EA011673B1 - Способ очистки fsh - Google Patents
Способ очистки fsh Download PDFInfo
- Publication number
- EA011673B1 EA011673B1 EA200701040A EA200701040A EA011673B1 EA 011673 B1 EA011673 B1 EA 011673B1 EA 200701040 A EA200701040 A EA 200701040A EA 200701040 A EA200701040 A EA 200701040A EA 011673 B1 EA011673 B1 EA 011673B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- chromatography
- stage
- carried out
- anion exchange
- resin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 39
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 48
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 48
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 30
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 30
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 28
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 26
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 23
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 19
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 8
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 7
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 101100427344 Mus musculus Usp10 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 2
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 abstract 1
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 9
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 8
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 4
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 4
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 4
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 4
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 2
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- KZTYYGOKRVBIMI-UHFFFAOYSA-N diphenyl sulfone Chemical compound C=1C=CC=CC=1S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KZTYYGOKRVBIMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 2
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 2
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 2
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUTLAXLNPLZCOF-UHFFFAOYSA-N 1-Methylhistidine Natural products OC(=O)C(N)(C)CC1=NC=CN1 LUTLAXLNPLZCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXHBSOXJLNEOPY-UHFFFAOYSA-N 2'-anilino-6'-(n-ethyl-4-methylanilino)-3'-methylspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C=1C=C(C2(C3=CC=CC=C3C(=O)O2)C2=CC(NC=3C=CC=CC=3)=C(C)C=C2O2)C2=CC=1N(CC)C1=CC=C(C)C=C1 IXHBSOXJLNEOPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAVZTHXOOBZCOB-UHFFFAOYSA-N 2,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl phenol Natural products CC(C)CC1=CC(C)=CC(CC(C)C)=C1O FAVZTHXOOBZCOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 2-[4-[(z)-2-chloro-1,2-diphenylethenyl]phenoxy]-n,n-diethylethanamine;hydron;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C1=CC(OCCN(CC)CC)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(/Cl)C1=CC=CC=C1 PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 1
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLPFFLWZZBQMAO-UHFFFAOYSA-N 4-(5,6,7,8-tetrahydroimidazo[1,5-a]pyridin-5-yl)benzonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C1N2C=NC=C2CCC1 CLPFFLWZZBQMAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHCNINMOALIGKM-UHFFFAOYSA-N 5,5,7,12,12,14-hexamethyl-1,4,8,11-tetrazacyclotetradecane Chemical compound CC1CC(C)(C)NCCNC(C)CC(C)(C)NCCN1 XHCNINMOALIGKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVHIXYEVGDQDX-UHFFFAOYSA-N 9,10-anthraquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1 RZVHIXYEVGDQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 1
- 108010085443 Anserine Proteins 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N Carnosic acid Natural products CC([C@@H]1CC2)(C)CCC[C@]1(C(O)=O)C1=C2C=C(C(C)C)C(O)=C1O QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N 0.000 description 1
- 108010087806 Carnosine Proteins 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SLRNWACWRVGMKD-UHFFFAOYSA-N L-anserine Natural products CN1C=NC(CC(NC(=O)CCN)C(O)=O)=C1 SLRNWACWRVGMKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-LURJTMIESA-N N(tele)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC(C[C@H](N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N N-beta-alanyl-L-histidine Natural products NCCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100234604 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ace-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010058823 Ovarian mass Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000210053 Potentilla elegans Species 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000005844 Thymol Substances 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- MYYIAHXIVFADCU-QMMMGPOBSA-N anserine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](NC(=O)CC[NH3+])C([O-])=O MYYIAHXIVFADCU-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N carnosine Chemical compound [NH3+]CCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC=N1 CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 229940044199 carnosine Drugs 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046989 clomiphene citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate Substances CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229950011548 fadrozole Drugs 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 201000003368 hypogonadotropic hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960003881 letrozole Drugs 0.000 description 1
- HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N letrozole Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C(N1N=CN=C1)C1=CC=C(C#N)C=C1 HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 229960000790 thymol Drugs 0.000 description 1
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fluid-Pressure Circuits (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Manufacturing Of Electric Cables (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу очистки рекомбинантного человеческого FSH или варианта FSH, начиная с неочищенного FSH, включающему следующие стадии: (1) аффинная хроматография с красителем; (2) хроматография гидрофобного взаимодействия и (3) хроматография с обращенной фазой.
Description
Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области очистки фолликулостимулирующего гормона (Е8Н).
Описание предшествующего уровня техники
Фолликулостимулирующий гормон (Е8Н) представляет собой инъецируемый белок, относящийся к классу гонадотропинов. Е8Н используется при лечении бесплодия и репродуктивных нарушений как у женщин, так и у мужчин.
В природе Р8Н вырабатывается гипофизом. Для фармацевтического применения Р8Н можно получить рекомбинантно (тР8Н) или его можно выделить из мочи женщин в постменопаузе (иР8Н).
Р8Н используется у женщин при индукции овуляции (01) и при регулируемой гиперстимуляции яичников (С0Н) для вспомогательных репродуктивных технологий (АКТ). При типичной схеме лечения для индукции овуляции пациентке ежедневно производят инъекции Р8Н или его варианта (примерно от 75 до 300 МЕ Е8Н/день) в течение периода от примерно 6 до примерно 12 дней. При типичной схеме лечения для регулируемой гиперстимуляции яичников пациентке ежедневно производят инъекции Е8Н или его варианта (примерно 150-600 МЕ Е8Н/день) в течение периода от примерно 6 до примерно 12 дней.
Е8Н также используется для индукции сперматогенеза у мужчин, страдающих олигоспермией. Схема с использованием 150 МЕ Е8Н 3 раза в неделю в комбинации с 2500 МЕ йСС (человеческого хорионического гонадотропина) 2 раза в неделю была успешна в достижении увеличения количества сперматозоидов у мужчин, страдающих гипогонадотропным гипогонадизмом [Витдиек е! а1.; 8иЬси1апеоик ке1Г-абт1шк!га!юп οί ЫдЫу ритШеб Го1Пс1е кйти1айпд йотшопе апб йишап ейотюше допабойорЫп ίοτ 1йе 1геа1теп1 оГ ша1е ЬуродопабойорЫс ЬуродопабЦш. 8рашкй СоЙаЬотаЙуе Сгоир оп Ма1е НуродопабойорЫс Нуродопабщш; Ниш. Кергоб.; 1997, 12, 980-6].
Ввиду значения Е8Н при лечении нарушений фертильности желательно получение Е8Н высокой чистоты и высокой удельной активности. Лечение Е8Н требует повторных инъекций. Высоко очищенные препараты Е8Н можно вводить подкожно, что позволяет пациенту самостоятельно его вводить, увеличивая таким образом удобство для пациента и выполнение им лечебных предписаний.
Ьупсй е! а1. |Тйе ех!гасйоп апб ритШсайоп оГ йишап рйийату ГоШс1е-8Йши1абпд йогтопе апб 1и(е1п15тд йогтопе; Ас!а Епбосгто1одюа, 1988, 288, 12-19] описывают способ очистки человеческого гипофизарного Е8Н. Способ включает анион- и катионобменную хроматографию, иммуноаффинную экстракцию и эксклюзионную хроматографию (гель-хроматографию). Считают, что способ приводит к получению гипофизарного Е8Н, имеющего удельную активность 4990 МЕ (иммуноанализ)/мг с 16 МЕ/мг ЬН (лютеинизирующего гормона). Содержание белка определяли или по сухой массе или в растворе по поглощению волн при 280 нм (допуская, что А28С\ см для 1 г/л равно 1).
В документе АО 98/20039 (1В8А 1пкШи( Вюсййпк|ие 8А) описан способ очистки человеческого мочевого Е8Н, начиная с мочевых экстрактов, называемых человеческими гонадотропинами, обнаруживаемыми в период менопаузы (йМС). В способе используется ионообменная хроматография на слабо основных анионных обменных смолах типа ИЕАЕ с последующей аффинной хроматографией на смоле, имеющей в качестве лиганда производное антрахинона. Считается, что способ дает выход мочевого Е8Н, свободного от ЬН и имеющего удельную активность 6,870 МЕ (иммуноанализ)/мг. Содержание белка определяли допущением того, что водный раствор 1 мг/мл белка имеет оптическую плотность 0,62 при 277 нм в кварцевых кюветах с длиной пути 1 см.
В документе АО 00/63248 (1пк!йи!о Маккопе 8А) описан способ очистки гонадотропинов, включая Е8Н, из мочи человека. Способ включает следующие стадии:
1) ионообменная хроматография с сильной катионной смолой типа сульфопропила;
2) ионообменная хроматография с анионной смолой и
3) хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С).
Сообщают о получении препарата Е8Н, имеющего удельную активность 8400 МЕ/мг (способ 8ΐее1шаи-Рοй1еу, Аккау оГ 1йе ГоШс1е кйти1абпд йогтопе Ьакеб оп 1йе аидтеШайоп тейй йитап сйопошс допабойорЫп; Епбостшо1оду; 1953, 53, 604-616) и менее чем 1 МЕ ЬН (способ прибавки массы крысиных семенных пузырьков: (Уап Не11 Н., Маййркеп К. & С.А. ОуетЬеек; Ас!а Епбосппой 1964, 47, 409) биологической активности на 75 МЕ Е8Н. Содержание белка определяли способом Ьо^ту [О.Н. Ьо^ту е! а1., 1. Вю1. Сйет., 1951, 193, 265].
