DE69316757T2

DE69316757T2 - Photoaktivierbare chemiluminizierende matrices

Info

Publication number: DE69316757T2
Application number: DE69316757T
Authority: DE
Inventors: Hrair San Jose Ca 95129 Kirakossian; John S. Los Altos Ca 94022 Pease; Edwin F. Atherton Ca 94025 Ullman; Daniel B. Sunnyvale Ca 94087 Wagner
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1998-05-07
Anticipated expiration: 2013-07-31
Also published as: EP0653066B1; ES2113547T3; US5709994A; EP0653066A1; DE69316757D1; CA2141451C; WO1994003812A1; DK0653066T3; US5618732A; ATE162892T1; JP3464798B2; CA2141451A1; JPH09502253A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung.

Diese Erfindung betrifft photoaktivierbare chemilumineszierende Matrizes und Verfahren, Zusammensetzungen und Testsätze zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe.
Das Gebiet der klinischen Diagnostik hat in den letzten Jahren eine breite Erweiterung erlebt, sowohl was die Vielfalt von Materialien (Analyten), die leicht und genau bestimmt werden können, als auch die Verfahren zur Bestimmung betrifft. Bequeme, zuverlässige und ungefährliche Mittel zum Nachweis der Anwesenheit von niedrigen Konzentrationen an Materialien in Flüssigkeiten sind erwünscht. In der klinischen Chemie können diese Materialien in Konzentrationen unterhalb von 10&supmin;¹² molar in Körperflüssigkeiten vorliegen. Die Schwierigkeit des Nachweises niedriger Konzentrationen dieser Materialien wird durch die relativ geringen Probengrößen vergrößert, die verwendet werden können.
Bei der Entwicklung eines Assays gibt es viele Überlegungen. Eine Überlegung ist die Signalantwort auf Veränderungen bei der Analytenkonzentration. Eine zweite Überlegung ist die Leichtigkeit, mit der das Protokoll für den Assay durchgeführt werden kann. Eine dritte Überlegung ist die Schwankung des störenden Hintergrundes von Probe zu Probe. Die Leichtigkeit der Herstellung und Reinigung der Reagenzien, die Verfügbarkeit der Ausrüstung, die Leichtigkeit der Automation und die Wechselwirkung mit interessierenden Materialien sind einige der zusätzlichen Überlegungen bei der Entwicklung eines nützlichen Assays.
Eine breite Kategorie von Techniken beinhaltet die Verwendung eines Rezeptors, der sich spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation eines markierten Liganden als Funktion der Anwesenheit des Analyten binden kann. Der beobachtete Effekt der Bindung durch den Rezeptor hängt vom Marker ab. In einigen Fällen sorgt die Bindung des Rezeptors lediglich für eine Unterscheidung im Molekulargewicht zwischen gebundenem und ungebundenem markiertem Liganden. In anderen Fällen erleichtert die Bindung des Rezeptors eine Abtrennung des gebundenen markierten Liganden von freiem markiertem Liganden, oder sie kann die Natur des vom Marker erhaltenen Signals beeinflussen, so daß das Signal mit der Menge des an markierten Liganden gebundenen Rezeptors variiert. Eine weitere Abwandlung besteht darin, daß der Rezeptor markiert ist und der Ligand unmarkiert ist. Alternativ werden sowohl der Rezeptor als auch der Ligand markiert, oder verschiedene Rezeptoren werden mit verschiedenen Markern markiert, wobei die Marker wechseiwirken, wenn sie in enger Nachbarschaft vorliegen und die Menge an anwesendem Liganden den Grad beeinflußt, zu welchem die Marker des Rezeptors wechselwirken können.
Es besteht ein anhaltender Bedarf an neuen und genauen Techniken, die für ein breites Spektrum von unterschiedlichen Liganden angepaßt werden können oder in speziellen Fällen verwendet werden können, wenn andere Verfahren nicht leicht anpaßbar sind.
Homogene Immunassays sind früher für kleine Moleküle beschrieben worden. Diese Assays schließen unter anderen den FRAT -Assay, den EMIT - Assay, den Enzym-Kanalbildungs-Immunassay und den Fluoreszenzenergie- Transfer-Immunassay (FETI) von SYVA; Enzym-Hemm-Immunassays (Hoffmann Laroche und Abbott Laboratories); den Fluoreszenzpolarisations-Immunassay (Dandlicker) ein. Alle diese Verfahren haben eine beschränkte Empfindlichkeit, und nur wenige, einschließlich FETI und Enzym- Kanalbildung, sind für große multiepitope Analyten geeignet.
Lumineszierende Verbindungen, wie fluoreszierende Verbindungen und chemilumineszierende Verbindungen, finden wegen ihrer Fähigkeit, Licht zu emittieren, auf dem Assay-Gebiet breite Anwendung. Aus diesem Grund sind Lumineszenzfarbstoffe als Marker in Assays, wie Nucleinsäure-Assays und Immunassays, verwendet worden. Beispielsweise wird ein Mitglied eines spezifischen bindenden Paares an einen Lumineszenzfarbstoff konjugiert, und verschiedene Protokolle werden verwendet. Das Lumineszenzfarbstoff- Konjugat kann verteilt werden zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase in Beziehung zu der Menge an Analyt in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält. Durch Messen der Lumineszenz von einer der Phasen kann man den beobachteten Lumineszenzpegel mit einer Konzentration des Analyten in der Probe in Beziehung setzen.
Teilchen, wie Liposomen und Erythrozyten-Geister, sind als Träger von verkapselten wasserlöslichen Materialien verwendet worden. Beispielsweise sind Liposomen verwendet worden, um biologisch aktives Material für eine Vielfalt von Verwendungen einzukapseln, wie beispielsweise Arzneistoff-Zufuhrsysteme, in die bei der Liposomenherstellung ein Medikament eingeschlossen und dann dem zu behandelnden Patienten verabreicht wird.
Teilchen, wie Latexperlen und Liposomen, sind auch in Assays verwendet worden. Beispielsweise kann in homogenen Assays ein Enzym in der wäßrigen Phase eines Liposoms eingeschlossen werden, welches mit einem Antikörper oder Antigen markiert ist. Die Liposomen werden veranlaßt, das Enzym in Anwesenheit von einer Probe und von Komplement freizusetzen. Antikörper- oder Antigen-markierte Liposomen, die wasserlösliche fluoreszierende oder nicht-fluoreszierende Farbstoffe innerhalb einer Vesikel mit wäßriger Phase eingekapselt oder Lipid-lösliche Farbstoffe in der Lipid-Doppelschicht eines Lipids gelöst aufweisen, sind auch verwendet worden, um Analyten zu testen, die mit dem oberflächengebundenen Antikörper oder Antigen eine immunchemische Reaktion eingehen können. Detergentien sind verwendet worden, um die Farbstoffe aus der wäßrigen Phase der Liposomen freizusetzen.
Chemilumineszierende Marker bieten eine außergewöhnliche Empfindlichkeit in Liganden-Bindungsassays, aber gewöhnlich sind ein oder mehrere chemische Aktivierungsschritte erforderlich. Fluores zierende Marker weisen diesen Nachteil nicht auf, sind aber weniger empfindlich.
Chemilumineszierende Marker sind für Immunassays und Nucleinsäure- Assays beschrieben worden, bei denen eine Gruppe, die kovalent an einen Bindungspartner gebunden ist, bei chemischer Aktivierung Licht emittiert. Ein Nucleinsäure-Assay-Testsatz, der einen Acridiniumester verwendet, wird von Genprobe Pace2 System (San Diego, CA) verkauft, und MagicLite - Immunassay-Testsätze, die diesen Typ von Marker verwenden, werden von CIBA-GEIGY (Basel, Schweiz) verkauft. Die Energieübertragung aus einer markierten Nucleinsäure-Sonde auf einen fluoreszierenden Akzeptor, der an eine zweite Sonde gebunden ist, ist von Heller et al., I und II, unten, für einen Sandwich-Nucleinsäure-Assay beschrieben worden. Maggio I, unten, bespricht eine ähnliche Vorgehensweise für Immunassays. Eine Energieübertragung aus einem Lumineszenzfarbstoff, der kovalent an ein Polynukleotid gebunden ist, auf einen interkalierten Fluorophor wurde von Heller et al., IV, unten, erwähnt. Die Übertragung von einem interkalierten Farbstoff auf einen Fluoreszenzfarbstoff an einem Polynukleotid wurde kürzlich von Cardullo et al., unten, beschrieben. Weiter hat McCapra, unten, die Verwendung von Photosensibilisatoren als Marker beschrieben, wobei der Photosensibilisator Sauerstoff zu seinem Singulettzustand aktiviert, welcher wiederum mit einer Verbindung reagiert, die beim Erwärmen Licht erzeugt.

