NO344271B1

NO344271B1 - Formulering av ingenolangelat for anvendelse som medikament, fremgangsmåte for fremstilling av en formulering, preparat derav som er egnet for topisk administrering, samt anvendelse av ingenolangelat ved fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av hudkreft

Info

Publication number: NO344271B1
Application number: NO20083150A
Authority: NO
Inventors: Marc Barry Brown; Michael Edward Donald Crothers; Tahir Nazir
Original assignee: Leo Laboratories Ltd
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2008-07-15
Publication date: 2019-10-21
Also published as: US9861603B2; US20090292017A1; PL1988877T3; CA2634073C; CA2634073A1; BRPI0619919A2; EA201201452A1; EP2399571A1; US20120295971A1; KR20080092373A; EA018545B1; PT1988877E; EP1988877A2; US20120309827A1; US20180289654A1; EA024152B1; KR101451993B1; SI1988877T1; US20140357712A1; US8278292B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører sammensetninger av forbindelser som kan erholdes fra Euphorbia-arter og som er anvendbare ved behandling av hudkreft.

Forbindelsen ingenolangelat kan isoleres fra forskjellige Euphorbia-arter, og særlig fra Euphorbia peplus og Euphorbia drummondii. Ingenolangelat eksisterer i tre isoformer: ingenol-3-angelat (isoform ”b”), ingenol-5-angelat (isoform ”a”) og ingenol-20-angelat (isoform ”c”). Den første av disse betegnes her også I3A og har den følgende strukturen:

Ingenolangelat er blitt funnet å være svært toksisk for hudkreftceller grunnet hurtig mitokondriell forstyrrelse og celledød ved primær nekrose, mens friske celler forblir upåvirket.

US-A-6432452 beskriver forbindelser som foreligger i et aktivt prinsipp avledet fra planter fra artene Euphorbia peplus, Euphorbia hirta og Euphorbia drummondii som viser selektiv cytotoksisitet mot flere forskjellige kreftcellelinjer. Forbindelsene er anvendbare for effektiv behandling av kreft, særlig ondartede melanomer og platecellekarsinomer (SCC). Forbindelsene er utvalgt blant jatrofaner, pepluaner, paralianer og ingenaner. Den foretrukne forbindelse er et angeloylsubstituert ingenan som er erholdt fra sevje fra Euphorbia peplus.

Ytterligere relevant kjent teknikk inkluderer Ogbourne S. M. et al., Antitumor Activity of 3-lngenyl Angelate: Plasma Membrane and Mitochondrial Disruption and Necrotic Cell Death, Cancer Research 64, 2833-2839, 2004.

Mikrogrammengder av ingenolangelat er typisk terapeutisk effektive. Imidlertid utgjør tendensen til isoform ”b” til å gjennomgå rearrangering til isoform ”a” og deretter til isoform ”c” et formuleringsproblem dersom det er ønskelig å begrense formuleringen til enten en spesifikk isoform eller til en ratio av isoformer. Dette er særlig et problem med I3A da de forskjellige isoformene har forskjellig løselighet.

Det foreligger et behov for en effektiv, topisk behandling av hudkreft da systemiske behandlinger som involverer andre legemidler, nødvendigvis resulterer i at følsomme, friske celler i ikke-måldeler av kroppen utsettes for cytotoksiske kjemikalier. I tillegg aksepteres systemiske antikreftbehandlinger, enten administrert oralt eller ved injeksjon, dårligere av pasienten.

Det foreligger et behov for tilveiebringelse av en stabil formulering av ingenolangelat, fortrinnsvis for topisk administrering.

Det er nå overraskende blitt funnet at ingenolangelat kan løses, i det vesentlige uten rearrangering mellom isoformene, i et akseptabelt løsemiddel i nærvær av en akseptabel, blandbar, sur buffer.

I et første aspekt tilveiebringer således foreliggende oppfinnelse en formulering av ingenolangelat for anvendelse som medikament, hvor ingenolangelatet er blitt løst i et farmasøytisk akseptabelt løsemiddel valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, metyletylketon, etylacetat, dietyleter, benzylalkohol og blandinger av disse, hvor formuleringen videre omfatter et farmasøytisk akseptabelt surgjøringsmiddel som i det minste delvis er forenlig med løsemidlet og som gir formuleringen en tilsynelatende pH på 3 til mindre enn 4.

Foreliggende oppfinnelse omfatter formuleringer av hvilken som helst av isoformene av ingenolangelat eller blandinger av disse. For tiden er den foretrukne isoform isoform ”b”, også betegnet her I3A. Det vil forstås at henvisninger til ”ingenolangelat” og ”I3A” inkluderer henvisning til andre isoformer og blandinger av disse med mindre annet er åpenbart.

Ingenolangelat kan løses i mange løsemidler, og forskjellige løsemidler er illustrert i det vedlagte eksempel 1. Imidlertid er ingenolangelat vanligvis ømfintlig for rearrangering i protiske løsemidler, og en hvilken som helst vesentlig grad av rearrangering, typisk over tilnærmet 1 % for planteavledede produkter, men mer foretrukket tilnærmet 0,5 %, er uønsket i en farmasøytisk formulering.

I aprotiske løsemidler, som vanligvis er løsemidler som ikke bidrar med protoner til en løsning, slik som polyetylenglykol, kan løsning ta mye tid, og dette, sammen med de nødvendige temperaturer, kan også føre til rearrangering i en grad over det akseptable nivå.

Substanser slik som aceton og acetonitril er i stand til å løse I3A, men er vanligvis ikke farmasøytisk akseptable og er nødvendigvis ikke egnet for lang tids lagring. substanser som metyletylketon, etylacetat eller dietyleter kan være mer akseptable, men benzylalkoholer vanligvis mest foretrukket.

Et antall av substanser er egnet for løsning av I3A, men stabiliteten er ikke garantert, og generelt uakseptable nivåer av rearrangering kan observeres etter perioder som spenner mellom så lite som 12 timer og så mye som seks måneder eller et år.

I fravær av vann eller annet protisk løsemiddel vil det ikke være en målbar pH. Under slike betingelser, og særlig ved forhøyede temperaturer, er rearrangering sannsynlig. Det er følgelig blitt funnet at det er generelt mulig å inhibere rearrangering ved nærvær av en egnet syre.

Egnede syrer er generelt organiske syrer idet det er blitt fastslått at I3A kan dekomponere mye underomtrent en pH på 3, mens rearrangering sannsynligvis vil opptre ved over en pH på tilnærmet 4,5. Dersom det er ment å lagre formuleringen i perioder avhvilken som helst lengde, slik som en måned eller mer, foretrekkes det at syren er i form av en buffer. Egnede buffere inkluderer citratbuffer, fosfatbuffer, acetatbuffer og citrat-fosfatbuffer selv om andre buffere vil være åpenbare for fagfolk. Spesielt gir bufferen en tilsynelatende pH til formuleringen som 3 til mindre enn 4. Det foretrekkes spesielt at den tilsynelatende formulerings pH er 3,8 eller lavere, fortrinnsvis tilnærmet 3,5 eller lavere. En tilsynelatende pH på tilnærmet 3 er anvendbar. En buffer med en pH på 2,75 er blitt funnet å være spesielt fordelaktig og gir en tilsynelatende pH på tilnærmet 3,5 til den endelige formuleringen når den anvendes i de mengder som er illustrert i de vedlagte eksemplene. Et foretrukket pH-område for bufferen er mellom 2,6 og 2,85, fortrinnsvis pH 2,7 - pH 2,8, og er fortrinnsvis en citratbuffer. Det vil forstås at syren vanligvis vil være i form av en vandig løsning, fortrinnsvis i deionisert vann, med mindre annet er angitt. Citratbuffer foretrekkes. Dersom acetatbuffer anvendes, kan denne typisk ha et pH-område fra 3,5 til 5,5, mens citrat-fosfatbuffer typisk kan ha et pH-område fra 2,75 til 7,0.

Det vil forstås at en løsning i hvilken løsemidlet er aprotisk, ikke kan ha en pH da dette er en måling av H<+>-ionet. Dersom en slik løsning i det minste delvis er blandbar med en syre eller sur buffer og en slik er tilstede, så vil forsøk på å måle pH gi et resultat. Foretrukne formuleringer ifølge oppfinnelsen er laget som som topiske administreringsformer og vil vanligvis omfatte en hovedandel av buffer eller ionisk løsning, men vil alltid omfatte aprotisk løsemiddel slik at kun en tilsynelatende snarere enn en absolutt pH kan måles, da den målte pH relaterer kun til den ioniske komponenten. Et egnet middel for måling av tilsynelatende pH er med Jenway 3320-pH-meteret. Følgelig vil resultatet ikke nødvendigvis ha den betydning som normalt tilskrives en ionisk løsning, særlig dersom mengden av syre eller buffer er lav, men signifikansen er at i den grad et ionisk miljø foreligger, er dette miljøet surt. Etter hvert som mengden av syre øker, så vil den tilsynelatende pH bli mer ekvivalent med pH. Uten ønske om å være bundet til teori, er det sannsynlig at ingenolangelat primært er løst i det aprotiske løsemiddel da det har svært lav løselighet i vann. Påfølgende tilsetning av ingenolangelatløsningen i løsemiddel til en surgjort ionisk løsning, tillater fremstilling av en egnet, eventuelt vandig, ionisk løsning av ingenolangelat, derved unngås oppløsning av ingenolangelat direkte i et protisk løsemiddel som er når den største grad av rearrangering ser ut til å finne sted. Kontakt med et protisk løsemiddel kan således umiddelbart føre til dannelse av de andre isoformene, men dette kan minimaliseres hvis en liten mengde syre eller sur buffer, disse begrepene anvendes synonymt her med mindre annet er åpenbart, er tilsatt. Selv handlingen med å løse i protiske løsemidler kan, grunnet tiden og betingelsene som er nødvendige, føre til et uønsket høyt nivå av isoformdannelse, så ømfitlig er ingenolangelat for rearrangering.

Løsemiddel og syren er i det minste delvis forenlige ved at et stabilt preparat av de to kan dannes. Syren og løsemidlet er fortrinnsvis blandbare, og fortrinnsvis blandbare i alle ratioer. Særlig foretrekkes det vanligvis å tilsette en liten mengde buffer til løsemidlet under eller kort tid etter løsningen av ingenolangelat for å holde den tilsynelatende pH på et relativt lavt nivå. Deretter kan det være ønskelig å tilberede det solubiliserte ingenolangelatet i et overskudd av bufferen som ble anvendt under den innledende solubiliseringen. Stabile preparater tilberedt med et overskudd av buffer, er illustrert i eksempel 9 nedenfor.

Det vil forstås at det foretrekkes at syren og løsemidlet er tilstrekkelig blandbare for å kunne danne en enkelt fase, selv om de ikke er blandbare eller mindre blandbare, kan løsemidler og syrer fremstilles i form av emulsjoner eller mikroemulsjoner. Slike emulsjoner kan være stabile, men tilveiebringelse av en blanding av løsemiddel og syre som en enkelt fase vil vanligvis ytterligere minimalisere en hvilken som helst risiko for rearrangering av angelat.

Løsemidler som er spesielt anvendbare i den foreliggende oppfinnelse, er løsemidler som viser både hydrofile og lipofile egenskaper, slik som ringsystemer som fortrinnsvis er homosykliske og som har hydroksygrupper som substitusjoner, men atskilt med minst ett karbonatom fra ringstrukturen. Et spesielt foretrukket eksempel på et slikt løsemiddel er benzylalkohol.

Selv om det er mulig å anvende en syre heller enn en buffer, foretrekkes det vanligvis å anvende en sur buffer for å minimalisere variasjonene i pH. Det vil følgelig forstås at selv om begrepet ”buffer” vanligvis vil anvendes her, omfatter dette begrepet også syrer og syrepreparater hvor dette er egnet. En spesielt foretrukket buffer er citratbuffer, pH 3 eller lavere, fortrinnsvis pH 2,75. I benzylalkohol vil en 2,5 % (vekt/vekt) mengde av citratbuffer pH 2,5 vanligvis gi en umålelig tilsynelatende pH, men gir i høyere mengder en pH på tilnærmet pH 3. Sammenhengen mellom bufferens pH og den tilsynelatende pH utforskes i de vedlagte eksemplene. Ved lave mengder av buffer når I3A løses i løsemidlet, er det ganske enkelt foretrukket å holde miljøet surt, og egenskapen til den foretrukne buffer ved disse nivåene ligner på egenskapene til den foretrukne buffer når formuleringen deretter fortynnes for anvendelse. Det foretrekkes vanligvis å surgjøre løsemidlet, fortrinnsvis benzylalkohol, med en mengde sur buffer, fortrinnsvis mellom 1 og 10 % (vekt/vekt), mer foretrukket mellom 2 og 5 %, før tilsetning av I3A.

Selv om formuleringen ikke må fortynnes for anvendelse, er det vanligvis tilfelle at I3A en potent substans, og stamløsninger av I3A i løsemiddel, fortrinnsvis benzylalkohol, kan fremstilles for lagring, fortrinnsvis ved 8 ºC eller lavere. Slike stamløsninger kan så fortynnes, fortrinnsvis med buffer, som ønsket, når en endelig formulering eller et endelig preparat tilberedes.

Mengden av buffer som anvendes når ingenolangelatet løses, kan variere mellom tilnærmet 0 og 100 %. Dersom mengden er 0, er det foretrukket å tilsette en mengde av buffer kort etter å tilsette ingenolangelatet til løsemidlet, for å minimere sannsynligheten for at rearrangering finner sted. Det er vanligvis foretrukket å unngå anvendelse av mengder av buffer høyere enn 100 % (vekt/vekt) av løsemidlet da oppløsning direkte i bufferen vanligvis ikke er lett oppnåelig. Det foretrekkes å benytte bufferen som et middel for å holde den tilsynelatende pH i løsemidlet på et lavt nivå uten at det tilføres en vesentlig mengde av protisk løsemiddel under oppløsningen av ingenolangelat. Etter at ingenolangelat i det vesentlige er blitt løst, så er det mulig og kan til og med være ønskelig å fremstille formuleringen med et overskudd av buffer som omfatter, om ønskelig, andre eventuelle protiske bestanddeler, slik som for eksempel antibiotika.

Foretrukne nivåer av buffer er i området fra 0,5 % til 10 %, og fortrinnsvis mellom 1 % og 5 %, hvor tilnærmet 2-3 % er mest foretrukket under oppløsningsfasen. Oppløsningsfasen omfatter løsning av i det minste en hovedmengde av ingenolangelatet i løsemidlet, fortrinnsvis minst 95 % (vekt/vekt) av ingenolangelat i løsemidlet og mer foretrukket minst 99 % (vekt/vekt).

Formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes direkte eller lagres for fremtidig anvendelse. I tillegg kan formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringe en basal formulering som så kan ytterligere modifiseres før anvendelse. For eksempel kan, som beskrevet ovenfor, formuleringen tilberedes i et overskudd av buffer eller for eksempel formuleres til en gel.

Det er også blitt funnet at formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse vanligvis er mer stabile ved lavere temperaturer. Spesielt foretrukne formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som de som omfatter benzylalkohol og citratbuffer, kan vise vesentlig stabilitet ved temperaturer så høye som 40 ºC, men generelt observeres økende stabilitet ved temperaturer under romtemperatur og -trykk (RTP), og den høyeste stabilitet observeres ved temperaturer under tilnærmet 8 ºC. Frysing ser ikke ut til å øke stabiliteten slik at den høyeste stabilitet vanligvis oppnås ved ganske enkelt å plassere formuleringene ifølge oppfinnelsen i et konvensjonelt kjøleskap ved en temperatur mellom tilnærmet 2 ºC og 8 ºC.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av en løsning av ingenolangelat som omfatter å løse ingenolangelatet i et farmasøytisk akseptabelt løsemiddel valgt fra gruppen bestående av polyetylenglykol, metyl-etylketon, etylacetat, dietyleter, benzylalkohol, og blandinger derav, hvor formuleringen videre omfatter et farmasøytisk akseptabelt surgjøringsmiddel som i det minste delvis er forenlig med løsemidlet og som gir formuleringen en tilsynelatende pH på 3 til mindre enn 4, hvor syren tilsettes sammen med, før eller etter ingenolangelatet.

I et alternativ tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en løsning av ingenolangelat som omfatter å løse ingenolangelatet i et farmasøytisk akseptabelt løsemiddel valgt fra gruppen bestående av polyetylenglykol, metyl-etylketon, etylacetat, dietyleter, benzylalkohol, og blandinger derav, hvor fremgangsmåten omfatter tilsetning av et farmasøytisk akseptabelt surgjøringsmiddel som i det minste delvis er forenlig med løsemidlet og som gir formuleringen en tilsynelatende pH på 3 til mindre enn 4, hvor surgjøringsmidlet tilsettes sammen med, før eller etter ingenolangelatet. Surgjøringsmidlet er fortrinnsvis en buffer.

Det foretrekkes å tilsette syren eller bufferen tilstrekkelig kort tid etter tilsetningen av I3A for å sikrer at ikke mer enn tilnærmet 1 %, fortrinnsvis ikke mer enn tilnærmet 0,5 % av ”b”-isoformen rearrangeres til ”a”-isoformen. Fortrinnsvis tilsettes syren eller bufferen til løsemidlet før I3A tilsettes selv om de tre bestanddelene kan kombineres samtidig. Dette siste er det minst foretrukne alternativet.

