DE69330463T2

DE69330463T2 - Isolierte nukleotid-sequenzen zum nachweis von neisseria gonorrhoeae

Info

Publication number: DE69330463T2
Application number: DE69330463T
Authority: DE
Inventors: Rich Chmelo; Lisa Foltz
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-09-15
Filing date: 1993-09-15
Publication date: 2001-12-13
Anticipated expiration: 2013-09-16
Also published as: EP0660844B1; JPH08501220A; DE69330463D1; ES2161230T3; EP0660844A1; WO1994006817A1; US5389515A; EP0660844A4

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der klinischen Analyse. Insbesondere betrifft sie analytische Verfahren und Vorrichtungen, bei denen man sich die Verbesserungen des bekannten Strangverdrängungstests zunutze macht. Daneben betrifft die Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die bei Tests auf Neisseria gonorrhoeae unter Anwendung der Strangverdrängungsmethodik sowie bei anderen Nucleinsäuresonden- Tests brauchbar sind.

Hintergrund und Stand der Technik

Eine Klasse diagnostischer Tests, die auf dem Gebiet der klinischen Chemie bekannt und angenommen ist, beruht auf der Nucleinsäurehybridisierung. Es ist bekannt, daß Nucleinsäuremoleküle (DNA und RNA) an komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren können und dies auch tun, wodurch doppelsträngige Moleküle gebildet werden.
Die Prinzipien der Nucleinsäure-Hybridisierung beruhen auf zwei trügerisch einfachen Regeln. Alle Nucleinsäuremoleküle bestehen aus vier Nucleotidbasen. DNA enthält die Basen "A", "T", "C" und "G", während RNA "A", "U", "C" und "G" enthält. Die beiden vorstehend erwähnten einfachen Regeln sind (i) die Basen "A" und "T" und "U" komplementieren und hybridisieren aneinander und (ii) "C" und "G" komplementieren und hybridisieren aneinander. Nucleinsäuremoleküle unterschiedlicher und großer Längen können durch Bindung von Basen aneinander gebildet werden.
Die Fähigkeit zur Identifizierung bestimmter Organismen, Viren, Mutationen in DNA/RNA-Sequenzen etc. beruht auf der Gegenwart von Sequenzen, die dem zu identifizierenden Material eigen sind, sowie auf den vorstehend erwähnten Hybridisierungsprinzipien. Enthält beispielsweise ein Mikroorganismus "X" die ihm eigene DNA-Sequenz:
5'-AAACCGGCC-3',
so ist es theoretisch möglich, den Mikroorganismus dadurch zu identifizieren, daß man die ihm eigene Sequenz zugänglich macht und sie mit ihrem Komplement zusammenbringt:
3'-TTTGGCCGG-5'
Enthält das Komplement eine Markierung, d. h., irgendeinen "Marker", dann ist die Feststellung möglich, daß Hybridisierung eingetreten ist. Ebendieses Prinzip ist das Kernstück aller Nucleinsäurebestimmungstests.
Der Strangverdrängungstest ist allgemein in einer Reihe von US-Patenten beschrieben, d. h., US-Patent Nr. 4 629 689 (Diamond et al.), 4 725 536 (Fritsch et al.), 4 725 537 (Fritsch et al.), 4 735 897 (Vary et al.), 4 752 566 (Collins et al.), 4 766 062 (Diamond et al.), 4 766 064 (Williams et al.), 4 767 699 (Vary et al.), 4 795 701 (Vary), 4 818 680 (Collins et al.). Im wesentlichen wird dabei eine Testprobe, von der man annimmt, daß sie die fragliche Nucleinsäuresequenz enthält, mit einem Hybridkomplex aus zwei Nucleinsäuresequenzen unterschiedlicher Länge zusammengebracht. Die längere Sequenz wird als Bindungssonde bezeichnet und ist zur fraglichen Nucleinsäuresequenz komplementär. Eine kürzere Sequenz, die als Signalsonde bezeichnet wird, ist nur an einen Teil der Bindungssonde hybridisiert. Derjenige Teil der Bindungssonde, der nicht an die Signalsonde hybridisiert ist, wird als Anfangsbindungsregion bezeichnet. Mit dem obigen Sequenzbeispiel
5'-AAACCGGCC-3'
läßt sich beispielsweise ein Hybridkomplex wie etwa der folgende herstellen:
worin "TTGGCCGG" die Bindungssonde, "TTGG" die Anfangsbindungsregion und "GGCC" die Signalsonde ist. In der Praxis bindet die Bindungssonde über die Anfangsbindungsregion oder "IBR" (initial binding region) an die Zielsequenz. Da sie länger als die Signalsonde ist, hybridisiert die Bindungssonde weiter an das Zielmolekül, und längere Moleküle enthaltende Komplexe sind stabiler. Nucleinsäuren bilden jedoch keine stabilen Triplex-Komplexe, und daher wird die Signalsonde "verdrängt". Ist die Signalsonde markiert, läßt sich diese Verdrängung messen.
Der Strangverdrängungstest ist hilfreich, aber nicht ohne Probleme, wobei die Empfindlichkeit nicht das geringste ist. Man kennt z. B. pathologische Zustände, wo der Unterschied zwischen Normalität und Anomalität auf einer einzigen unterschiedlichen Nucleotidbase beruht. Die Sichelzellenanämie ist wohl das bekannteste Beispiel für einen pathologischen Zustand, der mit einer solchen Punktmutation identifiziert wird. Es gibt andere Analyten, wo die Bestimmung einer einzigen Nucleotidbase von Bedeutung ist oder die Unterschiede zwischen verschiedenen Mikroorganismen sehr gering sind. Die Identifizierung und Bestimmung in diesem Zusammenhang erfordert einen Grad an Empfindlichkeit und Spezifität, der mit Strangverdrängungstests bisher nicht zu erreichen war.
Ein im Zusammenhang mit Nucleinsäure-Assays recht ausgiebig untersuchter Organismus ist Neisseria gonorrhoeae, der Erreger einer geschlechtlich übertragenen Krankheit mit schätzungsweise zwei Millionen gemeldeten Fällen pro Jahr. Zu den Beispielen in der Patentliteratur im Hinblick auf Neisseria gonorrhoeae-spezifische Nucleinsäuresonden gehören die US-Patente Nr. 4 900 659 an Lo et al., 5 047 523 und 5 099 011 - beide an Woods et al.; diese Patente befassen sich mit der DNA/DNA-Hybridisierung und offenbaren Sonden, die zwar hilfreich, aber eben nicht sehr spezifisch sind.
Zudem offenbaren die veröffentlichten Patentanmeldungen WO 90/14442, EP-A-0 337 896, EP-A-0 272 009 und EP-A-0 408 077 die Hybridisierung zwischen RNA und komplementären Sonden. Diese Patente stellen eine Weiterentwicklung des Patents von Kohne dar, US-Patent Nr. 4 851 330, bei dem Organismen durch Nachweisen unikaler RNA-Sequenzen identifiziert werden, wobei die rRNA-Sequenz des Organismus das Ziel ist.
Keines dieser Zitate lehrt die hierin offenbarten spezifischen Nucleinsäuresonden für N. gonorrhoeae, die bei verschiedenen diagnostischen Tests, einschließlich Strangverdrängungstests brauchbar sind. Die hierin offenbarten Sequenzen sind nicht nur unikal, sie fungieren auch als spezifische N. gonorrhoeae-Sonden. Im Zusammenhang mit dieser Feststellung muß darauf hingewiesen werden, daß die Einmaligkeit einer spezifischen Sequenz nicht notwendigerweise bedeutet, daß die Sequenz als Sonde wirkt. Es sind verschiedene Überlegungen zu berücksichtigen, darunter die Gesamtlänge der Sonde, die Fähigkeit zur Identifikation einer großen Anzahl von Strängen des Organismus, Mikroheterogenität etc..
Angesichts der Schwierigkeiten mit der Identifizierung von Sonden, die als N. gonorrhoeae-Sonden brauchbar sind, ist es überraschend, daß Sonden, die sich nur in einem einzigen Basenpaar von vergleichbaren Sequenzen anderer Spezies von Neisseria unterscheiden, zur Identifizierung von N. gonorrhoeae eingesetzt werden können. Diese Sonden sind ein weiteres Merkmal der wie hierin beschriebenen Erfindung.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt Anfangsbindungsstudien mit N. gonorrhoeaespezifischen Hybridkomplexen.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen zur Tdentifizierung einzelner Basenfehlpaarungen.
Fig. 3 zeigt zusätzliche Verdrängungsstudien.
Fig. 4 zeigt weitere Verdrängungsstudien.
Fig. 5 zeigt zusätzliche Verdrängungsstudien.
Fig. 6 veranschaulicht die Empfindlichkeit des Tests.
Fig. 7 zeigt die Spezifität des Tests für extrahierte RNA.
Fig. 8 zeigt ebenfalls die Spezifität für extrahierte RNA.
Fig. 9 beschreibt die Ergebnisse, die mit Proben lysierter Bakterien festgestellt wurden.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse von Studien an Sichelzellenanämie-DNA.
Fig. 11 zeigt die Daten bei einem festphasenbasierten Assay.
Fig. 12 zeigt ebenfalls Verdrängungstests, wobei Perlen verwendet werden.
Fig. 13 ist ein Diagramm eines typischen Assay im Streifenformat.
Fig. 14 zeigt die mit dem Streifenformat erhaltenen Ergebnisse.
Fig. 15 zeigt die Ergebnisse, die bei einem Festphasenkinetik-Assay erhalten werden.
Fig. 16 zeigt ebenfalls Ergebnisse aus einem Festphasenkinetik-Assay.
Fig. 17 zeigt die Ergebnisse aus einem Festphasen-Assay unter Verwendung roher rmA-Extrakte.
Fig. 18 zeigt ein Modell für einen Abfang-Assay auf Streifen.
Fig. 19 zeigt die Ergebnisse, die mit einem Abfang-Assay auf Streifen festgestellt wurden.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Beispiel 1