2. Kurze Beschreibung des Standes der Technik

Die europäische Patentanmeldung 0421788 A2 offenbart ein Halogenperoxidase-Säure-Oxidationsmittel-Chemilumineszenz-Assaysystem zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe. Das System verwendet Halogenperoxidase, Halogenid, Oxidationsmittel und Chemilumineszenz erzeugendes Substrat. Das Indikatorsystem wirkt als Synthesemittel für hochreaktiven molekularen Singulett-Sauerstoff, welcher mit dem Chemilumineszenz erzeugenden Substrat reagiert, um ein oxidiertes Reaktionsprodukt im angeregten Zustand zu liefern. Das Reaktionsprodukt im angeregten Zustand relaxiert dann zu einem niedrigeren Energiezustand unter Emission von meßbarem Licht in einer Menge, die mit der Menge von jedem der Reaktionsteilnehmer in Beziehung steht. Das Chemilumineszenz erzeugende Substrat kann als Marker verwendet werden und kann an einen Liganden gekuppelt werden, wie ein Protein, Hormon, Hapten, Steroid, Lectin, eine Nucleinsäure, einen Metaboliten, ein Antigen, einen Antikörper, eine Nucleinsäure-Sonde, einen Bacteriophagen oder ein Virus (Seite 10, Zeilen 8 - 17).
Oser et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 29: 1167 - 1169 (1990) beschreibt einen nicht-radioaktiven Assay einer DNA-Hybridisierung durch DNA-Matrizen-vermittelte Bildung eines ternären Tb(III)-Komplexes in reiner flüssiger Phase.
Das US-Patent Nr. 5,017,473 offenbart einen homogenen Chemilumineszenz-Immunassay unter Verwendung eines lichtabsorbierenden Materials.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0345776 (McCapra) offenbart spezifische Bindungsassays, die einen Sensibilisator als Marker verwenden. Die Sensibilisatoren schließen irgendeine Einheit ein, welche, wenn sie durch Anregung mit Strahlung von einer oder mehreren Wellenlängen oder einem anderen chemischen oder physikalischen Stimulus (z.B. Elektronen- Transfer, Elektrolyse, Elektrolumineszenz oder Energieübertragung) stimuliert wird, einen angeregten Zustand erreicht, welcher (a) bei Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff molekularen Singulett-Sauerstoff erzeugt oder (b) bei Wechselwirkung mit einem Leuko-Farbstoff eine reduzierte Form annimmt, die durch Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff in ihren ursprünglichen, nicht-angeregten Zustand zurückgebracht werden kann, was die Erzeugung von Wasserstoffperoxid zur Folge hat. Jede der beiden Wechselwirkungen mit dem angeregten Sensibilisator erzeugt bei der Zugabe von Reagenzien ein nachweisbares Signal.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0070685 (Heller et al., I) beschreibt eine homogene Nucleinsäure-Hybridisierungsdiagnostik durch nicht-strahlende Energieübertragung.
Ein diagnostisches Verfahren mit Licht-emittierender Polynukleotid- Hybridisierung ist in der europäischen Patentanmeldung Nr.0070687 (Heller et al., II) beschrieben.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0232967 (Morrison I) bespricht Verfahren und Zusammensetzungen zur Durchführung von Assays für Ziel- Polynukleotidstränge. Die Verfahren schließen das Inkontaktbringen einer Probe mit einem Reagenz ein, welches eine erste und eine zweite Polynukleotid-Sonde einschließt. Die erste und zweite Sonde können eine erste Anordnung annehmen, in der die Sonden aneinander gebunden sind, und eine zweite Anordnung, in der die Sonden an ein Ziel gebunden sind. Die Sonden schließen Marker-Einheiten ein, die wechselwirken können, um ein Signal zu erzeugen, welches anzeigt, daß die Sonden in einer der beiden angeordnet sind.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0315364 beschreibt einen immunchemischen Assay, um die Anwesenheit oder Konzentration von Antigen oder Antikörpern in einer Flüssigkeit zu bestimmen. Der Assay umfaßt (a) das Bilden eines ternären Komplexes aus einem ersten markierten Antikörper oder Antigen, einem zweiten markierten Antikörper oder Antigen und dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper und (b) das Nachweisen eines Signals, das in Anwesenheit von mindestens einem Substrat durch Wechselwirkung zwischen dem ersten Marker und dem zweiten Marker erzeugt und durch deren Nähe zueinander verstärkt wird, wenn sie an die antigene Substanz gebunden sind.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0229943 (Heller et al., III) beschreibt fluoreszierende Stokes-Shift-Sonden für einen Polynukleotid- Hybridisierungsassay.
Das US-Patent Nr. 4,226,993 (Buckler et al.) beschreibt immunofunktionalisierte Phthalhydrazide, die als Zwischenprodukte bei der Synthese von chemilumineszierenden, Phthalhydrazid-markierten Konjugaten nützlich sind. Die Konjugate sind als Reagenzien in spezifischen bindenden Assays für die Bestimmung von Liganden oder deren spezifischen Bindungspartnern in flüssigen Medien nützlich.
Andere Literaturstellen des Standes der Technik sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0515194 aufgeführt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In ihrem breitesten Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Zustandes, wie beispielsweise der Anwesenheit oder Abwesenheit (a) eines Analyten in einem Medium, (b) eines Lecks in einem Fluidik-System, (c) der Abnutzung bei einem mechanischen Teil oder (d) der Emission von Licht. Das Verfahren umfaßt das Bestrahlen einer Zusammensetzung, die aus dem Zustand hervorgeht oder ihm unterliegt. Die Zusammensetzung umfaßt eine nicht-teilchenförmige feste Matrix oder eine teilchenförmige Matrix, die darin einverleibt (a) einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und (b) eine chemilumineszierende Verbindung aufweist, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann. Die teilchenförmige Matrix kann fest oder fluide sein.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Markierung eines Materials, wie (a) eines Moleküls, das mit der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einem Medium in Beziehung steht, (b) eines Fluidik-Materials in einem Fluidik-System oder (c) von abgeriebenem Material aus einem mechanischen Teil, (d) einer Zelle oder (e) von biologischem Gewebe. Das Verfahren umfaßt, daß man mit dem Material (1) einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett- Sauerstoff erzeugen kann, und (2) eine chemilumineszierende Verbindung vereinigt, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann. Der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung sind einer Matrix einverleibt, bei der es sich um einen nicht-teilchenförmigen Festkörper oder einen teilchenförmigen Festkörper oder ein teilchenförmiges Fluid handeln kann.