Denne fremgangsmåten kan også anvendes for fremstilling av ingenolangelatformuleringer ved anvendelse av andre forbindelser og løsemidler, slik som polyetylenglykol, hvor direkte solubilisering kan være forbundet med et uakseptabelt nivå av rearrangering. Selv om I3A kan løses i PEG, krever dette rundt en time ved forhøyet temperatur, noe som vanligvis fører til dannelse av et uakseptabelt nivå av ”a”-isoformen. Hvis I3A løses i bufret benzylalkohol først, så kan denne løsningen innføres direkte i PEG uten den langvarige eksponeringen overfor varme. Da kun nok benzylalkohol er nødvendig for å løse I3A, så trenger den totale mengden av benzylalkohol i den endelige PEG-formuleringen bare være i området av 1 % (vekt/vekt) eller lavere.

Disse formuleringene kan lagres over lengre perioder, særlig når de holdes ved temperaturer på 8 ºC eller lavere. Foretrukne sammensetninger viser ikke mer enn tilnærmet 1 %, fortrinnsvis ikke mer enn 0,5 %, rearrangering av ”b”-isoformen til ”a”-isoformen etter 3 måneder, mer foretrukket 6 måneder.

Oppfinnelsen tilveiebringer en formulering for anvendelsen ved behandling av en hudkreft.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av ingenolangelat for fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av hudkreft, hvor ingenolangelatet løses i et farmasøytisk akseptabelt løsemiddel valgt fra gruppen bestående av polyetylenglykol, metyletylketon, etylacetat, dietyleter, benzylalkohol, og blandinger derav og hvor formuleringen videre omfatter et farmasøytisk akseptabelt surgjøringsmiddel som i det minste delvis er forenlig med løsemidlet og som gir formuleringen en tilsynelatende pH på 3 til mindre enn 4.

Egnede kreftformer for behandling i samsvar med den foreliggende oppfinnelse omfatter platecellekreft og basalcellekreft.

Det vil forstås at ”behandling” som anvendt her, omfatter både terapi og profylakse.

Foreliggende bekrivelse omtaler også en fremgangsmåte for behandling av et individ som lider av en krefttilstand i huden som omfatter topisk tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av en sammensetning ifølge oppfinnelsen til området med krefttilstanden.

Egnede individer for behandling er pattedyr, inkludert mennesker, primater, buskap (inkludert kuer, hester, sauer, griser og geiter), selskapsdyr (inkludert hunder, katter, kaniner, marsvin), ville dyr i fangenskap og laboratoriedyr, slik som kaniner, mus, rotter, marsvin og hamstere. Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt egnet for behandling av hudkreft hos mennesker.

Det vil forstås at formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en hvilken som helst egnet kreftprofylakse eller -behandling. Administrasjonsformene kan være hvilke som helst egnet form, og inkluderer kremer, geler, salver, lotions, sprayer, lakker og løsninger for pensling for topisk påføring, pulvere, løsninger og suspensjoner for luftveiene, løsninger og emulsjoner for injeksjon, kapsler, siruper og eliksirer for oral administrering og pessarer og stikkpiller. Andre egnede administreringsformer vil være åpenbare for fagpersonen og kan for eksempel omfatte transdermale plastre. I en foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse formuleres ingenolangelatformuleringene for topisk administrering.

I alle tilfeller er den innledende formuleringen en formulering ifølge oppfinnelsen. Formuleringen kan tilberedes til den endelige formen, enten like før anvendelsen eller så snart som ønskelig etter fremstilling av formuleringen, men vil vanligvis forbli en formulering ifølge oppfinnelsen hele tiden.

Formuleringer kan omfatte ytterligere ingredienser som diskutert nedenfor. Det foretrekkes spesielt å benytte antioksidanter da disse ser ut til å gi formuleringene en forbedret stabilitet. Egnede eksempler på antioksidanter inkluderer retinol, askorbinsyre, lykopen, butylert hydroksytoluen og tokoferol.

Mengden av ingenolangelat som er nødvendig for farmasøytisk virkning, vil være åpenbar for fagpersonen og kan tilpasses ut fra fysiologiske parameterer slik som alder, kroppsvekt og kjønn til pasienten, så vel som størrelsen av en hvilken som helst lesjon. Generelt kan en mengde av ingenolangelat som vil gi mellom tilnærmet 0,01 μg cm<-2>og tilnærmet 1 mg cm<-2>benyttes, med et område fra 0,1 mg cm<-2>til tilnærmet 100 μg cm<-2>som ytterligere foretrukket. I de vedlagte eksemplene ble en formulering som ga 15 μg cm<-2>, anvendt, men formuleringer som gir 1 μg cm<-2>eller mindre, er blitt funnet å være effektive. Alternativt kan formuleringer ifølge oppfinnelsen inneholde I3A i en mengde på fra 0,001 % (vekt/vekt) til 0,15 % (vekt/vekt), mer foretrukket opp til tilnærmet 0,1-0,12 % (vekt/vekt).

Topiske formuleringer er en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse. I denne sammenheng er en til nå ikke anerkjent egenskap ved ingenolangelatene spesielt nyttig ved at det er blitt funnet at de har vasokonstriktoregenskaper. Følgelig blir den systemiske fordelingen av den aktive bestanddel minimaliseres grunnet den reduserte blodstrøm i nærheten av det behandlede område.

Det vil forstås at egenskapene til formuleringen vil bestemme permeasjonshastighet gjennom huden. Det foretrekkes følgelig vanligvis at formuleringen er fremstilt slik at det oppnås en permeasjonshastighet på minst tilnærmet 11 ng cm<-2>time<-1>. Det er ingen spesiell øvre grense selv om det vanligvis foretrekkes at permeasjonshastigheten ikke overskrider 1 μg cm<-2>time<-1>.

Topiske formuleringer kan ha hvilken som helst egnet form. Generelt foretrekkes det at de viser en viss grad av viskositet slik at de kan påføres det ønskede område uten at de renner bort. Følgelig foretrekkes det vanligvis å utforme ingenolangelat som kremer, geler, salver og løsninger for pensling. Gitt potensen av ingenolangelat kan løsninger for pensling benyttes da disse kan påføres sparsomt avhengig av nivået av aktiv bestanddel.

Poloksamerer kan anvendes i foretrukne formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse. De er kopolymerer som består av et hydrofobt poloksypropylen (POP) -molekyl som ligger mellom to hydrofile molekyler av poloksyetylen (POE). Følgelig har de evnen til å solubilisere lipofile legemidler i sin hydrofobe kjerne. Videre viser poloksamerbaserte, vandige gelformuleringer termoreologiske egenskaper, noe som kan være fordelaktig for lokalisert, vedvarende tilførsel av legemidler. Over en viss temperatur, kjent som den kritiske micelletemperatur (cmt), øker viskositeten av poloksamer-gelen dramatisk. En økning av viskositeten fører til redusert diffusjon av eventuelle legemidler som er løst i gelen, noe som sakker ned på frigjøringen av legemidlet fra gelen og fører til vedvarende tilførsel. Økningen i viskositet kan også tilveiebringe et langvarig, lokalisert ”lager” i virkesetet.

Cmt-en er avhengig av en rekke variabler, slik som konsentrasjonen av poloksamer og andre tilsetningsstoffer, slik som propylenglykol. Ideelt bør cmt-en være ved en temperatur som gjør at formuleringen kan injiseres i lesjonen som en væske (enkel administrering), og ved kontakt med kroppstemperatur dannes en gel, slik at det oppnås en lokalisert, vedvarende tilførsel av legemidlet. Fem poloksamerer er opplistet i USP og inkluderer poloksamer 188 og poloksamer 407. Poloksamer 188 er blitt godkjent som eksipiens for IV-formuleringer (http://www.accessdata.fda.gov).

Poloksamer-geler er blitt anvendt for subkutan tilførsel av insulin (Barichello et al., 1999) og andre legemiddel-tilførselssystemer for perkutan anvendelse (Tobiyama et al., 1994). Én spesiell kopolymer, poloksamer 407, er blitt administrert subkutant for langsom frigjøring av peptider og terapeutiske proteiner, som inkluderer interleukin-2 og humant veksthormon (Morikawa et al., 1987; Katakama et al., 1997). Etter administreringen frigjorde gelene langsomt de innfangede proteinmolekylene over en periode på 1-2 dager. Videre gjennomgikk en vesentlig andel av denne poloksameren til slutt utskillelse via nyrene.

Poloksamerer anses generelt som ikke-toksiske og ikke-irriterende materialer. Toksisitetsstudier i dyr, med hunder og kaniner, har vist at poloksamerer er ikkeirriterende og ikke-sensibiliserende ved tilførsel i konsentrasjon på 5 % (vekt/vol) og 10 % (vekt/vol) til øyne, gummer og hud. I en 14 dagers studie med intravenøs administrering til kaniner i konsentrasjoner på opp til 0,5 g/kg/dag ble ingen åpenbare bivirkninger notert. En lignende studie med hunder viste også ingen bivirkninger ved doseringsnivåer opp til 0,5 g/kg/dag. Videre ble ingen hemolyse av humane blodceller observert over et tidsrom på 18 timer ved 25 ºC med 0,001-10 % (vekt/vekt) poloksamer-løsninger (Wade og Weller, 1994). Hyperlipidemi i rotter er imidlertid blitt rapportert ved tilførsel av en intraperitoneal (IP) injeksjon (1,0 g/kg) av poloksamer 407 (Wasan et al., 2003).

Oljer kan også anvendes i den foreliggende oppfinnelse. Anvendelse av en emulsjonsbasert, intralesjonal formulering er blitt rapportert for behandling av psoriasis (Ho et al., 1990). Før administrering blir en bærer, slik som polyoksyetylert laksérolje, normalt fortynnet med saltvann for å danne emulsjonen. Våre undersøkelser har imidlertid vist at fortynning av I3A med normalt saltvann øker omdanningen av isoform ”b” til ”a”. Denne omdanningen kan minimaliseres hvis administreringstiden for formuleringen er kort.

Det finnes en rekke lipofile produkter som formuleres som oljebaserte løsninger for intramuskulære administreringer (IM), for eksempel Prolixin Enanthate (Bristol Myers Squibb). Bæreren (oljen) som anvendes, varierer meget, fra vegetabilske oljer slik som jordnøttolje (sammen med benzylbenzoat i Dimercaprol for injeksjon B.P.) og sesamolje (anvendt i depot-injeksjoner av Fluphenazine Enanthate for injeksjon B.P.). Anvendelse av oljeholdige bærere kan forsinke absorpsjonen grunnet forsinket fordeling av legemidlet fra oljen til de vandige kroppsvæskene (Ford, 1987). Når det injiseres i et vandig miljø (slik som muskelvev), vil et relativt lipofilt legemiddel som I3A oppløst i en oljefase, ha en tendens til ikke å forlate oljen og ”øyeblikkelig” fordeles inn i den vandige fasen. På denne måten kan en vedvarende frigjøringseffekt oppnås.

Bukkale formuleringer kan også benyttes. Transmukosal tilførsel av terapeutiske midler er en populær tilførselsform, fordi slimhinner er relativt permeable, som tillater det hurtige opptaket av et legemiddel inn i den systemiske sirkulasjonen og da kan «first pass»-metabolisme unngås. Transmukosale produkter kan utformes for administrering via den nasale veien og den orale/bukkale veien ved anvendelse av mukoadhesive midler. I utviklingen av disse legemiddeltilførselssystemene er mukoadhesjon av innretningen/-formuleringen et nøkkelelement. Begrepet ”mukoadhesiv” anvendes vanligvis for materialer som kleber til mucinlaget på en biologisk membran. Mukoadhesive polymerer er blitt benyttet i mange forskjellige doseringsformer i forsøk på å oppnå systemisk og lokalisert tilførsel av legemidler gjennom de forskjellige slimhinnene. Disse doseringsformene omfatter tabletter, plastre, klebestrimler, filmer, halvfaste stoffer og pulvere.

For å kunne fungere som mukoadhesive polymerer bør polymerene ha bestemte fysikalsk-kjemiske egenskaper, slik som hovedsakelig å være anioniske med flere hydrogenbindingsdannende grupper, egnede overflateegenskaper for fukting av slimhinner/slimhinnevevsoverflater og tilstrekkelig fleksibilitet og lengde (molekylvekt) til at de penetrerer mucus-nettverket eller vevssprekker. Mangfoldige klasser av polymerer er blitt rapportert som mulige mukoadhesive midler, f.eks. karbomerer (polyakrylsyrer), hydroksypropylmetylcellulose (HPMC) så vel som naturlig forekommende polymerer, slik som hyaluronsyre og kitosan.

Fremstilling av egnede formuleringer er innenfor teknikkens stand, og egnede eksipienser for inkludering i en hvilken som helst slik formulering omfatter for eksempel geldannende midler, viskositetsøkende midler, penetrasjonsfremmende midler, konserveringsmidler, slik som antibiotika og antisoppmidler, og kosmetiske ingredienser, slik som duftstoffer og fargestoffer.

Egnede geldannende midler omfatter: vannløselige, celluloseavledede polymerer som hydroksyalkylcellulosepolymerer (f.eks. hydroksymetylcellulose, hydroksyetylcellulose, hydroksypropylcellulose og hydroksypropylmetylcellulose), karboksymetylcellulose, metylhydroksyetylcellulose og metylcellulose, karbomer (f.eks. karbopol) og karrageenaner. Det geldannende middel kan tilsettes i hvilken som helst egnet mengde, slik som 1-5 % (vekt/vekt). Foretrukne geldannende midler er celluloseavledede, mest foretrukket hydroksyalkylcellulose, fortrinnsvis hydroksyetylcellulose.

Egnede konserveringsmidler vil være åpenbare for fagfolk og omfatter parabenene (metyl-, etyl-, propyl- og butyl), benzosyre og benzylalkohol.

Konserveringsmidler som kun anvendes for dette formål, vil vanligvis utgjøre 1 % (vekt/vekt) eller mindre av den endelige topiske formuleringen.

Egnede penetrasjonsfremmende midler inkluderer isopropylalkohol, sulfoksider (f.eks. dimetylsulfoksid, DMSO), azoner (f.eks. laurokapram), pyrrolidoner (for eksempel 2-pyrrolidon), alkanoler (f.eks. dekanol) og glykoler (for eksempel propylenglykol).

Foretrukne sammensetninger ifølge oppfinnelsen omfatter:

a) I3A,

b) penetrasjonsfremmende middel,

c) konserveringsmiddel,

d) geldannende middel, og

e) buffer,

hvor sammensetningen har en tilsynelatende pH på mellom 3 og 4.

Et spesielt foretrukket preparat omfatter:

a) 0,1 % (vekt/vekt) I3A,

b) 30 % (vekt/vekt) isopropylalkohol,

c) 0,9 % (vekt/vekt) benzylalkohol,

d) 1,5 % (vekt/vekt) hydroksyetylcellulose, og

e) 67,5 % (vekt/vekt) citratbuffer pH 3, fortrinnsvis pH 2,75.

Oppfinnelsen vil nå beskrives ved henvisning til de vedlagte figurer, hvor:

Figur 1: viser en skjematisk fremstilling av en Franz-celle.

Figur 2: Prosentdelen av isoform ”b” i isopropanol-gel (pH 6,5).

Figur 3: Prosentdelen av I3A ”b” i 30 % IPA/citratbuffer (pH 3).

Figur 4: Prosentdelen av I3A ”b” i 100 % benzylalkohol ved 2-8 ºC, RTP og 40 ºC.

Figur 5: Prosentdelen av I3A ”b” i 100 % fenoksyetanol ved 2-8 ºC, RTP og 40 ºC.

Figur 6: viser et flytdiagram for fremstilling av 0,1 % (vekt/vekt) I3A formulering 16 og den tilsvarende placebo. *For placeboformuleringen ble 0,25 g benzylalkohol tilsatt til 24,75 g av den basale utforming.

Figur 7: Relative G’- og G”-verdier for formuleringene 4, 14, 15, 16 og 17 (n=5 ± SD).

Figur 8: Tilsvarende tan d-verdier for formuleringene 4, 14, 15, 16 og 17.

Figur 9: Grafisk fremstilling av gjennomsnittlig frigjort mengde etter 26 timer (μg/cm<2>) av I3A ”b” fra 0,1 % (vekt/vekt) poloksamergel og PEG 400-formuleringer (n=3 ± SE).

Figur 10: Grafisk fremstilling av gjennomsnittlig frigjort mengde etter 26 timer (μg/cm<2>) av I3A ”b” fra 0,1 % (vekt/vekt) olje og PEG 400-formuleringer (n=3 ± SE).

Den foreliggende oppfinnelsen vil nå ytterligere illustreres med henvisning til de påfølgende eksemplene.

Eksempel 1

Stabiliteten av I3A ble undersøkt i forskjellige løsemiddelsystemer, inkludert aceton, acetonitril, metanol/vann, vann, DMSO, fosfatbuffere (pH-område 4,5 til 7) og ammoniumbuffer (pH 4,5) og ble vist å være stabil i aceton, acetonitril, DMSO, fosfatbuffer pH 4,5 og ammoniumbuffer (pH 4,5). Rearrangeringen av ingenolangelat så ut til å skje i rekkefølgen rearrangering av isomer ”b” til isomer ”a”, og så til isomer ”c”. Grunnet de små mengdene av aktiv forbindelse som ble anvendt, ble stabiliteten av forbindelsen beregnet som forholdet mellom arealet av topp ”b” og arealet av topp ”a”.

Materialer

Tabell 1. Leverandører av materialer som anvendes i dette eksempel

Alle eksipienser anvendt i den endelige formuleringen av I3A av kompendial kvalitet.

