DE69321720T2

DE69321720T2 - Für den interleukin-9-rezeptor kodierende nukleinsäuresequenzen bzw. dafür komplementäre nuleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE69321720T2
Application number: DE69321720T
Authority: DE
Inventors: Catherine B-1932 Sint-Stevens-Woluwe Druez; Jean-Christophe B-1200 Brussels Renauld; Jacques B-1970 Wezembeek Oppem Van Snick
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1992-03-09
Filing date: 1993-02-25
Publication date: 1999-05-06
Anticipated expiration: 2013-02-26
Also published as: US5962269A; JP3598386B2; DK0643719T3; DE69321720D1; CA2131719A1; ATE172470T1; AU3779093A; ES2123641T3; WO1993018047A1; US5789237A; EP0643719B1; AU669889B2; JPH07504816A; CA2131719C; EP0643719A1; EP0643719A4

Description

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht auf die Aufnahme des als Interleukin 9 bekannten Zytokins durch Zellen über dessen Rezeptor. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Isolierung von Nukleinsäuresequenzen, die für Interleukin-9-Rezeptormoleküle (nachstehend "IL-9R" genannt) kodieren. Diese Sequenzen können z. B. als eine Quelle für IL-9-Rezeptoren eingesetzt werden und als Sonden für Zellen, die auf das Zytokin reagieren. Die Komplimentärsequenzen können dazu eingesetzt werden, den Ausdruck zu hemmen und die Kodiersequenz zu prüfen.

HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK

Während des letzten Jahrzehntes hat sich unser Wissen in Bezug auf das Immunsystem und dessen Steuerung erheblich erweitert. Ein Gebiet von besonderem Interesse ist die Untersuchung von Proteinen und Glykoproteinen, die das Immunsystem steuern. Das vielleicht am besten bekannte, dieser Moleküle, die generisch als "Wachstumsfaktoren", "Zytokine", "Leukotriene", Lymphokine", usw. bezeichnet werden, ist Interleukin-2 ("IL-2"). Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,778,879 von Mertelsmann et al.; US-Patent Nr. 4,490,289 von Stern; US-Patent Nr. 4,518,584 von Mark et al.; und US-Patent Nr. 4,851,512 von Miyaji et al. Weiterhin wurden Patente bezüglich Interleukin 1-("IL-1") ausgestellt, wie US-Patent Nr. 4,808,611 von Cosman.
Es wird mittlerweile weitgehend akzeptiert, daß zur Ausübung ihrer Wirkung auf Zellen, Moleküle wie IL-2 und IL-1 mit Molekülen reagieren müssen, die auf Zellmembranen angeordnet sind, die als Rezeptoren bezeichnet werden. Patente, die Interleukin-Rezeptoren beschreiben sind u. a. Honjo et al. US-Patent Nr. 4,816,565; und Urdal et al., US-Patent Nr. 4,578,335. In neuester Zeit stellte Fanslow, et al., Science : 739-41 (11. Mai, 1990) Daten vor, die bewiesen, daß die Wirkung von IL-1 in vivo durch die Verabreichung einer löslichen Form dessen Rezeptors gesteuert werden konnte. Der letzte Absatz des von veröffentlichten Dokumentes, dessen Offenbarung als Verweis aufgeführt wird, beschreibt die Arten von therapeutischer Wirksamkeit, die von einer Verabreichung von löslichem IL-1-Rezeptor ("IL-1R") zu erwarten ist.
Das Lymphokin IL-9, früher "P40" benannt, ist ein Molekül, das von einer T-Zelle stammt, das ursprünglich als ein Faktor identifiziert wurde, der permanenten antigenunabhängigen Wachstum von T4-Zellreihen unterstützte. Siehe z. B. Uyttenhove, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. : 6934 (1988) und Van Snick et al., J. Exp. Med. : 363 (1989) und Simpson et al., Eur. J. Biochem. : 715 (1989).
Die Wirksamkeit von IL-9 wurde zuerst bei eingeschränkten T4-Zellreihen festgestellt, die keine Aktivität auf CTL oder neu isolierte T-Zellen zeigten. Siehe z. B. ., und Schmitt et al., Eur. J. Immunol. : 2167 (1989). Dieser Tätigkeitsbereich wurde erweitert als sich bei Experimenten herausstellte, daß IL- 9 und das als T-Zellen-Wachstumsfaktor III ("TCGF III") bezeichnete Molekül identisch sind. IL-9 verbessert den Proliferationseffekt von Knochenmarkmastzellen zu "IL-3", wie von Hültner et al., Eur. J. Immunol. 20: 1413-1416 (1990) und in US-Patent Nr. 5,164,317 beschrieben. Es wurde weiterhin festgestellt, daß die menschliche Form von IL-9 die Proliferation von megakaryoblastischer Leukämie stimuliert. Siehe Yang et al., Blood : 1880 (1989). Neueste Untersuchungen von IL9 haben bewiesen, daß hierdurch auch erythroide Kolonieformationen unterstützt werden (Donahue et al., Blood 75 (12): 2271-2275 (6-15-90)); die Proliferation von Myeloiderythroid-Berstformation gefördert wird (Williams et al., Blood 76: 306-311 (9-1-90)); und die Klonreifung von BFU. E von Erwachsenen- und Foetusabstammung unterstützt wird (Holbrook et al., Blood 77 (10): 2129-2134 (5/15/91)). Ausdruck von IL9 wurde auch in Hodgkinsche Krankheit und großzelligem anaplastischem Lymphom impliziert (Merz et al., Blood 728 (8): 1311-1317 (9-1-90)).
Dieses Fachgebiet beschreibt das Klonen von Rezeptoren für verschiedene Mitglieder der Interleukinfamilie. Moseley et al. Cell 59: 335-348 (1989), beschreibt die Isolierung von cDNS die für IL-4-Rezeptoren kodieren und die Analyse von beiden genomischen DNS und RNS für diese Moleküle. Hierzu arbeiteten Moseley et al. mit Zellen, die bis zu 1 Mio. Rezeptormoleküle per Zelle und eine N-terminale Aminosäurensequenz für IL-4-Rezeptoren aufweisen. Holmes et al., Science 253: 1278- 1280 (1991), und Murphy et al., Science 253: 1280-1282 (1991) beschreiben cDNS für den IL-8-Rezeptor. Murphy et al. führten Hybridisierungsuntersuchungen mit einer Oligonukleotidprüfung beruhend auf Kaninchen-IL-8R-Aminosäurensequenzen zur Isolierung des menschlichen Gegenstücks aus. Holmes et al. setzten menschliche neutrophilische cDNS-Bibliotheken ein, gefolgt von der Transfizierung in COS-Zellen.
Gillis, "T-cell Derived Lymphkines" in Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition (New York, 1989), bietet auf Seite 632 und den folgenden Seiten einen Überblick über Interleukin-Rezeptoren. Dieser Verweis beschreibt cDNS für den IL1- Rezeptor, den IL2-Rezeptor und den IL-6-Rezeptor.
Diese Untersuchungen zeigen, daß verschiedene Faktoren für den Versuch der Identifizierung und Isolierung einer Nukleinsäuresequenzen, die für einen Interleukinrezeptor kodiert, ausschlaggebend sind. Im Idealfall hat man die Aminosäuresequenz für den Rezeptor und einen Zellentyp mit einem hohen Ausdrucksgrad des Rezeptormoleküls.
Im Falle des Interleukin-9-Rezeptors ist, obgleich Druez et al., J. Immunol. 145: 2494-2499 (1990) den Rezeptor als ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 64 Kilodalton identifiziert und charakterisiert haben, wovon der Proteinteil ein Molekulargewicht von 54 Kilodalton - wie von SDS-PAGE ermittelt - aufweist, eine Aminosäurensequenz des Moleküls noch nicht erhältlich. Weiterhin sind nur äußerst wenige Zellarten bekannt, die IL9-R ( ) ausdrücken, wobei diese wiederum nur einen äußerst geringen Ausdruck aufweisen. Es ist daher überraschend, daß es nun möglich ist Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren und zu isolieren, die für den Interleukin-9-Rezeptor kodieren. Dies ist das wesentliche Merkmal der hierin beschriebenen Erfindung, wie aus der folgenden Offenbarung hervorgeht.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 stellt eine Scatchard-Analyse des Ausdruckes von Mäusen-IL9-Rezeptor nach der Tansfektion von COS-Zellen dar. Fig. 2 richtet abgeleitete menschliche und Mäuse-IL- 9R-Aminosäurensequenzen.
Fig. 3 vergleicht die Reaktion von TS1-Zellen vor und nach der Transfizierung mit für mit menschlichem IL-9R kodiertem DNS.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGEN

Beispiel 1

Der Mäuse-T-Zellenklon, TS1, der z. B. von Uyttenhove et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6934-6938 (1988) beschrieben wird, drückt ca. 200 Hochaffinitäts- Bindungsstellen für IL-9 aus, d. h. es drückt das IL-9 Rezeptormodul aus. Siehe Druez et al., J. Immunol. 145: 2494-2499 (1990). Diese Zellenreihe weist, obgleich sie wenige Rezeptormoleküle bietet, nicht die höchste Dichte an IL9R von allen geprüften Zellen auf und wurde somit als eine Quelle von mRNS zum Aufbau einer cDNS-Bibliothek gewählt.
Poly (A) + mRNS wurde von TS1-Zellen extrahiert und anschließend zu Doppelstrang-cDNS mit beliebigen Hexanukleotidprimern konvertiert, gemäß Grubler et al, Gene 25: 263-269 (1983).
Als nächster Schritt wurden EcoRI-Adaptoren angebracht und jegliches über 1,5 Kilobasen große cDNS wurde durch Fraktionierung auf einem 5-20%igen Kaliumazetatgradient isoliert, gemäß Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8573-8577 (1987).
Das nach Größe ausgewählte cDNS wurde anschließend in die ECORI-Stelle des Ausdruckvektors pCDSRa eingesetzt, wie von Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8: 466-472 (1988) beschrieben. Dies wurde anschließend in E. Coli-Stamm XL1-blau mit Standardtransformationsverfahren transfiziert (Maniatis). Zur Suche nach Klonen, die IL- 9R ausdrücken wurde plasmides DNS aus der cDNS-Bibliothek auf dessen Fähigkeit hin geprüft, IL-9-Bindetätigkeiten durch Ausdruck in COS-Zellen auszudrücken. Hierzu wurde die cDNS-Bibliothek in 100 Pools mit je ca. 500 Klonen unterteilt und das DNS mit dem DEAE-Dextran-Chloroquine-Verfahren von Aruffo et al., , in 1,5 · 10&sup5; COS-Zellen transfiziert und auf Glasobjektträgern ausgesät. Die Zellen wurden nach 2-3-tägigem Wachstum auf den Ausdruck von IL-9R mit x25I markiert, gereinigten rekombinanten Mäuse-IL9 geprüft. Dieses markierte Material wurde gemäß Bolton et al., Biochem. J. 133: 529-539 (1973) präpariert. Die Zellen wurden drei Stunden lang bei 20º C mit 0,2 nM dieses Materials inkubiert, kurz gewaschen, fixiert und anschließend in fotografische Emulsionsflüssigkeit eingetaucht. Die Objektträger wurden 10 Tage lang belichtet, anschließend entwickelt und mikroskopisch auf autoradiographische Körnung hin untersucht.
Bei der Suche stellten sich zwei der 100 Pools als positiv heraus. Ein positiver Pool enthält eine einzige positive Zelle während der zweite Pool 33 positive Zellen enthielt. Der letztere Pool wurde für weitere Versuche ausgewählt und wurde in 100 Pools zu je 15 Klonen unterteilt, wonach ein einzelner positiver Pool ausgewählt und in 100 einzelne Klone unterteilt wurde.

Beispiel 2

Nach der am Ende von Beispiel 1 beschriebenen Unterteilung und Neuplattierung, wurde das darin beschriebene, Suchverfahren auf den neuplattierten Zellen eingesetzt und führte zur Identifizierung eines Klons, der ein als p9RA1 bezeichnetes Plasmid enthielt. Da das "Quellenplasmid" pCDSRα bekannt und charakterisiert war, war es mit Standardverfahren möglich, den Einsatz als 1900 Basispaare in Länge zu identifizieren.

Beispiel 3

Mit dem Einsatz der p9RA1-1900-Basispaarteils als Sonde wurden weitere Untersuchungen ausgeführt, um weitere Mäuse-IL9R-Rezeptor-cDNS-Klone zu identifizieren. Das Verfahren gemäß Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) wurde eingesetzt, wobei die p9RA1-Sonde in zwei weitere cDNS-Bibliotheken hybridisiert wurde, die in der BstXI- Stelle des pCDMS-Vektors (Aruffo et al. ), mit Oligio-T oder beliebigen Primern erzeugt wurden und anschließendem Auswaschen.
Diese Methode führte zur Identifizierung von sechs zusätzlichen Klonen. Zwei von diesen waren mit Oligo-dT grundierte cDNS und wurden mit p9RB1 und p9RB3 bezeichnet, sowie vier zufällige primierte Klone p9RC2, p9RC3, p9RC4 und p9RC9. Die Klone haben die folgend Größen:
p9RB 1 1600 bp
p9RB3 900 bp
p9RB2 2000 bp
p9RB3 1000 bp
p9RB4 3000 bp
p9RB9 2100 bp

Beispiel 4

Um sicherzustellen, daß Klone p9RA1 und alle nachfolgenden Klone in der Tat IL9R ausdrückten, wurde eine Scatchard-Analyse an den transfizierten COS-Zellen ausgeführt, gemäß Goodwin et al., Cell 60: 941-951 (1990). Diese in Fig. 1 abgebildete Analyse, identifizierte eine einzelne Klasse von Bindungsstellen mit einem Kd von 194 pM bei Einsatz von p9RA1. Dies ist geringfügig höher als die zuvor auf TS1-Zellen gemessene Dissoziationskonstante, d. h. 67 pM.
Bei Prüfung des größten cDNS (d. h., der C4-Klone), wurden weiterhin Hochaffinitäts-Bindungsstellen für IL9 mit einem Kd von 126 pM identifiziert.

