EA004793B1 - Химерный белок растворимого рецептора интерлейкина-6/лиганда, его аналоги и способы применения - Google Patents

Abstract

Химерные белки, конструируемые путем слияния природной формы растворимого рецептора IL-6 и IL-6, которые являются полезными для лечения разных видов рака и болезней печени, улучшения приживаемости клеток при трансплантации костного мозга и лечения других болезней, связанных с IL-6.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биологической активности интерлейкина-6 (1Ь-6), которая зависит от агонистического действия растворимого рецептора 1Ь-6 (81Я-6Я). В частности, настоящее изобретение относится к новым химерным белкам 81Ь-6Я/1Ь-6, сконструированным путем слияния природных форм 81Б-6Я и 1Ь-6, и их биологически активным аналогам, которые позволяют эффективно лечить рак путем подавления роста раковых клеток, улучшают приживаемость трансплантата костного мозга, являются полезными для лечения болезней печени и других нарушений, обусловленных 1Ь-6.

Предпосылки изобретения и прототип

Интерлейкин-6 (1Ь-6) является хорошо известным цитокином, биологическая активность которого опосредована системой мембранных рецепторов, включающей два разных белка, один из которых определяется как рецептор 1Ь-6 (1Б-6Я или др80), а другой - как др 130 (обзор Нпаио е! а1., 1994). Растворимые формы 1Б-6Я (81Б-6Я), соответствующие внеклеточному домену др80, являются естественными продуктами организма человека, обнаруженными в виде гликопротеинов в крови и моче (ΝονίοΚ е! а1., 1990, 1992). Отличительная особенность молекул 81Б-6Я состоит в том, что они являются сильнодействующими агонистами 1Ь-6 во многих типах клеток, включая клетки человека (Тада е! а1., 1989; ΝονίοΚ е! а1., 1992). Это связано с тем, что даже без интрацитоплазматического домена др80 81Б-6Я способен стимулировать димеризацию др 130 под воздействием 1Ь-6, который, в свою очередь, опосредует последующую 1Ь-6-специфическую трансдукцию сигнала и биологические действия (Мигакаш1 е! а1., 1993). Комплекс активных рецепторов 1Ь-6 фактически представляет собой шестичленную структуру, образованную двумя цепями др130, двумя 1Б-6Я и двумя лигандами 1Ь-6 (№атй е! а1., 1994; Раоиекка е! а1., 1995), в которой 81Я-6Я характеризуется двумя типами взаимодействия с др130, оба из которых имеют важное значение 1Ь-6-специфической биологической активности (На11ш1 е! а1., 1995).

Обработка 81Б-6Я приводит к усилению биологической активности 1Ь-6 во многих типах клеток. Примером являются опухолевые клетки, рост которых подавляется 1Ь-6 в гораздо большей степени при добавлении 81Б-6Я; такими клетками, в частности, являются миелолейкозные клетки М1 мышей (Тада е! а1., 1989), клетки Т47Б карциномы молочной железы человека (Νονίοΐί. е! а1., 1992) или немелкие клетки карциномы легкого человека (Оапара!Ы е! а1., 1996). 1Ь-6 оказывает антиметастатическое действие ίη νίνο (Ка!/ е! а1., 1995), к1Ь-6Я также может усиливать ίη νίνο противоопухолевое действие 1Ь-6 (Маск1е\\зсх е! а1., 1995). Другим действием !Ь-6, которое усиливается добавле нием 81Б-6Я, является стимуляция кроветворных стволовых клеток с целью продуцирования смешанных колоний (8ш е! а1., 1995). Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что жизнеспособность первичных культур олигодендроцитов мозга поддерживается только комбинацией 81Я-6Я и 1Ь-6 (Ой, 1997), в то время как 1Ь-6 в отдельности проявляет слабую активность в таких культурах (Кайп апй Бе Уе1118, 1994). Это открытие показывает, что 1Ь-6 в сочетании с 81Б-6Я может имитировать активность других нейротропических цитокинов, таких как ресничный нейротропический фактор (ΟΝΤΡ) или фактор подавления лейкоза (Ь1Р), который также действует через др130, как это имеет место для 1Б-11 и онкостатина М (Ήίηηο е! а1., 1994).

Была предпринята попытка получить молекулу, которая могла бы сочетать вышеуказанные функции 1Ь-6 и 81Б-6Я, в результате которой было объявлено о продуцировании в рекомбинантных дрожжевых клетках слитого белка из усеченного сегмента последовательности 1Б-6Я человека и 1Ь-6, связанных линкером с высоким содержанием глицина (Р18сйет е! а1., 1997). Этот слитый белок включает, по существу, только Νдомен рецептора цитокина 1Б-6Я и С-домен рецептора цитокина; таким образом в нем практически полностью отсутствует иммуноглобулиноподобный (1д) домен 1Б-6Я и предмембранная область рецептора (область между С-доменом и трансмембранным доменом). В таком виде указанный белок представляет собой усеченную форму 81Б-6Я, причем усеченный 81Б-6Я в слитом белке связан вышеуказанным линкером с высоким содержанием глицина практически со всей зрелой формой 1Ь-6. Помимо отсутствия некоторых частей природного 81Б-6Я этот слитый белок, поскольку он получен в дрожжевых клетках, не имеет структуры гликозилирования, которая должна была бы быть у такого слитого белка, если бы он был получен в клетках млекопитающего, например в клетках человека. Фактически этот продуцированный в дрожжах слитый белок имеет молекулярную массу, равную примерно 57 кДа, в отличие от слитого продукта, содержащего практически все аминокислотные остатки природного 81Б-6Я и 1Ь-6 и полностью гликозилированного в клетках млекопитающих (например, человека), который должен иметь предполагаемую молекулярную массу около 85 кДа (см. приведенный ниже пример 2).

Общепринятая практика конструирования рекомбинантных белков, которые можно использовать для лечения людей, показывает, что такие белки должны как можно ближе соответствовать природным формам белков, обнаруженным в организме человека, во избежание стимуляции антител и других побочных эффектов, характерных для искусственных рекомбинантных продуктов. По этой причине для получения гликозилированных белков желательно использовать рекомбинантные системы клеток млекопитающих, такие как интерферон-β или колониестимулирующий фактор гранулоцитов (Сйегпа_)оукку е! а1., 1984, Ηο11ο\ναν. 1994), в химической форме, которая в наибольшей степени схожа с естественным продуктом человека. Бактерии или микроорганизмы, например такие, как дрожжи, которые не гликозилируются должным образом, вызывают также неправильную укладку цепей белка, что ведет к возникновению иммуногенных реакций. Это особенно важно для 1Ь-6, который существенно модифицирован посттрансляционно Ν- и О-гликозилированием, а также фосфорилированием (обзор Веуе1, 1989), и для природного к1Ь-6В из крови и мочи человека, являющего гликопротеином, в котором Ν- и С-концевые аминокислоты являются постоянными и их значения установлены (Νονίο1< е! а1., 1990 и принадлежащий обоим авторам патент США № 5216128 и соответствующий европейский патент № ЕР 413908 В1).

Из вышеизложенного следует, что указанный продукт слияния части 51Ь-6В и 1Ь-6 должен иметь целый ряд недостатков, в частности, с точки зрения применения для лечения человека из-за отсутствия у него части 51Ь-6В и продуцирования в дрожжах, что может стать причиной неправильного гликозилирования белка.

До сих пор не была описана слитая молекула, которая содержит природный к1Е-6В, обнаруженный в жидкостях организма человека, и природный 1Ь-6 и которая получена в клетках человека или других млекопитающих.

Поэтому целью настоящего изобретения является получение такой слитой молекулы, содержащей природные к1Ь-6В и 1Ь-6 (в любом порядке), которая продуцирована в клетках млекопитающих.

Еще одной целью настоящего изобретения является применение такого слитого белка (химера к1Ь-6В/1Ь-6) для подавления роста сильно метастатических меланомных клеток в очень низких концентрациях, так как эти клетки устойчивы к воздействию в отдельности 1Ь-6 или КШ-6В..

Еще одной целью этого изобретения является применение такого слитого белка (химера 51Ь-6В/1Ь-6) для улучшения приживаемости ίη νίνο кроветворных стволовых клеток при трансплантации костного мозга.

Еще одной целью настоящего изобретения является применение такого слитого белка для лечения других нарушений, обусловленных 1Ь6, например болезней печени или неврологических нарушений.

Еще одной целью данного изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие вышеуказанный слитый белок природных 51Ь-6В-1Ь-6 (химера 81И-6В/1И-6), для лечения рака, для применения при трансплантации костного мозга и для лечения других нарушений, обусловленных 1Ь-6, например болезней печени и неврологических нарушений.

Другие цели и объекты настоящего изобретения будут рассмотрены ниже или станут очевидными из дальнейшего описания настоящего изобретения.

Краткое изложение изобретения

В соответствии с настоящим изобретением получено несколько слитых белков (химер), содержащих практически все природные к1Ь-6В из жидкостей организма человека и практически все зрелые формы природного Ш-6 человека, которые соединены короткими линкерными пептидами длиной около 3 аминокислотных остатков или больше, например 13 аминокислотных остатков (см. ниже и примеры 1 и 2). Однако необходимо отметить, что в этих слитых белках линкерные пептиды могут отсутствовать и часть к1Ь-6В. может быть присоединена непосредственно к части 1Ь-6. Так как линкеры, представляющие собой искусственные аминокислотные последовательности, могут быть иммуногенными эпитопами, вызывающими образование антител у нуждающихся субъектов, желательно иметь непосредственно слитую химеру К1Е-6В/1Е-6, которая обладает требуемой биологической активностью и в то же время максимально уменьшает вероятность индуцирования таких потенциально вредных антител при введении такой химеры.

Сохранение всей последовательности кГЬ6В, включая 1д-подобный домен, обнаруженный в природной молекуле, а также необходимое гликозилирование и другие посттрансляционные модификации, вносимые клетками человека или млекопитающего при продуцировании вышеуказанной химеры в таких клетках, также имеет важное значение для уменьшения потенциальной иммуногенности химерного белкового продукта.

Однако можно использовать очень короткий линкер длиной около трех аминокислот в точке соединения частей к1Ь-6В. и 1Ь-6 химерного белка. Такой короткий линкер не должен быть иммуногенным эпитопом. Кроме того, можно использовать более длинные линкеры длиной примерно до 30 аминокислот с целью разделения двух частей, но в этом случае необходимо соблюдать осторожность и произвести экспериментальные исследования биологической эффективности и безопасности полученного продукта для гарантии того, что химерные молекулы с такими линкерами не являются иммуногенными.

В действительности при осуществлении настоящего изобретения было установлено, что более длинные линкеры не имеют большого значения для активности химерного белка; это свидетельствует о том, что для правильной укладки химеры не требуется более длинный линкер, особенно тогда, когда практически все природные последовательности частей к1Ь-6В. и 1Ь5 входят в химерную молекулу (см. пример 3 и фиг. 5, которые относятся также к сравнению химеры 81Ь-6ВЛЬ-6 с очень коротким (3 аминокислоты) линкером и аналогичной химеры с более длинным линкером из 30 аминокислот).

Эти слитые белки или химеры 81Ь-6ВЛЬ-6 эффективно продуцированы в соответствии с настоящим изобретением в экспрессирующих системах клеток млекопитающих, что позволило получить гликозилированные продукты, оказывающие сильное действие на опухолевые клетки, которые обычно не реагируют в отдельности на 1Ь-6 или 81Ь-6В, и улучшающие приживаемость трансплантированных клеток костного мозга человека (см. ниже и примеры 1-4). В таких трансплантатах костного мозга химеры 81Ь-6ВЛЬ-6 имеют важное значение для выживания и пролиферации трансплантированных некоммитированных полипотентных кроветворных стволовых клеток. Кроме того, из приведенных ниже результатов экспериментов и других анализов следует, что можно получить различные аналоги химерного белка 81Ь-6В/1Ь-6 по данному изобретению, которые обладают практически такой же биологической активностью, что и химера 81Ь-6ВЛЬ-6, причем указанные аналоги являются химерами 81Ь-6ВЛЬ-6, в которых один или несколько аминокислотных остатков, удалены, добавлены или заменены другими, и единственным ограничением таких аналогов является то, что они должны сохранять большую часть природной последовательности 81Ь-6В и 1Ь-6. Например, аминокислотные добавления в природные последовательности НЬ6В и 1Ь-6 ограничены примерно 20 аминокислотами, и эти добавления желательно произвести на участке соединения между 81Ь-6В и 1Ь-6, т.е. в молекуле линкера. Аналогичным образом из последовательностей 81Ь-6В и 1Ь-6 можно удалить не более 20-30 аминокислот. Замены аминокислотных остатков в последовательностях 81Ь-6В и 1Ь-6 другими аминокислотными остатками предпочтительно также ограничиваются примерно 20-30 аминокислотами. Все вышеуказанные делеции, добавления и замены являются приемлемыми в соответствии с настоящим изобретением только тогда, когда при экспрессии в клетках млекопитающих модифицированные таким образом аналоги сохраняют биологическую активность химеры 81Ь-6К/1Ь-6, состоящей в основном из природных последовательностей, и такую же структуру гликозилирования этой химеры.

Таким образом, настоящее изобретение относится к химерному гликозилированному белку растворимого рецептора интерлейкина-6 (81Ь-6В)-интерлейкина-6 (1Ь-6)(51Ь-6В/1Ь-6) и к его биологически активным аналогам, которые включают слитый белковый продукт, полученный путем слияния практически всей природной формы 81Ь-6В и практически всей природной формы !Ь-6, причем указанный 81Т-6К/1Ь-6 и его аналоги гликозилированы аналогично гликозилированию природных 81Ь-6В и 1Ь-6.

