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CN1269835A - 嵌合白细胞介素－6可溶性受体/配体蛋白质和其类似物及其应用 - Google Patents

嵌合白细胞介素－6可溶性受体/配体蛋白质和其类似物及其应用 Download PDF

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Abstract

提供了用于治疗癌症和肝紊乱,增强骨髓移植和治疗其它IL－6相关症状的从可溶性IL－6受体和IL－6的天然存在形式的融合构建的嵌合蛋白质。

Description

嵌合白细胞介素-6可溶性受体/配体蛋白质 和其类似物及其应用
发明领域
本发明涉及依赖于可溶性IL-6受体(sIL-6R)的对抗作用的白细胞介素-6(IL-6)生物活性的领域。更具体地说，本发明涉及从sIL-6R和IL-6的基本天然存在形式及其生物活性类似物的融合构建的新嵌合sIR-6R/IL-6蛋白质，它特定地可用于通过抑制癌细胞生长治疗癌，增强骨髓移植，治疗肝紊乱及其它IL-6相关症状。
本发明的背景和现有技术
白细胞介素-6(IL-6)是已知的细胞因子，它的生物活性是通过含有两个不同蛋白质，一个是IL-6受体(IL-6R或gp80)和另一个gp130的膜受体系统介导的(Hirano等人，1994年综述)。对应于gp80的细胞外区域的IL-6R(sIL-6R)的可溶性形式是作为血液和尿中的糖蛋白发现的人体的天然产物(Novick等人，1990，1992)。sIL-6R的例外特性是它们在许多细胞类型包括人细胞上作为IL-6的潜在的括抗剂作用(Taga等人，1989；Novick等人，1992)。这是由于即使没有gp80的胞质内区，sIL-6R仍然能够引发应答IL-6的gp130的二聚化，这依次介导了随后的IL-6特异的信号转导和生物效应(Murakami等人，1993)。活性的IL-6受体复合物是由于两条gp130链，两个IL-6R和两个IL-6配体形成六聚体结构(Ward等人，1994；Paonessa等人，1995)，其中sIL-6R与gp130具有两种类型的相互反应，这两种反应是IL-6特异生物活性所必须的(Halimi等人，1995)。
利用sIL-6R的处理导致了在许多细胞类型中IL-6生物活性增强。一个实施例是当加入sIL-6R时，IL-6在较大程度上抑制肿瘤细胞生长，如小鼠骨髓白血病M1细胞(Taga等人，1989)，人胸癌T47D细胞(Novick等人，1992)或人非小细胞肺癌细胞(Ganapathi等人，1996)。IL-6在体内具有抗转移活性(Katz等人，1995)，并且sIL-6R也可以增强IL-6的这样的体内抗肿瘤效应(Mackiewicz等人，1995)。加入sIL-6R增强IL-6的另一个活性是刺激造血干细胞以便生产多谱系菌落(Sui等人，1995)。本发明人也已经观察到脑少突神经胶质细胞的初级培养物的生存是得到sIL-6R和IL-6联合的支持的(Oh，1997)，而IL-6单独在这样的培养物中很少存活(Kahn和DeVellis，1994)。这一发现表明，当与sIL-6R结合时，IL-6可以模仿其它亲神经细胞因子如纤毛亲神经因子(CNTF)或白血病抑制因子(LIF)的活性，它们也是通过gp130作用的，正如IL-11和制癌蛋白M的情况(Hirano等人，1994)。
在试图提供可以结合上面提到的IL-6和sIL-6R的功能的分子时，最近有报道在重组的酵母细胞中，在富甘氨酸的接头连接的截短的人IL-6R序列的区段和IL-6之间产生了融合蛋白质(Fischer等人，1997)。这一融合蛋白质基本只包括IL-6R细胞因子受体N区和细胞因子受体C区，并且因此基本缺乏所有的IL-6R免疫球蛋白(Ig)状区域，和受体膜前区(在C区和跨膜区之间的区域)。正如它代表了sIL-6R的截短形式，这截短了通过上面提到的富甘氨酸接头基本与IL-6的整个成熟形式连接的融合蛋白质中的sIL-6R。除了缺乏天然sIL-6R的一些部分，在酵母细胞中产生的这一融合蛋白不具有糖基化图谱，而如果融合蛋白是在哺乳动物细胞特别是例如在人细胞中则会产生这样的糖基化图谱。事实上，与具有预期的分子量约85千道尔顿的基本含有所有天然sIL-6R和IL-6氨基酸残基和在哺乳动物(例如人)细胞中完全糖基化的融合产物相反，这一酵母产生的融合蛋白质具有约57千道尔顿的分子量(见下面的实施例2)。
在开发可以用于治疗病人的重组蛋白质中的一般实验已经表明，为了避免引发抗体和非天然重组产物观察到的其它副作用，保留尽可能接近天然形式的这些蛋白质是重要的，正如它们是在人体中发现的。由于这一原因，利用重组哺乳动物细胞系统生产糖基化蛋白质，如尽可能相似于天然人蛋白质的化学形式的干扰素-β或粒细胞菌落刺激因子(Chernajovsky等人，1984，Holloway，1994)是有利的。不能适当糖基化的细菌或微生物如酵母也会引起蛋白质链的错误折叠，导致免疫原性反应。这对于翻译后N-和O-糖基化以及磷酸化严重修饰的IL-6(Revel，1989综述)，和对于N末端和C末端氨基酸恒定和已经确定的糖蛋白，人血液和尿中的天然sIL-6R特别重要(Novick等人，1990和与本发明人共同拥有的美国专利第5,216,128号和它对应的EP 413908 B1)。
因此看来，上面提到的在部分sIL-6R和IL-6之间的融合蛋白可能产生缺点，特别是用于治疗人的方面，由于它缺乏部分sIL-6R，以及它在酵母生产中可能产生了蛋白质不正确的糖基化。
在此之前，还没有公开融合分子含有在人体液中发现的天然sIL-6R和天然IL-6，并且是在人或其它哺乳动物细胞中产生的。
因此,本发明的一个目的是提供含有天然sIL-6R和天然IL-6(以任何顺序)的融合分子，它是由哺乳动物细胞产生的。
本发明的另一个目的是利用非常低浓度的这样的融合蛋白(sIL-6R/IL-6嵌合体)抑制高度转移的黑素瘤细胞的生长，这些细胞是单独抗IL-6或sIL-6R的。
本发明另一个目的是在骨髓移植方案中利用这样的融合蛋白(sIL-6R/IL-6嵌合体)用于将人造血干细胞移植入体内。
本发明的另一个目的是在其它IL-6相关的紊乱，例如，肝症状或神经学症状中利用这样的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供含有上面提到的天然sIL-6R-天然IL-6融合蛋白质(sIL-6R/IL-6嵌合体)的药物组合物用于治疗癌症，用于骨髓移植方案，和用于其它IL-6相关的紊乱，例如，肝症状和神经学症状。
本发明的其它目的和方面将在下面本发明的公开内容中阐述或产生。
本发明概要
根据本发明，已经产生了许多融合蛋白(嵌合体)，每个基本含有所有来自人体液的天然存在的sIL-6R和基本含有所有天然存在的人IL-6的成熟形式，每个都由短至3个氨基酸残基，或较长例如13个氨基酸残基的短接头肽连接(参见下面和实施例1和2)。但是，应该注意到，在这些融合蛋白质中，接头肽可以缺失，并且sIL-6R成份可以直接连接到IL-6成份。因为代表非天然氨基酸序列的接头可以是在病人中引发抗体的免疫原性表位，优选具有需要的生物活性的直接融合的sIL-6R/IL-6嵌合体，同时，当服用这样的嵌合体时，就会使诱导形成这样潜在有害抗体的危险最小。
当在人或哺乳动物细胞中产生上面的嵌合体时，对于减少嵌合蛋白质产物的潜在的免疫原性，如在天然存在的分子中发现的包括Ig状区的整个sIL-6R序列的转化，以及人或哺乳动物细胞导入的适当的糖基化及其它翻译后修饰也是重要的。
但是，在嵌合蛋白的sIL-6R和IL-6成份之间的接合点使用非常短的约3个氨基酸的接头是可能的。这样的短接头可以不是免疫原性表位。当然也可能使用多达约30个氨基酸的较长的接头以便分离两个成份，但必须小心，必须进行生物学效能和安全性实验以便保证含有这样的接头的嵌合分子不是免疫原性的。
事实上，根据本发明，这样的较长接头不是嵌合蛋白的活性所必需的，表明当基本所有天然存在的sIL-6R和IL-6成份的序列插入嵌合分子时，嵌合体的适当折叠不需要较长的接头[参见实施例3和图5，其中也涉及了具有非常短(3个氨基酸)的接头的sIL-6R/IL-6嵌合体和具有较长(30个氨基酸)接头的相似嵌合体的比较]。
根据本发明，在哺乳动物细胞表达系统已经有效地产生了这些融合蛋白或sIL-6R/IL-6嵌合体，以便产生在通常非应答IL-6或sIL-6R的肿瘤细胞上具有潜在活性，并且高度有效地保证人骨髓移植细胞的成功移入的糖基化产物(参见下面和实施例1～4)。事实上，在这样的骨髓移植中，sIL-6R/IL-6嵌合体是移植非定向多(潜)能造血干细胞的存活和增殖所必需的。另外，从本发明所示的实验结果，以及从其它分析知道，可以制备本发明的sIL-6R/IL-6嵌合蛋白的各种类似物，它们基本具有sIL-6R/IL-6嵌合体的相同生物活性，这些类似物是已经缺失，附加或被其它替代的一个或多个氨基酸残基的sIL-6R/IL-6嵌合体，对这样的类似物的唯一限制是它们保留了大部分天然存在的sIL-6R和IL-6序列。例如，优选地，加入到天然存在的sIL-6R和IL-6序列的氨基酸限制到20个氨基酸，这些加入优选地是在sIL-6R和IL-6之间的接合的位点处，即接头分子。同样，优选地，从sIL-6R和IL-6序列的缺失限制到20～30个氨基酸，其它氨基酸残基替代sIL-6R和IL-6序列中的氨基酸残基也优选地限制到20～30个氨基酸。根据本发明，当获得的如此修饰的类似物基本保留了天然存在序列组成的sIL-6R/IL-6嵌合体的生物活性，并且当在哺乳动物细胞中表达时，基本保留了天然存在序列组成的嵌合体的相同的糖基化图谱，前面所述的所有缺失，附加和替代是可接受的。
因此，本发明提供了嵌合糖基化可溶白细胞介素-6受体(sIL-6R)-白细胞介素-6(IL-6)蛋白(sIL-6R/IL-6)及其生物活性类似物，它们含有在基本所有天然存在的sIL-6R形式，和基本所有IL-6的天然存在形式之间融合的蛋白质产物，所述的sIL-6R/IL-6及其类似物以与天然存在sIL-6R和IL-6D糖基化相似方式糖基化。
本发明的上面的嵌合蛋白的实施例包括：
(i)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白及其生物活性类似物，其中所述的sIL-6R通过肽接头分子与IL-6融合。
(ii)如在(i)中所述，嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的接头非常短，约3～4个氨基酸残基的非免疫原性接头。
(iii)如在(ii)中所述，嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的接头是序列E-F-M的三肽(Glu-Phe-Met)。
(iv)如在(i)中所述，嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的接头是序列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M(Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met)(SEQ ID NO：1)的13个氨基酸的肽。
(v)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质是本发明命名的在sIL-6R的C未端Val-356和IL-6的N末端Pro-29之间具有序列E-F-M的三肽接头的sIL-6RδVal/IL-6，所述的嵌合蛋白具有图3所述的序列。
(vi)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，是本发明命名的sIL-6RδVal/L/IL-6，在sIL-6R的C末端Val-356和IL-6R的N末端Pro-29之间具有序列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M的13个氨基酸肽接头，所述的嵌合蛋白质具有图3中所述的序列，其中所述的13个氨基酸肽序列替代了图3的位置357～359之间的序列E-F-M的三肽。
(vii)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，其中在哺乳动物细胞中以完全加工形式生产了所述的蛋白质。