Fremgangsmåter

Undersøkelse av stabiliteten av I3A i løsemidler/eksipienser

En stabilitetsstudie av I3A i følgende løsemidler/eksipienser/eksipienskombinasjoner ble utført over et tidsrom på 14 dager (med mindre annet er angitt) ved romtemperatur:

Aceton

Acetonitril

Metanol

Metanol/vann (70/30)

Vann

Fosfatbuffer pH 4,5, pH 5,5, pH 6,5, pH 7,0

DMSO*

Mineralolje

Miglyol 810

Polyetylenglykol 300

Propylenglykol

Oljesyre

2-hydroksypropyl- β-syklodekstrin (CAVASOL/H2O)

2-hydroksypropyl- β-syklodekstrin (CAVASOL/PO4 pH 4,5)

Tween 80/Span 80/H2O

Tween 80/Span 80/PO4 pH 4,5

β-syklodekstrinsulfobutyleter (CAPTISOL)/H2O**

β-syklodekstrinsulfobutyleter (CAPTISOL)/PO4 pH 4,5**

Natriumhyaluronat (HA)/PO4 pH 4,5***

Natriumhyaluronat (HA)/H2O pH 4,5***

*10 dagers undersøkelse ** 7 dagers undersøkelse *** 2 dagers undersøkelse

En 0,5 mg/ml stamløsning av I3A i acetonitril ble fremstilt. Alikvoter på 0,1 ml ble overført til enkeltvise glassprøveflasker ved hjelp av en byrette, løsningene ble tørket med en luftstrøm og så ble 1,0 g av det/den angjeldende løsemidlet/eksipiensen/-eksipienskombinasjon tilsatt til flaskene. På dag 0, dag 5 og dag 14 ble alikvoter av stabilitetsprøvene tatt ut for HPLC-analyse ved anvendelse av kromatografibetingelsene som er beskrevet under ”Stabilitet i DMSO” nedenfor. Stabiliteten ble uttrykt som forholdet mellom topp ”b” og topp ”a” (og topp ”c” hvis tilstede), hvor et høyt forhold indikerer stabilitet i en gitt eksipiens.

HPLC-analyse av stabiliteten av I3A i eksipiensstudium

En alternativ HPLC-fremgangsmåte ble utviklet for å kunne separere en ”skulder” som forelå i topp ”b” for noen preparater av I3A.

Kromatografibetingelsene som ble benyttet for eksipiensstabilitetsstudiet, var som følger:

Kolonne: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

(S/nr. 3-34070)

Kolonnelengde: 100 x 4,60 mm

Kolonnetemperatur: 25 ºC

Beskyttelseskolonne: C18 Columbus (Phenomenex)

(S/nr. 202678)

beskyttelseskolonne lengde: 50 x 4,60 mm

Mobil fase: 50 % vol/vol fosfatbuffer pH 4,5 /

50 % vol/vol acetonitril

Elueringshastighet: 1,0 ml/min

UV-bølgelengde: 230 nm

Injeksjonsvolum: 10 μl

Analysetid: 35 minutter

Innledende in vitro diffusjonsstudium

Etter at stabiliteten av I3A i eksipiensene og de penetrasjonsfremmende midlene var blitt fastslått, kunne et innledende in vitro diffusjonseksperiment utføres for å bestemme permeasjonen av stratum corneum for I3A fra noen enkle formuleringer.

Franz-diffusjonscellen er utformet for å etterligne de fysiologiske og anatomiske egenskapene til hud in situ. Dette er en luft-/væskefase statisk celle som omfatter en donoravdeling, en mottakeravdeling og en sidearm med en uttaksåpning (se figur 1). Kirurgisk skåret ut hud plasseres mellom de to halvdelen med stratum corneum vendende mot donoravdelingen for å tillate legemiddel påføring

Et innledende in vitro diffusjonseksperiment ble utført ved anvendelse av en enkel formulering av I3A i miglyol. Det var over hodet ingen fluks av legemidlet over stratum corneum, noe som antyder på at I3A ikke var formulert ved sin maksimale termodynamiske aktivitet i miglyol. Denne formuleringen ble anvendt i senere diffusjonscelleeksperimenter som en negativ kontroll og fungerte også til å bekrefte integriteten av stratum corneum for hvis det ikke var noen diffusjon av legemidlet fra denne formuleringen, kan det antas at stratum corneum forblir intakt

Fremstilling av formuleringer

En formulering av I3A ble fremstilt i fosfatbuffer (pH 4,5) med tilsatte β-syklodekstriner (CAPTISOL) med det formål å øke løseligheten og stabiliteten av I3A og fluksen av legemidlet. En andre formulering i DMSO, et kjent penetrasjonsfremmende middel, ble også fremstilt for sammenligningsformål, så vel som en formulering i miglyol som fungerte som negativ kontroll. Diffusjonen av I3A over stratum corneum fra disse formuleringene ble undersøkt.

Følgende formuleringer ble fremstilt:

Utforming Beskrivelse

1 I3A/CAPTISOL (30 mM)/fosfatbuffer pH 4,5

2 CAPTISOL (30 mM)/fosfatbuffer pH 4,5 kontroll

3 I3A/miglyol

4 miglyolkontroll

5 I3A/DMSO/fosfatbuffer pH 4,5

6 DMSO/fosfatbuffer pH 4,5 kontroll

Tabell 2 viser % (vekt/vekt) av hver av ingrediensene som foreligger i formuleringene. Ingrediensene ble nøyaktig innveid i forseglbare glassflasker og omrørt kraftig med en magnetisk rørepinne i flere timer ved romtemperatur. insufficientOCRQuality for page 18

Valg av mottakervæske

2-hydroksypropyl- β-syklodekstrin (CAVASOL, 1,38 mM) i PO4-buffer (pH 4,5) var mottakervæsken som ble anvendt i denne studien i et forsøk på å oppnå reservoarbetingelser. En begrensning for andre reservoarvæsker, slik som etanol/vann-systemer ble innført, da ”tilbakediffusjon” av etanol gjennom stratum corneum kunne ha degradert I3A som forelå i formuleringene.

Hudfremstilling

En frisk, kirurgisk skåret ut prøve av menneskehud ble erholdt direkte etter en mageplastikk. Donoren var en 56 år gammel hvit, ikke-røykende kvinne av kaukasisk herkomst. Subkutant fett ble forsiktig fjernet fra hudprøven ved anvendelse av pinsetter og en skalpell, hvoretter hudbiten ble neddyppet i vann ved 60 ºC i 45 sekunder. Huden ble så festet med nåler og med dermis-siden ned til en korkplate, og epidermis (omfattende stratum corneum og levende epidermis) ble forsiktig fjernet fra den underliggende dermis. Dermis ble fjernet, og epidermal membranen fikk flyte på overflaten av vann og ble overført til Whatman nr. 1 filtrerpapir. Det resulterende epidermal laget ble tørket grundig og lagret flatt i aluminiumsfolie ved -20 ºC inntil anvendelse.

Et stykke av epidermal laget (med filterpapirsiden opp) ble festet og inkubert i 4 t. ved 4 ºC neddyppet i 0,1 % (vekt/vol) trypsinløsning. Huden ble så inkubert videre i 1 t. ved 37 ºC. Stratum corneum ble fysisk fjernet ved forsiktig risting av klemmen med laterale bevegelser. Det resulterende stratum corneum-laget ble vasket to ganger med deionisert vann etterfulgt av 0,1 % (vekt/vol) anti-trypsinløsning for å blokkere enzymaktivitet og videre to gangers vask med deionisert vann. Stratum corneum ble tørket og lagret flatt i aluminiumsfolie ved -20 ºC inntil anvendelse.

Franz-cellediffusjonsstudium

Enkeltvis kalibrerte Franz-diffusjonsceller med et gjennomsnittlig diffusjonsoverflateareal på 0,56 ± 0,05 cm<2>og et gjennomsnittlig mottakervolum på 1,79 ± 0,06 ml ble anvendt for å utføre diffusjonseksperimentene. Stratum corneum (fremstilt som beskrevet ovenfor) ble vasket med fosfatbuffer (pH 4,5), kuttet med et 10 tommers hullbor og montert i Franz-cellene (vist i figur 1). Mottakervæsken som ble benyttet, var 2-hydroksypropyl- β-syklodekstrin (CAVASOL)/fosfatbuffer (pH 4,5), og denne ble overført til Franz-cellen, omrørt konstant med en magnetrører og holdt ved 37 ºC. Membranene fikk ekvilibrere med mottakerfasen i 30 minutter før påføring av formuleringene. Et utall av doser av hver formulering ble påført membranoverflaten ved anvendelse av en FINPIPETTE med positiv fortrengning, og donorkamrene ble beskyttet med PARAFILM. Fem prøvetidspunkter ble undersøkt (1, 2, 4, 6 og 24 timer), hvorved 200 μl av mottakervæsken forsiktig ble fjernet fra armen i Franz-cellen; hver uttatte prøve ble erstattet med et likt volum frisk (37 ºC) mottakervæske. Gjennom hele eksperimentet ble eventuelt tap av mottakervæske grunnet fordamping fra Franz-cellen erstattet for å holde volumet konstant. Prøvene ble analysert ved HPLC (se nedenfor).

HPLC-analyse for in vitro diffusjonsstudium

Kromatografibetingelsene som ble benyttet, var som følger:

Kolonne: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

(S/nr. 3-34070)

Kolonnelengde: 100 x 4,60 mm

Kolonnetemperatur: 25 ºC

Beskyttelseskolonne: C18 Columbus (Phenomenex)

(S/nr. 202678)

Beskyttelseskolonnes lengde: 50 x 4,60 mm

Mobil fase: 50 % (vol/vol) ammoniumbuffer pH 4,5/

50 % (vol/vol) acetonitril

Elueringshastighet: 1,0 ml/min

UV-bølgelengde: 230 nm

Injeksjonsvolum: 10 μl

Analysetid: 35 minutter

Resultater

Stabilitet av I3A i løsemidler og eksipienser

Tabell 3 nedenfor gir en indikasjon på stabiliteten av I3A i de forskjellige løsemiddelsystemene. Stabiliteten av I3A i løsemidlene og eksipiensene etter 14 dager (med mindre annet er angitt) ved romtemperatur ble kvantifisert som forholdet mellom isoform ”b” og isoformene ”a” og ”c”, hvor en predominans av ”b” tilsvarer stabilitet. Resultatene er oppsummert i tabell 3. Det antas at for en eksipiens i hvilken I3A ikke er stabil, vil andre, lignende eksipienser ikke være egnet.

Tabell 3. Oppsummering av resultatene fra stabilitetsstudien av I3A i forskjellige løsemidler og eksipienser

<*>10 dagers undersøkelse<**>7 dagers undersøkelse<***>2 dagers undersøkelse

Innledende in vitro diffusjonsstudium

Tabell 4 gir en sammenligning av fluksen av formuleringer av I3A som bestemt fra den kumulative mengde av I3A som har trengt gjennom pr. enhetsareal. DMSO er ett av de tidligste og mest undersøkte penetrasjonsfremmende midler og det har blitt vist å fremme perkutan penetrasjon av mange medikamenter i in vitro og in vivo eksperimenter. Følgelig var DMSO en anvendbar sammenligningseksipiens for bekreftelse av penetrasjonen av stratum corneum av I3A. Gitt dette løsemidlets svært toksiske egenskaper og det faktum at det gir irreversibel hudskade, så ville imidlertid DMSO ikke anvendes i en endelig formulering. Ingen permeasjon av I3A ble observert med miglyolformuleringen. En mulig forklaring på denne manglende diffusjonen av I3A fra miglyol over stratum corneum er at I3A er svært løselig i denne eksipiensen.

Tabell 4. Sammenligning av fluksen mellom formuleringer av I3A bestemt ut fra den kumulative mengden av I3A som har trengt gjennom pr. enhetsareal (middelverdi ± s.e.m, n=3 hhv. 4).

Resultatene viser at I3A diffunderer over stratum corneum (som utgjør hovedbarrieren for diffusjon av de fleste legemidler) i påvisbart nivå.

Stabilitetsstudium ved 4-8 ºC

Stabiliteten av I3A i forskjellige løsemidler ved 4-8 ºC ble undersøkt. En stamløsning av I3A ble fremstilt ved å innveie 1,26 mg I3A og løse dette i 2 ml aceton. Denne stamløsningen ble anvendt for fremstilling av stabilitetsprøvene som følger:

Uttak på 100 μl av stamløsningen ble overført til individuelle glass HPLC-flasker ved hjelp av en Hamilton-sprøyte, med nøye vask og tørking av sprøyten mellom hver prøve. Prøvene ble tørket med en luftstrøm, hvoretter 0,5 ml av det ønskede analyseløsemiddelsystem ble tilsatt. Løsemiddelsystemene ble analysert i triplikat og er opplistet nedenfor:

1. 100 % (vol/vol) aceton

2. 100 % (vol/vol) acetonitril

3. 100 % (vol/vol) metanol

4. 70 % (vol/vol) metanol: 30 % (vekt/vekt) vann

5. 100 % (vekt/vekt) vann

Blankprøver ble også fremstilt i triplikat ved å anvende 100 μl aceton istedenfor stamløsningen. Blankprøvene ble så tørket, og 0,5 ml aceton ble tilsatt til hver flaske. Flaskene ble alle krympeforseglet, forseglet med PARAFILM og plassert ved 4-8 ºC for varigheten av stabilitetsstudien. HPLC-analyse ble utført på prøvene på dag 0, dag 1, dag 5 og dag 14 av stabilitetsstudien. Prøvene ble klargjort for HPLC-analyse som beskrevet nedenfor:

Stabilitetsprøvene ble fjernet fra 4-8 ºC og etterlatt ved romtemperatur i 30 minutter. Alikvoter på 100 μl ble overført til nye glass HPLC-flasker ved anvendelse av en Hamilton-sprøyte med nøye vask og tørking av sprøyten mellom hver prøve. For å lette tørkingen av prøvene ble 0,5 ml aceton tilsatt til hver flaske, hvoretter prøvene ble inntørket med en luftstrøm. Prøvene ble rekonstituert med 1 ml acetonitril og analysert ved HPLC ved anvendelse av kromatografibetingelsene som er angitt ovenfor.

I3A er følgelig stabil i aceton og acetonitril ved 4-8 ºC som gjenspeilet i dominansen av topp ”b” for begge løsemidlene over tidsrommet på 14 dager. I protiske løsemidler øker dannelsen av isomer ”a” og så isomer ”c” hurtig.

Stabilitet ved forskjellige pH-verdier

Stabiliteten av I3A ble undersøkt ved pH 4,5 i to buffere, dvs. monokaliumfosfat/-dinatriumfosfat og eddiksyre/ammoniumacetat, i 24 timer ved romtemperatur. HPLC-analyse viste at I3A er stabil i begge buffere ved pH 4,5, dvs. at det fortsatt var en overvekt av isoform ”b” (figur 1) etter 24 timer.

Stabiliteten av I3A ble undersøkt ved pH 5,5, 6,5 og 7,0 over et tidsrom på 14 dager ved romtemperatur og ble funnet å avta med økende pH, dvs. at dannelse av isoform ”a” og deretter isoform ”c” forekommer på dag 14.

Stabilitet i DMSO

I3A ble undersøkt for stabilitet i DMSO ved romtemperatur og ved 37 ºC over et tidsrom på 10 dager. En kontrollprøve med I3A i acetonitril ble inkubert under de samme betingelser som analyseprøven. Prøvene ble analysert ved HPLC ved eksperimentets begynnelse (dag 0), etter 48 timer (dag 2) og igjen etter 10 dager.

De benyttede kromatografibetingelsene var som følger:

Kolonne: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

(S/nr. 3-34070)

Kolonnelengde: 100 x 4,60 mm

Kolonnetemperatur: 25 ºC

Beskyttelseskolonne: C18 Columbus (Phenomenex)

(S/nr. 202678)

Beskyttelseskolonnens lengde: 50 x 4,60 mm

Mobil fase: 50 % vol/vol fosfatbuffer pH 4,5/

50 % vol/vol acetonitril

Elueringshastighet: 1,0 ml/min

UV-bølgelengde: 230 nm

Injeksjonsvolum: 10 μl

Analysetid 35 minutter

Retensjonstid: 15 minutter, 24 minutter

I3A ser ut til å være stabil i DMSO ved romtemperatur og ved 37 ºC i 10 dager.

Eksempel 2

Isopropanol-gel pH 6,5

Stabiliteten av I3A ”b” i en isopropanol-gelformulering (pH 6,5) ble undersøkt. Fremgangsmåten var som følger:

Sammensetning av isopropanolgelen (pH 6,5)

CARBOPOL ble dispergert i vann og glyserol og løst ved oppvarming ved 40 ºC i et vannbad. Propylenalkohol ble så tilsatt til denne løsningen. Syklometikon ble løst i isopropylalkoholen, og denne andre løsningen ble blandet godt med CARBOPOL-løsningen, hvoretter vann ble tilsatt under omrøring til 100 %. Gelens pH ble justert til 6,5 med dråpevis tilsetning av etanolamin. Isopropanol-gelen ble lagret ved 2-8 ºC inntil anvendelse.