Вышеуказанный химерный белок по данному изобретению имеет следующие варианты:

(ί) химерный белок 51Ь-6В/1Ь-6 и его биологически активные аналоги, в которых указанный 81Ь-6В слит с 1Ь-6 при помощи молекулы пептидного линкера;

(ίί) химерный белок 51Ь-6В/1Ь-6 и его биологически активные аналоги по пункту (1), в которых указанный линкер является очень коротким неиммуногенным линкером длиной около 3-4 аминокислотных остатков;

(ίίί) химерный белок 51Ь-6Я/1Ь-6 и его биологически активные аналоги по пункту (ίί), в которых указанный линкер является трипептидом последовательности Е-Р-М (б1и-Рйе-Ме1);

(ίν) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6 и его биологически активные аналоги по пункту (ί), в которых указанный линкер является пептидом, состоящим из 13 аминокислотных остатков последовательности Е-Р-б-А-б-Е-У-Ь-б-б-О-Р-М (С1и-Рйе-С1у-А1а-С1у-Реи-Уа1-Реи-С1у-С1у-С1пРйе-Ме1) (81Т) ΙΌ № 1);

(ν) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6, определяемый как δΙΕ-6Κδνα1/ΙΕ-6, с трипептидным линкером последовательности Е-Р-М между Сконцевым остатком Уа1-356 8ΙΤ-6Κ и Ν’концевым остатком Рго-29 Ш-6, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 3;

(νί) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6, определяемый как δΙΕ-6Κδνα1/Ε/ΙΕ-6, состоящий из 13 аминокислот пептидный линкер последовательности Е-Р-б-А-б-Е-У-Ь-б-б-О-Р-М между Сконцевым остатком Уа1-356 8ΙΤ-6Κ и Νконцевым остатком Рго-29 [Ш-6Н. причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 3, где трипептид последовательности Е-Р-М в положениях 357-359 на фиг. 3 заменен указанной пептидной последовательностью, состоящей из 13 аминокислот;

(νίί) химерный белок 5ΙΡ-6Ρ/ΙΡ-6. где указанный белок продуцирован в клетках млекопитающих в полностью процессированной форме;

(νίίί) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6, где указанный белок продуцирован в клетках человека;

(ίχ) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6, где указанный белок продуцирован в клетках яичника китайского хомячка (СНО);

(х) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны подавлять рост высокозлокачественных раковых клеток;

(χί) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны подавлять рост злокачественных меланомных клеток;

(χίί) химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны стимулиΊ ровать ίη νίνο приживаемость кроветворных клеток человека при трансплантации костного мозга;

(χίίί) химерный белок 5ΙΩ-6Β/ΙΩ-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны защитить печень от гепатотоксических веществ.

Настоящее изобретение относится также к последовательности ДНК, кодирующей химерный белок 51Ь-6К/1Ь-6 и его биологически активные аналоги по данному изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору ДНК, включающему последовательность ДНК, кодирующую химерный белок 51Ь-6К/1Ь-6 и его биологически активные аналоги по этому изобретению, причем указанный вектор пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках млекопитающих.

Вектор ДНК по этому изобретению включает следующие варианты:

(ί). Вектор ДНК, который пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках человека.

(ίί). Вектор ДНК, где указанный вектор экспрессирован в клетках млекопитающих или человека, экспрессированный химерный белок имеет последовательность, позволяющую полностью процессировать химерный белок клеткой млекопитающего или человека и секретироватъ полностью процессированный химерный белок из клеток в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки.

(ίίί). Вышеуказанный вектор ДНК, где указанный вектор определяется как плазмида ροΩΝΑδΙΕ-6Κ/ΙΕ-6, включающая вектор ροΩΝΑβ, содержащий последовательность ДНК, кодирующую химерный белок 81Ь-6КЛЬ-6 под контролем промотора цитомегаловируса (СМУ).

(ίν). Вышеуказанный вектор ДНК, где указанный вектор определяется как плазмида ροΩΝΑ 81Ь-6В/Ь/1Ь-6, включающая вектор ροΩΝΑ3, содержащий последовательность ДНК, кодирующую химерный белок 81Ь-6КЛЬ-6 под контролем промотора цитомегаловируса (СМУ), и в котором в указанную последовательность ДНК, кодирующую указанный химерный белок 81Ь-6КЛЬ-6, вставлена линкерная последовательность, кодирующая линкерный пептид в сайте ЕсоШ, расположенном между последовательностью, кодирующей часть 81Ь-6К, и последовательностью, кодирующей часть 1Ь-6 белка.

Аналогичным образом настоящее изобретение относится также к трансформированным клеткам млекопитающих, содержащим вышеуказанный вектор ДНК, который способен экспрессировать последовательность химерного белка 81Ь-6КЛЬ-6, переносимую указанным вектором, полностью процессировать экспрессированный белок и секретировать его в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки.

Одним вариантом этих трансформированных клеток являются описанные здесь клетки почки эмбриона человека 293 (НЕК293), трансфецированные вектором ροΩΝΑ 81Ь-6К/1Е-6, указанные клетки способны экспрессировать химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6, полностью процессировать и секретировать указанный белок в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки, в форме гликопротеина с молекулярной массой около 85 кДа.

Другим вариантом трансформированных клеток являются описанные здесь клетки СНО (яичника китайского хомячка), трансфецированные вектором ροΩΝΑ 81Ь-6В/1Е-6, указанные клетки способны экспрессировать химерный белок 8ΙΕ-6Κ/ΙΕ-6, полностью процессировать и секретировать указанный белок в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки, в форме гликопротеина с молекулярной массой около 85 кДа.

Настоящее изобретение относится также к способу получения химерного белка или его биологически активных аналогов, который включает выращивание вышеуказанных трансформированных клеток в условиях, приемлемых для экспрессии, процессирования и секреции указанного белка или его аналогов в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки; и очистку указанного белка или его аналогов от культуральной среды иммуноаффинной хроматографией с использованием моноклональных антител, специфичных в отношении 8Ш-6К.

Химерный белок по настоящему изобретению имеет ряд применений, которые включают (ί) применение химерного белка 5ΙΩ-6Β/ΙΩ6 или его аналогов, солей и смесей в качестве ингибиторов раковых клеток;

(ίί) применение аналогично пункту (ί) в качестве ингибитора высоко злокачественных меланомных клеток;

(ϊϊί) применение химерного белка δΙΩ6КЛЬ-6 или его аналогов, солей и смесей в качестве активного ингредиента для улучшения приживаемости кроветворных клеток человека при трансплантации костного мозга;

(ίν) применение химерного белка δΙΩ6Κ/ΙΩ-6 или его аналогов, солей и смесей в качестве активного ингредиента для усиления гемопоэза, лечения болезней печени и неврологических нарушений и для других целей, связанных с использованием 1Ь-6 или δΙΩ-6Κ

Химерный белок по настоящему изобретению можно аналогичным образом применять для получения лекарственных средств для ряда медицинских показаний, в частности химерный белок δΙΩ-6Β/ΙΩ-6 или его аналоги, соли и смеси можно применять для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения разных видов рака путем подавления роста раковых клеток, или для получения лекарственного средства для стимуляции приживаемости крове творных клеток при трансплантации костного мозга, или для получения лекарственного средства для усиления гемопоэза, или для получения лекарственного средства для лечения неврологических нарушений, или для получения лекарственного средства для других целей, связанных с применением 1й-б или оГЙ-бВ.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента химерный белок оГЙ-бВДй-б или его аналог и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

Фармацевтическая композиция по этому изобретению включает следующие варианты:

(ί) фармацевтическая композиция для лечения разных видов рака млекопитающих;

(ίί) фармацевтическая композиция для улучшения приживаемости клеток при трансплантации костного мозга;

(ίίί) фармацевтическая композиция для лечения болезней печени и неврологических нарушений или для усиления гемопоэза, или для других целей, связанных с использованием 1й-б или о1й-бВ.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения разных видов рака у млекопитающих, или для улучшения приживаемости клеток при трансплантации костного мозга, или для лечения болезней печени и неврологических нарушений, или для усиления гемопоэза, или для других целей, связанных применением 1й-б или НЙ-бВ который заключается в том, что пациенту вводят вышеуказанную фармацевтическую композицию в виде приемлемой лекарственной формы и в соответствии с приемлемым способом введения.

Во избежание неясности следует отметить, что настоящее изобретение относится к химере между 1й-б и оГЙ-бВ, расположенным в любом порядке, т.е. Ν-концевую и С-концевую части можно поменять местами, и тогда химера будет представлять собой белок ГЙ-б-оГЙ-бВ, хотя в этом описании изобретения он определяется как белок о1й-бВ/1й-б.

Другие цели и варианты осуществления настоящего изобретения рассмотрены ниже или являются очевидными из нижеследующего подробного описания этого изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 (А, В) дано схематическое изображение разных векторов, реагентов и стадий процесса, используемых для конструирования химерной молекулы ДНК, кодирующей химерный белок, в котором сохранена структура природной формы о1й-бВ, заканчивающейся у остатка Уа1 35б, и следующей за ней последовательности природной, зрелой, процессированной формы 1й-б, как это подробно описано в примере 1.

На фиг. 2 (А, В) показаны результаты анализа по идентификации химеры оГЙ-бВЗУаИй-б р8б электрофорезом в полиакриламидном геле (А) и на основании профиля биологической активности (В), при этом на фиг. 2А дано изображение геля, окрашенного кумасси, на котором электрофорезом выявлены фракции, очищенные иммуносорбционным методом и элюированные из колонок для аффинной хроматографии, заполненных образцом секретированного белка, полученного из культур клеток, трансфецированных вектором, кодирующим химерный белок; и на фиг. 2В приведен репрезентативный график биологической активности (подавление роста меланомных клеток Р10.9) всех вышеуказанных фракций, элюированных из колонок для аффинной хроматографии, как это подробно описано в примерах 2 и 3.

На фиг. 3 показана аминокислотная последовательность (однобуквенный код) химеры о1й-бВ8Уа1/1й-б, в которой указаны разные домены молекулы, в том числе Ν-концевой сигнальный пептид (линия поверх последовательности), иммуноглобулиноподобный (1д-подобный) домен, Ν-домен рецептора цитокина (подчеркнут), С-домен цитокина (линия поверх последовательности) и предмембранная область рецептора (область между С-доменом и трансмембранным доменом), вся часть оГЙ-бВ химеры; а также зрелая часть химеры 1й-б (подчеркнута снизу), как это описано в примерах 1 и 2.

На фиг. 4 (А, В) показаны фотографии меланомных клеток Р10.9 в культуре, необработанные (А) и обработанные (В) химерным белком оГЙ-бВЛй-б в течение 4 дней, при этом на фиг. 4В видны морфологические изменения, вызванные химерой оГЙ-бВДй-б в метастатических меланомных клетках (клетки Р10.9), как это описано в примере 3.

На фиг. 5 дано графическое изображение результатов, показывающих подавление роста меланомных клеток Р10.9 химерным белком 51й-бВ/1й-б, используемым в разных концентрациях от около 0,12 до около 150 нг/мл, где химера 1й-бВ/1й-б, имеющая линкер длиной около 3 аминокислот, описанная в примере 3, сравнивается с химерой, имеющей линкер длиной 13 аминокислот (ГЙ-бВДй-б).

На фиг. б дано графическое изображение результатов, показывающих отсутствие подавляющего рост действия на меланомные клетки Р10.9 отдельно выделенного 1й-б (верхняя пунктирная кривая с незаштрихованными квадратами) в концентрациях 0-40 нг/мл 1й-б и отдельно выделенного оГЙ-бВ (точка схождения всех кривых на вертикальной оси, где концентрация 1й-б равна нулю); а также наблюдаемое действие подавления роста при совместном добавлении 1й-б и оГЙ-бВ в разных концентрациях, где 1й-б имеет концентрацию от 10 до 40 нг/мл и оГЙ-бВ добавлен в трех концентрациях, равных 100, 200 и 400 нг/мл на каждую концентрацию 1й-б, как это показано тремя нижними кривыми (две пунктирные кривые с незаштрихо ванными треугольниками и кружками и сплошная кривая с заштрихованными квадратами), аналогично примеру 3.

На фиг. 7 представлена авторадиограмма саузерн-блоттинга, показывающая требования, предъявляемые к химерному белку ЛЬ-бКЛЬ-б для улучшения приживаемости кроветворных стволовых клеток человека при трансплантации костного мозга мышам δΟΙΌ-ΝΘΌ (две расположенные справа полосы, относящиеся к мышам, получавшим химерный белок ЛЬ-бКЛЬ-б дополнительно к другим необходимым факторам, 8СЕ, ЕЬТ-3, сравниваются с тремя расположенными слева полосами, относящимися к мышам, получавшим только 8СЕ и ЕЬТ-3 и 8СЕ, ЕЬТ-3, а также отдельно выделенные, т.е. неслитые 1Ь-б и ЛЬ-бК), как это описывается в примере 4.

На фиг. 8 изображен график Скэтчарда, показывающий характеристики сродства химеры ЛЬ-бКЛЬ-б по сравнению со смесью 1Ь-б и ЛЬ-бК. где значения химеры изображены заштрихованными квадратами и значения смеси показаны заштрихованными ромбами, при этом отношение наклонов кривых составляет 4:1.

На фиг. 9 показан график более высокой активности химеры ЛЬ-бКЛЬ-б в отношении меланомных клеток Е10.9, по сравнению с активностью смеси ЛЬ-бК+1Ь-б или ЛЬ-бВ (без 1Ь-б).

На фиг. 10 показаны результаты защиты, обеспечиваемой химерой ЛЬ-бКЛЬ-б против токсикоза печени, где цифровые величины представляют среднее значение 4 экспериментов, заштрихованные квадраты относятся к 1Ь-б/-мышам, заштрихованные ромбы относятся к 1Ь-б-/-мышам, получавшим 1Ь-б, и заштрихованные звездочки относятся к 1Ь-б-/-мышам, получавшим химеру.

На фиг. 11 изображена аминокислотная последовательность (однобуквенный код) химеры 3е Ш-б-ЛЬ-бВбУак в которой подчеркнут линкер.

На фиг. 12 изображен график биологической активности, проявляемой в отношении меланомных клеток Е10.9 химерой 3е (темные заштрихованные звездочки), по сравнению с химерой 81Ь-бКЛЬ-б (заштрихованные квадраты) и двумя мутантами (Мий 39 (НО) заштрихованные ромбы) и (Мий ΝΗΌ - светлые заштрихованные звездочки), как это описывается в примере 9.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к химерному белку ЛЬ-бКЛЬ-б и его биологически активным аналогам, содержащим практически все природные формы ЛЬ-бК и практически все природные формы, слитые друг с другом, в которых сайт слияния может быть линкерным пептидом длиной 3 аминокислоты, при этом химерный белок ЛЬ-бКЛЬ-б и его аналоги имеют такую же величину и структуру гликозили рования, что и природные ЛЬ-бВ и 1Ь-б. Установлено, что химерный белок §1Ь-бК/1Ь-б, полученный в соответствии с настоящим изобретением в клетках млекопитающих, в частности в клетках человека (см. нижеследующие примеры 1-4) или в клетках СНО (см. нижеследующий пример б), эффективно экспрессируется в таких клетках, хорошо гликозилируется и оказывает сильное действие на опухолевые клетки, которые совершенно не реагируют на используемые отдельно 1Ь-б или ЛЬ-бВ.

