирЬотЫа рер1и8 и ЕирЬотЫа бтиттоиби. Ангелат ингенола существует в трех изоформах: ингенол-3ангелат (изоформа Ъ), ингенол-5-ангелат (изоформа а) и ингенол-20-ангелат (изоформа с). Первую из этих изоформ также обозначают в настоящем документе как Ι3Α и она имеет следующую структуру:

Было выявлено, что ангелат ингенола является высокотоксичным для клеток рака кожи вследствие быстрого разрушения митохондрий и гибели клеток посредством первичного некроза, при этом здоровые клетки остаются неповрежденными.

В υδ-Α-6432452 описаны соединения, находящиеся в действующем веществе, полученном из растений видов ЕирЬотЫа рер1и8, ЕирЬогЫа Ыйа и ЕирЬотЫа бтиттоиби, которые показывают селективную цитотоксичность против нескольких злокачественных клеточных линий. Соединения пригодны для эффективного лечения злокачественных опухолей, в частности злокачественных меланом и плоскоклеточного рака (8СС). Соединения выбраны из ятрофанов, пеплуанов, паралианов и ингенанов. Предпочтительным соединением является ангеноилзамещенный ингенан, получаемый из сока ЕирЬотЫа рер1и8.

Микрограммовые количества ангелата ингенола, как правило, являются терапевтически эффективными. Однако тенденция к перестройке изоформы Ъ в изоформу а, а затем в изоформу с является проблемой в составе, где является желательным ограничение состава либо до конкретной изоформы, либо до соотношения изоформ. В частности, это является проблемой для Ι3Α, поскольку различные изоформы обладают различной растворимостью.

Существует необходимость в эффективном способе местного лечения рака кожи, поскольку системное лечение, вовлекающее другие лекарственные средства, неизбежно приводит к воздействию на чувствительные здоровые клетки в частях организма, не являющихся мишенью для цитотоксических химических веществ. Кроме того, системные лекарственные средства против злокачественной опухоли, вводимые как перорально, так и посредством инъекции, являются менее приемлемыми для пациентов.

Существует необходимость в предоставлении стабильного состава ангелата ингенола, предпочтительно для местного введения.

В первом аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию для местного введения для лечения или профилактики рака кожи, содержащая а) 3-ангелат ингенола; Ъ) усиливающее проникновение вещество; с) консервант; б) гелеобразующее вещество; е) буфер; при этом композиция имеет кажущееся значение рН от 3 до 4 включительно.

Неожиданно в ходе данной работы было выявлено, что растворимость ангелата ингенола можно повышать по существу без преобразования между изоформами в приемлемом апротонном растворителе в присутствии приемлемого смешивающегося кислого буфера.

Настоящее описание относится к составу ангелата ингенола для применения в целях лечения, где ангелат ингенола растворен в фармацевтически приемлемом апротонном растворителе, при этом указанный состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый подкислитель, который, по меньшей мере частично, совместим с растворителем и который обеспечивает в составе кажущееся значение рН не более 4,5.

Настоящее описание относится к составам любой из изоформ ангелата ингенола, или их смесей. В настоящее время, предпочтительной изоформой является изоформа Ъ, также обозначаемая в настоящем описании как Ι3Α. Будет понятно, что указание на ангелат ингенола и Ι3Α включает указание на другие изоформы и их смеси, если не является очевидным иное.

Ангелат ингенола можно растворять во многих растворителях, и различные растворители проиллюстрированы в прилагаемом примере 1. Однако ангелат ингенола, главным образом, имеет предрасположенность к преобразованию в протонных растворителях, и любая существенная степень преобразования, как правило, более 1% для полученных из растений продуктов, однако более предпочтительно приблизительно 0,5%, является нежелательной в фармацевтическом составе.

В апротонных растворителях, которые, главным образом, представляют собой растворители, которые не обеспечивают протоны в растворе, такие как полиэтиленгликоль, растворение может занимать

- 1 024152 некоторый существенный период времени и это, совместно с требуемыми температурами, также может приводить к преобразованию на уровне выше приемлемых уровней.

Вещества, такие как ацетон и ацетонитрил, способны растворять Ι3Α, однако они, как правило, не являются фармацевтически приемлемыми, и могут быть не пригодными для длительного хранения. Более приемлемыми могут быть вещества, такие как метилэтилкетон, этилацетат или диэтиловый эфир, однако, главным образом, наиболее предпочтительным является бензиловый спирт.

Множество веществ пригодно для растворения Ι3Α, однако без гарантии стабильности, и, как правило, неприемлемые уровни преобразования можно наблюдать после периодов времени в диапазоне между от 12 ч и до 6 месяцев или года.

В отсутствии воды или другого протонного растворителя измеримого значения рН не будет. В таких условиях, и особенно при повышенных температурах, вероятным является преобразование. Таким образом, было выявлено, что обычно является возможным ингибирование преобразования посредством наличия пригодной кислоты.

Пригодные кислоты, как правило, представляют собой органические кислоты, поскольку было выявлено, что Ι3Α может разрушаться при рН значительно ниже 3, в то время как преобразование, вероятно, может происходить при более высоком значении рН, составляющем приблизительно 4,5. Когда предполагается хранение состава в течение периодов времени любой длительности, таких как месяц или более, является предпочтительным, чтобы кислота находилась в форме буфера. Пригодные буферы включают цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и цитратно-фосфатный буфер, хотя другие буферы будут очевидны специалистам в данной области. В частности, является предпочтительным, чтобы буфер обеспечивал кажущееся значение рН в составе не более 4,5 и не менее 2,5. рН состава менее 4 является более предпочтительным и особенно предпочтительным является, чтобы кажущееся значение рН в составе составляло 3,8 или менее, предпочтительно приблизительно 3,5 или менее. Пригодным является кажущееся значение рН приблизительно 3. Было выявлено, что буфер с рН 2,75 является особенно предпочтительным, обеспечивая кажущееся значение рН приблизительно рН 3,5 в конечном составе, когда его используют в количествах, как проиллюстрировано в прилагаемых примерах. Предпочтительный диапазон рН буфера находится между 2,6 и 2,85, предпочтительно рН 2,7-рН 2,8, и буфер предпочтительно представляет собой цитратный буфер. Будет понятно, что кислота, главным образом, будет находиться в форме водного раствора, предпочтительно в деионизированной воде, если нет иных указаний. Предпочтительным является цитратный буфер. Когда используют ацетатный буфер, он, как правило, может обладать диапазоном рН от 3,5 до 5,5, в то время как цитрат-фосфатный буфер, как правило, может обладать диапазоном рН от 2,75 до 7,0.

Будет понятно, что раствор, в котором растворитель является апротонным, не может обладать рН, поскольку это значение представляет собой показатель ионов Н+. Однако когда такой раствор является, по меньшей мере частично, смешивающимся с кислотой или кислым буфером, и он представлен в таком виде, тогда попытки измерить рН приведут к результату.

Составы по этому изобретению изготовлены в качестве форм для местного введения, и, главным образом, их большую часть будут составлять буфер или ионный раствор, однако они всегда будут содержать апротонный растворитель, так что можно измерить только кажущееся, а не абсолютное значение рН, поскольку измеренное значение рН относится только к ионному компоненту. Пригодные способы измерения кажущегося значения рН представляют собой способы с помощью рН-метра 1сп\уау 3320. Таким образом, результат может не обладать значением, в норме приписываемым ионному раствору, особенно где количество кислоты или буфера является небольшим, но значение состоит в том, что, поскольку имеется какое-либо ионное окружение, окружение является кислым. По мере повышения количества кислоты, кажущееся значение рН становится более эквивалентным значению рН. Без связи с какой-либо конкретной теорией, вероятно, что ангелат ингенола, главным образом, растворяется в апротонном растворителе, поскольку он обладает очень низкой растворимостью в воде. Последующее добавление раствора ангелата ингенола в растворителе к подкисленному ионному раствору дает возможность получения пригодного, необязательно водного, ионного раствора ангелата ингенола, избегая посредством этого растворения ангелата ингенола непосредственно в протонном растворителе, при котором повидимому происходит наибольший уровень преобразования. Таким образом, контакт с протонным растворителем может непосредственно приводить к образованию других изоформ, однако это можно минимизировать, если добавить небольшое количество кислоты или кислого буфера, и эти термины используют синонимично в настоящем документе, если не является очевидным иное. Даже действие растворения в протонных растворителях, с учетом необходимой длительности и условий, может приводить к нежелательно высоким уровням образования изоформ, а именно к предрасположенности ангелата ингенола к преобразованию.

Апротонный растворитель и кислота являются, по меньшей мере частично, совместимыми в том, что из этих двух компонентов может образовываться стабильный препарат. Кислота и растворитель предпочтительно являются смешивающимися, и предпочтительно они являются смешивающимися во всех соотношениях. В частности, в основном является предпочтительным добавление небольшого количества буфера в растворитель в процессе растворения ангелата ингенола, или сразу после этого, в целях

- 2 024152 поддержания кажущегося значения рН на относительно низком уровне. Затем может быть желательным получение растворенного ангелата ингенола в избытке буфера, который использовали в ходе первоначального растворения. Стабильные препараты, изготовленные с избытком буфера, проиллюстрированы ниже в примере 9.

Будет понятно, что предпочтительно, чтобы кислота и растворитель были достаточно смешивающимися для возможности образования одной фазы, хотя несмешивающиеся или менее смешивающиеся растворители и кислоты могут быть получены в форме эмульсий или микроэмульсий. Такие эмульсии могут быть стабильными, хотя обеспечение смеси растворителя и кислоты в виде одной фазы, как правило, дополнительно минимизирует какой-либо риск преобразования ангелата.

Растворители, которые являются особенно пригодными, представляют собой растворители, которые проявляют как гидрофильные, так и липофильные свойства, такие как кольцевые системы, которые предпочтительно являются гомоциклическими и которые имеют на них гидроксигруппы, замещенные, но отделенные от кольцевой структуры по меньшей мере одним атомом углерода. Особенно предпочтительным примером такого растворителя является бензиловый спирт.

Несмотря на то что можно вместо буфера можно использовать кислоту, для минимизации колебаний значения рН, главным образом, является предпочтительным применение кислого буфера. По существу, будет понятно, что, как правило, когда в настоящем документе будет использоваться термин буфер, этот термин также включает кислоты и препараты кислот, когда это целесообразно. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер, рН 3 или менее, предпочтительно рН 2,75. В бензиловом спирте, количество 2,5% мас./мас. цитратного буфера с рН 2,5 будет, главным образом, приводить к не поддающемуся измерению кажущемуся значению рН, однако, при более высоких количествах, оно приводит к рН приблизительно рН 3. Взаимосвязь между рН буфера и кажущимся значением рН рассмотрена в прилагаемых примерах. В случае низких количеств буфера при растворении Ι3Α в растворителе является предпочтительным просто поддержание кислого окружения, и свойства предпочтительного буфера на этих уровнях являются сходными со свойствами предпочтительного буфера при последующем разбавлении состава для применения. Главным образом, перед добавлением Ι3Α является предпочтительным подкисление растворителя, предпочтительно бензилового спирта, количеством кислого буфера, предпочтительно между 1 и 10% по массе, более предпочтительно между 2 и 5%.

Несмотря на то что состав не нужно разбавлять для применения, обычно Ι3Α является сильнодействующим веществом, и можно изготавливать исходные растворы Ι3Α в растворителе, предпочтительно в бензиловом спирте, для хранения, предпочтительно при 8°С или менее. Затем, если желательно, при изготовлении любого конечного состава или препарата такие исходные растворы можно разбавлять, предпочтительно буфером.

Используемое количество буфера при растворении ангелата ингенола может варьировать между приблизительно 0 и 100%. Когда количество составляет 0, предпочтительным является добавление количества буфера сразу после добавления ангелата ингенола в растворитель, в целях минимизации вероятности того, что произойдет какое-либо преобразование. Как правило, предпочтительным является избегание применения количеств буфера, превышающих 100% по массе растворителя, поскольку растворение непосредственно в буфере, как правило, не является легко достижимым. Предпочтительным является использование буфера в качестве средства для поддержания кажущегося значения рН растворителя на низком уровне, без добавления какого-либо существенного количества протонного растворителя в процессе растворения ангелата ингенола. После растворения по существу ангелата ингенола, возможно, и даже желательно, изготовление состава с избытком буфера, содержащего, если желательно, другие необязательно протонные компоненты, например, такие как антибиотики. Предпочтительные уровни буфера находятся в диапазоне 0,5-10%, и предпочтительно между 1 и 5%, при этом приблизительно 2-3% являются наиболее предпочтительными в процессе фазы растворения. Фаза растворения включает растворение по меньшей мере большей части ангелата ингенола в растворителе, предпочтительно по меньшей мере 95% мас./мас. ангелата ингенола в растворителе, более предпочтительно по меньшей мере 99% мас./мас.

Составы по настоящему изобретению можно использовать сразу или их можно хранить для последующего применения. Кроме того, составы по настоящему изобретению могут представлять собой основной состав, который можно далее модифицировать перед применением. Например, как описано выше, состав можно изготавливать в избытке буфера.

Также было выявлено, что составы по настоящему изобретению, как правило, являются более стабильными при более низких температурах. Особенно предпочтительные составы по настоящему изобретению, такие как составы, содержащие бензиловый спирт и цитратный буфер, могут проявлять значительную стабильность при температурах менее 40°С, однако, как правило, повышение стабильности наблюдают при температурах ниже комнатной температуры и давления (РТР), и наибольшую стабильность наблюдают при температурах ниже приблизительно 8°С. Замораживание, по-видимому, не повышает стабильность, так что более высокой стабильности достигают просто помещением составов по этому изобретению в обычный холодильник при температуре между приблизительно 2 и 8°С.

- 3 024152

Кроме того, настоящее описание относится к способу получения раствора ангелата ингенола, включающему растворение ангелата ингенола в фармацевтически приемлемом апротонном растворителе, при этом указанный состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый подкислитель, который является, по меньшей мере частично, совместимым с растворителем и который приводит к составу с кажущимся значением рН не более 4,5, где указанную кислоту добавляют одновременно с ангелатом ингенола, до или после него.

Альтернативно, настоящее описание относится к способу получения раствора ангелата ингенола, включающему растворение ангелата ингенола в фармацевтически приемлемом апротонном растворителе, при этом указанный способ включает добавление фармацевтически приемлемого подкислителя, который является, по меньшей мере частично, совместимым с растворителем и который приводит к составу с кажущимся значением 4,5, где указанный подкислитель добавляют одновременно с ангелатом ингенола, до или после него. Подкислитель предпочтительно представляет собой буфер.

Для обеспечения преобразования изоформы Ъ в изоформу а не более приблизительно 1%, предпочтительно не более приблизительно 0,5%, предпочтительным является добавление кислоты или буфера достаточно быстро после добавления Ι3Α. Предпочтительно кислоту или буфер добавляют в растворитель перед добавлением Ι3Α, хотя все три ингредиента можно комбинировать одновременно. Этот последний вариант является наименее предпочтительным вариантом.

Также этот способ можно использовать для получения составов ангелата ингенола с использованием других соединений и растворителей, таких как полиэтиленгликоль, где прямое растворение может быть ассоциировано с неприемлемым уровнем преобразования. Хотя Ι3Α может растворяться в РЕС, это занимает приблизительно 1 ч при повышенной температуре, что, как правило, приводит к образованию неприемлемых уровней изоформы а. Если Ι3Α сначала растворяют в забуференном бензиловом спирте, то затем его можно добавлять непосредственно к РЕС без длительного воздействия нагревания. Поскольку только достаточное количество бензилового спирта требуется для растворения Ι3Α, то общее количество бензилового спирта в конечном составе РЕС должно составлять только приблизительно 1% мас./мас. или менее. Эти составы можно хранить в течение длительных периодов времени, особенно если их держать при температурах 8°С или ниже. В предпочтительных композициях через 3 месяца, более предпочтительно через 6 месяцев выявляют не более приблизительно 1%, предпочтительно не более приблизительно 0,5% преобразования изоформы Ъ в изоформу а.

Кроме того, описанием предусмотрено применение состава по этому изобретению для лечения рака кожи.

Также это описание относится к применению ангелата ингенола для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики рака кожи, где ангелат ингенола растворен в фармацевтически приемлемом апротонном растворителе, при этом указанный состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый подкислитель, который, по меньшей мере частично, совместим с растворителем и который приводит к составу с кажущимся значением рН не более 4,5.

Пригодные злокачественные опухоли для лечения в соответствии с настоящим изобретением включают плоскоклеточный рак и рак из базальных клеток.

Будет понятно, что лечение, как используют в настоящем документе, включает как терапию, так и профилактику.

Также настоящее описание относится к способу лечения субъекта, страдающего злокачественным состоянием кожи, включающему местное применение терапевтически эффективного количества композиции, раскрытой в данном документе, в области злокачественного состояния.

Пригодными для лечения субъектами являются млекопитающие, включая человека, приматов, домашний скот (включая коров, лошадей, овец, свиней и коз), животных-компаньонов (включая собак, кошек, кроликов, морских свинок), находящихся в неволе диких животных и лабораторных животных, таких как кролики, мыши, крысы, морские свинки и хомяки. Композиции по настоящему изобретению являются особенно пригодными для лечения рака кожи человека.

Будет понятно, что составы по настоящему описанию можно применять для профилактики или лечения любого пригодного рака. Формы для введения могут представлять собой любые пригодные формы и они включают кремы, гели, мази, лосьоны, аэрозоли, лаки и наносимые кисточкой лекарственные средства для местного применения, порошки, растворы и суспензии для дыхательных путей, растворы и эмульсии для инъекции, капсулы, сиропы и эликсиры для перорального введения, и пессарии и суппозитории. Другие пригодные формы для введения будут хорошо понятны специалистам в данной области, и они могут включать, например, чрескожные пластыри. Составы ангелата ингенола по настоящему изобретению изготавливают для местного введения.

Во всех случаях, первоначальный состав является таким, как состав по этому изобретению. Состав можно превращать в конечную форму непосредственно перед применением, как только это становится желательным, после изготовления состава, однако, как правило, состав будет оставаться составом по этому изобретению все время.

Составы могут содержать дополнительные ингредиенты, как рассмотрено ниже. Особенно предпочтительным является использование антиоксидантов, поскольку они участвуют в обеспечении повы- 4 024152 шенной стабильности в составах. Пригодные примеры антиоксидантов включают ретинол, аскорбиновую кислоту, ликопен, бутилированный гидрокситолуол и токоферол.

Количество ангелата ингенола, требуемое для фармацевтической эффективности, будет очевидно специалистам в данной области, и его можно адаптировать в соответствии с физиологическими параметрами, такими как возраст, масса и пол пациента, а также размер какого-либо повреждения. Как правило, можно применять количество ангелата ингенола, пригодное для обеспечения между приблизительно 0,01 мкг-см^-2 до приблизительно 1 мг-см^-2, при этом диапазон от 0,1 мг-см^-2 до приблизительно 100 мкг-см^-2 является более предпочтительным. В прилагаемых примерах использовали состав, обеспечивающий 15 мкг-см^-2, однако было выявлено, что составы 1 мкг-см^-2 или менее являются более эффективными. В альтернативном случае, составы по этому изобретению могут содержать Ι3Α в количестве от 0,001 до 0,15% мас./мас., более предпочтительно вплоть до приблизительно 0,1-0,12% мас./мас.

Композиции по настоящему изобретению представляют собой местные составы. В этом отношении, ранее не известное свойство ангелатов ингенола является особенно пригодным, поскольку было выявлено, что они обладают сосудосуживающими свойствами. Таким образом, системное распределение активного ингредиента минимизируют, вследствие сниженного кровотока вблизи области лечения.

Будет понятно, что свойства состава будут определять скорость проникновения через кожу. По существу, главным образом, предпочтительно, чтобы состав был получен таким образом, чтобы обеспечивалась скорость проникновения по меньшей мере приблизительно 11 нг-см^-2-ч^-1. Не существует конкретного верхнего предела, хотя, главным образом, предпочтительно, чтобы он не превышал приблизительно 1 мкг-см^-2-ч^-1.

Местные составы могут обладать пригодной формой. Как правило, является предпочтительным, чтобы они обладали некоторым уровнем вязкости для того, чтобы их можно было нацеливать на требуемую область без стекания. Таким образом, особенно предпочтительным является изготовление ангелата ингенола в качестве кремов, гелей, мазей и лекарственных средств в вязком носителе. С учетом эффективности ангелата ингенола, можно использовать лекарственные средства в вязком носителе, поскольку их можно применять экономно, в зависимости от уровней активного ингредиента.

