DK175380B1 - Mutant af human vævsplasminogenaktivator, DNA-sekvens som koder herfor, replicerbar udtrykkelsesvektor til at udtrykke denne DNA-sekvens, mikroorganisme transformeret med denne vektor, cellekulturer transformeret med denne.... - Google Patents

Description

i DK 175380 B1

Den foreliggende opfindelse angår særlige hidtil ukendte mutanter éfAiuman vævsplasminogenaktivator (t-PA). Selv om disse mutanter generisk er omfattet af tidligere offentliggørelse, som anført nedenfor, udgør de hidtil ukendte specifikke derivater, som udviser aktiviteter, der ikke kunne forudsiges ud fra andres tidligere 5 forskning i det grundliggende human-vævsplasminogenaktivator-molekyle eller se- i.

rinproteasemodellerne trypsin og chymotrypsin.

Opfindelsens baaorund 10 Human vævsplasminogenaktivator blev først identificeret som et i det væsentlige rent isolat fra en naturlig kilde og afprøvet for den krævede plasmonogenaktivator-aktivitet af Collen et al., EP-offentliggørelsesskrift nr. 041766, offentliggjort den 16. december 1981, baseret på en US-prioritet fra den 11. juni 1980.

15 Senere har forskere i ansøgerens laboratorium fremstillet human vævsplasminogenaktivator, som er i hovedsagen fri for proteiner, hvormed den almindeligvis er forbundet, via rekombinant DNA-teknologi. Dette arbejde er blevet rapporteret i den videnskabelige litteratur og i EP-offentliggørelsesskrift nr. 093 619, offentliggjort den 9. november 1983, baseret på en US-prioritet fra den 5. maj 1982. Dette 20 EP-offentliggørelsesskrift omfatter fremstillingen af forskellige humanplasminogen-aktivatorderivater, modificeret på forskellig måde ved aminosyreudskiftninger, -deletioner eller -tilføjelser, frembragt fx ved stedsdirigeret mutagenese af den underliggende DNA. 1 2 3 4 5 6 35

Som angivet deri forekommer human vævsplasminogenaktivator (t-PA) i både en 2 enkelt-kæde- og en to-kædeform, den sidstnævnte er et proteolytisk derivat af den 3 førstnævnte. Det er blevet påvist, at proteolytisk omdannelse af enkelt-kæde-for- 4 men til to-kæde-formen sker under lysen af et fibrinkoagel; Rijken et al., J. Biol.

5

Chem. 257. 2920 (1982). Det antages, at to-kæde-formen er det middel, som er 6 ansvarligt for vævsplasminogenaktivator-aktiviteten, selv om der har været nogle indledende rapporter, som angav, at enkelt-kæde-formen af human t-PA, Rijken ibid, og enkelt-kæde-formen af svine-t-PA, Ranby et al, Thromb. Res. 27, 176 (1982), kan have nogen aktivitet; se også Rijken et al., Biochem. Biophy. Acta 580. 140 (1979).

I DK 175380 B1 I

I 2 I

I Senere undersøgere har imidlertid afvist sådanne rapporter om enkelt-kæde-akti- I

I vitet som resultatet af forurening af disse præparater med små mængder af to- I

I kæde-formen; Andreasen et al. EMBO J. 2Q, 151 (1984); Ichinose et al. FEBS. I

I Letters 175. 412 (1984). Sådanne senere rapporter har igen bekræftet den almene

I 5 antagelse, at serinproteser, herunder t-PA, udtrykkes som inaktive enkelt-kæde- I

I zymogener, som kun bliver aktive efter hydrolyse af proteinet ved et specifikt I

I center, fx arginin ved position 275 i t-PA’s tilfælde. I

I Jn wVo-sammenligninger af evnen hos enkelt-kæde i forhold til to-kæde-plasmino- I

I 10 genaktivator til at lysere fibrinkoagler er blevet gennemført under anvendelse af I

I kaniner og hunde. I kaniner er der blevet iagttaget tilnærmelsesvis ens styrke for I

I de to former af dette enzym; Collen et al., J. Clin. Invest. 21» 368 (1983). Nar de I

I blev bedømt ved en lignende model i hunde, blev imidlertid enkelt-kæde-formen af I

I plasminogenaktivator rapporteret at være lidt mindre aktiv end to-kæde-formen; I

I 15 Korninger et al., J. Clin. Invest. §9, 573 (1982). Disse undersøgelser tyder derfor I

I på, at enkelt-kæde-plasminogenaktivator ikke er bedre end, og faktisk kan være I

I mindre kraftig end, to-kæde-formen af plasminogenaktivator i deres evne til at I

I opløse fibrinkoagler in vivo. I

I 20 Sammenfatning af opfindelsen I

I Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte mutanter af human t-PA, som I

I overraskende udviser aktivitet på linje med eller bedre end den humane t-PA, som I

I først blev isoleret af Collen et al., (EP-offentliggørelsesskrift nr. 041 766), såvel I

I 25 som de t-PA-molekyler, som er beskrevet i de førnævnte rekombinant-rapporter I

I (EP-offentliggørelsesskrift nr. 093 619). I en særlig udførelsesform inkluderer de I

I specifikke mutanter, som omfattes af den foreliggende opfindelse, dem, der har I

I visse aminosyresubstitutioner i centret omkring positionerne 275 og 276 i den hu- I

I mane t-PA-aminosyresekvens, hvilke positioner indtages af henholdsvis arginin og I

I 30 isoleucin. Visse enzymatisk aktive molekyler genkender dette center (disse centre; I

I eventuelt sammen med én eller flere naboaminosyrer) og hydrolyserer funktionelt I

I bindingerne efter basiske aminosyrer, især mellem arginin/isoleucin og lysin/glycin, I

I til dannelse af to-kæde-materiale. De to kæder forbliver forbundet igennem disul- I

I fidbinding via cysteinrester. Ifølge denne udførelsesform af opfindelsen tjener fx I

35 udskiftningen ved disse positioner med andre aminosyrer end fx arginin og lysin til I

ίi„lujiS^BSS^^SS^^S^SSSHwEBBPS-:'*.iif . ~* DK 175380 B1 3 at frembringe mutanter, hvori de respektive spaltningscentre er ændret, således at der ikke dannes to-kæde-human-t-PA in vitro eller in vivo, eller kun dannes med reduceret hastighed. Således tilvejebringer dette aspekt af opfindelsen mutagene-ret enkelt-kæde-human-t-PA til afprøvning af biologisk aktivitet. Det har vist sig, at 5 sådanne mutanter gøres immune eller i det mindste resistente over for hydrolyse ved 275/276-centret, og at de resulterende enkelt-kæde-human-t-PA-mutanter uventet er på lige fod med aktiviteten af de ovennævnte af Collen et al. beskrevne og/eller rekombinante t-PA-molekyler ved visse biologiske prøvninger. Endvidere er indikationerne, at sådanne mutanter er mindre reaktive med naturligt forekom-10 mende t*PA-inhibitorer.

Kort beskrivelse af tegningerne

Fig. 1 er et restriktionskort over DNA’en for human-t-PA og inkluderer 5’- og 3’-15 utranslaterede områder såvel som sekvenser, der koder for præ-t-PA. Det prikkede område repræsenterer strukturgenet for t-PA.

Fig. 2A, B og C repræsenterer DNA’en og aminosyresekvenserne 12H- & lOHof-præ-t-PA inklusive 5’- og 3'-utranslaterede områder.

20

Fig. 3 er det samlede skema anvendt til at frembringe individuelle kloner indeholdende udskiftninger ved position 275.

Fig. 4-8 gengiver konstruktionen af ρΧΑΡΡΑΙδ 3'Axl0trpR.

25

Fig. 9 gengiver plasmidet pPADHFR-6 med relevante restriktionscentre.

Fig. 10 gengiver plasmaproteaseinhibitorkomplekseme dannet af radiomærket t-PA (venstre plade) og EIKGG-t-PA (højre plade) som detekteret ved autoradiografi på 30 en SDS-PAGE-gel.

Fig. 11 viser fibrinbindingsegenskabeme af enkelt-kæde-t-PA, to-kæde-t-PA og af den muterede enkelt-kæde-t-PA (EIKGG).

I DK 175380 B1 H Fig. 12 gengiver en dosis-reaktionskurve ved koagellyse in vivo (EIK er muteret enkelt-kæde-t-PA; rt-PA er ikke-muteret t-PA).

Detailbeskrivelse H 5 I denne beskrivelse med krav betegner "human vævsplasminogenaktivator", "hu- man-t-PA" eller "t-PA" human ydre (vævstype) plasminogenaktivator som produ- ceret fx af rekombinante cellekultursystemer i bioaktive former omfattende en proteasedel og svarende til den plasminogenaktivator, som ellers er nativ for hu- lo mant væv. Det vil forstis, at der forekommer naturlige alleliske variationer fra in- divid til individ, påvist ved én eller flere aminosyreforskelle i den samlede sekvens.

Desuden vil glycosyleringsmønstre afhænge af arten af det værtscellulære miljø.