Beispiel 5

Im Anschluß an die Isolierung von Mäuseklonen wurden weiterhin Versuche zur Isolierung von analogem menschlichen Material ausgeführt. Hierzu wurde eine Megakaryoblast-Zellreihe, d. h. Mo7E als eine Quelle von mRNS zur Bildung eines doppelstrangigen cDNS, wie in Beispiel 1, eingesetzt. Das Plasmid pRC/RSV wurde dazu eingesetzt, das cDNS aufzunehmen. Diese cDNS-Bibliothek wurde mit p9RA1 als Sonde untersucht und die Hybridisierung wurde zu den gleichen Bedingungen, wie beschrieben ausgeführt, mit Ausnahme der Auswaschungen, die mit einer niedrigeren Schärfe ausgeführt wurden (2 · SSC, 0,1% SDS, 55ºC). Sechs Klone wurden isoliert, d. h. ph9RA2, 3, 4, 5, 6 und 9 und wurden geordnet. Der Klon ph9RA3 enthielt ein offener 1566-Basispaar-Ablesrahmen, der eine 66%ige Übereinstimmung mit dem Mäuse-p9RC4 zeigte. Die abgeleiteten Mäuse- und menschlichen Proteinsequenzen werden in Fig. 2 dargestellt mit einer 53%igen Identität bei 522 Aminosäuren.

Beispiel 6

Um zu prüfen, daß der Klon ph9RA3 tatsächlich für einen menschlichen IL9- Rezeptor kodierte, wurde der Klon in eine Mäusezellreihe TS1 mit doppelpulsiger Elekroporation transfiziert. Kurz beschrieben, wurden 5 · 10&sup6; TS1-Zellen bei 37ºC in 0,8 ml von Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium neu suspendiert, das mit 10%igem fötalem Rinderserum, 50 mM 2-Merkaptoäthanol, 0,55 mM L-Arginin, 0,24 nM L- Asparagin und 1,25 nM L-Glutamin ergänzt wurde. Plasmide DNS (50 ug) wurde den Zellen in 0,4 cm Küvetten direkt vor der Elektroporation hinzugefügt. Nach einem doppelten elektrischen Impuls (750 V, 7452Ω, 40 uF und 100 V, 74Ω, 2100 uF) wurden die Zellen direkt in mit Mäuse-IL9 ergänzten frischem Medium verdünnt. 24 Stunden später wurden die Zellen gewaschen und in Anwesenheit von G418 und Mäuse-IL9 gezüchtet. Unter diesen Bedingungen entstand eine Transfizierhäufigkeit von ca. 1/10.000. Nach der Auswahl mit 6418, wurden transfizierte Zellen in menschlichem IL9 bewahrt und ein TS1-Proliferationstest wurde gemäß dem Verfahren von Uyttenhove et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 85: 6934-6938 (1988) ausgeführt. Falls das cDNS hIL9R ausdrückt, sollten Zellen proliferieren, während diejenigen ohne hIL9R nicht proliferieren.
Fig. 3 zeigt, daß Original-TS1-Zellen, die nicht auf 100 Einheiten/ml menschlichem IL9 reagieren nach der Transfizierung mit dem menschlichen IL9R cDNS reagierten und proliferierten.