В патенте США № 5990288 (Микюк е! а1.) описан способ очистки Е8Н из биологических образцов, таких как гипофизы человека или моча человека в период после менопаузы. В способе используется катионообменная хроматография на Етас!оде1 ЕМИ 8О3-650М с последующей стадией аффинной хроматографии с красителем на смоле Мипебс Огапд 1, с последующей стадией хроматографии гидрофобного взаимодействия на смоле ВакегЬопб А1бе Роге Н1-Ргору1. Считают, что способ приводит к получению гипофизарного Е8Н человека, имеющего удельную активность 7,066 МЕ (иммуноанализ)/мг и менее чем 1 МЕ (иммуноанализ)/мг ЬН, и мочевого Е8Н, имеющего удельную активность 6,298 МЕ (иммуноанализ)/мг и менее чем 3 МЕ (иммуноанализ)/мг ЬН. Содержание белка определяли по поглощению волн при 280 нм (допуская, что А280! см для 1 г/л равно 1).
- 1 011673
В документе СЫЬа с( а1. [1зо1а1юп апб рагйа1 сйагасГепзабоп оГ ЬН, Е8Н апб Т8Н Гтот сашпе рйийагу д1апб; Епбосппо1. 1., 1997, 44, 205-218] описана методика очистки гипофизарных гонадотропинов собаки, включая Е8Н, с использованием аффинной хроматографии конканавалина (Соп) А, хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С) и хроматографии с иммобилизованным ионом металла с Си++. Сообщают, что полученный Е8Н имеет удельную активность 2,17 МЕ/г белка, используя радиорецепторный анализ для Е8Н для измерения биологической активности и аналитического набора ВюВаб (ВюВаб ЬаЬогаЮпез СА И8А) для определения содержания белка.
В документе \¥О 88/10270 (Гп81йи1о б1 Рюегса Сезаге 8егопо 8РА) описан способ очистки Е8Н из мочи человека. Способ включает иммунохроматографию с Е8Н-специфичными иммобилизованными моноклональными антителами, связаными с Зерйагозе 4В дифинилсульфоном с последующей ВЭЖХ с обращенной фазой. Полученный Е8Н свободен от ЬН и других мочевых белков и имеет удельную активность 6,200 МЕ/мг лиофилизированного порошка (способ 81ее1тап-Рой1еу). Препарат был первым Е8Н, подходящим для подкожного введения ввиду его чистоты.
Сохраняется потребность в новых способах очистки Е8Н и вариантов Е8Н. В частности, есть потребность в способах очистки, которые избегают применения дорогостоящих стадий иммуноаффинной хроматографии.
Краткое описание сущности изобретения
Целью изобретения является предоставление нового способа очистки рекомбинантного Е8Н или рекомбинантного варианта Е8Н.
В первом аспекте изобретение предоставляет способ очистки рекомбинантного Е8Н человека или варианта Е8Н, начиная с жидкости, содержащей неочищенный Е8Н, включающий следующие стадии:
(1) аффинная хроматография с красителем;
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия и (3) хроматография с обращенной фазой; которые можно проводить в любом порядке.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует настоящее изобретение, т.е. способ очистки, включающий стадии аффинной хроматографии с красителем;
хроматографии гидрофобного взаимодействия;
хроматографии с обращенной фазой.
На фиг. 2 показана блок-диаграмма конкретного варианта осуществления настоящего изобретения, т.е. способа очистки, включающего стадии:
ультрафильтрации/диафильтрации;
анионообменной хроматографии;
аффинной хроматографии с красителем;
хроматографии гидрофобного взаимодействия;
хроматографии с обращенной фазой; анионообменной хроматографии;
нанофильтрации;
ультрафильтрации/диафильтрации.
Аббревиатуры
При описании изобретения используются следующие аббревиатуры:
ЭЕ: диафильтрация.
Е8Н: фолликулостимулирующий гормон.
г-Е8Н: рекомбинантный Е8Н.
11Р8Н: человеческий Е8Н.
Г-11Р8Н: рекомбинантный человеческий Е8Н.
ВУ: объем слоя.
ЭЕАЕ: диэтиламиноэтил.
ЕЫ8А: ферментный иммуноанализ.
ЭАС: аффинная хроматография с красителем.
1МАС: хроматография с иммобилизованным ионом металла.
ΟΌ: оптическая плотность.
Н1С: хроматография гидрофобного взаимодействия.
НРЬС: высокоэффективная жидкостная хроматография.
1КМА: иммунорадиометрический анализ.
ΚΌ или кЭ: килодальтон.
НСР: белок клетки-хозяина, белки, возникающие из клетки-хозяина, используемой для экспрессии Е8Н.
1РС: контроли в ходе очистки.
ГЕЕ: изоэлектрическое фокусирование.
РЕ8: полиэфирсульфон.
- 2 011673
ЯР-НРЬС: высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой.
О РР: анионный обмен на О-Зерйагозе РР.
ЯТ: комнатная температура.
ИР: ультрафильтрация.
^И: вода для инъекций.
Подробное описание изобретения
Изобретение предоставляет способ очистки рекомбинантного Р8Н человека или варианта рекомбинантного Р8Н, начиная с жидкости, содержащей неочищенный Р8Н, включающий стадии:
(1) аффинной хроматографии с красителем;
(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия и (3) хроматографии с обращенной фазой; которые можно проводить в любом порядке.
Способ очистки по настоящему изобретению дает основное количество Р8Н высокой чистоты, которое можно затем включить в состав готового к применению лекарственного средства, например СоиаГР (8етоио). Он имеет преимущество получения высокой степени чистоты без использования иммуноаффинной хроматографии. Неочищенный Р8Н, который образует исходный материал для очистки в соответствии с настоящим изобретением, состоит из сборов клеточных культур, содержащих рекомбинантный Р8Н.
В предпочтительном варианте осуществления антиоксидант или свободная аминокислота или дипептид с антиоксидантным и акцепторным эффектом включается на некоторых или на всех стадиях способа очистки в соответствии с настоящим изобретением. Точнее, антиоксидант присутствует в любом из буферов, используемых для очистки, и/или концентрирования, и/или фильтрации т-йРЗН. Антиоксидант предотвращает окисление Р8Н во время обработки. Предпочтительным антиоксидантом является Ь-метионин. Предпочтительно Ь-метионин используется в концентрации, равной или примерно 10-100 мМ. Другие примеры антиоксиданта включают трет-бутил-4-метоксифенол, 2,6-бис-(1,1-диметилэтил)-4-метилфенол; бимета-бисульфит калия или натрия, бисульфит натрия. Примерами свободной аминокислоты и дипептида с антиоксидантным и акцепторным эффектом являются гистидин, таурин, глицин, аланин, карнозин, ансерин, 1-метилгистидин или их комбинации.
Обычно исходный материал сначала очищается, а затем необязательно концентрируется (например, использованием ультрафильтрации) и/или производится замена буфера (например, посредством стадии диафильтрации) перед захватом на первой хроматографической стадии.
На стадиях хроматографии можно использовать смолы на основе полимеров и на основе агарозы. Можно также использовать мембранную хроматографию, при которой смола заменяется функционализированной мембраной.
Стадии очистки по настоящему изобретению (т. е. аффинная хроматография с красителем, хроматография гидрофобного взаимодействия, хроматография с обращенной фазой) более детально описаны ниже.
Аффинная хроматография с красителем, стадия (1).
Способ по изобретению включает стадию аффинной хроматографии с красителем (1). В предпочтительном варианте осуществления стадию аффинной хроматографии с красителем осуществляют с использованием смолы, имеющей в качестве иммобилизованного лиганда красящее соединение, которое хорошо известно специалисту в данной области, т.е. Сайаегоп В1ие Р3С-А. Термин «иммобилизованный» хорошо понятен специалисту в данной области и означает, что лиганд дериватизирован в том смысле, что он химически связан со смолой. Особенно предпочтительной смолой является В1ие Зерйатозе РР (которую можно получить от Ашетзйаш Вюзаепеез 1пс.). Технические характеристики В1ие Зерйатозе РР следующие.
- 3 011673
Технические спецификации
| Лиганд | СгЬасгоп В1ие ГЗС-А |
| Способ соединения лиганда | Соединение триазина |
| Способность связывания | = 18 мг человеческого сывороточного альбумина/мл сушеного геля |
| Матрица | Высоко поперечно сшитая агароза, 6% |
| Предел исключения (Мг) | 4х106 |
| Диапазон размера частиц | 45-165 мкм |
| Линейная скорость потока* | = 750 см/ч |
| Плотность лиганда | = 7 мкмоль СгЬасгоп В1ие/мл среды |
| Стабильность рН | 4-12 (длительная). 3-13 (кратковременная) |
| Химическая устойчивость | 40°С в течение 7 дней в: 70% этаноле, 6 М гаунидина гидрохлорида, 8 М мочевины |
Понятно, что способ можно выполнить с другими смолами, имеющими аналогичные характеристики. Примеры альтернативных смол включают Тоуореаг1 АТ-Ыие-НС-650М (Токой Вюкаепсе), Тоуореаг1 8ирегВи1у1 550, Тоуореаг1 Рйепу1 650, В1ие СеШНги В1дВеаб (81егодеие), 8^е11Се1 В1ие (Р1егсе), С1Ыасйгоше Ы1ие ЗСА-адагоке 100 (81дта), АГй-Се1 В1ие (ВюКаб), Есопо-Рас Ы1ие саПпбдек (Вю-Каб), В1ие керйагоке НР (Атегкйат), СЫасгоп В1ие ЗСА (81§та).