Human vævsplasminogenaktivator er et polypeptid, som har to funktionelle områ- 15 der bestående af et proteasedomæne, som er i stand til at omdanne plasmino- genaktivator til plasmin, og et kringleholdigt domæne, som antages at være an- svarligt for fibrinbinding. t-PA inkluderer derfor polypeptider indeholdende disse funktionelle domæner som en del af den samlede sekvens.

20 Et "to-kæde-spaltningscenter" i t-PA omfatter mindst argininresten i position 275.

Imidlertid antages forskellige aminosyrer i nabostilling til eller inden for en afstand af flere rester fra position 275 også at være en del af det domæne, som genkendes af enzymer, der omfatter plasminogenaktivator til dens to-kæde-form. Således kunne udskiftning af aminosyrer i andre positioner end 275 inden for domænet re- 25 sultere i mutant-plasminogenaktivatorer, som er resistente over for omdannelse til I to-kæde-formen.

I I den særlige udførelse betyder "enkelt-kæde-plasminogenaktivator-mutant" en plasminogenaktivator, som er resistent over for omdannelse til to-kæde-formen.

I 30 Den er karakteriseret ved enkelte eller flerdobbelte aminosyreudskiftninger i to- I kæde-aktiveringscentret. Som modificeret genkendes et sådant aktiveringscenter I ikke enzymatisk og hydrolyseres derfor ikke af enzymer, som normalt omdanner I plasminogenaktivator til dens to-kæde-form.

H

DK 175380 B1 I

Ved analogi til trypsin og chymotrypsin antages det, at vigtigheden af dannelsen af

to-kæde-formen af enhver serinprotease er den deraf følgende tilstedeværelse af I

den frie a-aminogruppe i t-PA i position 276. Ved denne sammenligning ville α- I

aminogruppen 276 efter spaltning ved Arg-275 være fri til at samvirke med poly- I

5 peptidkæden i området af aktivcenter-serinresten i t-PA. Den foreliggende opfin- I

delse omfatter derfor enhver mutation, som ville gribe ind i en sådan α-amino- I

gruppes samvirken med det proteaseaktive center uden at formindske den samlede I

aktivitet af molekylet som helhed. I

10 En række forskellige metoder kan anvendes til at inducere mutationer af underlig- I

gende DNA til fremstilling af mutanter deraf. En sådan metode, der belyses i denne I

beskrivelse som en særlig foretrukken udførelsesform, går ud på, at der først ind- I

sættes et fragment af det native t-PA-gen indeholdende sekvenser, som koder for I

det område, som skal muteres i den replikative form af fag M13mp8 til dannelse af I

I 15 M13mp8PA. Et syntetisk oligonukleotid, som er komplementært til de indsatte t- I

I PA-sekvenser, men indeholder én eller flere nukleotidtripletter, som koder for den I

I aminosyre, som skal indføres, sammensmeltes med den enkeltstrengede form af I

I M13mp8PA til dannelse af et dobbeltstrenget område. Dette område tjener som I

I startkæde (primer) for DNA-polymerase-I-syntese af den resterende komplemen- I

I 20 tære streng. Efter replikation og identifikation kan den mutante t-PA-sekvens yder- I ligere modificeres eller anvendes til at konstruere en prokaryotisk eller eukaryotisk I vektor til udtrykkelse af det muterede t-PA-polypeptid.

I Den ovenfor beskrevne almene metode kan også anvendes til at mutere t-PA i an- I 25 dre positioner end 275/276- og/eller 277/278-to-kæde-spaltningscentrene til frem- I stilling af muterede t-PA-derivater, som falder inden for opfindelsens område. Så- I t danne andre positioner er polypeptidsekvenser, som er følsomme for enzymatisk I hydrolyse, såsom trypsinlignende spaltningscentre, der typisk omfatter arginin eller I lysin efterfulgt af isoleucin, serin eller alanin. Udskiftning af én eller flere aminosy- I 30 rer inden for sådanne trypsinlignende spaltningscentre resulterer i mutante t-PA’er, I som modstår hydrolyse med trypsinlignende proteaser. Sådan resistens over for I enzymatisk nedbrydning under udtrykkelse og rensning såvel som under in vivo- I indgivning som farmaceutisk middel resulterer i en t-PA, som ikke mister biologisk I aktivitet sammenlignet med den ikke-muterede t-PA. Eksempler på sådanne tryp- I 35 sinlignende spaltningscentre inden for det humane t-PA-molekyle inkluderer argi- I DK 175380 B1 nin-alanin (positionerne 40-41), arginin-serin (positionerne 27-28) og arginin-serin (positionerne 462-463).

A. Alment

Der fremstilles muterede t-PA-derivater af den omhandlede art 1) med methionin som den første aminosyre (til stede på grund at ATG-startsignalkodonindsætning foran strukturgenet) eller 2) hvor methionin er fraspaltet intra- eller ekstracellu- lært, så det har den normale første aminosyre, eller 3) sammen med enten dets 10 signalpolypeptid eller et andet konjugeret protein end dets konventionelle signal- polypeptid, hvori signalpolypeptidet eller konjugatet er specifikt fraspalteligt i et intra- eller ekstracellulært miljø, eller 4) direkte udtrykt i moden form uden nød- vendigheden af at fraspalte noget fremmed, overflødigt polypeptid. I hvert tilfælde udvindes den således producerede humane muterede t-PA i dens forskellige former 15 og renses til et niveau, som er egnet til behandling af forskellige vaskulære til- stande eller sygdomme, såsom hjerteinfarkt, apopleksi, lungeemboli, dybvene- thrombose, perifer arteriel okklusion og andre thrombotiske tilstande.

Human muteret t-PA har også en funktionel definition ved at være i stand til at 20 bindes til fibrin og at formidle in vivo- eller in v/tro-omdannelse af plasminogen til plasmin, som igen solubiliserer fibrinkoagler.

"Udtrykkelsesvektor" inkluderer vektorer, som er i stand til at udtrykke DNA-se- I kvenser indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er operabelt forbundet med andre I 25 sekvenser, som er i stand til at frembringe dens udtrykkelse, og som er replicer- bare i værtsorganismer enten som episomer eller som en integreret del af den kromosomale DNA.

I "Rekombinante værtsceller" henfører til celler, som er blevet transformeret med I 30 udtrykkelsesvektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik.

I B. Værtscellekulturer og -vektorer I De vektorer og den fremgangsmåde, som er angivet heri, er egnet til anvendelse i I 35 værtsceller over et bredt område af prokaryotisk og eukaryotiske organismer. For DK 175380 B1 7 eksempel er £* fiali K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) særlig nyttig. Andre mikroorganismestammer, som kan anvendes, er fx L· ggli B. og E* coii X1776 (ATCC nr. 31537). Disse er kun belysende eksempler.

^ 5 Foruden prokaryoter kan anvendes eukaryotiske organismer sisom gærkulturer.

Kulturer af celler afledt af flercellede organismer er for tiden de foretrukne værter.

I princippet er enhver sådan cellekultur brugbar; men interessen har været størst for celler fra hvirveldyr, og formering af disse celler i kultur (vævskultur) er blevet en reproducerbar procedure; se Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patter-10 son, red. (1973). Eksempler på sådanne nyttige værtcellelinjer er VERO- og HeLa-celler. Kinesisk hamsterovarie (CHO)-cellelinjer, W138-, BHK-, COS-7- og MDCK-cellelinjer.

De nedenfor anførte eksempler beskriver anvendelsen af E. cpU under anvendelse 15 af trp-promotorsystemet og anvendelsen af CHO-celler under anvendelse af ud-trykkelsesvektorer, der inkluderer SV40-repliceringsoriginet som promotor. Imidlertid ville det være inden for fagmandens kunnen at anvende alternative prokary-otiske eller eukaryotiske værtscellekulturer.

20 C. Anvendte metoder 1. Transfektion

Hvis der anvendes celler uden formidable cellevægbarrierer som værtsceller, kan 25 transfektion udføres ved calciumphosphatfældningsmetoden som beskrevet af Graham et al., Virology 52, 546 (1978). Imidlertid kan der også anvendes kerneinjektion eller protoplastfusion.

Hvis der anvendes prokaryotiske celler eller celler, som indeholder væsentlige cel-30 levægkonstruktioner, er den foretrukne transfektionsmetode via calciumchlorid som beskrevet af Cohen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) é£), 2110 (1972).

35 I DK 175380 B1 H 2. Vektorkonstruktion

Konstruktion af egnede vektorer indeholdende den ønskede kode- og styresekvens sker ved i sig selv kendt standardligeringsteknik. Isolerede plasmider eller DNA- 5 fragmenter spaltes, skræddersys og religeres i den ønskede form til dannelse af de nødvendige plasmider.

D. EKSEMPLER

10 1. Konstruktion af M13mp8PABoIII til t-PA-mutaaenese

Human-t-PA-DNA blev opnået fra plasmiderne pPADHFR-6 (også betegnet pETPFR) og pA25ElO. Fremstillingen af disse to t-PA-plasmider er beskrevet i det oven- nævnte EP-offentliggørelsesskrift nr. 093 619 og betragtes som inkorporeret i 15 denne beskrivelse ved henvisning.