В предпочтительных составах по настоящему изобретению можно использовать полоксамеры. Они представляют собой сополимеры, которые состоят из гидрофобной молекулы полоксипропилена (РОР), расположенной посередине между двумя гидрофильными молекулами полоксиэтилена (РОЕ). Таким образом, они обладают способностью растворять липофильные лекарственные средства в гидрофобной основе. Более того, водные гелевые составы на основе полоксамеров проявляют термореологические свойства, которые могут быть преимущественными для локализованной длительной доставки лекарственных средств. Выше определенной температуры, известной как критическая мицеллярная температура (ст1). вязкость полоксамерного геля резко повышается. Повышение вязкости приводит к снижению диффузии любых лекарственных средств, растворенных в геле, что замедляет высвобождение лекарственного средства из геля и приводит к замедленной доставке. Повышение вязкости также может обеспечивать длительное локализованное депо в той же области действия.

Ст! зависит от ряда переменных, таких как концентрация полоксамера и других добавок, таких как пропиленгликоль. В идеальном случае, ст! должна представлять собой температуру, при которой состав можно инъецировать в область повреждения в качестве жидкости (простота введения) и при контакте с температурой тела образуется гель с целью достижения локализованной замедленной доставки лекарственного средства. В И8Р приведено пять полоксамеров, и они включают полоксамер 188 и полоксамер 407. Полоксамер 188 был одобрен в качестве эксципиента для внутривенных составов (Ьйр://тетете.ассе88ба!аТба.доу).

Полоксамерные гели использовали для подкожной доставки инсулина (ВагюЬе11о е! а1., 1999) и других систем для доставки лекарственного средства для подкожного применения (ТоЫуата е! а1., 1994). Один конкретный сополимер, полоксамер 407, вводили подкожно для медленного высвобождения пептидов и терапевтических белков, которые включали интерлейкин-2 и гормон роста человека (Мопкатеа е! а1., 1987; Ка!аката е! а1., 1997). После введения гели медленно высвобождали заключенные в него молекулы белка в течение 1-2 суток. Более того, существенная часть этого полоксамера в конце концов подвергалась экскреции почками.

Полоксамеры, как правило, считаются нетоксичными и не вызывающими раздражения материалами. Исследования токсичности на животных с использованием собак и кроликов показали, что полоксамеры являются не вызывающими раздражения и несенсибилизирующими при применении в концентрации 5% мас./об. и 10% мас./об. в глазах, деснах и коже. В 14-суточном исследовании внутривенного введения кроликам в концентрациях вплоть до 0,5 г/кг/суток, не было отмечено выраженных неблагоприятных эффектов. Сходное исследование с собаками также показало отсутствие неблагоприятных эффектов при уровнях дозирования вплоть до 0,5 г/кг/сутки. Более того, не было выявлено гемолиза кровяных клеток человека в течение 18 часов при 25°С для 0,001-10% мас./об. растворов полоксамера (^абе апб \Ме11ег, 1994). Однако была описана гиперлипидемия у крыс при введении внутрибрюшинной (ΙΡ) инъекции (1,0 г/кг) полоксамера 407 (^азап е! а1., 2003).

- 5 024152

В настоящем изобретении также можно использовать масла. Применение состава на основе эмульсии внутри повреждения описано для лечения псориаза (Но с1 а1., 1990). Перед введением носитель, такой как полиоксиэтилированное касторовое масло, обычно разбавляют физиологическим раствором с образованием эмульсии. Однако исследования авторов настоящего изобретения показали, что разбавление Ι3Α нормальным физиологическим раствором повышает превращение изоформы Ъ в а. Это превращение можно минимизировать, если время введения состава является коротким.

Существует множество липофильных продуктов, которые изготавливают в качестве масляных растворов для внутримышечного введения (ΙΜ), например проликсина энантат (Βτίδΐοΐ Муегк §цшЪЪ). Используемый носитель (масло) широко варьирует среди растительных масел, таких как арахисовое масло (используемое с бензилбензоатом в димеркапроле для инъекций В.Р.) и кунжутное масло (используемое в инъекции замедленного всасывания флуфеназина энантата для инъекций В.Р). Применение масляных носителей может замедлять всасывание вследствие замедленного высвобождения лекарственного средства из масла в водные жидкости организма (Ροτά, 1987). При инъекции в водную среду (такую как мышечная ткань) относительно липофильное лекарственное средство, такое как Ι3Α, растворенное в масляной фазе, будет иметь тенденцию не выходить из масла и не высвобождаться мгновенно в водную фазу. Таким образом, может быть достигнут эффект замедленного высвобождения.

Также можно использовать буккальные составы. Доставка лекарственных средств через слизистую оболочку представляет собой распространенную форму введения, поскольку слизистые мембраны являются относительно проницаемыми, что дает возможность быстрого захвата лекарственного средства в системный кровоток и избежания пресистемного метаболизма. Продукты для доставки через слизистую оболочку можно разрабатывать для введения назальным способом и оральным/буккальным способом с использованием мукоадгезивных веществ. При разработке этих систем для доставки лекарственных средств, адгезия к слизистой оболочке устройства/состава является ключевым элементом. Термин мукоадгезивный обычно используют для материалов, которые обладают адгезией к муциновому слою биологической мембраны. В попытках достигнуть системной и локализованной доставки лекарственных средств через различные слизистые оболочки мукоадгезивные полимеры использовали во множестве различных дозированных форм. Эти дозированные формы включают таблетки, пластыри, ленты, пленки, полутвердые вещества и порошки.

Для того чтобы выступать в качестве мукоадгезивных полимеров, полимеры должны обладать физико-химическими свойствами, такими как анионные свойства с наличием множества групп, образующих водородные связи, пригодные поверхностные свойства для смачивания поверхности слизистой оболочки/слизистой ткани и достаточная гибкость и длина (молекулярная масса) для проникновения через слизистую сеть или щели в ткани. В качестве потенциальных мукоадгезивных веществ были описаны различные классы полимеров, такие как карбомеры (полиакриловая кислота), гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), а также встречающиеся в природе полимеры, такие как гиалуроновая кислота и хитозан.

Получение пригодных составов относится к пределам квалификации специалистов в данной области, и пригодные эксципиенты для включения в любой такой состав включают, например, гелеобразующие вещества, загустители, усиливающие проникновение вещества, консерванты, такие как антибиотики и противогрибковые вещества, и косметические ингредиенты, такие как ароматизаторы и красители.

Пригодные гелеобразующие вещества включают растворимые в воде полимеры, образованные из целлюлозы, такие как полимеры гидроксиалкилцеллюлозы (например, гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза), карбоксиметилцеллюлоза, метилгидроксиэтилцеллюлоза и метилцеллюлоза, карбомер (например карбопол); и каррагенаны. Образующее гель вещество можно добавлять в любом пригодном количестве, таком как 1-5% мас./мас. Предпочтительными гелеобразующими веществами являются образованные из целлюлозы вещества, наиболее предпочтительно гидроксиалкилцеллюлоза, в частности гидроксиэтилцеллюлоза.

Пригодные консерванты будут очевидны специалисту в данной области, и они включают парабены (метил, этил, пропил и бутил), бензойную кислоту и бензиловый спирт. Консерванты, используемые исключительно для этой цели, будут, главным образом, составлять 1% мас./мас. или менее от конечного местного состава.

Пригодные усиливающие проникновение вещества включают изопропиловый спирт, сульфоксиды (такие как диметилсульфоксид, ΌΜδΘ), азоны (например, лаурокапрам), пирролидоны (например, 2пирролидон), алканолы (например, деканол) и гликоли (например, пропиленгликоль).

Композиции по этому изобретению включают:

a) Ι3Α;

b) усиливающее проникновение вещество;

c) консервант;

ά) гелеобразующее вещество; и е) буфер, где композиция обладает кажущимся значением рН между 3 и 4 включительно.

Особенно предпочтительная композиция включает следующее:

а) 0,1% мас./мас. Ι3Α;

- 6 024152

b) 30% мас./мас. изопропиловый спирт;

c) 0,9% мас./мас. бензиловый спирт;

Д) 1,5% мас./мас. гидроксиэтилцеллюлоза;

е) 67,5% мас./мас. цитратный буфер, рН 3, предпочтительно рН 2,75.

Далее это изобретение описано на основании прилагаемых фигур.

Фиг. 1: представлено схематическое изображение ячейки Франца.

Фиг. 2: процентная доля изоформы Ь в изопропаноловом геле (рН 6,5).

Фиг. 3: процентная доля Ι3Α Ь в 30% ΙΡΑ/цитратном буфере (рН 3).

Фиг. 4: процентная доля Ι3Α Ь в 100% бензиловом спирте при 2-8°С, ΚΤΡ и 40°С.

Фиг. 5: процентная доля Ι3Α Ь в 100% феноксиэтаноле при 2-8°С, ΚΤΡ и 40°С.

Фиг. 6: представлена блок-схема для получения 0,1% мас./мас. состава Ι3Α 16 и соответствующего плацебо (* для состава плацебо к 24,75 г основного состава добавляли 0,25 г бензилового спирта).

Фиг. 7: относительные величины С' и С для составов 4, 14, 15, 16 и 17 (η=5±δΌ).

Фиг. 8: соответствующие значения (ап Д для составов 4, 14, 15, 16 и 17.

Фиг. 9: график среднего количества Ι3Α Ь, высвобожденного после 26 ч (мкг/см²) из 0,1% мас./мас. составов из геля на основе полоксамера и РЕС 400, (η=3±δΕ).

Фиг. 10: График среднего количества Ι3Α Ь, высвобожденного через 26 ч (мкг/см²) из 0,1% мас./мас. составов из масла и РЕС 400, (η=3±δΕ).

Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано с помощью следующих неограничивающих примеров.

Пример 1.

Стабильность Ι3Α исследовали в различных системах растворителей, включая ацетон, ацетонитрил, метанол/воду, воду, ΌΜδΟ, фосфатные буферы (диапазон рН от 4,5 до 7) и аммонийный буфер (рН 4,5), и было показано, что он является стабильным в ацетоне, ацетонитриле, ΌΜδΟ, фосфатном буфере, рН 4,5, и аммонийном буфере (рН 4,5). Преобразование ангелата ингенола, как оказалось, происходило в порядке преобразования изомера Ь в изомер а, а затем в изомер с. Вследствие небольших количеств используемого активного вещества, показатель стабильности соединения вычисляли в качестве соотношения площади пика Ь к площади пика а.

Материалы.

Таблица 1

Поставщики материалов, используемых в этом примере

Материалы	Поставщик
Ι3Α (ангелат ингенола)	Поставлялся РерИп АизЪгаЫа	ЫтлЛес1,
партия Νο. 080402 300502	и партия Νο.
β-циклодекстрина сульфобутиловый	эфир, 7-	Суйех 1псогрога+ес1,	□за
натриевая соль	(СарЫзо!®)
серия Νο. СУ-ОЗА-ОЮ244
2-гидроксипропил-р	-	Иаскег-СЪеггие СтЬН	&	Со.,
циклодекстрин (Сауа5о1® N7 ИР), партия Νο. 74ВО08 миглиол 810Ν, серия Νο. 980403	Сегтапу
пропиленгликоль, 286991	партия Νο.
минеральное масло 128Н0136	серия Νο.	Згдта СЬетгса! Со.,	ик
масляная кислота,	серия Νο.
973658842В Зрап 80, серия Νο.	120Н0454
Ткееп 80, серия Νο	44Н0121
Полиэтиленгликоль Νο. 60Н0463 ϋΜ30	300, серия
Гиалуронат натрия	(НА)	Куока Накко РЬагтасеиЁ1са1з
партия ΝΟ.ΚΧ00282		Тарап
Монофосфат калия,	партия Νο.	А1бг1с1г СНегатса! Со.	, ик
14286
Ацетат аммония,	серия Νο.	ΒϋΗ Ьабсга^огу ВиррИез,	ик
А147753001
Ледяная уксусная кислота
Ацетон для применения в ВЭЖХ	Еа-ЬЬЬигп СЬет1са1з ΙΛά,	ик
ацетонитрил для применения в
ВЭЖХ
метанол для применения в ВЭЖХ
деионизированная	вода	Е1да ΙΛά.,ϋΚ
{Е1дазЪаЬ ОрМоп ЗА)
РагаРИгп®	Атеггсап ИаЩопа! Саш™,	изА

Все используемые в конечном составе Ι3Α эксципиенты были нормативного класса.

- 7 024152

Способы.

Исследование стабильности Ι3Α в растворителях/эксципиентах.

Исследование стабильности Ι3Α в следующих сочетаниях растворитель/эксципиенты/эксципиент проводили в течение 14 суток (за исключением того, когда указано иное) при комнатной температуре:

Ацетон;

Ацетонитрил;

Метанол;

Метанол/вода (70/30);

Вода;

Фосфатный буфер рН 4,5, рН 5,5, рН 6,5, рН 7,0;

ΌΜδΟ*;

Минеральное масло;

Миглиол 810;

Полиэтиленгликоль 300;

Пропиленгликоль;

Олеиновая кислота;

2-Г идроксипропил-в-циклодекстрин (Сауа§о1®/Н₂О);

2-Гидроксипропил-в-циклодекстрин (Сауа§о1®/РО₄ рН 4,5);

Т\уссп 80/8раи 80/Н₂О;

Т\уссп 80/8раи 80/РО₄ рН 4,5;

β-циклодекстрина сульфобутиловый эфир (СарЙ8о1®)/Н₂О**; β-циклодекстрина сульфобутиловый эфир (СарЙ8о1®)/РО₄, рН 4,5**;

Гиалуронат натрия (НА)/РО₄ рН 4,5;

Гиалуронат натрия (НА)/Н2О рН 4,5;

* исследование в течение 10 суток;

** исследование в течение 7 суток;

*** исследование в течение 2 суток.

Получали исходный раствор 0,5 мг/мл Ι3Α в ацетонитриле. Аликвоты по 1,0 мл переносили в отдельные стеклянные пробирки с помощью бюретки; растворы сушили струей воздуха, а затем в пробирки добавляли 1,0 г соответствующего сочетания растворитель/эксципиент/эксципиент. На 0 сутки, 5 сутки и 14 сутки аликвоты образцов для исследования стабильности удаляли для анализа посредством ВЭЖХ с использованием условий хроматографии, описанных в разделе Стабильность в НМ8О, ниже. Стабильность выражали в качестве соотношения пика Ъ к пику а (и пику с при его наличии), при этом высокое соотношение указывает на стабильность в конкретном эксципиенте.

Анализ ВЭЖХ для исследования стабильности Ι3Α в эксципиентах.

Дополнительный способ ВЭЖХ проводили в целях разделения выступа, появившегося на пике Ъ, который был выявлен в некоторых препаратах Ι3Α.

Хроматографические условия, используемые для исследования стабильности в эксципиентах, были следующими:

Колонка: НурегсагЪ (ТНсгтоОисЧ. РЬепотепех) (δ/по. 3-34070);

Длина колонки: 100x4,60 мм;

Температура колонки: 25°С;

Защитная колонка: С18 Со1итЪи8 (РЬепотепех) (δ/по. 202678);

Длина защитной колонки: 50x4,60 мм;

Подвижная фаза: 50% об./об. фосфатный буфер рН 4,5/50% об./об. ацетонитрил;

Скорость потока: 1,0 мл/мин;

Длина УФ-волны: 230 нм;

Объем инъекции: 10 мкл;

Время пробега: 35 мин.

Предварительное исследование диффузии ш уПго.

После установления стабильности Ι3Α в эксципиентах и усиливающих проникновение веществах можно было проводить предварительный эксперимент по диффузии ш уПго в целях определения проникновения Ι3Α из некоторых простых составов через ороговевающий слой. Диффузор Франца был сконструирован для имитации физиологических и анатомических условий в коже ш 8Йи. Он представляет собой статическую ячейку с воздушной/жидкой фазой, которая содержит донорный отдел, приемный отдел и отверстие для забора образцов бокового рукава (см. фиг. 1). Хирургически вырезанную кожу помещают между двумя половинами, при этом ороговевающий слой расположен в сторону донорного отдела для обеспечения нанесения лекарственного средства.

Проводили первоначальный эксперимент по диффузии ш уПго с использованием простого состава Ι3Α в миглиоле. Прохождения лекарственного средства через ороговевающий слой не было совсем, подтверждая, что термодинамическая активность Ι3Α, полученная в миглиоле, не была максимальной. Этот

- 8 024152 состав использовали в более поздних экспериментах в диффузоре в качестве отрицательного контроля, а также он служил для подтверждения целостности ороговевающего слоя, поскольку если не происходит диффузии лекарственного средства из этого состава, то можно предположить, что ороговевающий слой остается неповрежденным.

Изготовление составов.

Состав Ι3Α получали в фосфатном буфере (рН 4,5) с добавлением β-циклодекстринов (СарЙ8о1®) с целью повышения растворимости и стабильности Ι3Α и проникновения лекарственного средства. Второй состав в ΌΜδΘ, известном усиливающем проникновение веществе, также получали для целей сравнения, а также получали состав в миглиоле, который служил в качестве отрицательного контроля. Исследовали диффузию Ι3Α через ороговевающий слой из этих составов.

Получали следующие составы:

Состав	Описание
1	IЗА/СарЫзо1® (30 мМ)/фосфатный буфер, рН 4,5
2	СарТ1Ео1® (30 ωΜ)/фосфатный буфер, рН 4,5, контроль
3	IЗА/миглиол
4	миглиол, контроль
5	13А/0М50/фосфатный буфер, рН 4,5
6	ОМЗО/фосфатный буфер, рН 4,5, контроль

В табл. 2 представлены % мас./мас. каждого из ингредиентов, находящихся в составах. Ингредиенты аккуратно взвешивали в герметизируемые стеклянные пробирки и сильно перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение нескольких часов при комнатной температуре.

Таблица 2

Состав Ι3Α для исследования диффузии ίη νίίτο

Состав	13А(300502)	СарИзо!®	{30 мМ)	РО4 буфер	Миглиол	ΌΜ3Ο	Всего
Масса (г)	% масс./ масс.	Масса (г)	% масс./ масс.	Масса (г)	масс./ масс.	Масса (г)	% масс./ масс.	Масса (г)	% масс/ масс.	Масса (г)	% масс./ масс.
1	0,0016	0, 08	0,1299	6,54	1,8956	95, 38	-	-	-	-	1,9875	100,00
2	-	-	0,1301	6, 05	2,0203	93, 95	-	-	-	-	2,1504	100,00
3	0,0016	0,08	-	-	-	-	2,0128	99, 92	-	-	2,0144	100,00
4	-	-	-	-	-	-	2,0000	100,00	-	-	2,0000	100,00
5	0,0017	0, 08	-	-	0,4035	20,04	-	-	1,6080	79, 87	2,0132	100,00
6	-	-	-	-	0,4112	20, 13	-	·“	1,6320	79, 87	2,0432	100,00

Выбор жидкости приемника.

2-Гидроксипропил-в-циклодекстрин (С^а8о1®, 1,38 мМ) в РО₄-буфере (рН 4,5) представлял собой жидкость приемника, используемую в этом исследовании в целях попытки поддержания условий погружения. Другие резервуарные жидкости, такие как системы этанол/вода были ограничены вследствие того, что обратная диффузия этанола через ороговевающий слой может привести к деградации Ι3Α, находящегося в составах.

Препарат кожи.

Свежий хирургически вырезанный образец кожи человека получали сразу после абдоминопластики. Донором была 5 6-летняя некурящая женщина европиоидной расы. Подкожный жир осторожно извлекали из образца кожи с использованием пинцета и скальпеля, а затем часть кожи погружали в воду при 60°С в течение 45 с. Затем кожу прикрепляли дермой вниз на пробковую доску и эпидермис (содержащий ороговевающий слой и живой эпидермис) осторожно удаляли из подлежащей дермы. Дерму удаляли и эпидермальную мембрану помещали на поверхность воды и отбирали на фильтровальную ватманскую бумагу по. 1. Полученный эпидермальный пласт тщательно сушили и хранили в горизонтально в алюминевой фольге при -20°С до применения.

Срез эпидермального пласта (стороной фильтровальной бумаги вверх) фиксировали и инкубировали в течение 4 ч при 4°С, погруженным в 0,1% мас./об. раствор трипсина. Затем кожу далее инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Ороговевающий слой физически удаляли осторожным встряхиванием зажима латеральными движениями. Полученный ороговевающий слой промывали два раза деионизированной водой, а затем 0,1% мас./об. антитрипсиновым раствором для блокирования активности фермента, а затем промывали два раза деионизированной водой. Ороговевающий слой сушили и хранили горизонтально в алюминиевой фольге при -20°С до применения.

Исследование диффузии в ячейке Франца.