Элюирование на стадии аффинной хроматографии с иммобилизованным красителем следует предпочтительно проводить с использованием буфера фосфата, особенно предпочтительно фосфата натрия. рН элюента должен предпочтительно составлять от 6,0, или примерно 6,0, до 11,5, или примерно 11,5, предпочтительнее от 6,5, или примерно 6,5, до 8, или примерно 8, особенно предпочтительно 7,0, или примерно 7,0. Альтернативные буферы, подходящие для поддержания рН 7,0, включают следующие: МЕ8, В|5-Тп5. ΛΌΛ. Р1РЕ8, АСЕ8, ВЕ8, МОР8, ТЕ8, НЕРЕ8. Элюционный буфер для стадии аффинной хроматографии с красителем должен предпочтительно содержать соль для увеличения проводимости, предпочтительно №101.
В особенно предпочтительном варианте осуществления буферы, контактирующие с продуктом для стадии аффинной хроматографии с красителем (уравновешивание, промывка и элюирование) содержат антиоксидант, такой как Ь-метионин. Другие примеры антиоксиданта включают трет-бутил-4метоксифенол, 2,6-бис-(1,1-диметилзтил)-4-метилфенол; бимета-бисульфит калия или натрия, бисульфит натрия.
Хроматография гидрофобного взаимодействия, стадия (2).
Способ также включает стадию хроматографии гидрофобного взаимодействия (2). В предпочтительном варианте осуществления хроматографию гидрофобного взаимодействия проводят с такой смолой, как Тоуореаг1 Ви1у1 650М (которую можно получить от Токой Вюкер 1пс.).
Понятно, что стадию (2) можно выполнять, используя альтернативные смолы, имеющие аналогичные характеристики. Альтернативные смолы, которые можно использовать, следующие: Рйепу1 8ерйагоке 6 Еак! В1о\\' (1о\г киЫ); Рйепу1 8ерйагоке 6 Еак! В1о\\' (й1дй киЫ); Ви1у1 8ерйагоке 4 Еак! В1о\у; Ос1у1 8ерйагоке 4 Еак! В1о\у; Рйепу1 8ерйагоке Н1дй РегГогтапсе; 8ОИКСЕ 15ЕТН; 8ОИКСЕ 1518О; 8ОИКСЕ 15РНЕ - все от Атегкйат Вюкаепсек (800) 526-3593; (см. \у\у\г.атег8ЙатЫю8с1епсе8.сот). Другие смолы представляют собой Нубгосе11 СЗ или С4; Нубгосе11 Рйепу1 от ВюСйгош ЬаЫк 1пс. (812) 234-2558; (см. \\л\лг.Ыюсйгот. сот).
Связывание на смоле Н1С достигается в буфере с высокой проводимостью, полученной посредством добавления соли (например, ЫаС1, (ХН4)28О4 или Ыа28О4). Элюирование на стадии хроматографии гидрофобного взаимодействия предпочтительно проводится уменьшением проводимости подвижной фазы (уменьшение концентрации соли), используя буфер, имеющий рН от 6,0, или примерно 6,0, до 8,0, или примерно 8,0, предпочтительнее от 6,5, или примерно 6,5, до 7,5, или примерно 7,5, наиболее предпочтительно 7,0 или примерно 7,0). Особенно предпочтительная система включает в себя фосфат натрия для забуферивания предпочтительно при рН 7,0, или примерно 7,0, и сульфат аммония. Альтернативные буферы указаны выше.
В особенно предпочтительном варианте осуществления контактирующие с продуктом буферы для стадии (2) Н1С (уравновешивание, промывка, элюирование) содержат антиоксидант, такой как Ь-метионин. Альтернативные антиоксиданты указаны выше.
- 4 011673
Хроматография с обращенной фазой, стадия (3).
Способ по изобретению также включает стадию хроматографии с обращенной фазой (ЯРС) (3). РЯС предпочтительно проводят, используя такую смолу, как 8ОЦЯСЕ 30 ЯРС (которую можно получить Атегайат Вюкаепсек). Понятно, что стадию (3) можно выполнять, используя альтернативные смолы, которые хорошо известны специалисту в данной области и которые имеют аналогичные характеристики.
Хроматографию предпочтительно проводят, используя забуферивание подвижной фазы при слегка щелочном рН, например при рН 7,0-8,5, или примерно 7,0-8,5, предпочтительнее при 7,5-7,6, или примерно 7,5-7,6. В предпочтительном варианте осуществления забуферивающий вид представляет собой ацетат аммония. Альтернативные буферы, подходящие для рН 7,6, или примерно 7,6, включают в себя ВЕ8, МОР8, фосфат, ΊΈ8, НЕРЕ8. Буферные растворы, используемые для этой стадии, могут также содержать органический модификатор, концентрация которого модулируется для различных фаз стадии хроматографии (загрузка, промывание, элюирование и регенерация). В предпочтительном варианте осуществления органический модификатор представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель, предпочтительно спирт (такой как метанол, этанол и т.д.), наиболее предпочтительно 2-пропанол (изопропанол).
В особенно предпочтительном варианте осуществления буферы, содержащие продукт, для стадии ЯРС (уравновешивание, промывка, элюирование) содержат антиоксидант, такой как Ь-метионин. Альтернативные антиоксиданты указаны выше.
Необязательная дополнительная стадия очистки 0 - ионообменная хроматография.
В дополнение к трем основным стадиям очистки, указанным выше, настоящее изобретение может включать дополнительные стадии очистки.
В одном варианте осуществления способ очистки по изобретению включает предварительную стадию ионообменной хроматографии (0), проводимую предпочтительно с сильной анионообменной смолой, особенно предпочтительно смолой четвертичного аммония, такой как О-8ер11аго5С ЕЕ (которую можно получить от Лтегайат Вюкаепсек), имеющей следующие характеристики:
Тип ионообменника:
Сильный анион
Общая емкость (моль/мл):
Предел исключения (глобулярные белки):
Форма шариков:
Структура шариков:
Функциональная стабильность рН
0,18-0,25
4х106
Сферическая, диметр 45-165 мкм
Поперечно сшитая агароза, 6%
2-12
Меняющаяся стабильность рН
Линейная скорость потока при 2 5°С
Слой высотой 15 см, колонка ХК 50/30:
1-14 бар
400-700 см/ч
Альтернативно, ионообменную хроматографию стадии (0) можно проводить, используя такую смолу, как Етас1оде1 ЕМО ТМАЕ Н1САР (которую можно получить от Мегск КСаА, Эагтхгай! Сеттапу), или смолу, имеющую аналогичные характеристики, см. ниже.
- 5 011673
| Подтверждение | ГгасТоде! ЕМП ТМАЕ |
| Каталожный № | 1,16887 |
| Размер частиц 3-типа | 20-40 мкм |
| Тип хроматографии | Ионообменная хроматография |
| Функциональная группа | Группа триметиламинометила (тип 0) |
| Структура мономера | СН2=СН-СОЦН- (СН2) гН+ (СН3) 3 |
| Способность связывать белок | 120 мг ВЗА/мл геля |
| Диапазон устойчивости рН | рН от 2 до рН 12 |
| Величина рК | >13 |
| Условия элюирования | Высокие концентрации соли |
| Предел давления (слой: 150x10 мм) | 20 бар (падение давления по колонне) |
| Рабочая температура | От 4°С до комнатной температуры |
| Консервант | 20% этанол |
| Кассета, готовая к применению | 50-10 мм |
| Основанное количество материала типа 5 | 100 мл; 500 мл |
| Скорость линейного потока | 1,27-6,35 см/мин |
Стадию ионообменной хроматографии предпочтительно проводят, используя буфер, имеющий слегка щелочной рН (например, от 7,2, или примерно 7,2, до 9,0, или примерно 9,0, или от 8,0, или примерно 8,0, до 9,0, или примерно 9,0, наиболее предпочтительно 8,5, или примерно 8,5). Подходящие буферы включают, например, боратные буферы, триэтаноламин/аминоуксусную кислоту Тпб. ацетат аммония, трицин, бицин, ТЕ8. НЕРЕ8, ТАР8. Наиболее предпочтительным является боратный буфер при рН 8,5, или примерно 8,5. Элюирование из ионообменной смолы достигается увеличением проводимости подвижной фазы посредством добавления соли, предпочтительно №1С1. В особенно предпочтительном варианте осуществления содержащие продукт буферы для ионообменной хроматографии (уравновешивание, промывка, элюирование) содержат антиоксидант, предпочтительно Ь-метионин. Альтернативные антиоксиданты указаны выше.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению включает в себя следующие стадии:
(0) анионообменная хроматография предпочтительно на сильной анионообменной смоле (предпочтительно на смоле четвертичного аммония, такой как О-8ерНаго5е или Ртас1оде1 ΕΜΌ ТМАЕ);
(1) аффинная хроматография с красителем (предпочтительно на В1ие 8ерйато5е РР);
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (предпочтительно на Тоуореаг1 Ви1у1 650Μ);
(3) хроматография с обращенной фазой (предпочтительно на 8оитсе 30 КРС).
Необязательная дополнительная стадия очистки (-1) - ультрафильтрация/диафильтрация.