Plasmid pA25E10 indeholder sekvenser, som koder for mindst 508 aminosyrer af t- PA-genet og 772 basepar af det 3'-utranslaterede område. Dette plasmid blev ned- brudt med SacI og Bglll til dannelse af et fragment på 744 basepar, som blev iso- 20 leret ved tidligere beskrevne standardmetoder. Som det kan ses af den kendte se- I kvens og restriktionskortet for t-PA i fig. 1, indeholder dette fragment kodoneme I for t-PA-aminosyrerne 411-527 og inkluderer en del af det 3’-utranslaterede områ- de.

25 Plasmidet pPADHFR-6 indeholder hele strukturgenet for t-PA og en del af det 3’- I utranslaterede område. Dette plasmid blev nedbrudt med SacI og Bglll til dannelse af et fragment på 1230 basepar, som blev isoleret. Dette fragment indeholder ko- I doner for de første 410 aminosyrer af den modne form af t-PA.

I 30 Disse fragmenter blev ligeret sammen under anvendelse af standardmetoder og I nedbrudt med Bglll. Der blev isoleret et fragment på 1974 basepar indeholdende I kodoner for hele den modne t-PA-sekvens plus en del af det 3’-utranslaterede I område. Dobbeltstrenget M13mp8 (Messing et al, Third Cleveland Symposium on I Macronolecules Recombinant DIMA, red. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), I 35 side 143) blev nedbrudt BamHI og sammensmeltet med den Bglll-nedbrudte t-PA- MUM Hill - DK 175380 B1 9 sekvens til dannelse af M13mp8PABgIII. F £oIi JM 101-celler (ATCC nr. 33876) blev transformeret med den dobbeltstrengede replikative form af M13mp8PABgIII.

De enkeltstrengede og dobbeltstrengede (RF) former af M13mp8PABgIII kan isoleres fra EL coK JM 101-celler inficeret med denne fag. Den enkeltstrengede form 5 blev anvendt til den stedsspecifikke mutagenese af t-PA.

2. Syntese af startkæder for stedsspecifik mutaaenese

Det humane t-PA-strukturgen blev modificeret ved stedsspecifik mutagenese til at 10 udtrykke t-PA'er med aminosyreudskiftninger i forskellige positioner. Der blev fremstillet syntetiske oligonukleotider fx ved fast-fase-phosphotriestermetoden beskrevet af Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 25, 5765 (1978). De følgende syntetiske startkæder blev fremstillet og anvendt til sådan stedsspecifik mutagenese: 15

Nativ amino- 275 279 syresekvens Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly

Nativ

20 DNA-sekvens G CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA G

Startkæde 1B8 Gly

DNA-sekvens G CCT CAG TTT GGT ATC AAA GGA G

25 Startkæde 2C9 Glu

DNA-sekvens G CCT CAG TTT GM ATC AAA GGA G

Startkæde 4A10 Gly

DNA-sekvens G CCT CAG TTT GGT ATC ATC GGA G

30

Startkæde 3A7 Gly Ile

DNA-sekvens G CCT CAG TTT GGT ATC £TC GGA G

Startkæde 4B3 Glu Ile

35 DNA-sekvens G CCT CAG TTT GAA ATC ATC GGA G

I DK 175380 B1 I

I I

Aminosyre- og gensekvensen af nativ t-PA er afbildet i de første to. linjer. Startkæ- I

derne har tripletter, som adskiller sig fra den native gensekvens ved de viste res- I

ter. Den tilsvarende aminosyreudskiftning er vist oven over tripletten, som koder I

5 for den aminosyre. I

3. Stedsspecifik mutaaenese

De i det følgende beskrevne procedure blev anvendt til at frembringe forskellige t- I 10 PA-kloner indeholdende den muterede sekvens af de syntetiske startkæder. Den

almene metode, som blev anvendt, er den, der er beskrevet af Adelman et al. DNA

2, 183 (1983), der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning.

Det samlede skema til frembringelse af hver af disse kloner er vist i fig. 3.

M13RF1B8, M13RF2C9 og M13RF4A10 blev skabt ved anvendelse af startkæder in- I 15 deholdende mutationer for de enkelte viste aminosyrer. Enkelt standard M13RF4A10 indeholdende en mutation i position 277 blev sammensmeltet med I startkæde 3A7 eller 4B3 til dannelse af henholdsvis M13RF3A7 og M13RF4B3. Ren- set M13 FR-DNA fra hvert af disse muterede t-PA-gener blev fremstillet ud fra E.

coli 3M 101-celler. Senere blev DNA-fragmenter indeholdende den muterede t-PA- 20 DNA-sekvens anvendt til at konstruere udtrykkelsesvektorer for den muterede t- PA.

I 50 ng af et syntetisk oligonukleotid blev phosphoryleret i 30 minutter ved 37°C i I 10 μΙ 50 mM "Tris"-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP in- 25 deholdende 8 enheder T4-polynukleotidkinase. Til anvendelse som sonde blev 400

ng af det syntetiske oligonukleotid phosphoryleret som ovenfor, undtagen af ATP

blev erstattet med 60 mCi [y^PJ-ATP (3000 μΟ/πιΠΊοΙ), hvilket resulterede i om- kring 50-60 x 105 tællinger/minut pr. 400 ng 24mer. Til heteroduplexdannelse blev I 10 ng enkeltstrenget M13mp8PABgIII opvarmet til 95°C (10 minutter) og langsomt

I 30 afkølet til stuetemperatur (30 minutter) i 40 μΙ 10 mM "Tris,,-HCI, pH 7,5, 10 mM

MgCI2, 1 mM dithiothreitol indeholdende 10 ng af den phosphorylerede startkæde I og 50 ng EcoRI-nedbrudt Ml3mp8PABgIIIRF, startfragment. Startkæde-forlængel- I sen blev startet ved tilsætning af 10 μΙ ligasepuffer indeholdende 2 mM ATP, 0,25 I mM hver af dGTP, dTTP, dCTP og dATP, 5 enheder E. coM DNA-polymerase I- 11 DK 175380 B1 startfragment og 400 enheder T4-DNA-ligase. Efter 1 time ved 12°C blev reaktionsblandingen anvendt til at transformere sgli JM 101-celler.

Transformation blev gennemført ved blanding af 10 μΙ af ligeringsblandingen med 5 200 μΙ kompetente JM 101-celler efterfulgt af inkubation i 30 minutter på is og 5 minutter ved 37°C. Derpå blev 3,5 mL 2YT topagar ved 55°C blandet med 300 μΙ mættede JM 101-celler, 10 μΙ IPTG (200 mM) og 50 μΙ Xgal, og efter tilsætning af de transformerede celler blev blandingen udpladet på 9 cm petriskåle indeholdende LB uden tilsatte lægemidler.

10

Farveløse plakker blev opsamlet og overført til en mikrotiterskål indeholdende 100 μΙ 2YT-medium. De indpodede mikrotitervæsker blev stemplet på LB-agarpla-der på 15 cm i diameter overlejret med en plæne af 600 μΙ JM 101-celler i 8 mL 2YT topagar og inkuberet natten over ved 37°C. De dannede plakker blev overført 15 til en nitrocelluloseskål ved fysisk kontakt i 1 minut. Nitrocelluloseskålen blev behandlet med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI i 3 minutter og vasket 2 gange med 3 M NaCI, 0,5 M "Tris"-HCI, pH 7,5, i 15 minutter og derpå med 2X SSC i 15 minutter. Præhybridiseringsblandingen indeholdende 10 mM ’Tris", pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCI, IX Denhardt 0,5% NP40, 100 μΜ ATP, 1 mM natriumpyro-phosphat, 1 mM 20 natrium-phosphat og 50 pg/mL EL cgli tRNA. IX Denhardt's indeholder pr. liter 200 mg Ficoll, 200 mg polyvinylpyrrolidon, 200 mg okse-serumalbumin (BSA; fraktion V). Pladen blev bagt ved 80°C i vakuum i 90 minutter. Pladen blev derpå inkuberet i 3 timer med 6 ml præhybridiseringsvæske i en petriskål efterfulgt af tilsætning af 5 x 106tællinger/minut mærket startkæde og hybridiseret natten over. Selektiv 25 vaskning af pladen blev gennemført med 0,4X SSC ved 49°C, og efter lufttørring bliver pladen eksponeret på røntgenfilm. Positivt hybridiserende kloner blev yderligere analyseret ved dideoxy-sekvensbestemmelse; se Aldeman, ibid.