(viii)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，其中所述的蛋白质在人细胞中产生。
(ix)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，其中所述的蛋白质在CHO细胞中产生。
(x)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中通过能够抑制高度恶性的癌细胞的生长来鉴定所述的嵌合蛋白质和类似物。
(xi)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中通过能够抑制高度恶性的黑素瘤细胞的生长来鉴定所述的嵌合蛋白质和类似物。
(xii)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中通过能够引发骨髓移植中人造血细胞移入体内来鉴定所述的嵌合蛋白质和类似物。
(xiii)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中通过能够保护肝抵抗肝毒素试剂来鉴定所述的嵌合蛋白质和类似物。
本发明还提供上面提到的编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物的DNA序列。
另外，本发明也提供了如上提到的含有编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质和本发明的生物活性类似物的DNA序列的DNA载体，所述的载体适于在哺乳动物细胞中表达所述的嵌合蛋白质。
本发明的DNA载体的实施例包括：
(i)DNA载体，其中载体适于在人细胞中表达所述的嵌合蛋白质。
(ii)DNA载体，其中当在哺乳动物或人细胞中表达所述的载体时，表达的嵌合蛋白质具有允许哺乳动物或人细胞完全加工嵌合蛋白质和将完全加工嵌合蛋白质从细胞分泌到所述细胞生长的培养基中的序列。
(iii)如上的DNA载体，其中所述的载体是本发明命名的质粒pcDNAsIL-6R/IL-6，其中包括pcDNA3载体，含有在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的DNA序列。
(iv)如上的DNA载体，其中所述的载体是本发明命名的质粒pcDNAsIL-6R/L/IL-6，其中包括pcDNA3载体，含有在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的DNA序列，并且其中在编码所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的所述的DNA序列中在放置于编码sIL-6R部分的序列和编码蛋白质的IL-6部分的序列之间的EcoRI位点插入了编码接头肽的接头序列。
同样，本发明也提供含有如上所述的DNA载体的转化的哺乳动物细胞，即能够表达由所述的载体携带的，完全加工表达蛋白和分泌到所述细胞生长的培养基中的sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质序列。
这些转化细胞的实施例是pcDNA sIL-6R/IL-6载体转染的本发明叙述的人胚肾细胞293(HEK293)，所述的细胞能够表达sIL-6R/IL-6嵌合蛋白，完全加工所述的蛋白，和以约85千道尔顿糖蛋白的形式分泌所述的蛋白到所述细胞生长的培养基中。
转化细胞的另一个实施例是本发明叙述的利用pcDNA sIL-6R/IL-6载体转染的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，所述的细胞能够表达sIL-6-R/IL-6嵌合蛋白，以约85千道尔顿糖蛋白的形式完全加工所述的蛋白质到所述的细胞生长的培养基中。
本发明也提供了生产如上所述的嵌合蛋白质及其生物活性类似物的方法，包括在适于表达的条件下生长前面所述的转化细胞，加工和分泌所述的蛋白质或类似物到所述细胞生长的培养基，和从所述的培养基通过利用特异于sIL-6R的单克隆抗体的免疫亲和层析纯化所述的蛋白质或类似物。
本发明的嵌合蛋白质具有许多用途包括：
(i)利用嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐及其混合物作为癌细胞的抑制剂。
(ii)利用如(i)所述，作为高度恶性的黑素瘤细胞的抑制剂。
(iii)利用嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐，及其混合物作为引发骨髓移植中人造血细胞的移入的活性成份。
(iv)利用嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐，及其混合物，作为增加血细胞生成，用于治疗肝和神经系统病症，或用于IL-6或sIL-6R的其它用途的活性成份。
同样，本发明的嵌合蛋白质可以用于制备许多医学适应症的药剂，即嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐及其混合物，用于制备通过抑制癌细胞治疗癌症的药剂，或用于制备通过引发骨髓移植中的人造血细胞的移入增强骨髓移植的药剂，或用于制备增强血细胞生成的药剂，或用于制备治疗神经系统紊乱的药剂，或用于制备利用IL-6或sIL-6R的其它用途的药剂。
另外，本发明也提供作为含有活性成份的，如上所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或其类似物和药物可接受载体，稀释剂或赋形剂的药物组合物。
本发明的这一药物组合物的实施例包括：
(i)用于治疗哺乳动物癌症的药物组合物。
(ii)增强骨髓移植的药物组合物。
(iii)用于治疗肝和神经系统紊乱或用于增强血细胞生成或用于IL-6或sIL-6R的其它应用的药物组合物。
本发明也提供治疗哺乳动物中的癌症，增强骨髓移植，治疗肝和神经系统紊乱，增强血细胞生成，或IL-6或sIL-6R的其它应用的方法，包括以合适剂量和适宜的给药途径，给病人服用所述的药物组合物。
为了避免疑惑，本发明涉及任何顺序的IL-6和sIL-6R之间的嵌合体，即N末端和C末端部分可以逆转，且之后嵌合体是IL-6-sIL-6R蛋白质，虽然在本发明中统称为sIL-6R/IL-6蛋白质。
从本发明下面的详细的公开内容阐述或表示了本发明的其它方面和实施例。
附图的简要说明
图1A～图1C表示用于构建编码嵌合蛋白质的嵌合DNA分子的各种载体，试剂和加工步骤的图解，其中嵌合蛋白在Val 356残基结束的sIL-6R的天然形式接在天然的，成熟的序列之后，如实施例1中详细叙述的IL-6的加工形式的结构是保守的；
图2A和图2B表示通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(A)和通过生物活性图谱(B)鉴定sIL-6RδVal/IL-6p86嵌合体进行的分析获得的结果，其中在图2A中，显示了从加载利用编码嵌合蛋白的载体转染的细胞培养物中获得的分泌蛋白质样品的亲和层析柱洗脱的电泳免疫纯化部分的考马斯染色的凝胶的再生。并且在图2B中显示了每个从亲和层析柱洗脱的上面提到的部分的生物活性(F10.9黑素瘤细胞的生长抑制)的图解表示，在实施例2和3中已详细叙述；
图3描述了sIL-6RδVal/IL-6嵌合体的氨基酸序列(一字母密码)，其中显示的是分子的不同区域，包括N末端信号肽(线在序列的顶部)，免疫球蛋白状(Ig-状)区域，细胞因子受体N区域(下划线)，细胞因子C区域(线在序列的上部)，和受体膜前区(在C区和跨膜区之间的区域)，嵌合体的所有sIL-6R部分；以及嵌合体的成熟IL-6成份(下划线)，在实施例1和2叙述；
图4A和图4B显示了利用sIL-6R/IL-6嵌合蛋白处理4天(B)和未处理(A)的培养基中的F10.9黑素瘤细胞的图解，其中在图4B中，表示了如实施例3所述，利用sIL-6R/IL-6嵌合体处理的这样的转移黑素瘤细胞(F10.9细胞)中诱导的形态学变化；
图5是在各种嵌合体浓度范围，从约0.12纳克/毫升～150纳克/毫升，sIL-6R/IL-6嵌合蛋白抑制F10.9黑素瘤细胞的生长的图解说明，其中将如实施例3中所述的只含有3个氨基酸接头IL-6RIL-6的嵌合体与含有长13个氨基酸接头(IL-6RLIL-6)的嵌合体进行比较；
图6是分离的IL-6单独(圆点曲线的上面的含有开放的方块的曲线)，浓度范围从0～40纳克/毫升的IL-6，和sIL-6R单独(在垂直轴上所有曲线的会聚点，其中IL-6浓度为零)对F10.9黑素瘤细胞缺乏生长抑制效果，以及以各种浓度一起加入IL-6和sIL-6R，其中IL-6浓度范围为10纳克/毫升～40纳克/毫升，和对每个IL-6浓度，加入的sIL-6R的三个浓度是100纳克/毫升，200纳克/毫升和400纳克/毫升观察到的生长抑制效果，如下面三个曲线说明的(含有开放的三角和圆环的两个点曲线和含有封闭的方块完整的曲线)，如实施例3中所述；
图7是如实施例4所述，在对SCID-NOD小鼠进行骨髓移植过程中，显示成功移入人造血干细胞需要sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质的DNA印迹影印的放射自显影的再生(两个右手的道代表接受sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质以及其它需要的因子，SCF，FLT-3的小鼠，这和三个左手的道相反，它们表示仅接受了SCF和FLT-3和SCF，FLT-3以及分离的，即，非融合的IL-6和sIL-6R的小鼠)；
图8是比较IL-6和sIL-6R混合物，sIL-6R/IL-6嵌合体的亲和特征，实心方块描述的嵌合体和实心菱形块描述的混合物的值的斯卡查德图，斜率是4～1；
图9显示了比较sIL-6R+IL-6的混合物之一或sIL-6R之一(没有IL-6)sIL-6R/IL-6嵌合体对F10.9黑素瘤细胞的较高的活性；
图10显示了sIL-6R/IL-6嵌合体抵抗肝毒性的保护作用，这些值表示了4个实验的平均值，实心方块表示IL-6-/-小鼠，实心菱形块表示接受IL-6的IL-6-/-小鼠，和实心星表示接受嵌合体的IL-6-/-小鼠；
图11描述了IL-6-sIL-6RδVal嵌合体3e的氨基酸序列(一字母密码)，接头为下划线；和
图12显示了比较sIL-6R/IL-6嵌合体(实心方块)和两个突变体[Mutt39(HD)-实心菱形块]和MuttNHD-轻微实心的星，嵌合体3e(黑实心星)对图9的黑素瘤细胞的生物活性，如实施例9所述。
本发明的详细说明
本发明涉及嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，它们基本具有融合在一起的所有sIL-6R的天然存在形式和基本所有IL-6的天然存在形式，可以通过短至3个氨基酸的接头肽融合的位点，并且该嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物具有与天然存在的sIL-6R和IL-6一样的糖基化的量或方式。发现在哺乳动物细胞，特别是人细胞(参见下面的实施例1～4)或CHO细胞(参见下面的实施例6)中根据本发明产生的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质在这样的细胞中有效地表达，且有待于高度糖基化，并分别对IL-6或sIL-6R显示完全没有应答的肿瘤细胞上具有潜在的活性。
更具体地说，根据本发明，已经观察到(参见下面的实施例1～3)，本发明的前述嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质在比当利用非融合sIL-6R和IL-6的混合物需要的浓度更低的浓度引起高度恶性哺乳动物细胞如F10.9黑素瘤细胞生长抑制。这是考虑了F10.9黑素瘤细胞当利用单独的IL-6或sIL-6R处理时继续正常生长并且只有当接触相对高剂量的非融合IL-6和sIL-6R的联合时抑制生长的事实后特别明显的结果。因此，本发明的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质是比它的单独部分的混合物，即非融合IL-6和sIL-6R的混合物更具潜力的高度恶性黑素瘤细胞的抑制剂。所以，本发明的嵌合蛋白质特定地可用作治疗各种癌症的活性成份。
嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的较高的活性是通过比非融合IL-6和sIL-6R的混合物更高的gp130亲和力说明的(实施例7)。
另外，根据本发明，已经发现(参见下面实施例4)，本发明的嵌合sIL-6R/IL-6分子特定地可用于增强骨髓移植。事实上，利用已知方案在严重的联合免疫缺陷(SCID)小鼠中移入人骨髓细胞，其中干细胞因子(SCF)和Flt3配体可用于使大多数能够长期移入受体骨髓的原始多能造血干细胞生存和增殖，发现这两个因子，SCF和Flt3配体对于促进人细胞移入受体小鼠骨髓是不够的，并且这只是当同时加入嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质时移入成功。这一发现表明在这样的移入方案中嵌合蛋白质是必需的。在同样的实验中，当独立地加入时，非融合IL-6和sIL-6R对于促进成功的骨髓移植是不够的，并且当一起加入时，比嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质活性更少，即在100纳克/毫升的有效浓度时，sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质促进成功的骨髓移植，而当一起加入时，甚至在较高的浓度(sIL-6R从125～1250纳克/毫升，IL-6从50～200纳克/毫升)，两个独立的非融合sIL-6R和IL-6在促进这样的移植时活性更少。
优选地，本发明上述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质是人细胞或任何适当的哺乳动物细胞表达系统，如能够与人细胞一样糖基化蛋白质，并且如人细胞一样导入翻译后修饰的仓鼠CHO细胞中产生的重组糖基化sIL-6R/IL-6嵌合体。一个重要的特征是除了在嵌合蛋白质的sIL-6R和IL-6成份之间掺入了非常短的三肽或较长的接头肽以外，这样产生的嵌合糖蛋白是如人体中发现的天然sIL-6R和IL-6亲代分子一样没有截短，没有加入外部非天然多肽序列。
为了制备上述本发明的优选的嵌合蛋白质，应该考虑天然存在的sIL-6R和IL-6的如下特征：已知存在于人细胞膜的IL-6R是编码含有信号肽，免疫球蛋白(Ig)状区，细胞因子结合区，跨膜区和细胞质区的468个氨基酸的cDNA产生的(Yamasaki等人，1988)。在体液中发现的sIL-6R的可溶形式，如来自膜的成熟IL-6R，具有对应于Leu-20的N末端(Novick等人，1990)和对应于刚刚在IL-6R的跨膜区之前的Val-356的C末端(参见共同拥有的美国专利第5,216,128号，和欧洲专利413.908 B1)。为了将这一sIL-6R序列与IL-6融合，在Val-356之后导入EcoRI限制位点。在这一EcoRI位点之后导入了在IL-6cDNA的Pro-29开始和在Met-212结束的成熟IL-6的序列(Zilberstein等人，1986；Hirano等人，1986)。在这一EcoRI位点中，同时可以，但不是必须的，导入需要长度的接头肽以便在嵌合蛋白质中隔离sIL-6R和IL-6成份。正如下面的实施例中所述，正如这样的可能的嵌合蛋白质的实施例产生了两个不同的嵌合蛋白质，在这一EcoRI位点，一个具有三肽接头，另一个具有13个氨基酸残基接头，二者具有基本等同的生物活性。
本发明也涉及上述嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的类似物，该类似物基本保留了只具有sIL-6R和IL-6的天然存在序列的嵌合蛋白质的相同的生物活性。这样的类似物可以是在嵌合蛋白质的sIL-6R和/或IL-6成份中缺失，叠加或被其它替代了多达30个氨基酸残基的一个类似物，以致这样的修饰相对于嵌合蛋白质本身没有改变嵌合蛋白质类似物的生物活性，并且其中这样的类似物的sIL-6R成份保留了信号肽，Ig状区，细胞因子受体N区，细胞因子受体C区，和受体膜前区的天然存在结构(在加工之前，参见图3)。同样，这样的嵌合蛋白类似物应该基本保留IL-6成份的天然存在的成熟形式。各种类似物大多数可以在嵌合蛋白质分子中连接sIL-6R和IL-6成份的接头肽的位点相互区别和区别于基本的嵌合蛋白质分子(只基本含有天然存在的sIL-6R和IL-6序列)。这样的接头可以多达30个氨基酸的长度，作用是在嵌合蛋白质中使sIL-6R和IL-6成份相互分离。关于这样的接头，应该小心选择它的序列(所以也在适当的标准测试中生物学地测试每个这样的类似物)，以致将不导致使它失活的嵌合蛋白质的不正确的折叠，或将不导致使嵌合蛋白质类似物成为引发抗待治疗的病人中的抗体的免疫原蛋白质，此外的结果是将这样的类似物至少作为中期或长期药剂是无效的。
关于上述本发明的嵌合蛋白质的类似物，这些类似物是其中不同的氨基酸残基替代了一个或多个和多达约30个本发明的基本嵌合蛋白质的氨基酸残基，或缺失，或在本发明的嵌合蛋白质原始序列(基本含有天然存在的sIL-6R和IL-6序列)中附加一个或多个氨基酸残基，而与本发明的基本嵌合蛋白质比较，没有相当大地改变得到的产物的活性。通过已知的合成和/或定位诱变技术或其任何其它已知的技术可以制备这些类似物。
任何这样的类似物优选地具有足够复制基本sIL-6R/IL-6嵌合体的氨基酸序列，如具有其基本相似的活性。所以，可以确定通过包括将类似物进行下面的实施例2～4阐述的生物活性测试的常规实验，是否任何给定的类似物基本具有如本发明的基本嵌合蛋白质的相同的活性。
根据本发明所用的嵌合蛋白质的类似物，或编码其的核酸包括如本领域技术人员根据本发明表示的技术和指导不经过实验可以常规获得的取代肽或聚核苷酸的有限套数的基本对应序列。对于蛋白质化学和结构的详细说明，参见Schulz，G.E.等人，蛋白质结构的原理，Springer-Verlag，纽约，1978；和Creighton，T.E.，蛋白质：结构和分子特性，W.H.Freeman和Co.旧金山，1983，它们都引入本发明作为参考。对于核苷酸序列替代的表示，如密码子优先，参见Ausubel等人，出处同上，在A.1.1-A.1.24和Sambrook等人，分子生物学的当前方案，Interscience组约，6.3和6.4章(1987，1992)，在附录的C和D。
本发明的类似物的优选的变化是已知的″保守″替代。在基本具有天然存在的sIL-6R和IL-6序列的嵌合蛋白质中的保守氨基酸替代可以包括在具有足够相似的生化特性的基团内的同义氨基酸，在基团的成员之间的替代将保留分子的生物学功能，Grantham，科学，185卷，862～864(1974)。在上面定义的序列中也可以进行插入和缺失氨基酸而不改变它们的功能，特别是如果插入或缺失只包括几个氨基酸，例如在30个以下，并且优选地在10个以下，并且不除去或替代功能构型的关键氨基酸，例如半胱氨酸残基，Anfinsen，″控制蛋白质链的折叠的原理″，科学，181卷，223～230(1973)。在本发明的范围内，出现了这样的缺失和/或插入产生的类似物。
优选地，同义氨基酸基团是表I中定义的那些。更优选地，同义氨基酸基团是表II中定义的那些。并且最优选地，同义氨基酸基团是表III中定义的那些。表I同义氨基酸的优选基团
    氨基酸                              同义基团
      Ser                          Ser，Thr，Gly，Asn
      Arg                          Arg，Gln，Lys，Glu，His
      Leu                          Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
      Pro                          Gly，Ala，Thr，Pro
      Thr                          Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr
      Ala                          Gly，Thr，Pro，Ala
      Val                          Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
      Gly                          Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
      Ile                          Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
      Phe                          Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
      Tyr                          Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
      Cys                          Ser，Thr，Cys
      His                          Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
      Gln                          Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
      Asn                          Gln，Asp，Ser，Asn
      Lys                          Glu，Gln，His，Arg，Lys
      Asp                          Glu，Asn，Asp
      Glu                          Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
      Met                          Phe，Ile，Val，Leu，Met
      Trp                          Trp表II同义氨基酸的更优选的基团
     氨基酸                        同义基团
      Ser                          Ser
      Arg                          His，Lys，Arg
      Leu                          Leu，Ile，Phe，Met
      Pro                          Ala，Pro
      Thr                          Thr
      Ala                          Pro，Ala
      Val                          Val，Met，Ile
      Gly                          Gly
      Ile                          Ile，Met，Phe，Val，Leu
      Phe                          Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
      Tyr                          Phe，Tyr
      Cys                          Cys，Ser
      His                          His，Gln，Arg
      Gln                          Glu，Gln，His
      Asn                          Asp，Asn
      Lys                          Lys，Arg