Перед стадией ионообменной хроматографии (0) может быть желательно проведение стадии ультрафильтрации для концентрирования неочищенного Р8Н. Ультрафильтрация (или диафильтрация) предпочтительно проводится с использованием мембраны, имеющей отсечку на уровне 3-10 кДа, или примерно 3-10 кДа, наиболее предпочтительно на уровне 8 кДа, или примерно 8 кДа.
Необязательная дополнительная стадия очистки (4) - анионообменная хроматография.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению также включает вторую стадию анионообменной хроматографии (4). Предпочтительная смола представляет собой Ртас1оде1 ΕΜΌ ТМАЕ Н1САР (которую можно получить от Мегск КСаЛ, ЭагтУабЕ Сеттаиу) или смола, имеющая аналогичные характеристики, как указано выше. Альтернативно, вторую стадию анионообменной хроматографии можно проводить на О-8ер11аго5е РР или другой смоле, имеющей аналогичные характеристики, как указано выше.
- 6 011673
Стадии анионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с красителем, хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С), хроматографии с обращенной фазой и вторую стадию анионообменной хроматографии можно проводить в любом порядке, хотя предпочтительно первой проводить стадию анионообменной хроматографии. Остающиеся стадии аффинной хроматографии с красителем, хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С), КРС и необязательной анионообменной хроматографии можно проводить в любом порядке, хотя предпочтительно следовать порядку, указанному ниже:
(0) анионообменная хроматография;
(1) аффинная хроматография с красителем;
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С);
(3) хроматография с обращенной фазой (КРС) и (4) вторая анионообменная хроматография.
Необязательная дополнительная стадия очистки (5) - ультрафильтрация/диафильтрация.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления после любой из стадий хроматографии (в частности, после стадии хроматографии с обращенной фазой) образец Р8Н подвергают стадии концентрирования. Предпочтительно эту стадию выполняют, используя ультрафильтрацию в комбинации с диафильтрацией для получения основного количества продукта, имеющего желательный состав. Ультрафильтрацию (или диафильтрацию) предпочтительно проводят, используя мембрану, имеющую отсечку на уровне 3-10 кДа, или примерно 3-10 кДа, наиболее предпочтительно на уровне 5 кДа, или примерно 5 кДа.
В особенно предпочтительном варианте осуществления стадии проводят в следующем порядке:
(-1) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку на уровне 8 кДа, или примерно 8 кДа);
(0) анионообменная хроматография (предпочтительно с использованием колонки О-8срНаго5С РР);
(1) аффинная хроматография с красителем (предпочтительно с использованием колонки В1ие 8срНаго5С РР);
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С) (предпочтительно с использованием колонки Ви1у1 650М);
(3) хроматография с обращенной фазой (КРС) (предпочтительно с использованием колонки 8оигее 30 КРС);
(4) анионообменная хроматография на сильно основной анионообменной смоле (предпочтительно с использованием смолы ТМАЕ Шеар) и (5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку 5 кДа).
Может быть желательно подвергнуть образец Р8Н стадии нанофильтрации, в частности в качестве стадии очистки от вирусов, т.е. для снижения риска загрязнения препарата Р8Н вирусами или подобными вирусам частицами, происходящими из клеточной культуры. Нанофильтрацию можно проводить на любой стадии процесса очистки, однако особенно предпочтительно проводить нанофильтрацию после 2-й стадии ионообменной хроматографии, или после хроматографии с обращенной фазой, или после хроматографии гидрофобного взаимодействия. Нанофильтрацию можно выполнять более одного раза, например ее можно выполнять дважды.
В особенно предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает следующие стадии:
(-1) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку на уровне 8 кДа, или примерно 8 кДа);
(0) анионообменная хроматография (предпочтительно с использованием колонки О-8ерНаго5С РР);
(1) аффинная хроматография с красителем (предпочтительно с использованием колонки В1ис 8ер11аго5С РР);
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С) (предпочтительно с использованием колонки Ви1у1 650М);
(3) хроматография с обращенной фазой (КРС) (предпочтительно с использованием колонки 8оигее 30 КРС);
(4) анионообменная хроматография на сильно основной анионообменной смоле (предпочтительно с использованием смолы ТМАЕ Шеар);
(4') нанофильтрация;
(5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку 5 кДа).
Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что способ очистки лишен дорогостоящей стадии иммуно-аффинной хроматографии и обеспечивает каким-то образом высокую степень чистоты Р8Н и удельной биологической активности. Очищенный Р8Н по настоящему изобретению также не содержит нежелательных примесей, привносимых иммуно-аффинной хроматографией (например, иммуноглобулинов, выщелачиваемых из смолы).
- 7 011673
Хранение/Лиофоилизация.
Жидкую композицию, полученную в результате описанного выше способа очистки и содержащую очищенный Е8Н. можно заморозить для хранения в том виде, как она есть, или после очистки элюат можно подвергнуть лиофилизации («сушке замораживанием») для удаления растворителя. Полученный жидкий или лиофилизированный продукт называется «основная масса Е8Н».
Препаративные формы Е8Н.
Е8Н, или вариант Е8Н по изобретению, или очищенные в соответствии со способом по изобретению можно включить в препаративную форму для инъекций: внутримышечных или подкожных, предпочтительно подкожных. Препаративную форму Е8Н можно лиофилизировать, и в этом случае ее растворяют в воде для инъекций перед инъекцией. Препаративная форма Е8Н может также представлять собой жидкую препаративную форму, и в этом случае ее можно инъецировать непосредственно, без предварительного растворения.
Препаративная форма Е8Н может представлять собой одну дозу или множество доз. Если она представляет собой множество доз, она должна предпочтительно содержать бактериостатическое средство, такое как, например, бензиловый спирт, метакрезол, тимол или фенол, предпочтительно бензиловый спирт или метакрезол. Однодозовые препаративные формы могут также включать бактериостатическое средство.
Е8Н по изобретению может быть включен в препаративную форму с известными наполнителями и стабилизаторами, например сахарозой или маннитом. Она может также включать антиоксидант, такой как метионин. Она может, кроме того, включать поверхностно-активное вещество, такое как ΤνΕΕΝ (предпочтительно ΤνΕΕΝ 20) или Р1игошс (предпочтительно, Р1игошс Е68).
В особенно предпочтительной препаративной форме Е8Н, полученный способом по изобретению, включается в препаративную форму растворением его в воде для инъекций с сахарозой, фосфатным буфером (рН 7), Р1игошс Е68, метионином и метакрезолом или бензиловым спиртом.
Особенно предпочтительная жидкая многодозовая препаративная форма рекомбинантного Е8Н для подкожной или внутримышечной инъекции следующая.
Компоненты многодозовых жидких препаративных форм Е8Н
| Компонент № | Описание | 300 ΙΟ ΓΞΗ | 450 Ю ГЗН | 900 ΙΟ Г5Н |
| 1 | гНЕЗН (мкг/кассету) | 22,2 (305 10) | 33,3 (458 10) | 66,7 (916 10) |
| 2 | Сахароза (мг/кассету) | 30,0 | 45,0 | 90,0 |
| 3 | НаН2Р04.Н20 (мг/кассету) | 0,225 | 0,337 | 0, 675 |
| 4 | Νβ2ΗΡθ4.2ΗζΟ (мг/кассету) | 0,555 | 0,832 | 1, 665 |
| 5 | Р1игоп1с Е68 (мг/флакончик) | 0,050 | 0,075 | 0, 150 |
| 6 | Метионин (мг/флакончик) | 0,050 | 0,075 | 0,150 |
| 7 | м-крезол (мг/флакончик) | 1, 50 | 2,25 | 4,50 |
| 8 | рН | 7,0 | 7,0 | 7,0 |
| 9 | ИГ1 | сколько требуется до 0,5 мл | сколько требуется до 0,75 мл | сколько требуется до 1,5 мл |
Показания.
Е8Н по изобретению подходит для применения при всех видах лечения, для которых показан Е8Н. Он особенно подходит для подкожного введения при индукции овуляции, регулируемой гиперстимуляции яичников для вспомогательных репродуктивных технологий и при лечении олигоспермии. Его можно применять в сочетании с другими гонадотропинами, такими как ЬН и 11СС. Его можно также применять с другими соединениями, которые усиливают реакцию на Е8Н, такие как кломифен цитрат, ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол, летрозол, фадрозол и ΥΜ-511.