For å undersøke stabiliteten av I3A ”b” i isopropanol-gel (pH 6,5) ble det fremstilt en 0,02 % (vekt/vekt) I3A ”b”/isopropanol-gelformulering som ble fordelt på tre prøver for lagring ved 2-8 ºC, RTP og 40 ºC. På regelmessige tidspunkter ble prøvene analysert i duplikat for stabiliteten av I3A ”b” målt som dannelse av isoform ”a”, hvor resultatene er gitt i figur 2. I3A ”b” rearrangeres til isoform ”a” og så til isoform ”c”. Dette kan muligens skyldes den høyere pH og nærvær av vann i isopropanol-gelen, noe som fremmer denne omformingen av I3A ”b” til isoformene ”a” og ”c”.

I3A ”b” i 30 % (vekt/vekt) isopropylalkohol/citratbuffer pH 3,0

Stabiliteten av I3A ”b” (porsjon nr. 240902) i 30 % (vekt/vekt) IPA/citratbuffer (pH 3) når lagret ved 2-8 ºC og 40 ºC ble undersøkt i duplikat, med resultatene gitt i figur 3.

Konserveringsmidler

Forskjellige konserveringsmidler ble undersøkt for deres egnethet for anvendelse i formuleringene av I3A ”b” i konsentrasjoner som sannsynligvis vil passere en analyse av konserveringseffektiviteten. I utgangspunktet ble konserveringsmidlene fremstilt i citratbuffer (pH 3) og analysert ved HPLC for å se etter topper i kromatogrammene som kan interferere med analysen av I3A-isoformene. Resultatene er oppsummert i tabell 5.

Tabell 5. HPLC-analyse av konserveringsmidler

Det er ikke ønskelig å ha mange interfererende topper i kromatogrammene fra konserveringsmidlene, da dette gjør det vanskelig å analysere legemidlet i formuleringer og kan gjøre det nødvendig å innføre en separat analyse for konserveringsmidlene.

I3A ”b” (0,05 % (vekt/vekt)) ble løst separat i de valgte konserveringsmidlene (benzylalkohol og fenoksyetanol), lagret ved 2-8 ºC, RTP og 40 ºC og analysert for stabilitet i duplikat, målt som dannelsen av isoform ”a”, med regelmessige mellomrom. Resultatene fra denne stabilitetsstudien er gitt i figurene 4 og 5.

Resultatene indikerer at benzylalkohol er det mest egnede konserveringsmiddel av de analyserte.

Fremstilling av I3A ”b”-formuleringer

Følgende tre formuleringer og tilsvarende placeboer ble fremstilt:

A. 0,1 % (vekt/vekt) I3A ”b”/makrocetyleter-krem med 1,0 % (vekt/vekt) benzylalkohol som konserveringsmiddel

B. 0,1 % (vekt/vekt) I3A ”b”/30 % (vekt/vekt) IPA/1,5 %(vekt/vekt)HEC/-1,0 % (vekt/vekt) benzylalkohol/citrat pH 3

C. 0,1 % (vekt/vekt) I3A ”b”/9,5 % (vekt/vekt) syklometikon/9,5 % (vekt/vekt) IPM/1,0 % (vekt/vekt) benzylalkohol/elastomer 10

En stamløsning av I3A ”b” ble fremstilt i benzylalkohol (tabell 6), og denne stamløsningen ble anvendt for å fremstille formuleringene. For placeboprøvene ble benzylalkohol alene anvendt istedenfor I3A ”b”/benzylalkoholstamløsningen. De nøyaktige massene til komponentene av I3A ”b”-formuleringene er gitt i tabellene 7-9.

Formuleringene og de tilsvarende placeboprøvene ble fremstilt som følger: Formulering A: I3A ”b”/makrocetyleter-krem

Den makrocetyleter-emulgerende salven ble nøyaktig innveid i en glassflaske og så smeltet i et vannbad ved 60 ºC. Fersk fremstilt citratbuffer (pH 3) ble nøyaktig innveid i en separat glassflaske, oppvarmet i vannbadet og så gradvis innført i den smeltede, emulgerende salven under konstant omrøring til blandingen var avkjølt. Denne fremgangsmåten ga makrocetyleter-kremen. For fremstilling av formuleringen ble I3A ”b” i benzylalkohol nøyaktig innveid i en glassflaske, og makrocetyleter-kremen ble gradvis og nøyaktig innveid i samme flaske under konstant omrøring.

Formulering B: I3A ”b”/30 % IPA-gel

I3A ”b”/benzylalkoholen ble nøyaktig innveid i en glassflaske. De gjenværende bestanddelene ble nøyaktig innveid i denne løsningen i rekkefølgen IPA, så citratbuffer og så HEC, med kraftig omrøring mellom hver tilsetning.

Formulering C: I3A ”b”/silikoner

I3A ”b”/benzylalkohol ble nøyaktig innveid i en glassflaske. De gjenværende komponentene ble nøyaktig innveid i denne løsningen i rekkefølgen Elastomer 10, så syklometikon og så IPM, med kraftig omrøring mellom hver tilsetning.

Analyse av formuleringene

Formuleringene ble analysert ved studiens begynnelse for å bekrefte konsentrasjonen av I3A ”b” (vekt/vekt) i formuleringene, og denne ble funnet å være tilnærmet 0,1 % (vekt/vekt) I3A ”b”. Av dette totale I3A ”b” innholdet forelå mindre enn 0,7 % av isoform ”a” og intet isoform ”c” i formuleringene. Formuleringene ble analysert for fremkomst av isoform ”a” på tidspunktet for avslutning av studien og ble vist å ha mindre enn 0,3 % av isoform ”a” etter lagring ved 2-8 ºC. Isoform ”c” ble ikke påvist i noen av formuleringene.

Stabilitet av I3A-isoformer i analyse-løsemiddelsystemene over et tidsrom på 72 timer

Stabiliteten av I3A-isoformene ”a”, ”b” og ”c” i de tre prøvesystemene over et tidsrom på 72 timer (ekvivalent med den maksimale mulige lengden av tid som prøvene kan holdes i den automatiske prøvetakeren under en lang analytisk HPLC-kjøring) ble bekreftet som følger: Standarder av de tre isoformene av I3A (tilnærmet 100 μg/ml) ble fersk fremstilt i acetonitril, acetonitril/citratbuffer (pH 3) og acetonitril/ammoniumacetatbuffer (pH 4,5) og umiddelbart analysert med HPLC. Standardene ble så fordelt på tre like volumer og plassert ved 2-8 ºC, romtemperatur og 40 ºC i 72 timer, og ble så igjen analysert ved HPLC. Resultatene fra denne undersøkelsen er gitt i tabell 10. Den høyeste omdanningen av I3A ”b” til isoform ”a” ved romtemperatur skjedde i prøven fremstilt i 100 % (vol/vol) acetonitril, mens I3A ”b”-standarden i acetonitril/citrat (pH 3) viste svært liten omdanning til isoform ”a” selv ved 40 ºC, noe som tyder på at dette løsemiddelsystemet kan være det mest egnede for å sikre at prøvene forblir stabile over

analysetiden. insufficientOCRQuality for page 31

Eksempel 3

Et pH-stabilitetsstudium av I3A ”b” i IPA-geler fremstilt med citratbuffer i pH-området fra 2,5 til 4,0, ble utført ved 2-8 ºC og 40 ºC (akselerert stabilitet).

MATERIALER

FREMGANGSMÅTER

Fremstilling av I3A ”b”-geler og placeboer ved anvendelse av citratbuffer i pH-området fra 2,5 til 4,0.

Sammensetningen av de aktive IPA-gelene og placebo-IPA-gelene fremstilt for stabilitetsstudien ved forskjellige pH-verdier, er gitt i tabell 11, hhv. 12. Store mengder av placebo ble fremstilt for å forenkle målingen av pH i placebo-gelene ved tidspunkt 0. Mindre mengder av den aktive gelen, dvs. 30 g av hver, ble fremstilt, da mengden av legemidlet som var tilgjengelig for studien, var begrenset. Tidligere stabilitetsstudier utført på I3A-IPA-gelen, hvor den tilsynelatende pH i placebo-gelen og den aktive gelen ble målt over 12 måneder, har vist at det ikke er noen merkbar forskjell mellom de to gelene. Videre ble den samme tilsynelatende pH målt i både den aktive gelen og placebogelen. Følgelig ble kun pH i placebo-gelene målt for bestemmelse av den tilsynelatende pH i gelene ved stabilitetsstudiens begynnelse. Etter hydratisering over natten ble gelene analysert for T=0-tidspunktet, og de tilsynelatende pH-verdier i placeboprøvene ble målt. Prøvene ble jevnt fordelt i 7 ml sodaglass-flasker for å unngå temperaturendringer i materialet ved uttak på de forskjellige tidspunktene, og flaskene ble lagret ved 2-8 ºC, hhv. 40 ºC (akselerert stabilitet). insufficientOCRQuality for page 34 insufficientOCRQuality for page 35

Måling av den tilsynelatende pH i IPA-placebo-gelene fremstilt ved anvendelse av citratbuffer i pH-området fra 2,5 til 4,0

Den tilsynelatende pH i IPA-placebo-gelene fremstilt ved anvendelse av citratbuffer i pH-området fra 2,5 til 4,0, ble målt ved anvendelse av et Jenway 3320 pH-meter.

Ekstraksjon av I3A fra IPA-gelene

Legemidlet ble ekstrahert fra IPA-gelene som følger: 1 g av hver av gelene eller deres tilsvarende placeboer ble nøyaktig innveid i en 10 ml volumetrisk kolbe i duplikat eller i triplikat. Prøvene ble først blandet med 1 ml citratbuffer (pH 3) ved kraftig og gjentatt blanding på en vortex-blander innstilt til maksimal hastighet, og så etterlatt ristende i en orbital ristemaskin i 30 minutter ved 400 rpm. De volumetriske kolbene ble så justert opp til volummerket med acetonitril av HPLC-kvalitet, og prøvene ble igjen underkastet kraftig risting ved repeterende blanding på en vortex-blander innstilt på maksimal hastighet, og så etterlatt ristende i en orbital ristemaskin i 60 minutter ved 400 rpm. Alikvoter ble overført til HPLC-flasker for analyse.

Ekstraksjon av I3A fra gelen ble utført i triplikat, dvs. tre separate innveiinger med injeksjoner i duplikat for tidspunkt 0 og tidspunkt = 3 måneder (2-8 ºC prøver) og i duplikat, dvs. to separate innveiinger med duplikat injeksjoner for tid = én uke og 4 uker (40 ºC prøver).

HPLC-analyse

Analysen ble utført ved anvendelse av følgende systemer og betingelser:

Instrumenter

Waters Alliance 2695 Separations Module (S/nr. B98SM4209M)

Waters 2487 Dual λ Absorbance detector (S/nr. M97487050N).

Waters Alliance 2695 D Separations Module (S/nr. G98SM8039N)

Waters 2487 Dual λ Absorbance detector (S/nr. L02487106M)

EMPOWER PRO EMPOWER programvaren

De benyttede kromatografibetingelsene var som følger:

Kolonner: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

S/nr. 3-34070 og S/nr. 1034024A Kolonnelengde: 100 x 4,60 mm

Kolonnetemperatur: omgivelsestemperatur

Beskyttelseskolonne: C18 Columbus (Phenomenex)

S/nr. 202678 og S/nr. 74554-7 Beskyttelseskolonnes lengde 50 x 4,60 mm

Mobil fase: 50 % vol/vol natriumacetatbuffer pH 4,5/

50 % acetonitril (vol/vol)

Elueringshastighet: 1,0 ml/min

UV-bølgelengde: 230 nm

Injeksjonsvolum: 30 μl

Analysetid: 35 minutter

Automatisk prøvetakertemperatur: 8 ºC ± 2 ºC

Retensjonstider: 13 minutter ± 2 minutter for isoform ”a”,

22 minutter ± 2 minutter for isoform ”b”,

23 minutter ± 2 minutter for isoform ”c”, uidentifisert topp med relativ retensjonstid sammenlignet med isoform ”b” på 0,93 ± 0,02.

RESULTATER

Måling av tilsynelatende pH i placebogelene ved tidspunkt 0

Resultatene fra målingen av den tilsynelatende pH i placebo-gelene er vist i tabell 13. Ingen pH-målinger ble utført på noen av stabilitetstidspunktene.

Tabell 13. Måling av den tilsynelatende pH i placebo-IPA-geler (n = 1)

Bestemmelse av prosent topprenhet av I3A-isoformer i de aktive gelene Prosent topprenhet av I3A ”b” i de aktive gelene ved begynnelsen av stabilitetsstudiens (T=0) og etter én ukes lagring ved 40 ºC, 4 ukers lagring ved 40 ºC og 3 måneders lagring ved 2-8 ºC er gitt i hhv. tabell 14, 15, 16, og 17. Prosent topprenhet i I3A ”b” var høyere enn 98 %, mens prosent topprenhet av isoform ”a” var lavere enn 1,2 % for alle geler etter 3 måneders lagring ved -28 ºC. For den akselererte stabilitetsstudien ved 40 ºC ble den høyeste reduksjonen av prosent topprenhet av ”b” over de fire ukene observert med gelen med tilsynelatende placeboverdi på 4,74. Da I3A ”b” er blitt vist å omdannes til isoform ”a”, ble dannelsen av isoform ”a” også undersøkt som en stabilitetsmarkør. Økningen av prosent topprenhet av isoform ”a” fra tid 0 til 1 ukes og 4 ukers lagring ved 40 ºC og etter 3 måneders lagring ved 2-8 ºC ble beregnet, og resultatene er gitt i tabell 18.

Tabell 14. Prosent topprenhet av isoformer av I3A i de aktive gelene (n=3, middelverdi ± standardavvik, UAP = ikke identifisert topp, RRT = relativ retensjonstid) for tidspunkt 0

Tabell 15. Prosent topprenhet av isoformer av I3A i de aktive gelene (n=2, middelverdi ± område, UAP = ikke-identifisert topp, RRT = relativ retensjonstid) etter én ukes lagring ved 40 ºC

Tabell 16. Prosent topprenhet av isoformer av I3A i de aktive gelene (n=2, middelverdi ± område, UAP = ikke-identifisert topp, RRT = relativ retensjonstid) etter fire ukers lagring ved 40 ºC

Tabell 17. Prosent topprenhet av isoformer av I3A i de aktive gelene (n=3, middelverdi ± standardavvik, UAP = ikke-identifisert topp, RRT = relativ retensjonstid) etter tre måneders lagring ved 2-8 ºC

Tabell 18. Beregnet økning av prosent topprenhet av I3A isoform ”a” fra tidspunkt 0 i IPA-gelene

Resultatene antyder at pH har en effekt på dannelsen av isoform ”a” selv når gelen lagres ved 2-8 ºC i 3 måneder. En økning av prosent toppareal for isoform ”a” på 0,21 % ble målt for gelen fremstilt med citratbuffer pH 3,00, sammenlignet med en økning på 0,44 % av prosent toppareal for isoform ”a” for gelen fremstilt med citratbuffer pH 3,5. Ved T=4 uker ved 40 ºC var forskjellene mellom gelene når det gjaldt økning av prosent topprenhet for isoform ”a” ytterligere forsterket.

Eksempel 4

Formuleringer med olje

MATERIALER

FREMGANGSMÅTER

Utvelgelse av egnede oljer/eksipienser

Sesamolje, fraksjonert kokosnøttolje (triglyserider med middels kjedelengde), soyabønneolje, maisolje og peanøttolje ble identifisert som bærere for parenteral tilførsel. Hver kan anvendes opp til et nivå på 100 %.

Andre eksipienser som kan inngå i parenterale oljeformuleringer, vises nedenfor sammen med de maksimale konsentrasjonene som anvendes.

Fremstilling av I3A- og placeboformuleringer for innledende stabilitetsstudier

Sterilisering av fraksjonert kokosnøttolje

Tilnærmet 50 g av den fraksjonerte kokosnøttoljen (CRODAMOL GTC/C) ble innveid i en 100 ml konisk kolbe (borsilikatglass) som ble korket (kork av borsilikat-glass) og plassert i en på forhånd oppvarmet ovn (Gallenkampf Hot box Oven med vifte, størrelse 2) ved 173 ± 5 ºC i 1 time. Etter denne behandlingen ble oljen avkjølt til romtemperatur før anvendelse.

Tilsetning av I3A til den steriliserte oljen

Tilnærmet 10 mg I3A ble nøyaktig innveid i en 28 ml glassflaske og tilsatt til tilnærmet 200 mg benzylalkohol (nøyaktig vekt notert) som på forhånd var filtrert gjennom et 0,22 μm MILLEX-GV-filter. Denne blandingen ble med regelmessighet vortexbehandlet over et tidsrom på tilnærmet 2 t. inntil I3A var blitt oppløst i benzylalkoholen. Til denne blandingen ble tilnærmet 9,79 g av den steriliserte oljen tilsatt, og den ble vortex-behandlet i tilnærmet 5 minutter inntil en homogen løsning ble oppnådd. Placeboprøven ble fremstilt på tilsvarende måte bortsett fra at tilnærmet 9,80 g (i motsetning til 9,79 g) av den steriliserte oljen (nøyaktig vekt notert) ble anvendt som kompensasjon for I3A. De nøyaktige vekter og prosentdeler i preparatene vises i tabellene 19 og 20 for aktiv (I3A) og placebo formuleringer.

Tabell 19. Målmengder og faktiske mengder (og % (vekt/vekt)) for I3A-oljeformuleringen

*Avrundet til 3 d.p.

Tabell 20. Målmengder og faktiske mengder (og % (vekt/vekt)) for placebooljeformuleringen

*Avrundet til 3 d.p.