4. Konstruktion af vektorer til udtrvkkeise af mutant-t-PA i E. coli pXAPPA18 30 3’Axl0trpR

Plasmidet pXAPPA18 3’Axl0trpR blev konstrueret til anvendelse som udtrykkelses-vektor for de forskellige muterede t-PA-DNA-sekvenser. Det samlede skema, som blev anvendt til konstruktion af dette plasmid, er afbildet i fig. 4-8. Det resulteren-35 de plasmid er afbildet i fig. 8. Det indeholder trpR-repressorgenet og en deletion af I DK 175380 B1 pBR322-DNA-sekvenser som inhiberer plasmidforstærkning. Denne deletion, kendt I som XAP-deletionen, består i fjernelsen af 641 basepar af pBR322-DNA-sekvenser mellem Aval- og PvuII-restriktionscentrene i pBR322 som angivet af Sutdiff, Cold

Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, bind 42, 77, 1979) Cold Spring 5 Harbor Press, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning.

trpR-repressorgenet kompenserer for den for tidlige derepression af t-PA-udtryk- kelse, som forarsages af forøget plasmid-kopital. Et mellemprodukt ved konstrukti- onen af ρΧΑΡΡΑΙδ 3'Axl0trpR er plasmidet pPA18, der blev konstrueret som afbil- det i fig. 4. Dette plasmid indeholder hele præ-t-PA-strukturgenet såvel som 5’- og 10 3’-utranslaterede områder. En trp-promotor forbundet med t-PA-genet og sekven- ser, der overfører ampicillin- og tetracydin-resistens, er også karakteristiske for H dette plasmid.

Til at konstruere pPA18 blev anvendt 4 plasmider, nemlig pFIFtrp69, pHKYlO, 15 ptPAtrpl2 og pPA25E10. Plasmid pFIFtrp69 er angivet i Goeddel et al., Nudeic

Adds Res. 8, 4057 (1980). Plasmid pHKYlO er angivet i US-patentansøgning nr.

685 521, indleveret den 24. december 1984, som er afdelt af US-patentansøgning nr. 307 473, indleveret den 1. oktober 1981, som igen er afdelt af US-patentan- I søgning nr. 133 296, indleveret den 24. marts 1980 (EP-offentliggørelsesskrift nr.

I 20 0 036 776). Plasmiderne ptPAtrpl2 og pPA25E10 er angivet i Pennica et al., Nature 301, 214 (1983) og i det ovennævnte EP-offentliggørelsesskrift nr. 093619.

Almindeligvis nedbrydes plasmidet pFIFtrp69 med PstI og Xbal til dannelse af 950- I baseparfragmentet betegnet fragment 1 i fig. 4. Plasmidet ptPAtrpl2 blev nedbrudt 25 med Xbal og Narl. Fra dette blev isoleret den 340 basepar sekvens, som er beteg- I net fragment 4 i fig. 4. Plasmidet pPA25E10 blev nedbrudt med Narl og Bglll. Fra B dette blev isoleret det 1604-baseparfragment, som er betegnet fragment 3 i fig. 4.

B Plasmidet pHKYlO blev nedbrudt med PstI og Bglll til dannelse af et 2900-base- B parfragment betegnet fragment 2 i fig. 4. Disse 4 fragmenter blev ligeret, og denne B 30 DNA blev anvendt til at transformere E. coli-celler til dannelse af pPA18.

fl Plasmidet pPA18 blev isoleret og nedbrudt med Sau3A efter behandling med Kle- B now-fragmentet af DNA-polymerase I til udfyldning af restriktionscentret. Det ikke- I cirkulære plasmid blev behandlet med SacI, og der blev isoleret en 389 basepar 35 sekvens betegnet fragment 5 i fig. 5. Plasmidet pPA18 blev også nedbrudt med 13 DK 175380 B1

SacI og BamHI. Fra denne blanding blev isoleret vektorfragmentet 6. Plasmidet pBR322, Boyer et al., Gene 2, 95 (1977), blev nedbrudt med EcoRI efterfulgt af behandling med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I. Denne åben-endede DNA-sekvens blev behandlet med BamHI til dannelse af den 375 basepar sekvens, 5 der er afbildet som fragment 7 i fig. 5. Fragmenterne 5, 6 og 7 blev ligeret, og dette præparat blev anvendt til at transformere E coli. hvorfra plasmidet ρΡΑ183'Δ blev opnået. Dette plasmid er ækvivalent med pPA18, undtagen at en del af det 3’-utranslaterede område i t-PA-genet er blevet fjernet.

10 Plasmidet ρΡΑ183'Δ blev nedbrudt med PstI og Narl til dannelse af et 313 base-parfragment betegnet fragment 8 i fig. 6. Dette fragment koder for aminosyrerne 8-109. Det syntetiske oligonukleotidfragment 9 har den følgende sekvens: 5' CTAGAATTATGTCTTATCAAGTTATTTGCA 15 TTAATACAGAATAGTTCAATAA 5'

Denne syntetiske DNA blev ligeret til Pstl-centret i fragment 8 for at genskabe ar-gininkodonen i position 7 og de første 6 aminosyrekodoner af det modne t-PA-mo-lekyle. Desuden blev et ribosombindingscenter anbragt 5’ for den syntetiske N-20 terminale methioninkodon anbragt umiddelbart 5* for rest 1 af den modne t-PA-aminosyrekodesekvens. 5’-enden af dette oligonukleotid indeholder et Xbal-re-striktionscenter. Således blev fragment 8 ligeret i nærværelse af det syntetiske oligonukleotidfragment 9, og blandingen blev behandlet med Xbal og Narl til dannelse af fragment 10 (se fig. 6).

25

Plasmidet ρΡΑ183’Δ blev nedbrudt med Narl og SacI til dannelse af den 900 basepar sekvens, som er betegnet fragment 11 i fig. 7. Dette plasmid blev også nedbrudt med SacI og Xbal til dannelse af vektorfragment 12 i fig. 7. Fragmenterne 10, 11 og 12 blev ligeret og anvendt til at transformere E. coli. hvorfra der blev 30 isoleret ρΡΑ183'ΔΧ10. En DNA-sekvens indeholdende XAP-deletionen og trpR-repressorgenet afledes af pFMBtrpR, som er angivet i US-patentansøgning nr. 538 730, indleveret den 3. oktober 1983 (EP-offentliggørelsesskrift nr. 136 907). Kort fortalt blev dette plasmid konstrueret ud fra 3 plasmider, som er kendte af fagfolk: phGH107, beskrevet i EP-offentliggørelsesskrift nr. 022 242, offentliggjort den 14.

35 januar 1981, blev anvendt som kilde til den lac-inducerbare promotor; ptrpR3, I DK 175380 B1

I 14 I

I beskrevet i Roeder et al., Molecular Genetics 176. 361 (1979), blev anvendt som I

I kilde til kodesekvensen for trp-repressoren; og pFMBl, beskrevet i EP- I

I offentliggørelsesskrift nr. 0068 693, offentliggjort den 5. januar 1983, blev anvendt I

I som kilde til kodesekvensen for FMD-antigenet afledt af stamme A24. I

I I

I For at opnå trp-repressorsekensen blev ptrpR3 behandlet med Haelll, og 334-ba- I

separfragmentet blev isoleret fra en 6% acrylamidgel, og det isolerede fragment I

I blev ligeret med 16-mere EcoRI-linkere med sekvensen: I

I 10 5’CCATAGAATTCTATGG. I

I For at opnå vektorrygraden og lac-promotoren blev phGH107 først nedbrudt med I

I EcoRI og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. Det store vektorfragment I

I indeholdende lacUV5-promotoren blev derpå ligeret til det tildannede trpR-plasmid I

I 15 under anvendelse af T4-ligase, og ligeringsblandingen blev transformeret ind i I

coli. Plasmid-DNA fra transformanter blev isoleret, og tilstedeværelsen af det øn- I

I skede plasmid, betegnet ptrpR/hGH107, blev bekræftet; Messing et al., Nucleic I

I Acids Res. % 309 (1981).

I 20 ptrpR/hGH 107 blev delvis nedbrudt med EcoRI, gjort stumpendet ved anvendelse I

I af Klenow og behandlet med PvuII til opnåelse af lac-promotor-trp-repressor-ope- I

I ronet (530-baseparfragmentet). Delvis PvuII-nedbrydning af pFMBl og isolering af I

vektorfragmentet på 6% polyacrylamidgel gav udtrykkelsesvektorrygraden inde- I

I holdende FMB-kodesekvensen understyring af trp-promotoren. ptrpR/hGH107- I

I 25 fragmentet blev blandet med pFMBl-Pvull-nedbrydningsblandingen og ligeret med I

I T4-ligase. Ligeringsblandingen blev derpå anvendt til at transformere E. cqH stam- I

I me 294, og transformanter blev anvendt som kilde til plasmid-DNA. Det resulte- I

rende plasmid, pFMB/trpR, blev bekræftet ved minisigtning og orienteringen af ind- I

I sætningen ved Aval-PvuII-nedbrydning. Plasmid pFMB/trpR blev nedbrudt med I

I 30 Ndel og BamHi. Fragmentet indeholdende trpR-repressoren blev isoleret. Plasmid I

I ρΡΑ183'Δχ10 blev nedbrudt med Ndel og BamHI. Hoved vektorfragmentet blev iso- I

I leret. Dette vektorfragment og trpR-repressorfragmentet fra pFMB/trpR blev lige- I

I ret, og DNA-blandingen blev anvendt til at transformere JL coli, hvorfra plasmidet I pXAPPA183’Axl0trpR blev isoleret som vist i fig. 8.