      Asp                          Asp，Asn
      Glu                          Glu，Gln
      Met                          Met，Phe，Ile，Val，Leu
      Trp                          Trp表III同义氨基酸的最优选的基团
   氨基酸                     同义基团
    Ser                        Ser
    Arg                        Arg
    Leu                        Leu，Ile，Met
    Pro                        Pro
    Thr                        Thr
    Ala                        Ala
    Val                        Val
    Gly                        Gly
    Ile                        Ile，Met，Leu
    Phe                        Phe
    Tyr                        Tyr
    Cys                        Cys，Ser
    His                        His
    Gln                        Gln
    Asn                        Asn
    Lys                        Lys
    Asp                        Asp
    Glu                        Glu
    Met                        Met，Ile，Leu
    Trp                        Met
在可用于获得本发明的嵌合蛋白的类似物的蛋白质中产生氨基酸替代的例子包括任何已知方法的步骤，如授予Mark等人的美国专利RE33,653，4,959,314，4,588,585和4,737,462；授予Koths等人的5,116,943；授予Namen等人的4,965,195；授予Chong等人的4,879,111；和授予Lee等人的5,017,691中表示的，和美国专利第4,904,584号中表示的赖氨酸替代的蛋白质(Shaw等人)。
在本发明的另一个优选的实施例中，用于本发明的任何嵌合蛋白质的类似物具有基本对应于上面提到的本发明的基本嵌合蛋白质的氨基酸序列。术语″基本对应于″是用于理解含有不影响特别是在它涉及抑制癌细胞增殖或促进骨髓移植的能力的范围中，其基本特征的基本嵌合蛋白质的序列的变化最小的类似物。通常认为是在″基本对应于″的范围内的变化的类型是从编码本发明的嵌合蛋白质的DNA的常规诱变技术产生的，导致少数几个小的修饰，并且以上面讨论的方式筛选需要的活性。
本发明的类似物包括与DNA或RNA在严格条件下杂交，并且编码基本含有所有编码sIL-6R和IL-6的天然存在序列的本发明的嵌合蛋白质的核酸如DNA或RNA编码的那些。例如，这样的杂交DNA或RNA可以是编码具有例如图3中阐述的序列，但由于遗传密码的简并性即，由于这一简并性一些不同核苷酸序列仍然编码相同的氨基酸序列，与天然起源的核苷酸序列有核苷酸序列区别的相同蛋白质的一个。另外，正如上面也提到的，氨基酸变化(缺失，叠加，替代)的量限制在约30个氨基酸，以致变化的量最大，本发明的类似物将是基本保留在sIL-6R成份中的引导序列(在加工之前)，Ig状区，细胞因子受体N-和C-区和受体膜前区(在C区和跨膜区之间的区)和基本所有的IL-6成份的那些。这样的核酸可作为确定是否它编码保留本发明的嵌合蛋白质的功能活性的多肽的引物候选物。术语″严格条件″指本领域技术人员常规称为″严格″的那些杂交和随后的洗涤条件。参见Ausubel等人，分子生物学中的当前方案，出处同上，Interscience，纽约，6.3和6.4章，(1987，1992)，和Sambrook等人，出处同上。没有限制地，严格条件的例子包括比研究的杂交的计算Tm低12～20℃，例如2×SSC和0.5％ SDS 5分钟，2×SSC和0.1％ SDS15分钟，0.1×SSC和0.5％ SDS 37℃ 30～60分钟，然后，在68℃0.1×SSC和0.5％ SDS 30～60分钟的洗涤条件。本领域技术人员理解的严格条件依赖于DNA序列的长度，寡核苷酸探针(如10～40个碱基)或混合的寡核苷酸探针。如果利用了混合的探针，优选四甲基氯化铵(TMAC)而不是SSC。参见Ausubel，出处同上。
本发明的术语″盐″指本发明的嵌合蛋白质或其类似物的羧基基团的盐和氨基基团的酸加入盐。通过本领域已知的方法可以形成羧基基团的盐，包括无机盐，例如，钠，钙，铵，铁或锌盐等，和例如与胺，如三乙醇胺，精氨酸，或赖氨酸，哌啶，普鲁卡因等形成的有机碱性盐。酸加入盐包括例如，与矿质酸如盐酸或硫酸的形成盐，和与有机酸如乙酸或草酸形成的盐。当然，任何这样的盐必须基本具有与本发明的嵌合蛋白质或它的类似物相似的活性。
本发明也涉及编码上述嵌合蛋白质及其类似物的DNA序列以及在适当的哺乳动物中，优选地人细胞中携带表达这样的DNA序列的DNA载体。本发明的载体的实施例是含有包括在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的sIL-6R/IL-6融合序列的pcDNA3载体(Invitrogen)的质粒pcDNA sIL-6R/IL-6。
本发明也涉及能够表达上述蛋白质的转化的哺乳动物优选地人细胞。这样的转化细胞的实施例是分泌85千道尔顿糖蛋白的融合sIL-6R/IL-6嵌合体的pcDNA sIL-6R/IL-6转染的人胚肾细胞293(HEK293，ATCC CRL1573)。
其它实施例是与上述pcDNA sIL-6R/IL-6区别在于在EcoRI位点插入了编码10个另外的氨基酸的短接头的质粒pcDNA sIL-6R/L/IL-6。可以导入许多各种长度的不同序列以便使sIL-6R和IL-6之间的距离最佳化。
本发明也包括IL-6成份在sIL-6R之前的嵌合蛋白质(正如图11所示)。
本发明另外涉及生产和纯化本发明的嵌合蛋白质或其类似物的方法，包括在适于将嵌合蛋白质产物表达和分泌进入培养基的条件下生长上面的转化细胞，然后通过利用下面实施例2和5提到的抗sIL-6R单克隆抗体34.4的免疫亲和层析纯化分泌的蛋白质。
本发明也涉及含有作为活性成份的sIL-6R/IL-6嵌合体或其类似物或其混合物或其盐和药物可接受载体，稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物的实施例包括增强IL-6型反应的药物组合物，用于治疗癌症，用于骨髓移植，用于增加血细胞生成，特别是凝血细胞生成，用于治疗神经系统病症，用于治疗肝紊乱，与IL-6或相关细胞因子的其它用途。
通过将嵌合蛋白质或它的类似物与生理可接受载体，和/或稳定剂和/或赋形剂混合，并通过在剂量小瓶中冻干制备成剂量形式制备用于给药的本发明的药物组合物。给药的方法可以通过相似试剂的任何可接受的给药方式，并且将取决于待治疗的病症，例如静脉内，肌肉内，皮下，通过局部注射或局部应用，或连续地输入等。待给药的活性化合物的量取决于给药的途径，待治疗的疾病，和病人的症状。例如局部注射在体重基础上将需要比静脉内输入更低的蛋白质的量。
本发明也涉及利用嵌合蛋白质或它的类似物或其混合物用于治疗癌症，用于骨髓移植，用于增强血细胞生成，特别是凝血细胞生成，用于治疗神经系统病症，用于保护由于化学物(例如，四氯化碳，乙醇，paracetamol)或其它原因(例如病毒，外伤)的坏死性疾病的病人中的肝组织和用于IL-6或相关细胞因子的其它用途。同样，本发明也涉及用于制备治疗上面提到的病症或用于上面提到的适应症的药剂中的嵌合蛋白质或其类似物或其混合物。
除了上面提到的治疗方法，也涉及了利用该嵌合体和/或编码它的DNA的来自体内的过程和基因治疗方案。
在下面的非限制性实施例和附图中将更详细地说明本发明。
实施例1：构建sIL-6RδVal/IL-6嵌合体表达载体
在图1A～图1C中，显示除了所有各种起始和中间载体，各种试剂和反应步骤，构建携带编码sIL-6RδVal/IL-6嵌合蛋白质的序列的表达载体的步骤的流程图。这一构建步骤基本利用了本领域已知的构建选择的表达载体的技术(参见，例如Sambrook等人，1989)，过程简要如下：
在(λ)gt11噬菌体中克隆来自人胸癌T47D细胞的cDNA文库，并且利用起源于Yamasaki等人(1988)的IL-6R序列的寡核苷酸探针筛选。分离了具有整个人IL-6R编码序列的一个λgt11cDNA克隆。从λgt11通过EcoRI切出插入片断，并且克隆在大肠杆菌噬菌体质粒Blue Script pBS/SK(Stratagene克隆系统，LaJolla，加利福尼亚)的多克隆位点(MCS)中。通过EcoRI切出这一质粒pBS/SK-IL-6R(图1)，然后末端平齐化，再利用EcoRV裂解分离在IL-6R的EcoRV位点为末端的959碱基对(bp)的IL-6R的5’片断(等同1203)。在MCS的EcoRV裂开的新的pBS/SK载体中克隆从琼脂糖凝胶电泳提取的这一片断(图1中的pBS/SK-sIL-6R-RV)。
将上面提到的前面获得的pBS/SK-IL-6R DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以便在正向的引物1137～1156和反向的引物1505～1488之间扩增368bp的片断。利用刚刚在IL-6R的Val-356密码子之后的EcoRI位点合成反向引物(参见图1)，因为前面已经确定了Val残基是在人尿中挥发的可溶性sIL-6R的天然形式的羧基末端氨基酸(Novick等人，1990；Oh等人，1996，共同拥有的美国专利第5,216,128号和欧洲专利第413908B1号)。通过EcoRV和EcoRI；裂解PCR产物，并且连接进入IL-6R的EcoRV位点和MCS的EcoRI位点之间的pBS/SK-sIL-6R-RV(图1)。然后通过连接MCS的HindIII位点和在IL-6R的碱基对410的NcoI位点(两个位点首先末端平齐化)除去5’未翻译序列缩短得到的质粒pBS-sIL-6R-δVal-RI，以便产生pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoI收率(图1)。
IL-6序列起源于质粒pKKβ2～7，如前所述(Chen等人，1988)是通过利用含有接着甲硫氨酸密码子和IL-6的Proline-29密码子的EcoRI位点，结束在BstNI(EcoRII)位点的合成寡核苷酸，在大肠杆菌表达载体pKK223-3(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的EcoRI位点中插入BstNI裂解的IFN-β2/IL-6 cDNA(Zilberstein等人，1986)构建的。pKK2～7的IL-6cDNA插入片断结束在NlaIV位点中的终止密码子的7个碱基对，并且接着11bp的pKK223-3载体的HindIII位点(图1)。利用HindIII裂解pKKβ2～7DNA，末端平齐化，利用EcoRI再裂解，并且在pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoI中插入IL-6cDNA以致立即在IL-6R的Val356之后融合IL-6的成熟序列(在Pro-29开始)，由3个密码子分开(Glu-Phe-Met)。然后，在它的MCS的SalI和NotI位点再裂解得到的质粒pBS/SK-sIL-6R/IL-6(图1)，并且在pcDNA3(Invitrogen公司，圣迭戈，加利福尼亚)的EcoRV位点中克隆插入片断。得到的质粒pCDNA3-sIL-6R/IL-6(图1)含有强巨细胞病毒(CMV)启动子下游的插入片断，接着是保证sIL-6RδVal/IL-6嵌合体的有效转录的多聚腺苷酸化位点。在嵌合体中sIL-6R的5’末端的保守性保证了在哺乳动物细胞中的表达的基础上，嵌合蛋白质的信号肽功能和N末端的加工将如天然sIL-6R中。