Для проведения экспериментов по диффузии использовали индивидуально калиброванные диффузоры Франца со средней площадью диффузионной поверхности 0,56±0,05 см² и средним объемом приемника 1,79±0,06 мл. Ороговевающий слой (полученный как описано выше) промывали фосфатным бу- 9 024152 фером (рН 4,5), разрезали с помощью 10-бора и помещали в ячейки Франца (иллюстрированные на фиг. 1). Используемая жидкость приемника представляла собой 2-гидроксипропил-в-циклодекстрин (Сауа8о1®)/фосфатный буфер (рН 4,5) и ее помещали в ячейку Франца, перемешивали постоянно магнитной мешалкой и поддерживали при 37°С. Перед нанесением составов, мембранам позволяли уравновеситься с фазой приемника в течение 30 мин. На поверхность мембраны наносили неопределенную дозу каждого состава с использованием нагнетателя объемного типа Ршр1рейе®, и донорные камеры защищали посредством Рагай1ш®. Исследовали пять моментов времени забора образцов (1, 2, 4, 6 и 24 ч), при этом 200 мкл жидкости приемника осторожно забирали из рукава ячейки Франца; каждый извлеченный образец помещали в равный объем свежей (37°С) жидкости приемника. На протяжении эксперимента, любые потери жидкости приемника вследствие выпаривания из ячейки Франца замещали для поддержания постоянного объема. Образцы анализировали посредством ВЭЖХ (выше).

Анализ ВЭЖХ для диффузионного исследования ίη νίίτο.

Используемые хроматографические условия были следующими:

Колонка: НурегеагЬ (ТНсгтоОис51. Рйепотепех) (8/по. 3-34070);

Длина колонки: 100x4,60 мм;

Температура колонки: 25°С;

Защитная колонка: С18 Со1итЬи8 (Рйепотепех) (8/по. 202678);

Длина защитной колонки: 50x4,60 мм;

Подвижная фаза: 50% об./об. аммонийный буфер, рН 4,5/50% об./об. ацетонитрил;

Скорость потока: 1,0 мл/мин;

Длина УФ-волны: 230 нм;

Объем инъекции: 10 мкл;

Время пробега: 35 мин.

Результаты.

Стабильность Ι3Α в растворителях и эксципиентах.

В табл. 3 представлены показатели стабильности Ι3Α в различных системах растворителей. Стабильность Ι3Α в растворителях и эксципиентах через 14 суток (если нет иных указаний) при комнатной температуре количественно определяли в значениях соотношения изоформы Ь к изоформам а и с, при этом преобладание Ь приравнивалось к стабильности. Обобщенные результаты представлены в табл. 3. Полагают, что для эксципиента, в котором Ι3Α не является стабильным, другие подобные эксципиенты не будут пригодными.

Таблица 3

Обобщенные результаты исследования стабильности Ι3Α в различных растворителях и эксципиентах

Растворитель/Эксципиент	Стабильность?	Примечания
Ацетон	А
Ацетонитрил	Ί
Метанол	X	Формы изоформы а
Метанол/вода (70/30)	X	Форма изоформы а, а затем с
Вода	X	Форма изоформы а, а затем с
ΩΜ3Ο*	А
Фосфатный буфер, рН 4,5	Ί
Фосфатный буфер, рН 5,5	X	Формы изоформы а
Фосфатный буфер, рй 6,5	X	Форма изоформы а, а затем с
Фосфатный буфер, рН 7,0	X	Быстрое образование изоформы с
Аммонийный буфер, рН 4,5	у/
Минеральное масло	у/	Вязкие свойства обеспечивает сложность экстракции Ι3Α для анализа ВЭЖХ Осаждение Ι3Ά
Миглиол 810	у/
Полиэтиленгликоль	у/

- 10 024152

Пропиленгликоль	X	Образование а и с	изоформ
Масляная кислота	X	Сложность количественного определения вследствие множества помеховых пиков на хроматограмме. Представлена изоформа а, выступ на Ь (образование с)
2-гидроксипропил-рциклодекстрин (ΟθνθΞοΙ®) /Н2О	X	Большой пик для изоформы с
2-гидроксипропил-рциклодекстрин (Сауазо1®)/РО4, рН 4,5	4	Некоторое Ι3Α	осаждение
Тнееп 80/Зрап 80/Н2О
Тнееп 80/Зрап 80/РО4, рН 4,5	4
β-циклодекстрина сульфобутиловый эфир (СарТт5о1®) /Н2О**	X	Представлены а и с	изоформы
β-циклодекстрина сульфобутиловый эфир (Сар+ + зо1®)/РО4, рН 4,5**	4
Гиалуронат натрия/Н2О***	X	Представлена а	изоформа
Гиалуронат натрия/РО4, рН 4,5***	4

исследование в течение 10 суток “ исследование в течение 7 суток ★** исследование в течение 2 суток

Предварительное исследование диффузии ίη νίίτο.

В табл. 4 приведено сравнение прохождения между составами Σ3Λ, как определяют из общего количества проникающего Ι3Α на единицу площади. ΌΜδΟ представляет собой один из наиболее ранних и наиболее широко исследованных усиливающих проникновение веществ, и во многих экспериментах ίη νίίτο и ίη νίνο было показано, что он усиливает чрескожное проникновение многих лекарственных средств. По существу, ΌΜδΟ представлял собой пригодный эксципиент сравнения для подтверждения проникновения через ороговевающий слой Ι3Α. Однако с учетом высокотоксичных свойств этого растворителя и того факта, что он приводит к необратимому повреждению кожи, ΌΜδΟ не будут использовать в конечном составе. Не было выявлено проникновения Ι3Α в случае состава с миглиолом. Возможным объяснением этого отсутствия диффузии Ι3Α из миглиола через ороговевающий слой является то, что Ι3Α высокорастворим в этом эксципиенте.

Таблица 4

Сравнение проникновения между составами Ι3Α, как определяют исходя из общего количества проникающего Ι3Α на единицу площади (среднее значение±8.е.ш, η=3 и 4 соответственно)

Состав	(мкг/см£/ч)
13А/СарТ1зо1®/фосфатный буфер, рН 4,5	1,92+1,02
ТЗА/ЦМЗО/фосфатный буфер, рН 4,5	0,61+0,13

Результаты показывают, что Ι3Α диффундирует через ороговевающий слой (который образует основной барьер для диффузии большинства лекарственных средств) на поддающихся детекции уровнях.

Исследование стабильности при 4-8°С.

Исследовали стабильность Ι3Α в различных растворителях при 4-8°С. Исходный раствор 1,26 мг Ι3Α отвешивали и растворяли в 2 мл ацетона. Этот исходный раствор использовали для получения образцов для исследования стабильности следующим образом:

Аликвоты по 100 мкл исходного раствора переносили в отдельные стеклянные пробирки для ВЭЖХ посредством шприца Ηαιηίΐΐοη. с осторожным промыванием и высушиванием шприца между образцами. Образцы высушивали потоком воздуха, а затем добавляли 0,5 мл соответствующей тестируемой системы растворителей. Системы растворителей тестировали по три образца и они перечислены ниже:

1) 100% об./об. ацетон;

2) 100% об./об. ацетонитрил;

3) 100% об./об. метанол;

- 11 024152

4) 70% об./об. метанол: 30% мас./мас. вода;

5) 100% мас./мас. вода.

Также получали пустые образцы в трех экземплярах с использованием 100 мкл ацетона вместо исходного раствора. Затем пустые образцы высушивали и в каждую пробирку добавляли 0,5 мл ацетона. Все пробирки обжимали, закрывали посредством рагай1ш® и помещали при 4-8°С для исследования длительности стабильности. Анализ ВЭЖХ проводили в образцах на 0 сутки, 1 сутки, 5 сутки и 14 сутки исследования стабильности. Образцы для анализа ВЭЖХ получали, как описано ниже:

Образцы для исследования стабильности извлекали из 4-8°С и оставляли при температуре окружающей среды в течение 30 мин. Аликвоты по 100 мкл переносили в свежие стеклянные пробирки для ВЭЖХ с использованием шприца НатПЮп. при осторожном промывании и высушивании шприца между образцами. Для способствования высушиванию образцов, в каждую пробирку добавляли 0,5 мл ацетона, а затем образцы высушивали струей воздуха. Образцы разбавляли 1 мл ацетонитрила и анализировали посредством ВЭЖХ с использованием хроматографических условий, указанных выше.

Таким образом, Ι3Α является стабильным в ацетоне и ацетонитриле при 4-8°С, что отражается преобладанием пика Ъ для обоих растворителей в течение 14 суток. В протонных растворителях образование изомера а, а затем изомера с быстро возрастет.

Стабильность при различных значениях рН.

Стабильность Ι3Α исследовали при рН 4,5 в двух буферах, а именно монофосфат калия/дифосфат натрия и уксусная кислота/ацетат аммония в течение 24 ч при комнатной температуре. Анализ ВЭЖХ показал, что Ι3Α является стабильным в обоих буферах при рН 4,5 т.е. через 24 ч все еще существует преобладание изоформы Ъ (фиг. 1).

Стабильность Ι3Α исследовали при рН 5,5, 6,5 и 7,0 в течение 14 суток при комнатной температуре, и было выявлено ее снижение при повышении рН, т.е. к 14 суткам происходит образование изоформы а, а затем изоформы с.

Стабильность в ΌΜδΘ.

Ι3Α исследовали в отношении стабильности в ΌΜδΘ при комнатной температуре и при 37°С в течение 10 суток. Контрольный образец Ι3Α в ацетонитриле хранили при тех же условиях, что и тестируемый образец. Образцы анализировали посредством ВЭЖХ в начале эксперимента (0 сутки), через 48 часов (2 сутки) и снова через 10 суток.

Используемые хроматографические условия были следующими:

Колонка: НурегсагЪ (ΤΙιοπηοΟιιοίΤ РЬепотепех) (δ/ηο. 3-34070);

Длина колонки: 100x4,60 мм;

Температура колонки: 25°С;

Защитная колонка: С18 Со1итЪи8 (РЬепотепех) (δ/ηο. 202678);

Длина защитной колонки: 50x4,60 мм;

Подвижная фаза: 50% об./об. фосфатный буфер, рН 4,5/50% об./об. ацетонитрил;

Скорость потока: 1,0 мл/мин;

Длина УФ-волны: 230 нм;

Объем инъекции: 10 мкл;

Время пробега: 35 мин;

Время удержания: 15 мин, 24 мин.

Оказалось, что Ι3Α является стабильным в ΌΜδΘ при комнатной температуре и при 37°С в течение 10 суток.

Пример 2. Изопропаноловый гель, рН 6,5.

Исследовали стабильность Ι3Α Ъ в препарате изопропанолового геля (рН 6,5). Протокол был следующим.

Состав изопропанолового геля (рН 6,5)

Эксципиент	Плановая масса	Истинная масса	% мас./мас.
Глицерин	5,0000 г	5,0000 г	5,02
Циклометикон	0,5000 г	0,5000 г	0,50
Изопропиловый спирт	25,0000 г	25,0000 г	25, 10
СагЬоро!® 934	0,3000 г	0,3018 г	0,30
Пропиловый спирт	25,0000 г	25,0000 г	25,10
Вода	43,7000 г	43,7000 г	43,87
Этаноламин	до рН 6,5	0,1000 г	0,10
Всего:	100

СагЪоро1® диспергировали в воде и глицерине и растворяли нагреванием до 40°С на водяной бане. Затем в этот раствор добавляли пропиловый спирт. Циклометикон растворяли в изопропиловом спирте и

- 12 024152 этот второй раствор хорошо перемешивали с раствором еагЬоро1®, а затем при перемешивании добавляли воду до 100%. рН геля доводили до 6,5 капельным добавлением этаноламина. Изопропаноловый гель хранили при 2-8°С до применения.

Для исследования стабильности Ι3Α Ь в изопропаноловом геле (рН 6,5), изготавливали состав 0,02% мас./мас. Ι3Α Ь/изопропаноловый гель и разделяли на три образца для хранения при 2-8°С, КТР и 40°С. В регулярные моменты времени образцы анализировали в отношении стабильности Ι3Α Ь с точки зрения образования изоформы а в двух экземплярах, и эти результаты приведены на фиг. 2. Ι3Α Ь преобразуется в изоформу а, а затем в изоформу с. Возможно, это является следствием более высокого значения рН и наличия воды в изопропаноловом геле, что способствует этому превращению Ι3Α Ь в изоформы а и с.

Ι3Α Ь в смеси 30% мас./мас. изопропиловый спирт/цитратный буфер, рН 3,0.

Стабильность Ι3Α Ь (партия № 240902) в смеси 30% мас./мас. ΙΡΑ/цитратный буфер (рН 3), при хранении при 2-8°С и 40°С исследовали в двух экземплярах, и эти результаты приведены на фиг. 3.

Консерванты.

Различные консерванты исследовали в отношении их пригодности для применения в составах Ι3Α Ь в концентрациях, в которых они, вероятно, пройдут тест на эффективность консерванта. Первоначально консерванты получали в цитратном буфере (рН 3) и анализировали посредством ВЭЖХ для проверки пиков на хроматограммах, которые могут препятствовать анализу изоформ Ι3Α. Обобщенные результаты приведены в табл. 5.

Таблица 5

Анализ консервантов посредством ВЭЖХ

Консервант	% мае. /мае.	Примечания
Бензиловый спирт	1,0	Нет помеховых пиков
Метилпарабен (М.Р.)	0,2	Большой пик на протяжении области изоформы а
Пропилларабен (Р.Р.)	0,02	Большой пик на протяжении области изоформы а
М.Р./Р.Р.	0,2/0,02	Большой пик на протяжении области изоформы а
Феноксиэтанол	1,0	Большой пик на протяжении области изоформы а
Контроль в виде цитратного буфера	0	Нет помеховых пиков

Не желательно наличие многих помеховых пиков от консервантов на хроматограммах, поскольку это приводит к трудности анализа лекарственного средства в составах, и это может делать необходимым проведение отдельного анализа для консервантов.

Ι3Α Ь (0,05% мас./мас.) растворяли отдельно в выбранных консервантах (бензиловый спирт и феноксиэтанол), хранили при 2-8°С, КТР и 40°С и проверяли в отношении стабильности с точки зрения образования изоформы а в двух экземплярах через регулярные промежутки времени. Результаты этого исследования стабильности приведены на фиг. 4 и 5.

Результаты указывают на то, что бензиловый спирт является наиболее пригодным консервантом среди тестированных консервантов.

Изготовление составов Ι3Α Ь.

Изготавливали следующие три состава и соответствующие им плацебо:

Α) крем из 0,1% мас./мас. Ι3Α Ь/макроцетилового эфира с 1,0% мас./мас. бензиловым спиртом в качестве консерванта;

B) 0,1% мас./мас. Ι3Α Ь/30% мас./мас. ΙΡΑ/1,5% мас./мас. НЕС/1,0% мас./мас. бензиловый спирт/цитрат, рН 3;

C) 0,1% мас./мас. Ι3Α Ь/9,5% мас./мас. циклометикон/9,5% мас./мас. ΙΡΜ/1,0% мас./мас. бензиловый спирт/эластомер 10.

Исходный раствор Ι3Α Ь изготавливали в бензиловом спирте (табл. 6) и этот исходный раствор использовали для изготовления составов. Для плацебо, вместо исходного раствора Ι3Α Ь/бензиловый спирт использовали бензиловый спирт отдельно. Точные массы компонентов составов Ι3Α Ь подробно представлены в табл. 7-9. Составы и соответствующие им плацебо изготавливали следующим образом:

Состав А: крем из Ι3Α Ь/макроцетилового эфира.

Эмульгирующую мазь из макроцетилового эфира аккуратно отвешивали в стеклянную пробирку, а затем плавили на водяной бане при 60°С. Свежий приготовленный цитратный буфер (рН 3) аккуратно отвешивали в отдельную стеклянную пробирку, нагревали на водяной бане, а затем постепенно добавляли в расплавленную эмульгирующую мазь при постоянном перемешивании до охлаждения. Этот процесс

- 13 024152 приводил к крему на основе макроцетилового эфира. Для приготовления состава, Ι3Α Ъ в бензиловом спирте аккуратно отвешивали в стеклянную пробирку и в него постепенно и аккуратно отвешивали крем на основе макроцетилового эфира, при постоянном перемешивании.

Состав В: гель Ι3Α Ъ/30% ΙΡΑ.

Ι3Α Ъ/бензиловый спирт аккуратно отвешивали в стеклянную пробирку. Остальные компоненты аккуратно отвешивали в этот раствор в порядке ΙΡΑ, затем цитратный буфер, а затем НЕС, при сильном перемешивании между добавлениями.

Состав С: Ι3Α Ъ/силиконы.

Ι3Α Ъ/бензиловый спирт аккуратно отвешивали в стеклянную пробирку. Остальные компоненты аккуратно отвешивали в этот раствор в порядке эластомер 10, затем циклометикон, а затем ΙΡΜ, при сильном перемешивании между добавлениями.

Анализ состава.

Составы анализировали в начале исследования для проверки концентрации Ι3Α Ъ (мас./мас.) в составах и было выявлено, что она составляет 0,1% мас./мас. Ι3Α Ъ. Из этого общего содержания Ι3Α Ъ, в этих составах было менее 0,7% изоформы а и не было изоформы с. Составы проверяли в отношении появления изоформы а в момент завершения исследования и было показано, что они имеют менее чем 0,3% изоформы а при хранении при 2-8°С. Изоформа с не выявлялась ни в одном из составах.

Таблица 6

Исходный раствор Ι3Α Ъ/бензиловый спирт

	Планируемая масса	Истинная масса	% мас./мае.
ХЗА'Ь' (Партия № 240902)	0,0650 г	0,0650 г	0,15
Бензиловый спирт	0,6500 г	0,6547 г	99,85
Всего:	0,7150 г	0,7197 г	100,00

Состав А

Таблица 7

	Состав	Плацебо
Эксципиенты для основного крема	Планируемая масса	Истинная масса	% мас./мас.	Планируемая масса	Истинная масса	% мае./мас.
Эмульгирующая мазь на основе макроцетилового эфира	7,5000 г	7,5015 г	30,00	6,0000 г	6,0589 г	30,50
Цитратный буфер	17,5000 г	17,5030 г	70,00	13,8000 г	13,8049 г	69, 50
Всего:	25,0000 г	25,0045 г	100	19,8000 г	19,8638 г	100
Основной крем из макроцетилового эфира	19,8000 г	19,8860 г	98, 96	19,8000 г	19,8638 г	98, 99
Ι3Α 'Ь'/бензиловый спирт	0,2000 г	0,2088 г	1,04	0	0	0
Только бензиловый спирт	0	0	0	0,2000 г	0,2020 г	1, 01
Всего:	20,0000 г	20,0948 г	100,00	20,0000 г	20,0658 г	100,00

Таблица 8

Состав В

	Состав	Плацебо
Эксципиенты	Планируемая масса	Истинная масса	% мас./мас.	Планируемая масса	Истинная масса	% мас./мас. !
Ι3Α 'Ь1/бензиловый спирт	0,2000 г	0,2035 г	1, 02	0	0	0
Только бензиловый спирт	0	0	0	0,2000 г	0,2019 г	1, 01
ΙΡΑ	6, 0000 г	6,0027 г	29, 97	6,0000 г	6,0002 г	29, 99
Цитратный буфер рН 3	13,5000 г	13,5158 г	67,49	13,5000 г	13,5018 г	67,49
НЕС	0,3000 г	0,3040 г	1, 52	0,3000 г	0, 3029 г	1,51
Всего:	20,0000 г	20,0260 г	100	20,0000 г	20,0068	100

- 14 024152

Таблица 9

Состав С

	Состав	Плацебо
Эксципиенты	Планируемая масса	Истинная масса	% мае./мае.	Планируемая масса	Истинная масса	% мас./мас.
Ι3Α *Ь1/бензиловый спирт	0,2000 г	0,2011 г	1,00	0	0	0
Только бензиновый спирт	0	0	0	0,2000 г	0,2109 г	1,05
Циклометикон	1,9000 г	1,9040 г	9,51	1,9000 г	1, 9026 г	9,49
ΙΡΜ	1,9000 г	1,9068 г	9, 53	1,9000 г	1,9156 г	9, 56
Эластомер 10	16,0000 г	16,0026 г	79, 96	16,0000 г	16,0099 г	79, 89
Всего:	20,0000 г	20,0145 г	100	20,0000 г	20,0390 г	100

Стабильность изоформ Ι3Α в анализе систем растворителей в течение 72 ч.

Стабильность изоформ Ι3Α а, Ъ и с в трех системах образцов в течение 72 ч (эквивалентно максимально возможной длительности, при которой образцы могут находиться в автоматическом пробоотборнике в течение длительного анализа ВЭЖХ) подтверждали следующим образом. Получали свежие стандарты трех изоформ Ι3Α (приблизительно 100 мкг/мл) в ацетонитриле, смеси ацетонитрил/цитратный буфер (рН 3) и смеси ацетонитрил/аммонийный буфер (рН 4,5) и сразу анализировали посредством ВЭЖХ. Затем стандарты разделяли на три равных объема и помещали при 2-8°С, комнатной температуре и 40°С на 72 ч, а затем снова анализировали посредством ВЭЖХ. Результаты этого исследования представлены в табл. 10. Наибольшее превращение 13 А Ъ в изоформу а при комнатной температуре происходило в образце, изготовленном в 100% об./об. ацетонитриле, в то время как стандарт Ι3Α Ъ в смеси ацетонитрил/цитрат (рН 3) показал очень небольшое превращение в изоформу а даже при 40°С, подтверждая, что эта система растворителей может быть наиболее пригодной для обеспечения стабильности образцов на протяжении времени отбора проб.