I 35 15 DK 175380 B1 5. E. coli-udtrvkkelsesvektorer for tPa-mutanter 5 Fig. 8 afbilder pXAPPA18 3'Axl0trpR-vektoren, som blev anvendt til at udtrykke t-PA og t-PA-mutanter i E call. Som det kan ses, styres udtrykkeisen af det native t-PA-strukturgen af trp-promotoren. Opmærksomheden henledes pi Xbal-, Narl- og Sacl-restriktionscentrene. Plasmidet pXAPPA18 3'Axl0trpR blev nedbrudt med Narl og Xbal. Der blev isoleret et fragment på 340 basepar identificeret som fragment 1 10 i fig. 8. Et vektorfragment identificeret som fragment 2 i fig. 8 blev opnået ved . isolering af det store fragment opnået ved nedbrydning af pXAPPA18 3'Axl0trpR med Xbal og Sacl. Fragment 3 (900 bp) blev opnået ved nedbrydning af RF-DNA fra hver af mutant-t-PA-M13-klonerne opnået ved stedsspecifik mutagenese (fig.

3) med Narl og Sacl. Vektorer, som udtrykte forskellige mutant t-PA'er, blev op-15 nået ved ligering af fragmenterne 1 og 2 med de respektive fragmenter 3 og anvendt til at transformere £. coli. hvorfra der blev isoleret hver af jL £Sii mutant-t-PA-udtrykkelsesvektorerne: PXAPPA18 3'Axl0trpR 1B8 20 pXAPPA18 3'Axl0trpR 2C9 ρΧΑΡΡΑΙδ 3'Axl0trpR 4A10 PXAPPA18 3’Axl0trpR 3A7 ρΧΑΡΡΑΙδ 3'Axl0trpR 4B3 25 Disse plasmider såvel som vildtype-t-PA-udtrykkelsesvektoren ρΧΑΡΡΑΙδ 3’Axl0trpR blev anvendt til at transformere E. coii W3110fhuA*.

coj] W3110 fhuA; er en TI-fag-resistent bakterie karakteriseret ved en deletion eller inversion af DNA-sekvenser forbundet med fhuA'-genet som angivet i den si-30 deløbende US-patentansøgning nr. 06/673 995, indleveret den 21. november 1984.

Kort fortalt transduceres JL ςοΠ W3110 (ATCC 27325) med λ-bakteriofag indeholdende det overførbare element TnlO, som overfører tetracydinresistens.

35 Stammer af TnlO-trasduceret W3110 selekteres på grundlag af resistens over for I DK 175380 B1 I 16 fag-infektion. Fag-resistente stammer hældes sammen og inficeres med bakterio- fag PI. Det resulterende lysat anvendes til at transducere E. coli AT982 (Bukhari et H al., J. Bacteriology 105. 844 (1971). Stamme AT982 indeholder en Dap-mutation lokaliseret nær ved fhuA-genet. I overensstemmelse hermed vil transduktion af 5 stamme AT982 med Pl-lystatet og selektion af transduktanter, som er tetracyclin- resistente og som genskaber Dap-funktionen, indicere, at transposonet TnlO er lo- kaliseret i fhuA-genet. Stammer, som er tetracydinresistente og udviser gendannet

Dap-funktion, er kilden til DNA for bakteriofag-Pl-transduktion af E. coll W3110.

Der selekteres transducerede W3110-stammer, som udtrykker tetracyclinresistens 10 og fagresistens. Disse stammer selekteres derefter på basis af resistens over for fag-infektion og reversion til tetracyclinfølsomhed; Naloy et al., J. Bacteriology 145, 1110 (1981). Reversionen til tetracyclinfølsomhed koblet med bevarelsen af resistens over for Tl-fag-infektion indicerer, at DNA-sekvensen forbundet med fhuA-genet enten er blevet deleteret eller irreversibelt vendt om. således konstru- 15 erede stammer betegnes E. coli W3110 fhuA'.

Fagen indeholdende det overførbare element TnlO, som blev anvendt til at ind- sætte TnlO i W3110, blev konstrueret som følger. Udgangsmaterialet var λ cI857b I 2210am29. Denne fag er kendt af fagfolk, Kleckner J. Mol. Biol. 116. 125 (1977), 20 og blev konstrueret ud fra tre velkendte mutanter af λ ved standardprocedurer. Et

lysat at denne λ-fag blev fremstillet på amber-undertrykkeren E* cg|i C600 (ATCC

nr. 23724), som var blevet manipuleret ved procedurer kendt af fagfolk til også at I være TnlO-transposone; Kleckner J. Mol. Biol 116, 125 (1977). Dette lysat blev B anvendt til at inficere JL £Qli C600 (λοΙ857), som indeholder en amber-undertryk- B 25 ker og en λ-profag bærende cI857-genotypen. Lysater af tetracydinresistente kolonier blev fremstillet ved varmeinduktion ved dyrkning af de tetracyclinresi- B stente kolonier først i bouillon ved 32°C og derefter ved 42eC i 90 minutter. Lysatet blev derpå udpladet på EL coli C600 og replikaudpladet. Plakkerne, som viste sig på I E. coN C600, blev replikaudpladet ved 32°C på E. coli C600 og E. coli W3102 sup + B 30 (λ imm434), som indeholder den heteroimmune profag λ imm434; Kleckner, N. et B al., Genetics 90, 427 (1978). Plakker, som viste sig pi den heteroimmune stamme, B blev udpladet på tetracyclinplader. Plakker, som viste sig på disse plader, er i stand I til at transducere tetracyclinresistens og blev anvendt ved den ovenfor beskrevne I metode til skabelse af E coli W3110 fhuA\ I 35 DK 175380 B1 —P—IWTfV»Urt· ϊ~~ ’ '_' ·^Β—^Μ^^Τ’Γ· . _' · - -·*- iil.mi·^^—^ 17

Nativ t-PA og mutant t-PA blev opnået fra 10 liter kulturer af disse celler transformeret med det passende t-PA- eller mutant-PA-plasmid. Udtrykkelse blev induceret af tryptophandeficientmedier.

5 6. Udtrvkkelsesvektorer for t-PA-mutanter i pattedvrceller

Plasmidet pPADHFR-6 (også betegnet pETPFR, se EP-offentliggørelsesskrift nr.

093 619 ovenfor) er afbildet i fig. 9. Udtrykkeisen af det native t-PA-strukturgen er under styring af den tidlige promotor for SV40 T-antigen. Denne promotor styrer 10 også udtrykkeisen af DHFR-genet. Opmærksomheden henledes på Bglll-, BstXI-og BStEII-restriktionscentrene. Et vektorfragment betegnet som fragment 1 i fig. 9 blev opnået ved isolering af det store fragment frembragt ved nedbrydning af pPADHFR-6 med Bglll og BstEII. Fragmentet betegnet som fragment 2 i fig. 9 blev opnået ved isolering af 400 basepar t-PA-fragmentet opnået ved nedbrydning af 15 pPADHFR-6 med Bglll og BstXI. Et t-PA-fragment på 1141 basepar indeholdende de ønskede mutationer og svarende til fragment 3 i fig. 9 blev opnået ved nedbrydning af RF-DNA fra hver af mutant-t-PA-klonerne med BstXI og BstEII. Fragmenterne 1 og 2 blev ligeret med hvert fragment 3. DNA-blandingerne blev anvendt til at transformere E. £sii. Fra hver af transformanterne blev opnået de 20 respektive eukaryotiske udtrykkelsesvektorer: pPADHFR-6 1B8 pPADHFR-6 2C9 pPADHFR-6 4A10 25 pPADHFR-6 3A7 pPADHFR-6 4B3

Disse plasmider såvel som den ikke-muterede t-PA-udtrykkelsesvektor pPADHFR-6 blev anvendt til at transficere DHR-deficiente CHO-celler som angivet ovenfor 30 (Graham et al., Virology 52, 456 (1973); se også EP-offentliggørelsesskrift nr.

093 619). Udtrykkelse af nativ og mutant t-PA blev forstærket ved udsættelse af kulturerne for stigende koncentrationer af methotrexat.