正如上面指出的，sIL-6RδVal/IL-6构建体的有利特征是sIL-6R的天然形式和IL-6的天然形式的融合是基本的，因为它们存在于人体中，并且没有外部的多肽序列。但是，在sIL-6RδVal/IL-6构建体中EcoRI位点的保守性(图1)允许在sIL-6R和IL-6成份之间容易地导入接头多肽区段。同时构建了含有导入在sIL-6R的Val-356和IL-6的Pro-29之间的13个氨基酸接头序列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的构建体(sIL-6RδVal/L/IL-6)。
实施例2：在人细胞中表达sIL-6RδVal/IL-6嵌合体
利用哺乳动物细胞培养物的基本标准技术，细胞转染和用于待表达的新导入DNA序列的表达的转染细胞的分析(方法参见例如，Sambrook等人，1989)，利用上面的质粒构建体(实施例1)转染人细胞并且评估其中的表达。简言之，利用了下面的方法：
利用质粒构建体pCDNA3-sIL-6R/IL-6DNA转染人HEK293细胞(ATCC CRL1573转化的初级人胚肾细胞)(在上面的实施例1中阐述的)。将对数期HEK293培养物胰蛋白酶化，在9厘米的Nunc平板上播种(2.5×106细胞/平板)。一天后，通过CaPO4沉淀方法，利用10微克pCDNA3-sIL-6R/IL-6DNA进行转染(Sambrook等人，1989)，1小时后将培养基改变成DMEM-10％FCS和连续培养另外16小时。在将培养基改变成DMEM-2％FCS后，在两个连续的48小时的时期内收集分泌的蛋白质。通过在1,000rpm除去碎片10分钟，利用多克隆兔抗sIL-6R和小鼠McAB 17.6通过ELISA测试上清液的sIL-6R(Novick等人，1991)。发现1.2微克/毫升浓度的sIL-6R等当物，表明在转染的人细胞中嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的表达非常有效。
利用特异于人sIL-6R的细胞外区中的表位的单克隆抗体34.4进行分泌的嵌合蛋白质(sIL-6R/IL-6)的免疫纯化(Novick等人，1991；Halimi等人，1995)。在小鼠的腹膜腔中生长34.4杂交瘤细胞，并且通过硫酸铵沉淀从腹水中获得的免疫球蛋白(Ig)部分。利用亲和凝胶-10(Bio-Rad实验室，Richmond，加利福尼亚)固定McAB34.4(与1毫升亲和凝胶-10偶联的15毫克Ig)。在McAB 34.4的柱上吸收含有pCDNA3-sIL-6R/IL-6转染的HEK293细胞的分泌蛋白质的上清液(0.3毫升柱吸收15毫升上清液)。在利用PBS洗涤后，通过25毫摩尔柠檬酸pH2.5洗脱结合的蛋白质，然后利用1摩尔/升Hepes缓冲液pH8.5立即中和，并且对PBS过夜透析(约8～12小时)。
在SDS中聚丙烯酰胺凝胶电泳的免疫纯化蛋白质的分析显示了考马斯蓝染色的独特的蛋白质带(图2)。如预期的来自sIL-6RδVal的糖基化形式(在Oh等人，1996表示的是60千道尔顿)和糖基化IL-6(如Zilberstein等人，1986表示的23～26千道尔顿)的融合的蛋白质分子量是85千道尔顿。sIL-6R/IL-6的氨基酸序列是543个氨基酸，在信号肽加工后预测它是524个氨基酸的蛋白质或约58千道尔顿(图3)。从人细胞中的重组DNA产生的sIL-6R/IL-6嵌合体的较大的尺寸表明了分子相当大的部分的糖基化的量。
实施例3：sIL-6R/IL-6嵌合体抑制转移的黑素瘤细胞的生长和诱导它的分化
从B16黑素瘤细胞起源的F10.9克隆在C57黑/6小鼠中形成高度转移的肿瘤，在2～3个月内由于肺转移而杀死动物(Katz等人，1995)。在F10.9细胞培养物中加入sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质在细胞中产生深远的形态学变化，并且抑制它们的生长(图4)。嵌合体处理的F10.9细胞变得延长了，突出了扩展的树枝状细胞，组装了胚黑素细胞或胶质细胞的纺锤分化。
在含有10％FCS的0.2毫升RPMI1640培养基中在96孔微滴平板的孔中播种3×103个细胞之后对细胞生长测量4天。在12.5％戊二醛中固定细胞30分钟，在水中洗涤和利用0.1％结晶紫染色30分钟。在完全洗涤和干燥之后，通过10％乙酸提取颜色，在540纳米处确定光密度。嵌合体产生依赖剂量的生长抑制，在低至10纳克/毫升的嵌合(p85)蛋白的浓度下完全抑制生长(图5)。嵌合蛋白质sIL-6RδVal/IL-6和sIL-6RδVal/L/IL-6(在sIL-6R和IL-6成份之间含有较长接头的嵌合体，参见实施例1)的活性相似。这一结果也可显示在嵌合体的sIL-6R和IL-6成份之间的接头肽不是嵌合体的活性所必需的，如上面的sIL-6RδVal/IL-6嵌合体只具有非常短的3个氨基酸接头，而上面的sIL-6RδVal/L/IL-6具有较长的13个氨基酸接头肽，但两者在抑制这些转移细胞的生长时基本具有相同的活性。相反，IL-6或sIL-6RδVal都不单独抑制这些黑素瘤细胞的生长(图6)证明了sIL-6R/IL-6(p85)嵌合体蛋白质的独特活性。为了获得相似的效果，需要200～400纳克/毫升IL-6和125纳克/毫升sIL-6RδVal的混合物(图6)。当以摩尔浓度计算时，F10.9细胞的最大抑制需要7.5纳摩尔/升IL-6和2纳摩尔/升sIL-6RδVal仅对0.12纳摩尔/升的sIL-6R/IL-6嵌合体。
在McAB 34.4柱上免疫纯化过程中，接着p85 sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质的生长抑制活性的测定(参见实施例2)。对应于p85带的强度的活性图谱可在图2中的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的不同部分观察到。
实施例4：sIL-6R/IL-6嵌合体对于人骨髓移植细胞的移入是必需的
在移植进入严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠中后可以研究来自人骨髓的血细胞生成干细胞的移入(Vormoor等人，1994)。将SCID-NOD小鼠进行亚致死照射，并且在尾静脉注射3×105人CD34+骨髓细胞。注射之前，在含有不同细胞因子联合的液体培养基中培养纯化的CD34+细胞3天。一个月之后，杀死小鼠，取骨收集骨髓细胞。通过与人重复DNA进行DNA印迹影印杂交评估SCID-NOD受体小鼠中人细胞的移入。
已经发现对于能够在受体骨髓中长期移入的大多数初级多能血生成干细胞的生存和增殖，干细胞因子(SCF，青灰因子或ckit配体)和Flt3配体(flt3/flk2酪氨基酸激酶受体配体)是重要的(McKenna等人，1995)。正如图7所示，这两个因子本身对于促进在SCID-NOD受体小鼠的骨髓中移入人细胞是不够的。移入需要加入sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质到可检测的明显水平。在100纳克/毫升，sIL-6R/IL-6嵌合体比分离的IL-6(50～200纳克/毫升)和sIL-6R(125～1250纳克/毫升)更加有活性(图7)。需要sIL-6R/IL-6嵌合体表明这一蛋白质是可以寄居在和再寄居于骨髓环境的非定型多能血细胞生成干细胞的生存和增殖所必须的，表明这一蛋白质可用于骨髓移植临床方案。
这是第一次证明了sIL-6R/IL-6嵌合体至少具有下面两个新发现的活性：
(i)当与SCF和Flt3配体一起加入到人血细胞生成初级原始细胞中时，它促进它们的生存和增殖；和
(ii)在免疫缺陷的小鼠中的人骨髓移植的体内模型中它是有活性的(明显是必需的)。
实施例5：在高度纯化的初级造血干细胞上sIL-6R/IL-6嵌合体是活化的
在Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上进行人带血液单核细胞的分级分离低密度单核细胞(NMC)，接着利用miniMACS试剂盒(Miltney Biotec，Bergisch Gladbach，德国)以便制备80％纯度的CD34+细胞的群体。然后，将这些细胞通过固定的抗CD38单克隆抗体或通过荧光活化细胞分拣，回收对应于约0.1％原始细胞的CD34+CD38-群体。将这些纯化的干细胞(20,000个细胞)放置于含有50纳克/毫升的干细胞因子(SCF)和100纳克/毫升flt3-ligang(FL)(两者都来自R和D系统，Minneapolis，MN)的0.5毫升RPMI培养基，10％胎牛血清(FCS)，1％小牛血清白蛋白中悬浮培养。将培养基的一半补充100纳克/毫升的sIL-6R/IL-6嵌合体，其它没有补充培养。在5％CO2，37℃温育6天。通过注射(i.v)来自体内培养物的所有细胞进入亚致死照射的NOD-SCID小鼠中评估骨髓再寄生细胞的数目。在无菌条件下培养小鼠。在6星期后，杀死小鼠，回收它们的长骨的骨髓。在含有30％FCS，50微摩尔β-巯基乙醇，50纳克/毫升SCF，5纳克/毫升IL-3，5纳克/毫升GM-CSF，6单位/毫升红细胞生成素(所有是R&D系统)的半固体0.9％甲基纤维素平板上涂布这些骨髓(BW)细胞。培养基也含有人血清，调节到预防小鼠菌落的生长。结果(表IV)表明在悬浮培养物中加入的sIL-6R/IL-6嵌合体与SCF和FL分别比较产生的从移植的小鼠中回收的人菌落形成细胞(CFU)的数目增强了30～50倍。这表示在6天比较0天，存在于悬浮培养物中的SCID再寄生干细胞的数目有大的增加。在缺乏sIL-6R/IL-6嵌合体时，在悬浮培养的6天中，SCF和FL产生的干细胞的数目没有增加。通过实施例4中的DNA印迹影印分析从移植的NOD/SCID小鼠回收的BM细胞的DNA。当小鼠接受利用嵌合体培养的细胞时，与没有嵌合体比较，回收的人DNA的量高10倍。
如表IV中来自NOD/SCID小鼠的骨髓的CFU祖先只有当人血细胞已经在移植之前与sIL-6R/IL-6嵌合体培养时，才产生不同髓血统(巨嗜细胞和粒细胞)以及红细胞类和淋巴类血统(例如，CD19+，CD56+)的造血细胞。表IV能够再寄居NOD/SCID小鼠的骨髓的人躯干细胞在来自带血液的CD34+CD38-  培养天数  从移植的NOD/SCID小鼠的人细胞的悬浮培养过程中加入            BM形成的人造血菌落的数目
                             0              4
SCF+FL                       6              2～3
SCF+FL+sIL-6R/IL-6           6              50～100
其它实验将sIL-6R/IL-6对带血CD34+CD38+群体的影响与更高纯化的CD34+CD38-躯干细胞比较。sIL-6R/IL-6对高度纯化的细胞的体内扩展比更不纯化的细胞更加强烈地增强了(表V)。这表明大多数初级干细胞是sIL-6R/IL-6影响细胞扩展的优先的靶。表V造血干细胞的体外扩展播种的细胞群体          利用SC+FL在6天          利用SC+FL+sIL-6R/IL-6(20,000个细胞)          的细胞数目              在6天的细胞数目实验1CD34+CD38+            780,000                  675,000(×0.86)CD34+CD38-            42,000                   153,000(×3.6)实验2CD34+CD38+            330,000                  507,000(×1.5)CD34+CD38-            3,000                    18,000(×6.0)
在NOD/SCID小鼠注射前，通过增强高度纯化的CD34+CD38-干细胞的培养物的悬浮的长度测量骨髓再寄居活性的体外维持程度。在注射培养细胞后6星期，在受体小鼠的骨髓中对移入人DNA的比例进行评估。在培养过程中，在SCF和FL中加入sIL-6R/IL-6时，在培养的2星期之后仍然观察到高的移入(＞1％人DNA)，并且移入高于非培养细胞。相反，利用含有SCF，FL，GM-CSF，IL-3的培养物的实验已经显示在培养1星期后，没有保留SCID再寄居细胞(Bhata，M.等人，实验方法杂志，186，619～624，1997)。