- 8 011673
Последовательности
ЗЕ<2 Ю N0:1: α-субъединица гликопротеина человека;
ЗЕ<2 Ю N0:2: α-субъединица ИЕЗН;
ЗЕО 10 N0:3: вариант
ЗЕС Ю N0:4: вариант
5Е0 Ю N0:5: вариант β-субъединицы НГЗН β-субъединицы НГЗН β-субъединицы НГЗН
Фолликулостимулирующий гормон, или Е8Н, используемый здесь, относится к Е8Н человека (НЕ8Н), получаемому в виде зрелого белка полной длины. Е8Н представляет собой димер, состоящий из α-субъединицы гликопротеина человека и β-субъединицы Е8Н человека. Белковая последовательность α-субъединицы гликопротеина человека представлена в 8Е0 ГО N0:1, а белковая последовательность β-субъединицы Е8Н человека приведена в 8Е0 ГО N0:2. Использование термина «рекомбинантный» относится к препаратам Е8Н, которые получают посредством использования технологии рекомбинантной ДНК (см., например, \¥0 85/01958). Один пример способа экспрессии Е8Н с использованием рекомбинантной технологии заключается в трансфекции эукариотических клеток последовательностями ДНК, кодирующими α- и β-субъединицы Е8Н, предоставленные на одном векторе или на двух векторах, причем каждая субъединица имеет отдельный промотор, как описано в европейских патентах № ЕР 0211894 и ЕР 0487512. ДНК, кодирующая Е8Н, может представлять собой кДНК или она может содержать интроны. Другой пример использования рекомбинантной технологии для получения Е8Н является использование гомологичной рекомбинации для вставки гетерологичного регуляторного сегмента в функциональной связи с эндогенными последовательностями, кодирующими одну или обе из субъединиц Е8Н, как описано в европейском патенте № ЕР 0505500 (АррНеб КехеагсН 8ух!етх АК8 Но1бшд Νν). Предусмотрены также способы, такие как способы, описанные в \У0 99/57263 (ТтаихкатуоНс ТНетар1ех), где одна из субъединиц вставляется гетерологично в клетку, а другая субъединица экспрессируется активацией геномных последовательностей вставкой гетерологичного регуляторного сегмента гомологичной рекомбинацией. Способ по изобретению можно использовать для очистки Е8Н, экспрессируемого с использованием любого из этих способов и других способов.
Выражение «рекомбинантная клетка» относится к клетке, получаемой вставкой гетерологичной ДНК, включая любой из указанных выше способов генетической манипуляции.
Предпочтительно Е8Н получают рекомбинантно в клетках яичников китайских хомячков (СНО), трансфецированных вектором или векторами, включающими ДНК, кодирующую α-субъединицу гликопротеина человека и β-субъединицу Е8Н. ДНК, кодирующая α- и β-субъединицы, может присутствовать на одном и том же или различных векторах.
Выражение «вариант Е8Н» предназначено для охвата тех молекул, которые отличаются по аминокислотной последовательности, типом гликозилирования или связью между субъединицами из Е8Н человека, но проявляют активность Е8Н. Примеры включают СТР-Е8Н, длительно действующий модифицированный рекомбинантный Е8Н, состоящий из α-субъединицы дикого типа и гибридной β-субъединицы, в которой карбоксиконцевой белок был слит с С-концевым пептидом β-субъединицы Е8Н, как описано в публикациях (ЬаРо11 е! а1.; Еибоспио1оду; 1992, 131, 2514-2520 или К1еш е! а1.; Эеуе1ортеи! апб с11агас1епхаОоп о! а 1оид-ас!шд гесотЬшаи! НЕ8Н адошх!; Нитаи Кергоб. 2003, 18, 50-56). Включен также одноцепочечный СТР-Е8Н, одноцепочечная молекула, состоящая из следующих последовательностей (от Ν-концевой к С-концевой):
| βΓ3Η | рЬСС-СТР(113-145) | агзн |
где βΕ8Н обозначает β-субъединицу Е8Н, β^Ο-ΟΓΡ (113-145) обозначает карбоксиконцевой пептид НСС и аЕ8Н обозначает α-субъединицу Е8Н, как описано в публикации РНаттасокшейсх аиб рНагтасобуиаткх о! хшд1е-сНат гесотЫиаи! Нитаи ЕоШс1е-хНти1а!тд Ногтоие сои1ашшд !Не Нитаи сНопошс доиабо!горНш сатЬоху!егтша1 рерйбе ш !Не гНехих тоикеу, ЕейНйу & 8!егбйу; 2002, 77, 1248-1255.
Другие примеры вариантов Е8Н включают молекулы Е8Н, имеющие дополнительные сайты гликозилирования, включенные в α- и/или β-субъединицу, как раскрыто в \У0 01/58493 (Махудеи), и молекулы Е8Н со связями 8-8 между субъединицами, как описано в \У0 98/58957. Другие примеры вариантов Е8Н включают химерные молекулы, включающие последовательности из Е8Н и последовательности из НСО или ЬН, такие как последовательности, описанные в \У0 91/16922 и \У0 92/22568.
Указанные здесь варианты Е8Н также включают карбоксиконцевые делеции β-субъединицы, которая короче, чем зрелый белок полной длины 8Е0 ГО N0:2. Карбоксиконцевые делеции человеческой β-субъединицы представлены в 8Е0 ГО N08:3, 4 и 5. Понятно, что карбоксиконцевые варианты β-цепи образуют комплекс с известной α-субъединицей для образования гетеродимера варианта Е8Н.
В предпочтительном варианте осуществления Е8Н получают рекомбинантно в клетках СНО, или в сыворотке, или в бессывороточной среде.
- 9 011673
В предпочтительном варианте осуществления очищенный Р8Н, полученный в соответствии со способом по изобретению, подходит для подкожного введения, обеспечивая возможность самостоятельного введения пациентом.
Выражение «неочищенный рекомбинантный Р8Н» относится к надосадочной жидкости клеточной культуры из рекомбинантных клеток, экспрессирующих Р8Н, перед тем как он был подвергнут любой хроматографической стадии. Это выражение охватывает сырую форму надосадочной жидкости (выделенную из клеток), а также концентрированную, и/или отфильтрованную, и/или ультрафильтрованную надосадочную жидкость.
Термин «биологическая активность» в отношении активности Р8Н относится к способности препаративной формы Р8Н вызвать биологические реакции, связанные с Р8Н, такие как увеличение массы яичников при анализе 81еетаи-РоЫеу (Аккау οί 1йе ГоШе1е 8йти1айид йогтоие Ьакеб оп 1йе аидтеШайои \νί11ι йитаи сйопошс доиабойорйт; Епбосппо1оду; 1953, 53, 604-616), или рост фолликулов у пациентки. Фолликулярный рост у пациентки можно оценить ультразвуком, например с точки зрения ряда фолликулов, имеющих средний диаметр на уровне примерно 16 мм на 8-й день стимуляции. Биологическую активность оценивают в отношении принятых стандартов для Р8Н.
Содержание ЬН в препарате Р8Н можно измерить, например, используя ЬН-специфический иммуноанализ, такой как ЭеШа йЬН 8рес (\Уа11ас Оу, Тигки, Р1и1аиб).
Термин «удельная активность» в отношении Р8Н означает биологическую активность в МЕ препарата в признанном биологическом анализе Р8Н, таком как биологический анализ 81ее1таи Рой1еу [деленную на количество белка, по данным определения анализом общего содержания белка, таким как анализ Лоури (О.Н. Ьотету, N.1. ВокеЬтоидй, Л.Ь. Рагг аиб ВЛ. Ваиба11 (1951), 1. Вю1. Сйет. 193: 265; Найтее Е.Е. (1972). Аиа1. Вюсйет. 48: 422; 1. В. ЭиПеу аиб Р.А. Снеге (1975), Аиа1. Вюсйет. 64: 136), анализ ВгабГогб (ВгабГогб, М.М. (1976), Аиа1. Вюсйет. 72, 248)], спектральная поглощательная способность 280 нм.
Предпочтительно Р8Н, полученный по изобретению, имеет удельную активность более чем 8000 МЕ/мг, или примерно 8000 МЕ/мг, предпочтительнее больше чем 9000 МЕ/мг, или примерно 9000 МЕ/мг, еще предпочтительнее более чем 10000 МЕ/мг, или примерно 10000 МЕ/мг, еще предпочтительнее 14000 МЕ/мг, или примерно 14000 МЕ/мг, где биологическую активность измеряют биологическим анализом 81ее1таи Рой1еу, а содержание белка измеряют 8Е-НРЬС (субстратно-ферментной ВЭЖХ).
Образцы Р8Н можно анализировать в отношении их чистоты на различных стадиях процедуры, используя, например, такие методики, как методики, перечисленные ниже.
Количественный анализ т-йР8Н/свободная α-субъединица/чистота/окисленные формы: ВР-НРЬС.
Как указано выше, Р8Н представляет собой гетеродимерный гликопротеин, составленный из α- и β-субъединицы. Может происходить некоторая диссоциация субъединиц и это можно контролировать определением количества свободной α-субъединицы, присутствующей в образце. Кроме того, субъединицы Р8Н могут стать окисленными. Окисленные примеси можно количественно определить, используя ВР-НРЬС, в то время как свободные субъединицы можно оценить, используя δΌδ-РАОЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).
Количественное определение т-йР8Н: иммуноанализ.
Содержание Р8Н в образце можно определить, используя иммуноанализ, специфичный для Р8Н, такой как иммуноанализ Р8Н ЭЕЬРМ.
Общий белок: анализ ВгабГогб, анализ Лоури, спектральная поглощательная способность при 280 нм.
Как и в отношении любого белкового препарата, общее содержание белка можно определить, используя такие методики, как анализ ВгабГогб, анализ Лоури, спектральная поглощательная способность при 280 нм.
Тип изоформ: 1ЕР.
Как указано выше, Р8Н представляет собой гликопротеин, имеющий множественные олигосахаридные остатки, присоединенные в различных местах на обеих субъединицах. Олигосахаридные остатки могут иметь различные степени разветвления и могут быть перекрыты остатками сиаловой кислоты. Остатки сиаловой кислоты отрицательно заряжены (при нейтральном рН). Различия перекрытия ведут к неоднородности, причем смесь видов имеет различные изоэлектрические точки (р1). Это можно оценить, используя методику, которая разделяет на основании заряда, такую как изоэлектрическое фокусирование (1ЕР).
Белок клетки-хозяина (НСР).