Таблица 10

Стабильность изоформы а, Ъ и с в различных системах растворителей

Ацетонитрил Изоформа ’а'	Изоформа 'Ь'	Изоформа 'с1
Время	% 'а'	% ' Ь'	% ’ с 1	% ’а'	% ’Ь'	% ’ с ’	% 'а'	% ’Ь'	% ’с’
0	96, 82	2,24	0,29	0, 39	99,27	0	1,28	0,41	97, 30
72ч 2-8°С	90, 63	5,71	2, 55	3, 94	95,45	0	1, 62	0	96, 69
72ч КТР	86, 58	7,8	3, 65	5,83	93, 51	0	1,55	0,27	97,19
72ч 40рС	16, 36	47,01	35, 74	15,52	83, 35	0	0, 6	0	97,09
Ацетонитрил/Натрий 4 Изофо	-ацетатный буфер (рН ,5) рма ’а'	Изоформа 'Ь'	Изоформа 'с'
Время (ч)	% ' а ’	% ’Ь'	% ' с ’	% г а ’	% ’Ь'	% ' с'	% ’ а'	% ’Ь'	% ' с'
0	96, 65	2,16	0,23	0, 34	98,88	0, 01	1,34	0, 45	97,02
72ч 2-8°С	96, 47	2, 83	0	0, 63	99,02	0	1,41	0,27	97,17
72ч КТР	95,25	4,22	0	1,16	98,41	0	0,83	0	97,97
72ч 40°С	82, 51	16,62	0	6, 35	93,13	0	0	0	97,75
Ацетонитрил/Цитратный буфер (рН 3) Изоформа 'аг	Изоформа 'Ь'	Изоформа ’с’
Время (ч)	% 'а' I %’Ь’	% ’с’	% 'а'	% 'Ь'	% 'с'	% ’а'	% ’Ь'	% ’ С ’
0	97, 91	1, 63	0	0,13	99,64	0	1, 12	0,20	98,41
72ч 2-8°С	98, 31	1,46	0	0,18	99,49	0	0, 87	0,16	98,84
72ч РТР	98, 84	1,08	0	0,13	99,76	0	0,53	0	99,24
72ч 40°С	98,13	1,79	0	0,34	99, 63	0	0	0	98, 7

Пример 3.

Исследование рН-стабильности Ι3Α Ъ в гелях ΙΡΑ, изготовленных с цитратным буфером в диапазоне рН от 2,5 до 4,0 проводили при 2-8 и 40°С (ускоренное исследование стабильности).

- 15 024152

Материалы.

Материалы	Поставщик
Ι3Α Ь (ангелат ингенола) Партия По. 070303 Партия Νο. 0319	РерИп Аиз1гаИа	ЫтгРес),
Натрия дигидрата цитрат (класса ΙΙ5Ρ) ,	КаидПЁ Ш	ик
партия Р009243 Моногидрат лимонной кислоты из?), партия Р11115	(класса
Ледяная уксусная кислота,	серия	ВОН	ЬаЬогаДогу
К2953917 Ацетат натрия, серия ТА1044704		ЗиррЫез,	ЗК
Бензиловый спирт (класса 05Р)	серия	Мегск, Сеггаапу
Νο. К31593981
Изопропиловый спирт (класса серия Νο. К31802995310	из?),
ПаУгозо!® 250 НИХ, партия Νο. Ϊ	-0177	НопеумеИ ОК	апб ЗДатп,
Ацетонитрил для применения в ВЭЖХ	ПеЬег СЬет1са1з, (Ж
Деионизированная вода	МИПО, ОК

Способы.

Изготовление гелей Ι3Α Ъ и плацебо с использованием цитратного буфера с рН в диапазоне от 2,5 до 4,0.

Составы гелей ΙΡΑ с активным веществом и плацебо, изготовленные для исследования стабильности в диапазоне рН, приведены в табл. 11 и 12 соответственно. Большие количества плацебо изготавливали для упрощения измерения рН гелей с плацебо в 0 момент времени. Изготавливали меньшие количества активного геля, т.е. 30 г в каждом случае, поскольку количество лекарственного средства, доступного для исследования, было ограниченным. Предшествующие исследования стабильности, проведенные для геля ΙΡΑ с Ι3Α, в котором кажущееся значение рН для плацебо и активного геля подвергали мониторингу в течение 12 месяцев, показали, что нет заметных различий между этими двумя веществами. Более того, указанное кажущееся значение рН измеряли как для геля с активным веществом, так и для геля с плацебо. Таким образом, в начале исследования стабильности для определения кажущегося значения рН гелей, измеряли только рН гелей с плацебо. После гидратации в течение ночи, гели анализировали в момент времени Т=0 и определяли кажущиеся значения рН плацебо. Образцы разделяли равным образом в 7-мл пробирки из натриевого стекла для избежания периодического изменения температуры материала при отборе образцов в различные моменты времени и пробирки хранили при 2-8 и 40°С (ускоренное исследование стабильности) соответственно.

Таблица 11

Состав активных гелей ΙΡΑ, изготовленных с цитратным буфером в диапазоне рН от 2,5 до 4,0

Эксципиент	Планируемая масса (г)	Цитратный буфер рН 2,5	Истинные % масс. / масс.	Цитратный буфер рН 2,75	Истинные % масс./ масс.	Цитратный буфер рН 3, 0	Истинные % масс./ масс.	Цитратным буфер рНЗ, 5	Истинные % масс./ масс.	Цитратный буфер рН 4,0	Истинные % масс./ масс.
Ι3Α ΒΝ 070303	0,0300	0,03004	0,10	0,03003	0,10	0,03005	0,10	0,03003	0, 10	0,03000	0,10
Бензиловый спирт	0,2700	0,27112	0, 90	0,27055	0, 90	0,27060	0,90	0, 27278	0, 91	0,27193	0, 91
ΙΡΑ	9,0000	9,00340	30,00	9,01909	30,04	9,00107	30,00	9,00243	30,00	9,00158	30,00
Цитратный буфер	20,2500	20,25235	67,50	20,25345	67,46	20,25086	67,50	20,25061	67,49	20,2533	67,49
НЕС ННХ	0,4500	0,45063	1,50	0, 45041	1,50	0,45031	1,50	0, 45053	1,50	0,45041	1,50
Всего	30,0000	30,00754	100,00	30,02353	100,00	30,00289	100,00	30,00638	100,00	30,00722	100,00

Таблица 12

Состав гелей ΙΡΑ с плацебо, изготовленных с цитратным буфером в диапазоне рН от 2,5 до 4,0

Эксципиент	Планируемая масса (г)	Цитратный буфер рН 2, 5	Истинные % масс./ масс.	Цитратный буфер рН 2,75	Истинные % масс./ масс.	Цитратный буфер рН 3,0	Истинные % масс./ масс.	Цитратный буфер рН 3, 5	Истинные % масс./ масс.	Цитратный буфер рН 4,0	Истинные % масс./ масс.
Бензиловый спирт	0,9000	0,9070	0, 91	0,9003	0, 90	0,9046	0, 90	0,9036	0, 90	0,9042	0, 90
ΙΡΑ	30,0000	30,0035	30,00	30,0016	30,00	30,0233	30,00	30,0136	30,00	30,0201	30,01
Цитратный буфер	67,6000	67,6107	67, 59	67,6108	67, 60	67, 6400	67,59	67,6211	67, 60	67,6139	67,58
НЕС ННХ	1,5000	1,5022	1,50	1,5065	1,50	1,5086	1,51	1,5031	1,50	1,5064	1,51
Всего	100,0000	100,0234	100,00	100,0192	100,00	100,0765	100,00	100,0414	100,00	100,0446	100,00

Измерение кажущегося значения рН гелей ΙΡΑ с плацебо, изготовленных с использованием цитратного буфера в диапазоне рН от 2,5 до 4,0.

Кажущееся значение рН гелей ΙΡΑ с плацебо, изготовленных с использованием цитратного буфера с диапазоне рН от 2,5 до 4,0 измеряли с использованием рН-метра 1сп\уау 3320.

- 16 024152

Экстракция Ι3Α из гелей ΙΡΑ.

Лекарственное средство экстрагировали из гелей ΙΡΑ следующим образом. Один грамм каждого из гелей или соответствующих им плацебо аккуратно отвешивали в 10-мл мерную колбу в двух или трех экземплярах. Сначала образцы смешивали с 1 мл цитратного буфера (рН 3) сильным и повторяющимся перемешиванием на вихревой мешалке, установленной на максимальную скорость, а затем оставляли для встряхивания на орбитальном устройстве для встряхивания в течение 30 мин при 400 об/мин. Затем мерные колбы доводили до отметки объема ацетонитрилом для применения в ВЭЖХ и образцы снова сильно перемешивали повторяющимся перемешиванием на вихревой мешалке, установленной на максимальную скорость, а затем оставляли для встряхивания на орбитальном устройстве для встряхивания в течение 60 мин при 400 об/мин. Аликвоты переносили в пробирки для анализа посредством ВЭЖХ.

Экстракцию Ι3Α из геля проводили в трех экземплярах, т.е. три отдельных отвеса с двойными инъекциями в момент времени 0 и момент времени = три месяца (образцы при 2-8°С) и в двух экземплярах, т.е. два отдельных отвеса с двойными инъекциями для момента времени = одна неделя и четыре недели (образцы при 40°С).

Анализ ВЭЖХ.

Анализ проводили с использованием следующих систем и условий:

Инструменты.

Сепараторный модуль 0а1ег5 ЛШапсс 2695 §ерагайои8 Моби1е (δ/по. В988М4209М);

Детектор поглощения 0а1ег5 2487 Эиа1 λ Α^οΛαικ^ 0е1ес1ог (δ/по. Μ97487050Ν);

Сепараторный модуль 0а1ег5 Α11^аηсе 2695 Ό ЗерагаОощ Моби1е (δ/по. С98δΜ8039N);

Детектор поглощения 0а1ег5 2487 Эиа1 λ ΑЪδο^Ъапсе 0е1ес1ог (δ/по. Б02487106М);

Программное обеспечение Етро\уег Рго Етро\уег™.

Используемые хроматографические условия были следующими:

Колонки: НурегсагЪ (ТНегтоОне^. РЬепотепех) δ/по. 3-34070 и δ/по. 1034024Α;

Длина колонки: 100x4,60 мм;

Температура колонки: температура окружающей среды;

Защитные колонки: С18 Со1итЪи8 (РЬепотепех) δ/по. 202678 и δ/по. 74554-7;

Длина защитной колонки: 50x4,60 мм;

Подвижная фаза: 50% об./об. натрий-ацетатный буфер рН 4,5/50% ацетонитрил (об./об.);

Скорость потока: 1,0 мл/мин;

Длина УФ-волны: 2 30 нм;

Объем инъекции: 30 мкл;

Время исследования: 35 мин;

Температура в автоматическом пробоотборнике: 8±2°С;

Время удержания: 13±2 мин для изоформы а; 22±2 мин для изоформы Ъ; 23±2 мин для изоформы с; неопределенный пик с относительным временем удержания изоформы Ъ 0,93±0,02.

Результаты.

Измерение кажущегося значения рН гелей плацебо в 0 момент времени.

Результаты для измерения кажущегося значения рН для гелей с плацебо приведены в табл. 13. Измерений рН в какой-либо момент времени для стабильности не проводили.

Таблица 13

Измерение кажущегося значения рН гелей ΡΑ с плацебо (п=1)

Определение процентной чистоты пиков изоформ Ι3Α в активном геле.

Процентные чистоты пиков Ι3Α Ъ в гелях с активным веществом в начале исследования стабильности (Т=0), и после одной недели хранения при 40°С, четыре недели хранения при 40°С, и после трех месяцев хранения при 2-8°С, приведены в табл. 14, 15, 16 и 17 соответственно. Процентная частота пика Ι3Α Ъ составляла более 98%, в то время как процентная чистота пика изоформы а составляла менее 1,2% для всех гелей после трех месяцев хранения при -28°С. Для ускоренного исследования стабильности при 40°С, наибольшее снижение процентной чистоты пика Ъ в течение четыре недель наблюдали в геле с кажущимся значением, составляющим 4,74 для плацебо. Поскольку было показано, что Ι3Α Ъ превращается в изоформу а, образование изоформы а также исследовали в качестве маркера стабильности. Вычисляли повышение процентной чистоты пиков изоформы а от 0 момента времени после од- 17 024152 ной недели и четырех недель хранения при 40°С, и после трех месяцев хранения при 2-8°С, и эти результаты приведены в табл. 18.

Таблица 14

Процентная чистота пиков изоформ Ι3Α в активных гелях (п=3, среднее значение±стандартное отклонение, υΑΡ = неопределенный пик, РРТ = относительное время удержания) в 0 момент времени

рН цитрат- ного буфера ( + 0, 05}	Кажущееся значение рН геля с плацебо	Процентная частота пика
Изоформа ' а'	Изоформа ’Ь'	Изоформа ’ с ’	□АР ККТ ДЛЯ изоформы Ь’ 0,93+0,02	Общие другие ПАР
2, 50	3,07	0, 4410,03	99,2010,11	0,00 + 0, 00	0,20+0,04	0,16+0,07
2,75	3,34	0, 2410,06	99,70+0,09	0,0010,00	0,02 + 0,02	0,04 + 0, 04
3,00	3, 62	0, 5210,01	99,1610, 06	0,00+0, 00	0,14+0,02	0,19+0,06
3, 50	4,22	0,4710,02	99,36+0,10	0,00±0,00	0, 09+0, 03	0,08+0,04
4,00	4,74	0,44+0,03	99,30±0,10	0,00+0,00	0, 10 + 0, 01	0,16+0,07

определенный пик, РРТ=относительное время удержания) после одной недели хранения при 40°С

Таблица 15

Процентная чистота пиков изоформ Ι3Α в активных гелях (п=2, среднее значение±диапазон, υΑΡ = не-

рН цитратного буфера ( + 0,05)	Кажущееся значение рН геля с плацебо	Процентная частота пика
Изоформа г а 1	Изоформа ' Ь'	Изоформа 'с'	ПАР ККТ для изоформы 'Ь' 0,93+0,02	Общие другие ПАР
2, 50	3, 07	1,01 + 0,02	98,83+0,05	0,00+0,00	0,04+0,01	0, 13+0, 03
2,75	3, 34	0,53+0, 34	99, 06+0,06	0,0010, 00	0,06+0,01	0,35+0, 31
3, 00	3, 62	1,61±0,05	98,26+0,09	0,00+0,00	0,05+0,01	0,07 + 0,04
3, 50	4,22	2,56+0,04	97,27+0,22	0,00+0,00	0,04+0,04	0,12+0,15
4, 00	4,74	4,68+0,03	95,1210,07	0,00+0,00	0, 08 + 0, 02	0, 12+0, 04

Таблица 16

Процентная чистота пиков изоформ Ι3Α в активных гелях (п=2, среднее значение±диапазон, υΑΡ = неопределенный пик, РРТ=относительное время удержания) после четырех недель хранения при 40°С

рН цитрат- ного буфера (±0/05)	Кажущееся значение рН геля с плацебо	Процентная частота пика
Изоформа 'а'	Изоформа ’Ь'	Изоформа г с г	САР ККТ для изоформы ’Ь1 0, 9310, 02	Общие другие ПАР
2, 50	3, 07	2,70+0,01	96,24±0,09	0,00+0, 00	0, 0710,02	0, 99+0,06
2,75	3,34	2,91+0,02	96, 44 + 0,14	0 г00 + 0,00	0,06+0,02	0,59+0,11
3, 00	3, 62	4,74+0,02	94,75±0,12	0,00+0,00	0,08+0,02	0,44+0,09
3, 50	4,22	7,68+0,02	92,01+0,12	0,00+0,00	0, 0710,04	0,25+0,03
4,00	4,74	13,34+0,02	86, 4710, 14	0, 00+0,00	0, 06+0, 03	0, 1310, 09

- 18 024152 при 2-8°С

Таблица 17

Процентная чистота пиков изоформ Ι3Α в активных гелях (п=2, среднее значение±стандартное отклонение, υΑΡ = неопределенный пик, ККТ= относительное время удержания) после трех месяцев хранения

рН цитрат- ного буфера (±0,05)	Кажущееся значение рН геля с плацебо	Процентная частота пика
Изоформа ' а'	Изоформа 1Ь'	Изоформа 'с'	пар ккт ДЛЯ изоформы ’Ь’ 0, 93+0,02	Общие другие идр
2, 50	3, 07	0,56+0,01	99,34+0,03	0,00+0,00	0,00+0, 00	0,10+0,03
2, 75	3, 34	0,20+0,03	99,71+0,13	0,00+0, 00	0,00+0,00	0, 09+0,05
3, 00	3, 62	0,73+0, 01	99, 15 + 0,01	0,00+0, 00	0,00+0,00	0,12+0,01
3, 50	4,22	0,91 + 0,01	99,00+0,01	0,00+0, 00	0,00+0, 00	0,09+0,01
4,00	4,74	1,16+0,09	98,73 + 0,13	0,00+0, 00	0,00+0,00	0,11+0,05

Таблица 18

Вычисленное повышение процентной чистоты пиков изоформы а Ι3Α с 0 момента времени в гелях ΙΡΑ

рН цитратного буфера ( + 0,05)	Кажущееся значение рН геля с плацебо	Повышение процентной чистоты пика изоформы а с 0 момента времени (таблица 5):
Хранение при 40°С	Хранение при 2-3°С
		Т=1 неделя	Т=4 недели	Т~3 месяца
2,50	3,07	0,57	2,26	0,12
2,75	3,34	0,29	2,67	0,00
3,00	3, 62	1,09	4,22	0,21
3,50	4,22	2,09	7,21	0,44
4,00	4,74	4,24	12,90	0,72

Данные позволяют предположить, что рН оказывает эффект на образование изоформы а даже при хранении геля при 2-8°С в течение трех месяцев. Повышение процентной площади пика изоформы а 0,21% измеряли в геле, изготовленном с цитратным буфером с рН 3,00, по сравнению с повышением процентной площади пика изоформы а, составляющим 0,44%, для геля, изготовленного с цитратным буфером с рН 3,5. К Т=4 недели при 40°С различия между гелями с точки зрения повышения процентной чистоты пиков изоформы а увеличились.

Пример 4.

Масляные составы.

Материалы.

Материалы	Поставщик
Ι3Α Партия Νο. 0302	РерИп ЫтИей, Аиз+гаНа
Бензиловый спирт, РЬ Еиг, ВР, ΝΓ Партия Νο. К31593981 301	Мегск КСаА, Сегтапу
Сгобато! СТС/С (Триглицериды средней цепи) Партия Νο, ЕЕ03907	Сгойа, Згпдароге
Натрия дигидрата цитрат Серия Νο. 27833.261	Мегск СНетгса+з, ЧК
Лимонная кислота серия Νο. 111К0142	£1дта СЬепи.са1 Со., ОК
Ледяная уксусная кислота Ацетат натрия, серия 102363Р	ΒϋΗ ЬаЬога+огу ЗиррИез, ик
Ацетонитрил для применения в ВЭЖХ Трифторуксусная кислота (ΤΕΆ), серия Νο. 0392851	ЕгэНет Зс+епИ+хс, 0К
Деионизированная вода	М+Шроге, ик

Способы.

Выбор пригодных масел/эксципиентов.

Кунжутное масло, фракционированное кокосовое масло (триглицериды средней цепи), соевое масло, кукурузное масло и арахисовое масло, были идентифицированы в качестве носителей для парентерального введения. Каждый из них можно использовать вплоть до 100% уровня.

Другие эксципиенты, которые могут быть включены в парентеральные масляные составы, пред- 19 024152 ставлены ниже совместно с максимальными используемыми концентрациями.

Эксципиент (применение)	Максимальная используемая концентрация (%)
Бензиловый спирт (растворитель/консервант)	3, 0
Этанол (растворитель)	70
Бутилированный гидроксианизол (антиоксидант)	0, 03
Бутилированный гидрокситолуол (антиоксидант)	0, 03

Изготовление составов Ι3Α и плацебо для предварительных исследований стабильности.

Стерилизация фракционированного кокосового масла.

Приблизительно 50 г фракционированного кокосового масла (СКОЭЛМОБ ОТС/С) отвешивали в 100-мл коническую колбу (боросиликатное стекло), закрывали пробкой (пробка из борсиликатного стекла) и помещали внутрь предварительно нагретого сушильного шкафа (ОаНеикатрБ Но( Ъох Оуеп с вентилятором, размер 2) при 173±5°С в течение 1 ч. После этого перед применением маслу позволяли охладиться до комнатной температуры.

Добавление Ι3Α в стерилизованное масло.