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Nachweis eines Materials. Das Verfahren umfaßt, daß man (a) mit dem Material (1) einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und (2) eine chemilumineszierende Verbindung vereinigt, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann; der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung werden einer festen Matrix oder einem teilchenförmigen Feststoff oder Fluid einverleibt; (b) das Material mit Licht der Wellenlänge 200 - 1000 nm bestrahlt und (c) das von der chemilumineszierenden Verbindung emittierte Licht nachweist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung verzögerter Lumineszenz. Das Verfahren umfaßt den Schritt des Bestrahlens einer Zusammensetzung, die eine nicht-teuchenförmige feste Matrix oder eine teilchenförmige feste oder fluide Matrix umfaßt, welche darin einverleibt (1) einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und (2) eine chemilumineszierende Verbindung aufweist, welche durch Singulett- Sauerstoff aktiviert werden kann.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten gerichtet. Das Verfahren umfaßt die Schritte, daß man ein Medium, von dem man vermutet, daß es einen Analyten enthält, Bedingungen unterwirft, unter denen ein Komplex von Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaares (sBp) im Verhältnis zu der Anwesenheit des Analyten gebildet wird, und bestimmt, ob sich der sBp- Mitglied-Komplex gebildet hat, indem man als Marker eine einzige Zusammensetzung verwendet, die sowohl chemilumineszierende als auch Photosensibilisator-Eigenschaften aufweist, derart, daß bei Aktivierung der Photosensibilisator-Eigenschaft Singulett-Sauerstoff erzeugt wird und die chemilumineszierende Eigenschaft aktiviert.
Eine andere Ausführungsform eines Verfahrens zur Bestimmung eines Analyten umfaßt (a) das Bereitstellen in Kombination von (1) einem Medium, von dem man vermutet, daß es den Analyten enthält, (2) einem Marker- Reagenz, das ein erstes spezifisches Bindungspaar(sBp)-Mitglied umfaßt, welches mit einer einzigen Zusammensetzung assoziiert ist, die sowohl Photosensibilisator- als auch chemilumineszierende Eigenschaften aufweist, derart, daß bei Aktivierung der Photosensibilisator-Eigenschaft Singulett- Sauerstoff erzeugt wird und die chemilumineszierende Eigenschaft aktiviert, wobei das erste sBp-Mitglied in der Lage ist, sich an den Analyten oder ein zweites sBp-Mitglied zu binden, um einen Komplex zu bilden, der mit der Anwesenheit des Analyten in Beziehung steht, (b) das Aktivieren der Photosensibilisator-Eigenschaft und (c) das Nachweisen der Menge an Lumineszenz, die von der chemilumineszierenden Eigenschaft erzeugt worden ist, wobei deren Menge mit der Menge an Analyt in dem Medium in Beziehung gesetzt wird.
Ein anderes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt (a) das Bereitstellen in Kombination von (1) einem Medium, von dem man vermutet, daß es den Analyten enthält, (2) einem Marker-Reagenz, das ein erstes spezifisches Bindungspaar(sBp)-Mitglied mit einem Teilchen assoziiert umfaßt, welches einen Photosensibilisator, der bei Aktivierung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung aufweist, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, so daß nach Aktivierung des Photosensibilisators Singulett-Sauerstoff erzeugt wird und die chemilumineszierende Verbindung aktiviert, wobei das erste sBp-Mitglied in der Lage ist, sich an den Analyten oder ein zweites sBp-Mitglied zu binden, um einen Komplex zu bilden, der mit der Anwesenheit des Analyten in Beziehung steht, (b) das Aktivieren des Photosensibilisators und (c) das Nachweisen der Menge an Lumineszenz, die durch die chemilumineszierende Verbindung erzeugt wurde, wobei deren Menge mit der Menge an Analyt in dem Medium in Beziehung gesetzt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der obigen Verfahren ist diejenige, in der mindestens eines von dem besagten Photosensibilisator und der besagten chemilumineszierenden Verbindung kovalent an die besagte Matrix geknüpft ist.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die eine nicht-teilchenförmige feste Matrix oder einen teilchenförmigen Feststoff oder ein teilchenförmiges Fluid umfaßt, die bzw. das darin einverleibt einen Photosensibilisator, der bei Aktivierung Singulett- Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung aufweist, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann.
Eine andere Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfaßt ein Teilchen, entweder fest oder fluide, das darin einverleibt einen Photosensibilisator, der Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung aufweist, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, wobei das Teilchen an ein Molekül gebunden ist, das beim Nachweis eines Analyten nützlich ist. Das Molekül kann ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares sein.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die Fluid-Teilchen umfaßt, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Öltröpfchen, Liposomen und Emulsionen besteht und darin einverleibt einen Photosensibilisator, der bei Aktivierung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung aufweist, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Kalibrierung von Lichtintensität, die durch eine lumineszierende Zusammensetzung emittiert wird. Das Verfahren umfaßt die Schritte, daß man (a) in einem Medium eine lumineszierende Zusammensetzung, die Licht bei Bestrahlung emittieren kann, und eine der obigen Zusammensetzungen der Erfindung vereinigt, wobei eine der Zusammensetzungen, wenn sie durch Licht aktiviert wird, eine Abfallszeit für die Lichtemission aufweist, die beträchtlich größer ist als die Abfallszeit für die andere, (b) das Medium bestrahlt, um die lumineszierende Zusammensetzung und die Zusammensetzung der Erfindung zu aktivieren, (c) die Intensität von Licht, das während des Abfalls der aktivierten Zusammensetzung mit der kürzeren Abfallszeit emittiert wird, mißt, (d) die Intensität von Licht mißt, das nach dem Messen von Schritt (c) und nach dem mindestens teilweisen Abfall der aktivierten Zusammensetzung mit der kürzeren Abfallszeit emittiert wird, und (e) die Intensität des Lichts, das während des Abfalls der aktivierten Zusammensetzung mit der kürzeren Abfallszeit emittiert wird, mit der Intensität von Licht vergleicht, das in Schritt (d) emittiert wird, um eine interne Kalibrierung bereitzustellen. Die Schritte b und c können ein oder mehrere Male vor dem Schritt d wiederholt werden. In einer Ausführungsform weist die aktivierte Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die kürzere Abfallszeit auf 4 Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Testsatz, der eine der obigen Zusammensetzungen und ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares umfaßt.

BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen zur Verfügung, bei denen es sich um feste Materialien oder feste oder fluide Teilchen handelt, die einen Photosensibilisator und eine chemilumineszierende Verbindung umfassen. Die Bestrahlung dieser Zusammensetzungen kann eine verzögerte Lumineszenz liefern, wobei die Halbwertszeit des Lumineszenzabfalls durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt wird, einschließlich der Struktur der chemilumineszierenden Verbindung, der Zusammensetzung des festen Materials oder des Teilchens, der Temperatur und der Anwesenheit von Aktivatoren, die die Zersetzunggeschwindigkeit der Moleküle, gewöhnlich Dioxetane, vergrößern, welche nach Reaktion der chemilumines zierenden Verbindung mit Singulett-Sauerstoff erzeugt werden. Die Zusammensetzungen sind in der Lage zu lumineszieren, wenn sie beispielsweise in trockenem Zustand, an Zelloberflächen gebunden oder in einem anderen Medium, in dem sie stabil sind, vorliegen.
Die Zusammensetzungen können beispielsweise als sehr empfindliche Tracer verwendet werden, da sie zuerst aktiviert werden können und dann Sekunden oder Minuten nach der Aktivierung nachgewiesen werden können. Beispielsweise können die Zusammensetzungen verwendet werden, um Lecks in Fluidik-Systemen aufzuspüren, wenn sie in dem Fluid suspendiert werden, bei welchem es sich um eine Flüssigkeit oder um ein Gas handeln kann. Die Anwendung von Tracern, um Lecks nachzuweisen, ist im Stand der Technik wohlbekannt. Im allgemeinen werden etwa 10&supmin;¹&sup4; - 10&supmin;²% einer Zusammensetzung der Erfindung in der Flüssigkeit oder dem Gas dispergiert. Als nächstes wird das Fluid mit Licht bestrahlt, um den Photosensibilisator zu aktivieren, und dann läßt man das Fluid durch das System treten. In dieser Anwendung ist es wünschenswert, die Lumineszenz unter Verwendung einer der nachstehend beschriebenen Techniken zu verzögern. Das System wird bezüglich jeglicher Lumineszenz überprüft, die entweichen könnte, um zu bestimmen, ob irgendein Leck anwesend ist.
Die Zusammensetzungen können auch in der forensischen Kriminologie als Bestäubungspulver verwendet werden. Die Verwendung von Bestäubungspulvern für einen derartigen Zweck ist wohlbekannt und wird hier nicht beschrieben. Für diesen Zweck sollten die vorliegenden Zusammensetzungen teilchenförmig sein und einen Durchmesser von etwa 0,01 - 10 µm aufweisen. Die Konzentration von Photosensibilisator und chemilumineszierender Verbindung in dem Teilchen beträgt im allgemeinen etwa 10&supmin;&sup5; M bis 10&supmin;¹ M.
Beispiele für andere Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung werden nachstehend zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angegeben. Die Zusammensetzungen können mechanischen Teilen einverleibt werden, um die Abschätzung einer Abnutzung durch den Nachweis von abgeriebenem Material zu gestatten. Sie können auch als Lichtdosimeter oder Kalibriermittel für die Festkörperfluoreszenz verwendet werden. Wenn sie als Dosimeter verwendet werden, wird es häufig wünschenswert sein, daß das Dioxetan, das durch die Reaktion von Singulett-Sauerstoff mit der chemilumineszierenden Verbindung gebildet wird, ausreichend stabil ist, so daß die Lumineszenz nicht stattfindet, bis die Zusammensetzung erwärmt wird. Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung für diese Anwendungen in Form eines Filmes vor. Die Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um Lichtquellen und photometrische Vorrichtungen zu kalibrieren. Im allgemeinen können die teilchenförmigen Zusammensetzungen der Erfindung so gewählt werden, daß sie eine relativ lange Abfallszeit aufweisen, so daß diese Werte verwendet werden können, um ein Verhältnis zu schnelleren Abfallszeiten von anderen Materialien aufzustellen und eine Kalibrierung bei Lichtintensitätsmes sungen und Photoelektronenvervielfacher-Anwendungen bereitzustellen.
Die teilchenförmigen Zusammensetzungen der Erfindung finden spezielle Anwendung auf dem Gebiet der diagnostischen Assays, wo sie als Marker oder als Teil eines Marker-Reagenz verwendet werden können. Meistens wird die Zusammensetzung ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sBp) an ihre Oberfläche gebunden aufweisen. Das sBp- Mitglied kann sich an einen Analyten oder ein Molekül binden, dessen Anwesenheit die Anwesenheit eines Analyten anzeigt, um einen Komplex zu bilden. Der Komplex kann durch Bestrahlen des Markers und Überwachen des Lichtes, das anschließend emittiert wird, nachgewiesen werden. Die Assays können auf kompetitive oder Sandwich-Weise oder in Abwandlungen derselben durchgeführt werden.
Wenn an dem nachzuweisenden Molekül eine Zelle beteiligt ist, kann die Zelle mit einer teilchenförmigen Zusammensetzung der Erfindung markiert werden. Beispielsweise kann die Zusammensetzung der Erfindung ein sBp-Mitglied einschließen, das komplementär zu einem sBp-Mitglied auf der Oberfläche der Zelle ist. Die markierte Zelle wird bestrahlt und dann ohne zusätzliche Beleuchtung durch ein Mikroskop betrachtet. Als Ergebnis kann Hintergrundfluoreszenz, welche ein ernsthaftes Problem bei der Fluoreszenzmikroskopie darstellt, vermieden werden.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können für eine interne Kalibrierung bei Lumineszenz-Assays verwendet werden. Indem man Teilchen der Zusammensetzung in ein Assay-Medium einschließt, in welchem Lumineszenz durch Bestrahlung des Mediums erzeugt wird, erzeugt die Zusammensetzung eine Emission, die nachweisbar verschieden von der in dem Assay erzeugten sein kann. Dieser Unterschied kann das Ergebnis einer Emission bei unterschiedlicher Wellenlänge oder einer unterschiedlichen Abfallsgeschwindigkeit der Lumineszenz sein.
Beispielsweise wird in einem Fluoreszenz-Immunassay zuerst die Fluoreszenzintensität gemessen. Die Bestrahlung des Mediums wird unterbrochen, und Lumineszenz, die aus der Zusammensetzung der Erfindung hervorgeht, wird gemessen, um einen genauen internen Bezug zur Lichtintensität, Detektorempfindlichkeit und Probeneinwirkung bereitzustellen. Die Zusammensetzungen können auf ähnliche Weise für eine interne und externe Kalibrierung in den Assays verwendet werden, die in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0515194 (EP 515 194) beschrieben werden. In diesem Zusammenhang können, wie oben erwähnt, die teilchenförmigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung so gewählt werden, daß sie relativ lange Abfallszeiten aufweisen, wenn sie mit den Abfallszeiten der Materialien der EP 515 194 verglichen werden. Als Ergebnis können die vorliegenden teilchenförmigen Zusammensetzungen für eine interne Kalibrierung in Assays verwendet werden, die die Materialien der EP 515 194 verwenden. Ein Medium, daß sowohl die Materialien der EP 515 194 als auch die teilchenförmigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthält, kann bestrahlt werden, die Intensität des auf die Bestrahlung folgenden emittierten Lichts kann gemessen werden, man kann eine ausreichende Zeit verstreichen lassen, um einen teilweisen oder vollständigen Abfall der Emission aus den Materialien der EP 515 194 zu gestatten, das Medium kann dann gegebenenfalls wieder bestrahlt werden und die Lichtintensität kann wieder gemessen werden, und man kann die Emission abfallen lassen, und das Verfahren kann eine ausreichende Anzahl von Malen wiederholt werden, um die Verläßlichkeit der Messung zu maximieren. Nach dem Endzyklus kann die Intensität des Lichts, welches nun hauptsächlich aus der vorliegenden teilchenförmigen Zusammensetzung austritt, unabhängig gemessen werden, da die Abfallszeiten für die vorliegenden teilchenförmigen Zusammensetzungen viel länger sind. Die Restlichtintensität, die von den vorliegenden teilchenförmigen Zusammensetzungen im Verlauf der Bestrahlungszeiträume emittiert wird, ist proportional zur Bestrahlungslichtintensität mal der Bestrahlungszeit. Die vor dem Abfall gemessenen Lichtintensitäten der Emissionsmaterialien der EP 515 194 können ins Verhältnis zu der Restintensität der vorliegenden teilchenförmigen Zusammensetzungen gesetzt werden, um eine interne Kalibrierung bereitzustellen. Umgekehrt könnten die Abfallszeiten der vorliegenden Zusammensetzung kürzer sein als die Abfallszeiten der Zusammensetzung der EP 515 194, und das gleiche Verfahren könnte für eine Kalibrierung verwendet werden, außer daß die rasch abfallende Lichtintensität als Bezug dienen würde und die Restlichtintensität aus den Materialien der EP 515 194 stammen würde.