For eksempel blev plasmiderne pPADHFR-6 2C9 og pPADHFR-6 1B8 anvendt til at 35 transficere DHFR-deficiente CHO-celler [Urlab & Chasin (PNAS 22, 4216 (1980)]

I DK 175380 B1 I

I I

I under anvendelse af calciumphosphatfældningsmetoden beskrevet af Graham et I

I al., Virology 52,456 (1973). I

I I hvert tilfælde blev de kolonier, som opstod i selektivt medium (medium som I

I 5 manglede hypoxanthin, glycin og thymidin (-HGT), hældt sammen og dyrket yder- I

I ligere i HGT-medium. Disse celler blev udpladet med 2 x 105 celler pr. 100 mm I

I plade i 250 mM methotrexat (MTX) til selektion for forstærkning af plasmidsekven- I

I ser. Fem kloner, som voksede i 250 nm MTX, blev ekstraheret fra pladen, og alle I

I fandtes at secernere t-PA til mediet. Disse kloner blev anvendt til yderligere under- I

I 10 søgelse. I

I E. Prøvningsmetoder I

I 1. Rensning af mutant-t-PA oa t-PA I

I 15 I

I De forskellige t-PA'er udtrykt i pattedyrceller som beskrevet ovenfor blev seceme- I

I ret til cellekulturmediet. Mediet indeholdende sådanne t-PA’er blev anvendt direkte I

I ved forskellige prøvninger, som skal beskrives i det følgende, eller blev underkastet I

I ét eller flere af de følgende rensningstrin for at forøge renheden af t-PA eller mu- I

I 20 tant-t-PA før sådanne prøvninger. I

I Medier fra CHO-celler indeholdende mutant-t-PA blev charge-ekstraheret med I

I chelaterende "Sepharose"® (Pharmacia) (10-20 mL resin/L medium) aktiveret med I

I zinkchlorid som beskrevet af Rijken et al., Biochem. & Biophys. Acta. 580. 140 I

I 25 (1979) og opsamlet på et filter. Harpiksen blev hældt i en kolonne, vasket med en I

I puffer indeholdende 0,02 M natriumphosphat, pH 8,0, 0,25 M NaCI, 0,01% I

I "Tween® 80” og 10 mg/L aprotinin. t-PA'en blev elueret med den samme puffer in- I

I deholdende 50 mM imidazol. t-PA-sammenhældningen blev dialyseret ind i 0,02 Μ I

I natriumphosphat, pH 8, 0,25 M NaCI og 0,01% 'TWEEN® 80" og sat på en lysin- I

I 30 "Sepharo$e"®-harpiks, Radcliffe et al.. Arch. Biochem. Biophys. 189. 185 (1978) og I

I Allen et al., Thrombosis Heamostasis 45, 43 (1981) eller benzamidin-"Sepharose"®- I

harpiks, Bykowska et al., Biochem. & Biophys. Acta, 703, 113 (1982). Zinkchelat- I

I harpiksen blev vasket kort med 0,02 M natriumphosphat, pH 8, 1 M NaCI og 0,01% I

I "Tween® 80", og t-PA eller mutant-t-PA blev elueret med den samme puffer inde- I

I 35 holdende 0,5 M arginin. Benzamidin-’Sepharosen" blev vasket med dialysepufferen I

19 DK 175380 B1 og elueret med dialysepufferen indeholdende 1 M guanidin. De resulterende proteiner var mere end 90% rene, analyseret ved SDS-PAGE. Foruden den ovenstående rensningsteknik kan der anvendes immobiliserede monoklonale antistoffer (se Nielsen et al., EMBO J. 2, 115 (1983).

5 2. SDS-polvacrvlamidoel-elektroforese (SDS-PAGE)

Prøver af medier indeholdende t-PA-protein eller t-PA-mutantproteinerne blev kon-centreret i vakuum og fortyndet i natriumdodecylsulfat-(SDS)-prøvepuffer. Når det 10 er angivet, tilsattes 10 mM dithiothreitol (DTT) for at reducere proteindisulfiderne. Diskontinuert SDS-elektroforese under anvendelse af 10% eller 7-17% polyacryl-amid-adskillelsesgeler blev gennemført ifølge Laemmli's procedure [Laemmli, Nature 227. 680 (1970)). Til analyse af plasmaprøver anvendtes 4-10% SDS-poly-acrylamidgradient-adskillelsesgeler med det samme puffersystem ifølge Laemmli.

15 Antagne molekylvægte (Mr) ud fra SDS-PAGE-analyse blev opnået ved sammenligning med mobiliteten af protein med kendt molekylvægt.

3. Bobleafoivelses-koaoellvse 20 Rekombinant (ikke-mutant) t-PA og mutant t-PA’er heraf (mutant-t-PA) blev prøvet for deres evne til at solubilisere fibrinkoagler ved bobleafgivelses-koagellyseprøv-ningen.

Kort fortalt blev thrombin (Sigma Chemical Co.) opløst i destilleret vand til omkring 25 1000 enheder/mL. Denne lageropløsning blev fortyndet 1:30 med prøvepuffer, som indeholdt 0,06 M monobasisk natriumphosphat, 0,06 M dibasisk natriumphosphat, 200 mg/L natriumazid og 0,01% "Tween® 80". Der blev forberedt en række reagensglas indeholdende 0,5 mL fortyndet thrombinopløsning (30-40 enh./mL) og 0,5 mL af enhver af forskellige koncentrationer af t-PA (16 ng/ml til 1 x 106 ng/ml), 30 passende kontroller eller ukendt prøve i passende fortyndinger. Der blev også forberedt en anden række reagensglas indeholdende henholdsvis 20 μΙ plasminogen (1,0 mg/mL), 1,0 mL fibrinogen (1 mg/mL) og 10 μΙ hele glasmikrokugler på over 350 μίτι (3M Company).

I DK 175380 B1 I 20

De ovenstående reagenser og reagensglas blev holdt på is, indtil det afsluttende trin af prøvningen. 200 μΙ af thrombin-t-PA-opløsningen eller hver af thrombin- mutant-t-PA-opløsningerne sattes i rækkefølge til et reagensglas indeholdende plaminogenet, fibrinogenet og mikrokuglerne, blev omrystet i 15 sekunder og an- I 5 bragt i et vandbad på 37°C. Koagler dannedes i hvert glas inden for 30 sekunder.

Tiden mellem t-PA-tilsætningen og reaktionens slutpunkt blev målt. Slutpunktet blev defineret som den tid, da mikrokuglerne ved prøvningen var steget til overfla- den.

10 Mængden af thrombolytisk aktivitet for en bestemt prøve blev bestemt ved refe- rence til en standard-t-PA-kurve. Specifik aktivitet blev udregnet på basis af den tilbageværende mængde t-PA eller mutant-t-PA bestemt ved radioimmunoprøv- H ning.

15 4. In v/fro-koagellyseprøvnino

Rekombinant t-PA og mutant-t-PA blev også prøvet i et in v/tro-koagellysesystem.

Kort fortalt blev humant blod opsamlet med 3,13% natriumcitrat som antikoagu- 20 lånt, og cellefraktionen blev fjernet ved centrifugering. 50 μΙ 0,5 M CaCl2, 25 μΙ ok- sethrombin (100 enh./mL) og 10 μΙ humant 125I-fibrinogen (100.000 tælling- er/minut pr. 10 μΙ) sattes til hver mL plasma. Denne plasmablanding blev suget ind i siliciumrør med en indvendig diameter på 4 mm og inkuberet ved 37°C i 1 time.

Segmenter (1 cm) af røret blev udskåret og koaglet fjernet. Koaglerne blev anbragt I 25 i puffer bestående af 0,02 M natriumcitrat, pH 5, og 'Tween® 80". Koaglerne blev skyllet 4 gange i 1 time med frisk puffer. Mængden af radioaktivitet i den sidste skylning overskred ikke ca. 10% af mængden af radioaktivitet i koaglet. Hvert I koagel blev anbragt i 2,5 mL plasma. En 250 μί-prøve af plasma blev taget som I nulpunkt. En prøve af t-PA eller mutant-t-PA blev tilsat i et volumen på 100 μί.

I 30 Prøver (250 μί) blev taget efter 1, 2, 3 og 4 timer, og radioaktiviteten deri blev be-

stemt. Standarder indeholdende 5, 10, 20 og 40 enheder af t-PA-aktivitet pr. mL

I blev kørt parallelt. Lyseprocenten blev udregnet efter korrektion for volumenæn- dringer efter hver prøve.

— .'.» -*“'<·ν*-ίΤΜ^^^Μ^^^Τ1^ι T;™-·_ ' tWBSWHF '‘,:^^^»'--.^gTO^aB^Pl,Wi'T·· DK 175380 B1 21 5. Krornooene prøvninger S-2288: t-PA blev målt direkte under anvendelse af Kabi's kromogene syntetisk* tripeptid-substrat, S-2288 (Helena Laboratories, Beaumont, Texas, USA). Til denne 5 prøvning blev t-PA og 1 mM S-2288 (startkoncentration) i 0,05 M "Tris'', pH 7,4 indeholdende 0,012 M NaCI og 0,01% 'Tween® 80" inkuberet ved 37°C i 10 minutter. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 50 μΙ iseddike til 0,5 mL reaktionsblanding. Aktiviteten blev udregnet ud fra absorbansen ved 405 nm under anvendelse af den følgende ligning, stardardiseret af producenten: 10 IU-min