Приблизительно 10 мг Ι3Α аккуратно отвешивали в 28-мл стеклянную пробирку и добавляли бензиловый спирт приблизительно до 20 мл (точная масса указана), который ранее фильтровали через 0,22мкм фильтр МББЬЕХ-ОУ. Эту смесь периодически встряхивали в течение приблизительно 2 ч до растворения Ι3Α в бензиловом спирте. К этой смеси добавляли приблизительно 9,79 г стерилизованного масла и встряхивали в течение приблизительно 5 мин до образования гомогенного раствора. Плацебо изготавливали аналогичным образом, за исключением того, что для компенсации Ι3Α использовали приблизительно 9,80 г (в противоположность 9,79 г) стерилизованного масла (точная масса указана). Точные массы и процентные составы в составах с активным веществом (Ι3Α) и плацебо представлены в табл. 19 и 20.

Таблица 19

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла с Ι3Α

	Планируемая масса	Планируемые % мае,/мае.	Истинная масса	* Истинные % мае./мае,
Ι3Α	10 мг	0,10	10,15 мг	0,101
Бензиловый спирт	200 мг	2,0	200,16 мг	1,998
Фракционированное кокосовое масло	9,79 г	97,9	9,80854 г	97,901
Всего	10 г	100	10,01885 г	100

^Округлено до 3 с!.р

Таблица 20

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла с плацебо

	Планируемая масса	Планируемые % мае./мае.	Истинная масса	★ Истинные % мае./мае.
Бензиловый спирт	200 мг	2,0	200,89 мг	1,971
Фракционированное кокосовое масло	9, 8 г	98,0	9,99313 г	98,029
Всего	10 г	100	10,19402 г	100

*Округлено до 3 с!.р

Условия хранения для составов Ι3Α и плацебо.

Аликвоты каждого состава (плацебо или активного вещества) распределяли в 2-мл флаконы из янтарного стекла с завинчивающейся крышкой (боросиликатное стекло), закрывали и хранили в двух условиях хранения, а именно 2-8°С и 25+2°С. Составы тестировали с использованием способа, описанного ниже, в течение периодов хранения вплоть до одного месяца, и включительно.

Предварительное исследование стабильности Ι3Α в фракционированном кокосовом масле.

В табл. 21 приведены суммарные данные для стабильности Ι3Α во фракционированном кокосовом масле, хранящемся при 2-8°С и 25°С в течение 43 суток. Данные стабильности указывают на то, что, как оказалось, не происходит повышения процентного количества изоформы а в процессе хранения при 28°С и 25°С после 43 суток, что сравнимо с процентным количеством изоформы а из свежей партии Ι3Α в 1=0 и 1=43 суток.

- 20 024152

Таблица 21

Процентное количество изоформы а в качестве процентного количества изоформы а и Ι3Α Ь, хранящихся в двух условиях в течение 43 суток

	% Ι3Α а
Свежий образец Ι3Α в ацетонитриле в нулевой момент времени	2,50
Момент времени 0 Момент времени 5 суток (2-8°С)	1,90 1,86
Момент времени 5 суток (25°С)	1, 97
Момент времени 20 суток (2-8°С)	1, 94
Момент времени 20 суток (25°С)	1, 93
Момент времени 28 суток (2-8°С)	1, 93
Момент времени 28 суток (25°С)	1,94
Момент времени 43 суток (2-8°С)	1,95
Момент времени 43 суток (25°С)	1,91
Свежий образец ТЗА в ацетонитриле в момент времени 43 суток	2,14

Результаты.

Не было значимых отличий (р>0,05) в площади пика и времени удержания изоформ Ι3Α а и Ь между образцами, инъецированными в ацетонитриле или смеси ацетонитрил/масло.

Из списка доступных масел, два считали пригодными для составления Ι3Α, а именно фракционированное кокосовое масло и кунжутное масло. Рекомендованная стерилизация кунжутного масла составляет 2 ч при 170°С, в то время для фракционированного кокосового масла она составляет 1 ч при 170°С. Это обладает преимуществами в отношении количества времени и энергии, потраченных для изготовления состава. Вследствие нестабильности Ι3Α при нагревании (экспериментально показано, данные не представлены), масло необходимо стерилизовать отдельно и Ι3Α добавлять в асептических условиях (с фильтрацией) в виде раствора, растворенного в бензиловом спирте. Было выявлено, что материал фильтра, а именно фильтр 0,22-мкм МГЬЬЕХ-СУ, является пригодным для фильтрации смеси ГА/бензиловый спирт, однако адсорбцию Ι3Α на мембрану фильтра, еще необходимо исследовать. Если желательно, вследствие относительно низкой вязкости этого масла (приблизительно 30 мП по сравнению с кунжутным маслом, которое обладает вязкостью приблизительно 44 мП), также состав можно получать ш δίΐιι со смесью ВА/бензиловый спирт и полный состав стерилизовать фильтрацией.

Пример 5. Пероральные составы.

Выбирали ряд эксципиентов для буккальных составов, и 17 неводных составов изготавливали и визуально оценивали в отношении консистенции и сольватации.

Множество полимеров представляли собой потенциальные мукоадгезивные носители. Вследствие присущей нестабильности Ι3Α в водных системах, исследованные составы были неводными, с замещением глицерина и полиэтиленгликоля (РЕС) водной фазой.

Материалы	Поставщик
Ι3Α Партия Νο. 0319	РерИп ЫтИесЗ, АизРгаНа
Бензиловый спирт, РН Еиг, ВР, ΝΓ Партия Νο. К31593981 301	Мегск КСаА, Сегтапу
Полиэтиленгликоль 400 (РЕС 400) Партия по. 8.17003.1000	Мегск КСаА, Сегтапу
Глицерин Партия по. 121К0152 Лимонная кислота Партия Νο. 111К0142 Свиной муцин - III тип Партия по. 68Н7480	31дта СНет1са1 Со., ик
Карбопол 934 Партия по. 15885	δετνθ, Сегтапу
Метилцеллюлоза (МС) Партия по. 404006/1	Писа, ик
Гидроксиэтилцеллюлоза НХ (НЕС) Гидроксипропилцеллюлоза (НР)	Негси1ез, 08А
Метанол для применения в ВЭЖХ Трифторуксусная кислота (ТЕА), серия по. 0392851	ПэЬег 5οίεηϊί£ίο, ЧК
Деионизированная вода (18.2М Ом см)	МПНроге, иК

- 21 024152

Способы.

Предварительный визуальный скрининг составов плацебо.

Исходно изготавливали семнадцать составов плацебо и подвергали их визуальному скринингу в отношении консистенции и сольватации (табл. 22). В кратком изложении, требуемые количества РЕО 400 и карбопола 934 перемешивали в 28-мл стеклянных пробирках в течение 10 мин с помощью шпателя и другие ингредиенты добавляли в следующем порядке: глицерин, бензиловый спирт и метилцеллюлоза или НЕС или НРС. Затем составы смешивали с помощью мешалки δ^1νе^8οη 14ΡΤ при приблизительно 10000 об/мин в течение приблизительно 2-3 мин. Перед визуальным скринингом все смешанные составы плацебо оставляли для растворения в течение ночи (>24 ч).

Таблица 22

Композиция составов плацебо для визуальной оценки

	Номер состава/% мас./мас- добавленного эксципиента
Эксципиент	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
РЕО 400	26,0	25, 0	26, 0	26, 5	25, 0	26,0	26,8	26,5	27,0	27,5	27,0	28,0	26,5	26,5	26,0	26,5	26,0
Глицерин	70,0	70,0	70, 0	70, 0	70, 0	70,0	70, 0	70,0	70,0	70,0	70,0	70,0	70,0	70,0	70, 0	70,0	70,0
Бензиловый спирт	1,0	1, 0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1, о	1,0	1,0	1, 0
Метилцеллюлоза	1,0	1, о					0,2	2,0	1,0	1,0				1,0	1,5
Карбопол	2,0	3,0	2,0	1,5	3,0	2,0	2,0	0, 5	1,0	0, 5	1, 0	0, 5	0, 5	1, 5	1,5	1,5	1,5
НЕС			1,0	1,0	1,0
НРС						1,0					1, 0	0,5	2, 0			1,0	1,5

Реологический скрининг составов плацебо (мукоадгезия).

Одним подходом для исследования мукоадгезии является реологическая охарактеризация мукоадгезивной поверхности контакта. В ее основе лежит предположение, что степень взаимного проникновения можно подвергать детекции измерением различий в реологических параметрах между полимерными гелями и их смесями с муцином. Синергическое повышение вязкости было предложено в качестве показателя прочности биологического адгезионного сцепления. На основании визуального скрининга было выбрано пять составов плацебо, исходя из вязкости и сольватации, для дальнейшей реологической оценки с использованием свиного муцина. Выбранные составы приведены в табл. 23.

Таблица 23

Составы, выбранные для реологического скрининга

Изготовление образцов для реологической оценки.

Изготовление свиного муцина.

В кратком изложении, 15 г порошка свиного муцина отвешивали в стакан и доводили до 150 г с использованием деионизированной воды до конечной концентрации 10% мас./мас. муцина. Смеси позволяли гидратироваться при 2-8°С в течение приблизительно 2-3 ч. Гидратированный муцин далее разбавляли деионизированой водой с получением конечной концентрации 5% мас./мас. муцина в деионизированной воде. Смесь оставляли для гидратации в течение ночи в холодильнике при 2-8°С.

Изготовление смеси состав/муцин.

Выбранные составы (табл. 23) изготавливали, как описано выше. В каждый состав добавляли равную массу 10% мас./мас. муцина и осторожно перемешивали шпателем. Смесь оставляли для гидратации при 2-8°С в течение ночи. Кроме того, выбранные составы также разбавляли (50:50 мас./мас.) деионизированной водой и оставляли для гидратации в течение ночи в холодильнике при 2-8°С.

Процесс динамического (осцилляционного) реологического тестирования.

Реологический скрининг проводили с использованием реометра Сагпшеб ί','δα. Приблизительно 0,5 г тестируемого образца помещали между платформой и пластиной с параллельным расположением. После сдавливания образца между платформой и плитой, любой избыток образца осторожно удаляли с

- 22 024152 использованием шпателя в правых углах по отношению к геометрической форме. Каждый образец тестировали всего пять раз, с получением механических спектров. Полученные конечные параметры С', С и 1аи δ использовали для оценки мукоадгезивной прочности составов, где С' представляет собой модуль упругости, С представляет собой модуль вязкости и 1аи δ представляет собой соотношение С' и С.

Оптимизация и изготовление выбранных составов с активным веществом и плацебо.

После реологического тестирования было выбрано два состава для дальнейшей оптимизации (составы 16 и 17) в отношении изготовления партии состава для исследования стабильности. Оптимизированный процесс изготовления использовали для получения партий активного вещества (содержащего Ι3Α) и плацебо (по 25 г каждого). На фиг. 6 представлено изготовление состава 16 активного вещества и плацебо с планируемыми количествами используемых эксципиентов/лекарственного средства. В кратком изложении, требуемое количество карбопола 934 добавляли к РЕС 400 в боросиликатную бутыль и нагревали до 50°С в течение приблизительно 2 ч до полного растворения смеси. Эту смесь охлаждали до комнатной температуры; добавляли требуемое количество глицерина и смесь нагревали до приблизительно 60°С в воде на водяной бане в течение 2 ч до образования гомогенной пасты. Добавляли требуемое количество НЕС и перемешивали до охлажденной смеси с использованием смесителя δίΙνβΓδοη Ь4КТ, установленного приблизительно на 10000 об/мин в течение 2-3 мин. Затем этой смеси позволяли полностью раствориться в течение ночи (приблизительно 12 ч) при комнатной температуре. Как показано на фиг. 6, это приводит к основному составу.

Активный состав изготавливали первоначальным растворением Ι3Α в бензиловом спирте. Требуемое количество смеси ПА/бензиловый спирт добавляли к растворенному основному составу и осторожно перемешивали шпателем с получением конечной концентрации 0,1% мас./мас. Ι3Α. Аналогично, изготавливали состав плацебо добавлением бензилового спирта в растворенную смесь, и осторожно перемешивали. Состав 17 изготавливали аналогичным образом. В табл. 24 представлены планируемые % мас./мас. смеси эксципиенты/ПА в составах активного вещества и плацебо.

Приблизительно 1 г составов плацебо и активного вещества разделяли на аликвоты в 2-мл флаконы с завинчивающейся крышкой и помещали для исследования стабильности при 2-8, 25 и 40°С (последнюю температуру использовали для краткосрочных ускоренных исследований стабильности).

Таблица 24

Планируемые % мас./мас. (до 1 ά.ρ.) в оптимизированных составах активного вещества и плацебо

	Состав 16	Состав 17
Эксципиент/лекарственное средство	Активное вещество	Плацебо	Активное вещество	Плацебо
РЕС 400	26,5	26, 5	26, 0	26, 0
Карбопол	1, 5	1,5	1,5	1,5
Глицерин	69,9	70, 0	69, 9	70, 0
НРС	1, 0	1,0	1,5	1,5
Бензиловый спирт	1, 0	1, 0	1, о	1, о
Ι3Α (0319)	0,1		0, 1

Анализ ПА в составе.

Экстракция Ι3Α из активного состава.

Для оценки лекарственного продукта в целях оценки деградации Ι3Α Ъ в изоформу а (чистота хроматографического пика) был проведен способ экстракции. Экстракцию Ι3Α из активного состава проводили следующим образом (указанный процесс также использовали для состава плацебо). В кратком изложении, приблизительно 1 г состава аккуратно отвешивали в 10-мл мерную колбу, а затем добавляли 1 мл цитратного буфера (рН 3). Смесь осторожно встряхивали рукой в течение приблизительно 5 мин до гомогенного состояния и объем доводили метанолом для применения в ВЭЖХ. Затем колбу встряхивали на механическом устройстве для встряхивания в течение приблизительно 2 ч. Содержимое колбы переносили в 15-мл полипропиленовую пробирку и центрифугировали в течение 5 мин при 2200 об/мин. Супернатант разделяли на аликвоты в пробирки для ВЭЖХ и анализировали.

Предварительные данные по выделению (не представлены) указывают на то, что приблизительно 80% или более Ι3Α Ъ было выделено из состава с активным веществом, и более существенно, ни один из эксципиентов не оказывал влияния в составе.

Способ ВЭЖХ.

Способ анализа для исследования Ι3Α в буккальном составе представлен ниже.

Колонка: симметричная, С18 - 5 мкм (^а1ег§) (δ/ηο. Т636515 07, Ρ/ηο. \УЛТ054205);

Длина колонки: 150x3,90 мм;

Температура колонки: 30°С;

Защитная колонка: симметричная, С18 - 5 мкм (^а1ег§) (Ρ/ηο. ^ΑΤ054225);

Длина защитной колонки: 20x3,90 мм;

Подвижная фаза: 0,02% об./об. ΤΡΑ в воде (А); 0,02% об./об. ΤΡΑ в ацетонитриле (В), А:В; 50:50

- 23 024152 (исходный состав) (градиент, см. таблицу ниже);

Скорость потока: 1,0 мл/мин;

Длина УФ-волны: 230 нм (ΡΌΑ);

Объем инъекции: 10;

Время исследования: 20 мин;

Температура автоматического пробоотборника: 8°С.

Образцы и плацебо тестировали в нулевой момент времени. Приблизительно через 1-2 недели образцы, хранящиеся при 40°С, также тестировали в целях получения некоторых данных по ускоренному исследованию стабильности.

Результаты.

Визуальный скрининг.

Визуальный скрининг проводили количественно и он представляет собой относительно эффективный способ предварительного скрининга ряда составов в отношении вязкости и сольватации. Составы плацебо оценивали два независимых эксперта и отбраковывали их на основе слишком высокой или слишком низкой вязкости. Более того, любой состав, который не был растворен полностью, также отбраковывали. Было совершенно очевидно, что в соответствии со способом изготовления, концентрация карбопола 934 более 1,5% мас./мас. приводит к неводным гелям, которые являются слишком вязкими и/или не полностью растворенными. Снижение количества карбопола 934 до 0,5% мас./мас. и добавление метилцеллюлозы в концентрации 2,0% мас./мас. приводит к гелю низкой вязкости. Однако повышение концентрации карбопола 934 до 1,0% мас./мас. и одновременное снижение концентрации метилцеллюлозы до 1,0% мас./мас., тем не менее, приводит к гелю, который обладает низкой вязкостью. Исходя из визуальных наблюдений, будет понятно, что добавление метилцеллюлозы не влияет на вязкость значительно, по сравнению с добавлением карбопола 934. Однако было показано, что метилцеллюлоза обладает мукоадгезивными свойствами и, таким образом, были получены дополнительные составы, которые содержали 1,0 и 1,5% мас./мас. метилцеллюлозу в сочетании с 1,5% мас./мас. карбополом 934. Визуальная оценка этих составов показала, что они являются гомогенными и обладают требуемой консистенцией для дальнейшей оценки. Аналогично, было выявлено, что НРС не влияет на вязкость по сравнению с добавлением карбопола 934. Однако поскольку НРС также добавляют в качестве потенциального мукоадгезивного вещества, было выявлено, что составы, содержащие НРС в концентрации 1,0 и 1,5% мас./мас., совместно с карбополом 934 в концентрации 1,5% мас./мас. являются визуально приемлемыми для дальнейшей реологической оценки. Также было выявлено, что состав 4 является визуально приемлемым в отношении вязкости и сольватации, и он включал НЕС (другой потенциальный мукоадгезивный полимер). Таким образом, пять составов (состав 4, 14, 15, 16 и 17) реологически оценивали в отношении их мукоадгезивной прочности с использованием свиного муцина.

Реологическая оценка составов 4, 14, 15, 16 и 17.

Модуль упругости О' представляет собой показатель устойчивости образца к упругой деформации (т.е. он отражает связанность полимерной сети) и О представляет собой показатель устойчивости образца к вязкой деформации.

Средние значения О' и О при 5 Гц, усредненные для 5 образцов, получали на основании конечных данных для возможности сравнения между различными составами. Выражение, которое позволяет определение синергических различий в значениях О' и О между смесью состав/муцин и отдельными компонентами этой смеси, приведено в уравнении 1. Чем больше относительные показатели О', тем больше взаимодействие состава с муцином.

—. О (Состве/Мучин) (С (Состав) + Сг (Мучим))

Относительный О =-1-- Уравнение 1

О' (Состав.) +с (Муцин)

Сходное уравнение можно использовать для вычисления О. 1ап δ вычисляли с использованием относительных величин О' и О с использованием уравнения 2.

_ Средний относительный О Уравнение 2 ~~ Средний относительный θ'

На фиг. 7 представлены относительные показатели О' и О для всех пяти тестируемых составов, и на фиг. 8 представлены соответствующие значения 1ап δ.

Исходя из реологической оценки, был выявлен следующий порядок повышения мукоадгезивной прочности: состав 17 > состав 16 > состав 14 > состав 15 > состав 4. Однако составы 14 и 15 показали большие отклонения (как выявили вследствие больших стандартных отклонений). Это может быть следствием негомогенных взаимодействий этих составов с муцином. Более того, также было выявлено, что О', полученный для составов в деионизированной воде, обладает большими отклонениями, указывая, таким образом, на то, что эти составы обладают негомогенной гидратацией. Было выявлено, что состав 4 обладает наибольшими значениями О' при смешивании с муцином, однако относительное значение О' было значимо ниже (р<0,05) по сравнению со всеми другими тестируемыми составами. Это было объяснено за счет того факта, что значения О' для состава 4, диспергированного в воде, были значительно бо- 24 024152 лее высокими по сравнению со всеми составами, диспергированными в воде. Оказалось, что состав 4 приводил к относительно более хорошему вязкоупругому гелю в воде (по сравнению с другими составами в воде), однако, по-видимому, он обладает относительно небольшим взаимодействием с муцином, поскольку относительное значение С', которое устраняет эффект состава (а также эффект муцина), было значительно более низким. Исходя из относительных значений С', составы 16 и 17 показали наибольшее взаимодействие со свиным муцином, что предполагает, что эти два состава можно использовать в качестве потенциальных мукоадгезивных составов. Составы 14 и 15 показали небольшое взаимодействие с муцином, однако гидратация/взаимодействие этих составов могут быть негомогенными, исходя из больших стандартных отклонений. Состав 4 показал наименьшее относительное значение С' и, таким образом, наиболее низкое взаимодействие. Соответствующие значения 1ап δ представляют собой относительный показатель вязкоэластичности, более низкое значение 1ап δ указывает на относительно более высокое переплетение и, наоборот, более высокое значение 1ап δ указывает на относительно низкое переплетение (вследствие относительно большего количества вязкого компонента) и, таким образом, подтверждает эти наблюдения.

Оптимизация и изготовление выбранных составов с активным веществом и плацебо.

Процесс оптимизации проводили в целях снижения времени изготовления составов от приблизительно 24 ч до приблизительно 12 ч. Составы 16 и 17 были выбраны для оптимизации и исследований стабильности.

Анализ ВЭЖХ составов Ι3 Α.

В табл. 25 представлена процентная чистота пиков для Ι3Α Ъ, а также процентная площадь для изоформы а и других неопределенных пиков (ЦАР), в составах 16 и 17 в нулевой момент времени. Также для сравнения представлена процентная чистота пика образца 0,1% мас./мас. геля ΙΡΑ с Ι3Α в нулевой момент времени. Все пики для буккальных составов вручную интегрировали и сравнивали с соответствующими составами плацебо.