Белок клетки-хозяина можно анализировать, используя анализ ЕЫ8А. Например, антитела могут вырабатываться к «культуре-пародии», которая представляет собой культуру клеток-хозяев без гена Р8Н.
- 10 011673
Примеры
Теперь настоящее изобретение будет проиллюстрировано посредством двух примеров.
Соответствующие блок-диаграммы, иллюстрирующие указанные 2 примера, представлены на фиг. 1 и 2. Полученный г-йЕЗН называется «основная масса г-йЕЗН».
Пример 1 (см. фиг. 1).
Стадия (1). Аффинная хроматография с красителем на синей сефарозе.
Исходный материал ЕЗН для очистки получают из сборов клеточных культур, содержащих рекомбинантный ЕЗН, т.е. ЕЗН, который был получен рекомбинантно в клетках СНО, или в сыворотке, или в бессывороточной среде. Колонку для аффинной хроматографии с красителем (смола В1ие Зерйагоке ЕЕ) сначала уравновешивают буфером с низкой электропроводностью при рН 8,5, содержащим Ь-метионин. Затем жидкость, содержащую Е8Н, наносят непосредственно на смолу. После загрузки несвязанный материал вымывают, используя уравновешивающий буфер. Наконец, Е8Н элюируют промыванием колонки буфером фосфата натрия при рН 7,0, содержащим №1С1 и Ь-метионин. Объединенный элюат непосредственно подвергают химической обработке на следующей стадии. Эту стадию проводят при 2-8°С.
Стадия (2). Хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С) на Тоуореаг1 Ви1у1 650М.
Элюат В1ие Зерйагоке ЕЕ со стадии (1) загружают на колонку Тоуореаг1 Ви1у1 650М против буфера фосфата натрия, рН 7,0 содержащего сульфат аммония и Ь-метионин. Несвязанный материал вымывают уравновешивающим буфером. Е8Н элюируют тем же буфером, но со сниженной концентрацией сульфата аммония. Элюат перерабатывают на следующей стадии. Стадию проводят при комнатной температуре.
Стадия (3). Обращенная фаза на колонке 8оитсе 30 КРС.
Элюат Н1С (со стадии (2)) сначала кондиционируют добавлением 1РА (изопропанол). Колонку 8оитсе 30 КРС уравновешивают против буфера ацетата аммония, рН 7,6, содержащим Ь-метионин и 2-пропанол в концентрации, эквивалентной концентрации кондиционированного загрузочного материала. После вымывания несвязанный материал с уравновешивающим буфером смолу промывают буфером ацетата аммония, рН 7,6, содержащим Ь-метионин и повышенную концентрацию 2-пропанола. Е8Н окончательно элюируют дальнейшим увеличением концентрации 2-пропанола. Объединенный элюат в конечном счете разбавляют при перемешивании водой, содержащей Ь-метионин. Разведенный объединенный элюат перерабатывают на следующей стадии. Стадию проводят при комнатной температуре.
После выполнения описанной выше процедуры фактор очистки, т.е. отношение чистоты Е8Н в очищенном образце к чистоте Е8Н в исходном материале (неочищенном Е8Н), составляет примерно 40,000.
Пример 2 (см. фиг. 2).
Стадия (-1). Ультрафильтрация/диафильтрация концентрированного Г-11Е8Н.
Все операции выполняют в условиях охлаждения (2-8°С). Неочищенный Е8Н, формирующий исходный материал для очистки, получен из сборов клеточных культур, содержащих рекомбинантный ЕЗН.
Осветление.
Неочищенный Г-11Е8Н фильтруют через фильтр глубиной 0,5 мкм (такой как фильтры Ра11 РтоШе II или его эквивалент).
Ультрафильтрация.
Осветленный неочищенный продукт сначала концентрируют ультрафильтрацией, используя полиэфирсульфоновую мембрану 10 кДа. Затем концентрированный удерживаемый материал диафильтруют против по меньшей мере 5 двойных объемов боратного буфера, рН 8,5, содержащего Ь-метионин в качестве антиоксиданта. Электропроводность и рН удерживаемого материала измеряют для контроля хода диафильтрации. Затем удерживаемый материал дополнительно концентрируют перед опорожнением системы. Блок ультрафильтрации в конечном счете промывают диафильтрационным буфером и промывную жидкость смешивают с извлеченным удерживаемым материалом. Объединенный раствор подвергают переработке на следующей стадии.
Фильтрация.
Концентрированный продукт фильтруют через полиэфирсульфоновый фильтр с размером пор 0,2 мкм (или его эквивалент).
Стадия (0). Анионный обмен на О-Зерйагоке ЕЕ.
Затем отфильтрованный материал наносят на прочную анионообменную (О-Зерйагоке ЕЕ) смолу, уравновешенную против буфера бората натрия, рН 8,5, содержащего Ь-метионин. После загрузки колонку промывают уравновешивающим буфером для вымывания всего несвязанного материала. Затем колонку элюируют буфером бората натрия, рН 8,5, содержащим №101 (для увеличения электропроводности) и Ь-метионин (в качестве антиоксиданта). Собранный объединенный элюат перерабатывают для аффинной хроматографии с красителем.
Стадия (1). Аффинная хроматография с красителем на синей сефарозе.
Колонку для аффинной хроматографии с красителем (смола В1ие Зерйагоке ЕЕ) сначала уравновешивают элюционным буфером со стадии О-Зерйагоке ЕЕ. Затем элюат захвата наносят непосредственно на смолу. После загрузки несвязанный материал вымывают, используя уравновешивающий буфер. Нако
- 11 011673 нец, Е8Н элюируют промыванием колонки буфером фосфата натрия при рН 7,0, содержащим ЫаС1 и Ь-метионин. Объединенный элюат непосредственно перерабатывают на следующей стадии. Эту стадию выполняют при 2-8°С.
Стадия (2). Хроматография гидрофобного взаимодействия на Тоуореаг1 Ви1у1 650М.
Элюат В1ие Зерйагояе ЕЕ загружают на колонку Тоуореаг1 Ви1у1 650М, уравновешенную против буфера фосфата натрия, рН 7,0, содержащего сульфат аммония и Ь-метионин. Несвязанный материал вымывают уравновешивающим буфером. Е8Н элюируют тем же буфером, но со сниженной концентрацией сульфата аммония. Элюат перерабатывают на следующей стадии. Эту стадию выполняют при комнатной температуре.
Стадия (3). Обращенная фаза на колонке 8оигсе 30КРС.
Элюат Н1С (со стадии (2)) сначала кондиционируют добавлением 1РА (изопропанола). Колонку 8оигсе 30КРС уравновешивают против буфера ацетата аммония, рН 7,6, содержащего Ь-метионин и 2-пропанол в концентрации, эквивалентной концентрации кондиционированного загрузочного материала. После вымывания несвязанного материала уравновешивающим буфером смолу промывают буфером ацетата аммония, рН 7,6, содержащим Ь-метионин и повышенную концентрацию 2-пропанола. Е8Н окончательно элюируют дальнейшим увеличением концентрации 2-пропанола. Объединенный элюат в конечном счете при перемешивании разбавляют водой, содержащей Ь-метионин. Разбавленный объединенный элюат перерабатывают на следующей стадии. Эту стадию выполняют при комнатной температуре.
Стадия (4). Анионообменная хроматография на колонке со смолой Егас1оде1 ΕΜΌ ТМАЕ Ысар.
Колонку со смолой Егас1оде1 ΕΜΌ ТМАЕ Ысар сначала уравновешивают буфером бората натрия, рН 8,5, содержащим Ь-метионин. Разбавленный материал после КРС со стадии (3) загружают на колонку. Несвязанный материал вымывают, используя уравновешивающий буфер. Е8Н элюируют из колонки, увеличивая концентрацию соли линейным образом. Эту стадию выполняют при 2-8°С.
Стадия (4'). Нанофильтрация.
Элюат со стадии (4) Егас1оде1 ЕМЭ ТМАЕ наносят непосредственно на устройство нано фильтрации 20 нм под давлением 3 бар в атмосфере азота. Фильтрат перерабатывают на следующей стадии. Эту операцию выполняют при 2-8°С.
Стадия (5). Ультрафильтрация основной массы продукта.
Подвергнутый нанофильтрации материал Е8Н концентрируют фильтрацией в тангенциальном потоке на полиэфирсульфоновой мембране 5 кДа. Когда удерживаемый материал достигает примерно половины исходного объема, материал обменивают буфером диафильтрацией против \УП.
Чистота образцов.
Определяют чистоту образцов Е8Н после стадий очистки.
- 12 011673
| Стадия очистки | Чистота |
| Стадия (-1): Ультрафильтрация/диафильтрация | 19% ЕЗН - ЕЗН, определенный КР-НРЬС - Общее содержание белка, определенное анализом Вгасйогб |
| Стадия (0): Анионный обмен на <2 ЗерИагозе ГЕ | 44% ЕЗН - ЕЗН, определенный КР-НРЬС - Общее содержание белка, определенное анализом Вгаб£огб |
| Стадия (1) Аффинная хроматография на синей сефарозе | 68% ЕЗН - ЕЗН, определенный КР-НРЬС - Общее содержание белка, определенное спектральной поглощательной способностью при 280 нм или примерно 420000 РСЗ - ЕЗН, определенный КР-НРЬС - Содержание белка в клеткехозяине, определенное ЕЫЗА |
| Стадия (2) : Хроматография гидрофобного взаимодействия на колонке Тоурреаг1 ВиЬу1 650М | Количество примесей: 3400 м.д. - ЕЗН, определенный КР-НРЬС - Содержание белка в клеткехозяине, определенное ЕЫЗА |
| Стадия (3} : Обращенная фаза на колонке Зоигсе 30 КРС | Количество примесей: 170 м.д. - ЕЗН, определенный КР-НРЬС - Содержание белка в клеткехозяине, определенное ЕЫЗА |
| Стадия (4) Анионообменная хроматография на колонке со смолой ЕгасЪоде1 ЕМЬ ТМАЕ Б1сар | Количество примесей: <80 м.д. - ЕЗН, определенный КР-НРЬС - Содержание белка в клеткехозяине, определенное ЕЫЗА |
Биологическая активность образцов.