Es wurden Untersuchungen angestellt, um geeignete Materialien für die Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae herzustellen. Das 16S-rmA-Gen für einen bestimmten Stamm von N. gonorrhoeae ist bekannt (Rossau et al., Nucl. Acids Res. 16, 6227 (1988)). Bei hierin nicht beschriebenen Experimenten wurde die vergleichbare DNA für die 16S-rRNA bestimmter Stämme von N. meningitidis und N. lactamica sequenziert. Ein Vergleich zeigte, daß die Nucleinsäuren 1262-1281 nicht homolog waren:
AGCCGCGAGGCGGAGCCA 1 (SEQ ID NR. 1)
AGCCGCG G CGGAGCCA 2 (SEQ ID NR. 2)
AGCCGCGA CGATGCAT 3 (SEQ ID NR. 3)
Durch weitere Experimente wurden drei andere Regionen mit Unterschieden bei einem einzigen Basenpaar identifiziert:
ACACGTGGAATTCCACCTCCCTCTGAC (SEQ ID NR. 4);
CCCACGCTTTCGGACATGAACGTCAGT (SEQ ID NR. 5);
AGAGTGCCCAACCGAATGATGGCAAC (SEQ ID NR. 6).
Diese Sequenzen entsprechen den Basen 661-687, 750-776 bzw. 1125-1151 des 16S-rRNA-Gen-Minusstrangs von N. gonorrhoeae. In SF0 ID NR. 4 ist die Base 674ºC", jedoch "T" in den anderen beiden Neisseria-Spezies. In SEQ ID NR. 5 ist die Base 763 "A" wie bei den anderen beiden Spezies, und in SEQ ID NR. 6 ist die Base 1138ºC", jedoch "T" bei den anderen beiden Stämmen. Brauchbar sind auch Sequenzen, die zu diesen komplementär sind.

Beispiel 2

Um brauchbar zu sein, müssen die ausgewählten Sequenzen N. gonorrhoeae so allgemein wie möglich identifizieren, dürfen aber nicht an Material hybridisieren, das nicht von N. gonorrhoeae ist. Um dies mit den Sequenzen zu überprüfen, wurden mittels Markierung am 5'-Ende Sonden daraus hergestellt. Oligonucleotide entsprechend SEQ ID NR. 4, 5 und 6 (1,0 ul, etwa 2,46 umol) wurden mit 13,09 ul destilliertem H&sub2;O, 2,0 ul Puffer, 3,66 ul γ-32P-ATP und 0,25 ul T&sub4;-Polynucleotidkinase gemischt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, wonach 2,5 ul 0,1 M EDTA bei pH 8,0 zugesetzt wurden. Die Mischung wurde bis zum Gebrauch auf Eis bei 4ºC gehalten.
Ein repräsentativer Querschnitt von 39 Neisseria-Stämmen wurde zusammengestellt und mit drei Kontrollen verwendet. In Anlehnung an übliche Techniken wurde aus jedem Stamm die chromosomale DNA extrahiert. Die DNA wurde dann auf einer Nylon-Membran fixiert und als Ziel für die vorstehend markierten Nucleotidsequenzen verwendet. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 65ºC durchgeführt, wonach die Dot-Blots gewaschen, getrocknet und der üblichen Autoradiographie unterzogen wurden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt: Tabelle I
Die Ergebnisse zeigen, daß alle drei Sequenzen für N. gonorrhoeae spezifisch sind und somit die Grundlage für weitere Arbeit bieten.