Aktivitet i 0,5 ml reaktions- = AOD x 793.65 OD blanding (IU, internationale inkubationstid enheder) 15 S-2251: Plamsinogenaktivering ved hjælp af t-PA blev målt under anvendelse af Kabi's specifikke kromogene tripeptid-substrat, som er specifikt for plasmin, S-2251 (Helena Laboratories). En alikvot af prøven blev blandet med 0,10 mL 0,7 mg/mL plasminogen (0,05 M "Tris", pH 7,4, indeholdende 0,012 M NaCI) plus 20 0,02 mL humant fibrinogen 20 mg/mL (0,05 M "Tris"-HCI, pH 7,4, indeholdende 0,012 M NaCI), og volumenet blev indstillet til 0,15 mL. Blandingen blev inkuberet ved 37°C i 10 minutter, der tilsattes 0,35 mL S2251 (1,0 mM-opløsning i den ovenstående puffer), og reaktionen fortsattes i 5 eller 10 minutter ved 37°C. Der tilsattes iseddike (50 μΙ) for at afslutte reaktionen, og adsorbansen ved 405 nm blev 25 milt. Kvantisering af mængden af aktivitet blev opnået ved sammenligning med resultaterne opnået under anvendelse af en rekombinant nativ t-PA-prøve, som var blevet standardiseret under anvendelse af S-2288-prøvningen. Dette var nødvendigt fra starten, fordi absorbansen ved 405 nm varierede fra dag til dag, efterhånden som plasminogenet ældedes og også ændrede sig, hvis der anvendtes forskel-30 lige præparationer af plasminogen og fibrinogen. Denne variabilitet blev til sidst reduceret ved omhyggelig præparation af store mængder humant plasminogen (glu-plasminogen) med efterfølgende lyofilisering af alikvoter af materialet. Ali-kvoterne blev opbevaret ved -20°C. Før brugen blev de genopløste plasminogen-præparationer opbevaret ved 0°C i højst 4 timer. Stimulering af t-PA-aktivitet med 35 fibrinogen blev målt ved sammenligning af aktiviteten af opløsninger indeholdende

I DK 175380 B1 I

I 22 I

I prøvekoncentrationer af fibrinogen med lignende reaktionsblandinger, hvori fibri- I

I nogenet var blevet udeladt. Pi grund af fibrins uopløselighed anvendtes fibrinogen I

B ved denne prøvning. Stimuleringen med høje koncentrationer af fibrinogen viser I

B sig at efterligne den stimulering, som kunne forventes med det uopløselige fibrin. I

Is I

I 6. In v/Vo-inhibitor-kompleksprøvnino I

I Rekombinant t-PA og muteret t-PA blev prøvet in vitro for at bestemme deres re- I

I aktivitet med naturligt forekommende inhibitorer af t-PA-aktivitet. Almindeligvis I

I 10 blev t-PA og mutant-t-PA ioderet med 125I ved anvendelse af Iodobeads (Pierce I

I Chemical Co.), hvilket resulterede i t-PA eller mutant-t-PA med specifikke radioak- I

B tiviteter på omkring 2 x 106 tællinger/min. pr. μg. til in v/'tro-kompleksdannelse I

sattes den radiomærkede t-PA (1 μg) til frisk aftrukket citrateret humant helblod I

I (500 μΙ). Prøverne blev inkuberet ved stuetemperatur, og reaktionen blev stoppet I

I 15 ved fortynding af en alikvot i 2% SDS. Prøver blev analyseret i 4-10% polyacryl- I

I amidgradient-SDS-PAGE. Komplekser blev bestemt ved autoradiografi. I

I 7. Fibrinbindinasprøvnino I

I 20 Fremgangsmåden til fibrinbinding er en modifikation af den metode, der er beskre- I

I vet af Rijken et al., J. Biol. Chem. 257. 2920 (1982). t-PA-prøven, som skal prøves I

I (500 ng), sættes til en opløsning indeholdende 0,05 M "Tris", pH 7,4, 0,12 M NaCI, I

0,01% "Tween® 80", 1 mg/ml humant serumalbumin og forskellige koncentrationer I

I af plasminogenfrit fibrinogen (0, 0,1, 0,5 og 1,0 mg/mL). Det endelige volumen af I

B 25 reaktionsblandingen er 1 mL. Prøven inkuberes ved 37°C i 5 minutter efterfulgt af I

B tilsætning af 1 enhed thrombin. Prøven inkuberes i 1 time ved 37°C. Koaglet fjer- I

B nes under anvendelse af en glasstav, og mængden af t-PA, som forbliver ubundet i I

supernatanten, bestemmes. Dataene afsættes på en kurve som procent bundet t- I

B PA over for fibrinogenkoncentrationen (fig. 11). I

B 30 I

B 8. In v/Vo-koaaellvse I

B Der anvendtes den in v/Vo-koagellyse-model, som er beskrevet af Collen et al., J. I

B Clin. Invest. 21, 368 (1983). Hvide New Zealand-hankaniner på mellem 2,5 og I

B 35 3 kg blev anæstetiseret med ketamin, jugularvenen blev kateteriseret, og små for- I

23 DK 175380 B1 bindelseskar i området blev ligeret. Omkring 2 cm af jugularvenen blev isoleret med reversible ligaturer, en tråd blev ført fra segmentets proksimale til dets distale ende, segmentet blev skyllet med en salt-thrombin-opløsning og fyldt med frisk kaninblod, som indeholdt 125I-mærket humant fibrinogen. Efter 30 minutter blev 5 blodstrømmen genoptaget hen over koaglet. Det blev startet i.v. t-PA-infusion med en startbolus på 10% af den totale dosis. Infusionen blev leveret i løbet af 4 timer.

30 minutter efter infusionens afslutning blev koaglet indhøstet og talt. Genvindingen af radioaktivitet blev anvendt som kvalitetskontrol; blodprøver, urin, vatpinde og kanyler blev talt for at sikre, at bedømmelsen af den mængde radioaktivitet, 10 som var til stede i det oprindelige koagel, var nøjagtig.

F. Prøvningsresultater t-PA-mutanter med de følgende sekvenser ved to-kæde-aktiveringscentret, rester-15 ne 270-279, er blevet udtrykt i både E. cqU og kinesisk hamsterovarieceller (CHO-celler): 275 279 nativ -Arg-Ile-Lys-Gly-Gly- (RIKGG) 20 1B8 -Gly-Ile-Lys-Gly-Gly- (GIKGG) 2C9 -Gly-Ile-Lys-Gly-Gly- (EIKGG) 1. Western-afdupninger og zvmoarafi 25 EIKGG- og GIKGG-mutanterne udtrykt i CHO-celler blev analyseret ved Western-afdupninger afledt af reducerede og ikke reducerede SDS-PAGE-geler. Nativ enkelt-kæde-t-PA viser sig som to bånd med molekylvægte på 52.000 og 50.000 dalton på grund af en forskel i graden af glycosylering. EIKGG-mutanten fra en ikke-redu-ceret SDS-PAGE viste et overvejende immunoreaktivt bånd ved en molekylvægt på 30 omkring 50.000 dalton. Western-afdupningen af mutanten GIKGG fra en ikke-re-duceret SDS-PAGE viste imidlertid en molekylvægt på 55.000 dalton. Forskellen i tilsyneladende molekylvægt af GIKGG-mutanten sammenlignet med nativ t-PA kan tyde på en lidt forskellig konformation eller carbonhydratstruktur sammenlignet med nativ t-PA. Spaltning af proteinet ved Arg 275 kan detekteres ved en lavere 35 molekylvægt af t-PA, når den analyseres efter reduktion (hvorved protease- og I DK 175380 B1 I 24 kringlekæderne adskilles). Zymografier af de reducerede SDS-PAGE-geler viste, at plasminogenaktivator-aktiviteten i disse prøver var ved molekylvægten af det im- I munoreaktive bånd af enkelt-kæde-formen af t-PA (omkring 60.000). To-kæde- formen af t-PA har en elektroforetisk mobilitet, som stemmer overens med en mo- 5 lekylvægt på omkring 30.000 dalton. Denne procedure viste, at enkelt-kæde-for- I mer af mutant-t-PA-proteinerne var til stede i medierne fra transformerede celler.

S. 2251-prøvnino 10 Analyse af den native t-PA og en mutant-EIKGG-t-PA ved S-2251-prøvningen er vist i tabel I. Disse værdier blev opnået før anvendelsen af glu-plasminogen i prøv- ningen for at nedsætte prøvningsvariabiliteten. Den naturligt forekommende t-PA- sekvens RIKGG blev tildelt en arbitrær specifik aktivitet i nærværelse af fibrinogen H på basis af S2288-prøvningen. Denne standard-t-PA blev prøvet med hver af 15 EIKGG-t-PA-mutanterne for at normalisere resultaterne.

Som det kan ses, har EIKGG-t-PA-mutatanten, uanset graden af rensning, en spe- cifik aktivitet ved S2251 plus fibrinogenprøvningen, som er større end aktiviteten for den rekombinante t-PA.

I 20 TABEL 1 25 DK 175380 B1

De i tabel IA anførte data blev opnået under anvendelse af høj kvalitet lyofiliseret glu-plasminogen. Med en mere reproducerbar prøvning fandtes EIKGG-mutanten at have inaktivitet af samme størrelse som den native t-PA ved S-2251-prøvningen i nærværelse af fibrinogen. I fravær af fibrinogen var mutanten stadig mindre aktiv 5 end den native (tabellerne I og IA), hvilket viser en større specificitet.