Таблица 25

Процентная чистота пиков составов в нулевой момент времени

Состав	% Чистота пика ТЗА'Ь’	% изоформы ’аг	% Общие иАР
16	99,6	о, з	0,1
17	99,7	0,3	0,0
0,1% мас./мас. гель ΙΡΑ	99,2	0,5	0,3

В табл. 26 представлена процентная чистота пиков для Ι3Α Ъ, а также процентная площадь для изоформы а и других неопределенных пиков (ЦАР) в составах 16 и 17 приблизительно через две недели после хранения при 2-8°С и 40°С (ускоренное исследование стабильности). Также для сравнения в таблице представлена процентная чистота пика 0,1% мас./мас. геля ΙΡΑ с Ι3Α, хранящегося при 40°С в течение одной недели. Все пики для буккальных составов вручную интегрировали и сравнивали с соответствующими составами плацебо.

Таблица 26

Процентная чистота хроматографических пиков составов в момент времени приблизительно 1-2 недель, хранящихся при 2-8 и 40°С

	% Чистота пика Ι3Α ' Ь'	% изоформы 'а'	% Общие ОАР
Состав	2-8°С	40°С	2-8°С	40°С	2-8°С	40°С
16	99,8	99,2	0,2	0,4	0,0	0,4
17	99,8	99, 3	0,2	0,4	0,0	0,3
*0, 1% мас./мас. гель ΙΡΑ	МО	98,3	ΝΩ	1,6	ΝΟ	0,1

* Чистота пика через одну неделю; Νϋ - не определен

Оказалось, что нет заметных отличий между процентной чистотой пика Ι3Α в любом из составов в нулевой момент времени и исходным значением на рецептуре (99,3% Ι3Α Ъ, данные РВ21001/24). Более того, процентная площадь изоформы а на рецептуре составляла 0,40%, что является сходным с процентной областью пика для изоформы а в нулевой момент времени (табл. 25).

Не было заметного повышения процентного количества изоформы а после приблизительно 1-2 недель хранения буккальных составов при 2-8°С (табл. 26), в то время как повышение процентного содержания изоформы а наблюдали для всех буккальных образцов, хранящихся при 40°С. Однако повышение процентного количества изоформы а, выявленное для 0,1% мас./мас. геля ΙΡΑ, было выше (1,60%) после хранения в течение 1 недели при 40°С. Исходя из процентной чистоты пиков, эти предварительные данные, по-видимому, могут указывать на то, что буккальные составы Ι3Α, по меньшей мере, настолько же стабильны, как и 0,1% гель ΙΡΑ с Ι3Α и, возможно, являются более стабильными.

- 25 024152

Пример 6. Составы полоксамеров. Исследовали четыре состава полоксамеров. Материалы.

Материал	Поставщик
Ι3Α Ъ Партия Νο. 0319	Ρερϋη Ι,ίιηϊΐβά, АизРгаНа
Моногидрат лимонной кислоты ВР Серия по. К11115	КаидЫ: ΙΛά, ик
Трицатрат натрия дигидрат ВР, серия по. К0092143	КаидЬР ΙΛά, ик
Деионизированная вода	МППроге, ЧК
Полоксамер 407 (Ьибго1 Р127) Серия по. ΜΡΤΥ562Β	ВАЗГ, Сегтапу
Этанол (Апа1аг) 99,7-100% масс./масс., серия по. В354007	вон, ик
Полиэтиленгликоль 400 (РЕС 400) Серия по. 53820403 312	Мегск, Сегтапу
Пропиленгликоль Серия по. К32254378 336	Мегск, Сегтапу
Ацетонитрил (АСЫ) для применения для градиента ВЭЖХ, серия по. 0309807	ПзПег ЗНепННс, ик
Трифторуксусная ксилота (ТГА) Серия по. 0263747	ПзЬег СЬеттсаХз, ОК
Бензиловый спирт РО Еиг, ВР, ЫГ Партия Νο. К31593981 301	Мегск КСаА, Сегтапу

Способы.

Выбор эксципиентов.

Перед исследованием предварительного состава было идентифицировано несколько пригодных эксципиентов для составов полоксамеров, и они перечислены ниже, совместно с максимальными рекомендованными концентрациями.

Эксципиенты				Концентрация
Пропиленгликоль	75	,2%	мае./об.	(в/м);	60,0%	об./об. (в/в)
*РЕ2 400	65	, 0%	мае./об.	(в/в) ,·	18% об	./об (в/м)
Бензиловый спирт	3,	0% мас./об.	(в/в)
Лимонная кислота	1,	0%	мае./об.	(в/м)
Цитрат натрия	2,	85%	мае./об.	(в/м)

* использовали для контрольного состава

Изготовление составов для реологических исследований.

Различные составы полоксамера 407 с плацебо изготавливали с использованием эксципиентов, перечисленных выше, в целях оценки реологических свойств.

Изготовление цитратного буфера, рН 3.

Моногидрат лимонной кислоты (ММ 211 г/моль) изготавливали в деионизированной воде в концентрации 0,1 М. Раствор трицитратацитрата натрия дигидрата, 0,1 М, (ММ 294,1 г/моль) также изготавливали в деионизированной воде. Раствор цитратного буфера, рН 3, изготавливали смешиванием 40% об./об. раствора моногидрата лимонной кислоты (0,1 М), 10% об./об. раствора трицитрата натрия дигидрата (0,1 М) и 50% об./об. деионизированной воды и конечное значение рН измеряли с использованием рН-метра (3320 ΙΕΝνΑΥ).

Изготовление основных растворов полоксамера 407.

Предварительные исследования показали, что растворы полоксамера 407 в диапазоне концентраций между 18-20% мас./мас. являются пригодными для обеспечения диапазона вязкостей с варьирующими значениями ст!. Растворы полоксамера изготавливали с использованием холодного способа, описанного 8сЬто1ка (1972).

В кратком изложении, требуемые количества полоксамера 407 (табл. 27) добавляли либо в цитратный буфер, рН 3, либо в пропиленгликоль/цитратный буфер, рН 3, в 100-мл стеклянных бутылях из боросиликатного стекла Эигап.

Пропиленгликоль/цитратный буфер, рН 3, предварительно изготавливали взвешиванием соответствующего количества пропиленгликоля и цитратного буфера рН 3 (табл. 27) и встряхивания в течение 1-2 мин до визуально гомогенного состояния. Бутыли Этап, содержащие ингредиенты закрывали и помещали на баню лед/вода на 4 ч с частым встряхиванием каждые 15 мин, до образования прозрачных растворов. Эти растворы хранили при 2-8°С до тех пор, пока не потребуются.

- 26 024152

Процесс стерилизации.

Поскольку гели требуются для терапии внутри очага повреждения, важной является стерилизация. В целях достижения стерилизации, изготовленные гели подвергали автоклавированию с использованием способа ВР, где приблизительно 100 г каждого из гелей, приведенных в табл. 27, помещали в 100-мл бутыли Эигап и подвергали автоклавированию в течение 15 мин при 121°С. После этого процесса, гели оставляли охлаждаться при комнатной температуре, а затем хранили при 2-8°С до тех пор, пока не потребуются.

Таблица 27

Истинные и планируемые количества основных растворов полоксамера

	ΡοΙοχ-01	Ро1ох-02	Ро1ох-рд-01	Ро1ох-рд-02
Эксципиенты	Планируемая	Истинная	Планируемая	Истинная	Планируемая	Истинная	Планируемая	Истинная
	масса/г	масса/г	масса/г	масса/г	масса/г	масса/г	масса/г	масса/г
Полоксамер 407	18	18,03366	20	20,0138	18	18,04115	20	20,02152
Пропиленгликоль					10	10,01009	10	10,01882
Цитратный буфер рН 3	82	82,1126	80	80,1427	72	72,1025	70	70,0849
Всего	100	100,146	100	100,157	100	100,154	100	100,125

Таблица 28

Истинные и планируемые количества составов плацебо для реологической оценки

	Ро1ох-01-плацебо	Ροϊοχ-02-плацебо	Ро1ох-рд-01-плацебо	Ро1ох-рд-02-плацебо
Эксципиенты	Планируемая масса/г	Истинная масса/г	Планируемая масса/г	Истинная масса/г	Планируемая масса/г	Истинная масса/г	Планируемая масса/г	Истинная масса/г
Ро1ох-01	9,90	9,90671
Ро1ох-02			9,90	9,90458
Ро1ох-рд-01					9,90	9,90885
Ро1ох-рд-02							9, 90	9,90033
Бензиловый спирт/Цитратный буфер	0,10	0,10173	0, 10	0,10115	0,10	0,10027	0,10	0,10161
Всего	10,0	10,00844	10, о	10,00573	10,0	10,00912	10,0	10,00194

Изготовление составов полоксамера с плацебо для реологической оценки.

Вследствие нестабильности Ι3Α при стерилизации нагреванием, составы, содержащие Ι3Α, необходимо изготавливать растворением Ι3Α в пригодном растворителе с последующим асептическим добавлением (т.е. асептической фильтрацией) к основным растворам полоксамера после автоклавирования. Выбранный растворитель представлял собой бензиловый спирт. Однако для реологической оценки изготавливали только составы полоксамера с плацебо, содержащие бензиловый спирт, вследствие ограниченной доступности Ι3Α.

Изготовление раствора бензиловый спирт/цитратный буфер, рН 3.

Количество цитратного буфера, добавленного к бензиловому спирту, составляло 2,5% мас./мас., что было ниже растворимости цитратного буфера рН 3 в бензиловом спирте. В кратком изложении, приблизительно 0,5 г цитратного буфера, рН 3, добавляли к 19,5 г бензилового спирта с получением конечного процентного содержания цитратного буфера, составляющего 2,5% мас./мас., в бензиловом спирте. Затем этот раствор фильтровали через фильтр Μίΐΐίροτε (0,22-мкм М1ЬЬЕХ-ОУ, МГЬЫРОКЕ) для имитации состояния асептической фильтрации.

Добавление раствора бензиловый спирт/цитратный буфер, рН 3, к основным растворам полоксамера.

Составы плацебо (табл. 28) изготавливали добавлением требуемого количества фильтрованной смеси бензиловый спирт/цитратный буфер рН 3 к стерилизованным основным растворам полоксамера, полученным как указано выше. В кратком изложении, приблизительно 9,90 г (точная масса указана в табл. 28) каждого основного раствора полоксамера отвешивали в 20 мл флакон из натриевого стекла и охлаждали на льду/в воде с образованием жидкости (при комнатной температуре эти растворы образуют гели). К охлажденной основе полоксамера добавляли приблизительно 0,10 г (точная масса указана в табл. 28) фильтрованной смеси бензиловый спирт/цитратный буфер, рН 3, и встряхивали в течение 2 мин до получения визуально прозрачного гомогенного раствора. Затем эти составы хранили при 2-8°С до тех пор, пока не потребуются.

Реологическая оценка.

Реологическую оценку проводили с использованием реометра Сагпшсй С8Ь² Приблизительно 0,4 г тестируемого образца помещали между платформой и пластиной с параллельным расположением. После сдавливания образца между платформой и плитой, любой избыток образца осторожно удаляли с использованием шпателя в правых углах по отношению к геометрической форме. Каждый образец тестировали всего три раза, и полученную вязкость записывали в качестве функции температуры.

- 27 024152

Изготовление составов с активным веществом и соответствующих плацебо для исследований стабильности и высвобождения.

После реологической оценки, изготавливали составы полоксамера с активным веществом (Ι3Α) и плацебо для исследований стабильности и высвобождения. Более того, составы РЕС 400 с плацебо и активным веществом (0,1% мас./мас. Ι3Α) также изготавливали в качестве контрольных составов для тестирования высвобождения.

Изготовление исходного раствора Ι3Α в смеси бензиловый спирт/цитратный буфер.

Приблизительно 50 мг (планируемое количество) Ι3Α аккуратно отвешивали в 7-мл стеклянную небольшую пробирку совместно с 500 мг (планируемое количество) смеси бензиловый спирт/цитратный буфер рН 3. Эту смесь периодически встряхивали в течение 5 мин до растворения Ι3Α.

Изготовление составов полоксамера с активным веществом и плацебо.

Составы плацебо получали, как описано выше (табл. 28). Составы полоксамера с активным веществом (Ι3Α), содержащие планируемую концентрацию 0,1% мас./мас. Ι3Α Ъ изготавливали способом, сходным с составами плацебо, за исключением того, что избыточную массу вследствие Ι3Α Ъ компенсировали аналогичным снижением добавляемого количества основного раствора полоксамера (табл. 29). В кратком изложении, приблизительно 110 мг (точная масса указана) смеси СА/бензиловый спирт/цитратный буфер, рН 3, добавляли к 9,89 г охлажденного стерилизованного основного раствора полоксамера и встряхивали в течение приблизительно 2 мин до получения визуально прозрачного гомогенного раствора. Точные массы и планируемые массы указаны в табл. 29.

Таблица 29

Истинные и планируемые количества составов полоксамера с активным веществом для исследований стабильности и высвобождения

Эксципиенты	Ро1ох-01-активное вещество	ΡοΙοχ-02-активное вещество	Ро1ох-рд-01-активное вещество	Ро1ох-рд-02-активное вещество
	Планируемая масса/г	Истинная масса/г	Планируемая масса/г	Истинная масса/г	Планируемая масса/г	Истинная масса/г	Планируемая масса/г	Истинная масса/г
Ро1ох-01	9, 89	9,89261
Ро1ох-02			9, 89	9,89098
Ро1ох-рд-01					9, 89	9,89461
Ро1ох-рд-02							9,89	9,89704
*13 А/Бензиловыи спирт/Цитратный буфер	0, 11	0,11051	0, 11	0,109,99	0,11	0,11496	0,11	0,11338
Всего	10,0	10,00312	10,0	10,00097	10, 0	10,00957	10, 0	10,01042

*Точное количество Ι3Α в смеси бензиновый спирт/цитратныи буфер, рН 3, = 0,09118 г/г

Таблица 30

Истинные и планируемые количества контрольных составов РЕС 400 с плацебо и активным веществом для исследований высвобождения

	РЕС 400-плацебо	РЕС 400-активное вещество
Эксципиенты	Планируемая	Истинная	Планируемая	Истинная масса/г
	масса/г	масса/г	масса/г
РЕС400	7,92	7,92151	7,912	7,91457
Цитратный буфер рН 3	1,98	1,97021	1,978	1,99458
Бензиновый спирт	0, 10	0,10592
*13А/Бензиловый спирт			0,11	0,11274
Всего	10,0	10,02189	10	10,02189

*Точное количество Ι3Α в бензиловом спирте = 0,09155 г/г

Изготовление контрольных составов РЕС400.

После аналогичного процесса, 12,5 мг Ι3Α добавляли к 125 мг бензилового спирта, который предварительно фильтровали через фильтр МПИроге (0,22-мкм МШЬЕХ-СУ, МШЫРОКЕ). Этот раствор встряхивали в течение приблизительно 5 мин до полного растворения Ι3Α. Для изготовления контрольных составов с активным веществом, приблизительно 110 мг этой смеси добавляли к раствору 7,912 г РЕС400 и 1,978 г цитратного буфера рН 3. Плацебо изготавливали аналогичным образом, за исключением того, что использовали приблизительно 7,92 г РЕС400 и 1,98 г цитратного буфера и 100 мг стерилизованного бензилового спирта. Точные массы и планируемые массы представлены в табл. 6 для составов РЕС 400 с плацебо и активным веществом соответственно.

Условия хранения для составов полоксамера с активным веществом и плацебо.

Аликвоты каждого из составов полоксамера 407 (с плацебо или активным веществом) распределяли в 2 мл флаконы из желтого стекла (боросиликатное стекло) с завинчивающейся крышкой, закрывали и хранили в трех условиях хранения, а именно 2-8°С, 25±2°С и 40±2°С для исследований стабильности.

- 28 024152

Тестирование стабильности Ι3Α в составах полоксамера.

Для оценки лекарственного продукта проводили способ экстракции в целях оценки деградации Ι3Α Ъ в изоформу а (чистота хроматографического пика). Экстракцию Ι3Α из активного состава проводили следующим образом (указанный процесс также использовали для состава плацебо). В кратком изложении, приблизительно 0,5 г состава аккуратно отвешивали в 5-мл мерную колбу, и доводили до отметки смесью ацетонитрил/цитратный буфер, рН 3, (90:10 об./об.) для применения в ВЭЖХ. Раствор разделяли на аликвоты в пробирки для ВЭЖХ и анализировали.

Предварительные данные по выделению (не представлены) указывают на то, что приблизительно 80% или более Ι3Α Ъ было выделено из состава с активным веществом, и более существенно, ни один из эксципиентов не оказывал влияния в составе. Составы анализировали в 1=0 и ускоренные исследования стабильности (40°С) проводили при 1=5 недель.

Предварительные исследования высвобождения Ι3Α.

Высвобождение Ι3Α Ъ из составов через синтетическую мембрану исследовали с использованием диффузоров Франца в закрытых условиях.

Выбор жидкости приемника.

Жидкость приемника, используемая для проверки и поддержания условий погружения, представляла собой смесь 20% об./об. этанол/цитратный буфер (рН 3,0) и ее помещали в ячейку Франца и перемешивали постоянно магнитной мешалкой. Предварительные исследования стабильности проводили на Ι3Α в смеси 20% об./об. этанол/цитратный буфер (рН 3,0) при 37°С в течение приблизительно 18 ч. Было выявлено, что повышение процентной площади пика в изоформе а через 18 ч составляет 0,26%. В целях исследования в ячейке Франца этот показатель считали приемлемым. Кинетическую растворимость Ι3Α в смеси 20% об./об. этанол/цитратный буфер (рН 3,0) определили как 509,7±3 мкг/мл при 25°С.

Исследования высвобождения ш У11го (ячейка Франца).

Для проведения исследования высвобождения использовали калиброванные по отдельности диффузоры Франца со средней диффузионной площадью поверхности 0,53 см² и средним объемом приемника 1,85±0,02 мл. Изготавливали регенерированные целлюлозные мембраны (М^СО 12000-14000), разрезали и помещали в ячейки Франца. Мембранам давали возможность уравновеситься с фазой приемника в течение 30 мин, а затем наносили составы. На поверхность мембраны наносили избыточную дозу, составлявшую 0,5 г, каждого состава с использованием нагнетателя объемного типа Иппр1ре11е®. Проводили одно исследование образца (26 ч после нанесения геля), после чего 200 мкл жидкости приемника осторожно отбирали из рукава ячейки Франца. На протяжении эксперимента, любые потери жидкости приемника вследствие выпаривания из ячеек Франца заменяли для подержания постоянного объема. Эксперимент проводили в закрытых условиях (верхнюю часть верхних донорных лунок накрывали РагаЙ1т®), для всех составов (п=3 ячейки Франца на активный состав и п=1 ячейка Франца на состав плацебо). Образцы анализировали посредством ВЭЖХ, как описано в примере 1, и концентрацию высвобожденного Ι3Α Ъ оценивали с использованием серии калибровочных стандартов, изготовленных в смеси 80% об./об. цитратный буфер/20% об./об. этанол.

Результаты.

Стерилизация основных растворов полоксамера.

Сразу после стерилизации основных растворов полоксамера, Ро1ох-01 и Ро1ох-02 без пропилена, было показано разделение фаз. После охлаждения на льду/в воде, эти составы превратились в прозрачные гомогенные фазы. Однако основные растворы, содержащие пропиленгликоль, Ро1ох-рд-01 и Ро1охрд-02 показали отсутствие разделения фаз сразу после стерилизации, подтверждая, что добавление пропиленгликоля ингибирует этот эффект.

Реологическая оценка.

Реологические исследования проводили на составах полоксамера с плацебо и вязкость (П) определяли как функцию температуры (°С), в диапазоне температур 4-40°С. Значение ст1 определяли с помощью средней точки изгиба. Для всех составов плацебо происходило небольшое повышение вязкости при повышении температуры до определенной точки, в ст1 происходило резкое повышение вязкости при небольшом повышении температуры. Было выявлено, что значение ст1 зависит от концентрации, т.е. чем ниже концентрация полоксамера 407, тем выше значение ст1. Более того, добавление пропиленгликоля к составу полоксамера с плацебо далее снижало ст1. Однако выше ст1, вязкость указанных образов повышалась приблизительно в 1,5-2 раза по сравнению с соответствующими не содержащими пропиленгликоль составами. Например, было выявлено, что при 37°С вязкость Ро1ох-01-плацебо составляет приблизительно 1,2 П, в то время как было выявлено, соответствующий состав пропиленгликоля с плацебо (Ро1ох-рд-01-плацебо) обладает вязкостью 2,4 П. Таким образом, может оказаться, что добавление пропиленгликоля повышает вязкость выше значения ст1, однако истинное значение ст1 снижается. В табл. 31 представлены обобщенные значения ст1 и вязкости при 37°С для всех составов.