Die Lichtintensität kann in breitem Umfang variieren. Im allgemeinen gilt für rasch abfallende Spezies, bei denen eine Bestrahlung durchgeführt werden kann, bis ein stationärer Zustand erreicht ist, daß, je heller die Lichtquelle ist, desto mehr aktivierte Spezies in dem stationären Zustand anwesend ist und desto intensiver die anschließende Emission ist. Für langsam abfallende Zusammensetzungen gilt, daß, je länger der Bestrahlungszeitraum ist, desto mehr aktivierte Spezies akkumuliert wird und desto intensiver die Emission ist. In diesem Fall kann man Bestrahlungszeit und Lichtintensität aushandeln. In dem erstgenannten Fall ist die Lichtintensität kritisch. Die Bestrahlung kann über 1 Mikrosekunde bis 20 Minuten, vorzugsweise 0,1 bis 60 Sekunden, bevorzugter 0,1 bis 10 Sekunden, üblicherweise etwa 1 Sekunde, durchgeführt werden. Die Lichtquelle kann vielwellig sein, wird dann aber gefiltert, um kurzwelliges Licht abzuschneiden. Beispielsweise kann ein 650-Sperrfilter mit einer Wolfram-Halogenlampe (100 bis 1000 Watt) verwendet werden. Alternativ kann eine He/Ne-Laserquelle verwendet werden. Ein anderes Vorgehen beinhaltet die Verwendung einer LED, gewöhnlich 630 nm oder länger, mit 5 bis 100 mW Leistung. Die nachstehend in der Beschreibung beschriebenen Experimente verwenden ein 400 Watt-Halogenlampenlicht, das direkt durch eine Röhre in die Probe geleitet wird.
Ein Assay für einen Analyten kann bewerkstelligt werden, indem man eine als Marker verwendete teilchenförmige Zusammensetzung der Erfindung, an die ein Analyt oder ein sBp-Mitglied gebunden wurde, dessen Anwesenheit die Anwesenheit eines Analyten anzeigt, von ungebundener Zusammensetzung abtrennt. Es wird entweder die abgetrennte gebundene oder die ungebundene Fraktion behandelt, um den Photosensibilisator zu aktivieren, gewöhnlich durch Bestrahlung mit Licht, und die Fraktion wird dann auf Lumineszenz überprüft. Die Emission der chemilumineszierenden Verbindung kann durch einen Katalysator und/oder Energieakzeptor modifiziert werden, welcher in die Zusammensetzungen der Erfindung eingeschlossen werden kann. Der Energieakzeptor muß fluoreszierend sein und modifiziert gewöhnlich die Wellenlänge der Emission. Der Katalysator steigert gewöhnlich die Geschwindigkeit und/oder den Wirkungsgrad der Emission. Die fluoreszierenden und katalytischen Eigenschaften können in der gleichen Verbindung oder in gesonderten Verbindungen vorliegen, von denen eine oder beide in die Zusammensetzungen der Erfindung eingeschlossen werden können.
Der vorliegende Assay sorgt für ein bequemes Verfahren zum Nachweis und Messen einer breiten Vielfalt von Analyten auf einfache, effiziente, reproduzierbare Weise, bei welchem eine visuelle Beobachtung oder eine herkömmliche Ausrüstung zum Messen der Menge an während der Reaktion erzeugtem Licht verwendet werden kann.
Bevor weiter mit einer Beschreibung der speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, wird eine Anzahl von Ausdrücken definiert und in Einzelheit beschrieben.
Analyt -- die nachzuweisende Verbindung oder Zusammensetzung. Der Analyt kann ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sBp) umfassen, und es kann sich um einen Liganden handeln, der einwertig (monoepitop) oder mehrwertig (polyepitop) ist, gewöhnlich antigenisch oder haptenisch, und bei dem es sich um eine einzelne Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen handelt, die sich mindestens eine gemeinsame Epitopen- oder Determinantenstelle teilen. Der Analyt kann ein Teil einer Zelle, wie Bakterien, oder eine Zelle, die ein Blutgruppen-Antigen, wie A, B, D usw., oder ein HLA-Antigen trägt, oder ein Mikroorganismus, z.B. ein Bakterium, Fungus, Protozoon oder Virus, sein.
Bei den mehrwertigen Ligandenanalyten handelt es sich normalerweise um Poly(aminosäuren), d.h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und Kombinationen derselben. Derartige Kombinationen schließen Komponenten von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Zellkernen, Zellmembranen und dergleichen ein.
Meistens weisen die polyepitopen Ligandenanalyten, auf welche die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000, gewöhnlicher mindestens etwa 10000 auf. In der Poly(aminosäure)-Kategorie liegt das Molekulargewicht der interessierenden Poly(aminosäuren) im allgemeinen bei etwa 5000 bis 5000000, gewöhnlicher etwa 20000 bis 1000000; unter den interessierenden Hormonen liegt das Molekulargewicht bei etwa 5000 bis 60000.
Eine große Vielfalt von Proteinen kann in Betracht gezogen werden, wie beispielsweise die Familie der Proteine, die ähnliche strukturelle Merkmale aufweisen, Proteine, die spezielle biologische Funktionen aufweisen, Proteine, die mit speziellen Mikroorganismen in Beziehung stehen, insbesondere krankheitsverursachenden Mikroorganismen, usw. Derartige Proteine schließen beispielsweise Immunglobuline, Zytokine, Enzyme, Hormone, Krebs-Antigene, Nährstoffmarker, gewebespezifische Antigene usw. ein.
Das folgende sind Klassen von Proteinen, die durch die Struktur verwandt sind:
Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Scleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nudeoproteine, Glycoproteine, T-Zell-Rezeptoren, Proteoglycane, HLA, unklassifizierte Proteine (Z.B. Somatotropin, Prolactin, Insulin, Pepsin).
Eine Anzahl von Proteinen, die in menschlichem Plasma gefunden werden, sind klinisch wichtig und schließen ein:
Präalbumin, Albumin, α-Lipoprotein, α&sub1;-Antitrypsin, α&sub1;-Glycoprotein, Transcortin, 4.6S-Postalbumin, tryptophanarmes α&sub1;-Glycoprotein, a&sub1;X- Glycoprotein, Thyroxin-bindendes Globulin, Inter-α-Trypsin-Inhibitor, Gc- Globulin ((Gc 1-1), (Gc 2-1), (Gc 2-2)), Haptoglobin ((Hp 1-1), (Hp 2-1), (Hp 2-2)), Ceruloplasmin, Cholinesterase, α&sub2;-Lipoprotein(e), Myoglobin, C-reaktives Protein, α&sub2;-Makroglobulin, α&sub2;-HS-Glycoprotein, Zn-α&sub2;- Glycoprotein, α&sub2;-Neuraminoglycoprote in, Erythropoietin, β-Lipoprotein, Transferrin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen, β&sub2;-Glycoprotein I, β&sub2;- Glycoprotein II, Immunglobulin G (IgG) oder γG-Globulin, Mol.-Formel: γ2κ2 oder γ2λ2, Immunglobulin A (IgA) oder γA-Globulin, Mol.-Formel: (α&sub2;κ&sub2;)a oder (α&sub2;κ&sub2;)a, Immunglobulin M (IgM) oder γM-Globulin, Mol.-Formel: (µ&sub2;κ&sub2;)&sup5; oder (µ&sub2;λ&sub2;)&sup5;, Immunglobulin D (IgD) oder γD-Globulin (γD), Mol.-Formel: (δ&sub2;κ&sub2;) oder (δ&sub2;λ&sub2;), Immunglobulin E (IgE) oder γE-Globulin (γE), Mol.- Formel: (&epsi;&sub2;κ&sub2;) oder (&epsi;&sub2;λ&sub2;), freie leichte κ- und λ-Ketten, Komplement- Faktoren: C'1 (z.B. C'1q, C'1r, C'1s), C'2, C'3 (z.B. β&sub1;A, α&sub2;D), C'4, C'5,
Wichtige Blutgerinnungsfaktoren schließen ein:
Wichtige Proteinhormone schließen ein:

Peptid- und Proteinhormone

Parathyroid-Hormon (z.B. Parathormon), Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Eryhtropoietin, Melanotropin (z.B. Melanozytenstimulierendes Hormon; Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon), Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon), Thyrotropin, Follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon (interstitielles Zellstimulierendes Hormon), luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Prolactin), Gonadotropin (Choriongonadotropin)

Gewebehormone

Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin, menschliches Placenta-Lactogen Zytokine IL I; IL II; IL VI; EGF; TNF; NGF

Krebs-Antigene

PSA, CEA, α-Fetoprotein, saure Phosphatase, CA19.9, CA125

Gewebespezifische Antigene

alkalische Phosphatase, Myoglobin, CPK-MB, Calcitonin, basisches Myelinprotein

Peptidhormone aus der Neurohypophyse

Oxytocin, Vasopressin, Releasing-Faktoren (RF): CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF
Andere interessierende polymere Materialien sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.
Erläuternde Mikroorganismen schließen ein:
Corynebacteria
Corynebacterium diphtheriae
Pneumococci
Diplococcus pneumoniae
Streptococci
Streptococcus pyrogenes
Streptococcus salivarus
Staphylococci
Staphylococcus aureus
Staphylococcus albus
Neisseria
Neisseria meningitidis
Neisseria gonorrhea
Enterobacteriaciae
Escherichia coli
Aerobacter aerogenes Die coliformen
Klebsiella pneumoniae Bakterien
Salmonella typhosa
Salmonella choleraesuis Die Salmonellen
Salmonella typhimurium
Shigella dysenteria
Shigella schmitzii
Shigella arabinotarda
Die Shigellen
Shigella flexneri
Shigella boydii
Shigella sonnei
Andere enterische Bacilli
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis Proteus-Arten
Proteus morgani
Pseudomonas aeruginosa
Alcaligenes faecalis
Vibrio cholerae
Hämophilus-Bordetella-Gruppe Rhizopus oryzae
Haemophilus influenza, H. ducryi Rnizopus arrhizua
Phycomycetes
Haemophilus haemophilus Rhizopus nigricans
Haemophilus aegypticus Sporotrichum schenkii
Haemophilus parainfluenza Flonsecaea pedrosoi
Bordetella pertussis Fonsecacea compact
Pasteurellae Fonsecacea dermatidis
Pasteurella pestis Cladosporium carrionii
Pasteuralla tulareusis Phialophora verrucosa
Brucellae Aspergillus nidulans
Brucella melitensis Madurella mycetomi
Brucella abortus Madurella grisea
Brucella suis Allescheria boydii
Aerobe sporenbildende Bacilli Phialophora jeanselmei
Bacillus anthracis Microsporum gypseum
Bacillus subtilis Trichophyton mentagrophytes
Bacillus megatenum Keratinomyces ajelloi
Bacillus cereus Microsporum canis
Anaerobe sporenbildende Bacilli Trichophyton rubrum
Clostridium botulinum Microsporum adouini
Clostridium tetani Viren
Clostridium perfringens Adenoviren
Clostridium novyi Herpes-Viren
Clostridium septicum Herpes simplex
Clostridium histolyticum Varicella (Windpocken)
Clostridium tertium Herpes Zoster (Gürtelrose)
Clostridium bifermentans Virus B
Clostridium sporogenes Cytomegalovirus
Mycobacterien Pocken-Viren
Mycobacterium tuberculosis hominis Variola (Pocken)
Mycobacterium bovis Vaccinia
Mycobacterium avium Poxvirus bovis
Mycobacterium leprae Paravaccinia
Mycobacterium paratuberculosis Molluscum contagiosum
Actinomyzeten (pilzartige Bakterien) Picornaviren
Actinomyces isaeli Poliovirus
Actinomyces bovis Coxsackievirus
Actinomyces naeslundii Echoviren
Nocardia asteroides Rhinoviren
Nocardia brasiliensis Myxoviren
Die Spirochäten Influenza (A, B und C)
Treponema pallidum Spirillum minus Parainfluenza (1 - 4)
Treponema pertenue Streptobacillus Mumps-Virus
monoiliformis Newcastle-Disease-Virus
Treponema carateum Masern-Virus
Borrelia recurrentis Rinderpest-Virus
Leptospira icterohemorrhagiae Canine-Distemper-Virus
Leptospira canicola Respiratory-Syncytial-Virus
Trypan as omes Rubella-Virus
Mycoplasmen Arboviren
Mycoplasma pneumoniae
Andere Pathogene Eastern-Equine
Enzephalitis-Virus
Listeria monocytogenes Western-Equine--
Enzephalitis-Virus
Erysipelothrix rhusiopathiae Sindbis-Virus
Streptobacillus moniliformis chikugunya-Virus
Donvania granulomatis Semliki-Forest-Virus
Bartonella bacilliformis Mayora-Virus
Rickettsien (bakterienartige St. Louis-Enzephalitis--
Parasiten) Virus
Rickettsia prowazekii california-Enzephalitis--
Virus
Rickettsia moosen Colorado-Tick-Fever-Virus
Ricketts ia rickettsii Gelbfieber-Virus
Rickettsia conori Dengue-Virus
Rickettsia australis Reoviren
Rickettsia sibiricus Reoviren Typen 1 - 3
Retroviren
Rickettsia akan Human- Immunode ficiency--
Rickettsia tsutsugamushi Viren I und II (HIV)
Human-T-Cell-Lymphotrophic--
Virus I & II (HTLV)
Rickettsia burnetti Hepatitis
Ricketts ia quintana Hepatitis-A-Virus
Chlamydien (unklassifizierbare Hepatitis-B-Virus
Parasiten, bakteriell/viral) Hepatitis-C-Virus
Chlamydia-Agenzien
(Bennenung ungewiß) Tumur-Viren
Pilze Rauscher-Leukämie-Virus
Cryptococcus neoformans Gross-Virus
Blastomyces dermatidis Maloney-Leukämie-Virus
Hisoplasma capsulatum
Coccidioides immitis Menschliches Papilloma--
Virus
Paracoccidioides brasiliensis
Candida albicans
Aspergillus fumigatus
Mucor corymbifer (Absidia corymbifera)
Die monoepitopen Ligandenanalyten weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2000, gewöhnlicher von 125 bis 1000 auf. Die Analyten umfassen Arzneistoffe/Drogen, Metaboliten, Pestizide, umweltverschmutzende Stoffe und dergleichen. Unter den interessierenden Arzneistoffen/Drogen sind die Alkabide. Unter den Alkabiden befinden sich Morphinalkaloide, was Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan, deren Derivate und Metaboliten einschließt; Kokainalkabide, welche Kokain und Benzylecgonin einschließen, deren Derivate und Metaboliten; Ergotalkabide, welche das Diethylamid von Lysergsäure einschließen; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkabide; Isochinolinalkabide; Chinolinalkabide, welche Chinin und Chinidin einschließen; Diterpenalkabide, deren Derivate und Metaboliten.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen umfaßt Steroide, was die östrogene, Androgene, andrenokortikalen Steroide einschließt, Gallensäuren, kardiotonische Glycoside und Aglycone, was Digoxin und Digoxigenin einschließt, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metaboliten. Auch eingeschlossen sind die Steroid-mimetischen Substanzen, wie Diethylstilböstrol.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Lactame mit 5 bis 6 Ringgliedern, welche die Barbiturate, z.B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantonin, Primidon, Ethosuximid, und deren Metaboliten einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, was die Amphetamine; Catecholamine, einschließlich Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin; Narcein; Papaverin; und Metaboliten der obigen einschließt.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um benzheterocyclische Verbindungen, die Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, deren Derivate und Metaboliten einschließen, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Purine, was Theophyllin, Koffein, deren Metaboliten und Derivate einschließt.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt diejenigen ein, die von Marihuana abgeleitet sind, was Cannabinol und Tetrahydrocannabinol einschließt.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Hormone, wie Thyroxin, Cortisol, Triiodthyronin, Testosteron, Östradiol, Östron, Progesteron, Polypeptide, wie Angiotensin, LHRH, und immunsuppresive Substanzen, wie Cyclosporin, FK506, Mycophenolsäure, und dergleichen.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt die Vitamine ein, wie A, B, z.B. B12, C, D, E und K, Folsäure, Thiamin.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Prostaglandine, die sich durch den Grad und die Stellen der Hydroxylierung und Unsättigung unterscheiden.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um tricyclische Antidepressiva, welche Imipramin, Dismethylimipramin, Amitriptylin, Nortriptylin, Protriptylin, Trimipramin, Chlomipramin, Doxepin und Desmethyldoxepin einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um anti-neoplastische Wirkstoffe, welche Methotrexat einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Antibiotika, welche Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, die Metaboliten und Derivate einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Nudeoside und Nudeotide, welche ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit deren geeigneten Zucker- und Phosphat- Substituenten einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um verschiedene individuelle Arzneistoffe/Drogen, welche Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistamine, Chloramphenicol, anticholinerge Arzneistoffe/Drogen wie Atropin, deren Metaboliten und Derivate einschließen.
Metaboliten, die mit Krankheitszuständen in Beziehung stehen, schließen Spermin, Galactose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1 ein.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Aminoglycoside, wie Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
Unter den interessierenden Pestiziden befinden sich polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, deren Metaboliten und Derivate.