Биологическую активность очищенного Г-НР8Н измеряют, используя способ прибавки массы яичников 81ее1тап-Рой1еу. Удельную активность рассчитывают, используя биологическую активность, деленную на содержание Р8Н по данным определения способом 8Е-НРБС, как описано ниже.
Удельная активность конечной основной массы полученного продукта составляет обычно от 10000 до 17000 МЕ/мг. Иллюстративные величины для 2 образцов конечной основной массы продукта, полученного в соответствии со способом примера 2, представлены ниже в таблице.
- 13 011673
Удельная активность основной массы очищенного г-йРЗН по изобретению
| Анализ | Образец 1 | Образец 2 |
| Концентрация белка, определенная ЗЕ-НРЬС (мг/мл) | 0, 61 | 0, 54 |
| Удельная активность (биологическая активность/ЗЕ-НРЬС) | 12600 МЕ/мг | 14600 МЕ/мг |
Claims (4)
- (1) подвергания элюата стадии (0) стадии аффинной хроматографии с красителем на В1ие 8срНаго5С ЕЕ и фосфате, №1С1. Ь-метионине при рН на уровне или примерно 7,0 в качестве элюента;(-1) ультрафильтрации;(0) анионообменной хроматографии на О-8срНаго5С ЕЕ с боратом/ЫаС1, Ь-метионином с рН на уровне или примерно 8,5 в качестве элюента;(1) аффинная хроматография с красителем;(1) аффинная хроматография с красителем;(1) аффинная хроматография с красителем;(1) аффинной хроматографии с красителем;1. Способ очистки рекомбинантного РЗН или варианта РЗН, включающий подвергание жидкости, содержащей РЗН:
- (2) подвергания элюата стадии (1) стадии хроматографии гидрофобного взаимодействия на Тоуареаг1 Ви1у 1 650М с фосфатом, сульфатом аммония, Ь-метионином при рН на уровне или примерно 7,0 в качестве элюента;(2) хроматография гидрофобного взаимодействия;(2) хроматография гидрофобного взаимодействия и затем (3) хроматография с обращенной фазой.13. Способ по пп.10, 11 или 12, где анионообменную хроматографию стадии (0) проводят со смолой О-Зерйагозе РР или смолой Ргас£оде1 ΕΜΌ ТМАЕ Н1Сар.14. Способ по любому из пп.10-13, где ионообменную хроматографию стадии (0) проводят, используя боратный буфер в качестве элюента.15. Способ по п.14, где боратный буфер имеет рН на уровне или примерно 8,5.16. Способ по любому из пп.10-15, дополнительно включающий вторую стадию анионообменной хроматографии - стадию (4).17. Способ по п.16, где вторую стадию анионообменной хроматографии стадии (4) проводят после стадий (1), (2) и (3).18. Способ по п.17, где стадии проводят в следующем порядке:(0) анионообменная хроматография;(2) хроматография гидрофобного взаимодействия и затем (3) хроматография с обращенной фазой.10. Способ по любому из пп.1-9, дополнительно включающий стадию анионообменной хроматографии - стадию (0).11. Способ по п.10, где стадию анионообменной хроматографии проводят перед стадиями (1), (2) и (3).12. Способ по п.11, где стадии проводят в следующем порядке:(0) анионообменная хроматография;2. Способ по п.1, где аффинную хроматографию с красителем стадии (1) проводят со смолой, имеющей иммобилизованный С1Ьасгоп В1ие Р3С-А.(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия и (3) хроматографии с обращенной фазой, которые можно проводить в любом порядке.
- (3) подвергания элюата стадии (2) стадии хроматографии с обращенной фазой на 8оигсе 30 ВРС с ацетатом аммония, Ь-метионином, с 2-пропанолом при рН на уровне или примерно 7,6 в качестве элюента;(4) подвергания элюата стадии (3) стадии анионообменной хроматографии на смоле Егас1оде1 ΕΜΌ ТМАЕ Н1Сар с боратом, Ь-метионином при рН на уровне или примерно 8,5 и ЫаС1;(3) хроматография с обращенной фазой и (4) анионообменная хроматография.19. Способ по любому из пп.16-18, где вторую стадию анионообменной хроматографии стадии (4) проводят, используя смолу Ргас£оде1 ΕΜΌ ТМАЕ Н1Сар или смолу О-Зерйагозе РР.- 14 01167320. Способ по пп.16-19, где вторую стадию анионообменной хроматографии стадии (4) проводят, используя боратный буфер и градиент возрастающей концентрации №1С1.21. Способ по любому из пп.16-20, включающий стадию нанофильтрации - стадию (4'), проводимую после второй стадии анионообменной хроматографии стадии (4).22. Способ по п.21, включающий стадию ультрафильтрации (5), после стадии нанофильтрации (4').23. Способ по любому из пп.1-22, где любой из элюентов и/или буферов может содержать антиоксидант, в частности Ь-метионин.24. Способ очистки человеческого рекомбинантного Е8Н, включающий стадии:3. Способ по п.1 или 2, где смола, используемая для аффинной хроматографии с красителем стадии (1), представляет собой В1ие Зерйагозе РР.4. Способ по любому из пп.1-3, где аффинную хроматографию с красителем стадии (1) проводят, используя буфер фосфата натрия при рН на уровне или примерно от 6,5 до 11,5 в качестве элюента.5. Способ по любому из пп.1-4, где хроматографию гидрофобного взаимодействия (Н1С) стадии (2) проводят, используя Тоуареаг1 Ви1у1 650М или смолу, имеющую аналогичные характеристики.6. Способ по любому из пп.1-5, где хроматографию гидрофобного взаимодействия (Н1С) стадии (2) проводят, используя фосфат натрия/сульфат аммония в качестве элюента.7. Способ по любому из пп.1-6, где стадию хроматографии с обращенной фазой стадии (3) проводят, используя Зоигсе 30 ЯРС в качестве смолы.8. Способ по любому из пп.1-7, где стадию хроматографии с обращенной фазой стадии (3) проводят, используя ацетат аммония с 2-пропанолом в качестве элюента.9. Способ по любому из пп.1-8, где стадии проводят в следующем порядке:
- (4') подвергания элюата стадии (4) стадии нанофильтрации и (5) подвергания фильтрата стадии (4) стадии ультрафильтрации.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP04105639 | 2004-11-09 | ||
| US62871704P | 2004-11-17 | 2004-11-17 | |
| PCT/EP2005/055815 WO2006051070A1 (en) | 2004-11-09 | 2005-11-08 | Method for purifying fsh |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200701040A1 EA200701040A1 (ru) | 2007-10-26 |
| EA011673B1 true EA011673B1 (ru) | 2009-04-28 |
Family
ID=39560952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200701040A EA011673B1 (ru) | 2004-11-09 | 2005-11-08 | Способ очистки fsh |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7741455B2 (ru) |
| EP (1) | EP1809663B1 (ru) |
| KR (1) | KR101173717B1 (ru) |
| CN (1) | CN101087805B (ru) |
| AT (1) | ATE408624T1 (ru) |
| AU (1) | AU2005303818B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0517973B8 (ru) |
| CA (1) | CA2579131A1 (ru) |
| CY (1) | CY1108602T1 (ru) |
| DE (1) | DE602005009856D1 (ru) |
| DK (1) | DK1809663T3 (ru) |
| EA (1) | EA011673B1 (ru) |
| ES (1) | ES2312037T3 (ru) |
| HK (1) | HK1108704A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20080464T3 (ru) |
| IL (1) | IL182716A (ru) |
| MX (1) | MX2007005327A (ru) |
| NO (1) | NO340811B1 (ru) |
| PL (1) | PL1809663T3 (ru) |
| PT (1) | PT1809663E (ru) |
| SI (1) | SI1809663T1 (ru) |
| WO (1) | WO2006051070A1 (ru) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7754860B2 (en) * | 2003-12-22 | 2010-07-13 | Ares Trading S.A. | Method for purifying FSH |
| PL1917276T3 (pl) | 2005-08-26 | 2018-08-31 | Ares Trading S.A. | Sposób wytwarzania glikozylowanego interferonu beta |
| JP5199112B2 (ja) * | 2005-12-09 | 2013-05-15 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | Ｆｓｈ又はｆｓｈ変異体を精製するための方法 |
| WO2008150488A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Methods and systems for quantification of peptides and other analytes |
| EA022993B1 (ru) | 2007-06-28 | 2016-04-29 | Рациофарм Гмбх | Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека (fsh) |
| WO2009053358A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Merck Serono S.A. | Method for purifying fc-fusion proteins |
| WO2009053360A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Merck Serono S.A. | Method for purifying an fc-containing protein |
| CN110433136A (zh) | 2008-02-08 | 2019-11-12 | 泰哈麦克斯总部英国有限公司 | 促卵泡激素的液体制剂 |
| JP2009273427A (ja) | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法 |
| NZ595661A (en) * | 2009-04-01 | 2013-07-26 | Method for purifying recombinant follicle stimulating hormone (fsh) | |
| CN101519445B (zh) * | 2009-04-08 | 2013-03-27 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高比活尿促卵泡刺激素及其制备方法 |