Beispiel 7

Die Sequenz der Klone p9RC4, die als SEQ ID NR: 1 dargestellt ist, zeigt einen offenen Ableserahmen der ein 468-Aminosäurenprotein kodiert. Die abgeleitete Aminosäurensequenz deutet zwei hydrophobische Bereiche an, von denen einer Aminosäuren 15-40 umfaßt und sehr wahrscheinlich ein Signalpeptid darstellt. Die Wahrscheinlichkeits-Gewichtsmatrizze von von Heyne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986) sagt eine Spaltstelle für das Signalpeptid zwischen Positionen 37 und 39 voraus. Der zweite hydrophobische Bereich umfaßt Aminosäuren 271-291. Es wird angenommen, daß dies einen transmembranen Bereich darstellt.
Der putative extrazelluläre Bereich enthält 233 Aminosäuren, einschließlich 6 Zysteinrückstände und zwei potentielle N-verbundene Glykolysationsstellen bei Positionen 116 und 155. Ein "WSEWS-Motiv", d. h., "Trp-Ser-Glu-Trp-Ser", normalerweise von der Hämatopoietin-Rezeptor-Superfamilie, wie von Idzerda et al., J. Exp. Med. 171: 861-873 (1990) beschrieben, befindet sich in Positionen 244-248.
Der zytoplasmische Teil des Moleküls wird durch einen hohen Prozentsatz an Serin (13%) und Prolin (12,4%) sowie drei potentiellen Protein-Kinase-C- Phosphorylationsstellen bei Positionen 294,416 und 465 gekennzeichnet.
Ein Vergleich der verschiedenen Klone zeigt, daß p9RA1 und p9RB3 ein zusätzliches Glutamin zwischen Position 192 und 193 im Vergleich zu p9RC4 aufweisen, jedoch ohne eine Rahmenveränderung. Der Rückstand liegt im extrazellulären Bereich, scheint, wie das Beispiel 4 zeigt, jedoch nicht die Affinität für Ligand zu beeinflussen. Bei p9RC2 weist diese Position eine 22 Nukleotidedeletion in dieser Position in p) RC2 auf. Diese Merkmale und eine potentielle intronische Sequenz in p9RC9 deuten auf alternative Spleißvorfälle hin.
Die Analyse von p9RB3 deutet das Bestehen einer löslichen Form von IL9R an. Das cDNS für diesen Klon enthält einen großen Teil an extrazellulärem Bereich, hat jedoch keine Nukleotiden 651-1719, die das Ende des N-terminal Bereichs, den transmembranen und den zytoplasmischen Bereich kodieren.
Klon p9RA1 unterscheidet sich von allen anderen Klonen durch ein Stopp-Kodon hinter Alanin (379), gefolgt von einer 736-Basispaarsequenz, die mit keiner anderen cDNS-Sequenz verwandt ist.
Die Sequenz für das in diesem Beispiel beschriebene Mäuse-cDNS lautet wie folgt:
p9RC4 (SEQ ID Nr.: 1)
p9RA1 (SEQ ID Nr.: 3)
p9RB3 (SEQ ID Nr.: 5)

Beispiel 8

Das cDNS für menschliches IL9-R wurde auch analysiert. Wie angedeutet, zeigte Klon ph9RA3 eine 66%ige Identität mit Mäuse-p9RC4 und eine 53%- ige Homologie auf dem Niveau der Aminosäurensequenz. Eine putative Spaltenstelle befindet sich zwischen Aminosäuren 39 und 40. Diese Stelle bleibt zwischen den Spezies wie der transmembrane Bereich, die zwei potentiellen N-Glykosylationsstellen und die Konsensussequenz für die hämatopoietische Superfamile erhalten, die alle unter Beispiel 7 beschrieben werden.
Der zytoplasmische Teil des Proteins schien weniger erhalten zu sein und war bedeutend größer (231 Aminosäuren) als das Mäusegegenstück (177 Reste). Wegen eines Abschnittes von 9 aufeinanderfolgenden Serinen in Positionen 431-439 enthält das Molekül einen hohen Prozentsatz an Serin (11,2%).
Die Klone ph9RA2, 4, 6 und 9 bestätigten die von ph9RA3 abgeleitete Sequenz. Der Klon ph9RA5 weist jedoch eine 85 Nukleotiddeletion in Positionen 1063-1147 auf und deutet somit ein abgeschnittenes Protein an. Das putative abgeschnittene Protein wäre 307 Aminosäuren lang und würde die vollständigen extrazelluären und transmembranen Bereiche von IL9-R,5 Aminosäuren des zytoplasmischen Bereichs und 11 nichtverwandte Reste enthalten.
Der als pH9RA6 bezeichnete Klon enthält eine kurze Zwischensequenz am Anfang des DNS, die in ein Stopp-Kodon im Rahmen mit dem normalen Initiativenkolon führt. Es bildet weiterhin einen neuen ATG-Dreiher im Rahmen mit dem nachgeordneten Teil der Kodiersequenz. Im IL9R-Molekül ergibt dies eine Transkription mit einer einzigartigen N-terminal-Sequenz, wobei der Rest der Sequenz mit pH9RA3 identisch ist. Der Vergleich von pH9RA6 undpH9RA3 zeigt, daß nach dem ursprünglichen für beide Klone gleiche Methionin, pH9RA6 einen Einsatz von 22 Aminosäuren enthält. Auf diese folgt die Sequenz "GWTLESE...", d. h. die Sequenz die bei Position 10 von pH9RA3 beginnt.
Die Nukleinsäurensequenzen für pH9RA3, pH9RA5 und pH9RA6 werden jeweils als SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 9 und SEQ ID Nr.: 11 vorgestellt.
Aus dem Vorausgehenden geht die Isolierung einer Nukleinsäurensequenz, die für den Interleukin-9-Rezeptor kodiert, hervor. Die Mäuse- und menschliche Nukleinsäurensequenzen sowie die Homologie dazwischen (53%, mit bis zu 67% im extrazellulären Bereich) deuten an, daß Nukleinsäurensequenzen, die IL9-R von anderen Spezies kodieren auch identifiziert werden könnten.
Obgleich sich die vorstehenden Daten auf cDNS beziehen, ist ersichtlich, daß durch die Sequenzen des cDNS mRNS zugänglich wird, da dieses von der ersten gemäß bekannter Regeln bezüglich des Aufbaus der Sequenzen abgeleitet werden kann. Anhand der cDNS-Information ist anzunehmen, daß auch die genomischen Analoge der cDNS sichergestellt werden könnten.
Die hierin enthaltenen Informationen lehrten auch über den Aufbau von Vektoren, wie Plasmide, welche die jeweilige Nuldeinsäurensequenzen enthalten, d. h. die zur Kodierung von Säugetier-IL9R. Solche Vektoren können zusätzlich zur Kodiersequenz Bestandteile enthalten, wie Promotoren, die betriebsgemäß mit der Kodierreihe verbunden sind, "Markierer" wie antibiotische Widerstands- oder Auswahlgene, einschließlich des Thymidinkinase- oder "TK"-Genes, so wie andere, die Fachkräften bekannt sind. Die Nukleinsäurensequenzen und -Vektoren können - wie beschrieben - dazu eingesetzt werden, um verschiedene Zelltypen wie "COS", "CHO", oder andere Insektenzellreihen zu transfizieren. Die Sequenzen können entweder allein oder in jeweiligen Vektoren dazu eingesetzt werden, eine ansehnliche Reihe von prokariotischen und eukariotischen Zellen zu transfizieren.
Die Isolierung der Nukleinsäurensequenzen, die Wir den IL9-Rezeptor kodieren, ermöglicht es Forschem, Untersuchungen in verschiedene Richtungen anzustellen, was zuvor nicht möglich oder erheblich schwieriger war. So ist zum Beispiel, wie erwähnt, selbst bei den Zellen mit dem besten Ausdruck, der Ausdruck von IL-9R gering. Die Isolierung des Gens ermöglicht die Transfizierung von Empfängerzellen, gefolgt von Überausdruck, Verstärkung, usw. Hierdurch entsteht ein ausreichender Ausdruck auf Zellenoberflächen, um eine Immunisierung mit diesen Zellen zu ermöglichen sowie die Erzeugung einer immunogenen Antwort auf IL-9R, einschließlich der Produktion von Antikörpern. Die Isolierung von Antikörper erzeugenden Zellen gefolgt von Standardverfahren der Hybridombiologie führt zur Produktion von IL-9R-spezifischen monoklonalen Antikörpern.
Die erzeugten polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können anschließend in therapeutischen Verfahren zur Blockierung der Bindung von IL-9 an IL-9R-Moleküle eingesetzt werden. Da die Bindung von IL-9 an Zellenoberflächen in verschiedenen pathologischen Zuständen impliziert wird, ist dies ein wichtiges therapeutisches Ziel.
Weiterhin können IL-9R-spezifische Antikörper zur qualitativen und quantitativen Messung des IL-9R-Ausdrucks gemäß bekannten Immunoassay-Protokollen eingesetzt werden.
Die Beispiele zeugen von der Existenz einer flüssigen Form von IL- 9R. Wie bei anderen löslichen Interleukin-Rezeptormolekülen (siehe Fanslow et al., , kann dieses Molekül dazu eingesetzt werden, die Bindung von IL-9 an den zellgebundenen Rezeptor zu verhindern und somit die Wirkung von IL-9 auf einen Zelltypen, eine Unterpopulation, usw. zu stören. Somit kann lösliches IL-9R als ein Antagonist für IL-9 beschrieben werden.
Kürzliche Untersuchungen haben gezeigt, daß die lösliche Form eines Interleukinrezeptors, z. B. IL-6R, als ein Agonist fungiert. Siehe Taga et al., Zelle 58: 573-591 (8-11-89). Die lösliche Form von IL-9R kann in ähnlicher Weise funktionieren. Weiterhin kann das IL-9R-Molekül in löslicher Form oder in einer löslich gemachten Form als ein Immunogen zur Erzeugung von IL-9R-spezifischen Antikörpern eingesetzt werden. In entsprechenden Tieren wie Mäuse, Kaninchen oder Meerschweinchen kann entweder das gesamte Rezeptormolekül oder ein immunogener Teil davon eingesetzt werden, um eine Immunantwort zu erzeugen, die eine Antikörperformation enthält. Die Antikörper können anschließend mit Standardverfahren gereinigt werden. Als Alternative können B-Zellen, die Antikörper erzeugen, in jedem der Standardverfahren zur Erzeugung von Hybridomen isoliert und eingesetzt werden, um somit zur Erzeugung von IL-9R-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu führen.
Eine Analyse wird in Beispiel 6 beschrieben, in dem der Ausdruck von IL-9R-cDNS durch Messung der Reaktion einer transfizierten Zellreihe auf IL9 geprüft wird. Diese Analysemethode bietet ein Verfahren zur Suche nach verschiedenen Agonisten und Antagonisten. In kurz, eine Probe einer transfizierten Zelle mit einer Sequenz, die für IL9R kodiert ist, wird mit einer jeweiligen Verbindung in Kontakt gebracht. Falls die Verbindung ein Agonist ist, wird sie sich mit dem IL-9R-Molekül auf der Zelloberfläche verbinden und zu einer Reihe von Vorfällen führen, die normalerweise mit IL-9-/IL-9R-Bindung assoziiert wird. Zum gleichen Zweck kann ein Antagonist geprüft werden, indem die jeweilige Verbindung mit IL-9 und der Zellprobe in Verbindung gebracht wird, um festzustellen ob IL-9 eine verminderte oder keine Auswirkung hat. Die Agonist-/Antagonistprüfung kann als Teil einer umfangreicheren Erfindung gesehen werden, in der nach Molekülen geprüft wird, die um die Bindung an IL-9R konkurrieren.
Zusätzlich zu der hierin beschriebenen Kodiersequenz umfaßt die Erfindung auch zu den Kodiersequenzen komplementäre Sequenzen. Diese komplementären Sequenzen, die von den Kodiersequenzen selbst abgeleitet werden können, können z. B. als Sonden oder als "Antiwahrnehm"-Inhibitoren eingesetzt werden, um den Ausdruck der IL9R- Kodiersequenz zu verhindern. Weitere Aspekte der Erfindung werden für Fachkräfte deutlich sein und brauchen an dieser Stelle nicht weiter beschrieben zu werden. Die hierin eingesetzten Begriffe und Ausdrücke werden im beschreibenden und nicht im begrenzenden Sinn eingesetzt und die Anwendung dieser Begriffe dient nicht dazu, irgendwelche Äquivalente der erklärten Merkmale und beschriebenen Teile davon auszuschließen, wobei anerkannt wird, daß verschiedene Modifizierungen innerhalb des Umfangs der Erfindung möglich sind.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT:
(A) NAME: LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH
(H) STREET: 1345 AVENUE OF THE AMERICAS
(C) CITY: NEW YORK
(D) STATE: NEW YORK
(E) COUNTRY: UNITED STATES OF AMERICA
(F) POSTAL CODE (ZIP): NEY YORK 10105
(G) TELEPHONE: 212-765-3000
(ii) TITLE OF INVENTION: NUCLEIC ACID SEQUENCES CODING FOR OR COMPLEMENTARY TO NUCLEIC ACID SEQUENCES CODING FOR INTERLEUKIN 9 RECEPTOR
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 12
(iv) COMPUTER READABLE FOAM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS -
(D) SOFTWARE: Patentin Relense #1.0, Version #1.25 (EPO)

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1947 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 180..1745 (xi) SEQUENCE DESCRTPTION: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 522 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1683 base pairs
(H) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..921 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:

(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGHT: 307 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MQLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1997 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(5) LOCATION: 188..1795 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTYPE: 536 amino acids
(B) TYPE: amino and
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECVLE TYPE: grotein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:

Claims

1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für einen Interleukin-9-Rezeptor kodiert oder komplementär zu einer Sequenz ist, die für einen Interleukin-9-Rezeptor kodiert, wobei das genannte Molekül mindestens eine der SEQ ID Nr.: 1-6 oder deren Komplementären hybridisiert und unter den folgenden Bedingungen: "2 · SSC, 0,1% SDS, 55ºC".

2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Sequenz cDNS ist.

3. Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Sequenz für menschliches Interleukin-9-Rezeptor kodiert.

4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Sequenz für Mäuse-Interleukin-9-Rezeptor kodiert.

5. Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, das aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 3, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 5 und SEQ ID NR.: 6 gewählt wird.

6. Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Sequenz genomisches DNS ist.

7. Vektor einschließlich des isolierten Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1, der betriebsgemäß mit einem Promotor verbunden ist.

8. Vektor gemäß Anspruch 7, der weiterhin eine Markierungssequenz enthält.

9. Vektor gemäß Anspruch 8, wobei die genannte Markierungssequenz eine Widerstandsmarkierung ist.

10. Vektor gemäß Anspruch 7, wobei der Vektor ein Plasmid ist.

11. Mikroorganismus, der mit dem Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 transfiziert ist.

12. Mikroorganismus von Anspruch 11, wobei der genannte Mikroorganismus ist.

13. Zellreihe die mit dem Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 transfiziert ist.

14. Zellreihe gemäß Anspruch 13, wobei die genannte Zellreihe eine eukariotische Zellreihe ist.

15. Zellreihe gemäß Anspruch 14, wobei die genannte eukariotische Zellreihe eine CHO-Zellreihe ist.

16. Zellreihe gemäß Anspruch 14, wobei die genannte eukariotische Zellreihe eine CSO-Zellreihe ist.

17. Zellreihe gemäß Anspruch 14, wobei die genannte eukariotische Zellreihe eine Hefe-Zellreihe ist.

18. Zellreihe gemäß Anspruch 14, wobei die genannte Zellreihe eine Insektenzellreihe ist.

19. Zellreihe gemäß Anspruch 18, wobei die genannte Zellreihe ist.

20. Zellreihe gemäß Anspruch 18, wobei das Nukleinsäuremolekül in einem Ausdrucksvektor enthalten ist.

21. Zellreihe gemäß Anspruch 20, wobei der genannte Ausdrucksvektor ein Baculovirusvektor ist.

22. Verfahren zur Erzeugung eines Antikörpers, der sich spezifisch an einen Interleukin-9-Rezeptor bindet, einschließlich Immunisierung eines Versuchtieres mit der Zellreihe gemäß Anspruch 14 unter Bedingungen, die die Erzeugung von Antikörpern fördern, die sich spezifisch an Interleukin-9-Rezeptoren binden und Isolierung der genannten Antikörper vom genannten Tier.

23. Gereinigter Antikörper, der mit dem Verfahren gemäß Anspruch 22 erzeugt wurde und spezifisch Interleukin-9-Rezeptoren bindet.

24. Einsatz eines Antikörpers gemäß Anspruch 23 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Auswirkung von Interleukin-9 auf ein Versuchstier einschließlich einer ausreichenden Menge des Antikörpers von Anspruch 23 zur Hemmung der Bindung von Interleukin-9 an Zellen, die den Interleukin-9-Rezeptor ausdrücken.

25. Verfahren zur Bestimmung einer Substanz, die sich an den Interleukin-9-Rezeptor bindet einschließlich des Kontaktes der Zellreihe gemäß Anspruch 14 mit einer zu prüfenden Substanz und Ermittlung der Bindung oder der fehlenden Bindung an die genannte Zellreihe.

26. Verfahren zur Bestimmung eines Interleukin-9-Rezeptoragonisten einschließlich des Kontaktes der Zellreihe gemäß Anspruch 14 mit einer zu prüfenden Substanz und Ermittlung der Auswirkung davon, wobei eine Wirkungseigenschaft von Interleukin-9 einen Interleukin-9-Rezeptoragonisten anzeigt.

27. Verfahren zur Bestimmung eines Interleukin-9-Rezeptorantagonisten einschließlich des Kontaktes der Zellreihe gemäß Anspruch 14 mit einer zu prüfenden Substanz und Ermittlung ob die genannte Substanz die Auswirkung von Interleukin-9 auf die genannte Zellreihe stört, wobei eine Störung einen Interleukin-9-Rezeptorantagonisten anzeigt.

28. Verfahren zur Erzeugung eines Antikörpers, der sich speziell an den Interleukin-9- Rezeptor bindet, der durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 kodiert ist, einschließlich der Immunisierung eines nichtmenschlichen Tieres mit einer immunogenisch wirksamen Form des genannten Interleukin-9-Rezeptors in einer Menge, die ausreicht, um einen für den genannten Interleukin-9-Rezeptor spezifischen Antikörper zu erzeugen und Reinigung des genannten Antikörpers.