В частности, в соответствии с настоящим изобретением обнаружено (см. нижеследующие примеры 1-3), что вышеуказанный химерный белок ЛЬ-бКЛЬ-б по этому изобретению подавляет рост чрезвычайно злокачественных клеток млекопитающих, таких как меланомные клетки Е10.9, в более низких концентрациях по сравнению с теми, которые необходимы при использовании смеси неслитых ЛЬ-бВ и 1Ь-б. Это особенно важно с учетом того, что меланомные клетки Е10.9 продолжают расти без изменения после их обработки отдельно 1Ь-б или ЛЬ-бВ, и их рост прекращается только под воздействием относительно высоких доз смеси неслитых 1Ь-б и ЛЬ-бК. Химерный белок ЛЬ-бВ/1Ь-б по настоящему изобретению является гораздо более сильнодействующим ингибитором высокозлокачественных меланомных клеток, чем смесь его отдельных частей, т.е. смесь неслитых 1Ь-б и ЛЬ-бК. Таким образом, химерный белок по настоящему изобретению особенно полезен в качестве активного ингредиента для лечения разных видов рака.

Считается, что более высокая активность химерного белка ЛЬ-бКЛЬ-б связана с его более высоким сродством к др 130 по сравнению со смесью неслитых 1Ь-б и ЛЬ-бВ (пример 7).

Кроме того, установлено, что (см. нижеследующий пример 4) химерная молекула ЛЬбКЛЬ-б по настоящему изобретению является особенно полезной для усиления приживаемости клеток при трансплантации костного мозга. Действительно, при выполнении известной методики трансплантации клеток костного мозга человека мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО), у которых фактор стволовых клеток (8СЕ) и ЕЙ3-лиганд использованы для стимуляции выживания и пролиферации самых простых полипотентных кроветворных стволовых клеток, способных в течение длительного времени сохранять жизнеспособность в костным мозге реципиента, установлено, что эти два фактора, 8СЕ и ЕЙ3-лиганд, являются недостаточно активными, чтобы стимулировать приживаемость клеток человека в костном мозге мыши-реципиента, и что трансплантация оказывается успешной только при дополнительном использовании химерного белка 81Ь-бКЛЬ-б. Это открытие показывает, что химерный белок можно эффективно использовать при осуществлении такой трансплантации.

Использование в тех же экспериментах неслитых 1Ь-б и 81Ь-6К при раздельном добавлении не позволяет успешно стимулировать трансплантацию костного мозга и при совместном добавлении они оказываются гораздо менее активными, чем химерный белок §1Ь-бК/1Ь-б, т.е. при эффективной концентрации, равной 100 нг/мл, химерный белок НЬ-бКЛЬ-б эффективно стимулирует трансплантацию костного мозга, в то время как два отдельных неслитых ИЬ-бК и 1Ь-б, добавляемые вместе даже в более высоких концентрациях (ИЬ-бК в концентрации 1251250 нг/мл, 1Ь-б в концентрации 50-200 нг/мл), гораздо менее активно стимулируют такую трансплантацию.

Вышеуказанный химерный белок ИЬбКЛЬ-б по данному изобретению предпочтительно является рекомбинантной гликозилированной химерой ИЬ-бКЛЬ-б, продуцированной в клетках человека или в любой приемлемой экспрессирующей системе клеток млекопитающих, такой как клетки яичника китайского хомячка (СНО), которая способна гликозилировать белки аналогично клеткам человека и вносит такие же посттрансляционные модификации, что и клетки человека. Важной особенностью является то, что полученный таким образом химерный гликопротеин процессирован и модифицирован так же, как природные родительские молекулы ИЬ-бК и 1Ь-б, обнаруженные в организме человека, без усечения и добавления чужеродных, не встречающихся в природе, полипептидных последовательностей, за исключением очень короткого трипептида или более длинного линкерного пептида, вводимого между частями ИЬ-бК и 1Ь-б химерного белка.

Чтобы получить вышеуказанный предпочтительный химерный белок по этому изобретению, необходимо учесть следующие особенности природных ИЬ-бК и 1Ь-б. Известно, что 1ЬбК, присутствующий в клеточных мембранах человека, продуцируется кДНК, кодирующей 4б8 аминокислот, образующих сигнальный пептид, иммуноглобулиноподобный (1д) домен, домен связывания цитокина, трансмембранную область и цитоплазматический домен (Уатакак! с1 а1., 1988). Растворимая форма ИЬ-бК обнаружена в жидкостях организма и подобно зрелому 1Ь-бВ, выделенному из мембран, имеет Ν-конец, соответствующий остатку Ьеи-20 (ΝονίοΚ с1 а1., 1990), и С-конец, соответствующий остатку Уа135б, непосредственно перед трансмембранной областью 1Ь-бК (см. совместный патент США № 521б128 и европейский патент № 413908 В1). Чтобы слить последовательность ИЬ-бК с 1Ь-б, после Уа1-35б вводят сайт рестрикции ЕсоК1. Последовательность зрелого 1Ь-б, начинающуюся у остатка Рго-29 кДНК 1Ь-б и заканчивающуюся у остатка Ме1-212 (УПЬепДет е1 а1., 198б; Нпапо е1 а1., 198б), вводят вслед за сайтом ЕсоК1. В сайт ЕсоК1 можно, хотя и необязатель но, ввести линкерный пептид требуемой длины, чтобы отделить части ИЬ-бК и 1Ь-б друг от друга в химерном белке. Как описано ниже, в качестве возможных примеров таких химерных белков получены два разных химерных белка, в сайт ЕсоК! одного из которых введен трипептидный линкер, а в другой введен линкер, состоящий из 13 аминокислотных остатков, при этом оба химерных белка характеризуются практически одинаковой биологической активностью.

Настоящее изобретение относится также к аналогам вышеуказанного химерного белка 81ЬбКЛЬ-б по этому изобретению, где аналоги обладают практически такой же биологической активностью химерного белка, так как содержат только природные последовательности ИЬ-бК и 1Ь-б. Такие аналоги являются белками, в которых может быть удалено, добавлено или заменено до 30 аминокислотных остатков в частях ИЬ-бК и/или 1Ь-б химерного белка с учетом того, что модификации такого типа не должны существенно изменять биологическую активность аналога химерного белка по отношению к самому химерному белку, при этом часть ИЬ-бК таких аналогов практически полностью сохраняет природную структуру (до процессирования см. фиг. 3) сигнального пептида, 1д-подобного домена, Ν-домена рецептора цитокина, Сдомена рецептора цитокина и предмембранного домена рецептора. Аналогичным образом, такие аналоги химерного белка должны практически полностью сохранять природную зрелую форму части 1Ь-б. Различные аналоги могут существенно отличаться друг от друга и от основной молекулы химерного белка (содержащего только природные последовательности 81Ь-бК и 1Ьб) в сайте линкерного пептида, соединяющего части ИЬ-бК и 1Ь-б в химерном белке. Такой линкер может иметь длину до 30 аминокислот и служит для отделения частей ЛЕ-бК и 1Ь-б друг от друга в химерном белке. Что касается такого линкера, то нужно очень внимательно выбрать его последовательность (и затем выполнить биологические испытания каждого такого аналога приемлемыми стандартными методами), чтобы ошибочный выбор не стал причиной неправильной укладки цепей в химерном белке, в результате чего он может потерять активность, или не привел к получению аналога химерного белка, против которого иммуногенный белок начнет вырабатывать антитела в организме пациента, вследствие чего такой аналог окажется неэффективным, по крайней мере, в качестве лекарственного средства среднего или продолжительного лечения.

Что касается вышеуказанных аналогов химерного белка по этому изобретению, то этими аналогами являются белки, в которых от одного до около 30 аминокислотных остатков основного химерного белка по этому изобретению заменены другими аминокислотными остатками или удалены, либо один или несколько аминокислотных остатков добавлены к первоначальной последовательности химерного белка по этому изобретению (которая содержит только природные последовательности 81Ь-6К и 1Ь-6) без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с основным химерным белком по этому изобретению. Эти аналоги получают известными методами синтеза и/или сайтнаправленного мутагенеза или любым другим известным методом, пригодным для этой цели.

Любой такой аналог предпочтительно имеет последовательность аминокислот, которая достаточно точно соответствует аминокислотной последовательности основной химеры ЛЬ6КЛЬ-6, что сообщает ему практически такую же активность. Таким образом, определить у данного аналога наличие такой же активности, что и у основного химерного белка по этому изобретению, можно обычным экспериментированием, в соответствии с которым аналог испытывают на активность в соответствии с нижеследующими примерами 2-4.

Аналоги химерного белка, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, или кодирующие их нуклеиновые кислоты, включают ограниченную совокупность соответствующих последовательностей в качестве замещающих пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть получены специалистом в этой области без излишнего экспериментирования на основании положений и указаний, приведенных в этом описании изобретения. Для более подробного ознакомления с химией и структурой белков обратитесь к научным работам 8с1ш1х О.Е. е! а1., Рппар1ез о£ РгоΙοίη 81гис!иге, 8рттдег-Уег1ад, Ναν Уотк, 1978 и СгещЫоп Т.Е., Рго!етз: 81гис!иге апб Мо1еси1аг Рторетбез XV. Н. Ргеешап & Со., 8ап Етапазсо, 1983, которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Замены в нуклеотидной последовательности, такие как предпочтительные кодоны, описаны в научных работах АизиЬе1 е! а1., зирга, §§ А.1.1-А.1.24 и 8атЬтоок е! а1., Сштеп! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1п!ег5С1епее Ν.Υ, §§ 6.3 и 6.4 (1987, 1992), в приложениях С и Ό.

Предпочтительные изменения, вносимые в аналоги по настоящему изобретению, известны как консервативные замены. Консервативные замены аминокислот в химерном белке, состоящем в основном из природных последовательностей 51Ь-6К и 1Ь-6, могут включать тождественные аминокислоты, входящие в группу со сходными физико-химическими свойствами, благодаря чему при замене членов этой группы сохраняются биологические функции молекулы, ОтапШат, 8с1епсе, Уо1. 185, рр. 862-864 (1974). Очевидно, что инсерции и делеции аминокислот могут также производиться в вышеуказанных последовательностях без изменения их функ ции, особенно, если эти инсерции или делеции включают только несколько аминокислот, например менее тридцати, предпочтительно менее десяти, и не приводят к удалению или изменению положения аминокислот, имеющих важное значение для функциональной конформации, например остатков цистеина, АиИпзеп, Рттщр1ез Тйа! Ооуетп ТНе Ео1бтд о£ Рго!ет Сйашз, 8с1епсе, Уо1. 181, рр. 223-230 (1973). Аналоги, полученные в результате таких делеций и/или инсерций, входят в объем настоящего изобретения.

Предпочтительные группы тождественных аминокислот представлены в табл. I. Более предпочтительные группы тождественных аминокислот приведены в табл. II и наиболее предпочтительные группы тождественных аминокислот представлены в табл. III.

Таблица I

Предпочтительные группы тождественных аминокислот

Аминокислота	Тождественная группа
Зег	Зег, ТЬг, 61у, Азп
Агд	Агд, О1п, Ьуз, С1и, Ηίδ
Ьеи	Пе, РЬе, Туг, Ме1, Уа1, Ьеи
Рго	О1у, А1а, ТЬг, Рго
ТЬг	Рго, Зег, А1а, О1у, Н13, СНп, ТЬг
А1а	О1у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1	Ме1, Туг, РЬе, Пе, Ьеи, Уа1
О1у	А1а, ТЬг, Рго, Зег, О1у
Пе	Ме!, Туг, РЬе, Уа1, Теи, Пе
РЬе	Тгр, МС1, Туг, Пе, Уа1, Ьеи, РЬе
Туг	Тгр, Ме1, РЬе, Пе, Уа1, Ьеи, Туг
Суз	Зег, ТЬг, Суз
Ηίδ	61и, Ьуз, О1п, ТЬг, Аг§, Н1з
αΐη	О1и, Ьуз, Азп, ΗΪ3, ТЬг, Аг§, О1п
Азп	61п, Азр, Зег, Азп
Ьуз	О1и, С1п, Ηίδ, Аг§, Ьуз
Азр .	О1и, Азп, Азр
О1и	Азр, Ьуз, Азп, СНп, Ηίβ, Агд, С1и
Ме!	РЬе, Не, Уа1, Ьеи, Ме!
Тгр	Тгр

Таблица II

Более предпочтительные группы тождественных аминокислот Аминокислота Тождественная группа

8ег	Зег
Ага	Н13, Ьуз, Аг§
Ьеи	Ьеи, Не, РЬе, Мег
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго,А1а
Уа1	Уа1, Ме!, Не
О1у	О1у
Не	Не, Ме1, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	Ме!, Туг, Не, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, 8ег
Ни	Н15, О1п, Аг8
О1п	О1и, О1п, Н13
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Аг®
Азр .	Азр, Азп
С1и	С1и, О1п
Ме!	Ме!, РЬе, Не, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

Наиболее

Таблица III предпочтительные группы тождественных аминокислот

8ег	8ег
Аг§	Аг§
Ьеи	Ьеи, Не, Мег
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
О1у	О1у
Не	Не, Ме!, Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз, Зег
Н15	Н13
О1п	О1п
Азп	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
О1и	О1и
Тгр	Ме!, Не, Ьеи
Тгр	Ме!

Примеры выполнения замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения аналогов химерного белка по настоящему изобретению, включают любые известные методы, в частности описанные в патентах США №№ НЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Марку и др.; № 5116943, выданном Котсу и др., № 4965195, выданном Намену и др., № 4879111, выданном Чонгу и др., и № 5017691, выданном Ли и др.; и белки с замененным лизином, описанные в патенте США № 4904584 (511а\\ е1 а1.).

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения любой аналог химерного белка по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, которая практически соответствует аминокислотной последовательности вышеуказанного основного химерного белка. Термин практически соответствует означает аналоги с незначительными изменениями последовательности основного химерного белка, которые не влияют на его основные характеристики, в частности на его способность подавлять пролиферацию раковых клеток или стимулировать приживаемость клеток при трансплантации костного мозга. Изменения, которые обычно входят в определение практически соответствует, получают в результате выполнения обычных методов мутагенеза ДНК, кодирующей химерный белок по этому изобретению, которые позволяют получить несколько незначительных модификаций, и тестирования полученных аналогов с целью выявления требуемой активности, как это описывалось выше.

Аналоги по настоящему изобретению включают белки, закодированные нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизирует с ДНК или РНК в строгих условиях и кодирует химерный белок по настоящему изобретению, состоящий практически полностью из природных последовательностей, кодирующих 5[Ь-6В и IИ-6. Например, такая гибридизирующая ДНК или РНК может кодировать тот же белок по этому изобретению, который имеет, например, последовательность, показанную на фиг. 3, но отличается своей нуклеотидной последовательностью от природной нуклеотидной последовательности вследствие вырожденности генетического кода, т.е. несколько отличающаяся последовательность нуклеиновых кислот может по-прежнему кодировать ту же аминокислотную последовательность с учетом указанной вырожденности. Кроме того, как указывалось выше, число изменений аминокислот (делеции, добавления, замены) ограничено примерно 30 аминокислотами, поэтому даже при максимальном числе замен аналоги по настоящему изобретению все же сохраняют лидерную последовательность (до процессирования), Цподобный домен, Ν- и С-концевые домены рецептора цитокина и предмембранную область рецептора (область между С-концевым доменом и трансмембранным доменом) в части 5^-6^ и практически всю часть Ш-6. Такая нуклеиновая кислота будет кандидатом номер один для определения, кодирует ли она полипептид, который сохраняет функциональную активность химерного белка по настоящему изобретению.

Термин строгие условия относится к условиям гибридизации и последующей промывки, которые специалисты в этой области обычно определяют как строгие. См. АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!око1к ίη Мо1еси1аг В1о1обу, кирга, 1п1егкаепсе, Ν.Υ., рага.6.3 апб 6.4 (1987, 1992) и 8атЬгоок е! а1., кирга. Примеры строгих условий без каких-либо ограничений включают условия промывки при температуре на 12-20°С ниже высчитанной температуры исследуемого гибрида, например 2 х 88С и 0,5% 8Ό8 в течение 5 мин, 2 х 88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин; 0,1 х 88С и 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин и затем 0,1 х 88С и 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30-60 мин. Специалистам в данной области должно быть понятно, что строгость условий зависит также от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотиных зондов (10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. В случае смешанных зондов желательно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо раствора хлорида и цитрата натрия (88С). См. ЛикиЬе1, выше.

Термин соли означает как соли карбоксильных групп, так и соли с присоединением кислоты по аминогруппе химерного белка по этому изобретению или его аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть получены известными методами и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и тому подобные, и соли с органическими основаниями, полученные, например, при взаимодействии с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и тому подобные.

Соли с присоединением кислоты включают, например, соли с минеральными кислотами, такими как хлористо-водородная или серная кислоты, и соли с органическими кислотами, такими как уксусная или щавелевая кислоты. Все эти соли должны, конечно, обладать такой же активностью, что и химерный белок по этому изобретению или его аналоги.

Настоящее изобретение относится также к последовательностям ДНК, кодирующим вышеуказанный химерный белок по этому изобретению и его аналоги, а также к векторам ДНК, несущим такие последовательности ДНК для экспрессии в клетках подходящих млекопитающих, предпочтительно человека. Одним из вариантов вектора по этому изобретению является плазмида ρχΩΝΑ к1Ь-6Р/1Ь-6, включающая вектор рс^NΑ3 (НпуНгодеп), содержащий слитые последовательности к1Ь-6Р/1Ь-6, полученные под контролем промотора цитомегаловируса (СМУ).

Настоящее изобретение относится также к трансформированным клеткам млекопитающих, предпочтительно человека, клеткам, способным экспрессировать вышеуказанные белки по настоящему изобретению. Одним из вариантов таких трансформированных клеток являются клетки почки эмбриона человека 293 (НЕК 293,

АТСС СВЬ 1573), трансфецированные рс^NΑ

81Ь-6Р/1Ь-6, которые секретируют слитую химеру к1Ь-6В/1Ь-6 в виде гликопротеина с молекулярной массой 85 кДа.

Еще один вариант осуществления изобретения включает плазмиду рс^NΑ к1Ь-6К/Ь/1Ь-6, которая отличается от вышеуказанной ]χΩΝΑ к1Ь-6В/1Ь-6 вставкой в сайт ЕсоВ1 коротких линкеров, кодирующих 10 дополнительных аминокислот. Можно ввести целый ряд последовательностей различной длины, чтобы оптимизировать расстояние между к1Ь-6В. и 1Ь-6.

В изобретение входит также химерный белок, в котором часть 1Ь-6 предшествует к1Ь-6В. (как это показано на фиг. 11).

Настоящее изобретение далее относится к способу получения и очистки химерного белка по этому изобретению или его аналогов, который включает выращивание вышеуказанных трансформированных клеток в условиях, приемлемых для экспрессии и секреции химерного белкового продукта в культуральную среду и последующую очистку секретированного белка иммуноаффинной хроматографией с использованием моноклональных антител 34.4 против к1Ь-6В, как это описано в нижеследующих примерах 2 и 5.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента химеру к1Ь-6К/1Ь-6, ее аналоги, смеси или соли и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Одним из вариантов фармацевтической композиции по этому изобретению является фармацевтическая композиция для усиления действия 1Ь-6, для лечения разных видов рака, для стимуляции приживаемости клеток при трансплантации костного мозга, для усиления гемопоэза, в частности тромбоцитопоэза, для лечения неврологических нарушений и болезней печени, и для других целей, связанных с использованием 1Ь-6 или родственных цитокинов.

Фармацевтические композиции по этому изобретению получают в виде лекарственных форм, смешивая химерный белок или его аналоги с физиологически приемлемыми носителями и/или стабилизаторами, и/или наполнителями, и получают дозированную форму, например, с помощью лиофилизации в дозирующих пробирках. Способом введения может быть любой известный способ введения, приемлемый для аналогичных средств, и зависит от состояния заболевания, которое нужно лечить, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, путем местной инъекции, местного применения или непрерывного вливания и т. д. Количество вводимого активного соединения зависит от способа введения, заболевания и состояния пациента. Местные инъекции, например, требуют меньше го количества белка в расчете на массу тела, чем внутривенное вливание.

Настоящее изобретение относится также к применению химерного белка по этому изобретению, его аналогов или смесей для лечения разных видов рака, для стимуляции приживаемости клеток при трансплантации костного мозга, для усиления гемопоэза, особенно тромбоцитопоэза, для лечения неврологических нарушений, для защиты тканей печени у субъектов, страдающих некрозами, вызываемыми химическими веществами (например, тетрахлорметаном, алкоголем, парацетамолом) или другими причинами (например, вирусной инфекцией, хирургическим вмешательством) и для других целей, связанных с использованием 1Ь-б или родственных цитокинов. Аналогичным образом настоящее изобретение относится также к химерному белку, его аналогам или смесям, применяемым для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения вышеуказанных нарушений или в соответствии с рассмотренными выше показаниями.

Помимо вышеуказанных способов лечения химеру и/или кодирующую ее ДНК можно также использовать для выполнения процедур ехνίνο и генотерапии.

Настоящее изобретение далее более подробно описывается в нижеследующих примерах, не ограничивающих его объем, и на прилагаемых чертежах.

Пример 1. Конструирование экспрессирующего вектора химеры ДБ-бКбУаЫБ-б.

На фиг. 1 изображен схематический график последовательности технологических операций, выполняемых для конструирования экспрессирующего вектора, несущего последовательность, кодирующую химерный белок к1ЬбК.8Уа1/1Ь-б, включая все начальные и промежуточные векторы, разные реагенты и стадии реакции. Эта методика конструирования включает методы, хорошо известные в области конструирования выбранных экспрессирующих векторов (см., например, 8атЬтоок е! а1., 1989). Суть этой методики можно коротко описать следующим образом.

Библиотеку кДНК, полученную из клеток Τ47Ό карциномы молочной железы человека, клонируют в бактериофаге лямбда (λ) §111 и тестируют олигонуклеотидными зондами, выделенными из последовательности Ш-бК, по методу Ямасаки и др. (Уатакак е! а1., 1988). Выделяют один клон кДНК λ§111. который имеет полную последовательность, кодирующую 1ЬбК человека. Вставку вырезают из λ§ΐ11 с помощью ЕсоК! и клонируют в сайте множественного клонирования (МС8) фагимида Е.со11 В1ие 8спр1 рВ8/8К (81га1адепе С1ошид 8ук!етк, БаЭо11а, СаШотша). Плазмиду рВ8/8К-1Ь-бК (фиг. 1) разрезают ЕсоК1, дефосфолируют и вновь разрезают ЕсоКУ, чтобы выделить 5'-фрагмент

Ш-бК, состоящий из 959 пар оснований (п.о.) и заканчивающийся в сайте ЕсоКУ рецептора 1БбК (координата 1203). Этот фрагмент, экстрагированный электрофорезом в агарозном геле, клонируют в новом векторе рВ8/8К, открытом в ЕсоКУ сайта МС8 (рВ8/8К-к1Б-бК-КУ на фиг. 1).

Вышеуказанную, ранее полученную ДНК рВ8/8К-1Б-бК подвергают полимеразной реакции синтеза цепи (РСК), чтобы амплифицировать фрагмент длиной 3б8 п.о. между верхней затравкой 1137-115б и нижней затравкой 15051488. Нижнюю затравку синтезируют с помощью сайта ЕсоКГ, который расположен сразу же после кодона валина-35б 1Б-бК (см. фиг. 1), так как ранее было установлено, что этот остаток валина является аминокислотой с карбоксильным концом природной формы растворимого кГБ-бК, выделяемой в моче человека (Иосюк е! а1., 1990; Ой е! а1., 199б; принадлежащий обоим авторам патент США № 521б128 и европейский патент № ЕР 413908 В1). Продукт полимеразной реакции синтеза цепи разрезают ЕсоКУ и ЕсоКГ и лигируют в рВ8/8К-к1Б-бК-КУ между сайтом ЕсоКУ 1Б-бК и сайтом ЕсоКГ МС8 (фиг. 1). Полученную плазмиду рВ8-к1Б-бК-0Уа1-К1 укорачивают, чтобы удалить 5'-концевые нетранслированные последовательности путем лигирования сайта ΗίηάΙΙΙ МС8 с сайтом Исо1 у пары оснований 410 1Б-бК (оба сайта сначала дефосфолируют), что позволяет получить рВ851Б-бК-8Уа1-К1-Ысо1 (фиг. 1).

Последовательность 1Б-б выделяют из плазмиды рККв2-7, которая была сконструирована аналогично описанному способу (Сйеи е! а1., 1988) путем вставки кДНК 1РЫ-в2/1Б-б, вырезанной ΕκίΝΙ (211Ьегк!еш е! а1., 198б), в сайт ЕсоКГ экспрессирующего вектора рКК223-2 Е.сой (Рйаттааа, иррка1а, 8^е0еи), используя синтетический олигонуклеотид с сайтом ЕсоКГ, за которым следует кодон метионина и кодон пролина-29 ГБ-б, заканчивающийся в сайте 1ΜΝΊ (ЕсоКП). кДНК-вставка рККв2-7 1Б-б заканчивается через 7 пар оснований после терминирующего кодона в сайте И1а1У, за которым через 11 пар оснований расположен сайт ΗίηάΙΙΙ вектора рКК-223-3 (фиг. 1). ДНК р1<1<[32-7 разрезают ΗίηάΙΙΙ, дефосфолируют и вновь разрезают ЕсоШ, после чего кДНК Ш-б вставляют в рВ8-5I^-бК-βУа1-КI-NсοI для слияния зрелой последовательности К-б (начинающейся у пролина-29) с Ш-бК сразу же после валина-35б, при этом они разделены всего 3 кодонами (С1и-РйеМе!). Полученную плазмиду рВЗ/ЗК-кШ-бКЛБб (фиг. 1) вновь разрезают в сайтах 8аЛ и ИоП МС8 и эту вставку клонируют в сайте ЕсоКУ рсЭИА3 (ΙιτνίΙ годеи Сотротайои, 8аи П1едо, Сай£отша). Полученная плазмида рС^NА3-5I^бКЛБ-б (фиг. 1) содержит вставку внизу от сильного промотора цитомегаловируса (СМУ), за которой следует сайт полиаденилирования, обеспечивающий эффективную транскрипцию химеры 5ΙΩ-6Βδν;·ι1/ΙΩ-6. Сохранение 5'-конца δΙΩ-6Ρ в химере гарантирует, что при экспрессии в клетках млекопитающих функция сигнального пептида и процессирование Ν-конца химерного белка будут такими же, как у природного δΙΩ-6Ρ.

Как указывалось выше, преимуществом конструкции 8ΙΩ-6Βδ-ν;·ι1/ΙΩ-6 является то, что она получена в результате слияния природных форм δΙΩ-6Ρ и ΙΩ-6 в том виде, как они существуют в организме человека, без использования чужеродных полипептидных последовательностей. Однако сохранение сайта ЕсоК! в конструкции 5ΙΩ-6Β5να1/ΙΩ-6 (фиг. 1) позволяет легко ввести сегменты линкерного полипептида между частями δΙΩ-6Ρ и ΙΩ-6. Кроме того, была сконструирована еще одна конструкция с линкерной последовательностью длиной 13 аминокислот 61и-Рйе-61у-Л1а-61у-Ьеи-Уа1-Ьеи-61уС1у-С1п-РНе-Ме1, введенной между Уа1-356 δΙΩ6К и Рго-29 ΙΩ-6 ^Ш-6КДУаШШ-6).

Пример 2. Экспрессия химеры δΙΩ6Ρ.δν;·ι1/ΙΩ-6 в клетках человека.

Осуществляя стандартные методы культивирования клеток млекопитающих, трансфекции клеток и анализа трансфецированных клеток в отношении экспрессии вновь введенной последовательности ДНК, предназначенной для экспрессии (для ознакомления с этими методами см., например, 8атЬгоок е1 а1., 1989), вышеуказанную плазмидную конструкцию (пример 1) используют для трансфекции клеток человека и оценивают степень ее экспрессии. Вкратце используют следующие методики.

Клетки НЕК 293 человека (АТСС СКТ 1573, трансформированные первичные клетки почки эмбриона человека) трансфецируют ДНК плазмидной конструкции ρί.ΌΝΑ3-δΙΩ-6Κ/ΙΩ-6 (описанной в приведенном выше примере 1). Культуры НЕК 293, находящиеся в логарифмической фазе роста, обрабатывают трипсином и высевают в 9 см чашки Нунка (2,5 х 10⁶ клеток/чашку). На следующий день осуществляют трансфекцию 10 мкг ДНК ρί.ΌΝΑ3-δΙΩ-6Κ/ΙΩ-6 по способу осаждения СаРО₄ (8атЬгоок е1 а1., 1989), через 1 ч среду заменяют средой ΌΜΕΜ, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (ТС8), и продолжают культивирование в течение еще 16 ч. После замены этой среды средой ΌΜΕΜ, содержащей 2% ТС8, секретированные белки собирают в течение двух последующих периодов по 48 ч. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием со скоростью 1000 об./мин в течение 10 мин и супернатант анализируют по методу ΩΩΙ8Α для δΙΩ-6Κ, используя поликлонильные антитела кролика против δΙΩ-6Ρ и мыши МсАВ 17.6 (Томск е1 а1., 1991). Установлено, что концентрация, равная 1,2 мкг/мл эквивалентов δΙΩ-6Κ является показателем очень эффективной экспрессии химерного белка δΙΩ6Κ/ΙΩ-6 в трансфецированных клетках человека.

Иммуносорбционную очистку секретированного химерного белка (δΙΩ-6Κ/ΙΩ-6) осуществляют моноклональным антителом 34.4, специфичным в отношении эпитопа во внеклеточном домене δΙΩ-6Ρ человека (Томск е1 а1., 1991; Найт1 е1 а1., 1995). Клетки гибридомы 34.4 выращивают в брюшной полости мышей и иммуноглобулиновую (Ιβ) фракцию получают из асцитной жидкости осаждением сульфатом аммония. Для иммобилизации МсАВ 34.4 используют МйдеМО (Вю-Каб Ωιώδ, КюНтопТ СайГогша) (15 мг Ιβ, связанного с 1 мл ΑΓΓ^1-10). Супернатанты, содержащие белки, секретированные из клеток НЕК 293, трансфецированных ρС^NЛ3-δI^-6Β/I^-6, адсорбируют на колонках МсАВ 34.4 (0,3 мл колонка для 15 мл супернатанта). После промывки физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВ8) связанные белки элюируют 25 мМ лимонной кислоты, рН 2.5, сразу же нейтрализуют 1М раствором буфера на основе НЕРЕ8, рН 8,5 и диализуют в течение ночи (примерно 8-12 ч) против РВ8.

Анализ подвергнутого иммуносорбционной очистке белка электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия показывает наличие характерной полосы белка, окрашенной кумасси голубым (фиг. 2). Молекулярная масса этого белка равна 85 кДа, как это и предполагалось в результате слияния гликозилированных форм δΙΩ-6Κδνη1 (60 кДа по определению ОН е1 а1., 1996) и гликозилированного ΙΩ-6 (23-26 кДа по определению 211Ьега1ет е1 а1., 1986). Аминокислотная последовательность δΙΩ-6Β/ΙΩ-6 состоит из 543 аминокислот, которые после процессирования сигнальных пептидов позволяют предсказать белок длиной 524 аминокислоты или с молекулярной массой около 58 кДа (фиг. 3). Гораздо больший размер химеры δΙΩ-6Β/ΙΩ-6, полученный из рекомбинантной ДНК в клетках человека, свидетельствует о том, что гликозилирование охватывает значительную часть молекулы.

Пример 3. Подавление химерой δΙΩ-6Β/ ΙΩ-6 роста и дифференциации метастатических меланомных клеток.

Клон Г10.9, выделенный из меланомных клеток В16, образует чрезвычайно метастатические опухоли у мышей С57В1аск/6, которые вызывают гибель животных от легочных метастазов в течение 2-3 месяцев (Ка1х е1 а1., 1995). Добавление химерного белка δΙΩ-6Ρ/ΙΩ-6 в культуру клеток Г10.9 вызывает существенное морфологическое изменение в клетках и подавляет их рост (фиг. 4). Клетки Г10.9, обработанные этой химерой, вытягиваются, у них появляются выступающие дендритные выросты, напоминающие веретенообразную дифференцировку меланоцитов или глиальных клеток эмбриона.

Рост клеток определяют в количественном отношении через 4 дня после посева 3 х 10³ кле25 ток в лунки 9б-луночного микропланшета в 0,2 мл среды ВРМ1 1б40, содержащей 10% РС8. Клетки выдерживают в 12,5% глутаровом альдегиде в течение 30 мин, промывают в воде и окрашивают 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 30 мин. После тщательной промывки и сушки краситель экстрагируют 10% уксусной кислотой и определяют оптическую плотность при 540 нм. Эта химера подавляет рост клеток в зависимости от дозы до полного подавления их роста даже при такой низкой концентрации, как 10 нг/мл химерного белка (р85) (фиг. 5). Оба химерных белка о1ЬбВ8Уа1/1Ь-б и 51Ь-бВ0Уа1/Ь/1Ь-б (химера с более длинным линкером между частями оГЙ-бВ и 1Ьб, см. пример 1) обладают одинаковой активностью. Этот результат также показывает, что длина линкерного пептида между частями о1ЬбВ и 1Ь-б в этой химере не оказывает влияния на активность химеры, так как химера о1ЬбВ8Уа1/1Ь-б имеет очень короткий линкер длиной 3 аминокислоты, а химера 51Ь-бВ8Уа1/Ь/1Ьб имеет более длинный линкер, состоящий из 13 аминокислот, но обе эти химеры обладают практически одинаковой активностью подавления роста метастатических клеток. В отличие от этого, ни 1Ь-б, ни о1Ь-бВ0Уа1 в отдельности не подавляют рост меланомных клеток (фиг. б), что свидетельствует об уникальной активности химерного белка 81Ь-бВ/1Ь-б (р85). Чтобы получить аналогичный эффект, необходимо использовать смесь 200-400 нг/мл 1Ь-б и 125 нг/мл о1Ь-бВ0Уа1 (фиг. б). При вычислении в молярной концентрации для максимального подавления роста клеток Р10.9 необходимо 7,5 пМ 1Ь-б и 2 пМ 51Ь-бВ6Уа1 по сравнению всего с 0,12 пМ химеры о1Ь-бВ/1Ь-б.

Активность химерного белка оГЙ-бВЛЬ-б р85 по подавлению роста клеток исследуют во время иммуносорбционной очистки на колонках МсАВ 34.4 (см. пример 2). Характер активности соответствует интенсивности полосы р85, наблюдаемой в разных фракциях, полученных при выполнении электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, результаты которого приведены на фиг. 2.

Пример 4. Роль химеры 51Ь-бВ/1Ь-б в приживаемости трансплантированных клеток костного мозга.

Приживаемость кроветворных стволовых клеток из костного мозга человека можно исследовать после их трансплантации мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СШ) (Уогтоог е! а1., 1994). Мышей 8СШΝΟΌ подвергают облучению сублетальными дозами и инъецируют в хвостовую вену 3 х 10⁵ клеток СЭ34' костного мозга человека. До инъецирования очищенные клетки СЭ34' выдерживают в течение 3 дней в жидких культурах с разными комбинациями цитокинов. Через один месяц мышей умерщвляют и удаляют у них кости для получения клеток костного мозга. Приживаемость клеток человека у мышейреципиентов δΟΩ-ΝΟΩ определяют по методу гибридизации саузерн-блоттингом с повторяющейся ДНК человека.

Установлено, что фактор стволовых клеток (8СР, о!ее1-фактор или скй-лиганд) и Р1!3-лиганд (лиганд рецептора тирозинкиназы П13/Пк2) имеет важное значение для выживаемости и пролиферации большинства первичных полипотентных кроветворных стволовых клеток, способных в течение длительно действующему приживлению в костном мозге реципиента (МсКеппа е! а1., 1995). Как показано на фиг. 7, эти два фактора сами по себе являются недостаточными для стимуляции приживаемости клеток человека в костном мозге мышейреципиентов δΟΌ-ΝΟΌ. Чтобы обнаружить приживаемость клеток на значимых уровнях, необходимо добавить химерный белок о1ЬбВЛЬ-б. Химера о1Ь-бВ/1Ь-б, добавляемая в количестве 100 нг/мл, является гораздо более активной, чем выделенные отдельно 1Ь-б (50-200 нг/мл) и о1Ь-бВ (125-1250 нг/мл) (фиг. 7). Необходимость использования химеры оГЙ-бВЛЬ-б указывает на то, что этот белок имеет важное значение для выживаемости и пролиферации некоммитированных полипотентных кроветворных стволовых клеток, которые приживаются в костном мозге и создают в нем новую популяцию клеток, из чего следует, что этот белок может быть полезен в случае клинических операций по трансплантации костного мозга.

Впервые продемонстрировано, что химера оГЙ-бВ/ГЙ-б обладает по крайней мере двумя недавно обнаруженными видами активности:

(ί) при добавлении вместе с факторами 8СР и Р1!3-лигандом в кроветворные первичные недифференцированные клетки человека эта химера стимулирует их выживаемость и пролиферацию; и (ίί) эта химера является активной (и, очевидно, основной) в модели ш νίνο трансплантации костного мозга человека мышам с иммунодефицитом.

Пример 5. Химера о1Ь-бВ/1Ь-б активна на максимально очищенных первичных кроветворных стволовых клетках.

Мононуклеарные кровяные клетки из пуповины человека фракционируют, отделяя мононуклеарные клетки низкой плотности (ΝΜί.') в аппарате РюоП-Расще (Рйагтааа Вю1ес11. Ирроа1а, 8^ебеп), и обрабатывают мининабором МЛС8 (МШпеу Вю1ес, Вегфосй 61аб-Ьасй, Сегтапу) для получения популяции клеток СЭ34' 80% чистоты. Эти клетки пассируют на иммобилизованном моноклональном антителе против СЭ38 или сортируют по методу сортировки активированных флуоресценцией клеток, в результате чего получают популяцию ί.Ό34'ί.Ό38^-, соответствующую примерно 0,1% исходных клеток. Эти очищенные стволовые клетки (20000 клеток) помещают в суспензионные культуры в 0,5 мл среды ЯРМ1, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (ЕС8), 1% бычий сывороточный альбумин с 50 нг/мл фактора стволовых клеток (8СЕ) и 100 нг/мл 11!3-лиганда (ЕЬ) (оба вещества предоставлены фирмой Я&Б 8у8!ет8, М^ηηеарο1^8, ΜΝ). В половину культур добавляют 100 нг/мл химеры 81Е-6Я/1Ь-6, остальные культуры выращивают без этой химеры. Культуры инкубируют при 37°С в 5% СО₂ в течение 6 дней. Количество репопулирующих клеток костного мозга определяют путем инъецирования (внутривенно) всех клеток из культур ίη νί!το мышам ЫОБ-8С1Б, подвергнутым облучению сублетальными дозами. Мышей содержат в стерильных условиях. Через 6 недель мышей умерщвляют и удаляют костный мозг из длинных костей. Клетки костного мозга (ВМ) культивируют на пластинах из полутвердой 0,9% метилцеллюлозы, содержащих 30% ЕС8, 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 50 нг/мл 8СЕ, 5 нг/мл 1Ь-3, 5 нг/мл СМ-С8Е, 6 мк/мл эритропоэтина (все вещества предоставлены фирмой Я&Б 8у8!ет8). Культуры содержат также сыворотку человека, которая предотвращает рост колоний мышей. Результаты (табл. IV) показывают, что добавление химеры 81Е-6К/1Ь-6 к суспензионным культурам вызывает 30-50-кратное увеличение колониеобразующих клеток (СЕИ) человека у трансплантированных мышей по сравнению с 8СЕ и ЕЬ, используемыми отдельно. Это указывает на большое увеличение количества 8С1Б-репопулирующих стволовых клеток, присутствующих в суспензионных культурах на 6-й день по сравнению с 0-м днем. При отсутствии химеры 81Е-6Я/1Ь-6, δ СЕ и ЕЬ не вызывают увеличения количества стволовых клеток при нахождении в суспензионной культуре в течение 6 дней. ДНК клеток костного мозга, выделенную у трансплантированных мышей ЫОБ/8С1Б, анализируют по методу саузерн-блоттинга, как это описано в примере 4. Количество выделенной ДНК человека в 10 раз больше у мышей, которым были введены клетки, культивированные с химерой, по сравнению с мышами, которым были введены клетки без химеры.

Колониеобразующие клетки-предшественники из костного мозга мышей ЫОБ/8С1Б, как показано в табл. IV, увеличивают количество кроветворных клеток разных миелоидных линий (макрофаг и гранулоцит), а также эритроидных и лимфоидных линий (например, СБ 19', СБ56⁺), только тогда, когда кровяные клетки человека были культивированы с химерой 81Ь6Я/1Ь-6 до трансплантации.

Таблица IV

Стволовые клетки человека, способные репопулировать костный мозг мышей ЫОБ/8С1Б

Добавление в суспензионную культуру клеток СП34+СЭ38· человека из пуповинной крови	Дни культивирования	Количество колоний кроветворных клеток человека, образованных из костного мозга, тр ансплантиров анного мышам ΝΟΏ/δΟΏ
	0	4
8СЕ+ЕЬ	6	2-3
8СЕ+ЕЬ+81Ь-6й/1Ь-6	б	50-100

В дополнительных экспериментах производится сравнение влияния 81Е-6Я/1Ь-6 на популяцию клеток СБ34⁺СБ38⁺ пуповинной крови и на хорошо очищенные стволовые клетки СБ34⁺СБ38^-. Размножение ίη νίίτο под действием 81Е-6К/1Ь-6 хорошо очищенных клеток происходит гораздо интенсивнее, чем менее очищенных клеток (табл. V). Это свидетельствует о том, что предпочтительной мишенью для размножения 81Е-6Я/1Ь-6 являются прежде всего первичные стволовые клетки.

Таблица V

Размножение ίη уйго кроветворных стволовых клеток

Посеянная популяция клеток (20000 клеток)	Количество клеток на 6-й день под действием 8С + ГЬ	Количество клеток на 6-й день под действием 8С+ГЬ+ 81Ь-6К/1Ь-6
Эксперимент 1
С1)34'С1)38'	780000	675000(х 0,86)
СП34+СЭ38·	42000	153000(х 3,6)
Эксперимент 2
С1)34'С1)38'	330000	507000(х 1,5)
СП34+СЭ38·	3000	18000(х 6,0)

Сохранение ίη уйго репопулирующей активности костного мозга измеряют по увеличению длины суспензии культур хорошо очищенных стволовых клеток СБ34⁺СБ38^- до инъецирования мышам ЫОБ/8С1Б. Приживаемость клеток оценивают на основании относительного содержания ДНК человека в костном мозге мышей-реципиентов через 6 недель после внутривенного введения культивированных клеток. При добавлении 81Е-6Я/1Ь-6 к 8СЕ и ЕЬ в культуры клеток высокая приживаемость (>1% ДНК человека) наблюдается даже через две недели культивирования, причем приживаемость является выше, чем в некультивированных клетках, В отличие от этого, эксперименты с культурами, содержащими 8СЕ, ЕЬ, 6М-С8Е, 1Ь-3, показывают, что 8С1Б-репопулирующие клетки не сохраняются через одну неделю культивирования (Вйа!а М. е! а1., ГЕхр.Мей. 186, 619-624, 1997).

Эти результаты свидетельствуют о том, что 81Е-6Я/1Ь-6 стимулирует размножение и сохранение первичных стволовых клеток человека, способных приживаться в костном мозге реципиента. Стволовые клетки, размножаясь, остаются активными в недифференцированном состоянии. Химера 81Е-6Я/1Ь-6 является новым средством культивирования приживающихся кроветворных клеток. Весьма вероятно, что эта химера позволит использовать ретровирусные векторы для введения генов в приживающиеся стволовые клетки в соответствии со схемой генотерапии. До настоящего времени такая обработка стволовых клеток человека была невозможна, так как эти первичные клетки не сохранялись ίη νίίΓΟ в фазе клеточного цикла, как это необходимо для интеграции ретровирусной ДНК. Химера ЛЬ-бКЛЬ-б позволяет решить эту проблему.

Пример б. Получение химеры ГЬ-бК/ГЬ-б в клетках СНО.

ДНК плазмиды ροΌΝΑ3 ЛЬ-бК/ГЬ-б, показанную на фиг. 1, котрансфецируют в клетки яичника китайского хомячка (СНО) вместе с ДНК плазмиды рИНЕК по методу Могу с1 а1. (ДНК 5, 181-193, 198б). Вместе с другими трансфектантами, выращиваемыми в 50 нМ метотрексата, выделяют клон Ь12-[1Ь-бКЛЬ-б]. Установлено, что этот клон остается устойчивым на протяжении нескольких пассирований, поэтому полуконфлюэнтные культуры обычно секретируют в культуральную среду 2,5 мкг/мл химеры ГЬ-бК/ГЬ-б.

Для очистки химеры ГЬ-бК/ГЬ-б 3,25 л среды из культур клона Ь12 в 2% бычьей сыворотки концентрируют до 200 мл. Полученное вещество адсорбируют на 18 мл колонке с моноклональным антителом 34.4 против ЛЬ-бК человека, связанного с гранулами АШде1 10, и элюируют известным способом (ΝονίοΚ е1 а1., Нуйпбота, 10, 137-14б, 1991). Элюат, содержащий 25 мМ лимонной кислоты, сразу же нейтрализуют буфером на основе ΗΕΡΕδ 1, рН 8,б. Белки концентрируют на мембране Ат1соп для вырезания фрагмента с молекулярной массой 10 кДа до конечной концентрации 1 мг/мл. В результате выполнения электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия обнаружена одна полоса с молекулярной массой 85 кДа, соответствующая химере ГЬ-бК/ГЬ-б. Гликозилирование подтверждено уменьшением размера после обработки гликозидазой (Воейппдег, Маппйеип). Установлено, что биологическая активность СНО-продуцированной химеры ГЬбК/ГЬ-б остается стабильной в течение по крайней мере 5 месяцев при 4°С. Как правило, химеру хранят при -70°С.

Пример 7. Сродство химеры ГЬ-бК/ГЬ-б к др130.

СНО-продуцированную химеру ГЬ-бК/ГЬ-б и смесь ГЬ-б и ЛЬ-бК человека сравнивают в отношении связывания с растворимой формой др130 (§др 130), которая является второй цепью системы рецепторов для ГЬ-б (см. раздел Предпосылки изобретения). 9б-Луночный титрационный микропланшет (Мтс) покрывают моноклональным антителом против др130 человека и добавляют 50 нг/мл §др130 (оба вещества предоставлены фирмой К&И 8уЛет§, МшпеароШ). Химеру ГЬ-бК/ГЬ-б промывают в физиологиче ском растворе с фосфатным буфером и вводят в разные лунки в разных концентрациях от 0,1 до 50 нг/мл. В отдельные лунки добавляют гйиГЬ-б (Аге§-8егопо, 6еηеνа) в количестве 500 нг/мл вместе с ЛЬ-бК5Уа1 человека в концентрациях от 2 до 500 нг/мл. Культуры инкубируют в течение ночи при 4°С и добавляют поликлональное антитело кролика против ГЬ-бК (Ой е1 а1., СуЮкте, 8, 401-409, 199б), а затем Гд козы против кролика, конъюгированный с пероксидазой хрена, которую обнаруживают цветной реакцией (81дта, 8бЬош5). На фиг. 8 показан график Скэтчарда полученных результатов. Установлено, что сродство химеры ГЬ-бК/ГЬ-б к др 130 в 4 раза выше, чем у двух частей молекулы, добавляемых отдельно (б,3 х 10^-11М по сравнению с 2,б х 10^-10М). Этот результат соответствует ожидаемому и объясняет более высокую активность химеры в отношении меланомных и кроветворных клеток по сравнению с комбинацией ГЬ-б + ЛЬ-бК (фиг. 9 и пример 4).

Пример 8. Химера ГЬ-б/ГЬ-б защищает от гепатотоксичности.

Инъецирование мышам тетрахлорметана (СС1₄) вызывает обширный некроз печени, ведущий к гибели животных (81а1ег Т.Е. е1 а1., Рйбок, Тгап8.К.8ос.Вю1.8сЬ, 311, б33-б45, 1985). Когда мышам с генетическим дефицитом ГЬ-б ЛЬ-б^-'^-) вводят относительно низкие дозы СС1₄ (2-3 мл/кг массы тела) в виде внутрибрюшинной инъекции, смертность через 24 ч составляет примерно 70% (фиг. 10). Инъецирование СНО-продуцированной химеры ГЬ-бКЛЬб за 1 ч до введения СС14 и через 4 ч после введения СС14 защищает животных, и через 24 ч не наблюдается ни одного случая гибели животных. В отличие от этого, инъецирование свободного гйиГЬ-б не оказывает никакого действия (фиг. 10). Химера ГЬ-бК/ГЬ-б является эффективной в дозах, равных 2-3 мкг/инъекцию, что в молярном отношении в 10 раз меньше, чем неэффективная доза ГЬ-б. При более высоких дозах СС1₄ (например, 3,5 мл/кг на фиг. 10) эта химера также оказывает защитное действие, причем смертность в этом случае ниже, чем при введении ГЬ-б или без введения цитокина. Различие между показателями смертности у мышей, которым была введена эта химера и которым она не была введена, при одинаковом воздействии СС1₄, является значимым при р<0,01. Гистологическое исследование срезов печени, окрашенных гематоксиллинэозином, подтверждает, что СС1₄ вызвал некроз тканей и что химера ГЬ-бКЛЬ-б защищает гепатоциты от токсического действия этого химического вещества (не показано).

Химеру ГЬ-бК/ГЬ-б можно использовать для защиты тканей печени у пациентов, страдающих некрозом вследствие воздействия химических веществ (например, алкоголя, парацетамола) или по другим причинам (например, вирусный гепатит).

Пример 9. Конструирование и активность химеры ^-6/8^-6^^^1.

Была сконструирована химерная молекула, в которой часть ГЬ-6 расположена в Ν-концевой области и часть 8^-6^ находится в С-концевой области. Плазмиду ρΕδ^Λ^ΚδΥαΙ вырезают в сайте 8аи3а (1086 п.о.) и в сайте НшбШ вслед за терминирующим кодоном после Уа1-356 (см. пример 1). Линкер, содержащий три сайта рестрикции: 8реС 8таI и ВатШ, синтезирован следующим образом:

8ρеI 8таI ВатН1

5' СТ ЛОТ 666 ССС 666 6Т6 6С6 66

А ССС 666 ССС САС С6С ССС ТА6 5' (8Е0 ГО № 2)

Сайт 8аи3а 8^-6^ лигируют с ВатШ линкера и клонируют в сайте множественного клонирования плазмиды В1ие8СГ1р1 рВ8 8К. Последовательность Ш-6 амплифицируют полимеразной реакцией синтеза цепи из ДНК рККв2-7, используя затравки (инициирующий кодон подчеркнут)

8ρеI

Верхняя 5' 6А СТА 6ТА 6СТ АТ6 ААС ТСС ТТС ТС (8|^;(.) ГО № 3)

НаеШ

Нижняя 5' А6 66С САТ ТТ6 СС6 АА6 А6С С (8Е0 ГО № 4)

Продукт полимеразной реакции синтеза цепи, вырезанный 8ρеI и НаеШ, вводят между сайтом 8ρеI и 8таI вышеуказанного линкера. Другой линкер ВатШ-Ы^ с внутренним сайтом 8таI синтезируют следующим образом:

8таI

5' 6АТ СС6 66С 66С 666 66А 666 666 ССС 666 С[№соГ] [ВатШ] 6С СС6 СС6 ССС ССТ ССТ ССС 666 ССС 66Т АС 5'(8ЕО ГО ΝΟ: 5)

Эту последовательность клонируют между ВатШ предыдущего линкера и Ν№ 1464 последовательности №-6^. Фрагмент кЕ-6Е от 8таI 867 до 1464 вводят между 8таI второго линкера и Ν№ I^-6Β. Полученную химерную ДНК секвенируют и вновь клонируют в ρί.ΌΝΛ3 для экспрессии в клетках НЕК 293 человека. Аминокислотная последовательность этой химеры 3е ^-6-^-6^ показана на фиг. 11 (линкер подчеркнут). Химеру 3е очищают аффинной хроматографией на моноклональном антителе против Ш-6 (по методу Ыоуюк е( а1., НуЬпбота 8, 561-567, 1989). Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия позволяет выявить полосу, соответствующую молекулярной массе 75 кДа.

Биологическая активность химеры 3е ГЕ-6№-6^. направленная на подавление роста меланомных клеток Е10.9, показана на фиг. 12. Эта химера обладает выраженной активностью при сравнении с химерой IИ-6^6 И-6 (препарат 1-3), которое выполняют при осуществлении того же эксперимента, хотя для 50% подавления роста ее необходимо использовать в большем количестве.

Были получены два мутанта IИ-6^6 И-6, в которых аминокислоты Н18-280 и А8р-281 части №-6^ химеры IИ-6^6 И-6 (фиг. 3) заменены соответственно 8ег и Уа1 путем мутагенеза по методу РСН (мутант 39 или НЭ) или А8П-230 дополнительно заменена А8р (мутант Ν4Ό). Как показано на фиг. 12, эти два мутанта почти не обладают активностью при сравнении с химерами ΣΕ-όΕ/ΣΕ-ό и ^-6-^-6^. Поскольку в Λ6Ε эти аминокислоты взаимодействуют с др 130, как показывают результаты моделирования молекулы (На11т1 е( а1., 1995), из этого следует, что химера 8^-6^/^-6 сохраняет этот важный сайт взаимодействия.

У химеры 3е ^-6^-6^ отсутствует иммуноглобулиноподобный домен [^-6Ε. который имеется в IИ-6 Ей И-6. Однако удаление Цдомена из IИ-6 Ей И-6 не уменьшает биологическую активность этой химеры в отношении клеток Е10.9. Связывание химеры 3е [^-6-[^-6Ε с др130 составляет примерно 30% от аналогичного показателя другой химеры №-/>^/№-6 (не показано). Такое более низкое связывание соответствует более слабому воздействию на рост меланомных клеток.

Эти результаты показывают, что блокирование карбоксильного конца кЕ-6 путем слияния через линкер с 8Ш-6Е сохраняет хорошую биологическую активность в этих новых химерах.

Ссылки

СНеп Ь, Могу Υ, Х11Ьег81е1п А апб Ееуе1 М. 6го\\111 шЫЬйюп о Г Нитап Ьгеа8( сагсшота апб 1еикет1а/1утрНота се11 1ше8 Ьу гесотЫпап! ш(егГегоп-Ье(а 2/Ш-6. Ргос. №1(1. Асаб.8ск И8А, 85: 8037-8041,1988.

С11егпа)оу8ку Υ, Могу Υ, СНеп Ь, Магк8 Ζ, Ыоуюк Ό, ЕиЫп8(еш М апб Ееуе1 М. ЕГПаеп( соп8(йиНуе ргобисНоп оГ Нитап йЬгоЬ1а81 1п1егГегоп Ьу 11ат81ег се118 (гашГогтеб \νί11ι (Не ΛΝ-β 1 депе Ги8еб (о ап 8У40 еаг1у ргото(ег. ЭМА, 3:297-308, 1984.

Е18сНег М, 6о1б8сНтй1 Σ, Ре8сНе1 С, ВгакепНоГГ ΣΡ6, Ка11еп К-Σ, \Уо11тег А, 6гоШпдег Σ апб Ео8е-1окп 8. А ЬюасНуе бе81дпег су (ок те Гог Нитап Нета1оро1еНс ргодепйог се11 ехраи8юп. №1(иге Вю1есНпо1оду 15: 142-145, 1997.

6апара(1и М.К., \Уе1/ег А.К., ВошеШпо 8., Вико\\'8к| Н.М., 6апара(Ы 8., Кгсе Т., Са8еу 6. апб Ка^атига К. Ее818(апсе (о [п(е^1еик^п-6 ш Нитап Ыоп-8та11 се11 1ипд сагсшота се11 1ше8: Ео1е оГ гесер(ог сотропеп(8. Се11 6го\\Н1 апб ΌίίГегепНаНоп, 7: 923-929, 1996.

На11т1 Н., Е18еп8(еш М., ОН Σ., Ееуе1 М. апб СНеЬа(Н Σ. Ерйоре рерйбе8 Ггот ш1ег1еикт-6 гесер(ог аЫсН шН1Ьй (Не дгоМН оГ Нитап туе1ота се118. Еиг. Су^окше №1ν., 6: 135-143, 1995.

Нйапо Т., Уа8ика\уа К., Нагаба Н., Тада Т., \Уа(апаЬе У., Ма(8иба Т., Ка8Ытига 8., №карта

К., Коуата К., патаки К., Т8ипа8а^а 8., 8ак1уата Е., Ма(8Ш Н., ТакаНага У., ТашдисЫ Т. апб

К1кЫто1о Т. Сотр1етеп1агу ΌΝΆ Гог а поуе1 1п1ег1еик1п (В8Р-2) (На( тйисек В 1утрНосу(ек (о ргойисе 1ттипод1оЬи1тк. №1иге, 234: 73-7б, 198б.

Н1гапо Т., Ма(кийа Т. апй Nака^^та К. 8ί§па1 (гапкйисбоп (НгоидН др130 (На( 1к кНагей атопд Не гесер(огк Гог (Не ί п1е г1еик1 п б ге1а(ей су (ок те киШатЛу. 8(ет се11к, 12:2б2-277, 1994.

Но11оуау С.1. АррНсабопк оГ гесотЬтап! ΌΝΆ (есНпо1оду ш (Не ргойисбоп оГ д1усоку1а(ей гесотЬшап! Нитап дгапи1осу!е со1опу к(тш1а(тд Гас(ог. Еиг. I. Сапсег, 30: 82-б, 1994.