Lagringsbetingelser for I3A- og placeboformuleringer

Alikvoter av hver formulering (placebo eller aktiv) ble overført til 2 ml ravfargede glassflasker (borsilikatglass) med skrukork, forseglet og lagret ved to lagringsbetingelser, nemlig 2-8 ºC og 25 ± 2 ºC. Formuleringene ble analysert ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet ovenfor for lagringstider opp til og inkludert én måned.

Foreløpig stabilitet av I3A i fraksjonert kokosnøttolje

Tabell 21 oppsummerer stabiliteten av I3A i fraksjonert kokosnøttolje lagret ved 2-8 ºC og 25 ºC over et tidsrom på 43 dager. Stabilitetsresultatene viser at det tilsynelatende ikke er noen økning av prosentdelen av isoform ”a” under lagring ved 2-8 og 25 ºC etter 43 dager, sammenlignet med prosentdelen av isoform ”a” i en frisk porsjon av I3A ved t=0 og t=43 dager.

Tabell 21. Prosentdel av isoform ”a” som prosent av isoform ”a” og I3A ”b” lagret ved to betingelser i 43 dager

RESULTATER

Det var ingen signifikant forskjell (p>0,05) i toppareale og retensjonstid for I3A isoform ”a” og ”b” mellom prøvene som ble injisert i acetonitril eller acetonitril/olje.

Fra listen over tilgjengelige oljer ble to ansett som egnet for formulering av I3A, nemlig fraksjonert kokosnøttolje og sesamolje. Den anbefalte steriliseringen av sesamolje er 2 t. ved 170 ºC, mens den for fraksjonert kokosnøttolje er 1 t. ved 170 ºC. Dette byr på fordeler når det gjelder mengden tid og energi som anvendes for fremstilling av formuleringen. Grunnet ustabiliteten av I3A overfor varme (eksperimentelt bevist, resultater ikke vist) må oljen steriliseres separat og I3A tilsettes aseptisk (filtrert) som en løsning løst i benzylalkohol. Et filtermedium er blitt vist å være egnet for filtrering av I3A/benzylalkoholblandingen, nemlig et 0,22 μm MILLEX-GV-filter, adsorpsjonen av I3A til filtermembranen krever imidlertid fortsatte undersøkelser. Om ønskelig, grunnet den relativt lave viskositeten av denne oljen (tilnærmet 30 mPa sammenlignet med sesamolje, som har en viskositet på tilnærmet 44 mPa), kan formuleringen også fremstilles in situ med I3A/benzylalkohol og den fullstendige formuleringen steriliseres ved filtrering.

Eksempel 5

Orale formuleringer

Et antall eksipienser ble valgt til de bukkale formuleringene, og 17 ikke-vandige formuleringer ble fremstilt og visuelt evaluert for konsistens og oppløsning.

En rekke polymerer forelå som mulige mukoadhesive bærere. Grunnet den iboende ustabiliteten av I3A i vandige systemer, var de undersøkte formuleringene vannfrie idet glyserol og polyetylenglykol (PEG) erstattet den vandige fasen.

MATERIALER

FREMGANGSMÅTER

Innledende visuell analyse av placeboformuleringer

Sytten placeb-oformuleringer ble i utgangspunktet fremstilt og visuelt analysert for konsistens og oppløsning (tabell 22). Kort beskrevet ble de nødvendige mengder av PEG 400 og Carbopol 934 omrørt i 28 ml glassflasker i 10 minutter med en spatel, og de andre ingrediensene ble tilsatt i følgende rekkefølge: glyserol, benzylalkohol og metyl-cellulose, HEC eller HPC. Formuleringene ble så blandet sammen med en Silverson 14RT rører ved tilnærmet 10 000 rpm i tilnærmet 2-3 minutter. Alle de blandede placebo-formuleringene ble inkubert for oppløsning over natten (>24 timer) før visuell analyse. insufficientOCRQuality for page 45

Reologisk analyse av placeboformuleringer (mukoadhesjon) Én tilnærming til studien av mukoadhesjon er reologisk karakterisering av den mukoadhesive grenseflate. Dette bygger på antakelsen om at graden av interpenetrasjon kan bestemmes ved å måle forskjeller i reologiske parametrer mellom polymergeler og deres blandinger med mucin. Den synergistiske økningen av viskositeten har blitt foreslått som et mål for bioadhesjons-bindingsstyrke. Fra den visuelle analysen ble fem placeboformuleringer valgt ut basert på viskositet og oppløsning for videre reologisk vurdering ved anvendelse av grisemucin. De valgte formuleringene er listet opp i tabell 23.

Tabell 23. Formuleringer utvalgt for reologisk analyse

Fremstilling av prøver for reologisk vurdering

Fremstilling av grisemucin

Kort beskrevet ble 15 g grisemucinpulver innveid i et begerglass og justert til 150 g ved anvendelse av deionisert vann for en sluttkonsentrasjon på 10 % (vekt/vekt) mucin. Dette fikk hydratisere ved 2-8 ºC i tilnærmet 2-3 timer. Det hydratiserte mucinet ble videre fortynnet med deionisert vann for erholdelse av en sluttkonsentrasjon på 5 % (vekt/vekt) mucin i deionisert vann. Dette ble etterlatt for å hydratisere over natten i kjøleskap ved 2-8 ºC.

Fremstilling av formulering/mucin-blanding

De valgte formuleringene (tabell 23) ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Til hver formulering ble en lik vekt av 10 % (vekt/vekt) mucin tilsatt og forsiktig omrørt med en spatel. Dette ble etterlatt for å hydratisere ved 2-8 ºC over natten. I tillegg ble de valgte formuleringene også fortynnet (50:50 (vekt/vekt)) med deionisert vann og etterlatt for å hydratisere over natten i kjøleskap ved 2-8 ºC.

Dynamisk (oscillatorisk) fremgangsmåte for reologisk analyse

Den reologiske analysen ble utført ved anvendelse av et Carrimed CSL<2>reometer. Tilnærmet 0,5 g av analyseprøven ble plassert mellom plattformen og parallell plategeometri. Etter at prøven var sammenpresset mellom plattformen og platen, ble overskudd av prøve forsiktig fjernet ved anvendelse av en spatel i rett vinkel relativt til geometrien. Hver prøve ble analysert totalt fem ganger, noe som førte til mekaniske spektre. De resulterende parametrer som ble erholdt, G’, G” og tan δ, ble anvendt for vurdering av den mukoadhesive styrken til formuleringene, hvor G’ er elastisitetsmodulus, G” er viskositetsmodulus og tan δ er forholdet mellom G’ og G”.

Optimalisering og fremstilling av utvalgte aktive formuleringer og placeboformuleringer

Etter reologisk analyse ble to formuleringer valgt ut for videre optimalisering (formulering 16 og 17) med hensyn til fremstilling av en porsjon av formulering for stabilitet. Den optimaliserte fremstillingsprosessen ble anvendt for å fremstille porsjoner av aktive (inneholdende I3A) formuleringer og placeboformuleringer (25 g av hver).

Figur 6 viser fremstillingen av aktiv og placeboformulering 16 med målmengdene av eksipienser/legemiddel anvendt. Kort beskrevet ble den nødvendige mengde Carbopol 934 tilsatt til PEG 400 i en borsilikat-flaske og oppvarmet til 50 ºC i tilnærmet 2 t. inntil blandingen var fullstendig oppløst. Denne blanding ble avkjølt til romtemperatur, den nødvendige mengde glyserol tilsatt, og blandingen ble oppvarmet til tilnærmet 60 ºC i et vannbad i 2 t. inntil en homogen masse ble dannet. Den nødvendige mengde HEC ble tilsatt og rørt inn i den avkjølte blandingen ved anvendelse av en Silverson L4RT-blander justert til tilnærmet 10 000 rpm i 2-3 minutter. Denne blandingen fikk så fullstendig løse seg opp over natten (tilnærmet 12 t) ved romtemperatur. Som vist i figur 6, ga dette en ”basal formulering”.

Den aktive formuleringen ble fremstilt ved først å løse I3A i benzylalkohol. Den nødvendige mengde av I3A/benzylalkohol ble tilsatt til den oppløste, basale formuleringen og forsiktig omrørt med en spatel for oppnåelse av en sluttkonsentrasjon på 0,1 % (vekt/vekt) I3A. På tilsvarende måte ble placeboformuleringen fremstilt ved å tilsette benzylalkohol til den oppløste blandingen og forsiktig omrøring. Formulering 17 ble fremstilt på tilsvarende måte. Tabell 24 viser mål-% (vekt/vekt) for eksipienser/I3A i den aktive og placeboformuleringen.

Tilnærmet 1 g av placebo- og aktive formuleringer ble alikvotert i 2 ml flasker med skrukork og plassert på stabilitet ved 2-8 ºC, 25 ºC og 40 ºC (den siste temperaturen ble benyttet for korttids akselererte stabilitetsstudier).

Tabell 24. Mål-% (vekt/vekt) (til 1 d.p.) i den optimaliserte aktive og placeboformulering

Analyse av I3A i formuleringen

Ekstraksjon av I3A fra den aktive formuleringen

Med henblikk på en evaluering av legemiddelproduktet ble en ekstraksjonsfremgangsmåte satt opp for å evaluere degraderingen av I3A ”b” til isoform ”a” (kromatografisk topprenhet). Ekstraksjonen av I3A fra den aktive formuleringen var som følger (den samme fremgangsmåten ble også anvendt for placeboformuleringen). Kort beskrevet ble tilnærmet 1 g av formuleringen nøyaktig innveid i en 10 ml målekolbe etterfulgt av 1 ml citratbuffer (pH 3). Denne ble forsiktig omristet for hånd i tilnærmet 5 min. inntil den var homogen og justert til volum med metanol av HPLC-kvalitet. Kolben ble så omristet i en mekanisk ristemaskin i tilnærmet 2 t. Innholdet i kolben ble så overført til et 15 ml polypropylenrør og sentrifugert i 5 min. ved 2 200 rpm.

Supernatanten ble alikvotert på HPLC-flasker og analysert.

Foreløpige gjenvinningsverdier (ikke vist) indikerte at tilnærmet 80 % eller mer av I3A ”b” ble gjenvunnet fra den aktive formuleringen og, mer signifikant, at det ikke var noen interferens fra noen av eksipiensene i formuleringen.

HPLC-fremgangsmåte

Analysefremgangsmåten for analysen av I3A i den bukkale formuleringen er vist nedenfor.

Kolonne: Symmetry C18 - 5 μm (Waters)

(S/nr. T636515 07, P/nr. WAT054205) Kolonnelengde: 150 x 3,90 mm

Kolonnetemperatur: 30 ºC

Beskyttelseskolonne: Symmetry C18 - 5 μm (Waters)

(P/nr. WAT054225)

Beskyttelseskolonnens lengde: 20 x 3,90 mm

Mobil fase: 0,02 % (vol/vol) TFA i vann (A);

0,02 % (vol/vol) TFA i acetonitril (B)

A:B; 50:50 (utgangssammensetning) (GRADIENT, se tabellen nedenfor) Elueringshastighet: 1,0 ml/min

UV-bølgelengde: 230 nm (PDA)

Injeksjonsvolum: 10

Analysetid: 20 minutter

Automatisk prøvetagertemperatur: 8 ºC

Prøver og placeboer ble analysert ved tid null. Etter tilnærmet 1-2 uker ble prøver lagret ved 40 ºC også analysert for å oppnå noen data for akselerert stabilitet.

RESULTATER

Visuell analyse

Den visuelle analysen ble utført kvalitativt og utgjorde en relativt effektiv fremgangsmåte for for-analyse av en rekke formuleringer når det gjelder viskositet og oppløsning. Placeboformuleringer ble analysert av to uavhengige analysepersoner og avvist basert på at viskositeten var enten for høy eller for lav. Videre ble enhver formulering som ikke var fullstendig oppløst, også forkastet. Det var temmelig tydelig at ifølge fremgangsmåten for fremstilling ga en Carbopol 934-konsentrasjon høyere enn 1,5 % (vekt/vekt) ikke-vandige geler som var for viskøse og/eller som ikke var fullt ut oppløst. En reduksjon av mengden Carbopol 934 til 0,5 % (vekt/vekt) og tilsetning av metylcellulose i en konsentrasjon på 2,0 % (vekt/vekt) ga en gel med lav viskositet. En økning av Carbopol 934-konsentrasjonen til 1,0 % (vekt/vekt) og samtidig reduksjon av metylcellulosekonsentrasjonen til 1,0 % (vekt/vekt) ga imidlertid fortsatt en gel som var lav i viskositet. Fra de visuelle observasjonene så det ut til at tilsetning av metylcellulose ikke påvirket viskositeten i stor grad sammenlignet med tilsetning av Carbopol 934.

Metylcellulose er imidlertid blitt vist å ha mukoadhesive egenskaper, og følgelig ble ytterligere formuleringer fremstilt som inneholdt 1,0 og 1,5 % (vekt/vekt) metylcellulose i kombinasjon med 1,5 % (vekt/vekt) Carbopol 934. En visuell vurdering av disse formuleringene viste at de var homogene og hadde den nødvendige konsistens for videre evaluering. På tilsvarende måte ble HPC funnet ikke å påvirke viskositeten sammenlignet med tilsetning av Carbopol 934. Da HPC også er blitt foreslått som et mulig mukoadhesivt middel, ble imidlertid formuleringer som inneholdt HPC i en konsentrasjon på 1,0 og 1,5 % (vekt/vekt) sammen med Carbopol 934 i en konsentrasjon på 1,5 % (vekt/vekt), funnet visuelt akseptable for videre reologisk vurdering. Formulering 4 ble også funnet å være visuelt akseptabel med hensyn til viskositet og oppløselighet, og denne omfattet HEC (en annen muligens mukoadhesiv polymer). Følgelig ble fem formuleringer (formulering 4, 14, 15, 16 og 17) reologisk vurdert for mukoadhesiv styrke ved anvendelse av grise-mucin.

Reologisk vurdering av formuleringene 4, 14, 15, 16 og 17

Elastisitetsmodulus G’ er et mål på prøvens resistens overfor elastisk deformering (dvs. en gjenspeiling av polymerens nettverkskonnektivitet), og G’’ er et mål på prøvens resistens overfor viskøs deformasjon.

Gjennomsnittlig G’ og G’’ ved 5 Hz, beregnet som gjennomsnittet for 5 prøver, ble ekstrahert fra de resulterende data for å muliggjøre sammenligning mellom forskjellige formuleringer. Et uttrykk som muliggjør bestemmelse av synergistiske forskjeller uttrykt som G’ og G’’ mellom formuleringen/mucinblandingen og de enkelte komponentene i blandingen er gitt i ligning 1. Jo høyere de relativ G’-verdiene, jo større er interaksjonen mellom formuleringen og mucinet.

G’(Formulering/Mucin) – (G’(Formulering)+ G’(Mucin)

Relativ G’ = (G’(Formulering)+ G’(Mucin) Ligning 1

En lignende ligning kan anvendes for beregning av G’’. Tan δ ble beregnet ved anvendelse av de relative G’- og G’’-verdiene ved anvendelse av ligning 2.

gjennomsnittlig relativ G’’

tan δ = gjennomsnittlig relativ G’ Ligning 2

Figur 7 viser de relative G’- og G’’-verdiene for alle de fem analyserte formuleringene, mens figur 8 viser de tilsvarende tan δ-verdiene.

Basert på den reologiske vurderingen, ble rekkefølgen for økningen i mukoadhesiv styrke, funnet å være formulering 17 > formulering 16 > formulering 14 > formulering 15 > formulering 4. Imidlertid viste formulering 14 og 15 stor variasjon (som observert med de store standardavvikene). Dette kan skyldes de ikke-homogene interaksjonene av disse formuleringene med mucin. Videre ble G’ målt for formuleringene i deionisert vann, også funnet å ha stor variasjon, noe som indikerer at disse formuleringene viste ikke-homogen hydratisering. Formulering 4 ble funnet å ha de høyeste G’-verdiene når blandet med mucinet, imidlertid var den relative G’-verdi signifikant lavere (p<0,05) sammenlignet med alle de andre analyserte formuleringene. Dette ble tilskrevet det faktum at G’-verdiene for formulering 4 dispergert i vann, var betydelig høyere sammenlignet med alle de andre formuleringene dispergert i vann. Det kan se ut til at formulering 4 ga en relativt god viskoelastisk gel i vann (sammenlignet med de andre formuleringene i vann), imidlertid så det ut til å være en relativt liten interaksjon med mucin da den relative G’-verdien, som eliminerer virkningen av formuleringen (så vel som mucinvirkningen), var signifikant lavere. Basert på de relative G’-verdiene, viste formuleringene 16 og 17 den største interaksjonen med grisemucin, noe som tyder på at disse to formuleringene kunne anvendes som potensielle mukoadhesive formuleringer. Formulering 14 og 15 viste noe interaksjon med mucin, imidlertid kunne hydratiseringen/interaksjonen av disse formuleringene være ikke-homogen, vurdert ut fra de store standardavvikene. Formulering 4 viste den laveste relative G’-verdien og følgelig den laveste interaksjonen. De tilsvarende tan δ-verdiene er et relativt mål på viskoelastisiteten hvor en lavere tan δ indikerer en relativt høyere sammenfiltring og omvendt en høyere tan δ viser en relativt lav sammenfiltring (grunnet en relativt større viskøs komponent) og understøtter følgelig disse observasjonene.

Optimalisering og fremstilling av utvalgte aktive og placeboformuleringer Optimaliseringsfremgangsmåten ble utført for å redusere tiden for fremstilling av formuleringene fra tilnærmet 24 t. ned til tilnærmet 12 t. Formulering 16 og 17 ble valgt ut for optimaliserings- og stabilitetsstudier.