- 29 024152

Таблица 31

Значения ст1 и вязкости (при 37°С) для всех составов полоксамера с плацебо (η=3±δΕΜ)

	Ро1ох-01- плацебо	Ро1ох-02- плацебо	Ро1ох-рд- 01-плацебо	Ро1ох-рд- 02-плзцебо
Ст£/°С	28,5±0,07	21,9+0,03	22,7±0,00	18,2±0,03
Вязкость (П) при 37°С	1,2±0,03	2,9±0,06	2,4±0,01	3,4±0,04

Исследования стабильности Ι3Α в составах полоксамера В табл. 32 представлена процентная чистота пиков для Ι3Α Ъ, а также процентная площадь изоформы а и других неопределенных пиков (ИЛР) для всех составов полоксамера с активным веществом в нулевой момент времени. Также для сравнения представлена процентная чистота пика 0,1% мас./мас. геля ΙΡΑ с Ι3Α в нулевой момент времени. Все пики вручную интегрировали и сравнивали с соответствующими составами плацебо.

Таблица 32

Процентная чистота пиков составов в нулевой момент времени

Состав	% Чистота пика 13 А ’Ь'	% изоформы ' а'	% Общие САР
Ро1ох-01-активное вещество	99,8	0,2	0,0
Ро1ох-02-активное вещество	99,8	0, 2	0,0
Ро1ох-рд-01-активное вещество	99, 8	0,2	0,0
Ро1ох-рд-02-активное вещество	99,8	0,2	0,0
0,1% - мас./мас. гель ΙΡΑ	99,2	0, 5	0,3

В табл. 33 представлена процентная чистота пиков для Ι3Α Ъ, а также процентная площадь для изоформы а и других ЦАР во всех активных составах через пять недель после хранения при 40°С (ускоренное исследование стабильности). Также в таблице для сравнения представлена процентная чистота пика 0,1% мас./мас. геля ΙΡΑ с Ι3Α, хранящегося при 40°С в течение четырех недель. Все пики вручную интегрировали и сравнивали с соответствующим составом плацебо.

Таблица 33

Процентная чистота хроматографических пиков составов, хранящихся при 40°С, через пять недель

Состав	% Чистота пика 13А'Ь'	% изоформы 'а'	1 Общие ЧАР
Ро1ох-01-активное вещество	95, 6	2,6	1,8
Ро1ох-02-активное вещество	93,3	2,8	3,9
Ро1ох-рд-01-активное вещество	92,2	2,7	5,1
Ро1ох-рд-02-активное вещество	93,3	3, 0	3,7
+ 0,1% мас./мас. гель ΙΡΑ	94,8	4,7	0,5

* Тестировали через четыре недели хранения при 40°С с использованием способа ВЭЖХ 1.

Нет заметных отличий в процентной чистоте пика Ι3Α в любом из составов полоксамера. Однако в нулевой момент времени, процентное количество изоформы а является меньшим в этих составах по сравнению с гелем ΙΡΑ с Ι3Α, возможно в результате добавления небольшого количества цитратного буфера, рН 3, добавленного в бензиловый спирт в процессе изготовления составов.

Повышение процентного содержания изоформы а наблюдали для всех составов полоксамера с активным веществом после пяти недель хранения при 40°С. Однако повышение процентного количества изоформы а, выявленное для 0,1% мас./мас. геля ΙΡΑ, было более высоким (4,7%) после четырех недель хранения при 40°С. Исходя из процентной чистоты пиков, эти данные, по-видимому, могут указывать на то, что стабильность составов полоксамера с Ι3Α сравнима с 0,1% гелем ΙΡΑ с Ι3Α.

Предварительные исследования высвобождения.

На фиг. 9 представлено высвобожденное количество (мкг/см²) Ι3Α через 26 ч, из составов 0,1% мас./мас. геля полоксамера и ΡΕΟ 400. Не было выявлено значимых отличий (р>0,05) в высвобождении между любыми из составов полоксамера, однако высвобождение из всех составов полоксамеров было значительно более медленным (р<0,05), чем высвобождение из контрольного состава ΡΕ0400. Количество высвобожденного Ι3Α Ъ, усредненное для всех составов полоксамера, составляло приблизительно 16 мкг/см², в то время как количество, высвобожденное из контрольного состава ΡΕΟ 400, составляло приблизительно 53 мкг/см²; это соответствует снижению количества Ι3Α Ъ, высвобожденного из всех составов полоксамеров приблизительно на 70%, по сравнению с контролем через 26 ч.

- 30 024152

Результаты.

В этом исследовании изучали четыре состава полоксамера. Эти гели полоксамера обеспечивают повышение вязкости (при 37°С), где вязкость ро1ох-01-плацебо < ро1ох-рд-01-плацебо < ро1ох-02-плацебо < ро1ох-рд-02-плацебо. Более того, может оказаться, что добавление пропиленгликоля повышает вязкость выше значения ст(. однако истинное значение ст! снижается.

Стабильность гелей полоксамера оказалась сравнимой с 0,1% гелем ΙΡΑ с Ι3Α в ускоренных условиях.

Исследования высвобождения показали, что не существует значимых отличий в высвобождении (р>0,05) между любым из составов полоксамера; однако высвобождение из всех составов полоксамера было значимо более медленным (р<0,05), чем высвобождение из контрольного состава ΡЕС 400. Более того, наблюдали снижение количества Ι3Α Ь, высвобожденного из всех составов полоксамера, приблизительно на 70%, по сравнению с контролем, через 26 ч.

Пример 7.

Исследовали высвобождение Ι3Α Ь ίη уйго из составов, вводимых внутрь очага повреждения, на основе масла по сравнению с контрольным составом ΡЕС 400.

Материалы.

Материал	Поставщик
Ι3Α Ь Партия Νο. 0319	РерИп ЫиЮеб, Аиз+гаНа
Моногидрат лимонной кислоты ВР Серия по. К11115	КаидМ: Ь+б, (Ж
Трицитрат натрия дигидрат ВР, серия по. К0092143
Деионизированная вода	МИНроге, 0К
Сгобато1 СТС/С (триглицериды средней цепи) Партия Νο. ЕЕ03907/3270	Сгоба, Згпдароге
Этанол (Апа1аг) 99,7-100% масс./масс. Серия по. 1,354007	вон, ик
Полиэтиленгликоль 400 (РЕС 400) Серия по. 53820403 312 Бензиловый спирт РЬ Еиг, ВР, ΝΓ Партия Νο. К31593981 301	Мегск, Сегтапу
Ацетонитрил (АСЫ) Для применения для градиента ВЭЖХ, серия по. 0309807 Трифторуксусная кислота (ТГА) Серия по. 0263747	ПзЪег Βοίθηίίΐίο, ϋΚ
Бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) Серия по, СНАЗМР115	Дап Эеккег ТгП.егпа-тспа!, Яе+ЬегТапба

Способы.

Изготовление составов с Ι3Α (активное вещество) и плацебо для исследований высвобождения.

Изготавливали три масляных состава с соответствующими им плацебо. Количество бензилового спирта поддерживали при 1% мас./мас. Изготовление двух составов вовлекало либо добавление антиоксиданта перед стерилизацией масла нагреванием, либо добавление антиоксиданта после стерилизации масла.

Изготовление масляного состава (как описано в РВ23001/2) СгоДа-ΒΑ.

Стерилизация фракционированного кокосового масла.

Приблизительно 100 г фракционированного кокосового масла (СВОЭЛМОБ СТС/С) отвешивали в 100-мл коническую колбу (боросиликатное стекло), закрывали (крышка из боросиликатного стекла) и помещали в предварительно нагретый сушильный шкаф (сушильный шкаф Са11епкатр£ Но! Ьох Оуеп с вентилятором, размер 2) при 170±2°С в течение 1 ч. После этого процесса, перед применением, маслу позволяли охладиться до комнатной температуры.

Добавление Ι3Α к стерилизованному маслу.

Приблизительно 15 мг Ι3Α аккуратно отвешивали в 20-мл стеклянный флакон и добавляли приблизительно к 150 мг бензилового спирта (точная масса указана), который предварительно фильтровали через 0,22-мкм фильтр МГБЬЕХ-СУ. Эту смесь периодически встряхивали в течение приблизительно 2 ч до растворения Ι3Α в бензиловом спирте. К этой смеси добавляли приблизительно 14,835 г стерилизованного масла и встряхивали в течение приблизительно 5 мин до получения гомогенного раствора. Плацебо изготавливали аналогичным образом за исключением того, что приблизительно 14,85 г стерилизованного масла (точная масса указана) использовали для компенсации Ι3Α. Точные массы и процентные составы представлены в табл. 34 и 35 для составов активного вещества (Ι3Α) и плацебо.

- 31 024152

Таблица 34

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла Сгойа/ΒΑ с Ι3Α

	Пл а нир уе ма я масса	Планируемые % мае./мае.	Истинная масса	*Истинные % мае,/мае.
13А (031Э)	15 мг	0,10	15,56 мг	0, 104
Бензиловый спирт	150 мг	1,0	159,98 мг	1,065
Фракционированное кокосовое масло	14,835 г	98,9	14,84625	98,831
Всего	15 г	100	15,02179 г	100

★ Округлено до 3 ά.ρ

Таблица 35

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла Сгойа/ΒΑ с плацебо

	Планируемая масса	Пл анируемые % мае,/мае.	Истинная масса	* Истинные % мае,/мае.
Бензиловый спирт	150 мг	1,0	149,84 мг	0,999
Фракционированное кокосовое масло	14,85 г	99,0	14,85161 г	99,001
Всего	15 г	100	15,00145 г	100

* Округлено до 3 с1.р

Изготовление состава масла С^οάа-ΒЛ/Αηΐ^οx.

Длительное хранение масел может приводить к прогорканию, которое может вызывать деградацию лекарственного продукта. Таким образом, в целях снижения этого эффекта, в состав можно включать антиоксидант (после стерилизации нагреванием). Составы плацебо и активного вещества, содержащие антиоксидант после стерилизации нагреванием масла, изготавливали в соответствии со следующим способом.

Изготовление смеси антиоксидант/бензиловый спирт.

Приблизительно 60 мг антиоксиданта (ВНТ) растворяли в 2 г бензилового спирта и фильтровали через 0,22-мкм фильтр МШЬЕХ-СУ.

Добавление Ι3Α к стерилизованному маслу.

Приблизительно 15 мг Ι3Α (партия 0319) аккуратно отвешивали в 20-мл стеклянный флакон и добавляли приблизительно к 154,5 мг смеси ВНТ/бензиловый спирт, полученную, как указано выше. Эту смесь периодически встряхивали в течение приблизительно 2 ч до растворения Ι3Α в бензиловом спирте. К этой смеси добавляли приблизительно 14,8305 г охлажденного стерилизованного масла и встряхивали в течение приблизительно 5 мин до получения гомогенного раствора. Плацебо изготавливали аналогичным образом за исключением того, что приблизительно 14,8455 г стерилизованного масла (точная масса указана) использовали для компенсации Ι3Α. Точные массы и процентные составы представлены в табл. 36 и 37 для составов активного вещества (Ι3Α) и плацебо.

Таблица 36

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла С^οάа-ΒЛ/Αηΐ^οx с Ι3Α

	Планируемая масса	Планируемые ΐ мае./мае.	Истинная масса	* Истинные % мае./мае.
13А (0319)	15 мг	0,10	15,14 мг	0,101
Бензиловый спирт	150 мг	1,0	158,27 мг	1,055
внт	4,5 мг	0,03	4,55 мг	0, 030
Фракционированное кокосовое масло	14,8305 г	98, 87	14,83014 г	98,814
Всего	15 г	100	15,0081 г	100

* Округлено до 3 ά.ρ

Таблица 37

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла С^οάа-ΒЛ/Αпΐ^οx с плацебо

	Планируемая масса	Планируемые % мае./мае.	Истинная масса	* Истинные % мае./мае.
Бензиловый спирт	150 мг	1,0	150,56 мг	1,004
ВНТ	4,5 мг	0,03	4,55 мг	0,030
Фракционированное кокосовое масло	14,8455 г	98,97	14,84591 г	98,966
Всего	15 г	100	15,00102 г	100

* Округлено до 3 ά.ρ

- 32 024152

Изготовление состава масла Сгоба/Лпиох-ВЛ.

Стерилизация масел сухим жаром также может привести к прогорклости, которая может вызывать деградацию лекарственного продукта. Таким образом, в целях снижения этого эффекта перед стерилизацией нагреванием, в состав можно включать антиоксидант. Составы плацебо и активного вещества, содержащие антиоксидант перед стерилизацией масла изготавливали в соответствии со следующим способом.

Стерилизация смеси антиоксидант/масло.

Приблизительно 15 мг антиоксиданта (ВНТ) растворяли приблизительно в 50 г масла в 100-мл конической колбе (боросиликатное стекло), закрывали (боросиликатная стеклянная пробка) и помещали внутрь предварительно нагретого сушильного шкафа (сушильный шкаф Оа11епкатр£ Но1 Ъох Оуеп с вентилятором, размер 2) при 170±2°С в течение 1 ч. После этого процесса, перед применением смеси антиоксидант/масло позволяли охладиться до комнатной температуры.

Добавление Ι3Α к стерилизованному маслу.

Приблизительно 15 мг Ι3Α (партия 0319) аккуратно отвешивали в 20-мл стеклянный флакон и добавляли приблизительно к 150 мг бензилового спирта, который предварительно фильтровали через 0,22мкм фильтр МДЬЕХ-ОУ. Эту смесь периодически встряхивали в течение приблизительно 2 ч до растворения Ι3Α в бензиловом спирте. К этой смеси добавляли приблизительно 14,835 г охлажденной стерилизованной смеси антиоксидант/масло и встряхивали в течение приблизительно 5 мин до получения гомогенного раствора. Плацебо изготавливали аналогичным образом за исключением того, что приблизительно 14,8455 г стерилизованного масла (точная масса указана) использовали для компенсации Ι3Α. Точные массы и процентные составы представлены в табл. 38 и 39 для составов активного вещества (Ι3Α) и плацебо.

Таблица 38

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла С^οάа/Αηΐ^οx-ВΑ с Ι3Α

	Планируемая масса	Планируемые % мае./мае.	Истинная масса	* Истинные % мае./мае.
13А (0319)	15 мг	0,10	15,09 мг	0,100
Бенэиловый спирт	150 мг	1,0	14 6, 92 мг	0,979
внт	4,5 мг	0,03	4,42 мг	0,030
Фракционированное кокосовое масло	14,8305 г	98,87	14,33568 г	98,891
Всего	15 г	100	15,00211 г	100

★ Округлено до 3 З.р

Таблица 39

Планируемые и истинные количества (и % мас./мас.) для состава масла С^οάа/Αηΐ^οx-ВΑ с плацебо

	Планируемая масса	Планируемые % мае./мае.	Истинная масса	*Истинные % мае,/мае.
Бенэиловый спирт	150 мг	1,0	153,9 мг	1,025
ВНТ	4,5 мг	0,03	4 г 67 мг	0,031
Фракциониров аиное кокосовое масло	14,3455 г	98,97	14,85901 г	98,944
Всего	15 г	100	15,01758 г	100

* Округлено до 3 й.р

Аликвоты всех составов хранили для предварительных исследований высвобождения, и остальную часть разделяли на аликвоты в 2-мл желтые флаконы из боросиликатного стекла, закрывали и хранили при 2-8 и 25°С для исследований стабильности.

Предварительные исследования высвобождения Ι3Α.

Высвобождение Ι3Α Ъ из составов через синтетическую мембрану исследовали с использованием диффузоров Франца в закрытых условиях.

Выбор жидкости приемника.

Приемная жидкость, используемая для проверки и поддержания условий погружения, представляла собой смесь 20% об./об. этанол/цитратный буфер (рН 3,0) и ее помещали в ячейку Франца и перемешивали постоянно магнитной мешалкой. Предварительные исследования стабильности проводили для Ι3Α в смеси 20% об./об. этанол/цитратный буфер (рН 3,0) при 37°С в течение приблизительно 18 ч. Было выявлено, что повышение процентной площади пика изоформы а через 18 ч составляет 0,26%. В целях исследования в ячейке Франца этот показатель считали приемлемым. Кинетическую растворимость Ι3Α в смеси 20% об./об. этанол/цитратный буфер (рН 3,0) определили как 509,7±3 мкг/мл при 25°С.

Исследования высвобождения ίη νίΐΐΌ (ячейка Франца).

Для проведения исследования высвобождения использовали калиброванные по отдельности диффузоры Франца со средней диффузионной площадью поверхности 0,53 см² и средним рецепторным объ- 33 024152 емом 1,85±0,02 мл. Изготавливали регенерированные целлюлозные мембраны (М\УСО 12000-14000), разрезали и помещали в ячейки Франца. Мембранам давали возможность уравновеситься с фазой приемника в течение 30 мин, а затем наносили составы. На поверхность мембраны наносили избыточную дозу, составлявшую 0,5 г, каждого состава с использованием нагнетателя объемного типа Рширхрейе®. Проводили одно исследование образца (26 ч после нанесения геля), после чего 200 мкл жидкости приемника осторожно отбирали из рукава ячейки Франца. На протяжении эксперимента любые потери жидкости приемника вследствие выпаривания из ячеек Франца заменяли для подержания постоянного объема. Эксперимент проводили в закрытых условиях (верхнюю часть верхних донорных лунок накрывали Ρ;π;·ιЙ1т®), для всех составов (η=3 ячейки Франца на активный состав и η=1 ячейка Франца на состав плацебо). Образцы анализировали посредством ВЭЖХ, как описано в примере 1, и концентрацию высвобожденного Ι3Α Ъ оценивали с использованием серии калибровочных стандартов, изготовленных в смеси 80% об./об. цитратный буфер/20% об./об. этанол.

Способ ВЭЖХ.

Способ ВЭЖХ, описанный выше в примере 1, использовали для определения Ι3Α.

Результаты.

Предварительные исследования высвобождения.

На фиг. 10 представлено количество высвобожденного Ι3Α Ъ (мкг/см²) через 26 ч, из 0,1% мас./мас. составов масла и ΡЕС 400. Не было выявлено значимых различий (р<0,05) между любыми из составов масла. Однако высвобождение Ι3Α Ъ из всех составов масла было значительно меньшим (р<0,05), чем высвобождение из контрольного состава ΡЕС 400. Количество Ι3Α Ъ, высвобожденного из всех составов масла, составляло приблизительно 3,4 мкг/см², однако количество, высвобожденное из контрольного состава ΡЕС 400, было приблизительно в 16 раз больше (53 мкг/см²). Более того, оказалось, что добавление ВНТ (антиоксиданта) не оказывает значимого влияния на высвобождение Ι3Α Ъ из составов масла.

Пример 8. Стабильность составов геля ΙΡΑ.

Определяли стабильность (Т=12 месяцев) Ι3Α Ъ в составах геля ΙΡΑ, изготовленных с использованием цитратных буферов с различными значениями рН. Диапазон значений рН составлял от 2,5 до 4,0.

Материалы.

Материал	Поставщик
Ацетонитрил (для применения в ВЭЖХ) Партия по, 0444972	ПзПег СЬет1са1з, ОК
Моногидрат лимонной кислоты (класса Ό3Ρ} Партия по. К9129642	Мегск, Сегтапу
Деионизированная вода (Μίΐΐίζ))	МПНроге, ОК
Ι3Α Ь (ангелат ингенола) Партия по. РЕР 0401	Поставлялся РерИп Ытткей, АизРгаНа
Трицитрат натрия дигидрат (класса ЮЗР) Партия по. К9125363	Мегск, Сегтапу
Трифторуксусная кислота (для применения в ВЭЖХ) Партия по. 0434753	ЕтзНег 3οίθηηίίίο, υκ

Способы.

Оборудование и способ для ВЭЖХ.

Растворы образцов анализировали посредством ВЭЖХ в отношении процентной чистоты пика. Хроматографические условия для способа ВЭЖХ 2 подробно описаны ниже.

Оборудование:

\Уа1ег5 Л11^аηсе 2695 Бераи-Кюсю ΜοάιιΡ р1и8 Αиΐο8атρ1е^ (δΝ: Ρ96δΜ4656Ν);

Детектор \Уа(ег5 996 ΡΌΑ (δΝ: ΜΧ7ΑΜ7987Μ);

ΜίΙΡηηίιιιη³’² δοΠ\ν;·ιΐΌ. Уе^ши 4.00;

Хроматографические условия:

Колонка: симметричная С18 - 5 мкм (^а1ег§) (δΝ: Т70641Т 12);

Длина колонки: 150x3,90 мм;

Температура колонки: 30±2°С;

Защитная колонка: симметричная С18 - 5 мкм (^а1ег§) (ΡΝ: \VЛΤ054225);

Длина защитной колонки: 20±3,90 мм;

Подвижная фаза: 0,02% об./об. ΤΡΑ в воде (А); 0,02% об./об. ΤΡΑ в ацетонитриле (В) А:В, 50:50 (исходный состав);

Скорость потока: 1,0 мл/мин;

Температура автоматического пробоотборника: 8±2°С;

Длина УФ-волны: 230 нм;

- 34 024152

Объем инъекции: 10 мкл; Время пробега: 20 мин. Градиенты.