КаНп М.А. апй Эе УеШк ί. Кеди1абоп оГ ап оНдойепйгосу(е ргодепйог се11 1те Ьу (Не т(ег1еикт-б ГатПу оГ су(октек. Ска, 12: 87-98, 1994.

Ка(х А., 8Ни1тап Ь.М., Рогдайог А., Кеуе1 М., Ре1йтап М. апй ЕкепЬасН Ь. АЬгодабоп оГ В1б те1апота те(ак(акек Ьу 1опд-(егт 1о\\-йоке 1п(ег1еикт-б (Негару. к 1ттипо(Нег. 13: 98-109, 1993.

Маск1е\\'1сх А., \У|/пего\\'1сх М., КоеЬ Е., №\\ак к, Рау1оукк1 Т., Ваитапп Н., НетлсН Р. апй Коке-йоНп 8. 1п(ег1еикт-б-(уре су (ок ί пек апй (Ней гесер(огк Гог депе (Негару оГ те1апота. Апп. Хеу Уогк Асай. 8ск, 7б2: 3б1-374, 1995.

МсКеппа Н.к, йе Упек Р., Вгаке1 К., Ьутап 8.Ό. апй Уййатк Э.Е. ЕГГес( оГ Г1(3 йдапй оп (Не ех у1уо ехрапкюп оГ Нитап СЭ34' Нета(оро1ебс ргодепйог се11к. В1оой 8б: 3413-3420, 1995.

Мигакапп М., Н1Ь1 М., №1када\уа Ν., №1дакауа Т., Уакикауа К., УаташкЫ К., Тада Т. апй К|кН|то(о Т. 1Ь-б тйисей НотойНпепхайоп о Г др130 апй аккоаа(ей асбгабоп оГ а (угокте ктаке. 8с1епсе, 2б0: 1808-1810, 1993.

№\тск Ό., Епд1етапп Н., ХУаИасН Ό., Ьейпег О., Кеуе1 М. апй КиЬтйет М. РппПсабоп оГ ко1иЬ1е су (ок те гесер(огк Ггот погта1 шгпе Ьу Ндапй-акйпйу апй ттшпоаПтНу сНгота(одгарНу. к СНгота(одг., 510: 331-337, 1990.

№\тск Ό., Епде1тапп Н., Кеуе1 М., Ьейпег О. апй КиЬтк(ет М. Мопос1опа1 апйЬоФек (о (Не ко1иЬ1е 1Ь-б гесер(ог: аГйпйу рппПсабоп, ЕЙ18А апй 1пН1Ь111оп о Г йдапй Ъшйшд. НуЬпйота, 10: 137-14б, 1991.

№\тск Ό., 8Ни1тап Ь.М., СНеп Ь. апй Кеуе1 М. ЕпНапсетеп( оГ т(ег1еикт-б су(ок(абс ейес! оп Нитап Ьгеак( сагстота се11к Ьу ко1иЬ1е 1Ь-б гесер(ог Ггот цппе апй геуегкюп Ьу топос1опа1 апНЬой1ек. Су(окте, 4: б-11, 1992.

ОН МУ., Кеуе1 М. апй СНеЬа(Н к А ко1иЬ1е т(ег1еикт-б гесер(ог 1ко1а(ей Ггот сопййюпей тейтт оГ Нитап Ьгеак( сапсег се11к 1к епсойей Ьу а йгЕГегепНайу крНсей тКЫА. САЧокте, 8: 401409, 199б.

ОН Ч-\У. Ехргеккюп оГ гесотЫпап! ко1иЬ1е Нитап т(ег1еикт-б гесер(огк апй апа1ук1к оГ (Ней йтсбопк. РН.Э. ТНек1к \Уе1/тапп 1пкбб.1(е оГ 8с1епсе (Кеуе1 М, кирегу1ког), 1997.

Раопекка С., Сга/1ат К., Ое8егю А., 8ауто К., С1аррош Ь., ЬаНтт А., 8айаб А.Ь., Тота(б С. апй СШЬейо С. Туо йШшс! апй тйерепйеп( кйек оп 1Ь-б (пддег др130 й1тег Гогтабоп апй к1дпа1Нпд. ЕМВО Е, 14: 1942-1951, 1995.

Кеуе1 М. Нок( йеГепке адатк( тГесбопк апй тПаттабопк: Ко1е о Г (Не пш1бй.тсбопа1 1ЬбЛЕЫ-в2 суЧокте. Ехрепепйа 45: 549-557, 1989.

8атЬгоок к, РгйксН Е.Р. апй Матабк Т. Мо1еси1аг с1ошпд: А 1аЬога1огу тапиа1. Со1й 8рппд НагЬог Ргекк, 1989.

8ш X., Ткпр К., Тапака К., Тарта 8., Мигаока К., ЕЫНага У., 1кеЬисН1 К., Уакикауа К., Тада Т., «Шитою Т. апй Nакайаΐа Т. Ср130 апй с-кй Цдпайпдк купегд|/е Гог ех у1уо ехрапкюп оГ Нитап ргтйбуе йеторо^е(^с ргодепйог се11к. Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 92: 2859-28б3, 1995.

Тада Т., Н1Ь1 М., Нйа(а У., Уатакак1 К., Уакикауа К., Ма(кийа Т., Нйапо Т. Апй «Шитою Т. 1п(ег1еикт-б (пддегк (Не аккоаабоп оГ йк гесер(ог уйН а рокк1Ь1е к1дпа1 (гапкйисег др130. Се11, 58: 573-581, 1989.

Уогтоог к, йар|йо( Т., РПшто Р., Кгкйоп С., Ра((егкоп В., Вгохтеуег Н.Е. апй Эюк ЕЕ. 8СЮ иксе ак ап ш угуо тойе1 оГ Нитап согй Ь1оой НетаЧорохекхк. В1оой се11к 20:31б-320,1994.

Уагй ЬЮ., Ноу1е(( С.Е, Э|ксо1о С., Уакикауа К., НаттасНег А., МогНх КЬ. апй 81тркоп Кй. Н1дН аГйпйу т(ег1еикт-б гесер(ог 1к а Нехатепс сотр1ех сопкШтд оГ (уо то1еси1ек еасН оГ йиейеикт-б, т(ег1еикт-б гесер(ог апй др130. к Вю1. СНет., 2б9: 2328б-23289, 1994.

Уатакакч К., Тада Т., Нйа(а У., Уауа(а Н., КауаткЫ У., 8еей В., ТашдисЫ Т., Нйапо Т. апй К1кН1то1:о Т. Оотпд апй ехргеккюп оГ (Не Нитап й'1(ег1еикт-б (В8Р-2/1п1егГегоп Ье(а-2) гесер(ог. 8с1епсе, 241: 825-828, 1988.

2йЬегк1ет А., Кидд1еп К., Когп Нй. апй Кеуе1 М. 8(гпс(пге апй ехргеккюп оГ оГ сЭХА апй депек Гог Нитап 1п1егГегоп-Ье1а-2, а йШтс! крес1ек тйитЫе Ьу дгоу1Н-кйти1а1огу су(октек. ЕМВО Е, 5: 2529-2537, 198б.

Список последовательностей ί1) Общая информация (ί) Заявитель (A) Название: Уеда Везеагсй апд ОеуейортепЕ Со. ЬСс1.

(B) Улица: Неггтапп 1пзЫСиЕе οί Зсгепсе, Р.О.В. 95 (C) Город: ВейоУОС (Е) Страна: 1згае1 (Израиль) (Г) Почтовый индекс: 76100 (С) Телефон: 972-8-9344093 (Н) Телефакс: 972-8-9470739 (A) Имя: ВЕУЕЬ, М1СЙе1 (B) Улица: ΒβίΛ Вгаг11 5, Кехгтапп 1пзС15ийе о£ Зсгепсе (C) Город: ВейоуоС (Е) Страна: 1згае1 (Израиль) (Г) Почтовый индекс: 76100 (A) Имя: СНЕВАТН, ДисВХН (B) Улица: Вейоу МИ1ег 13 (C) Город: ВейоуоЬ (Е) Страна: 1згае1 (Израиль) (Г) Почтовый индекс: 76284 (A) Имя: 1ΛΡΙΟΟΤ, Тзуее (B) Улица: Вейоу Вохег 6 (C) Город: Νβδδ-Ζίοηβ (Е) Страна: 1згае1 (Израиль) (Г) Почтовый индекс: 74046 (A) Имя: КОЬЬЕТ, ΟγϊΕ (B) Улица: Вейоу Ватай Сйеп 14 (C) Город: ВагсаЬ Сап (Е) Страна: 1згае1 (Израиль) (Г) Почтовый индекс: 52232 (ίί) Название изобретения: Химерный белок растворимого рецептора интерлейкина-6/лиганда, его аналоги и способы применения (Ш) Количество последовательностей: 8 (ίν) Компьютерные данные:

(A) Тип носителя: гибкий диск (B) Компьютер: ΙΒΜ-совместимый персональный компьютер (C) Операционная система: РС-БОЗ/МЗ-ООЗ (ϋ) Программное обеспечение: программа РаСепС1п, выпуск

1.0, версия 1.30(ЕРО) (νί) Данные предшествующей заявки:

(A) Номер заявки: 1Ь 121284 (B) Дата подачи: 10 июля 1997 г (νί) Данные предшествующей заявки:

(A) Номер заявки: 1Ь 122819 (B) Дата подачи: 30 декабря 1997 г.

(2) Информация для ЗЕф ΙΟίΙ:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 13 аминокислот (B) Тип: аминокислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Б) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: пептид (χί) Описание последовательности: 3Εβ 10 № 1

6111 РЬе С1у АХа 61у Ьеи Уа1 Ьеи 61у 61у 61л РЬе МеС ⁵ 10 (2) Информация для ЗЕО Ю № 2:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 44 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (ϋ) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: ЗЕО 1Б Ν* 2

СТАСТ666СС С666СТССС6 С6АССС666С СССАСССССС СТАС 44 (2) Информация для ЗЕО 10 № 3:

(ί) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 25 пар оснований (0) Тип: нуклеиновая кислота (С) Структура цепи: одноцепочечная (0) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: ЗЕ<2 10 № 3

ЗАСТА6ТА6С ТАТ6ААСТСС ТТСТС 25 (2) Информация для ЗЕО Ю Ν· 4:

(1) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 21 пара оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (О) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: ЗЕф ΙΟ Ν' 4

А666ССАТТТ 6СССААСА6С С 21 (2) Информация для 5Εζ2 10 №5:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 62 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (ϋ) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: ЗЕО 1Б № 5

6АТССС6СС5 6СС6666А66 666ССССС66 СОСССССССС ССССТССТСС С666ССС6СТ 60

АС 62 (2) Информация для ЗЕО 10 № 6:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 14 аминокислот (B) Тип: аминокислота (С) Структура цепи: одноцепочечная (ϋ) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: пептид (χί) Описание последовательности: ЗЕО 10 № 6

01у С1у С1у С1у Азр Рго С1у С1у С1у С1у С1у С1у Рго С1у 1 5 10

2) Информация для ЗЕО Ю № 7:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 543 аминокислоты (B) Тип: аминокислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ω) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: пептид (χί) Описание последовательности: 5Εΰ Ю № 7

Мес

Ьеи

А1а

Ча1

61у

Суз

АХа

Ьеи

Ьеи

АХа

АХа

Ьеи

Ьеи

А1а

А1а

Рго

1

5

10

15

61у

А1а

АХа

Ьеи

АХа

Рго

Агд

Агд

Суз

Рго

АХа

СХп

СХи

ЧаХ

А1а

Агд

61у

Ча1

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьеи

Рго

СХу

Азр

Зег

ЧаХ

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

Рго

35

40

45

01у

Ча1

СХи

Рго

СХи

Азр

Азп

А1а

тьг

Ча1

ΗΪ5

Тгр

ЧаХ

Ьеи

Агд

Ьуз

50

55

60

Рго

А1а

А1а

61у

Зег

ΗΪ5

Рго

Зег

Агд

Тгр

АХа

СХу

МеС

СХу

Агд

Агд

65

70

75

80

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Агд

Зег

Ча1

ОХп

Ьеи

Ηίβ

Азр

Зег

СХу

Азп

Туг

Зег

Суз

85

90

95

Туг

Агд

АХа

61у

Агд

Рго

АХа

С1у

ТНг

Ча1

НЬз

Ьеи

Ьеи

ЧаХ

Азр

ЧаХ

100

105

110

Рго

Рго

61и

СХи

Рго

С1п

Ьеи

Зег

Суз

РЬе

Агд

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Зег

115

120

125

Азп

ЧаХ

ЧаХ

Суз

СХи

Тгр

С1у

Рго

Агд

Зег

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

ТЬг

ТЬг

130

135

140

Ьуз

АХа

ЧаХ

Ьеи

Ьеи

VII

Агд

Ьуз

РЬе

61п

Азп

Зег

Рго

АХа

СХи

Азр

145

150

Х55

160

РЬе

СХп

С1и

Рго

Суз

СХп

Туг

Зег

СХп

(51и

Зег

СХп

Ьуз

РЬе

Зег

Суз

165

170

175

01п

Ьеи А1а Ча1 180

Рго 01и С1у Азр Зег Зег РЬе Туг 11е Ча1 Зег МеС

185

190

Суз

Ча1

А1а

Зег

Зег

Ча1

С1у

Зег

Ьуз

РЬе

Зег

Ьуз

ТНг

С1п

ТНг

РЬе

195

200

205

С1П

С1у

Суз

С1у

Не

Ьеи

С1п

Рго

АЗр

Рго

Рго

АХа

Азп

Не

ТЬг

Ча1

210

215

220

ТНг

А1а

Ча1

А1а

Агд

Азп

Рго

Агд

Тгр

Ьеи

Зег

Ча1

ТНг

Тгр

01п

Азр

225

230

235

240

Рго

ΗΪ3

Зег

Тгр

Азп

Зег

Зег

РЬе

Туг Агд

Ьеи

Агд

РЬе

С1и

Ьеи

Агд

245

250

255

Туг

Агд

А1а

С1и

Агд

Зег

Ьуз

ТНг

РЬе

ТНг

ТНг

Тгр

МеС

Ча1

Ьуз

Азр

260

265

270

Ьеи

С1п

Нхз

ΗΪ5

Суз

Ча1

Не

Н13

Азр

А1а

Тгр

5ег

С1у

Ьеи

Агд

ΗΪ3

275

280

285

Ча1

Ча1

01п

Ьеи

Агд

А1а

οίη

С1и

С1и

РЬе

01у

С1п

С1у

С1и

Тгр

Зег

290

295

300

О1и

Тгр

Зег

Рго

С1и

А1а

МеС

С1у

ТЬг

Рго

Тгр

ТЬг

01и

Зег

Агд

Зег

305.