HPLC-analyse av I3A-formuleringer

Tabell 25 viser prosent topprenhet for I3A ”b” så vel som prosent areal av isoform ”a” og andre ikke-identifiserte topper (UAP) for formulering 16 og 17, tatt ved tid null. Også vist som en komparator er prosent topprenhet for en 0,1 % (vekt/vekt) I3A-IPA-gelprøve ved tid null. Alle topper for de bukkale formuleringene ble manuelt integrert og sammenlignet med de tilsvarende placeboformuleringene.

Tabell 25. Prosent topprenhet for formuleringer ved tid null

Tabell 26 viser prosent topprenhet for I3A ”b” så vel som prosent areal for isoform ”a” og andre ikke-identifiserte topper (UAP) for formulering 16 og 17 målt tilnærmet to uker etter lagring ved 2-8 ºC og 40 ºC (akselerert stabilitet). I tabellen finnes også som komparator prosent topprenhet for 0,1 % (vekt/vekt) I3A-IPA-gel lagret ved 40 ºC i én uke. Alle topper for de bukkale formuleringene ble manuelt integrert og sammenlignet med de tilsvarende placeboformuleringene.

Tabell 26. Prosent kromatografisk topprenhet i formuleringer etter tilnærmet 1-2 ukers lagring ved 2-8 ºC og 40 ºC

*Topprenhet etter én uke; ND - ikke bestemt

Det ser ut til ikke å være noen åpenbar forskjell i prosent topprenhet av I3A i noen av formuleringene ved tid null sammenlignet med utgangsverdien ved mottak (99,3 % I3A ”b”, rapport PB21001/24). Videre var prosent areal av isoform ”a” ved mottak 0,40 %, noe som tilsvarer prosent toppareal for isoform ”a” ved tid null (tabell 25).

Det var ingen merkbar økning av prosentdelen av isoform ”a” etter tilnærmet 1-2 ukers lagring av de bukkale formuleringene ved 2-8 ºC (tabell 26), mens en økning av prosentdelen av isoform ”a” ble observert for alle bukkale prøver lagret ved 40 ºC.

Økningen av prosentdelen av isoform ”a” som ble observert i 0,1 % (vekt/vekt) IPA-gelen, var imidlertid høyere (1,60 %) etter 1 ukes lagring ved 40 ºC. Basert på prosent topp-renhet ser disse innledende resultatene ut til å indikere at de bukkale I3A-formuleringene er minst like stabile som 0,1 % I3A-IPA-gelen og muligens enda mer stabile.

Eksempel 6

Poloksamerformuleringer

Fire poloksamerformuleringer ble undersøkt.

MATERIALER

FREMGANGSMÅTER

Valg av eksipienser

Før preformuleringsstudiene ble det identifisert flere egnede eksipienser for poloksamerformuleringer, og disse er opplistet nedenfor sammen med de maksimale anbefalte konsentrasjoner.

*Anvendt for kontrollutforming

Fremstilling av formuleringer for reologiske undersøkelser

Forskjellige placeboformuleringer med poloksamer 407 ble fremstilt ved anvendelse av eksipiensene listet opp ovenfor for å evaluere den reologiske atferden.

Fremstilling av citratbuffer pH 3

Sitronsyre-monohydrat (molekylvekt 211 g/mol) ble løst i deionisert vann til en konsentrasjon på 0,1 M. En løsning av trinatriumcitrat-dihydrat, 0,1 M (molekylvekt 294,1 g/mol) ble også fremstilt i deionisert vann. Citratbufferløsning pH 3 ble fremstilt ved å blande 40 % (vol/vol) sitronsyre-monohydratløsning (0,1 M), 10 % (vol/vol) trinatriumcitrat-dihydratløsning (0,1 M) og 50 % (vol/vol) deionisert vann, og den endelige pH ble målt ved anvendelse av et pH-meter (3320 JENWAY).

Fremstilling av poloksamer 407 «basis»-løsninger

Innledende undersøkelser viste at poloksamer 407-løsninger i et konsentrasjonsområde mellom 18 og 20 % (vekt/vekt) var egnet for erholdelse av et område av viskositeter med varierende cmt-verdier. Poloksamerløsningene ble fremstilt ved anvendelse av den kalde fremgangsmåten som er rapportert av Schmolka (1972).

Kort beskrevet ble de nødvendige mengder av poloksamer 407 (tabell 27) tilsatt enten til citratbuffer pH 3 eller propylenglykol/citratbuffer pH 3 i 100 ml Duran-flasker av borsilikatglass. Propylenglykol/citratbuffer pH 3 ble fremstilt på forhånd ved å innveie den nødvendige mengde propylenglykol og citratbuffer pH 3 (tabell 27) og omristing av blandingen i 1-2 minutter inntil den var visuelt homogen. Duran-flaskene som inneholdt bestanddelene, ble korket og plassert i et is/vannbad i 4 timer med hyppig omristing hvert 15. minutt inntil klare løsninger ble dannet. Disse løsningene ble lagret ved 2-8 ºC inntil de skulle anvendes.

Steriliseringsfremgangsmåter

Da gelene er nødvendige for intralesjonal behandling, er sterilisering viktig. For å oppnå sterilisering ble de fremstilte gelene autoklavert ved anvendelse av BP-fremgangsmåten, hvor tilnærmet 100 g av hver av gelene som er opplistet i tabell 27, ble plassert i 100 ml Duran-flasker og autoklavert i 15 minutter ved 121 ºC. Etter denne behandlingen ble gelene avkjølt til romtemperatur og så lagret ved 2-8 ºC inntil anvendelse. insufficientOCRQuality for page 55 insufficientOCRQuality for page 56

Fremstilling av placebo-poloksamerformuleringer for reologisk evaluering Grunnet ustabiliteten av I3A overfor varmesterilisering bør formuleringer som inneholder I3A, fremstilles ved å løse I3A i et egnet løsemiddel fulgt av aseptisk tilsetning (dvs. aseptisk filtrering) til autoklaverte, «basis» poloksamerløsninger. Det valgte løsemiddel var benzylalkohol. For reologisk vurdering ble det imidlertid kun fremstilt placebo-poloksamerformuleringer som inneholdt benzylalkohol grunnet den begrensede tilgang på I3A.

Fremstilling av benzylalkohol/citratbuffer pH 3-løsning

Mengden av citratbuffer som ble tilsatt til benzylalkohol, var 2,5 % (vekt/vekt) som var under løseligheten av citratbuffer pH 3 i benzylalkohol. Kort beskrevet ble tilnærmet 0,5 g citratbuffer pH 3 tilsatt til 19,5 g benzylalkohol for oppnåelse av en endelig prosentdel av citratbuffer på 2,5 % (vekt/vekt) i benzylalkohol. Denne løsningen ble så filtrert gjennom et Millipore-filter (0,22 μm MILLEX-GV, MILLIPORE) for å etterligne betingelsene ved aseptisk filtrering.

Tilsetning av benzylalkohol/citratbuffer pH 3-løsning til «basis» poloksamerløsninger

Placeboformuleringer (tabell 28) ble fremstilt ved å tilsette den nødvendige mengde filtrert benzylalkohol/citratbuffer pH 3 til de steriliserte «basis» poloksamerløsningene som ble fremstilt ovenfor. Kort beskrevet ble tilnærmet 9,90 g (nøyaktig vekt angitt i tabell 28) av hver «basis» poloksamerløsning innveid i en 20 ml sodaglassflaske, og dette ble avkjølt i is/vann for dannelse av en væske (ved romtemperatur danner disse løsningene geler). Den avkjølte poloksamer-”basen” ble tilnærmet 0,10 g (den nøyaktige vekt vises i tabell 28) filtrert benzylalkohol/citratbuffer pH 3 tilsatt, og blandingen ble vortex-behandlet i 2 minutter inntil en visuelt klar, homogen løsning ble erholdt. Disse formuleringene ble så lagret ved 2-8 ºC inntil anvendelse.

Reologisk evaluering

Den reologiske evalueringen ble utført ved anvendelse av et Carrimed CSL<2>reometer. Tilnærmet 0,4 g analyseprøve ble plassert mellom plattformen og den parallelle plategeometri. Etter at prøven var sammenpresset mellom plattformen og platen, ble overskudd av prøve forsiktig fjernet ved anvendelse av en spatel i rett vinkel til geometrien. Hver prøve ble analysert i alt tre ganger, og de resulterende viskositeter ble notert som funksjon av temperaturen.

Fremstilling av aktive formuleringer og relative placeboer for stabilitets- og frigjøringsstudier

Etter den reologiske vurderingen ble aktive (I3A) og placebo-poloksamerformuleringer fremstilt for stabilitets- og frigjøringsstudier. Videre ble placebo- og aktive formuleringer (0,1 % (vekt/vekt) I3A) med PEG 400 også fremstilt som kontrollformuleringer for frigjøringsanalyse.

Fremstilling av stamløsning av I3A i benzylalkohol/citratbuffer

Tilnærmet 50 mg (målmengde) I3A ble nøyaktig innveid i en 7 ml medisinflaske av glass sammen med 500 mg (målmengde) benzylalkohol/citratbuffer pH 3. Denne blandingen ble med regelmessighet vortexbehandlet i 5 minutter inntil I3A var oppløst.

Fremstilling av aktive og placebo-poloksamerformuleringer Placeboformuleringer ble fremstilt som beskrevet ovenfor (tabell 28). Aktive (I3A) poloksamerformuleringer som inneholdt en målkonsentrasjon på 0,1 % (vekt/vekt) av I3A ”b”, ble fremstilt på tilsvarende måte som placeboformuleringene, bortsett fra at den ekstra vekten grunnet tilsetning av I3A ”b” ble kompensert av en tilsvarende reduksjon mengden av poloksamer-”basis” løsning tilsatt (tabell 29). Kort beskrevet ble tilnærmet 110 mg (nøyaktig vekt notert) av I3A/benzylalkohol/citratbuffer pH 3 tilsatt til 9,89 g av den avkjølte, steriliserte, ”basis” poloksamerløsning og vortexbehandlet i tilnærmet 2 min. inntil en visuelt klar, homogen løsning ble erholdt. De nøyaktige vekter og målvekter er vist i tabell 29. insufficientOCRQuality for page 59

Fremstilling av PEG 400-kontrollformuleringer

Ifølge en tilsvarende fremgangsmåte ble 12,5 mg I3A tilsatt til 125 mg benzylalkohol som på forhånd var filtrert gjennom et Millipore-filter (0,22 μm MILLEX-GV, MILLIPORE). Denne løsningen ble vortexbehandlet i tilnærmet 5 min. inntil I3A var fullstendig oppløst. For fremstilling av de aktive kontrollformuleringene ble tilnærmet 110 mg av denne blandingen tilsatt til en løsning av 7,912 g PEG 400 og 1,978 g citratbuffer pH 3. Placeboformuleringene ble fremstilt på tilsvarende måte, bortsett fra at tilnærmet 7,92 g PEG 400, 1,98 g citratbuffer og 100 mg sterilisert benzylalkohol ble anvendt. De nøyaktige vekter og målvekter er vist i tabell 6 for placebo- og aktive PEG 400-formuleringer.

Lagringsbetingelser for aktive og placebo-poloksamerformuleringer Alikvoter av hver av poloksamer 407-formuleringene (placebo eller aktive) ble fordelt i 2 ml ravfargede flasker med skrukork (borsilikatglass), forseglet og lagret ved tre lagringsbetingelser, nemlig 2-8 ºC, 25 ± 2 ºC og 40 ± 2 ºC, for stabilitetsstudier.

Stabilitetstesting av I3A i poloksamerformuleringene

For evaluering av legemiddelproduktet ble det satt opp en ekstraksjonsfremgangsmåte for evaluering av degraderingen av I3A ”b” til isoform ”a” (kromatografisk topprenhet). Ekstraksjonen av I3A fra den aktive formuleringen var som følger (den samme fremgangsmåte ble også anvendt for placeboformuleringen). Kort beskrevet ble tilnærmet 0,5 g av formuleringen nøyaktig innveid i en 5 ml målekolbe og justert opp til merket med acetonitril av HPLC-kvalitet/citratbuffer pH 3 (90:10 (vol/vol)). Løsningen ble alikvotert på HPLC-flasker og analysert.

Foreløpige gjenvinningsresultater (ikke vist) viste at tilnærmet 80 % eller mer av I3A ”b” ble gjenvunnet fra den aktive formulering og, mer signifikant, at det ikke var noen interferens fra noen av eksipiensene i formuleringen. Formuleringene ble analysert ved t=0, og akselererte stabilitetsstudier (40 ºC) ble utført ved t=5 uker.

Foreløpige I3A-frigjøringsstudie

Frigjøringen av I3A ”b” fra formuleringene over en syntetisk membran ble undersøkt ved anvendelse av Franz-diffusjonsceller under okkluderte betingelser.

Valg av mottakervæske

Mottakervæsken benyttet i et forsøk på å opprettholde stor mottakerkapasitet, var 20 % (vol/vol) etanol/citratbuffer (pH 3,0), og denne ble innført i Franz-cellen og omrørt konstant med en magnetrører. Foreløpige stabilitetsstudier ble utført på I3A i 20 % (vol/vol) etanol/citratbuffer (pH 3,0) ved 37 ºC over et tidsrom på tilnærmet 18 timer. Prosent økning av topparealet for isoform ”a” etter 18 timer ble funnet å være 0,26 %.

For formålet med Franz-cellestudien ble dette ansett som akseptabelt. Den kinetiske løselighet av I3A i 20 % (vol/vol) etanol/citratbuffer (pH 3,0) ble bestemt til 509,7 ± 3 μg/ml ved 25 ºC.

In vitro frigjøringsstudier (Franz-celle)

Individuelt kalibrerte Franz-diffusjonsceller med et gjennomsnittlig diffusjonsoverflateareal på 0,53 cm<2>og et gjennomsnittlig mottakervolum på 1,85 ± 0,02 ml ble anvendt for utførelse av frigjøringsstudien. De regenererte cellulosemembranene (MWCO 12000-14000) ble klargjort, kuttet og montert i Franz-cellene. Membranene fikk ekvilibreres med mottakerfasen i 30 minutter før formuleringene ble tilført. En uendelig dose på 0,5 g av hver formulering ble påført på membranoverflaten ved anvendelse av en ”Finnpipette” med positiv fortrengning. Én prøveavlesning ble undersøkt (26 timer etter påføring av gelen), hvorved 200 μl mottakervæske forsiktig ble fjernet fra armen i Franzcellen. Gjennom hele eksperimentet ble tap av mottakervæske grunnet fordamping fra Franz-cellene erstattet for opprettholdelse av et konstant volum. Eksperimentet ble utført under okkluderte betingelser (toppen av de øvre donorbrønnene dekket med PARAFILM) for alle formuleringer (n=3 Franz-celler for hver aktive formulering og n=1 Franz-celle for hver placeboformulering). Prøver ble analysert ved HPLC som beskrevet i eksempel 1, og konsentrasjonen av I3A ”b” som var frigjort, ble evaluert ved anvendelse av en serie av kalibreringsstandarder fremstilt i 80 % (vol/vol) citratbuffer/20 % (vol/vol) etanol.

RESULTATER

Sterilisering av «basis» poloksamerløsninger

Umiddelbart etter sterilisering av «basis» poloksamerløsningene viste Polox-01 og Polox-02 uten propylen faseseparasjon. Etter avkjøling i is/vann ble disse løsningene klare, homogene faser. Imidlertid viste «basis» løsningene som inneholdt propylenglykol, Polox-pg-01 og Polox-pg-02, ingen faseseparasjon umiddelbart etter steriliseringen, noe som antyder at tilsetning av propylenglykol inhiberer dette fenomenet.

Reologisk vurdering

Reologiske undersøkelser ble utført på placebo-poloksamerformuleringer, og viskositeten (Pa.s) ble bestemt som funksjon av temperaturen ( ºC) over temperaturområdet 4-40 ºC. Cmt-verdien ble bestemt ved å ta midtpunktet for infleksjonen. For alle placeboformuleringer var det en svak økning av viskositeten ved økt temperatur inntil et visst punkt, ved cmt var det en dramatisk økning av viskositeten ved en liten temperaturøkning. Cmt-verdien ble funnet å være konsentrasjonsavhengig, dvs. at jo lavere poloksamer 407-konsentrasjon, jo høyere cmt-verdi. Videre reduserte tilsetning av propylenglykol til placebo-poloksamerformuleringene ytterligere cmt. Over cmt økte imidlertid viskositeten av de samme prøvene tilnærmet 1,5-2 ganger sammenlignet med de tilsvarende propylenglykolfrie formuleringene. For eksempel ved 37 ºC ble viskositeten av Polox-01-placebo funnet å være tilnærmet 1,2 Pa.s, mens den tilsvarende placebopropylenglykolformulering (Polox-pg-01-placebo) ble funnet å være 2,4 Pa.s. Følgelig ser tilsetning av propylenglykol ut til å øke viskositeten over cmt-verdien, imidlertid reduseres den faktiske cmt-verdi. Tabell 31 oppsummerer cmt-verdier og viskositet ved 37 ºC for alle formuleringer.

Tabell 31. Cmt-verdier og viskositet (ved 37 ºC) for alle placebo-poloksamerformuleringer (n=3 ± SEM)

Undersøkelser av stabiliteten av I3A i poloksamerformuleringer

Tabell 32 viser prosent topprenhet for I3A ”b” så vel som prosentarealet for isoform ”a” og andre ikke-identifiserte topper (UAP) for alle aktive poloksamerformuleringer tatt ved tid null. Som sammenligning vises også prosent topprenhet av en 0,1 % (vekt/vekt) I3A-IPA-gel ved tid null. Alle topper ble manuelt integrert og sammenlignet med de tilsvarende placeboformuleringene.