Bei Rezeptor-Analyten liegen die Molekulargewichte im allgemeinen im Bereich von 10000 bis 2 x 10&sup8;, gewöhnlicher von 10000 bis 10&sup6;. Bei Immunglobulinen, IgA, IgG, IgE und IgM, variieren die Molekulargewichte im allgemeinen von etwa 160000 bis etwa 10&sup6;. Enzyme weisen normalerweise ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 10000 bis 1000000 auf. Natürliche Rezeptoren variieren in weitem Bereich, wobei sie im allgemeinen ein Molekulargewicht von mindestens etwa 25000 aufweisen und ein Molekulargewicht von 10&sup6; oder höher aufweisen können, einschließlich solcher Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-bindenden Globulins, Thyroxin-bindenden Präalbumins, Transcortin usw.
Der Ausdruck Analyt schließt weiter Polynukleotid-Analyten, wie die nachstehend definierten Polynukleotide, ein. Diese schließen m-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA, DNA-RNA-Duplexe usw. ein. Der Ausdruck Analyt schließt auch Rezeptoren ein, die Polynukleotid-bindende Mittel sind, wie beispielsweise Restriktionsenzyme, Aktivatoren, Repressoren, Nukleasen, Polymerasen, Histone, Reparaturenzyme, chemotherapeutische Mittel und dergleichen.
Bei den Analyten kann es sich um ein Molekül handeln, das direkt in einer Probe, wie einem biologischen Gewebe, einschließlich Körperflüssigkeiten, von einem Wirt gefunden wird. Die Probe kann direkt überprüft werden oder sie kann vorbehandelt werden, um den Analyten leichter nachweisbar zu machen. Weiter kann der interessierende Analyt bestimmt werden, indem man ein Mittel nachweist, das als Sonde für den interessierenden Analyten dient, wie ein spezifisches Bindungspaar- Mitglied, das komplementär zu dem interessierenden Analyten ist, dessen Anwesenheit nur nachgewiesen wird, wenn der interessierende Analyt in einer Probe anwesend ist. Demgemäß wird das Mittel, das für den Analyten als Sonde dient, der Analyt, der in einem Assay nachgewiesen wird. Das biologische Gewebe schließt herausgeschnittenes Gewebe aus einem Organ oder anderen Körperteil eines Wirts und Körperflüssigkeiten, zum Beispiel Urin, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Samen, Stuhl, Sputum, zerebrospinale Flüssigkeit, Tränen, Schleim und dergleichen, ein.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sBp-Mitglied") -- eines von zwei unterschiedlichen Molekülen, welches auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung einen Bereich aufweist, der sich spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär mit demselben definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind gewöhnlich Mitglieder eines immunologischen Paares wie Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nucleinsäure- Duplexe, IgG-Protein A, Polynukleotid-bindende Mittel, Polynukleotid-Paare wie DNA-DNA, DNA-RNA und dergleichen, keine immunologischen Paare sind, aber in der Erfindung und der Definition von sBp-Mitglied eingeschlossen sind.
Polynukleotid -- ein Verbindung oder Zusammensetzung, bei der es sich um ein polymeres Nukleotid handelt, das im natürlichen Zustand etwa 50 bis 500000 oder mehr Nukleotide aufweist und im isolierten Zustand etwa 15 bis 50000 oder mehr Nukleotide, gewöhnlich etwa 15 bis 20000 Nukleotide, häufiger 15 bis 10000 Nukleotide, aufweist. Das Polynukleotid umfaßt Nucleinsäuren aus irgendeiner Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, natürlich vorkommend oder synthetisch erzeugt, einschließlich DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA, gewöhnlich DNA, und es kann sich dabei um t-RNA, m-RNA, r-RNA, mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und -RNA, DNA-RNA-Hybride oder Mischungen derselben, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material, wie Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schimmelpilzen, Fungi, Pflanzen, Tiere, Menschen und Fragmente derselben, und dergleichen handeln
Ligand -- irgendeine organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann.
Liganden-Analogon -- ein modifizierter Ligand, ein organischer Rest oder Analyten-Analogon, gewöhnlich mit einem Molekulargewicht von mehr als 100, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation ein Mittel bereitstellt, um ein Liganden-Analogon an ein anderes Molekül zu knüpfen. Das Liganden-Analogon unterscheidet sich gewöhnlich von dem Liganden um mehr als den Ersatz eines Wasserstoffs durch eine Bindung, welche das Liganden-Analogon an einen Aktivitätskern oder Marker knüpft, muß dies aber nicht. Das Liganden-Analogon kann sich auf ähnliche Weise wie der Ligand an den Rezeptor binden. Bei dem Analogon könnte es sich beispielsweise um einen Antikörper handeln, der gegen den Idiotyp eines Antikörpers gegen den Liganden gerichtet ist.
Rezeptor ("Antiligand") -- irgendeine Verbindung oder Zusammensetzung, die eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, z.B. eine Epitopen- oder Determinantenstelle, erkennen kann. Erläuternde Rezeptoren umfassen natürlich vorkommende Rezeptoren, z.B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nucleinsäuren, Protein A, die Komplement-Komponente Clq und dergleichen.
Spezifische Bindung -- das spezifische Erkennen des anderen Moleküls durch eines von zwei verschiedenen Molekülen, verglichen mit beträchtlich weniger Erkennen anderer Moleküle. Im allgemeinen weisen die Moleküle auf ihren Oberflächen oder in Vertiefungen Bereiche auf, die Anlaß zu einem spezifischen Erkennen zwischen den zwei Molekülen geben. Beispielhaft für die spezifische Bindung sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym- Substrat-Wechselwirkungen, Polynukleotid-Wechselwirkungen und so weiter.
Nicht-spezifische Bindung -- nicht-kovalente Bindung zwischen Molekülen, welche relativ unabhängig von speziellen Oberflächenstrukturen ist. Nicht-spezifische Bindung kann die Folge von mehreren Faktoren sein, einschließlich hydrophober Wechselwirkungen zwischen Molekülen.
Antikörper -- ein Immunglobulin, das sich spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls bindet und dadurch als zu diesem komplementär definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie die Immunisierung eines Wirts und das Sammeln von Serum (polyklonal) oder durch Herstellung kontinuierlicher Hybridzellinien und Sammeln des sezernierten Proteins (monoklonal) oder durch Klonieren und Exprimieren von Nukleotidsequenzen oder mutagenisierten Versionen derselben, die mindestens für die Aminosäuresequenzen kodieren, die für die spezifische Bindung von natürlichen Antikörpern erforderlich sind. Antikörper können ein vollständiges Immunglobulin oder ein Fragment desselben einschließen, wobei Immunglobuline die verschiedenen Klassen und Isotypen, wie IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3, IgM usw., einschließen. Fragmente derselben können Fab, Fv und F(ab')&sub2;, Fab' und dergleichen einschließen. Zusätzlich können gegebenenfalls Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen oder ihren Fragmenten verwendet werden, solange eine Bindungsaffinität zu einem speziellen Molekül beibehalten wird.
Antiserum, das Antikörper (polyklonal) enthält, wird durch gut eingeführte Techniken erhalten, welche die Immunisierung eines Tieres, wie eines Kaninchens, eines Meerschweinchens oder einer Ziege, mit einem geeigneten Immunogen und das Erhalten von Antiserum aus dem Blut des immunisierten Tieres nach einer angemessenen Wartezeit beinhalten. Übersichtsartikel des Standes der Technik sind bei Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., U.S., 1976), Butler, J., Immunol. Meth. 7: 1 - 24 (1975); Broughton und Strong, Clin. Chem. 22: 726 - 732 (1976); und Playfair et al., Br. Med. Bull. 30: 24 - 31 (1974) zu finden.
Antikörper können auch durch somatische Zellhybridisierungstechniken erhalten werden, wobei derartige Antikörper üblicherweise als monoklonale Antikörper bezeichnet werden. Monoklonale Antikörper können gemäß den Standardtechniken von Köhler und Milstein, Nature 265: 495 - 497, 1975, erzeugt werden. Übersichtsartikel für monoklonale Antikörper-Techniken werden in Lymphocyte Hybridomas, Herausgeber Melchers et al., Springer- Verlag (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980) und Methods of Enzymology 73 (Teil B): 3 - 46 (1981) gefunden. Proben eines geeigneten immunogenen Präparats werden in ein Tier, wie beispielsweise eine Maus, injiziert, und nach einer ausreichenden Zeit wird das Tier geopfert, und Milzzellen werden erhalten. Alternativ können die Milzzellen eines nicht-immunisierten Tieres gegen das Immunogen in vitro sensibilisiert werden. Die Milzzellenchromosomen, die für die Basensequenzen für die gewünschten Immunglobuline kodieren, können komprimiert werden, indem man die Milzzellen, im allgemeinen in Anwesenheit eines nicht-ionischen Detergens, beispielsweise Polyethylenglycol, mit einer Myelom-Zellinie fusioniert. Man läßt die resultierenden Zellen, die fusionierte Hybridome einschließen, in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium, wachsen, und die überlebenden immortalisierten Zellen werden in einem solchen Medium unter Verwendung von Grenzverdünnungsbedingungen gezüchtet. Die Zellen werden in einem geeigneten Behälter, z.B. in Mikrotiter-Vertiefungen, gezüchtet, und der Überstand wird bezüglich monoklonaler Antikörper durchmustert, welche die gewünschte Spezifität aufweisen.