TABEL IA

S-2251 + S-2251 - Fibrinogen- 10 Mutation Mutant fibrinogen fibrinogen stimulering RIKGG1 nativ (250.000)2 17.600 14 EIKGG1 2C9 248.000 500 500 15 1 renset under anvendelse af zinkchelat-lysin-agarose 2 tildelt aktivitet 2. Boblefrioørelses-koagellyse- og in vitro-koaoellvseprøvnino 20 Boblefrigørelses-koagellyseprøvningen blev anvendt til at bestemme den specifikke aktivitet af rekombinant t-PA og den rensede EIKGG-t-PA-mutant. Aktiviteten af hver af disse t-PA'er blev bestemt ved de ovenfor beskrevne procedurer. Koncentrationen af t-PA og EIKGG-t-PA-mutant blev bestemt ved radioimmunoprøvning. Resultaterne af denne prøvning, inklusive specifik aktivitet, er vist i tabel II.

25

TABEL II

Iden- Aktivitet Protein- Specifik

Prøve tif. enh./ml kone., mg/ml aktivitet 30 1 EIKGG* 8400 0,088 95.909 2 EIKGG* 7698 0,088 87.477 3 t-PA** 5640 0,088 64.090 1 1 Frosset - optøet én gang I DK 175380 B1 I 26 2 Frosset - optøet Fire gange * renset under anvendelse af zinkchelat-benzamidin-agarose ** renset under anvendelse af zinkchelat- og lysin-agarose 5 Boblefrigørelses-koagellyseprøvningen viser, at en enkelt-kæde-mutant af t-PA, specifikt EIKGG-t-PA-mutanten, har en 50% større specifik aktivitet end rekombi- nant t-PA. Som det kan ses, resulterede gentagen frysning og optøning i et svagt fald i den specifikke aktivitet af EIKGG-t-PA-mutanten. Imidlertid bevarede t-PA- mutanten stadig en større specifik aktivitet end den rekombinante t-PA.

3. In v/Vo-inhibitor-komDleksprøvning

Inaktiveringen af proteaser med plasmaproteaseinhibitorer er en velundersøgt me- kanisme til inaktivering af serumproteaser. De resulterende komplekser er stabile 15 over for denaturering og kan bedømmes ved elektroforese på SDS-PAGE. Ved denne procedure sættes radiomærket t-PA til plasma eller helblod, og prøven inku- beres ved 37°C . Prøven underkastes SDS-PAGE efterfulgt af autoradiografi. Detek- tionen af radiomærker ved Mr-positioner større end fri t-PA er en indikation af mængden af t-PA-proteaseinhibitorkompleks, som er blevet dannet. Når den analy- ' 20 seres i rotteblod, fandtes t-PA langsomt at danne komplekser med Mr på over 200.000. Efter flere timers inkubation kunne mere end 70% af radiomærket de-

tekteres i sådanne komplekser. I modsætning hertil dannede den muterede t-PA

ikke disse komplekser; hovedmængden af radiomærket, detekteret ved autoradio- grafi, forblev ved positionen af frit, ikke inaktiveret enzym. Nar en lignende analyse I 25 blev gennemført i humant blod (fig. 10), dannede t-PA også sådanne komplekser, I men dannede desuden komplekser med Mr mellem 100.000 og 200.000. Som med rotteblodet dannede den muterede t-PA udpræget mindre inhibitorkomplekser med I Mr på over 200.000. Proteaseinhibitorkomplekserne med Mr-værdier mellem I 100.000 og 200.000 var stadig til stede. Disse resultater tyder på, at mutanten I 30 ikke inaktiveres af den eller de proteinaseinhibitorer, som danner komplekser med I Mr-værdier på over 200.000. Artsforskelle bemærkes i reaktiviteten af både t-PA og den muterede t-PA ved dannelsen af komplekser med Mr mellem 100.000 og 200.000.

27 DK 175380 B1 4. Fibrinbindino

Det er tidligere blevet rapporteret, at enkelt-kæde- og to-kæde-former af t-PA har omkring lige stor affinitet for fibrin (Rijken et al., J. Biol. Chem. 257. 2920 (1982).

5 Ved den heri beskrevne prøvning iagttages i modsætning hertil en betydeligt højere affinitet for Fibrin af enkelt-kæde-formen af t-PA sammenlignet med to-kæde-for-men (fig. 11).

5. In v/Vo-koaoellvse 10

Fig. 12 viser de relative dosisreaktionskurver for t-PA (o) og EIK-mutanten (o).

Dataene er præsenteret som middeltallet ± standardusikkerheden pi middeltallet med 5 kaniner i hver gruppe. Afstanden mellem de to kurver ved punktet for 50% lyse blev målt, og styrken af EIK-formen af t-PA blev bedømt til at være 2,4 gange 15 større end af den ikke-muterede form (RIK). En statistisk signifikant forskel blev opnået ved dosen 0,25 mg/kg (p<0,01).

G. Konklusion 20 De ovenstående resultater viser, at mutation ved rest 275 i t-PA kan være mere effektiv end den naturlige form af to separate grunde: 1. Forøget specificitet; prøvninger af t-PA-funktion tyder på et mere aktivt/specifikt protein.

25 2. Nedsat in v/Vo-plasmainhibitorbinding: in v/Vo-inhibering af sådanne mutanter tyder på et fald i inaktivering med visse proteaseinhibitorer. Dette skulle muliggøre cirkulationen af den aktive ikke-kompleksbundne form af t-PA og derved tillade mere funktionel t-PA at opløse et koagel.

30

Den videnskabelige litteratur er modsigende med hensyn til de enzymatiske egenskaber af enkelt-kæde-formen af t-PA. For bedre at forstå t-PA's funktion kan man betragte homologe proteiner. Omfattende undersøgelser er blevet gennemført med serinproteaserne trypsin og chymotrypsin. Proteasedomænet i t-PA er meget lig 35 disse proteiner og forventes at fungere på en lignende måde. Baseret på den funk-

I DK 175380 B1 I

I 28 I

I tionsmekanisme, som er bestemt for trypsin og chymotrypsin, ville forhindring af I

I spaltning ved arginin 275 i t-PA forventes kun at påvirke de funktionelle egenska- I

I ber af proteasedomænet. Mutanternes forøgede fibrinaffinitet er derfor overras- I

I kende. I

I 5 I

I Uanset den eller de involverede mekanismer (forøget specificitet, mangel på prote- I

I aseinhibitorbinding, forøget affinitet til fibrin eller en kombination af disse) fandtes I

I én mutant, når den blev prøvet for dens evne til at lysere en blokeret vene in vivo, I

I at være omkring 2,5 gange mere aktiv end t-PA'en med den naturlige sekvens. I

I 10 Som omtalt tidligere, er enkelt-kæde-formen af t-PA blevet påvist at omdannes til I

I to-kæde-formen Ved stedet for et koagel. En sådan omdannelse ville ødelægge en- I

I hver fordel forbundet med enkelt-kæde-formen. Kun en muteret form at t-PA, som I

I er ude af stand til at omdannes til to-kæde-formen med fysiologiske protease, vil I

I være i stand til at bevare dens fordele, når den først er ved koagelstedet. I

I 15 I

I Efter at have beskrevet den foretrukne udførelsesform af den foreliggende I

I opfindelse, vil det kunne ses af personer med almindelig indsigt i området, at der I

I kan laves adskillige modifikationer af den beskrevne udførelsesform, og at sådanne I

I modifikationer er beregnet på at være inden for omfanget af den foreliggende I

20 opfindelse. I

Claims (11)

1. Mutant af human vævsplasminogenaktivator (t-PA), kendetegnet ved, at den er produceret af rekombinante værtsceller, i 5 hvilken mutant position 275 indtages af en anden aminosyre end arginin og hvilken mutant er resistent over for specifik enzymatisk spaltning.

2. Mutant ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aminosyren er glycin. 10

3. Mutant ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aminosyren er glutaminsyre.

4. Mutant ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, 15 kendetegnet ved, at position 277 indtages af en anden aminosyre end lysin.

5. Mutant ifølge krav 4, kendetegnet ved, at aminosyren i position 277 er isoleucin. 20

6. Glu27s Ile277-mutant af human vævsplasminogenaktivator.

7. Glu275-mutant af human vævsplasminogenaktivator.

8. DNA-sekvens, som koder for mutanterne ifølge et hvilket som helst af de foregående krav. 1 2 3 4 5 40 Replicerbar udtrykkelsesvektor, som er i stand til i en transformant værtscelle at udtrykke DNA-sekvensen ifølge krav 8. 2 Mikroorganisme transformeret med vektoren ifølge krav 9. 3 Cellekultur transformeret med vektoren ifølge krav 9. 4

12. Pattedyrcellekultur transformeret med vektoren ifølge krav 9. 5 Cellekultur ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den er opnået ved transformation af en kinesisk hamsterovarie-(CHO)-cellelinje. I 30 DK 175380 B1 I

14. Præparat, kendetegnet ved, I at det omfatter en terapeutisk effektiv mængde af en plasminogenaktivator- I I mutant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 i blanding med en farmaceutisk I acceptabel bærer. I I 5 I

15. Mutant af human vævsplasminogenaktivator ifølge et hvilket som helst af I I kravene 1-7 til anvendelse til behandling af vaskulære sygdomme eller tilstande i I I et subjekt. I