Экстракция Ι3ΑΒ из составов геля ΙΡΑ.

Ι3ΑΒ экстрагировали из каждого геля ΙΡΑ следующим образом: приблизительно 0,5 г каждого состава геля с активным веществом или плацебо аккуратно отвешивали в 5-мл мерную колбу класса А. Для каждого состава это действие проводили в трех экземплярах. Затем в каждый образец геля добавляли цитратный буфер (рН 3,0, 0,5 мл) и смешивали встряхиванием при максимальной скорости в течение 1 мин, а затем переносили в орбитальное устройство для встряхивания и встряхивали при 400 об/мин в течение 30 мин. В каждую из объемных колб добавляли ацетонитрил для применения в ВЭЖХ, вплоть до объема, и снова смешивали встряхиванием при максимальной скорости в течение 1 мин. В конце мерные колбы переносили в орбитальное устройство для встряхивания и встряхивали при 400 об/мин в течение 60 мин. Затем аликвоты переносили в пробирки для анализа посредством ВЭЖХ.

Измерение кажущегося значения рН в гелях плацебо.

Кажущееся значение рН в гелях плацебо измеряли с использованием рН-метра 1сп\\ау 3320 с комбинированным рН-электродом. В кратком изложении, приблизительно 0,5 г каждого геля переносили в 25-мл стеклянные флаконы и позволяли стоять при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч. Комбинированный рН-электрод помещали в гель ΙΡΑ, обеспечивая, чтобы вся мембрана электрода была покрыта гелем. Считыванию данных с рН-метра давали возможность установиться в течение минимум 1 мин и регистрировали кажущееся значение рН геля.

Результаты.

Измерения кажущегося значения рН гелей с плацебо в Т=12 месяцев.

Кажущееся значение рН гелей ΙΡΑ с плацебо при Т=0 и Т=12 месяцев после хранения при 2-8°С представлено в табл. 40.

Таблица 40

Кажущееся значение рН гелей ΙΡΑ с плацебо при Т=0 и Т=12 месяцев

рН цитратного буфера (+0,05)	Кажущееся значение рН геля с плацебо Т=0 (п=1)	Кажущееся значение рН геля с плацебо Т=12 месяцев (п=1)
2, 50	3,07	2, 97
2, 75	3,34	3,19
3, 00	3,62	3,57
3, 50	4,22	4,23
4,00	4,74	4,75

Данные в табл. 40 показывают, что не было значимого изменения кажущегося значения рН после 12 месяцев хранения при 2-8°С, для гелей ΙΡΑ с плацебо, изготовленных с цитратными буферами с рН 3,00, 3,50 и 4,00. Однако в гелях ΙΡΑ с плацебо, изготовленных с цитратными буферами с рН 2,50 и 2,75, происходило небольшое снижение рН, выявленное после 12 месяцев хранения при 2-8°С. Снижение рН, выявленное для этих гелей, может быть связано с выпариванием ΙΡΑ из геля либо в процессе хранения, либо в процессе анализа образца.

Процентная чистота пика изомеров Ι3Α в гелях ΙΡΑ с активным веществом при Т=12 месяцев

В табл. 41 представлена процентная чистота пика изомеров Ι3Α для различных составов гелей ΙΡΑ с активным веществом (0,1% мас./мас.) после хранения в течение 12 месяцев при 2-8°С и в табл. 42 представлено сравнение процентной чистоты пика !3Аа в Т=0 и Т=12 месяцев.

- 35 024152

Таблица 41

Процентная чистота пика изомеров Ι3Α для гелей ΙΓΑ с активным веществом после 12 месяцев хранения при 2-8°С

рН цитратного буфера (+0,05)	Кажущееся значение рН геля с плацебо (Т=12 месяцев)	Процентная чистота пика (среднее
значение ±50,	1=3)
Процентная чистота пика изоформы а	Процентная чистота пика 13АЬ	Процентная чистота пика других пар
2,50	2,97	0,64±0,22	99,12±0,40	0,24+0,20
2,75	3,19	1,07±0,16	98,32+0,61	0,31+0,17
3,00	3, 57	1,26+0,24	98,66±0,31	0,08±0,12
3,50	4,23	2,09+0,17	97,74+0,27	0,17+0,11
4,00	4,75	4,92+0,05	94,84±0,07	0,24±0,04

Данные, анализированные с использованием способа ВЭЖХ 2.

Данные в табл. 41 показывают, что после 12 месяцев хранения при 2-8°С происходит повышение процентной чистоты пика изоформы с повышением кажущегося значения рН соответствующего состава геля с плацебо. Например, гель ΙΓΑ, изготовленный с цитратным буфером с рН 2,75 обладает процентной чистотой пика изоформы а 1,07% по сравнению с составом геля ΙΓΑ, изготовленным с цитратным буфером рН 4,00, который обладает процентной чистотой пика изоформы а 4,92%. Эти данные указывают на повышенную стабильность Ι3Α Ь в составах геля ΙΓΑ, изготовленных с цитратными буферами с более низкими значениями рН.

Таблица 42

Сравнение процентной чистоты пика ПАа при Т=0 и Т=12 месяцев

рН цитратного буфера (±0,05)	Кажущееся значение рН геля с плацебо (Т=12 месяцев)	Процентная чистота пика (среднее значение +5ϋ, п=3)
Процентная чистота пика изоформы а Т=0	Процентная чистота пика 13Аа Т=12 месяцев
2,50	2,97	0, 44+0,03	0,64±0,22
2,75	3,19	0,24±0,06	1,07+0,16
3, 00	3,57	0, 52 + 0, 01	1,26+0,24
3, 50	4,23	0,47±0,02	2,09±0,17
4,00	4,75	0,44+0,03	4,92±0,05

Т=0 - данные, анализированные способом ВЭЖХ 1 и Т=12 месяцев данные, анализированные способом ВЭЖХ 2.

Данные в табл. 42 показывают, что после 12 месяцев хранения при 2-8°С происходит повышение процентной чистоты пика изоформы во всех составах геля ГРЛ с активным веществом. Однако состав геля ΙΓΑ, изготовленный с цитратным буфером с рН 2,50, показал только небольшое повышение процентной чистоты пика изоформы а (0,22%) по сравнению, например, с составом геля ΙΓΑ, изготовленным с цитратным буфером с рН 4,00, который показал наибольшее повышение процентной чистоты пика изоформы а (4,48%). Также эти результаты указывают на повышенную стабильность Ι3Α Ь в составах геля ΙΓΑ, изготовленных с цитратными буферами с более низкими значениями рН. По существу, оказалось, что состав геля ΙΓΑ, изготовленный с цитратным буфером с наименьшим значением рН, отвечает требованиям (<1% изоформы а) в течение 12 месяцев при 2-8°С.

Таким образом, после 12 месяцев хранения при 2-8°С составы геля ΙΓΑ, которые обеспечили лучшую стабильность для Ι3Α^ представляли собой составы, которые были изготовлены с цитратными буферами с более низкими значениями рН (рН 2,5-3,0).

Пример 9. Стабильность Ι3Α Ь в растворах предварительной смеси геля при варьирующих значениях рН и температуре.

Способы.

Изготовление растворов предварительной смеси геля.

Растворы предварительной смеси геля изготавливали в соответствии со следующим способом.

1. Отвесить цитратный буфер непосредственно в чистую сухую бутыль Эигап.

2. Отвесить ΙΓΑ непосредственно в бутыль Эигап стадии 1.

3. Отвесить точное количество Ι3Α Ь в чистую сухую бутыль для образца.

4. Отвесить точное количество бензилового спирта в бутыль для образца стадии 3.

5. Поместить бутыль для образца стадии 4 на орбитальное устройство для встряхивания и встряхивать при 400 об/мин до растворения всего Ι3Α Ь.

- 36 024152

6. Добавить раствор Ι3Α Ъ/бензиловый спирт стадии 5 в бутыль Эигап стадии 2.

7. Оставить смесь для получения гомогенного раствора.

Составы растворов предварительной смеси геля, подлежащих получению и помещению для исследования стабильности.

Таблица 43

Раствор предварительной смеси геля 1

Компонент	Концентрация мае./мас.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 2,75	69,0	13,80
Изопропиловый спирт	30,0	6, 00
Бензиловый спирт	0, 9	0,18
Ι3Α '6'	0,1	0, 02

Таблица 44

Раствор предварительной смеси геля 2

Компонент	Концентрация мас,/мас.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 3, 00	69,0	13,80
Изопропиловый спирт	30,0	6,00
Бензиловый спирт	0,9	0,18
Ι3Α 1Ь'	0, 1	0, 02

Таблица 45

Раствор предварительной смеси геля 3

Компонент	Концентрация мае,/мас.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 3,50	69, 0	13,80
Изопропиловый спирт	30,0	6, 00
Бензиловый спирт	0,9	0, 18
13А 'Ь'	0, 1	0, 02

Таблица 46

Раствор предварительной смеси геля 4

Компонент	Концентрация мас./мас.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 4,00	69,0	13,80
Изопропиловый спирт	30,0	6, 00
Бензиловый спирт	0,9	0,18
Ι3Α ‘ Ь'	0,1	0, 02

Таблица 47

Раствор предварительной смеси геля 5

Компонент	Концентрация мас./мас.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 2,75	69, 09	69,09
Изопропиловый спирт	30,00	30,00
Бензиловый спирт	0, 90	0,90
Ι3Α 'Ь'	0,01	0,01

Таблица 48

Раствор предварительной смеси геля 6

Компонент	Концентрация мас./мас.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 3,00	69, 09	69, 09
Изопропиловый спирт	30, 00	30,00
Бензиловый спирт	0,90	0,90
Ι3Α ’Ь'	0,01	0,01

- 37 024152

Таблица 49

Раствор предварительной смеси геля 7

Компонент	Концентрация мае./мае.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 3,50	69,09	69, 09
Изопропиловый спирт	30,00	30,00
Бензиловый спирт	0,90	0,90
Ι3Α 'Ь'	0,01	0,01

Таблица 50

Раствор предварительной смеси геля 8

Компонент	Концентрация мае./мае.	Подлежащее взвешиванию количество (г)
Цитратный буфер рН 4,00	69, 09	69, 09
Изопропиловый спирт	30, 00	30,00
Бензиловый спирт	0, 90	0,90
Ι3Α ’Ь’	0,01	0,01

Тестирование стабильности составов предварительной смеси геля.

Растворы предварительной смеси геля, полученные как указано выше, помещали для исследования стабильности при 2-8, 25 и 40°С и тестировали в моменты времени Т=0 и 2 недели. В каждый момент времени растворы предварительной смеси оценивали в отношении содержания Ι3Α Ъ в соответствии со способом, подробно описанным ниже.

Тестирование стабильности составов предварительной смеси геля.

Растворы предварительной смеси геля помещали для исследования стабильности при 2-8, 25 и 40°С и тестировали в моменты времени Т=0 и 2 недели. В каждый момент времени растворы предварительной смеси оценивали в отношении содержания Ι3Α Ъ вычислением процентной площади пика ВЭЖХ для Ι3Α Ъ относительно площадей пиков родственных Ι3Α Ъ веществ изоформы а и изоформы с, как описано ниже.

Оборудование и способы ВЭЖХ.

Все образцы, которые анализировали на Ι3Α Ъ, анализировали с использованием способа ВЭЖХ

2. Оборудование и хроматографические условия для способа ВЭЖХ 2 следующие.

Оборудование:

\Уа1сг5 ЛШаисе 2695 Зерагайоик Моби1е р1и§ ЛиЮ5атр1сг:

Детектор \Уа1ег5 996 ΡΌΑ;

Етро\\сг 5>оП\уаге. Уегыоп 2.00.

Хроматографические условия:

Колонка: симметричная С18 - 5 мкм (^а1ег8):

Длина колонки: 150x3,90 мм;

Температура колонки: 30±2°С:

Защитная колонка: симметричная С18 - 5 мкм (^а1ег§) (ΡΝ: ^ΑΤ054225):

Длина защитной колонки: 20x3,90 мм;

Подвижная фаза: 0,02% об./об. ΤΡΑ в воде (А): 0,02% об./об. ΤΡΑ в ацетонитриле (В) А:В, 50:50 (исходный состав) (градиент, см. табл. 51 ниже):

Скорость потока: 1,0 мл/мин:

Температура автоматического пробоотборника: 8±2°С:

Длина УФ-волны: 230 нм:

Объем инъекции: 10/40 мкл:

Время пробега: 20 мин.

Таблица 51

Таблица градиентов для способа ВЭЖХ 2

Стадия	Время	Поток	%А	%в	Кривая
		1,00	50, 0	50,0
2	2,00	1,00	50,0	50,0	6
3	5, 00	1,00	40, 0	60,0	6
4	12, 00	1,00	20, 0	80,0	6
5	16, 00	1,00	20,0	80,0	6
6	16, 50	1,00	50,0	50, 0	6
7	20, 00	1,00	50,0	50,0	6

- 38 024152

Данные стабильности в отношении Ι3Α Ъ в растворах предварительной смеси геля с диапазоном рН от 2,15 до 4,00 при 2-8, 25 и 40°С (среднее значение, п=3)

предва- ри- тельной смеси геля	Темпера- тура хранения (°С)	Время (недели)	% Чистота пика 13А Т,Ь'Т относительно Ъ, изоформы а и изоформы с Ι3Α	% Чистота пика изоформы а” относительно Ъ, изоформы с и изоформы т’а Ι3Α	% Чистота пика изоформы с относительно а, изоформы С и изоформы Ь Ι3Α
1	Ν/Α	0	98,98	1, 02	0,00
2	Ν/Α	0	98,96	1, 04	0, 00
3	Ν/Α	0	98,97	1, 03	0,00
4	Ν/Α	0	98,91	1, 09	0,00
5	Ν/Α	0	99, 09	0, 91	0,00
6	Ν/Α	0	98,99	1, 01	0,00
7	Ν/Α	0	98,99	1,01	0,00
8	Ν/Α	0	99,00	1,00	0,00
1	2-8	2	98,77	1,23	0,00
2	2-8	2	98,65	1, 35	0,00
3	2-8	2	98,61	1, 39	0,00
4	2-8	2	98,50	1, 50	0, 00
5	2-8	2	98,80	1,20	0, 00
6	2-8	2	98,57	1,43	0,00
7	2-8	2	98,44	1,56	0,00
8	2-8	2	98,03	1, 97	0,00
1	25	2	98,69	1,31	0,00
2	25	2	98,51	1,49	0, 00
3	25	2	98,19	1,81	0,00
4	25	2	97,42	2,58	0,00
5	25	2	98, 78	1,22	0,00
6	25	2	98,55	1,45	0,00
7	25	2	98,39	1, 61	0,00
8	25	2	97,71	2,29	0,00
1	40	2	97,77	2,23	0,00
2	40	2	96, 99	3,01	0,00
3	40	2	96, 48	3,52	0,00
4	40	2	96, 02	3,98	0,00
5	40	2	98,09	1,91	0,00
6	40	2	97, 93	2,07	0,00
7	40	2	97,23	2,77	0,00
8	40	2	96,43	3, 57	0,00

- 39 024152

Заключения.

Хранение растворов предварительной смеси геля при 2-8°С обеспечивает наилучшую стабильность Ι3Α Ъ, исходя из более высокой процентной чистоты пика ВЭЖХ, полученной для Ι3Α Ъ по сравнению с хранением растворов предварительной смеси геля при 25 и 40°С.

Два раствора предварительной смеси геля, которые обеспечили наилучшую стабильность для Ι3Α Ъ, исходя из процентной чистоты пика ВЭЖХ, представляли собой растворы номер 1 и 5. Эти растворы предварительной смеси содержали цитратный буфер с наименьшим значением рН, используемым в исследовании (рН 2,75).

Два раствора предварительной смеси геля, которые обеспечили наименьшую стабильность для Ι3Α Ъ, исходя из процентной чистоты пика ВЭЖХ, представляли собой растворы номер 4 и 8. Эти растворы предварительной смеси содержат цитратный буфер с наибольшим значением рН, используемым в этом исследовании (рН 4,00).

Снижение температуры и рН цитратного буфера в растворах предварительной смеси геля обеспечило наилучшую стабильность для Ι3Α Ъ, где процентную чистоту пика ВЭЖХ Ι3Α Ъ использовали в качестве показателя стабильности в этом исследовании.

Ссылки

Но У.С., СпГГккз СЕМ, Е1кз Ο.Ν., Сир!а Α.Κ., МсСиа1д С.С., №ско1о£Г В.к, Соорег Κ.Ό., Напикоп Т.А. апб Уоогкеез кк I. Αт Αсаб Эегта1о1 22:94-100, 1990.

Рогб кЬ. Рагеп!ега1 ргобис!з Ы: Ркагтасеийсз, Тке Заепсе оГ бозаде Гогт без1дп (Еб МЕ Ликой), СкигскШ Ыушдз!опе, Ьопбоп, 1988.

\Уабе Α. апб ^е11ег Р.1. НапбЪоок оГ Ркагтасеикса1 Ехс1р1еп!з 2^пб Ебкюп. Лте^^сап Ркагтасеикса1 Αззос^а!^оп, ХУазктдЮп, 1994.

Вапске11о кМ., Мопзкка М., Такауата К. апб №да1 Т., ΑЪзо^р!^оп оГ шзикп Ггот ркиошс Р-127 де1з Го11о\утд 8иЪси!апеои8 абтиизИакоп ш га!з. Ы! I. Ркагт 184:189-198, 1999.

ТоЫуата Т., М|уа/ак| З., апб Такаба М., Изе оГ р1иготс Р-127 де1з аз а уекю1е Гог регсЫапеоиз аЪзогрйоп. Υакиζа^даки 54:205-213, 1994.

Мопкауа К. е! а1., Епкапсетеп! оГ !кегареикс е££ес!з оГ гесотЫпап! ш!ег1еикт-2 оп а !гапзр1ап!аЪ1е га! йЪгозагсота Ъу 1ке изе оГ а зиз!атеб ге1еазе уеЫс1е, Ркиошс де1. Сапсег 47:37-41, 1987.

Ка!аката М. е! а1., Соп!го11еб ге1еазе оГ китап дго\\1к когтопе ш га!з Гокоушд рагеп!ега1 абтккз1гакоп оГ ро1охатег де1з. I. Соп!го1 Ке1 49:21-26, 1997.

\Уазап К.М., ЗиЪгататап К., Куопд М., Со1бЪегд кк, \Упдк1 Т. апб 1окпз!оп Т.Р., Ро1охатег 407 теб1а!еб акегакопз т !ке аскуЫез оГ еп/утез геди1а!шд кр1б те!аЪокзт ш га!з. I. Ркагт Зск 6 189-197, 2003.

Роуе11 М.Р., Nдиуеп Т. апб Ва1о1ап Ь. Сотрепбшт оГ Ехс1р1еп!з Гог Рагеп!ега1 Рогти1акопз. ΓΩΑ I. Ркагт δοΐ. Теск 52:238-311, 1998.

Зскто1ка Ι.Κ., Л^кГ^с^а1 зкш Ι. Ргерагакоп апб ргорегкез оГ р1иготс Р-127 де1з Гог !ке !геа!теп! оГ Ъигпз. I. Вютеб. Ма!ег. Кез., 6, 571-582, 1972.

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция для местного введения для лечения или профилактики рака кожи, содержащая а) 3ангелат ингенола; Ъ) усиливающее проникновение вещество; с) консервант; б) гелеобразующее вещество; е) буфер; при этом композиция имеет кажущееся значение рН от 3 до 4 включительно.
2. 2. Композиция по п.1, где усиливающее проникновение вещество выбрано из изопропилового спирта, сульфоксида, азона, пирролидона, алканола или гликоля.
3. 3. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где консервант представляет собой парабен, бензойную кислоту или бензиловый спирт.
4. 4. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где гелеобразующее вещество представляет собой растворимый в воде полимер, образованный из целлюлозы, карбомер или каррагенан.
5. 5. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где гелеобразующее вещество представляет собой полимер гидроксиалкилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу или метилцеллюлозу.
6. 6. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буфер представляет собой цитратный или фосфатный буфер.
7. 7. Композиция по любому из предыдущих пунктов, которая имеет кажущееся значение рН между 3 и 4.
8. 8. Композиция по п.7, которая имеет кажущееся значение рН между 3 и 3,5.
9. 9. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буфер представлен в количестве между 0,5 и 10% мас./мас. композиции.
10. 10. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая а) 0,1% мас./мас. 3-ангелата ингенола; Ъ) 30% мас./мас. изопропилового спирта; с) 0,9% мас./мас. бензилового спирта; б) 1,5% мас./мас. гидроксиэтилцеллюлозы; е) 67,5% мас./мас. цитратного буфера при рН 3.