这些结果显示sIL-6R/IL-6允许扩展和维持了能够在受体骨髓中移入的人初级干细胞。当增倍时，非分化状态的干细胞保留活性。sIL-6R/IL-6嵌合体提供了培养移入造血细胞的新方法。这也允许利用逆病毒载体在基因治疗的方案中，在移入的干细胞中导入基因。直到现在，这在人干细胞中还没有可能性因为这些初级细胞正如逆病毒DNA整合需要的循环周期中不能体外生存。sIL-6R/IL-6嵌合体解决了这一问题。
实施例6：在CHO细胞中IL-6R/IL-6嵌合体的产生
如Mory等人(DNA 5，181-193，1986)所述，图1中的质粒sIL-6R/IL-6pcDNA3的DNA与质粒pDHFR的DNA一起共转染进入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在50纳摩尔/升氨甲喋呤中生长的转染体中，分离克隆L12-[IL-6R/IL-6]。在许多通道中发现这一克隆是稳定的，并且半融合培养物通常分泌培养基，量为2.5微克/毫升IL-6R/IL-6嵌合体。
为了纯化IL-6R/IL-6嵌合体，将在2％小牛血清中的克隆L12培养物中的3.25升培养基浓缩到200毫升。在与亲和凝胶10小珠偶联的18毫升抗人sIL-6R单克隆抗体34.4柱上吸收浓缩物并(Novick等人，杂交瘤，10，137～146，1991)洗脱。利用Hepes缓冲液，pH8.6立即中和25毫摩尔/升柠檬酸洗脱物。在10千道尔顿的截止Amicon膜上浓缩蛋白质到最后浓度为1毫克/毫升。在SDS-PAGE上，观察到对应于IL-6R/IL-6嵌合体的85千道尔顿的单一带。在利用糖基化酶(Boehringer，Mannheim)处理后，由于大小减少证明了糖基化。发现在4℃，CHO产生的IL-6R/IL-6嵌合体的生物活性至少稳定5个月，通常储藏温度是-70℃。
实施例7：IL-6R/IL-6嵌合体与gp130的亲和力
将CHO产生的IL-6R/IL-6嵌合体和人IL-6和sIL-6R的混合物与IL-6的受体系统的第二链gp130(sgp130)的可溶性形式的结合进行比较(参见背景)。利用抗人gp130单克隆抗体包衣微滴96孔平板(Nunc)并且加入50纳克/毫升sgp130(两者来自R&D系统，Minneapolis)。在磷酸缓冲盐中洗涤后，在不同的孔中以不同浓度范围0.1到50纳克/毫升加入IL-6R/IL-6嵌合体。在分开的孔中，以500纳克/毫升与2到500纳克/毫升浓度的人sIL-6RVal一起加入rhuIL-6(Ares-Serono，Geneva)。在4℃温育过夜后，加入兔多克隆抗IL-6R(Oh等人，细胞因子，8，401～409，1996)，接着加入颜色反应检测的与辣根过氧化物酶共轭的山羊抗兔Ig(Sigma，圣路易斯)。图8显示了这些结果的斯卡查德图。发现IL-6R/IL-6嵌合体对于gp130的亲和力比分别加入的分子的两个部分(6.3×10-11摩尔/升对2.6×10-10摩尔/升)高4倍以上。这一结果是在线内的，并且比较在黑素瘤和在血细胞生成细胞上IL-6+sIL-6R的联合，嵌合体具有更高的活性(图9和实施例4)。
实施例8：IL-6R/IL-6嵌合体保护肝毒性
在小鼠中注射四氯化碳(CCl4)产生了严重的肝坏死导致动物死亡(Slater T.F.等人，Philos.Trans.R.Soc.Biol.Sci.311，633～645，1985)。当通过腹膜内注射给予通常缺乏IL-6的小鼠相当低剂量的CCl4(2～3毫升/公斤体重)，在24小时的致死率是70％(图10)。在CCl4之前1小时和在CCl4之后4小时注射CHO生成的IL-6R/IL-6嵌合体，保护了动物，在24小时没有看到死亡。相反，游离的rhuIL-6注射同样没有效果(图10)。IL-6R/IL-6嵌合体在每次注射时剂量为2～3微克是有效的，低于没有效果的IL-6剂量的10倍的摩尔比例。在更高剂量的CCl4(例如，3.5毫升/公斤，在图10中)，嵌合体也有保护性，致死率低于IL-6或没有细胞因子的。接受相同的CCl4攻击的嵌合体处理和未处理小鼠之间致死率的差异很明显p＜0.01。利用hematoxillin-eosin染色的肝切片的组织学观察证明CCl4产生肝组织坏死，并且IL-6R/IL-6嵌合体保护肝细胞不受这一化学物的毒性影响(未示出)。
IL-6R/IL-6嵌合体的应用可以保护由于化学物(例如，乙醇，paracetamol)或其它原因(例如，病毒性肝炎)患有坏死疾病的病人中的肝组织。
实施例9：IL-6/sIL-6RδVal嵌合体的构建和活性
构建了IL-6成份是在N末端和sIL-6R成份是在C末端的嵌合分子。在Val-356后面和接着终止密码子的Sau3a(bp1086)和HindIII裂解质粒pBS-sIL-6RδVal(参见实施例1)。如下合成了含有三个限制位点：SpeI，SmaI和BamH1的接头：SpeI           SmaI                 BamH1CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG
 A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5’(SEQ ID NO：2)
将这一sIL-6R的Sau3a的位点与接头的BamH1连接，并且在Bluescript pBS SK质粒的多倍克隆位点中克隆。通过PCR利用引物从pKKβ2-7DNA扩增IL-6序列(起始密码下划线)：
      SpeI正向5’GA CTA GTA GCT  ATGAAC TCC TTC TC(SEQ ID NO：3)
      HaeIII反向5’AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C(SEQ ID NO：4)
在上面的接头的SpeI和SmaI位点之间导入利用SpeI和HaeIII裂解的PCR产物。如下合成了含有内部SmaI的另一个接头BamH1-NcoI：
                                  SmaI5’GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C[NcoI][BamH1] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5′
                  (SEQ ID NO：5)在前面的接头的BamH1和IL-6R序列的NcoI1464之间克隆它。然后在第二个接头的SmaI和IL-6R的NcoI之间导入SmaI 867到NcoI1464的IL-6R片断。测序得到的嵌合DNA，并且在pCDNA3中再克隆以便在人HEK 293细胞中表达。这一IL-6-IL-6R嵌合体3e的氨基酸序列在图11中表示了(接头下划线)。通过在抗IL-6单克隆抗体上亲和层析纯化的嵌合体3e(如在Novick等人，杂交瘤8：561-567，1989)。在SDS-PAGE上，观察到了75千道尔顿的带。
图12显示了抑制F10.9黑素瘤细胞的生长的IL-6-IL-6R嵌合体3e的生物活性。在同样的实验中，虽然对于50％的生长抑制需要更多的活性，与IL-6R/IL-6嵌合体(制剂1-3)比较显然它更加具有活性。
制成两个IL-6R/IL-6的突变体，其中将IL-6R/IL-6的IL-6R成份的His-280和Asp-281(图3)通过PCR诱变分别改变成Ser和Val(突变体39或HD)，或其中另外将Asn-230改变成Asp(突变体NHD)。正如图12中可以看到，如与IL-6R/IL-6和IL-6-IL-6R嵌合体比较，这两个突变体几乎没有活性。因为在IL-6R中，正如分子模型(Halimi等人，1995)显示，这些氨基酸与gp130反应，这证明了sIL-6R/IL-6嵌合体保存了这一基本的相互作用位点。
IL-6-IL-6R嵌合体3e丢失了存在于IL-6R/IL-6的IL-6R的免疫球蛋白状区。但是，刚刚从IL-6R/IL-6除去Ig-区没有减少它在F10.9细胞上的生物活性。IL-6-IL-6R嵌合体3e与gp130的结合是另一个IL-6R/IL-6嵌合体的约30％(未示出)。这一较低结合是在黑素瘤细胞生长上的更低的活性的线内的。
这些结果证明通过与sIL-6R的融合，封闭IL-6羧基末端在这样的新嵌合体中保存了良好的生物活性。
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Yamasaki K，Taga T，Hirata Y，Yawata H，Kawanishi Y，SeedB，Taniguchi T，Hirano T和Kishimoto T.人白细胞介素-6(BSF-2/干扰素-2)受体的克隆和表达。科学241：825～828，1988。
Ziberstein A，Ruggieri R，Korn HJ和Revel M.人干扰素-β-2生长刺激细胞因子可诱导的不同种类的cDNA和基因的结构和表达，EMBO J.，5：2529～2537，1986。
                 序列表(1)总的情况：
(i)申请人：
  (A)姓名：耶达研究和开发有限公司
  (B)街道：魏茨曼科学研究所，邮政信箱95号
  (C)城市：雷霍沃特
  (E)国家：以色列
  (F)邮编：76100
  (G)电话：972-8-9344093
  (H)传真：972-8-9470739
  (A)姓名：雷维尔·米歇尔
  (B)街道：拜特巴西域5，魏茨曼科学研究所
  (C)城市：雷霍沃特
  (E)国家：以色列
  (F)邮编：76100
  (A)姓名：舍巴特·朱迪思
  (B)街道：雷霍米勒13
  (C)城市：雷霍沃特
  (E)国家：以色列
  (F)邮编：76284
  (A)姓名：拉皮多特·茨韦
  (B)街道：雷霍博克瑟6
  (C)城市：内斯-宰纳
  (E)国家：以色列
  (F)邮编：74046
  (A)姓名：科莱特·奥里特
  (B)街道：雷霍拉马特切恩14
  (C)城市：拉马特甘
  (E)国家：以色列
  (F)邮编：52232
(ii)发明题目：白细胞介素-6可溶性受体/配体蛋白质，其类似物和其用途
(iii)序列数目：8
(iv)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：Patentln Release#1.0，Version#1.30版(EPO)
(vi)过去的申请资料：
  (A)申请号：IL 121284
  (B)申请日：1997年7月10日
(vi)过去的申请资料：
  (A)申请号：IL 122818
  (B)申请日：1997年12月30(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：13个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
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(ii)分子类型：肽
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Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met
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  (A)长度：44个碱基对
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  (A)长度：25个碱基对
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  (A)长度：21个碱基对
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Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly
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  (A)长度：543个氨基酸