Tabell 32. Prosent topprenhet i formuleringer ved tid null.

Tabell 33 viser prosent topprenhet for I3A ”b” så vel som prosentarealet for isoform ”a” og andre UAP for alle aktive formuleringer, målt etter fem ukers lagring ved 40 ºC (akselerert stabilitet). Til sammenligning viser tabellen også prosent topprenhet for 0,1 % (vekt/vekt) I3A-IPA-gel lagret ved 40 ºC i 4 uker. Alle topper ble manuelt integrert og sammenlignet med den tilsvarende placeboformulering.

Tabell 33. Prosent kromatografisk topprenhet i formuleringer ved tid fem uker, lagret ved 40 ºC

*Analysert etter 4 ukers lagring ved 40 ºC ved anvendelse av HPLC-fremgangsmåte 1

Det er ingen åpenbar forskjell i prosent topprenhet for I3A i noen av poloksamerformuleringene. Ved tid null er imidlertid prosentdelen av isoform ”a” lavere for disse formuleringene sammenlignet med I3A-IPA-gelen, muligens som en følge av tilsetningen av en liten mengde citratbuffer pH 3 til benzylalkohol under fremstillingen av formuleringene.

En økning i prosentdelen av isoform ”a” ble observert for alle aktive poloksamerformuleringer etter fem ukers lagring ved 40 ºC. Økningen i prosent av isoform ”a” observert i 0,1 % (vekt/vekt) IPA-gelen var imidlertid høyere (4,7 %) etter fire ukers lagring ved 40 ºC. Basert på prosent topprenhet, ser disse resultatene ut til å vise at stabiliteten av I3A-poloksamerformuleringene er sammenlignbar med stabiliteten av 0,1 % I3A-IPA-gelen.

Foreløpige frigjøringsstudier

Figur 9 viser mengden frigjort (μg/cm<2>) etter 26 t. av I3A fra 0,1 % (vekt/vekt) poloksamergel og PEG 400-formuleringer. Ingen signifikant forskjell i frigjøringen ble funnet (p>0,05) mellom noen av poloksamerformuleringene, imidlertid var frigjøringen fra alle poloksamerformuleringer signifikant langsommere (p<0,05) enn frigjøringen fra PEG 400-kontrollformuleringen. Mengden I3A ”b” frigjort i gjennomsnitt for alle poloksamerformuleringer, var tilnærmet 16 μg/cm<2>, mens mengden frigjort fra kontroll-PEG 400-formuleringen var tilnærmet 53 μg/cm<2>; dette representerer en reduksjon på tilnærmet 70 % av mengden I3A ”b” frigjort fra alle poloksamerformuleringene sammenlignet med kontrollformuleringen etter 26 timer.

RESULTATER

Fire poloksamerformuleringer ble undersøkt i denne undersøkelsen. Disse poloksamergelene ga en økning i viskositet (ved 37 ºC) hvor viskositeten av polox-01-placebo < polox-pg-01-placebo < polox-02-placebo < polox-pg-02-placebo. Videre ser tilsetning av propylenglykol ut til å øke viskositeten over cmt-verdien, imidlertid reduseres den faktiske cmt-verdi.

Stabiliteten av poloksamergelene ser ut til å være sammenlignbar med stabiliteten av 0,1 % I3A-IPA-gelen under akselererte betingelser.

Frigjøringsstudier viste at det ikke var noen signifikant forskjell i frigjøringen (p>0,05) fra poloksamerformuleringene; imidlertid var frigjøringen fra alle poloksamerformuleringer signifikant langsommere (p<0,05) enn frigjøringen fra PEG 400-kontrollformuleringen. Videre ble en reduksjon på tilnærmet 70 % av mengden I3A ”b” frigjort fra alle poloksamerformuleringene, observert, sammenlignet med kontrollen, etter 26 timer.

Eksempel 7

In vitro frigjøring av I3A ”b” fra oljebaserte, intralesjonale formuleringer ble undersøkt og sammenlignet med PEG 400-kontrollformuleringen.

MATERIALER

FREMGANGSMÅTER

Fremstilling av I3A (aktive) og placeboformuleringer for frigjøringsstudier Tre oljeformuleringer ble fremstilt med tilsvarende placeboer. Mengden benzylalkohol ble holdt til 1 % (vekt/vekt). Fremstillingen av to av formuleringene omfattet enten tilsetning av en antioksidant før varmesterilisering av oljen eller tilsetning av en antioksidant etter sterilisering av oljen.

Fremstilling av oljeformulering (som rapportert i PB23001/2) ”Croda-BA” Sterilisering av fraksjonert kokosnøttolje

Tilnærmet 100 g av den fraksjonerte kokosnøttoljen (CRODAMOL GTC/C) ble innveid i en 100 ml konisk kolbe (borsilikatglass), korket (kork av borsilikatglass) og plassert i en forvarmet ovn (Gallenkampf Hot box Oven med vifte, størrelse 2) ved 170 ± 2 ºC i 1 time. Etter denne behandlingen ble oljen avkjølt til romtemperatur før anvendelse.

Tilsetning av I3A til den steriliserte oljen

Tilnærmet 15 mg I3A ble nøyaktig innveid i en 20 ml glassflaske og tilsatt til tilnærmet 150 mg benzylalkohol (nøyaktig vekt notert) som på forhånd var filtrert gjennom et 0,22 μm MILLEX-GV-filter. Denne blandingen ble regelmessig vortexbehandlet over et tidsrom på tilnærmet 2 timer, inntil I3A var løst i benzylalkoholen. Til denne blandingen ble det tilsatt tilnærmet 14,835 g av den steriliserte oljen og vortexbehandlet i tilnærmet 5 minutter inntil en homogen løsning ble erholdt. Placeboformuleringen ble fremstilt på tilsvarende måte bortsett fra at tilnærmet 14,85 g av den steriliserte oljen (nøyaktig vekt notert) ble anvendt som kompensasjon for I3A. Nøyaktige vekter og prosentinnhold i preparatene vises i tabell 34 og 35 for aktive (I3A) og placeboformuleringer.

Tabell 34. Målmengder og faktiske mengder (og % (vekt/vekt)) for I3A-Croda/BA-oljeformuleringen

*Avrundet til 3 d.p.

Tabell 35. Målmengder og faktiske mengder (og % (vekt/vekt)) for placebo-Croda/BA-oljeformuleringen

*Avrundet til 3 d.p.

Fremstilling av oljeformulering ”Croda-BA/Antiox”

Langtidslagring av oljer kan føre til harskning, noe som kan degradere legemiddelproduktet. Følgelig kan en antioksidant tilsettes til formuleringen (etter varmesterilisering) for å redusere denne virkningen. Placebo- og aktive formuleringer som inneholdt en antioksidant etter varmesterilisering av oljen, ble fremstilt på følgende måte.

Fremstilling av antioksidant/benzylalkoholblanding

Tilnærmet 60 mg antioksidant (BHT) ble løst i 2 g benzylalkohol og filtrert gjennom et 0,22 μm MILLEX-GV-filter.

Tilsetning av I3A til den steriliserte oljen

Tilnærmet 15 mg I3A (porsjon nr. 0319) ble nøyaktig innveid i en 20 ml glassflaske og tilsatt til tilnærmet 154,5 mg BHT/benzylalkohol fremstilt som beskrevet ovenfor. Blandingen ble regelmessig vortexbehandlet over et tidsrom på tilnærmet 2 timer inntil I3A var oppløst i benzylalkoholen. Til denne blandingen ble det tilsatt tilnærmet 14,8305 g av den avkjølte, steriliserte oljen, og blandingen ble vortexbehandlet i tilnærmet 5 minutter inntil en homogen løsning ble erholdt. Placeboformuleringen ble fremstilt på tilsvarende måte bortsett fra at tilnærmet 14,8455 g av den steriliserte oljen (nøyaktig vekt notert) ble anvendt for å kompensere for I3A. Nøyaktige vekter og prosentsammensetning vises i tabell 36 og 37 for aktiv (I3A) og placeboformuleringer.

Tabell 36. Mål- og faktiske mengder (og % (vekt/vekt)) for I3A-Croda-BA/-antiox-oljeformuleringen

*Avrundet til 3 d.p.

Tabell 37. Mål- og faktiske mengder (og % (vekt/vekt)) for placebo-Croda-BA/-Antiox-oljeutforming

*Avrundet til 3 d.p.

Fremstilling av oljeformulering ”Croda/Antiox-BA”

Sterilisering med tørr varme av oljer kan også føre til harskning, noe som degraderer legemiddelproduktet. Følgelig kan en antioksidant inngå i formuleringen for å redusere denne virkningen før varmesteriliseringen. Placebo- og aktive formuleringer som inneholdt en antioksidant før varmesteriliseringen av oljen, ble fremstilt på følgende måte.

Sterilisering av antioksidant/oljeblanding

Tilnærmet 15 mg antioksidant (BHT) ble løst i tilnærmet 50 g olje i en 100 ml konisk kolbe (borsilikatglass), korket (kork av borsilikatglass) og plassert i en forvarmet ovn (Gallenkampf Hot box Oven med vifte, størrelse 2) ved 170 ± 2 ºC i 1 time. Etter denne behandlingen ble antioksidanten/oljen avkjølt til romtemperatur før anvendelse.

Tilsetning av I3A til den steriliserte oljen

Tilnærmet 15 mg I3A (porsjon nr. 0319) ble nøyaktig innveid i en 20 ml glassflaske og tilsatt til tilnærmet 150 mg benzylalkohol som på forhånd var filtrert gjennom et 0,22 μm MILLEX-GV-filter. Blandingen ble regelmessig vortexbehandlet i tilnærmet 2 t. inntil I3A var løst i benzylalkoholen. Til denne blandingen ble det tilsatt tilnærmet 14,835 g av den avkjølte, steriliserte antioksidant/oljeblandingen og vortexbehandlet i tilnærmet 5 minutter inntil en homogen løsning ble erholdt. Placeboformuleringen ble fremstilt på tilsvarende måte, bortsett fra at tilnærmet 14,8455 g av den steriliserte oljen (nøyaktig vekt notert) ble anvendt for å kompensere for I3A.

Nøyaktige vekter og prosentsammensetning vises i tabellene 38 og 39 for aktive (I3A) og placeboformuleringer.

Tabell 38. Mål og faktisk mengder (og % (vekt/vekt)) for I3A-Croda/Antiox-BA-oljeformuleringen

*Avrundet til 3 d.p.

Tabell 39. Mål og faktiske mengder (og % (vekt/vekt)) for placebo-Croda/-Antiox-BA-oljeformuleringen

*Avrundet til 3 d.p.

Alikvoter av alle formuleringer ble lagret for foreløpige frigjøringsstudier, mens resten ble alikvotert i 2 ml ravfargede borsilikat-glassflasker, korket og lagret ved 2-8 ºC og 25 ºC for stabilitetsstudier.

Foreløpige I3A-frigjøringsstudier

Valg av mottakervæske

Mottakervæsken som ble benyttet i et forsøk på å opprettholde synkeforhold, var 20 % (vol/vol) etanol/citratbuffer (pH 3,0), og denne ble overført til Franz-cellen og omrørt konstant med magnetrører. Foreløpige stabilitetsstudier ble utført på I3A i 20 % (vol/vol) etanol/citratbuffer (pH 3,0) ved 37 ºC over et tidsrom på tilnærmet 18 timer. Prosent økning av topparealet for isoform ”a” etter 18 timer ble funnet å være 0,26 %. For formålet med Franz-cellestudien ble dette ansett som akseptabelt. Den kinetiske løselighet av I3A i 20 % (vol/vol) etanol/citratbuffer (pH 3,0) ble bestemt til 509,7 ± 3 μg/ml ved 25 ºC.

In vitro frigjøringsstudier (Franz-celle)

Individuelt kalibrerte Franz-diffusjonsceller med et gjennomsnittlig diffusjonsoverflateareal på 0,53 cm<2>og et gjennomsnittlig mottakervolum på 1,85 ± 0,02 ml ble anvendt for utførelse av frigjøringsstudiet. De regenererte cellulosemembranene (MWCO 12000-14000) ble klargjort, kuttet og montert i Franz-cellene. Membranene fikk ekvilibreres med mottakerfasen i 30 minutter før formuleringene ble påført. En uendelig dose på 0,5 g av hver formulering ble påført på membranoverflaten ved anvendelse av en ”Finnpipette” med positiv fortrengning. Én prøveavlesning ble undersøkt (26 timer etter påføring av gelen), hvorved 200 μl av mottakervæsken forsiktig ble fjernet fra armen i Franz-cellen. Gjennom hele eksperimentet ble eventuelt tap av mottakervæske grunnet fordamping fra Franz-cellene erstattet for opprettholdelse av et konstant volum.

Eksperimentet ble utført under okkluderte betingelser (toppen av de øvre donorbrønnene dekket med PARAFILM) for alle formuleringer (n=3 Franz-celler for hver aktive formulering og n=1 Franz-celle for hver placeboformulering). Prøvene ble analysert ved HPLC, og konsentrasjonen av I3A ”b” frigjort, ble evaluert ved anvendelse av en serie av kalibreringsstandarder fremstilt i 80 % (vol/vol) sitrabuffer/20 % (vol/vol) etanol.

HPLC-fremgangsmåte

HPLC-fremgangsmåten som tidligere er beskrevet i eksempel 1, ble anvendt for bestemmelse av I3A.

Resultater

Foreløpige frigjøringsstudier

Figur 10 viser mengden I3A ”b” frigjort (μg/cm<2>) etter 26 timer fra 0,1 % (vekt/vekt) oljeformuleringer og PEG 400-formuleringer. Ingen signifikant forskjell i frigjøringen ble funnet (0>0,05) mellom noen av oljeformuleringene. Imidlertid var frigjøringen av I3A ”b” fra alle oljeformuleringer signifikant lavere (p<0,05) enn frigjøringen fra PEG 400-kontrollformuleringen. Mengden I3A ”b” frigjort fra alle oljeformuleringer, var tilnærmet 3,4 μg/cm<2>, imidlertid var mengden frigjort fra PEG 400-kontrollformuleringen, tilnærmet 16 ganger høyere (53 μg/cm<2>). Videre ser det ut til at tilsetning av BHT (antioksidant) ikke i signifikant grad påvirker frigjøringen av I3A ”b” fra oljeformuleringene.

Eksempel 8

Stabilitet av IPA-gelformuleringer

Stabiliteten (T=12 måneder) av I3A ”b” i IPA-gelformuleringer fremstilt ved anvendelse av citratbuffere med forskjellig pH, ble bestemt. pH-området var fra 2,5 til 4,0.

MATERIALER

FREMGANGSMÅTER HPLC-instrumentering og -metodologi

Prøveløsningene ble analysert for prosent topprenhet ved HPLC. De kromatografiske betingelsene for HPLC-fremgangsmåte 2 er gitt i detalj nedenfor:

Instrumentering:

Waters Alliance 2695 Separations Module plus Autosampler (SN: L96SM4656N) Waters 996 PDA-detektor (SN: MX7AM7987M)

Programvaren Millennium<32>, versjon 4.00

Kromatografibetingelser:

Kolonne: Symmetry C18 - 5 μm (Waters)

(SN: T70641T 12)

Kolonnelengde: 150 x 3,90 mm

Kolonnetemperatur: 30 ºC ± 2 ºC

Beskyttelseskolonne: Symmetry C18 - 5 μm (Waters)

(PN: WAT054225)

Beskyttelseskolonnens lengde: 20 x 3,90 mm

Mobil fase: 0,02 % (vol/vol) TFA i vann (A);

0,02 % (vol/vol) TFA i acetonitril (B)

A:B; 50:50 (utgangssammensetning) Elueringshastighet: 1,0 ml/min

Autoprøvetakertemperatur: 8 ºC ± 2 ºC

UV-bølgelengde: 230 nm

Injeksjonsvolum: 10 μl

Analysetid: 20 minutter

Gradienter

Ekstraksjon av I3Ab fra IPA-gelformuleringene

I3Ab ble ekstrahert fra hver av IPA-gelformuleringene som følger: tilnærmet 0,5 g av hver aktive eller placebo-gelformulering ble nøyaktig innveid i en 5 ml målesylinder av A-kvalitet. Dette ble utført i duplikat for hver formulering. Citratbuffer (pH=3,0, 0,5 ml) ble så tilsatt til hver gelprøve og vortexbehandlet ved maksimal hastighet i 1 minutt og så overført til en orbital ristemaskin og omristet ved 400 rpm i 30 minutter. Acetonitril av HPLC-kvalitet ble tilsatt opp til volumet for hver av målekolbene som igjen ble vortexbehandlet ved maksimal hastighet i 1 minutt. Til slutt ble målekolbene overført til en orbital ristemskin og omristet ved 400 rpm i 60 minutter. Alikvoter ble så overført til HPLC-flasker for analyse.

Måling av tilsynelatende pH i placebogeler

Tilsynelatende pH i placebogelene ble målt ved anvendelse av et Jenway 3320 pH-meter med en kombinasjons-pH-elektrode. Kort beskrevet ble tilnærmet 0,5 g av hver gel overført til 25 ml glassflasker og inkubert ved romtemperatur i minst 1 time.

Kombinasjons-pH-elektroden ble plassert i IPA-gelen idet man sikret at hele elektrodens membran var dekket med gel. Avlesningen på pH-meteret fikk innstille seg i minst 1 min., og den tilsynelatende pH i gelen ble notert.

RESULTATER

Måling av tilsynelatende pH i placebogeler ved T=12 måneder

Tilsynelatende pH i placebo-IPA-gelene ved T=0 og T=12 måneder etter lagring ved 2-8 ºC vises i tabell 40.

Tabell 40. Tilsynelatende pH i placebo-IPA-gelene ved T=0 og T=12 måneder

Resultatene i tabell 40 viser at det ikke var noen signifikant endring av tilsynelatende pH etter 12 måneders lagring ved 2-8 ºC for placebo-IPA-gelene fremstilt med citratbuffer pH 3,00, 3,50 og 4,00. For placebo-IPA-gelene fremstilt med citratbuffer pH 2,50 og 2,75, ble imidlertid en svak reduksjon av pH observert etter 12 måneders lagring ved 2-8 ºC. Reduksjonen i pH som ble observert for disse gelene, kan skyldes fordamping av IPA fra gelen, enten under lagring eller under prøveanalysen.

Prosent topprenhet av I3A-isomerer i aktive IPA-geler ved T=12 måneder Tabell 41 viser prosent topprenhet av I3A-isomerer for de forskjellige aktive (0,1 % (vekt/vekt)) IPA-gelformuleringene etter lagring i 12 måneder ved 2-8 ºC, mens tabell 42 viser en sammenligning av prosent topprenhet av I3Aa ved T=0 og T=12 måneder.

Tabell 41. Prosent topprenhet av I3A-isomerer for de aktive IPA-gelene etter 12 måneders lagring ved 2-8 ºC

Resultater analysert ved anvendelse av HPLC-fremgangsmåte 2

Resultatene i tabell 41 viser at det etter 12 måneders lagring ved 2-8 ºC er en økning av prosent topprenhet av isoform a med økende tilsynelatende pH i de tilsvarende placebo-gelformuleringene. For eksempel har en IPA-gel fremstilt med citratbuffer pH 2,75, en prosent topprenhet av isoform a på 1,07 % sammenlignet med en IPA-gelformulering fremstilt med citratbuffer pH 4,00 som har en prosent topprenhet av isoform a på 4,92 %. Disse resultatene fremhever den forhøyede stabilitet av I3Ab i IPA-gelformuleringer fremstilt med citratbuffere med lavere pH.

Tabell 42. Sammenligning av prosent topprenhet av I3Aa ved T=0 og T=12 måneder

T=0 resultater etter analyse ved HPLC-fremgangsmåte 1 og

T=12 måneder resultater etter analyse ved HPLC-fremgangsmåte 2

Resultatene i tabell 42 viser at det er en økning av prosent topprenhet av isoform a i alle de aktive IPA-gelformuleringene etter 12 måneders lagring ved 2-8 ºC. Imidlertid viste IPA-gelformuleringen fremstilt med citratbuffer pH 2,50, kun en svak økning av prosent topprenhet av isoform a (0,22 %) sammenlignet med for eksempel IPA-gelformuleringen fremstilt med citratbuffer pH 4,00, som viste den høyeste økningen av prosent topprenhet av isoform a (4,48 %). Igjen fremhever disse resultatene den økte stabilitet av I3Ab i IPA-gelformuleringer fremstilt med citratbuffere med lavere pH.

Følgelig ser IPA-gelformuleringen fremstilt med citratbufferen med den laveste pH, ut til å holde seg innenfor spesifikasjonene (<1 % isoform a) i 12 måneder ved 2-8 ºC.

Etter 12 måneders lagring ved 2-8 ºC var følgelig IPA-gelformuleringene som ga den beste stabilitet av I3Ab, formuleringene som ble fremstilt med citratbuffere med lav pH (pH = 2,5-3,0).

Eksempel 9

Stabilitet av I3A ”b” i gel-forblandingsløsninger med forskjellig pH og temperatur

Fremgangsmåter

Fremstilling av gel-forblandingsløsninger

Gel-forblandingsløsningene ble fremstilt ifølge følgende fremgangsmåte: 1. Citratbufferen veies direkte inn i en ren, tørr Duran-flaske.

2. IPA veies direkte inn i Duran-flasken fra trinn 1.

3. Den korrekte mengde I3A ”b” innveies i en ren, tørr prøveflaske.

4. Den korrekte mengde benzylalkohol innveies i prøveflasken fra trinn 3. 5. Prøveflasken fra trinn 4 plasseres i en orbital ristemaskin og omristes ved 400 rpm inntil all I3A ”b” er løst.

6. I3A ”b”/benzylalkoholløsningen fra trinn 5 tilsettes til Duran-flasken fra trinn 2.

7. Blandingen omrøres inntil en homogen løsning erholdes.

Sammensetningen av gel-forblandingsløsningene som skal fremstilles og plasseres for stabilitet, er:

Tabell 43 Gel-forblandingsløsning 1

Tabell 44 Gel-forblandingsløsning 2

Tabell 45 Gel-forblandingsløsning 3

Tabell 46 Gel-forblandingsløsning 4

Tabell 47 Gel-forblandingsløsning 5

Tabell 48 Gel-forblandingsløsning 6

Tabell 49 Gel-forblandingsløsning 7

Tabell 50 Gel-forblandingsløsning 8

Stabilitetsanalyse av gel-forblandingsformuleringer

Gel-forblandingsløsningene fremstilt ovenfor, ble analysert for stabilitet ved 2-8, 25 og 40 ºC og ble analysert for tidspunktene T=0 og T=2 uker. Ved hvert tidspunkt ble forblandingsløsningene analysert for I3A ”b”-innhold ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i detalj nedenfor.

1.1.3 Stabilitetsanalyse for gel-forblandingsformuleringer

De fremstilte gel-forblandingsløsningene ble plassert ved 2-8, 25 og 40 ºC for analyse av stabilitet og ble analysert på tidspunktene T=0 og T=2 uker. For hvert tidspunkt ble forblandingsløsningene analysert for I3A ”b”-innhold ved å beregne prosent HPLC-toppareal for I3A ”b” relativt til topparealet av de I3A ”b”-beslektede forbindelsene isoform ”a” og isoform ”c”, som beskrevet nedenfor.

HPLC-instrumentering og -metodologi

Alle prøver som skulle analyseres for I3A ”b”, ble analysert ved anvendelse av HPLC-fremgangsmåte 2. Instrumenteringen og kromatografibetingelsene for HPLC-fremgangsmåte 2 er som følger:

Instrumentering:

Waters Alliance 2695 Separations Module plus Autosampler

Waters 996 PDA-detektor

Programvaren Empower, versjon 2.00

Kromatografibetingelser:

Kolonne: Symmetry C18 - 5 μm (Waters) Kolonnelengde: 150 x 3,90 mm

Kolonnetemperatur: 30 ºC ± 2 ºC

Beskyttelseskolonne: Symmetry C18 - 5 μm (Waters)

(PN: WAT054225) Beskyttelseskolonnens lengde: 20 x 3,90 mm

Mobil fase: 0,02 % (vol/vol) TFA i vann (A);

0,02 % (vol/vol) TFA i acetonitril (B);

A:B; 50:50 (utgangssammensetning) (gradient, se tabell 51 nedenfor) Elueringshastighet: 1,0 ml/min Autoprøvetakertemperatur: 8 ºC ± 2 ºC

UV-bølgelengde: 230 nm

Injeksjonsvolum: 10/40 μl

Analysetid: 20 minutter

Tabell 51. Gradienttabell for HPLC-fremgangsmåte 2

Stabilitetsresultater for I3A ”b” i gel-forblandingsløsninger med pH i området fra 2,75 til 4,00 ved 2-8, 25 og 40 ºC (middelverdi, n=3)

Konklusjoner:

Lagring av alle gel-forblandingsløsninger ved 2-8 ºC gir den beste stabilitet av I3A ”b”, basert på den høyere prosent HPLC-topprenhet som erholdes for I3A ”b” sammenlignet med lagring av gel-forblandingsløsningene ved 25 og 40 ºC.

De to gel-forblandingsløsningene som ga best stabilitet av I3A ”b” basert på prosent HPLC-topprenhet, var nr. 1 og 5. Disse forblandingsløsningene inneholdt citratbufferen med den laveste pH som ble anvendt i undersøkelsen (pH=2,75).

De to gel-forblandingsløsningene som ga lavest stabilitet av I3A ”b”, basert på prosent HPLC-topprenhet, var nr. 4 og 8. Disse forblandingsløsningene inneholder citratbufferen med den høyeste pH som ble anvendt i undersøkelsen (pH=4,00).

Reduksjon av temperaturen og pH i citratbufferen i gel-forblandingsløsningen ga den beste stabilitet av I3A ”b” dersom prosent HPLC-topprenhet av I3A ”b” ble anvendt som stabilitetsindikator i denne studien.

REFERANSER:

Ho VC, Griffiths CEM, Ellis CN, Gupta AK, McCuaig CC, Nickoloff BJ, Cooper KD, Hamilton TA and Voorhees JJ. J Am Acad Dermatol 22:94-100, 1990.

Ford JL. Parenteral products In: Pharmaceutics, The Science of dosage form design (red. ME Aulton), Churchill Livingstone, London, 1988.

Wade A og Weller PJ. Handbook of Pharmaceutical Excipients 2<nd>Edition. American Pharmaceutical Association, Washington, 1994.

Barichello JM, Morishita M, Takayama K og Nagai T, Absorption of insulin from pluronic F-127 gels following subcutaneous administration in rats. Int J Pharm 184:189-198, 1999.

Tobiyama T, Miyazaki S og Takada M, Use of pluronic F-127 gels as a vehicle for percutaneous absorption. Yakuzaigaku 54:205-213, 1994.

Morikawa K et al., Enhancement of therapeutic effects of recombinant interleukin-2 on a transplantable rat fibrosarcoma by the use of a sustained release vehicle, Pluronic gel. Cancer 47:37-41, 1987

Katakama M et al., Controlled release of human growth hormone in rats following parenteral administration of poloksamer gels. J Control Rel 49:21-26, 1997.

Wasan KM, Subramanian R, Kwong M, Goldberg IJ, Wright t. og Johnston TP, Poloksamer 407 mediated alterations in the activities of enzymes regulating lipid metabolism in rats. J. Pharm Sci. 6 189-197, 2003.

Powell MF, Nguyen t. og Baloian L. Compendium of Excipients for Parenteral Formulations. PDA J Pharm Sci Tech 52:238-311, 1998.

Schmolka IR, Artificial skin I. Preparation and properties of pluronic F-127 gels for the treatment of burns. J. Biomed. Mater. Res., 6, 571-582, 1972.

Claims

Patentkrav

1. Formulering av ingenolangelat for anvendelse som medikament, hvor ingenolangelatet er blitt løst i et farmasøytisk akseptabelt løsemiddel valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, metyletylketon, etylacetat, dietyleter, benzylalkohol og blandinger av disse, hvor formuleringen videre omfatter et farmasøytisk akseptabelt surgjøringsmiddel som i det minste delvis er forenlig med løsemidlet og som gir formuleringen en tilsynelatende pH på 3 til mindre enn 4.

2. Formulering ifølge krav 1, hvor surgjøringsmidlet er blitt tilsatt etter fremstillingen av en løsning av ingenolangelat i løsemidlet.

3. Formulering ifølge krav 1 eller 2, hvor ingenolangelatet er ingenol-3-angelat.

4. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor ingenolangelatet som foreligger i formuleringen, er minst 99% ingenol-3-angelat.

5. Formulering ifølge krav 4, hvor mengden av ingenol-3-angelat er minst 99,5%.

6. Formulering ifølge krav 1, hvor løsemidlet i det vesentlige består av benzylalkohol.

7. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor surgjøringsmidlet er en syre.

8. Formulering ifølge krav 7, hvor surgjøringsmidlet er en organisk syre.

9. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor surgjøringsmidlet er en sur buffer.

10. Formulering ifølge krav 9, hvor bufferen er valgt fra gruppen som består av en citratbuffer, fosfatbuffer, acetatbuffer og citrat-fosfatbuffer.

11. Formulering ifølge krav 9, hvor bufferen er citratbuffer.

12. Formulering ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 11, hvor bufferens pH før tilsetning til formuleringen er mellom pH 2,5 og pH 4, innbefattet begge disse verdier.

13. Formulering ifølge krav 12, hvor bufferens pH er mellom pH 2,7 og pH 3,5, innbefattet begge disse verdier.

14. Formulering ifølge krav 13, hvor bufferens pH er mellom pH 2,7 og pH 3,0, innbefattet begge disse verdier.

15. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor den har en tilsynelatende pH på 3,5.

16. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, som består av ingenolangelat, benzylalkohol og citratbuffer pH 2,5, hvor bufferen foreligger i en mengde som utgjør mellom 0.5 og 10% (vekt/vekt) av formuleringen.

17. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor den videre omfatter en antioksidant.

18. Formulering ifølge krav 17, hvor antioksidanten er valgt fra gruppen som består av retinol, askorbinsyre, lykopen, tokoferol, butylert hydroksytoluen og blandinger av disse.

19. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor løsemidlet og surgjøringsmidlet er i stand til å danne en enkelt fase.

20. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor den videre omfatter et konserveringsmiddel valgt fra: et paraben, benzosyre, benzylalkohol og blandinger av disse.

21. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor den videre omfatter et penetrasjonsfremmende middel.

22. Formulering ifølge krav 21, hvor det penetrasjonsfremmende midlet er valgt fra gruppen som består av isopropylalkohol, et sulfoksid, et azon, et pyrrolidon, en alkanol, en glykol, en fettsyre, vann, en surfaktant, et terpen, et fosfolipid og blandinger av disse.

23. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor den videre omfatter et mukoadhesivt middel.

24. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor den foreligger i form av et preparat som er egnet for topisk administrasjon.

25. Preparat ifølge krav 24, hvor det omfatter en hovedandel av en sur buffer på vektbasis.

26. Preparat ifølge krav 24 eller 25, hvor det videre omfatter et geldannende middel.

27. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 24 til 26, hvor det foreligger i form av en gel, krem, salve eller pensling.

28. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor ingenolangelatet er minst 99% ingenol-3-angelat og hvor ikke mer enn 1% rearrangering til ”a”-isoformen (ingenol-5-angelat) har funnet sted etter 3 måneder.

29. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor ingenolangelatet er minst 99% ingenol-3-angelat og hvor ikke mer enn 0,5% rearrangering til ”a”-isoformen (ingenol-5-angelat) har funnet sted etter 3 måneder.

30. Formulering ifølge et hvilket som helst av de foregående krav for anvendelse ved behandling av hudkreft.

31. Anvendelse av ingenolangelat ved fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av hudkreft, hvor ingenolangelatet oppløses i et farmasøytisk akseptabelt løsemiddel valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, metyletylketon, etylacetat, dietyleter, benzylalkohol og blandinger av disse og hvor formuleringen videre omfatter et farmasøytisk akseptabelt surgjøringsmiddel som i det minste delvis er forenlig med løsemidlet og som gir formuleringen en tilsynelatende pH på 3 til mindre enn 4.

32. Anvendelse ifølge krav 31, hvor i formuleringen er som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 28.

33. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 31 til 32, hvor hudkreften er en platecelle- eller basalcellekreft.

34. Fremgangsmåte for fremstilling av en formulering av ingenolangelat, hvor den omfatter oppløsning av ingenolangelatet i et farmasøytisk akseptabelt løsemiddel valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, metyletylketon, etylacetat, dietyleter, benzylalkohol og blandinger av disse, hvor fremgangsmåten omfatter tilsetning av et farmasøytisk akseptabelt surgjøringsmiddel som i det minste delvis er forenlig med løsemidlet og som gir formuleringen en tilsynelatende pH på 3 til mindre enn 4, hvor surgjøringsmidlet tilsettes sammen med, før eller etter ingenolangelatet.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34, hvor formuleringen er som definert i et hvilket som helst av kravene 2 til 27.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 34 eller 35, hvor ingenolangelatet i det vesentlige er ingenol-3-angelat, og at tilsetningen av surgjøringsmiddel og tilsetningsbetingelsene er valgt slik at man forhindrer at mer enn 1% av ingenol-3-angelatet rearrangeres til ”a”-isoformen (ingenol-5-angelat).

37. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 34 til 36, hvor ingenolangelatet i det vesentlige er ingenol-3-angelat og at tilsetningen av surgjøringsmiddel og tilsetningsbetingelsene er valgt slik at man forhindrer at mer enn 0,5% av ingenol-3-angelatet rearrangeres til ”a”-isoformen (ingenol-5-angelat).

38. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 34 til 37, hvor surgjøringsmidlet gir formuleringen en tilsynelatende pH på mellom pH 3 og pH 3,5.

39. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 34 til 38, hvor surgjøringsmidlet tilsettes i en mengde som utgjør mellom 0.5 og 10% (vekt/vekt) av formuleringen.

40. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 34 til 39, hvor formuleringen fremstilles med kun de definerte bestanddelene før tilsetning av eventuelt andre ønskelige bestanddeler.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 40, hvor en videre ønsket bestanddel er et overskudd av sur buffer.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 40 eller 41, hvor en videre ønsket bestanddel er polyetylenglykol.

43. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 40 til 42, hvor en videre ønsket bestanddel er et geldannende middel.

44. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 41 til 43, hvor formuleringen deretter lagres ved en temperatur på mellom frysepunktet og 8 °C.