310

315

320

Рго

Рго

А1а

С1и

Азп

С1и

Ча1

Зег

ТЬг

Рго

МеС

01п

А1а

Ьеи

ТНг

ТНг

325

330

335

Азп

Ьуз

Азр

Азр

Азр

Азп

Не

Ьеи

РЬе

Агд

Азр

Зег

АХа

Азп

А1а

ТНг

340

345

350

Зег

Ьеи

Рго

Ча1

С1и

РЬе

МеС

Рго

Ча1

Рго

Рго

<31у С1и

Азр

Зег

Ьуз

355

360

365

Азр

νβΐ

А1а

А1а

Рго

ΗΪ5

Агд

С1п

Рго

Ьеи

ТНг

Зег Зег

С1и

Агд

Не

370

375

380

Азр

Ьуз

СХп

Не

Агд

Туг

Не

Ьеи

Азр

О1у

Не

Зег А1а

Ьеи

Агд

Ьуз

385

390

395

400

С1и

ТНг

Суз

Азп

Ьуз

Зег

Азп

Мес

Суз С1и

Зег

Зег

Ьуз

С1и

А1а

Ьеи

405

410

415

А1а

С1и

Азп

Азп

Ьеи

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз МеС

А1а

О1и

Ьуз

Азр

С1у

Суз

420

425

430

РЬе

С1п

Зег

С1у

РЬе

Азп

01 и

С1и

ТНг Суз

Ьеи

Ча1

Ьуз

Не

Не

ТНг

435

440

445

СХу

Ьеи

Ьеи

01 и

РЬе

01и

Ча1

Туг

Ьеи' 01и

Туг

Ьеи

ОХп

Азп

Агд

РЬе

450 455 460

465	470	475	480
Ьеи 11е С1п РЬе Ьеи	С1п Ьуз	Ьуз А1а Ьуз Азп Ьеи Азр А1а	Не ТНг
- 465		490	495

С1и Зег Зег С1и 01и С1п А1а Агд А1а Ча1 С1п Мес Зег ТЬг Ьуз Ча1

ТЬг

Рго

Аэр

Рго 500

ТЬг

ТЬг

Азп

АХа

Зег 505

Ьеи

Ьеи

ТЫ

Ьуз

Ьеи 510

С1п

АХа

61п

Азп

61п 515

Тгр

Ьеи

61п

Азр

Мее 520

ТЬг

ТЬг

ΗΪ3

Ьеи

Не 525

Ьеи

Агд

Зег

РЬе

Ьуз 530

61и

РЬе

Ьеи

61п

Зег 535

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи 540

Агд

С1п

Мее

(2) Информация для ЗЕО 10 № 8:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 471 аминокислота (B) Тип: аминокислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (0) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: пептид (χί) Описание последовательности: 3Εβ Ю № 8

Мее

Азп

5ег

РЬе

Зег

ТЬг

Зег

А1а

РЬе

СХу

Рго

Уа1

А1а

РЬе

Зег

Ьеи

1

5

10

15

С1у

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Уа1

Ьеи

Рго

АХа

АХа

РЬе

Рго

А1а

Рго

Уа1

Рго

Рго

20

25

30

С1у

С1и

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Уа1

АХа

А1а

Рго

ΗΪ3

Агд

С1п

Рго

Ьеи

ТЬг

35

40

45

Зег

Зег 61и 50

Агд

Не

Азр Ьуз С1п 11е Агд Туг 11е Ьеи Азр С1у 11е

55

60

Зег

А1а

Ьеи

Агд

Ьуз

<31 и

ТЬг

Суз

Азп'

Ьуз

Зег

Азп

Мее

Суз

61и

Зег

65

70

75

80

Зег

Ьуз

С1и

А1а

Ьеи

АХа

61и

Азп

Азп

Ьеи

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз

Мес

А1а

85

90

95

СХи

Ьуз

Азр

С1у

Суз

РЬе

С1п

Зег

61у

РЬе

Азп

61и

С1и

ТЬг

Суз

Ьеи

100

105

110

Уа1

Ьуз

11е

Не

ТЬг

61у

Ьеи

Ьеи

61и

РЬе

61 и

Уа1

Туг

Ьеи

61 и

Туг

115

120

125

Ьеи

σΐη

Азп

Агд

РЬе

61и

Зег

Зег

61 и

61и

61п

А1а

Агд

А1а

Уа1

61п

130

135

140

Мее

Зег

ТЬг

Ьуз

Уа1

Ьеи

Не

61п

РЬе

Ьеи

61п

Ьуз

Ьуз

А1а

Ьуз

Азп

145

150

155

160

Ьеи

Азр

А1а

Не

ТЫ

ТЬг

Рго

Азр

Рго

ТЫ

ТЬг

Азп

А1а

Зег

Ьеи

Ьеи

165

170

175

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1п

А1а

61п

Азп

С1п

Тгр

Ьеи

61п

Азр

Мее

ТЬг

ТЬг

Нгз

180 185 190

Ьеи Не Ьеи

Агд

Зег РЬе

Ьуз СХи РЬе Ьеи С1п Зег Зег

Ьеи

Агд

А1а

195

200

205

Ьеи

Агд

61п

Мее

СХу

С1у

СХу

61 у

Азр

Рго

61у С1у

С1у

61у С1у

С1у

210

2X5

220

Рго

С1у

Уа1

Рго

Рго

С1и

61и

Рго

61п

Ьеи

Зег

Суз

РЬе

Агд

Ьуз

Зег

225

230

235

240

Рго

Ьеи

Зег

Азп

Уа1

Уа1

Суз

СХи

Тгр

С1у

Рго

Агд

Зег

ТЬг

Рго

Зег

245

250

255

Ьеи

ТЬг

ТЬг

Ьуз

АХа

УаХ

Ьеи

Ьеи

Уа1

Агд

Ьуз

РЬе

С1п

Азп

Зег

Рго

260

265

270

А1а

61и

Азр

РЬе

61п

С1и

Рго

Суз

С1п

Туг

Зег

СХп

С1и

Зег

С1п

Ьуз

275

280

285

РЬе

Зег

Суз

61п

Ьеи

АХа

Уа1

Рго

СХи

СХу

Азр

Зег

Зег

РЬе

Туг

Не

290

295

300

Уа1

Зег

МеС

Суз

Уа1

АХа

Зег

Зег

УаХ

СХу

Зег

Ьуз

РЬе

Зег

Ьуз

ТЬг

305

3X0

3X5

320

С1п

ТЬг

РЬе

СХп

СХу Суз

СХу

11е

Ьеи

С1п

Рго

Азр

Рго

Рго

А1а

Азп

325

330

335

11е

ТЬг

Уа1

ТЬг

АХа

УаХ

А1а

Агд

Азп

Рго

Агд

Тгр

Ьеи

Зег

УаХ

ТЬг

340

345

350

Тгр

61п

Азр

Рго

ΗΪ5

Зег

Тгр

Азп

Зег

Зег

РЬе

Туг

Агд

Ьеи

Агд

РЬе

355

360

365

С1и

Ьеи

Агд

Туг

Агд

А1а

СХи

Агд

Зег

Ьуз

ТЬг

РЬе

ТЬг

ТЬг

Тгр

Мее

370

375

380

Уа1

Ьуз

Азр

Ьеи

С1п

Нхз

ΗΪ3

Суз

Уа1

11е

ΗΪ3

Азр

А1а

Тгр

Зег

61 у

385

390

395

400

Ьеи

Агд

ΗΪ3

Уа1

Уа1

С1п

Ьеи

Агд

А1а

С1п

С1и

61 и

РЬе

61 у

61 п

61 у

405

4X0

415

61 и

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Рго

СХи

АХа

Мее

С1у

ТЬг

Рго

Тгр

ТЬг

61и

420

425

430

Зег

Агд

Зег

Рго

Рго

АХа

С1и

Азп

С1и

Уа1

Зег

ТЬг

Рго

Мее

61п

А1а

435

440

445

Ьеи

ТЬг

ТЬг

Азп

Ьуз

Азр

Азр

Азр

Азп

Не

Ьеи

РЬе

Агд

Азр

Зег

А1а

450 455 460

Claims (35)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Химерный гликозилированный белок растворимого рецептора интерлейкина-6 (зШ6К) - интерлейкина-6 (ЧЕ-6) (зI^-6Ε/I^-6). включающий слитый белковый продукт, полученный путем слияния природной формы з [И-6Н и природной формы Ш-6.
2. 2. Химерный белок з^-6^/^-6 по п.1, где указанный з!Е-6Е слит с ГЪ-6 через молекулу пептидного линкера.
3. 3. Химерный белок зI^-6Κ/I^-6 по п.2, где указанный линкер является неиммуногенным линкером, состоящим примерно из 3 аминокислотных остатков.
4. 4. Химерный белок з^-6^/^-6 по п.3, где указанный линкер является трипептидом последовательности Е-Р-М(С1и-Рйе-Ме!).
5. 5. Химерный белок зI^-6Κ/I^-6 по п.2, где указанный линкер является пептидом, состоящим из 13 аминокислотных остатков последовательности Е-Р-С-А-С-Ъ-У-Ъ-С-С-О-Р-М (С1иРЬе-61у-А1а-61у-Ьеи-Уа1-Ьеи-61у-61у-С1п-РЬеМе!).
6. 6. Химерный белок зI^-6Κ/I^-6 по любому из пп.1-4, обозначаемый здесь как зГЪ6Κ.δУа1/I^-6. который включает трипептидный линкер последовательности Е-Р-М между Сконцевым Уа1-356 в з!Е-6Е и Ν-концевым Рго29 в ГЕ-6, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 3.
7. 7. Химерный белок зI^-6Κ/I^-6 по любому из пп. 1, 2 и 5, обозначаемый здесь как зШ6Κ.δУа1/^/I^-6. который включает пептидный линкер, состоящий из 13 аминокислот последовательности Е-Р-С-А-С-Ь-У-Ь-С-С-О-Р-М, между С-концевым Уа1-356 в з!Е-6Е и Νконцевым Рго-29 в ^-6, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 3, где трипептид последовательности Е-Р-М в положениях 357-359 на фиг. 3 заменен указанной пептидной последовательностью, состоящей из 13 аминокислот.
8. 8. Химерный белок з!Е-6Е/[Е-6 по п.1, обозначаемый здесь как ΣΕ-ό/δΣΕ-όΚ, который включает полную последовательность ^-6, предшествующую последовательности 8ΣΕ-6Κ, и пептидный линкер, состоящий из 14 аминокислот последовательности С-С-С-С-Э-Р-С-СС-С-С-С-Р-С (8ЕЦ Ш № 6), между С-концевым Ме!-212 в [И-6 и Уа1-112 в зI^-6Κ, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 11.
9. 9. Химерный белок зI^-6Κ/I^-6 по любому из пп.1-8, который продуцируют в клетках млекопитающих в полностью процессированной форме.
10. 10. Химерный белок зI^-6Κ/I^-6 по п.9, который продуцируют в клетках человека.

    Азп А1а ТЬг Зег Ьеи Рго Уа1

    465 470
11. 11. Химерный белок 8ΙΕ-6Β/ΙΕ-6 по п.9, который продуцируют в клетках яичника китайского хомячка (СНО).
12. 12. Последовательность ДНК, кодирующая химерный белок 8ΙΕ-6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.111.
13. 13. ДНК-вектор, включающий последовательность ДНК, кодирующую химерный белок 8ΙΕ-6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, причем указанный вектор пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках млекопитающих.
14. 14. ДНК-вектор по п.13, который пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках человека.
15. 15. ДНК-вектор по п.13, который пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках СНО.
16. 16. ДНК-вектор по любому из пп.13-15, который является плазмидой, обозначаемый здесь как ροΌΝΑ8ΙΕ-6Β/ΙΕ-6, которая включает вектор ροΌΝΑ3, содержащий последовательность ДНК, кодирующую химерный белок ДЬ6Β/ΙΕ-6 под контролем промотора цитомегаловируса (СМУ).
17. 17. Трансформированные клетки млекопитающих, содержащие ДНК-вектор по любому из пп.13-16, которые способны экспрессировать последовательность химерного белка 8ΙΕ-6Β/ΙΕ6, носителем которой является указанный вектор, полностью процессировать экспрессированный белок и секретировать его в культуральную среду, в которой выращиваются указанные клетки.
18. 18. Трансформированные клетки по п.17, которые являются вышеописанными клетками почки эмбриона человека 293 (НЕК293), трансфецированными вектором ροΌΝΑδΙΕ-6ΒΛΕ-6, причем указанные клетки способны экспрессировать химерный белок 8ΙΕ-6Β/ΙΕ-6, полностью процессировать указанный белок и секретировать указанный белок в культуральную среду, в которой указанные клетки выращиваются в виде гликопротеина с молекулярной массой около 85 кДа.
19. 19. Способ получения химерного белка по любому из пп.1-11, включающий выращивание трансформированных клеток по п.17 или 18 в условиях, пригодных для экспрессии, процессирования и секреции указанного белка в культуральную среду, в которой выращиваются указанные клетки; и очистку указанного белка из указанной культуральной среды.
20. 20. Способ по п.19, где очистку выполняют иммуноаффинной хроматографией, используя моноклональные антитела, специфичные в отношении 8ΙΕ-6Κ.
21. 21. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его солей и смесей в качестве ингибитора раковых клеток.
22. 22. Применение химерного белка по любому из пп.1-11 в качестве ингибитора чрезвычайно злокачественных меланомных клеток.
23. 23. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его солей и смесей в качестве активного ингредиента для стимуляции приживаемости гемопоэтических клеток человека при трансплантации костного мозга.
24. 24. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его солей и смесей в качестве активного ингредиента для защиты печени от гепатотоксических веществ.
25. 25. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для лечения рака у млекопитающих путем ингибирования раковых клеток.
26. 26. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для улучшения трансплантации костного мозга путем стимуляции приживаемости гемопоэтических клеток человека в трансплантанте костного мозга.
27. 27. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для усиления гемопоэза.
28. 28. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для лечения заболеваний печени.
29. 29. Применение химерного белка ДЬ6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для лечения неврологических нарушений.
30. 30. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента химерный белок 8ΙΕ-6Β/ΙΕ-6 по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
31. 31. Фармацевтическая композиция по п.30 для лечения рака.
32. 32. Фармацевтическая композиция по п.30 для улучшения трансплантации костного мозга.
33. 33. Фармацевтическая композиция по п.30 для усиления гемопоэза.
34. 34. Фармацевтическая композиция по п.30 для лечения заболеваний печени.
35. 35. Фармацевтическая композиция по п.30 для лечения неврологических нарушений.