| CN101555279B (zh) * | 2009-05-19 | 2013-03-27 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度尿促卵泡刺激素及其制备方法 |
| CN101928342B (zh) * | 2009-06-18 | 2013-05-08 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途 |
| EP2325194A1 (en) * | 2009-11-24 | 2011-05-25 | Glycotope GmbH | Process for the purification of glycoproteins |
| JP2011172602A (ja) * | 2011-06-15 | 2011-09-08 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法 |
| CN103570820B (zh) * | 2012-08-06 | 2015-11-18 | 齐鲁制药有限公司 | 一种重组人促卵泡激素的纯化方法 |
| WO2014159813A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
| JP5750471B2 (ja) * | 2013-05-22 | 2015-07-22 | Ｊｃｒファーマ株式会社 | 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法 |
| CN103539861B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-02-18 | 广州联康生物科技有限公司 | 长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| CN103554269B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-02-11 | 广州联康生物科技有限公司 | 重组猪促卵泡激素融合蛋白 |
| CN103539860B (zh) * | 2013-11-01 | 2014-12-03 | 广州优联康医药科技有限公司 | 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| EP3131924A1 (en) | 2014-04-18 | 2017-02-22 | Cadila Healthcare Limited | Novel purification process of gonadotropin |
| CN104961821A (zh) * | 2014-07-28 | 2015-10-07 | 厦门欧瑞捷生物科技有限公司 | 一种从人尿中提取促性腺激素的方法 |
| WO2016116966A1 (en) * | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins |
| CN105461799A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-06 | 哈药集团技术中心 | 一种重组人促卵泡生成素的纯化方法 |
| CN107698676B (zh) * | 2017-11-07 | 2020-07-14 | 江西浩然生物医药有限公司 | 一种高纯度尿促性素的提取制备方法 |
| CN110563832A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-12-13 | 江苏璟泽生物医药有限公司 | 一种高纯度重组促卵泡刺激素纯化方法 |
| CN110305903B (zh) * | 2019-07-31 | 2021-10-01 | 江苏璟泽生物医药有限公司 | 重组人促卵泡激素及其制备方法 |
| CN113372433B (zh) * | 2021-03-12 | 2022-10-11 | 上海景泽生物技术有限公司 | 纯化fsh方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988010270A1 (en) * | 1987-06-26 | 1988-12-29 | Istituto Di Ricerca Cesare Serono Spa | Urinary follicle stimulating hormone |
| WO1996025496A1 (en) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT BOVINE FOLLICLE STIMULATING HORMONE (REC bFSH) IN THE BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM |
| WO1998020039A1 (en) * | 1996-11-07 | 1998-05-14 | Ibsa Institut Biochimique S.A. | Fsh and lh separation and purification process |
| WO2000063248A2 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Instituto Massone S.A. | Highly purified gonadotropin compositions and process for preparing them |
| EP1106623A1 (en) * | 1999-11-16 | 2001-06-13 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| WO2005063811A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-07-14 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5665868A (en) | 1990-09-14 | 1997-09-09 | Vittal Mallya Scientific Research Foundation | Chromatographic agent and its use for the separation or proteins, polypeptides of metals |
| SE9201073D0 (sv) * | 1992-04-03 | 1992-04-03 | Kabi Pharmacia Ab | Protein formulation |
| AUPN801296A0 (en) | 1996-02-12 | 1996-03-07 | Csl Limited | Stabilised growth hormone formulation and method of preparation thereof |
| US6162905A (en) * | 1996-11-07 | 2000-12-19 | Ibsa Institut Biochimique S.A. | FSH and LH separation and purification process |
| US5990288A (en) * | 1997-10-21 | 1999-11-23 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| DE60127100T2 (de) * | 2000-02-22 | 2007-06-28 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Gereinigtes recombinantes hlh mit spezifischer bioaktivität und verfahren zu dessen reinigung |
| CA2405701A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU784808B2 (en) * | 2001-04-02 | 2006-06-29 | Kedrion Melville Inc. | Prion and viral clearance process |
| US7598356B2 (en) | 2004-07-08 | 2009-10-06 | Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center | Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily |
-
2005
- 2005-11-08 CN CN2005800375919A patent/CN101087805B/zh active Active
- 2005-11-08 AU AU2005303818A patent/AU2005303818B2/en active Active
- 2005-11-08 DK DK05815953T patent/DK1809663T3/da active
- 2005-11-08 CA CA002579131A patent/CA2579131A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-08 SI SI200530407T patent/SI1809663T1/sl unknown
- 2005-11-08 BR BRPI0517973A patent/BRPI0517973B8/pt active IP Right Grant
- 2005-11-08 US US11/575,833 patent/US7741455B2/en active Active
- 2005-11-08 KR KR1020077007365A patent/KR101173717B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-08 EP EP05815953A patent/EP1809663B1/en active Active
- 2005-11-08 WO PCT/EP2005/055815 patent/WO2006051070A1/en active Application Filing
- 2005-11-08 ES ES05815953T patent/ES2312037T3/es active Active
- 2005-11-08 DE DE602005009856T patent/DE602005009856D1/de active Active
- 2005-11-08 PT PT05815953T patent/PT1809663E/pt unknown
- 2005-11-08 PL PL05815953T patent/PL1809663T3/pl unknown
- 2005-11-08 MX MX2007005327A patent/MX2007005327A/es active IP Right Grant
- 2005-11-08 EA EA200701040A patent/EA011673B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-11-08 AT AT05815953T patent/ATE408624T1/de active
-
2007
- 2007-04-22 IL IL182716A patent/IL182716A/en unknown
- 2007-06-05 NO NO20072863A patent/NO340811B1/no unknown
-
2008
- 2008-03-10 HK HK08102739.4A patent/HK1108704A1/xx unknown
- 2008-09-19 HR HR20080464T patent/HRP20080464T3/xx unknown
- 2008-11-27 CY CY20081101371T patent/CY1108602T1/el unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988010270A1 (en) * | 1987-06-26 | 1988-12-29 | Istituto Di Ricerca Cesare Serono Spa | Urinary follicle stimulating hormone |
| WO1996025496A1 (en) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT BOVINE FOLLICLE STIMULATING HORMONE (REC bFSH) IN THE BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM |
| WO1998020039A1 (en) * | 1996-11-07 | 1998-05-14 | Ibsa Institut Biochimique S.A. | Fsh and lh separation and purification process |
| WO2000063248A2 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Instituto Massone S.A. | Highly purified gonadotropin compositions and process for preparing them |
| EP1106623A1 (en) * | 1999-11-16 | 2001-06-13 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| WO2005063811A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-07-14 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ENDOCRINE JOURNAL, vol. 44, no. 2, February 1997 (1997-02), pages 205-218, XP002274685, JPTOKYO, cited in the application, the whole document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200701040A1 (ru) | 2007-10-26 |
| BRPI0517973B8 (pt) | 2021-05-25 |
| DE602005009856D1 (de) | 2008-10-30 |
| ES2312037T3 (es) | 2009-02-16 |
| US7741455B2 (en) | 2010-06-22 |
| DK1809663T3 (da) | 2008-11-17 |
| IL182716A (en) | 2010-12-30 |
| US20080070832A1 (en) | 2008-03-20 |
| BRPI0517973B1 (pt) | 2018-02-14 |
| IL182716A0 (en) | 2007-07-24 |
| PT1809663E (pt) | 2008-10-02 |
| CA2579131A1 (en) | 2006-05-18 |
| HK1108704A1 (en) | 2008-05-16 |
| EP1809663B1 (en) | 2008-09-17 |
| CN101087805A (zh) | 2007-12-12 |
| BRPI0517973A (pt) | 2008-10-21 |
| EP1809663A1 (en) | 2007-07-25 |
| CN101087805B (zh) | 2012-05-23 |
| AU2005303818A1 (en) | 2006-05-18 |
| CY1108602T1 (el) | 2014-04-09 |
| ATE408624T1 (de) | 2008-10-15 |
| SI1809663T1 (sl) | 2009-02-28 |
| NO20072863L (no) | 2007-06-05 |
| HRP20080464T3 (en) | 2008-10-31 |
| AU2005303818B2 (en) | 2011-06-23 |
| WO2006051070A1 (en) | 2006-05-18 |
| NO340811B1 (no) | 2017-06-19 |
| KR101173717B1 (ko) | 2012-08-13 |
| MX2007005327A (es) | 2007-08-02 |
| KR20070083618A (ko) | 2007-08-24 |
| PL1809663T3 (pl) | 2009-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA011673B1 (ru) | Способ очистки fsh | |
| US8604175B2 (en) | Method for purifying FSH or a FSH mutant | |
| US8846344B2 (en) | Process for the purification of glycoproteins | |
| KR101160985B1 (ko) | Ｆｓｈ를 정제하는 방법 | |
| BRPI1012647B1 (pt) | Método para purificar um hormônio folículo-estimulante recombinante ou uma variante de hormônio folículo-estimulante recombinante | |
| JP4933439B2 (ja) | Ｆｓｈの精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |