DE69434741T2

DE69434741T2 - Reagenzien für die Diagnose von rheumatoiden Arthritis

Info

Publication number: DE69434741T2
Application number: DE69434741T
Authority: DE
Inventors: Toshio Osaka-shi Hirano; Tsuneyasu Nishinomiya-shi Kaisho
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-14
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2014-10-15
Also published as: EP0733643A1; US6489126B2; PT733643E; US20020161190A1; DE69434741D1; AU688801B2; CN1239518C; KR100260873B1; EP1156061A1; DE69431068T2; US5914252A; CN1135759A; ES2176260T3; TW474991B; EP0733643B1; TW442493B; WO1995010536A1; ATE326483T1; EP1862474A1; ZA948016B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines Reagens für die Diagnose von rheumatoider Arthritis.
Die vorliegende Patentanmeldung ist eine Teilanmeldung der EP-A-94929665.1.
In dem einschlägigen Stand der Technik wird ein als HM1.24 bezeichneter Antikörper offenbart, der ein HM1.24-Antigen erkennt, wobei das Antigen identisch ist mit BST2 (SEQ ID Nr.:1 der vorliegenden Patentanmeldung), wie mit den später eingereichten Dokumenten von Ohtomo, T. et al., (1999), Biochem. Biophys. Res. Comm., 258, S. 583–591, EP-A-0 997 152 und Goto. T. et al., Blood, 1994 84(6), S. 1922–1930, gezeigt wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben einen monoklonalen Mouse-Antikörper RS38 erhalten, der auf SynSV6-14 anspricht, jedoch nicht anspricht auf die gesunde Knochenmark-Stromalzelllinie NFSV1-1 und ein Membranprotein erkennt, das von dem vorgenannten Bst-1 des Prozesses der Erzeugung verschiedener nomoklonaler Mouse-Antikörper verschieden ist, die ein Membranprotein erkennen, das auf der von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommenen Synovialzelle expremiert wird, jedoch nicht auf der von gesunden Spendern abgenommenen Zelle expremiert wird. Dementsprechend haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bei der Isolierung von Klonen Erfolg gehabt, die ein neuartiges Membranprotein codieren, das auf den RS38 reagiert, mit dem Screening einer cDNA-Genbank, hergestellt von einer synovialen Zelllinie, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommen wird, und zwar unter Verwendung des RS38-Antikörpers, was zu der Vervollständigung der vorliegenden Erfindung geführt hat.
Die vorliegende Erfindung besteht in der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der ein Polypeptid erkennt, das eine Aminosäuresequenz enthält, die in der Sequenz Nr. 1 der Sequenztabelle gezeigt ist, oder ein Teil der Aminosäuresequenz, die über die Funktion der Unterstützung des pre-B-Zellwachstums für die Herstellung eines Reagens zur Diagnose der rheumatoiden Arthritis verfügt.
Nachfolgend werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben.
Der monoklonale RS38-Antikörper kann im Wesentlichen in der folgenden Weise hergestellt werden.
Das bedeutet, dass der RS38-Antikörper unter Verwendung einer Synovialzelle hergestellt werden kann, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommen ist, die über pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit als Antigen verfügt, durch dessen Immunisieren mit Hilfe einer üblichen Methode der Immunisierung, durch Zellverschmelzung der immunisierten Zelle mit Hilfe einer üblichen Methode der Zellverschmelzung und durch Klonen der verschmolzenen Zellen mit Hilfe einer üblichen Methode des Klonens.
Spezieller lässt sich eine bevorzugte Methode zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers als eine Methode exemplifizieren, die die Verwendung der Zelllinie SynSV6-14 umfasst, die von der Synovialmembran von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommen wird, und als eine Kulturzelle etabliert ist wie das vorgenannte Antigen, und das Verschmelzen der Plasmazelle (Immunocyt) einer mit dem Antigen immunisierten Normalzelle mit einer Myelomzelle eines Säugers umfasst, wie beispielsweise einer Maus; Klonen der erhaltenen verschmolzenen Zelle (Hybridom); Auswählen von Klonen, die den Antikörper erzeugen, der deren SynSV6-14 erkennt; und diese kultivieren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Antikörpers.
In der Methode zum Erzeugen des vorgenannten monoklonalen Antikörpers sind die mit dem Antigen zu immunisierenden Säuger nicht speziell beschränkt; und es wird vorzugsweise ein solcher unter Berücksichtigung der Kompatibilität mit einer für die in Frage kommende Zellverschmelzung zu verwendenden Myelomzelle ausgewählt, wobei in der Regel eine Maus, eine Ratte und ein Hamster verwendet werden.
Die Immunisierung erfolgt nach einer allgemeinen Methode wie beispielsweise durch Verabreichen von kultivierten Zellen aus der Zelllinie SynSV6-14, die von der Synovialmembran von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommen wurden, in die Bauchhöhle eines Säugers durch Injektion. Noch spezieller wird diese vorzugsweise in PBS oder physiologischer Kochsalzlösung zu einer geeigneten Menge verdünnt oder suspendiert und diese mehrmals täglich in 4 bis 21 Tagen an einem Tier verabreicht, und zwar nach Erfordernis gemeinsam mit einer üblichen Adjuvans. Zusätzlich kann ein üblicher Träger ("Schlepper") bei der vorgenannten Applizierung eingesetzt werden. Als ein Immunocyt wird vorzugsweise eine Milzzelle verwendet, die nach der letzten Applikation der vorgenannten Zelllinie erhalten wird.
Als eine Myelomzelle eines Säugetieres können als die andere Ausgangszelle, die mit dem vorgenannten Immunocyt verschmolzen werden soll, vorzugsweise verschiedene Zelllinien verwendet werden, einschließlich P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol., 123:1548 (1978)), p3-U1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81:1–7 (1978)), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6:511–519 (1976)), MPC-11 (Cell, 8:405–415 (1976)), SP2/0 (Nature, 276:269–270 (1978)), FO (J. Immunol. Meth., 35:1–21 (1980)), S194 (J. Exp. Med., 148:313–323 (1978)) und R210 Nature, 277:131–133 (1979)).
Die Zellverschmelzung des vorgenannten Immunocyten mit einer Myelomzelle kann im wesentlichen nach einer bekannten Methode ausgeführt werden, beispielsweise einer Methode von Milstein et al. [Methods Enzymol., 73:3–46 (1981)].
Spezieller läßt sich die vorgenannte Zellverschmelzung beispielsweise in einem üblichen Nährmedium in Gegenwart eines die Verschmelzung beschleunigenden Mittels ausgeführt werden. Beispiele für das die Verschmelzung beschleunigende Mittel schließen Polyethylenglykol (PEG) und Sendai Virus (HVJ) und darüber hinaus Hilfsmittel ein, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid, die nach Erfordernis in geeigneter Weise zugesetzt werden können, um die Fusionswirkung zu verstärken. Was die Verhältnisse von Immunocyten und Myelomzellen betrifft, die verwendet werden sollen, so werden Erstere in einer Menge des eins- bis zehnfachen des Letzteren eingesetzt. Beispiele für ein in der vorstehend erwähnten Verschmelzung verwendetes Medium schließen ein RPMI-1640-Medium ein und ein MEM-Medium, die für die Proliferation der vorgenannten Myelomzelllinie geeignet sind, wobei andere Medien normalerweise für die Kultur dieser Art der Zelle verwendet werden können und darüber hinaus ein ergänzendes Serum, wie beispielsweise fötales Kälberserum (FCS), die sich gemeinsam einsetzen lassen.
Die Zellverschmelzung wird ausgeführt, indem die vorgeschriebenen Mengen der vorgenannten Immunocyten und Myelomzellen in dem vorgenannten Medium gründlich gemischt werden, eine bis etwa 37°C vorerhitzte PEG-Lösung zugesetzt wird, z. B. PEG mit einer mittleren relativen Molekülmasse in der Größenordnung von 1.000 bis 6.000, die zu dem Medium bei der ursprünglichen Konzentration von etwa 30 bis 60% (Gewicht/Volumen) zugesetzt wird, sowie deren gründliches Mischen. Nacheinander kann so durch Wiederholen der Arbeitsvorgänge des schrittweisen Zusetzens geeigneter Medien und Zentrifugieren der Reaktionsmischung und Entfernung der Überstände ein Ziel-Hybridom hergestellt werden.
Dieses Hybridom wird ausgewählt, indem ein normales selektives Medium in Kultur genommen wird, beispielsweise ein HAT-Medium (ein Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält). Die Kultur in diesem HAT-Medium wird für andere Zellen als die Ziel-Hybridoma (nicht verschmolzene Zellen) zum Absterben ausreichende Zeit fortgesetzt, normalerweise über mehrere Tage bis zu mehreren Wochen. Danach wird das Screening und Monoklonieren der Hybridoma, die den Ziel-Antikörper erzeugen, nach einer üblichen eingrenzenden Verdünnungsanalyse ausgeführt.
Die so hergestellten Hybridoma, die den monoklonalen RS38-Antikörper erzeugen, können in einem üblichen Medium in Subkultur genommen werden und in flüssigem Stickstoff über längere Zeit aufbewahrt werden.
Um die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung aus den Hybridoma aufzunehmen, kann eine Methode eingesetzt werden, die das Kultivieren der Hybridoma nach einer üblichen Methode umfasst; und Erhalten von diesen aus den Überständen; oder eine Methode, die das Einbringen eines Hybridoms in ein geeignetes Säugetier umfasst, um es aus seiner Ascites proliferieren zu lassen und zu gewinnen. Die Erstere ist geeignet, um einen Antikörper mit hoher Reinheit zu erhalten, und die Letztere ist für die Massenproduktion des Antikörpers geeignet.
Darüber hinaus kann der nach der vorgenannten Methode erhaltene Antikörper zu einer hohen Reinheit gereinigt werden, indem übliche Mittel zur Reinigung eingesetzt werden, wie beispielsweise die Methode des Aussalzens, Gelfiltration und Affinitätschromatographie.
Der so hergestellte monoklonale Antikörper ermöglicht die Identifizierung der Synovialzellen von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), indem ein neues Membranprotein eines Antigens mit hoher Empfindlichkeit und hoher Präzision mit einer üblichen immunologischen Maßnahme exprimiert wird, wie beispielsweise Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (EIA) und Immunofluoreszenzanalyse.
Das entsprechende Gen wird erhalten, indem mRNA aus einer synovialen Zelle von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) hergestellt wird, die ein Membranprotein mit Human-Pre-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit exprimiert, und diese danach in eine doppelsträngige cDNA nach einer bekannten Methode umwandelt wird. Als eine Zelle, die zur Herstellung der mRNA verwendet wird, kann beispielsweise eine Zelllinie synSV6-14 genannt werden, die als eine Immunquelle für ein Hybridom RS38 verwendet wird, ohne jedoch auf diese Zelllinie beschränkt zu sein, weshalb jeder beliebige Typ von Zellen verwendet werden kann, der das Membranprotein mit Human-Pre-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit exprimiert. Im übrigen wurde in der vorliegenden Erfindung SynSV6-8 verwendet.
Für die Herstellung der Gesamt-RNA, um mRNA zu erhalten, kann eine Methode zur Gewinnung der Gesamt-RNA eingesetzt werden, die in einer Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation nach einer Guanidinthiocyanat-Behandlung besteht (Chirgwin et al., Biochemistry, 18:5294 (1979)); sowie eine Methode, die darin besteht, dass eine Tensid-Behandlung und eine Phenol-Behandlung in Gegenwart des Ribonucleaseinhibitors eines Vanadium-Komplexes ausgeführt wird (Berger & Birkenmeier, Biochemistry, 18:5143 (1979)); sowie andere bekannte Methoden.
Die Herstellung von mRNA aus der Gesamt-RNA kann erfolgen, indem Poly(A)⁺RNA aus der Gesamt-RNA beispielsweise mit Hilfe einer Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Oligo-(dT)-Bindungsträgers gewonnen wird, zum Beispiel Cephalose oder Cellulose; oder aber mit einer Chargen-Methode. Darüber hinaus kann Poly-(A)⁺RNA weiter nach einer Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt werden. Zusätzlich läßt sich eine Methode zur direkten Gewinnung von Poly-(A)⁺RNA erwähnen, ohne RNA darzustellen, oder eine konventionelle Methode unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Kits.
Um eine doppelsträngige cDNA aus der so erhaltenen mRNA zu gewinnen, wird beispielsweise eine DNA (cDNA) komplementär zu mRNA synthetisch hergestellt, indem mRNA als ein Template verwendet wird, sowie unter Verwendung eines Oligo-(dT) komplementär zu einer Poly-A-Kette, die sich am 3'-Ende als ein Primer befindet und dieses danach mit reverser Transkriptase behandelt wird.
Die doppelsträngige cDNA kann auch durch Abbau von mRNA mit Hilfe einer Alkali-Behandlung erhalten werden, indem die erhaltene einsträngige cDNA als ein Template einer Behandlung mit reverser Transkriptase oder DNA-Polymerase (z. B. Klenow-Fragment) unterworfen wird und diese danach mit SI-Nuclease behandelt wird, oder indem diese direkt mit RNase und DNA-Polymerase behandelt wird (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) und Gubler & Hoffman, Gene, 25:263 (1983)).
Gegenwärtig befinden sich leicht handhabbare Kits auf dem Markt, so dass eine doppelsträngige cDNA unter deren Einsatz erhalten werden kann.
Die cDNA-Genbank kann erhalten werden, indem die so erhaltene cDNA in einen geeigneten Vektor eingefügt wird, beispielsweise ein Plasmid-Vektor vom EK-Typ, wie z. B. pBR322 und pSC101, und ein Phagen-Vektor, wie beispielsweise λ gt10, und durch nachfolgendes Transformieren von Escherichia Coli mit diesem Vektor (z. B., X17.76, HB101, DH1, DH5) oder dergleichen (siehe beispielsweise die vorstehende Ausführung "Molekulares Klonen").
Andererseits lassen sich Wirtszellen von anderen Prokaryoten und Eukaryoten unter Verwendung eines geeigneten Expressionsvektors transformieren, in den die nach der vorstehend ausgeführten Methode erhaltene doppelsträngige cDNA eingesetzt wird.
Die Ligation der doppelsträngigen cDNA an den Vektor kann ausgeführt werden, indem ein geeigneter, chemisch synthetisierter DNA-Adaptor hinzugefügt wird und dieses mit einer Vektor-DNA, die mit Hilfe eines Restriktionsenzyms zuvor gespalten wurde, einer Behandlung mit T4-Phage-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP unterworfen wird.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält einen Replikationsursprung, einen selektiven Marker, einen in dem Aufwärtsbereich eines zu exprimierenden Gens befindlichen Promotor, eine RNA-Spleißstelle und ein polyadenyliertes Signal.
Als ein Genexpressionspromotor in einer Säugerzelle können Virus-Promotoren verwendet werden, wie beispielsweise Retro-Virus, Polyoma-Virus, Adeno-Virus und Simian-Virus (SV) 40, sowie Promotoren, die von Zellen deriviert sind, wie beispielsweise Human-Polypeptid-Kettenverlängerungsfaktor 1α (HEF-1α). Im Fall einer Verwendung eines Promotors von SV40 kann dieses beispielsweise mühelos nach einer Methode von Mulligan et al. ausgeführt werden (Nature, 277:108 (1979)).
Als ein Replikationsursprung können solche verwendet werden, die von SV40-Polyoma-Virus deriviert sind, von Adeno-Virus und Rinder-Papillomavirus (BPV), während als ein selektiver Marker ein Phosphotransferase-APH (3) II- oder I (neo)-Gen, ein Thymidin-Kinase (TK)-Gen, ein Escherichia Coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase(Ecogpt)-Gen und ein Dihydrofolat-Reduktase(DHFR)-Gen verwendet werden können.
Um das gewünschte Gen unter Verwendung einer prokaryotischen Zelle als eine Wirtszelle zu exprimieren, wird die Wirtszelle mit einem Replicon transformiert, das von einer Spezies deriviert ist, die als Wirtszelle ausgestattet werden können, nämlich als ein Plasmid-Vektor, der einen Replikationsursprung enthält und eine Regulationssequenz. Bevorzugt wird ein Vektor, der über ein Marker-Gen verfügt, das den transformierten Zellen die Selektivität eines Phänotypes vermitteln kann. Im Fall der Verwendung von Escherichia Coli für eine Wirtszelle kann diese beispielsweise unter Verwendung von pBR322 transformiert werden, ein Vektor, der von der Wirtszelle kommt (Boliver et al., Gene, 2:95 (1975)). Der pBR322 enthält ein Ampicillin-resistentes-Gen und ein Tetracyclin-resistentes-Gen, so dass dadurch Transformanten unter Einsatz einer dieser Resistenzeigenschaften identifiziert werden können.
Als ein Promotor, der für die Genexpression einer prokaryotischen Wirtszelle benötigt wird, können genannt werden ein Promotor eines β-Lactamase-Gens (Chang et al., Nature, 275:615 (1978)), ein Lactose-Promotor (Goeddle et al., Nature, 281:544 (1979)), ein Tryptophan-Promotor (Goeddle et al., Nucleic Acid Res., 8:4057 (1980)), ein tac-Promotor und dergleichen, die bevorzugt sind, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Als eine prokaryotische Wirtszelle von Wirten, die in dem Expressionssystem der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können Escherichia Coli, Bazillus subtilis, Bazillus thermophilus und dergleichen genannt werden, die bevorzugt sind, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Zusätzlich lassen sich als eukaryotische Wirtszelle eukaryotische Mikroorganismen nennen, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, und Zellen, die von Säugetieren deriviert sind, wie beispielsweise eine COS-Zelle, eine Ovarialzelle des Chinesischen Hamsters (CHO), eine C127-Zelle, eine 3T3-Zelle, eine Hela-Zelle, eine BHK-Zelle, eine Namalwa-Zelle und eine fötale Human-Nierenzelle, die bevorzugt sind, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Im Übrigen kann die Aufzucht der Transformanten der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden, indem die Aufzuchtbedingungen so ausgewählt werden, dass sie für die Wirtszellen entsprechend geeignet sind.
Die Isolation eines cDNA, die ein Membranproteins mit Pre-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit der vorliegenden Erfindung kodiert, kann beispielsweise ausgeführt werden, indem die Pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit als ein Index verwendet wird, oder sie kann nach einer Methode ausgeführt werden, wie beispielsweise der direkten Expressionsklonierung unter Verwendung eines Antikörpers.
Die Messung der Pre-B-Zellwachstum unterstützenden Fähigkeit kann unter Verwendung einer Murin-Pre-B-Zelllinie DW 34 (Eur. J. Immunol., 18:1767 (1988)) ausgeführt werden. Das bedeutet, eine das Membranprotein exprimierende Zelle mit Pre-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit wird so lange kultiviert, bis sie auf 24-Mikrotiterplatten (vorzugsweise mit einer Dichte von etwa 50%) subkonfluent wird und darauf eine geeignete Strahlungsmenge aufgegeben, DW34 von 1 bis 2 × 10³ pro Mulde dazu hinzugefügt und in dem RPMI-1640-Medium kultiviert, das 10% FCS enthält, und zwar unter der Bedingung von 5% CO₂ bei 37°C für etwa 4 bis 6 Tage. Der Verstärkungsgrad der Wachstum unterstützenden Fähigkeit kann ermittelt werden, indem die Zahl der lebensfähigen Zellen von DW34 in jeder Mulde nach dem Trypanblau-Farbstoffausschluss untersucht wird.
Das gewünschte Gen kann durch Wiederholen der Schritte geklont werden, die aus den folgenden bestehen: Auswählen eines ein Membranprotein exprimierenden Transformanten nach der Durchfluss-Cytometrie mit Hilfe eines FACScan unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers RS38, der das neue Membranprotein auf der synovialen Zelle von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) erkennt; Herstellen eines Transformanten wiederum durch Sortieren der für die Herstellung des Transformanten verwendeten Plasmid-DNA; und sodann Screening des Transformanten nach der Durchfluss-Cytometrie.
Speziell wurde ein transduzierter Transformant (293T-Zelle) auf Mikro-Titerplatten kultiviert und von den Platten mit PBS, enthaltend 0,02%iger EDTA, entfernt und, nachdem die Zelle mit einer FACS-Pufferlösung gewaschen wurde, die sich aus PBS mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,02% NaN₃ zusammensetzte, umgesetzt mit RS38 als einen primären Antikörper. Darauf folgend wird nach der Entfernung von nicht umgesetztem primären Antikörper durch Waschen mit einer FACS-Pufferlösung weiter umgesetzt mit einem sekundären Antikörper, einem FITC-markierten Antikörper (FITC-markierte Anti-Maus/Ziege-Ig-Antikörper); tote Zellen mit Propidiumiodid gefärbt und lebensfähige Zellen mit Hilfe eines FACScan analysiert, um Transformanten zu selektieren, die stark auf RS38 ansprechen.
Außerdem könnte durch Wiederholen der Schritte die vollständige Länge von cDNA (pRS38-BOS), die ein Membranprotein-Polypeptid kodiert, das über neue Pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt und in Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle gezeigt ist, erhalten werden, was aus folgendem besteht: Behandeln von Escherichia Coli (DH5), die die cDNA enthält, die für die Herstellung von Transformanten verwendet wurde, die auf den Antikörper mit Alkali anspricht, um eine Gruppe von Plasmiden zu selektieren, die das gewünschte Gen enthalten; Unterteilen der Gruppe von Plasmiden in mehrere Gruppen von Plasmiden; wieder Transduzieren von diesen zu 293T-Zellen und danach Selektieren der Transformanten nach der FACScan-Analyse unter Verwendung des vorgenannten monoklonalen Antikörpers RS38.
Im übrigen wurde der Stamm von Escherichia Coli DH5α, der pRS38-pUC19 mit der in die XbaI-Spaltstellen eines pUC19-Vektors eingesetzten cDNA enthielt, im National Institute of Bioscience & Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan hinterlegt, bei der es sich um eine internationale behördliche Hinterlegungsstelle nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vom 5. Oktober, 1993, handelt, und zwar unter dem Namen Escherichia Coli DH5α (pRS38-pUC19) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4434.
Im allgemeinen geht man davon aus, dass die Gene von Eukaryoten Polymorphismus zeigen, wie er von Human-Interferon-Genen bekannt ist (z. B., Nishi et al., J. Biochem., 97:153 (1985)), wobei in einigen Fällen mindestens eine Aminosäure nach diesem Polymorphismus substituiert ist und sich in anderen Fällen Aminosäuren überhaupt nicht ändern, obgleich es Veränderungen in der DNA-Sequenz gibt.
Außerdem ist es möglich, dass einige Polypeptide, die mindestens eine Aminosäure mehr oder weniger als die Aminosäuresequenz haben, die in Sequenz Nr. 1 der Sequenz-Tabelle gezeigt ist, oder einige Polypeptide, die mit mindestens einer Aminosäure substituiert sind, ebenfalls über die gleiche Funktion verfügen wie die des neuen Membranproteins der vorliegenden Erfindung (Pre-B-Zellenwachstum unterstützende Fähigkeit). Tatsächlich ist beispielsweise bereits bekannt geworden, dass das von einem Human-Interleukin-2(IL-2)-Gen erhaltene Polypeptid, in dem eine DNA-Sequenz entsprechend dem Cystein zu einer Sequenz entsprechend dem Serin umgewandelt ist, ebenfalls über eine IL-2-Aktivität verfügt (Wang et al., Science, 224:1431 (1984)).
Darüber hinaus können ein bekanntes Proteingen und ein Gen, das in Sequenz Nr. 2 der Sequenztabelle gezeigt ist, mit Hilfe eines geeigneten Restriktionsenzymes oder Adaptors über eine Ligation verknüpft werden, um eine Polypeptidbindung an dem bekannten Protein zu liefern. Als das bekannte Proteingen lässt sich Immunoglobulin nennen, und es kann unter Verwendung des in Sequenz 2 der Sequenztabelle gezeigten Gens an dem Fc-Abschnitt davon gebunden werden anstatt an der Stelle der variablen Region davon (Zettlmeissl et al., DNA und CELL Biology, 9:347–353 (1990)).
Darüber hinaus tritt im Fall der Expression eines Polypeptids in eukaryotischen Zellen in vielen Fällen eine Glykosylierung auf, wobei die Glykosylierung über die Umwandlung von mindestens einer Aminosäure reguliert werden kann; auch in diesem Fall kann es über die gleiche Funktion verfügen wie die des neuen Membranprotein-Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Daher können selbst die Gene, in denen die Stelle, die das Membranprotein-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, künstlich über verschiedene Methoden wie vorstehend und Polypeptide modifiziert sind, insofern in die vorliegende Erfindung einbezogen werden, wie die von den Genen erhaltenen Polypeptide über die gleiche Funktion verfügen wie die des Membranprotein-Polypeptides der vorliegenden Erfindung.
Darüber hinaus erübrigt es sich auszuführen, dass Gene, die mit in Sequenz 2 der Sequenztabelle gezeigten Genen hybridisiert sind, und Polypeptide ebenfalls in die vorliegende Erfindung insofern einbezogen sind, wie die Polypeptide, die von den Genen exprimiert werden, die über die gleiche Funktion verfügen wie die des Membranprotein-Polypeptides der vorliegenden Erfindung (Pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit). In diesem Fall kann die Hybridisierung ausgeführt werden, indem die üblichen Bedingungen der Hybridisierung zum Einsatz gelangen (siehe beispielsweise die vorstehende Ausführung "Molekulares Klonen").
Das gewünschte homogene und gereinigte, lösliche Membranprotein-Polypeptid, das über Pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, kann erhalten werden durch: Inkulturnehmen eines Transformanten, der mit einem Gen transformiert ist, das das Polypeptid kodiert; Solubilisieren des erhaltenen Polypeptids mit einem geeigneten Detergens; das resultierende Polypeptid einer Separation und Reinigung unterziehen. Bevorzugte Beispiele für das Detergens schließen ein: Nonidet P-40 (NP-40), Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, Tween 20 und dergleichen.
Lösliche Membranproteine können darüber hinaus auch mit Hilfe der Gentechnik hergestellt werden. Da nämlich, wie in 3 gezeigt, RS38 als ein Zellmembranprotein vom Durchgangstyp angesehen wird, das über eine Zellmembran-Durchgangsdomäne und eine intrazelluläre Domäne an der Seite des N-Endes verfügt, kann lösliches RS38 mit der 49. Asn der Sequenz Nr. 1 der Sequenztabelle als das N-Ende hergestellt werden, indem eine Methode der PCR-Mutagenese eingesetzt wird (M. Kamman et al., Nucl. Acids Res., 15:5404 (1989)). In diesem Fall können als eine Signalsequenz solche verwendet werden, die bekannt sind, wobei Beispiele dafür die Signalsequenz von Bst-1 einschließen: (JP-A-5-141178/1993) sowie die von G-CSF (JP-P-2-5395/1990).
Als ein Mittel zur Separation und Reinigung des Membranprotein-Polypeptids kann ein Verfahren eingesetzt werden, das im Fall eines üblichen Proteins angewendet wird; so kann beispielsweise das Membranprotein-Polypeptid der vorliegenden Erfindung zweckmäßig separiert und gereinigt werden, indem verschiedene Arten von Chromatographie gewählt und kombiniert werden, wie beispielsweise Affinitätschromatographie unter Verwendung des vorgenannten monoklonalen Antikörpers, Ultrafiltration, Aussalzen, Dialyse und dergleichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 die Ergebnisse (photographische Darstellung aus der Agarose-Gel-Elektrophorese) der Analyse eines Gens, das in den "Beispielen" der vorliegenden Erfindung über die Northern-Blot-Analyse erhalten wurde;
2 das Wachstumsvermögen der Maus-Pre-B-Zelllinie DW34 eines Membranproteins, das in den "Beispielen" der vorliegenden Erfindung erhalten wurde;
3 die Ergebnisse der Analyse des hydrophoben Bereichs und des hydrophilen Bereichs eines Gens, das in den "Beispielen" der vorliegenden Erfindung mit Hilfe der DNA-Analysen-Software "Gene Works" erhalten wurde.
Der Hintergrund der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegende Erfindung wird detailliert anhand der folgenden "Referenzbeispiele" beschrieben.
Referenzbeispiel 1
Herstellung einer Stromazelllinie von gesunden Spendern
Es wurden Stromazellen von gesunden Spendern einer Elektroporation mit einem pAct-SVT-Plasmid unterworfen, das eine große SV40-T-Antigen-cDNA und einen Küken-β-Actin-Promotor enthielt (BBRC, 186:129–134 (1992)), und zwar mit Hilfe eines "Gene Pulsers" (hergestellt von BioLad). So wurden 0,8 ml eines Aliquots der Stromazellen von 1 × 10⁷ Zellen/ml von gesunden Spendern in PBS mit 10 Mikrogramm des Plasmids gemischt und die Mischung auf Eis für 10 Minuten inkubiert, einer Elektroporation unter den Bedingungen von 250 V und bei einer elektrostatischen Kapazität von 250 μF unterworfen, weiter inkubiert auf Eis für 10 Minuten, in dem RPMI-1640-Medium suspendiert (hergestellt von der GIBCO), das 10% FCS enthielt (hergestellt von Bioproducts) und in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm kultviert. Das Kulturmedium wurde alle 3 Tage ausgewechselt und die Kolonien von gut gewachsenen, haftenden Zellen etwa 2 Wochen später mit einem kleinen Stück Filterpapier geerntet, das mit Trypsin imprägniert war, um eine Stromazelllinie (NFSV1-1) zu erhalten, die von dem Knochenmark der gesunden Spender deriviert war (J. Immunol., 149:4088 (1992)).
Referenzbeispiel 2
Herstellung von synovialen Zelllinien von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA)
Es wurden synoviale Zellen, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) abgenommen wurden, mit einem pAct-SVT-Plasmid elektroporiert, das eine SV40-Groß-T-Antigen-cDNA enthielt und einen Küken-β-Actin-Promotor (BBRC, 186:129–134 (1992)), und zwar mit Hilfe eines "Gene Pulsers" (hergestellt von BioLad). So wurden 0,8 ml eines Aliquots der synovialen Zellen von 1 × 10⁷ Zellen/ml, die von Patienten mit RA in PBS deriviert waren, gemischt mit 10 μm des Plasmids und die Mischung auf Eis für 10 Minuten inkubiert, einer Elektroporation unter den Bedingungen von 250 V und bei einer elektrostatischen Kapazität von 250 μF unterworfen, weiter auf Eis für 10 Minuten inkubiert, in dem RPMI-1640-Medium suspendiert (hergestellt von GIBCO), das 10% FCS enthielt (hergestellt von Bioproducts) und in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm kultiviert. Das Kulturmedium wurde alle 3 Tage gewechselt und die Kolonien von gut gewachsenen, haftenden Zellen etwa 2 Wochen später mit einem kleinen Stück Filterpapier geerntet, das mit Trypsin imprägniert war, um synoviale Zelllinien (SynSV6-8 und SynSV6-14) zu erhalten, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) deriviert waren.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.
Referenzbeispiel 1
Herstellung von monoklonalen Antikörpern
1) Antigen und Immunisierung
Die synoviale Zelllinie SynSV6-14 von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), die über Pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt und in dem vorstehend ausgeführten Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, wurde als ein Antigen zur Immunisierung verwendet. Unter Verwendung des RPMI-1640-Mediums (hergestellt von GIBCO), das 10% fötales Kälberserum (FCS, hergestellt von Bioproducts) und 50 μM 2-Mercaptoethanol als ein Medium enthielt, wurde die Zelllinie in einem Inkubator subkultiviert, der bei 37°C 5% CO₂ enthielt.
Die Zellen wurden mit 0,02% EDTA und PBS behandelt und aus einer Kultivierungsflasche des Inkubators durch Pipettieren gewonnen. Die Zellen wurden in dem RPMI-Medium mit einer Rate von etwa 1 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert und zu einem BALB/C-Maus (4 Wochen alt, weiblich, hergestellt von S. L. C. of Japan) immunisiert. In der ersten Immunisierung wurden etwa 1 × 10⁷ Zellen/ml in die Bauchhöhle der Maus injiziert und 2 bis 3 Wochen später 1 × 10⁷ Zellen/ml als zusätzliche Immunisierung. Darüber hinaus wurden in Abständen von 2 bis 3 Wochen 1 × 10⁷ Zellen/ml 2 bis 3 Mal als zusätzliche Immunisierung injiziert und 3 Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Maus getötet und die Milz zur Verschmelzung gewonnen.
2) Zellverschmelzung
Nachdem die von einer der Mäuse extirpierte Milz zu Stücken zerlegt wurde, wurden isolierte Milzzellen zentrifugiert, in RPMI-1640-Medium (hergestellt von GIBCO) suspendiert und ausreichend gewaschen. Andererseits wurden 1 × 10⁷ Zellen durch Kultivieren einer Maus-Myelom-Zelllinie P3x63Ag8.653 (J. Immunol., 123:1548 (1979)) in dem DMEM-Medium (hergestellt von GIBCO), das 10% fötales Kälberserum (FCS, hergestellt von FILTRON) enthielt, in dem vorgenannten DMEM-Medium in ähnlicher Weise gewaschen und in ein Zentrifugenröhrchen mit 1 × 10⁸ dieser Milzzellen eingeführt und gemischt und danach einer Zellverschmelzung mit Polyethylenglykol 1500 (hergestellt von Boehringer) nach einer üblichen Prozedur unterworfen (Clin. Exp. Immunol., 42:458–462 (1980)).
Die erhaltenen verschmolzenen Zellen wurden in 96-Mikrotiterplatten in das DMEM-Medium gegeben, das 10% FCS enthielt, und in einem Inkubator bei 37°C kultiviert, der 5% CO₂ enthielt. Am folgenden Tag wurde das Medium durch das HAT-selektive Medium (vollständiges RPMI-1640-Medium mit einem Gehalt von 1,0 × 10^–4 Mol Hypoxanthin, 4,0 × 10^–7 Mol Aminopterin und 1,6 × 10^–5 Mol Thymidin mit 10% FCS und 50 μM 2-Mercaptoethanol dazu hinzugefügt) langsam ausgewechselt und die Kultur fortgeführt. Nachdem die Kultur gestartet war, wurde die Hälfte des Überstandes durch das neue HAT-Medium zwei Mal pro Woche ausgewechselt und die Kultur zur Aufrechterhaltung der Proliferation fortgeführt.
Die so erhaltenen verschmolzenen Zellen wurden mit der eingrenzenden Verdünnungsanalyse geklont.
So wurde unter Verwendung der Antikörper in dem Überstand der Kultur, der durch Aufziehen der vorstehend verschmolzenen Zellen erhalten wurde, das Ansprechen auf das Antigen untersucht und nach einer üblichen Prozedur unter Einsatz der eingrenzenden Verdünnungsanalyse Klone erhalten, die über ein starkes Ansprechen auf das Antigen allein verfügten.
So wurden zur Ausführung der Erzeugung von Klonen das vorgenannte Hybridom und die Milzzellen einer BALB/C-Maus in den vorgeschriebenen Mengen hergestellt, eine 96-Mikrotiterplatte mit einer Rate von 1 bis 10 Hybridoma pro Mulde beimpft und in einem Inkubator bei 37°C kultiviert, der 5% CO₂ enthielt. Der Vorgang des Klonens von aufgezogenen Hybridoma wurde in der gleichen Weise mit der üblichen eingrenzenden Verdünnungsanalyse so lange wiederholt, bis sie theoretisch zu einem einzigen Klon wurden. Die Klone, die den gewünschten Antikörper lieferten, wurden unter Verwendung des vorgenannten Antigens einem Screening unterzogen.
3) Screening
Das Screening von verschmolzenen Zellen (Hybridoma) wurde mit der indirekten Fluoreszenz-Antikörper-Technik ausgeführt, eine Durchfluss-Cytometrie-Analyse mit Hilfe eines Durchfluss-Cytometers.
Das Screening von Klonen, die den Ziel-Antikörper liefern, wurde ausgeführt, indem verwendet wurden: a) SynSV6-14 (Antigen für die Immunisierung) b) Knochenmark-Stromazelllinie NFSV1-1, deriviert von gesunden Spendern als Targetzellen. Nach dem Immunisieren der synovialen Zelllinie (SynSV6-14) von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), die über Pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt, auf BALB/C-Maus, wurde das Screening von monoklonalen Antikörpern, die auf SynSV6-14 ansprechen, nicht jedoch auf die Knochenmark-Stromazelllinie (NFSV1-1) von gesunden Spendern, die über keine Pre-B-Zellwachstum unterstützende Fähigkeit verfügt folgendermaßen ausgeführt. Das erste Screening wurde unter Verwendung von SynSV6-14 ausgeführt, eine Zelle, die einer Reaktion unterworfen werden soll, und zwar als ein Antigen zur Immunisierung. Zunächst wurden Kulturüberstände, die auf SynSV6-14 ansprechen, unter Hinblick auf die Auswahl von verschmolzenen Zellklonen ausgewählt, die auf diesen SynSV6-14 ansprechen, und danach ein primäres Screening ausgeführt.
So wurden in einem Reaktionspuffer (PBS mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,02% NaN₃) suspendierte Zellen in 20 μl eines Überstandes einer Hybridom-Kultur (etwa 5 × 10⁵/20 μl) suspendiert und für 20 Minuten bei 4°C zur Reaktion gebracht.
Diese wurden 2 Mal mit dem vorgenannten Puffer gewaschen und dazu FITC-markierter Anti-Maus-Ig-Ziege-Antikörper (hergestellt von Cappel) hinzugefügt und die Mischung für 20 Minuten inkubiert. Nachdem das Reaktionsprodukt 3 Mal gewaschen wurde, wurde es mit Hilfe eines Durchfluss-Cytometers (FACScan, hergestellt von Becton Dickinson) analysiert.
Danach wurde die Knochenmark-Stromazelllinie NFSV1-1 von gesunden Spendern als eine Zelle verwendet, die wie vorstehend einer Reaktion unterworfen und mit Hilfe eines Durchfluss-Cytometers analysiert wurde. Danach wurde ein Hybridom erhalten, das stärker auf SynSV6-14 ansprechende Antikörper lieferte.
Damit wurde ein Hybridom (RS38) isoliert, das Antikörper lieferte, die auf SynSV6-14 ansprechen, nicht jedoch auf die Knochenmark-Stromazelllinie NFSV1-1 von gesunden Spendern ansprechen. Die von dem Hybridom erhaltenen Antikörper waren vom IgM-_κ-Typ.
Im übrigen ist das Hybridom, das den vorgenannten monoklonalen Antikörper RS38 liefert, eine neuartige verschmolzene Zelle, die aus einer BALB/C-Maus-Milzzelle und Maus-Myelom-P3x63Ag8.653 als Ausgangszellen hergestellt wird und am National Institute of Bioscience & Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan, hinterlegt wurde, bei der es sich um eine internationale behördliche Hinterlegungsstelle nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vom 5. Oktober 1993 handelt, und zwar unter dem Namen Maus-Maus-Hybridom RS38 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4433.
4) Reinigung der Antikörper
Die vorstehend unter 2) hergestellten verschmolzenen Zellen wurden nach einer üblichen Prozedur kultiviert und die in dem Kulturüberstand erhaltenen Antikörper nach einer üblichen Prozedur gereinigt.
So wurden die Hybridoma aus den Mulden mit dem höchsten Antikörpertiter auf das vorgenannte Antigen aufgenommen und eine der Mulden, in der das Wachstum von Zellen erkannt werden konnte, herausgenommen und die erhaltenen Kulturzellen in eine Zellkulturflasche unter den Bedingungen von 5% CO₂ bei 37°C ausgezogen und kultiviert. Die erhaltenen Zellen wurden in die Bauchhöhle einer BALB/C-Maus (6 Wochen alt, weiblich, hergestellt von S. L. C. of Japan) mit zudosiertem Pristan injiziert. Nach 10 bis 14 Tagen wurden die Ascites aufgenommen, mit 50% Ammoniumsulfat ausgesalzen, mit PBS dialysiert und mit einer QAE-Säule gereinigt. Die Antikörper wurden weiter ausgesalzen und ausreichend dialysiert, um ein gereinigtes Produkt von etwa 6 mg/ml zu erhalten.
Referenzbeispiel 2A
Eigenschaften der monoklonalen Antikörper
1) Verteilung der Zelllinien
Die Verteilung des RS38-Antigens in verschiedenen Zelllinien (die in Tabelle 1 gezeigten verschiedenen Zelllinien) wurden mit Hilfe eines FACScan analysiert. So wurde jede der verschiedenen Zelllinien in eine FACS-Pufferlösung suspendiert, die PBS mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,02% NaN₃ aufwies, und zwar in Gegenwart von 10 μg/ml des in Beispiel 1 als einen primären Antikörper erhaltenen monoklonalen Antikörpers RS38, und auf Eis für 20 Minuten inkubiert. Nach dem 2maligen Waschen mit einer FACS-Pufferlösung wurde das resultierende Produkt weiter auf Eis für 15 Minuten unter Verwendung eines FITC-markierten Anti-Maus-Ig-Ziege-Antikörpers (hergestellt von Cappel) als einen sekundären Antikörper inkubiert. Dazu wurde Propidiumiodid (PI) zugegeben, so dass die Endkonzentration 1 μg/ml betrug, wobei die Mischung weiter auf Eis für 5 Minuten inkubiert wurde. Nachdem das resultierende Produkt drei Mal mit der FACS-Pufferlösung gewaschen wurde, wurden die Zellen mit Hilfe der Lichtstreuungsmessung analysiert und nur die lebensfähigen Zellen einer Analyse mit Hilfe eines FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) unterzogen. Als Kontrollen wurden Maus-monoklonale-Antikörper SG2 und RF3 (JP-A-5-141178/1993) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich wird, ergab sich, dass sich die Verteilung des RS38 von der des SG2 und RF3 unterschied. Tabelle 1 Ergebnisse der FACS-Analyse von Zelllinien
Rerenzbeispiel 3
1. Herstellung einer cDNA-Genbank
1) Herstellung von Poly(A)⁺RNA
Die Herstellung von Poly(A)⁺RNA aus der Synovialzelllinie SynSV6-8 von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) wurde unter Verwendung eines mRNA-Isolationkits "Fast Track^TM", Version 3.2, (hergestellt von Invitrogen) ausgeführt. Die SynSV6-8-Zellen wurden für zwanzig Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm homogenisiert und danach die gesamte RNA nach der zu diesem Kit zugehörigen Prozedur hergestellt. Weiter wurde die Poly(A)⁺RNA mit Hilfe der dem Kit beigefügten Oligo-d(T)-Cellulose nach der dem Kit beigefügten Prozedur gereinigt.
2) Aufbau der cDNA-Genbank
Es wurde eine doppelsträngige cDNA synthetisch hergestellt, indem die vorgenannte Poly(A)⁺RNA mit 5 μg als ein Material nach der dem cDNA-Synthesekit beigefügten Prozedur, Time Saver^TM-cDNA-Synthesekit (hergestellt von Pharmacia) verwendet wurde und ein BstXI-Adaptor (hergestellt von Invitrogen) damit durch Ligation mit Hilfe eines DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) nach der dem Kit beigefügten Prozedur verknüpft wurde. Die Entfernung des freien BstXI-Adaptors wurde mit Hilfe der dem Kit beigefügten Säule "Size Sep 400 Spin Column" nach der dem Kit beigefügten Prozedur vorgenommen, um etwa 100 μl einer Adaptor-ligierten, doppelsträngigen cDNA zu erhalten.
Danach wurden von den etwa 100 μl der so hergestellten Adaptorligierten, doppelsträngigen cDNA 2 μl in einer Ligationsreaktion verwendet und eine cDNA-Genbank aufgebaut, indem diese mit einem pEF-BOS-Vektor (Nuc. Acid Res., 18:5322 (1990)) über eine Ligation verknüpft wurde, der zuvor mit einem Restriktionsenzym BstXI und Alkaliphosphatase (hergestellt von Takara Shuzo) mit Hilfe eines cDNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) behandelt wurde. Die aufgebaute cDNA-Genbank wurde in die Escherichia Coli-Zelllinie DH5 (hergestellt von Toyobo) transformiert, und es wurde davon ausgegangen, dass es sich um einen unabhängigen Klon mit der Gesamtgröße von etwa 2 × 10⁵ handelte. Es wurden fünfzig Pools hergestellt, von denen jeder Pool 2.000 bis 4.000 Klone von transduzierten Escherichia Coli aufwies, und danach in den folgenden Tests verwendet.
2. Klonen nach der Methode der Direkten Expression
1) Transfektion in 293T-Zellen
Die Amplifikation einer cDNA wurde ausgeführt, indem die vorgenannten gepoolten Escherichia Coli in dem LB-Medium in Kultur genommen wurden, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und aus den Escherichia Coli eine Plasmid-DNA nach der Alkali-Methode gewonnen (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Der Reinigungsgrad der erhaltenen Plasmid-DNA wurde durch wiederholtes Ultrazentrifugieren nach der Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid-Dichtegradienten-Zentrifugation verstärkt und die gereinigte Plasmid-DNA zu einer 293T-Zelle transfiziert (Zelllinie, hergestellt durch Transfektion einer SV40-Groß-T-Antigen-cDNA in eine 293-Zelle (transformierte, primäre, embryonale Niere-Human-ATCC CRL 1573)) nach der Calciumphosphat-Methode.
Es wurden 2 μg der gereinigten Plasmid-DNA in 100 μl einer Pufferlösung aufgelöst, die 1 mM Tris-HCl und 0,1 mM EDTA enthielt, und nach Zugabe von 14 μl 2M CaCl₂ dazu die resultierende Mischung mit einer Pufferlösung aus 50 mM HEPES (pH:7,1), 280 mM NaCl und 1,5 mM Natriumphosphat langsam gemischt und danach die erhaltene Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und den 293T-Zellen in 24-Mikrotiterplatten zugegeben. Die 293T-Zellen wurden in dem DMEM (hergestellt von GIBCO)-Medium kultiviert, das 10% fötales Kälberserum (FCS, hergestellt von Bioproducts) enthielt, und zwar unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 2 Tage.
2) Analyse mit Hilfe des FACScan
Die transduzierten 293T-Zellen wurden aus den 24-Mikrotiterplatten in PBS mit einem Gehalt von 0,02% EDTA entnommen und mit einer FACS-Pufferlösung 2 Mal gewaschen, die PBS mit einem Gehalt von 2% FCS und 0,02 NaN₃ enthielt, und danach in 20 μl FACS-Pufferlösung in Gegenwart von 10 μg/ml des vorgenannten monoklonalen Antikörpers RS38 als einen primären Antikörper suspendiert und für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Nachdem sie 2 Mal mit der FACS-Pufferlösung gewaschen wurden, wurden sie auf Eis für 15 Minuten inkubiert, indem ein FITC-markierter Anti-Maus-Ig-Ziege-Antikörper (hergestellt von Cappel) als ein sekundärer Antikörper verwendet wurde. Dazu wurde Propidiumiodid (PI) zugesetzt, so dass die Endkonzentration davon 1 μg/ml betrug, wonach die Mischung weiter für 5 Minuten auf Eis inkubiert wurde, 3 Mal mit der FACS-Pufferlösung gewaschen wurde und die Zellen mit Hilfe der Lichtstreuungsmessung analysiert wurden und allein die lebensfähigen Zellen einer Analyse mit Hilfe des FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) analysiert wurden.
3) Klonen der cDNA-Genbank
Die aus Escherichia Coli von 2.000 bis 4.000 Klonen als einen Pool nach der Alkali-Methode gewonnenen Plasmid-DNA wurden nach der vorgenannten Methode zu 293T-Zellen transfiziert und die transfizierten Zellen nach der vorgenannten FACS-Analyse einem Screening unterworfen. In dem 25. Pool der 293T-Zellen wurde ein mit dem Maus-monoklonalen Antikörper RS38 stark gefärbter Peak erkannt. Die Plasmid-DNA wurde wiederum in Escherichia Coli DH5 (hergestellt von GIBCO BRL) transduziert und auf einer LB-Agar-Platte, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, geimpft.
Es wurden etwa 2.000 kolonieerzeugende Klone nacheinander auf einer Agar-Platte beimpft, deren Boden eine netzähnliche Form unterteilt war, so dass die Position eines beimpften Klons bei einer Rate von 100 Klonen pro Platte erkannt werden konnte und zwei Reihen von jeder Platte hergestellt wurden. Es wurden 20 Pools, von denen jeder Pool 100 Klone aufwies, in der gleichen Weise hergestellt und Escherichia Coli in dem LB-Medium kultiviert, das 50 μl/ml Ampicillin enthielt. Nach dem die Plasmid-DNA nach der Alkali-Methode gewonnen wurden, wurden sie nach der Calciumphosphat-Methode zu 293T-Zellen transfiziert und die transfizierten Zellen einer FACScan-Analyse in der gleichen Weise wie vorstehend unterworfen. Als Ergebnis der FACScan-Analyse wurden 100 Klone von Escherichia Coli einer nach dem anderen als positiv erkannt und jeder Klon kultiviert und danach nach der Alkali-Methode die Plasmid-DNA gewonnen. Jede Plasmid-DNA wurde zu 293T-Zellen nach der Calciumphosphat-Methode transfiziert und die FACScan-Analyse in der gleichen Weise wie vorstehend ausgeführt, um einen einzelnen positiven Klon zu erhalten, der als pRS38-BOS bezeichnet wurde.
Der Klon wurde einer Sequenzierungsreaktion unter Verwendung eines "Auto Read"-Sequenzierungskits (hergestellt von Pharmacia) und eines "Auto Cycle"-Sequenzierungskits (hergestellt von Pharmacia) nach der dem Kit beigefügten Prozedur unterzogen und die Bestimmung der DNA-Sequenz davon mit Hilfe eines ALF^TM-DNA-Sequenators (hergestellt von Pharmacia) ausgeführt. Als Ergebnis war dies ein Gen mit der vollen Länge von 996 bp (Sequenz Nr. 2 der Sequenz-Tabelle), von dem ausgegangen wurde, dass es eine Sequenz der 180 Aminosäure-Reste von dem längsten offenen Leseraster kodiert und wurde als Ergebnis der Ausführung des Homologie-Retrievals mit den Datenbanken SWISS PLOT und NBRL unter Verwendung einer Genanalyse-Software "Genetex" als ein neues Gen erkannt.
4) Untersuchung der Expression nach der Northern-Blot-Analyse
Die Herstellung von Poly(A)⁺RNA aus der synovialen Zelllinie SynSV6-14 von Patienten mit RA, der Knochenmark-Stromazelllinie-RASV5-5 von Patienten mit RA und der Knochenmark-Stromazelllinie NFSV1-1 von gesunden Spendern wurde unter Verwendung eines mRNA-Isolationskits "Fast Track^TM", Version 3.2, (hergestellt von Invitrogen) ausgeführt, um die Northern-Blot-Analyse (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989) auszuführen. So wurden die in den zehn Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm kultivierten Zelllinien gewonnen und homogenisiert und danach die Gesamt-RNA nach der dem Kit beigefügten Prozedur hergestellt. Ferner wurde die Poly(A)⁺RNA mit Hilfe der dem Kit beigefügten Oligo-d(T)-Cellulose entsprechend der dem Kit beigefügten Prozedur gereinigt.
Das Markieren einer Sonde wurde unter Verwendung eines "Multiprime DNA"-Markierungssystems (hergestellt von Amersham) ausgeführt. Das bedeutet, es wurde ein 315bp-Fragment durch Abbau eines Inserts hergestellt, von dem angenommen wird, dass es RS38 kodiert, das in die BstXI-Stelle von pEF-BOS mit einem Restriktionsenzym HindIII eingesetzt ist, wonach eine markierte Sonde nach der dem Kit beigefügten Prozedur hergestellt wurde. Die aus SynSV6-14, RASV5-5 und NFSV1-1 mit 3 μg/Spur hergestellte Poly(A)⁺RNA wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und danach das Blotten nach einer Kapillarmethode unter Verwendung eines "Gene Screen Plus^TM" (hergestellt von Du Pont) als eine Hybridisierungs-Transfermembran ausgeführt. Die Hybridisierung wurde bei 65°C über nacht unter Verwendung eines Gilbert-Church-Puffers vorgenommen, der 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA, 7% SDS und 1% BSA bei pH 7,0 aufwies. Nach Beendigung der Hybridisierung wurde die Membran bei Raumtemperatur 4 Mal mit 2 × SSC und danach mit 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C zweimal gewaschen und danach zur Ausführung einer Autoradiographie über nacht mit einem Röntgenfilm Vorderseite an Vorderseite plaziert. Als Ergebnis wurde auf SynSV6-14 entsprechend der Darstellung in 1 ein augenscheinliches Band von etwa 1,0 kb detektiert.
3. Expression durch eine BALB3T3-Zelle
Das neue Molekül wurde in eine BALB3T3-Zelle transfiziert und die Expression in Säugetier-Zellen untersucht.
So wurden 20 μg pRS38-BOS und 2 μg pSV2neo, die über ein Neomycinresistentes Gen verfügen (P. J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1:327 (1982)) zu einem 0,8 ml-Aliquot von 1 × 10⁷ Zellen/ml zugesetzt und auf Eis für 10 Minuten inkubiert und danach einer Transfektion mit Hilfe eines "Gene Pulsers" (hergestellt von BioLad) unter den Bedingungen von 250 V und einer elektrostatischen Kapazität von 250 μF unterworfen, um gleichzeitig eine Transduktion zu erreichen.
Ferner wurde die Zelle, nachdem sie auf Eis für 10 Minuten inkubiert wurde, in dem DMEM-Medium (hergestellt von GIBCO) suspendiert, das 2 mg/ml G418 und 10% FCS (hergestellt von Bioproducts) enthielt, und in 24-Mikrotiterplatten kultiviert. Das Auswechseln des Kulturmediums wurde alle 3 Tage vorgenommen und etwa 2 Wochen später transformierte Zelllinien BALB3T3 38-1, 38-3 und 38-9, die auf den vorgenannten Maus-monoklonalen Antikörper RS38 ansprachen, aus der Mulde erhalten, die eine einzige Kolonie von gut aufgewachsenen Haftzellen mit Neomycin-Resistenz bildeten. Zusätzlich wurde als eine Kontrollzelle eine transformierte Zelllinie BALB3T3 38-4 erhalten, die nicht auf RS38 ansprach, jedoch über Neomycin-Resistenz verfügte.
4. Biologische Eigenschaften des neuen Moleküls
1) Wachstum unterstützende Maus-Pre-B-Zelllinien
Die biologischen Eigenschaften des neuen Moleküls wurden unter Verwendung einer Maus-Pre-B-Zelllinie DW34, die unabhängig auf Stromazellen wächst, mit der Zahl der gewachsenen Zellen als Index nach der folgenden Methode analysiert.
Zunächst wurden transduzierte Zelllinien BALB3T3 38-1, 38-3 und 38-9 sowie Kontroll-Zelllinien BALB3T3 und BALB3T3 38-4 in 24-Mikrotiterplatten solange kultiviert, bis sie subkonfluent wurden, es wurde eine Strahlung von 30 Gy aufgegeben, darin DW34 von 2 × 10³ pro Mulde zugegeben und das resultierende Produkt in dem RPMI-1640 (hergestellt von GIBCO)-Medium mit einem Gehalt von 10% FCS (hergestellt von Bioproducts) unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 4 Tage kultiviert. Die Zahl der lebensfähigen Zellen von DW34 in jeder Mulde wurde mit Trypanblau-Farbstoffausschluss gezählt, um die Wachstum unterstützende Fähigkeit zu analysieren. Als Ergebnis war das Wachstum von DW34 in den transduzierten Zelllinien BALB3T3 38-1, 38-3 und 38-9 im Vergleich zu den Kontroll-Zelllinien BALB3T3 und BALB3T3 38-4 entsprechend der Darstellung in 2 verstärkt.
5. Physikochemische Eigenschaften des neuen Moleküls
1) Analyse des N-Endes
Die Analyse des hydrophoben Bereichs und des hydrophilen Bereichs des vorstehend erhaltenen Gens wurde unter Anwendung der DNA-Analyse-Software "Gene Works" ausgeführt. Die Ergebnisse der Analyse sind in 3 gezeigt. Als Ergebnis hatte der Bereich von 28 Aminosäure-Resten von der 21. Lys bis zur 48. Ala entsprechend der Darstellung in Sequenz Nr. 1 der Sequenz-Tabelle die stärksten hydrophoben Eigenschaften, weshalb angenommen wird, dass es sich um einen Protein-Typ handelt, der durch die Zellmembran hindurch geht, über eine Domäne verfügt, die durch die Zellmembran hindurch geht, sowie über eine intrazellulare Domäne an der Seite des N-Endes des vollentwickelten Proteins.
Wie vorstehend im Detail beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung ein Gen, das ein neues Membranproteinpeptid mit Pre-B-Zellwachstum unterstützender Fähigkeit kodiert, betrifft einen Vektor, der dieses Gen enthält, und betrifft Transformanten, die von diesem Vektor transformiert werden, und betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines neuen Membranproteins mit Pre-B- Zellwachstum unterstützender Fähigkeit unter Verwendung dieses Gens, so dass das Gen der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, das Membranprotein auf der synovialen Zelle von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) zu kodieren.
Das homogene und gereinigte neue Membranproteinpolypeptid kann in großen Mengen durch Insertieren des Gens der vorliegenden Erfindung in einen geeigneten Vektor und nachfolgendes Transformieren normaler Wirtszellen hergestellt werden, und es können darüber hinaus monoklonale Antikörper hergestellt werden, die dieses Membranproteinpolypeptid erkennen, indem die Synovialzelle verwendet wird, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) als ein Antigen zur Immunisierung deriviert ist. Damit wird es nach der vorliegenden Erfindung möglich, Reagentien zur klinischen Diagnose auf rheumatoide Arthritis herzustellen. SEQUENZ-LISTE

Claims

Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der ein Polypeptid erkennt, das eine Aminosäuresequenz enthält, die in der Sequenz-Nr. 1 der Sequenz-Tabelle gezeigt ist, oder einen Teil der Aminosäuresequenz, der über die Funktion einer Unterstützung des Prä-B-Zellwachstums verfügt, und zwar für die Herstellung eines Reagens zur Diagnose auf rheumatoider Arthritis.