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Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1                 5                 10                  15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
            20                  25                  30
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
         35                  40                  45Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
 50                  55                  60Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg65                   70                  75                  80Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
             85                  90                  95Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
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    115                 120                 125Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
130                 135                 140Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp145                 150                 155                 160Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
            165                 170                 175Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
        180                 185                 190Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
    195                 200                 205Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
210                 215                 220Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp225                 230                 235                 240Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
            245                 250                 255Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
        260                 265                 270Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
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290                 295                 300Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser305                 310                 315                 320Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr
            325                 330                 335Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
        340                 345                 350Ser Leu Pro Val Glu Phe Met Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys
    355                 360                 365Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile
370                 375                 380Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys385                 390                 395                 400Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu
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450                 455                 460Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val465                 470                 475                 480Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr
            485                 490                 495Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala
        500                 505                 510Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser
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530                 535                 540(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：471个氨基酸
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(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu1                5                   10                  15Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
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 50                  55                  60Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser65                   70                  75                  80Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
             85                  90                  95Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
        100                 105                 110Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
    115                 120                 125Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
130                 135                 140Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn145                 150                 155                 160Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
            165                 170                 175Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His
        180                 185                 190Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala
    195                 200                 205Leu Arg Gln Met Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly
210                 215                 220Pro Gly Val Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser225                 230                 235                 240Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser
            245                 250                 255Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro
        260                 265                 270Ala Glu Asp Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys
    275                 280                 285Phe Ser Cys Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile
290                 295                 300Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr305                 310                 315                 320Gln Thr Phe Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn
            325                 330                 335Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr
        340                 345                 350Trp Gln Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe
    355                 360                 365Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met
370                 375                 380Val Lys Asp Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly385                 390                 395                 400Leu Arg His Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly
            405                 410                 415Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu
        420                 425                 430Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala
    435                 440                 445Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala
450                 455                 460Asn Ala Thr Ser Leu Pro Val465                 470

Claims (37)

1.嵌合糖基化可溶性白细胞介素-6受体(sIL-6R)-白细胞介素-6(IL-6)蛋白质(sIL-6R/IL-6)及其生物活性类似物，含有在基本所有sIL-6R的天然存在形式和基本所有IL-6的天然存在形式之间融合的蛋白质产物，所述的sIL-6R/IL-6及其类似物以相似的方式糖基化成天然存在的sIL-6R和IL-6的糖基化形式。
2.根据权利要求1所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中将所述的sIL-6R通过肽接头分子与IL-6融合。
3.根据权利要求2所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的接头是非常短的，约3个氨基酸残基的非免疫原性接头。
4.根据权利要求3所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的接头是序列E-F-M的三肽(Glu-Phe-Met)。
5.根据权利要求2所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的接头是13个氨基酸残基的序列的肽，E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M(Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met)。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，是在sIL-6R的C末端Val-356和IL-6R的N末端Pro-29之间具有三肽接头序列E-F-M的命名的sIL-6RδVal/IL-6，所述的嵌合蛋白质具有图3中阐述的序列。
7.根据权利要求1，2和5中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质是命名的在sIL-6R的C末端Val-356和IL-6R的N未端Pro-29之间具有13个氨基酸肽接头序列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M的sIL-6RδVal/IL-6，所述的嵌合蛋白质具有图3中阐述的序列，其中在图3的位置357～359之间的三肽序列E-F-M被13个氨基酸肽序列替代了。
8.根据权利要求1所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质是在IL-6的MET-212和sIL-6R的VAL-112之间具有14个氨基酸肽接头序列G-G-G-G-D-P-G-G-G-G-G-G-P-G(SEQ ID NO：6)，整个IL-6在sIL-6R序列之前的命名IL-6/sIL-6R，所述的嵌合蛋白质具有图11中阐述的序列。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，其中所述的蛋白质以完全加工的形式在哺乳动物细胞中产生。
10.根据权利要求9所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，其中所述的蛋白质是在人细胞中产生的。
11.根据权利要求9所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质，其中所述的蛋白质是在CHO细胞中产生的。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的嵌合蛋白质和类似物由于能够抑制高度恶性癌细胞的生长而得到鉴定。
13.根据权利要求12所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中因为能够抑制高度恶性黑素瘤细胞的生长鉴定了所述的嵌合蛋白质和类似物。
14.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物，其中所述的嵌合蛋白质和类似物因为能够引发骨髓移植中人血细胞生成细胞的体内移入而得到鉴定。
15.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质和生物活性类似物，其中所述的嵌合蛋白质和类似物因为能够保护肝不受肝毒性试剂影响而得到鉴定。
16.根据权利要求1～11中任一项所述的编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物的DNA序列。
17.根据权利要求1～11中任一项所述的含有编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质及其生物活性类似物的DNA序列的DNA载体，所述的载体适于在哺乳动物细胞中表达所述的嵌合蛋白。
18.根据权利要求17所述的DNA载体，其中所述的载体是适于在人细胞中表达所述的嵌合蛋白质。
19.根据权利要求17所述的DNA载体，其中所述的载体是适于在CHO细胞中表达所述的嵌合蛋白质。
20.根据权利要求17～19中任一项所述的DNA载体，其中所述的载体是在哺乳动物或人细胞中表达的，表达的嵌合蛋白质具有允许哺乳动物或人细胞完全加工嵌合蛋白质和将完全加工的嵌合蛋白质从细胞分泌进入所述的细胞生长的培养基中的序列。
21.根据权利要求17～20中任一项所述的DNA载体，其中所述的载体是命名为含有pcDNA3载体的质粒pcDNAsIL-6R/IL-6，pcDNA3载体含有巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的DNA序列。
22.根据权利要求17～20中任一项所述的DNA载体，其中所述的载体是命名为质粒pcDNA sIL-6R/L/IL-6，该质粒含有pcDNA3载体，该载体含有在巨细胞病毒控制下的编码嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的DNA序列，其中在编码所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质的所述DNA序列的放置于编码sIL-6R部分的序列和编码蛋白质的IL-6部分的序列之间的EcoRI位点插入了编码肽接头的接头序列。
23.含有权利要求17～22中任一项所述的DNA载体的转化的哺乳动物细胞，能够表达所述的载体携带的sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质序列并且完全加工表达的蛋白质和将它分泌进入所述的细胞生长的培养基中。
24.根据权利要求23所述的转化细胞，其中所述的细胞是pcDNAsIL-6R/IL-6载体转染的人胚肾细胞293(HEK293)，所述的细胞能够表达sIL-6R/IL-6嵌合蛋白质，完全加工所述的蛋白质并且将所述的蛋白质以约85千道尔顿糖蛋白的形式分泌进入所述的细胞生长的培养基中。
25.生产根据权利要求1～14中任一项所述的嵌合蛋白质或其生物活性类似物的方法，包括在适于表达的条件下生长权利要求23或24所述的转化细胞，加工和将所述的蛋白质或类似物分泌进入所述的细胞生长的培养基中，从所述的培养基中纯化所述的蛋白质或类似物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中利用特异于sIL-6R的单克隆抗体的免疫亲和层析进行纯化。
27.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐，及其混合物用于癌细胞的抑制剂。
28.根据权利要求27所述的嵌合蛋白质或类似物用于高度恶性黑素瘤细胞的抑制剂。
29.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐，和其混合物作为在骨髓移植中引发人血细胞生成细胞的移入的活性成份的用途。
30.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐，和其混合物作为保护肝不受肝毒素试剂影响的活性成份的用途。
31.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐，和其混合物作为增强血细胞生成，治疗肝或神经系统症状，或其它利用IL-6或sIL-6R的应用的活性成份的用途。
32.根据权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或类似物，其任何一个的盐及其混合物用于制备通过抑制哺乳动物癌细胞治疗哺乳动物癌症的药剂，用于制备通过在骨髓移植中引发人血细胞生成细胞的移入增强骨髓移植的药剂，或用于制备增强血细胞生成的药剂，或用于制备治疗肝或神经系统紊乱的药剂，或用于制备利用IL-6或sIL-6R的其它应用的药剂。
33.含有作为活性成份的权利要求1～11中任一项所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白质或其类似物和药物可接受载体，稀释剂或赋形剂的药物组合物。
34.根据权利要求33所述的药物组合物用于治疗癌症。
35.根据权利要求33所述的药物组合物用于增强骨髓移植。
36.根据权利要求33所述的药物组合物用于治疗肝或神经系统紊乱，或用于增强血细胞生成或用于利用IL-6或sIL-6R的其它应用。
37.治疗哺乳动物中的癌症，增强骨髓移植，治疗肝或神经系统紊乱，增强血细胞生成或其中利用了IL-6或sIL-6R的其它应用的方法，包括以适当剂量形式和通过适当给药途径为病人服用权利要求33～36中任一项所述的药物组合物。
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