Beispiel 3

Die Anfangsversuche wurden durchgeführt auf der Grundlage der durch SEQ ID NR. 1 beschriebenen nichthomologen Sequenz. Für die Durchführung wurde ein Hybridkomplex hergestellt, der als lange Bindungssonde eine Sequenz aus 80 Nucleotiden enthielt. Diese lange Sequenz war komplementär zu SEQ ID NR. 1 und begann 49 Basen vom 5'-Ende von SEQ ID NR. 1. Über die letzten 25 Basen am 3'-Ende wurde eine Signalsonde hybridisiert:
GAGGCGGAGCCAATCTCACAAAACC (SEQ ID NR. 7)
Die Sonde aus 25 Nucleotiden wurde in der vorstehend beschriebenen Art und Weise markiert.
Die Verdrängungstests wurden in der von Diamond et al., US- Patent Nr. 4 766 022, und Collins et al., EP-A-0 167 238, beschriebenen Art und Weise durchgeführt. Der Vollständigkeit halber seien die Vorschriften jedoch hier angeführt. Zur Hybridisierung der beiden vorstehend beschriebenen Komponenten wurden die folgenden Komponenten in einem 1,5 ml- Mikrozentrifugenröhrchen vereinigt:
2 · SSC (15,5 ul)
50% PEG (5,0 ul)
Bindungssonde (110 fmol/ul) (2,5 ul)
Markiertes Signal (110 fmol/ul) (2,0 ul)
Das Endvolumen belief sich auf 25 ul, mit einer Salz-Endkonzentration von 1,24 · SSC und 10% PEG. Die Mischung wurde 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und dann bis zum Gebrauch auf Eis oder bei 4ºC gehalten.
Zum Test auf den Analyten wurden 1,0 ul des Hybridkomplexes mit 3 ul destilliertem Wasser, 4,0 ul 25% PEG, 1,0 ul 20 · SSC und 1,0 ul Probe vereinigt. Die Mischung wurde über einen beliebigen Zeitraum von 1-4 Stunden bei 50ºC inkubiert. Die Verdrängung der Signalsonde wurde mittels Elektrophorese bestimmt. Die Mischung wurde durch ein 20%iges nichtdenaturierendes Polyacrylamid-Gel laufen lassen (30% Acrylamid-Lösung: 66,6 ml, Wasser: 21,3 ml; 3% Ammoniumpersulfat: 2,1 ml; 10 · TBE: 10,0 ml) und durch eine sterile 0,45 um-Filtereinheit filtriert. Insgesamt 44 ul TEMED wurden zugesetzt, und die Mischung wurde zum Absetzen belassen. Die Probe wurde zugesetzt (1500 Volt, 2 Stunden, Puffer 1 · TBE; Beschickungspuffer: 30% Glycerin plus Farbstoffe Bromphenolblau und Xylolcyanol).
Die Ergebnisse - dargestellt in Fig. 1 - zeigen, daß N. gonorrhoeae (Bahnen 5-8) ein positives Signal ergab, nicht aber N. lactamica (Bahnen 9-12). N. meningitidis (Bahnen 13-16) lieferte jedoch ebenfalls positive Ergebnisse. Dies war dem hohen Grad an Homologie zwischen N. gonorrhoeae und N. meningitidis zuzuschreiben, der für rRNA- Sequenzen mit einer Höhe von 98,5% angegeben wird.

Beispiel 4

Angesichts der Bindung an N. meningitidis wurden auch andere Strategien geprüft. Hierbei wurden Veränderungen an der Bindungssonde und der Signalsonde hinsichtlich Größe und Ursprungspunkt vorgenommen. Die Veränderungen sind nachstehend dargestellt, wobei "SDBP" sich auf die Bindungssonde und "SDSP" sich auf die Signalsonde bezieht. Die erste Zahl bezeichnet die Länge der Sequenz, und die zweite Zahl deren Beginn relativ zum 5'-Ende des 16S rRNA-Gens von N. gonorrhoeae.
Betrachtet man diese Daten, so sei darauf hingewiesen, daß "1262", welches die Base von N. gonorrhoeae ist, an der die nichthomologe Sequenz beginnt, als "1213" bezeichnet wird, um Übereinstimmung mit dem E. coli-16S-rRNA-Gen zu haben, wie es in der Fachwelt üblich ist.

Tabelle 2: Geprüfte Komplexe

I SDBP-53-1243/SDSP-25-1268
II SDBP-43-1253/SDSP-25-1268
III SDBP-36-1261/SDSP-25-1268
IV SDBP-53-1243/SDSP-18-1271
V SDBP-43-1253/SDSP-18-1271
VI SDBP-36-1261/SDSP-18-1271
VII SDBP-53-1243/SDSP-18-1279
VIII SDBP-43-1253/SDSP-18-1279
IX SDBP-36-1261/SDSP-18-1279
X SDBP-32-1257/SDSP-25-1264
XI SDBP-36-1261/SDSP-25-1268
XII SDBP-32-1266/SDSP-25-1268
XIII SDBP-36-1261/SDSP-25-1271
XIV SDBP-32-1266/SDSP-25-1271
XV SDBP-32-1269/SDSP-25-1271
XVI SDBP-36-1261/SDSP-25-1273
XVII SDBP-32-1266/SDSP-25-1273
XVIII SDBP-32-1269/SDSP-25-1273
XIX SDBP-43-1260/SDSP-25-1276
XX SDBP-32-1266/SDSP-25-1276
XXI SDBP-32-1269/SDSP-25-1276
Von allen geprüften Hybridkomplexen zeigte nur Nummer 17 Spezifität, d. h., SDBP-32-1266/SDSP-25-1273. Die Anfangsbindungsregion dieses Komplexes war 7 Basen lang und hatte Fehlpaarungen an den Positionen 4 und 5, relativ zu Neisseria non-gonorrhoeae. Dieses Experiment zeigt, daß die Länge der IBR ein wichtiges Kriterium für die Spezifität ist.

Beispiel 5

Die in Beispiel 4 beschriebene Beobachtung, d. h., die Bedeutung der IBR-Länge, wurde in nachfolgenden Experimenten überprüft. Hierbei wurden synthetische N. gonorrhoeae-Analyten hergestellt, bei denen einzelne Punktmutationen eingebracht wurden. Es wurde der Komplex SDBP-32-671/SDSP-25- 678 verwendet, unter Anlehnung an die vorstehend gegebene Vorschrift. Fig. 2 zeigt, daß eine Auflösung bis hinab zu einer einzigen Basenfehlpaarung möglich war. Dies ist ein Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Auflösungsgrad in der Technik und bietet die Möglichkeit zur Diagnose von Krankheiten, die durch Punktmutationen verursacht werden (z. B. Sichelzellenanämie), und zur Differenzierung von eng verwandten Organismen, einschließlich Viren.

Beispiel 6

Die vorstehend beschriebenen Beispiele brauchten im allgemeinen etwa 10 Minuten bis zum Abschluß. Es wurden Versuche zur Verbesserung der Assay-Kinetik angestellt. Zu deren Durchführung wurden Zusammensetzungen auf der Grundlage der den Basen 661-687 von N. gonorrhoeae entsprechenden Sequenz hergestellt, die - wie oben angegeben - sich von anderen Neisseria-Organismen bei Base 674 unterscheidet. Es wurde eine Reihe von Komplexen hergestellt und mit Kontrollen, synthetischem N. gonorrhoeae-Reagens und mit synthetischem N. meningitidis-Reagens getestet. Beim Verdrängungstest wurden 50 fmol Probe und 10 fmol Hybridkomplex eingesetzt. Die Materialien wurden eine Stunde lang bei 37ºC bzw. 50ºC inkubiert. Die Ergebnisse der Verdrängung sind in den Fig. 3, 4, und 5 gezeigt. Die Ergebnisse lassen sich allerdings auch in der folgenden Tabelle 3 zusammenfassen: Funktionsdaten - ausgewählte Aufbauarten am "Ort 674"
a) Vom 3'-Ende der Bindungssonde
b) Selektivitätsskala: - = keine Selektivität; + bis ++++ = schlechte bis gute Selektivität;
Verdrängungsreaktion über 60 min bei der angegebenen Temperatur.
c) Der 8-Basenüberhang am 5'-Ende kann die Selektivität herabsetzen.
d) Der 7-Basenüberhang am 5'-Ende kann die Selektivität herabsetzen.
Die beiden Komplexe mit den besten Ergebnissen waren SDBP- 32-671/SDSP-25-678 und SDBP-24-671/SDBP-17-678, die beide IBRs mit einer Länge von 7 Basen aufwiesen. Diese Komplexe wurden dann bei kinetischen Untersuchungen eingesetzt, und es zeigte sich, daß die Verdrängungsreaktion beim Inkubieren bei 45ºC unter Anwendung der in den vorausgehenden Beispielen angewandten Bedingungen innerhalb von fünf Minuten vollständig war.

Beispiel 7

Es wurden Untersuchungen zur Bestimmung der Empfindlichkeit des Assay durchgeführt. Bei diesen Experimenten wurde 1 Attomol (1·10&supmin;¹&sup8; mol) des Komplexes mit 5-10fachen Überschüssen Analyt bei niedriger Stringenz vereinigt, und es wurden Empfindlichkeiten von etwa 1 Attomol beobachtet.
Auch stringente Bedingungen wurden getestet (0,22 · SSC, 10% PEG, 375 Attomol Hybrid, 0,005 Attomol bis 53 fmol Probe). Unter diesen Umständen wurde eine Empfindlichkeit bis etwa 530 Attomol beobachtet, wie beispielsweise aus Fig. 6 ersichtlich ist. Diese Figur zeigt Ergebnisse, die mit Mengen erhalten wurden, die im Bereich von weniger als stöchiometrisch bis zu 100fachen Überschüssen liegen.

Beispiel 8

Die Stabilität der Hybride wurde auf zwei verschiedene Arten getestet. Beim ersten Ansatz wurden im vorhinein Hybridkomplexe wie vorstehend beschrieben gebildet, die bei 4ºC aufbewahrt wurden. Dann wurden Aliquote in regelmäßigen Abständen entnommen und mittels Gelelektrophorese analysiert. Über einen Zeitraum von drei Wochen war keine Dehybridisierung festzustellen. Bei einer Variante hiervon wurden die Hybridkomplexe bei 50ºC untersucht, und nach 24 Stunden war weniger als 10% "Dehybridisierung" zu beobachten.
Bei einer zweiten Methode zur Bestimmung der Stabilität wurden Hybride gebildet, es wurde zur Trockene eingedampft und bei 4ºC aufbewahrt. Über einen Zeitraum von fünf Wochen wurden die Rückstände einmal pro Woche wieder in Hybridisierungspuffer gelöst, Aliquote wurden entnommen, und es wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. Auch nach fünf Wochen war keine Dehybridisierung zu beobachten.

Beispiel 9

Bei diesen Experimenten wurde die rmA von Neisseria unter Verwendung der Hybridkomplexe SDBP-32-671/SDSP-25-678 und SDBP-24-671/SDSP-17-678 analysiert. Beide Sonden waren ³²Pmarkiert.
Zunächst wurde RNA aus verschiedenen Neisseria-Stämmen isoliert. Hierzu wurden 200 ml einer jeden Probe bis zur mittleren logarithmischen Phase zur Vermehrung belassen. Die Kulturen wurden dann mit jeweils 20 ml "Puffer A" (200 mM Tris, pH 8,0, 20 mM EDTA, 20 mM NaN&sub3;, 20 mM Aurintricarbonsäure) versetzt. Die Kulturen wurden pelletisiert, und die Pellets wurden in 2 ml "STET"-Puffer (8% Sucrose, 5% Triton X-100, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7) mit 10 mM Vanadylribonucleosid-Komplex (VRC) resuspendiert. Die Suspensionen wurden mit Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugieren getrennt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und dann mit 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat und zwei Volumina Ethanol präzipitiert.
Die Präzipitate wurden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 10 000 U/min aufkonzentriert. Die Pellets wurden dann mit 10 mM VRC in 2 ml DEPC-behandeltem, sterilem Wasser resuspendiert. Die Mischung wurde zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und präzipitiert.
Nach dem Zentrifugieren wurden die resultierenden Pellets in 2 ml DEPC-behandeltem; sterilem Wasser und 1 g CsCl resuspendiert. Eine jede Mischung wurde dann auf ein 0,75 ml- Polster aus 5,7 M CsCl/100 mM EDTA, pH 7, aufgeschichtet und dann mit 1 ml Glycerin überschichtet. Die rRNA wurde dann durch Zentrifugieren bei 40 000 U/min über Nacht pelletisiert. Das Glycerin und das CsCl-Polster wurden entfernt und die RNA-Pellets in 400 ul DEPC-behandeltem, sterilem Wasser resuspendiert. Die RNA wurde mit Natriumacetat und Ethanol präzipitiert.
Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren aufkonzentriert und in 300 ul DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert. Die optischen Dichten wurden aufgenommen, und die RNA wurde in Aliquoten bei -20ºC eingefroren. Die Homogenität wurde durch Elektrophorese eines 11,25 ul-Aliquots auf 1% Formaldehyd/Agarose-Gel, gefolgt von Sichtbarmachen mit Ethidiumbromid überprüft. E. coli-rmA diente als Kontrolle. Die durchschnittlichen Ausbeuten beliefen sich auf 2,9 mg für N. gonorrhoeae, 2,7 mg für L. meningitidis und 3,1 mg für N. lactamica. Diese Proben enthielten sowohl 16S- als auch 23S-rRNA, wobei das Verhältnis etwa 1/3 zu 2/3 betrug.
Es wurden die vorstehend beschriebenen Vorschriften für die Hybridisierung durchgeführt. Es wurden die in diesem Beispiel aufgezählten Hybridkomplexe eingesetzt. Die Fig. 7 und 8 zeigen beide Verdrängung bei N. gonorrhoeae, nicht aber bei N. meningitidis oder N. lactamica.
Zur Durchführung einer erfindungsgemäßen Strangverdrängung mit einer schnell lysierten Probe von Neisseria wurden Nelsseria-Stämme auf Schokoladenagarplatten wachsen lassen, und einzelne Kolonien wurden in sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die 50 ul GTE (Glucose, Tris, EDTA/Lysozym-Lösung) enthielten. Diese Mischung wurde kräftig verwirbelt und fünf Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 50 ul-Aliquot einer gramnegativen Lysierlösung (Collins, EP-A-0 167 238) wurde zugesetzt, und die Probe wurde 15 Sekunden lang verwirbelt. Danach waren die Proben für den Strangverdrängungstest bereit.
Die Ergebnisse, die in Fig. 9 gezeigt sind, belegen die Wirksamkeit des Strangverdrängungstests mit der lysierten Probe.

Beispiel 10

Die Beispiele 1-9 zeigen, daß es möglich ist, den hierin erörterten Strangverdrängungstest zur Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae heranzuziehen. Der Test wurde auch auf die Identifizierung von Sequenzen in Verbindung mit Sichelzellenanämie hin überprüft.
Die Oligonucleotide wurden hergestellt nach Bakloriti et al., Blood 74, 1817-1822 (1989), d. h.:
Der Unterschied zwischen normalem und Krankheitsanalyt findet sich bei Base 60 (A für normal; T für Krankheit) und der Unterschied bei der Bindungssonde 4 Basen vom 3'-Ende (T für normal; A für Krankheit). Es wurden Reaktionen unter Anwendung der bei den Neisseria-Assays angegebenen Bedingungen durchgeführt, wobei diese Reaktionen bei 37ºC durchgeführt wurden. Die Bahnen 1-3 in Fig. 10 zeigen den Einsatz von normaler Bindungssonde mit Krankheitsanalyt, während die Bahnen 4-6 den Einsatz von Krankheitssonde ebenfalls mit normalem und Krankheitsanalyt zeigen. Eine definitive Identifizierung der Punktmutation war zu beobachten. Weiterhin war beim Vergleich der beiden Analyten keine Kreuzreaktivität zu beobachten. Eine Normalhämoglobin-Modellsequenz zeigte keine Verdrängung mit Sichelzellenhämoglobin-Modellanalyt und umgekehrt.

Beispiel 11

Die Beispiele 1-10 geben die in Lösung stattfindenden Strangverdrängungstests ausführlich wieder. In der Praxis ist ein festphasenbasiertes Analysensystem höchst erwünscht, da derartige Systeme z. B. in Arztpraxen und kleinen Laboratorien guten Anklang finden.
Es wurden Latexperlen mit Streptavidin-Beschichtungen als feste Phase verwendet, wobei darauf hingewiesen sei, daß viele Methoden zur Anlagerung dieses bindenden Agens und des verwandten Moleküls Avidin wohlbekannt sind. Diese wurden in Verbindung mit Biotin-markierten Hybridkomplexen verwendet. Bei diesen Komplexen handelte es sich um die vorstehend beschriebenen Materialien SDBP-32-671/32P-SDSP- 25-678 und SDBP-32-1266/ P-SDSP-25-1273. Nach den Anweisungen des Herstellers (siehe "Applied Biosystems User Bulletin 49") wurde eine Amino-Verknüpfung am SDBP angebracht, und das resultierende Material wurde biotinyliert. Hierzu wurde das Amino-verknüpfte Oligonucleotid getrocknet und in 75 ul 0,25 M Tris-HCl bei pH 7,6 wiederhergestellt. Eine 1,0 mg-Probe Biotin-NHS-Ester wurde dann in 75 ul DMF gelöst, und die beiden Stoffe wurden gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur verwirbelt. Das DMF wurde durch Dialyse abgetrennt und das resultierende Material am Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde in destilliertem Wasser gelöst. Eine HPLC-Analyse zeigte, daß die Biotin- Verknüpfung stattgefunden hatte.
Sobald die biotinylierten Sonden und die Streptavidin-Perlen verfügbar waren, konnten zwei verschiedene Methoden zur Durchführung eines Strangverdrängungstests verfolgt werden. Bei der einen Ausführung soll die Reaktion zwischen Zielanalyt und Hybridkomplex durchgeführt werden, wonach die Streptavidin-markierten Perlen zugesetzt werden, um etwaigen unumgesetzen Komplex abzufangen. Die Komplexe wurden in ähnlicher Weise mit den Perlen vorinkubiert, und die Strangverdrängung wurde durch Zugabe des Festphasen-gebundenen Komplexes zur Probe und anschließendes Ablaufenlassen der Strangverdrängung untersucht.
Bei Anwendung der ersten Option wurden die vorstehend beschriebenen Reaktionen in der Lösungsphase vonstatten gehen lassen, wonach die Streptavidin-markierten Perlen zugesetzt und zwei Minuten lang inkubiert wurden. Für die Untersuchung wurde ein Aliquot dieses Materials dann einem Gel zugesetzt.
Nach der zweiten Alternative wurden die Perlen mit dem biotinylierten Hybridkomplex (SDBP-32-1266/³²P-SDSP-25-1273) vermischt und zwei Minuten lang inkubiert, wonach sie der Probe zugesetzt wurden. Wiederum wurde dem Gel nach der Reaktion ein Aliquot Probe zugesetzt. Bei beiden Ausführungen wurden Tests mit zwei Parameter-Sätzen durchgeführt (37ºC, 90 Minuten Inkubieren; oder 50ºC, 20 Minuten Inkubieren). In Fig. 11 zeigen die Bahnen 1-8 die Ergebnisse bei Durchführung des Tests in Gegenwart der Perlen, während die Bahnen 9-16 die Ergebnisse sind, die erhalten wurden, wenn die Perlen nach der Reaktion zugesetzt wurden. In allen Fällen wurden 9 fmol Komplex und 50 fmol Analyt eingesetzt. Nur der N. gonorrhoeae-Modellanalyt ergab Verdrängung, während sowohl das Meningitidis- als auch das Lactamica-Modell keine solche aufwiesen.
In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Verdrängungsreaktion mit 10 fmol Biotin-markiertem SDBP-32-671/³²P-SDSP-25- 678 durchgeführt, das 30 Minuten lang bei 50ºC inkubiert und dann auf Eis abgekühlt wurde, ehe die beschichteten Perlen zugesetzt wurden. Es wurden synthetische Analyten wie auch rohe RNA-Extrakte getestet. Fig. 12 zeigt diese Ergebnisse. Vollständige Reaktionen fanden statt bei synthetischer N. gonorrhoeae und eine teilweise Reaktion bei N. meningitidis (Bahnen 2 bzw. 4). Bei den rohen Extrakten zeigte nur N. gonorrhoeae-Extrakt eine Reaktion (Bahn 5), während die anderen (Bahnen 6-8) keine Reaktion aufwiesen.

Beispiel 12

Es wurden auch Experimente durchgeführt, um den Verdrängungstest in Verbindung mit einer Nitrocellulose-Membran zu prüfen. Bei diesen Experimenten wurde die Reaktionsmischung auf eine Nitrocellulose-Membran (5 um, MSI) etwa 0,5 cm weit vom Boden aufgetragen. Dann wurde Hybridisierungspuffer zugesetzt, bis die Lösungsmittelfront etwa 2,5 cm weit gewandert war. Die Streifen wurden abgedeckt und autoradiographiert.
Fig. 13 zeigt ein typisches System für einen Assay im Streifenformat. Bei den hierin erörterten Experimenten wurde der Biotin-markierte Hybridkomplex SDBP-32-671/³²P SDSP-25-678 (10 fmol) mit verschiedenen Neisseria-Analyten vereinigt. Die Reaktionstemperatur betrug 50ºC. Aliquote wurden in 2, 5 und 10 Minuten-Intervallen entnommen, auf Streptavidin-beschichtete Perlen gegeben und auf Eis aufbewahrt. Die Mischungen wurden jeweils doppelt auf die Vorstehend beschriebenen Streifen aufgetragen und autoradiographiert.
Fig. 14 zeigt die Ergebnisse. Die Kontrollreaktion war ohne Analyt, und der Hybridkomplex verbleibt am Auftragepunkt. Wird der richtige Analyt (in der Figur "A") zugegeben, so findet Verdrängung statt, wie sich durch das allmähliche Verschwinden der Radioaktivität zeigt. Dies tritt bei N. meningitidis (in der Figur "M") nicht ein.

Beispiel 13

Die Reaktionskinetik wurde in Systemen verglichen, bei denen die Perlen nach der Verdrängung mit dem Komplex zugesetzt wurden. Alle Parameter waren so wie in Beispiel 12. Die Ergebnisse, die in den Fig. 15 und 16 dargestellt sind, zeigen, daß bei Zugabe der Perlen mit den Komplexen 80% Verdrängung nach 40 Minuten eintrat. Wurden jedoch die Perlen später zugesetzt, so trat 80% Verdrängung bereits nach 10 Minuten ein. In Anbetracht des ausgeprägten Unterschieds in der Kinetik wurde bei späteren Experimenten das schnellere Reaktionssystem eingesetzt.

Beispiel 14

Bei den vorstehend beschriebenen, auf Streifen basierenden Assays wurde synthetischer Analyt verwendet. Es wurde die Durchführbarkeit des Tests unter Verwendung von rmA geprüft. Der eingesetzte Sondenkomplex war der aus den Beispielen 11-13, und der Analyt war entweder RNA, die in der vorstehend beschriebenen Weise extrahiert wurde, oder es waren synthetische Analyten. Die Testvorschriften waren diejenigen aus den Beispielen 12 und 13. Wie aus Fig. 17 ersichtlich ist, zeigen die Ergebnisse, daß rohe Nucleinsäure-Mischung (N. gonorrhoeae RR21) und reine RNA Verdrängung zeigen, nicht aber reine N. lactamica-RNA und reine N. meningitidis-RNA.

Beispiel 15

Zur Vereinfachung der Reaktionsschritte wurde eine Variante der vorstehend erörterten Streifenmethode entwickelt. Diese Variante soll als direkte On-Strip-Methode bezeichnet werden, wie in Fig. 18 gezeigt. Im wesentlichen wurden Teile der Nitrocellulose-Streifen unter Anwendung der üblichen Techniken mit thermischem RSA/Streptavidin beschichtet. Unter Verwendung der biotinylierten Hybridkomplexe aus den Beispielen 11-14 wurden die üblichen Verdrängungsreaktionen in Lösungsphase durchgeführt. Nach der Verdrängungsreaktion wurden Aliquote auf die vorbeschichteten Streifen aufgetüpfelt (2 fmol Sonde, sowie 0,1, 0,3, 1,0, 3, 10,0 und 30,0 fmol Analyt). Es wurde eine Stunde lang bei 50ºC inkubiert. Jeder Analyt wurde zweimal laufen lassen, und die Kontrollen dreimal. Die Streifen wurden nach fünf Minuten chromatographiert und autoradiographiert, wie in Fig. 19 gezeigt. Es fand bei allen Konzentrationen Verdrängung statt, obwohl die Kontrolle ebenfalls etwas Verdrängung zeigte.

Beispiel 16

Die durch SEQ ID NR. 4, 5 und 6 dargestellten Sonden sowie deren Komplemente sind auch bei anderen Tests brauchbar, die keine Strangverdrängungstests sind. Sie wurden ausgiebig getestet, wobei über 200 weltweit ausgewählte klinische Isolate von Neisseria gonorrhoeae verwendet wurden.
Zur Durchführung der Sondenstudien wurden 25 ul-Kulturen von Neisseria-Stämmen wachsen lassen, und die genomische DNA wurde unter Anwendung der üblichen Methoden extrahiert. Die DNA wurde gereinigt und auf Agarose auf Reinheit und Unversehrtheit geprüft. Nachdem dies erledigt war, wurden 10 ug-Proben auf Nylon-Membranen aufgetragen, wobei wiederum die üblichen Techniken angewandt wurden. Dann wurden die Sondenproben zugesetzt (ungefähr 3·10&sup5; Zählimpulse ³²P-markierte Sonde), gefolgt von Hybridisierung bei 65ºC über Nacht. Die Membranen wurden gewaschen und auf einen Film einwirken lassen.
Die Ergebnisse sind in der begleitenden Tabelle 4 dargestellt. Die Einträge in der Tabelle entsprechen den folgenden SEQ IDs:

Sonde SEQ ID NR.

1A Komplement zu 4
2A 4
3 Komplement zu 6
4 6
5 Komplement zu 5
6 5
R102 Kontrollsequenz (siehe z. B. europäische Patentanmeldung 272 009) Tabelle 4 Zusammenfassung der DNA-Dot-Blots
Mit ihren umfangreichen Testergebnissen und den positiven Ergebnissen zeigt Tabelle 4 die Brauchbarkeit des Systems. Der Gesamtwirkungsgrad der Sonden ist wie folgt:

Beispiel 17

In Anbetracht der Ergebnisse von Beispiel 16, die die Spezifität für DNA zeigen, wurden Tests zur Prüfung auf RNA- Spezifität durchgeführt. Es wurden 25 RNA-Stämme nach Zufall ausgewählt, und die RNA wurde extrahiert, wobei entweder die üblichen Methoden oder die vorstehend dargestellten Methoden angewandt wurden. Kontrollstämme wurden ebenfalls verwendet. Zur Überprüfung der Reinheit und Unversehrtheit wurde die extrahierte RNA quantifiziert und auf 1% Formaldehyd/Agarose-Gelen einer Elektrophorese unterzogen, wonach 10 ug-Proben auf Nylon-Membranen aufgetragen wurden. Die RNA wurde durch Zugabe von deionisiertem Formamid und Formaldehyd denaturiert, eine Stunde lang bei 50ºC inkubiert, auf Eis gekühlt und dann auf die Membran aufgetragen. Die Hybridisierung wurde nach den oben erläuterten Vorschriften mit 5'-³²P und markierter Sonde über Nacht bei 60ºC durchgeführt.
Die Sonden 2A, 4 und 6 hybridisierten an einsträngige 16SrRNA, nicht aber 1A, 3 und 5, die identisch zu 16S-rmA sein sollten. Die Empfindlichkeit war in allen drei Fällen 100%.

Diskussion

Die vorstehenden Beispiele beschreiben eine verbesserte Form des Strangverdrängungstests. Bei dieser Methode wird im wesentlichen die fragliche Probe mit einem Hybridkomplex zusammengebracht. Der Komplex enthält eine Bindungssonde und eine Signalsonde. Das erste Element des Komplexes läßt sich in eine Anfangsbindungsregion oder "IBR" und eine Zielbindungsregion unterteilen. Zielbindungsregion und Signalsonde sind aneinander hybridisiert, und die IBR steht aus dem Komplex hervor. Die gesamte Bindungssonde muß zu dem zu analysierenden Nucleinsäuremolekül komplementär sein. Der Komplex wird zur Probe zugegeben, und die Bindungssonde beginnt, an den Nucleinsäureanalyten in der Probe zu hybridisieren. Hybride mit längerer Sequenz sind stabiler als kürzere, so daß die Hybridisierung zwischen Ziel und Sonde begünstigt ist, was zur Verdrängung der Signalsonde führt. Nach ihrer Verdrängung wird die Signalsonde gemessen oder beobachtet, woraus sich die Bestimmung des Zielanalyten ergibt.
Es gibt gewisse Anforderungen an die Elemente des Hybridkomplexes. Was die Bindungssonde betrifft, so darf die IBR nicht zu lang sein, damit Hybridisierung an eine Nicht-Analytensequenz verhindert wird. Dies kann bei einer Bindungssonde passieren, wenn beispielsweise die IBR 95% Homologie zu einer Nicht-Zielsequenz aufweist und die 5% Unterschied über die Länge der IBR verteilt sind. Tritt dies ein, so wird die IBR die statistischen Bereiche der Nichtkomplementarität letztlich ignorieren und auf jeden Fall hybridisieren. Zur Vermeidung derartiger Probleme muß die IBR kurz genug sein, um nichtkomplementäre Bindung zu verhindern. Auch die gesamte Sondensequenz muß kurz genug sein, um die Bildung stabiler Hybride mit nichtkomplementären Sequenzen zu verhindern. Selbst wenn die IBR keine falsche Hybridisierung eingeht, kann dies mit einer langen Sonde passieren, weil die längere Region immer noch hybridisiert. Vorzugsweise hat die gesamte Sondensequenz eine Länge von nur 20 bis 40 Basen, wobei eine Länge von 25 bis 35 Basen besonders bevorzugt ist. Innerhalb dieser Sondensequenzen ist es besonders bevorzugt, wenn die IBR 10 oder weniger Basen lang ist, so daß eine Zielbindungsregion verbleibt, die vorzugsweise 10 bis 30 oder sogar 15 bis 35 Nucleotidbasen lang ist. Besonders gute Ergebnisse wurden z. B. mit Basenlängen von 7 Basen für die IBR und 25 Basen für die Zielbindungsregion gefunden.
Die Hybridkomplexe des hierin beschriebenen Typs sind hilfreich für die Bestimmung von Analyten und können Unterschiede bis hinab zu einem einzigen Basenpaar genau unterscheiden. Als solche sind die Komplexe bei diagnostischen Tests auf verschiedenartige Analyten und pathologische Zustände brauchbar, darunter auch Punktmutationen. Zu den verschiedenen diagnostischen Anwendungen dieses Verfahrens gehört die Bestimmung geschlechtlich übertragener Krankheiten, Virus-Infektionen, Bakterien, chromosomaler Störungen, genetisch vererbter Krankheiten, Nucleinsäure-Mutationen und so weiter.
Wie man sieht, können bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Tests sowohl Lösungs- als auch Festphasentests durchgeführt werden, wobei die letztere Kategorie besonders bevorzugt ist. Zu den Varianten der letzteren Kategorie gehören Tests, bei denen der Hybridkomplex an einen Feststoff wie etwa eine Perle oder ein Nitrocellulose-Papier oder eine Nylon-Membran gebunden ist und die Signalsonde daraus verdrängt wird. Das verdrängte Signal kann dann gemessen werden. Bei diesen Systemen kann die Bindungssonde auf vielerlei Weisen an die feste Phase gebunden sein, die einem versierten Fachmann geläufig sind, da die Immobilisierung von Nucleinsäuren an feste Phasen eine gewisse Routine darstellt. Bei den besonders bevorzugten Systemen wird die Bindungssonde über ein (Strept)avidin/Biotin-Bindungssystem immobilisiert, wobei die Elemente des Bindungssystems untereinander austauschbar sind. Zusätzlich können Linker-Moleküle verwendet werden, um die Sonde an die feste Phase zu binden.
Wie vorstehend gezeigt, ist es auch möglich, den Verdrängungstest durchzuführen und dann die feste Phase zuzugeben, so daß die Komplexe aus der Lösung abgetrennt werden, in welcher der Test erfolgt. Man bestimmt dann die Signalmenge entweder auf der festen Phase oder in der Lösung.
Natürlich ist die Signalsonde markiert, damit sie leichter zu identifizieren ist. Es können Radiomarkierungen wie etwa ³²P und ³&sup5;S etc. verwendet werden, aber auch irgendeines der vielen Signale, die zur Markierung von Nucleinsäuresequenzen verwendet werden. Es können Metallteilchen wie etwa Gold-Sole verwendet werden, wie auch fluoreszierende, chemilumineszierende oder andere Materialien, die ein "inhärentes" Signal zeigen, etwa farbige Mikropartikel. Es können auch andere Markierungen verwendet werden, die insofern keine eigenen Signale erzeugen, als sie einer weiteren Behandlung bedürfen, um nachgewiesen zu werden. Zu diesen Stoffen gehören Enzyme wie etwa Peroxidasen und alkalische Phosphatasen - wobei ein Substrat für das Enzym zugesetzt wird, um ein Signal zu ergeben -, magnetische Teilchen, antigene oder haptene Moleküle, Antikörper und so weiter, bei denen eine weitere Reaktion erforderlich ist, um die Gegenwart des Signals anzuzeigen.
Die Erfindung umfaßt auch Reagenzien-Sets und Komplexe, die für die Durchführung der hierin beschriebenen Art von Verdrängungstests brauchbar sind. Bei den erfinderischen Komplexen handelt es sich um die vorstehend beschriebenen. Die Reagenzien-Sets enthalten den Komplex, und sie können z. B. eine Festphasenkomponente für die anschließende Bindung des Komplexes entweder vor oder nach Durchführung des Tests sowie eine Signaleinrichtung zum Nachweisen der Markierung auf der Signalsonde enthalten. Die Signaleinrichtung wird getrennt von der markierten Sequenz gehalten, während das Festphasenmaterial direkt an die Bindungssonde gebunden sein kann oder nicht. Falls gewünscht, ist es auch möglich, die Bindungssonde und die Signalsonde in getrennten Teilen des Sets bereitzustellen.
Die Anlagerung des Komplexes an feste Phasen ermöglicht dem Fachmann auch die Herstellung diagnostischer Vorrichtungen, bei denen ein Komplex auf einer festen Trägerauflage, etwa einem Nitrocellulose-Papierstreifen immobilisiert ist. Der Streifen kann an einem Punkt nach dem angelagerten Komplex ein signalerzeugendes System zur Bestimmung verdrängter Markierung enthalten. Das signalerzeugende System kann auch separat vom Streifen z. B. in Form eines Reagenzienbehälters dargeboten werden.
In den ersten Beispielen dieser Anmeldung sind auch isolierte Nucleinsäuresequenzen angegeben, die als spezifische diagnostische N. gonorrhoeae-Sonden brauchbar sind. Diese Oligomere hybridisieren mit anderen Spezies von Neisseria nicht in einem solchen Ausmaß, das zu falschen positiven Ergebnissen führen würde, was sie besonders nutzbringend beim Diagnostizieren von Gonorrhöe macht. Die SEQ ID NR: 1, 4-6 und 7 sind Beispiele für derartige Oligomere. Diese Sonden können in irgendeiner Weise wie vorstehend beschrieben sowie in jeder anderen, der Fachwelt bekannten Weise markiert sein. Es lassen sich verschiedene Testausführungen in Verbindung mit dem wie beschriebenen Strangverdrängungstest anwenden. Eine besonders erwünschte Anwendung des Tests ist die in einem automatisierten System. Bei einem solchen System wird der Hybridkomplex an einer festen Phase immobilisiert, etwa an der Innenwandung eines Reagenzglases oder einer Reaktionsküvette. Der Komplex kann direkt über einen (Strept)avidin/Biotin-Komplex oder mit irgendeinem anderen Hilfsmittel immobilisiert werden, das dem Fachmann für die Immobilisierung von Nucleinsäuren zur Verfügung steht. Dann wird die Probe dem Komplexträger zugesetzt, was zur Verdrängung der Signalsonde in die Probenflüssigkeit, in den Überstand etc. führt. Die Flüssigkeit, die die Signalsonde enthält, kann dann an irgendeine Stelle innerhalb des automatisierten Systems verbracht werden, wo sie gemessen wird. Weitere Aspekte der Erfindung werden einem versierten Fachmann ebenfalls klar sein und müssen hier nicht wiederholt werden.

SEQUENZ-PROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Chmelo, Rich; Foltz, Lisa
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Isolierte Nucleotid- Sequenzen zur Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae
(iii) ANZAHL SEQUENZEN: 12
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) EMPFÄNGER: Felfe & Lynch
(B) STRASSE: 805 Third Avenue
(C) STADT: New York City
(D) STAAT: New York
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 10022
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Diskette, 5,25", 360 kB Speicherkapazität
(B) COMPUTER: IBM PS/2
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS
(D) SOFTWARE: WordPerfect
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: 07/945 156
(B) ANMELDETAG: 15-SEP-1992
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN ZU ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Hanson, Norman D.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 30.946
(C) ZEICHENREGISTER NR. BMC 271-PCT
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEPHON: (212) 688-9200
(B) TELEFAX: (212) 838-3884

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:

AGCCGCGAGG CGGAGCCA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:

AGCCGCGGCG GAGCCA 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 3:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:

TACGTAGCAG CGCCGA 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:

ACACGTGGAA TTCCACCTCC CTCTGAC 27

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 5:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:

CCCACGCTTT CGGACATGAA CGTCAGT 27

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:

AGAGTGCCCA ACCGAATGAT GGCAAC 26

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:

GAGGCGGAGC CAATCTCACA AAACC 25

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:

GAAGTCTGCC GTTACTG 17

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:

CAGTAACGGC AGACTTCTCC TCAG 24

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 10:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:

CAGTAACGGC AGACTTCTCC AGAG 24

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 80 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:

CTGACACAAC TGTGTTCACT AGCAACTTCA AACAGACACC ATGGTGCACC 50
TGACTCCTGA GGAGAAGTCT GCCGTTACTG 80

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR. 12:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:

CTGACACAAC TGTGTTCACT AGCAACTTCA AACAGACACC ATGGTGCACC 50
TGACTCCTGT GGAGAAGTCT GCCGTTACTG 80

Claims

1. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül, das zur spezifischen Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae in einer Probe brauchbar ist, wobei das Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nucleinsäure-Molekülen mit einer Nucleotid-Sequenz, die angegeben ist unter SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5, SEQ ID NR. 6, einer zu SEQ ID NR. 4 komplementären Nucleotid-Sequenz, einer zu SEQ ID NR. 5 komplementären Nucleotid-Sequenz und einer zu SEQ ID NR. 6 komplementären Nucleotid-Sequenz.

2. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1 mit einer daran angelagerten nachweisbaren Markierung.

3. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 2, wobei die Markierung radioaktiv ist.

4. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 2 wobei die Markierung ein Enzym ist.

5. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Neisseria gonorrhoeae in einer Probe, umfassend das Zusammenbringen der Probe mit einem isolierten Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1 und Bestimmen der Hybridisierung derselben als Hinweis für die Gegenwart von Neisseria gonorrhoeae in der Probe.

6. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül aus der Nucleotid-Sequenz SEQ ID NR. 4 besteht.

7. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül aus der Nucleotid-Sequenz SEQ ID NR. 5 besteht.

8. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül aus der Nucleotid-Sequenz SEQ ID NR. 6 besteht.

9. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül aus einer zu SEQ ID NR. 4 komplementären Nucleotid-Sequenz besteht.

10. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül aus einer zu SEQ ID NR. 5 komplementären Nucleotid-Sequenz besteht.

11. Isoliertes Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül aus einer zu SEQ ID NR. 6 komplementären Nucleotid-Sequenz besteht.