Es gibt verschiedene Techniken zur Vergrößerung der Ausbeuten von monoklonalen Antikörpern, wie die Injektion der Hybridomzellen in die Peritonealhöhle eines Säugerwirts, der die Zellen aufnimmt, und das Ernten der Aszites-Flüssigkeit. Wenn sich eine unzureichende Menge des monoklonalen Antikörpers in der Aszites-Flüssigkeit ansammelt, wird der Antikörper aus dem Blut des Wirts geerntet. Alternativ kann die Zelle, die den gewünschten Antikörper erzeugt, in einer Hohlfaser- Zellkulturvorrichtung oder in einer Rotationskolben-Vorrichtung gezüchtet werden, welche beide im Stand der Technik wohlbekannt sind. Es gibt verschiedene herkömmliche Wege zur Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper von anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen (siehe Köhler und Milstein, oben).
Bei einer anderen Vorgehensweise für die Herstellung von Antikörpern kann die Sequenz, die für Antikörper-Bindungsstellen kodiert, aus der Chromosomen-DNA ausgeschnitten werden und in einen Klonierungsvektor eingeführt werden, welcher in Bakterien exprimiert werden kann, um rekombinante Proteine mit den entsprechenden Antikörper-Bindungsstellen zu erzeugen.
Im allgemeinen können Antikörper durch bekannte Techniken, wie Chromatographie, z.B. DEAE-Chromatographie, ABX-Chromatographie und dergleichen, Filtration usw., gereinigt werden.
Alkyl -- ein einwertiger verzweigter oder unverzweigter Rest, der von einem aliphatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung eines H-Atoms abgeleitet ist; umfaßt sowohl Niederalkyl als auch Höheralkyl.
Niederalkyl -- Alkyl, das 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl usw.
Höheralkyl -- Alkyl, das mehr als 6 Kohlenstoffatome enthält, gewöhnlich 6 bis 20 Kohlenstoffatome, wie beispielsweise Hexyl, Heptyl, Octyl usw.
Alkyliden -- ein zweiwertiger organischer Rest, der von einem aliphatischen Kohlenwasserstoff hergeleitet ist, wie beispielsweise Ethyliden, in welchem 2 Wasserstoffatome von demselben Kohlenstoffatom entfernt sind.
Aryl -- ein organischer Rest, der von einem aromatischen Kohlenwasserstoff durch die Entfernung eines Atoms abgeleitet ist und einen oder mehrere aromatische Ringe, gewöhnlich ein bis vier aromatische Ringe, enthält, wie beispielsweise Phenyl (aus Benzol), Naphthyl (aus Naphthalin) usw.
Aralkyl -- ein organischer Rest mit einer Alkylgruppe, an die eine Arylgruppe geknüpft ist, z.B. Benzyl, Phenethyl, 3-Phenylpropyl, 1- Naphthylethyl usw.
Alkoxy -- ein Alkylrest, der durch ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls geknüpft ist, z.B. Methoxy, Ethoxy usw.
Aryloxy -- ein Arylrest, der durch ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls geknüpft ist, z.B. Phenoxy, Naphthoxy usw.
Aralkoxy -- ein Aralkylrest, der durch ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls geknüpft ist, z.B. Benzoxy, 1-Naphthylethoxy usw.
Substituiert -- bedeutet, daß ein Wasserstoffatom eines Moleküls durch ein anderes Atom ersetzt worden ist, bei dem es sich um ein einziges Atom, wie ein Halogen usw., oder einen Teil einer Gruppe von Atomen handelt, die eine Funktionalität bilden, wie beispielsweise ein Substituent mit 1 bis 50 Atomen (außer den erforderlichen Wasserstoffatomen, die notwendig sind, um die Valenzen derartiger Atome zu sättigen), wobei die Atome unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Halogen (Chlor, Brom, bd, Fluor) und Phosphor besteht, und die an ein oder mehrere Metallatome gebunden sein können oder auch nicht.
Alkylthio -- ein Alkylrest, der durch ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z.B. Methylthio, Ethylthio usw.
Arylthio -- ein Arylrest, der durch ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls geknüpft ist, z.B. Phenylthio, Naphthylthio usw.
Elektronendonor-Gruppe -- ein Substituent, der, wenn er an ein Molekül gebunden ist, in der Lage ist, das Molekül zu polarisieren, so daß die Elektronendonor-Gruppe elektronenarm wird und relativ zu einem anderen Teil des Moleküls positiv geladen wird, d.h. eine verringerte Elektronendichte aufweist. Bei derartigen Gruppen kann es sich auf erläuternde und nicht-beschränkende Weise um Amine, Ether, Thioether, Phosphine, Hydroxy, Oxyanionen, Mercaptane und deren Anionen, Sulfide usw. handeln.
Ein Substituent mit 1 bis 50 Atomen (außer den erforderlichen Wasserstoffatomen, die notwendig sind, um die Valenzen derartiger Atome zu sättigen), wobei die Atome unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Halogen und Phosphor besteht -- ein organischer Rest; der organische Rest weist 1 bis 50 Atome außer der erforderlichen Anzahl von Wasserstoffatomen auf, welche notwendig ist, um die Valenzen der Atome in dem Rest abzusättigen. Im allgemeinen ist das vorwiegende Atom Kohlenstoff (C), kann aber auch Sauerstoff (O), Stickstoff (N), Schwefel (S), Phosphor (P) sein, wobei das O, N, S oder P, falls anwesend, an Kohlenstoff oder an eines oder mehrere untereinander oder an Wasserstoff oder an ein Metallatom gebunden ist, um verschiedene funktionelle Gruppen zu bilden, wie beispielsweise Carbonsäuren, Alkohole, Thiole, Carboxamide, Carbamate, Carbonsäureester, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Phosphorsäuren, Phosphorsäureester, Hamstoffe, Carbamate, Phosphoramide, Sulfonamide, Ether, Sulfide, Thioether, Olefine, Acetylene, Amine, Ketone, Aldehyde, Nitrile und dergleichen. Erläuternd für derartige organische Reste oder Gruppen sind, auf erläuternde und nicht-beschränkende Weise, Alkyl, Alkyliden, Aryl, Aralkyl und Alkyl, Aryl und Aralkyl, das mit einer oder mehreren der oben erwähnten Funktionalitäten substituiert ist.
Verknüpfende Gruppe -- die kovalente Verknüpfung zwischen Molekülen. Die verknüpfende Gruppe variiert abhängig von der Natur der angeknüpften Moleküle, d.h. des Photosensibilisators, der chemilumineszierenden Verbindung, des sBp-Mitglieds oder Mokeküls, das mit einem Teilchen assoziiert ist oder ein Teil desselben ist. Funktionelle Gruppen, die normalerweise bei einem Photosensibilisator oder einer chemilumineszierenden Verbindung vorliegen oder in diese eingeführt werden, werden zum Verknüpfen dieser Materialien mit einem sBp-Mitglied oder einem Teilchen, wie einer lipophilen Komponente eines Liposoms oder einem Öltröpfchen, Latexteilchen, Siliconteilchen, Metallsol oder Farbstoff-Kristallit, verwendet.
Meistens werden Carbonyl-Funktionalitäten, sowohl Oxocarbonyl, z B. Aldehyd, als auch Nicht-Oxocarbonyl (einschließlich Stickstoff- und Schwefel-Analoga), z.B. Carboxy, Amidin, Amidat, Thiocarboxy und Thionocarboxy, Verwendung finden.
Alternative Funktionalitäten für Oxo schließen aktives Halogen, Diazo, Mercapto, Olefin, insbesondere aktiviertes Olefin, Amino, Phosphoro und dergleichen ein. Eine Beschreibung von verknüpfenden Gruppen kann im US-Patent Nr. 3,817,837 gefunden werden, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Die verknüpfenden Gruppen können von einer Bindung bis zu einer Kette von 1 bis 100 Atomen, gewöhnlich etwa 1 bis 70 Atomen, vorzugsweise 1 bis 50 Atomen, bevorzugter 1 bis 20 Atomen, variieren, wobei jedes unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die normalerweise aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Halogen und Phosphor besteht. Die Zahl der Heteroatome in der verknüpfenden Gruppe liegt normalerweise im Bereich von etwa 0 bis 20, gewöhnlich von etwa 1 bis 15, bevorzugter von 2 bis 6. Die Atome in der Kette können mit von Wasserstoff verschiedenen Atomen substituiert sein, auf ähnliche Weise wie diejenige, die für die Substituenten mit 1 bis 50 Atomen beschrieben worden ist. Als allgemeine Regel kann die Länge einer speziellen verknüpfenden Gruppe willkürlich ausgewählt werden, um für eine bequeme Synthese und den Einbau irgendeiner gewünschten Gruppe, wie eines Energieakzeptors, Fluorophors, einer Gruppe für die Analyse einer Interkombination, wie eines Schweratoms, und dergleichen zu sorgen. Die verknüpfenden Gruppen können aliphatisch oder aromatisch sein, obwohl bei Diazogruppen gewöhnlich aromatische Gruppen beteiligt sein werden.
Wenn Heteroatome anwesend sind, ist Sauerstoff normalerweise als Oxo oder Oxy, gebunden an Kohlenstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor, anwesend, Stickstoff ist normalerweise als Nitro, Nitroso oder Amino, normalerweise an Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel oder Phosphor gebunden, anwesend; Schwefel wäre analog zu Sauerstoff; während Phosphor an Kohlenstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Stickstoff gebunden sein wird, gewöhnlich als Phosphonat und Phosphatmono- oder -diester.
Übliche Funktionalitäten bei der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der verknüpfenden Gruppe und dem zu konjugierenden Molekül sind Alkylamin, Amidin, Thioamid, Ether, Harnstoff, Thioharnstoff, Guanidin, Azo, Thioether und Carboxylat-, Sulfonat- und Phosphatester, -amide und -thioester
Wenn eine verknüpfende Gruppe an den Photosensibilisator gebunden ist, weist die photochemisch aktivierbare chemilumineszierende Verbindung oder eine teilchenförmige Zusammensetzung der Erfindung meistens eine Nicht-Oxocarbonylgruppe, einschließlich Stickstoff- und Schwefel-Analoga, eine Phosphatgruppe, eine Aminogruppe, ein Alkylierungsmittel, wie Halogen oder Tosylalkyl, Oxy (Hydroxyl oder das Schwefel-Analogon, Mercapto), Oxocarbonyl (z.B. Aldehyd oder Keton) oder ein aktives Olefin, wie ein Vinylsulfon oder einen α,β-ungesättigten Ester, auf. Diese Funktionalitäten werden an Amingruppen, Carboxylgruppen, aktive Olefine, Alkylierungsmittel, z.B. Bromacetyl, geknüpft. Wenn ein Amin und eine Carbonsäure oder deren Stickstoff-Derivat oder eine Posphorsäure verknüpft werden, werden Amide, Amidine und Phosphoramide gebildet. Wenn Mercaptan und aktiviertes Olefin verknüpft werden, werden Thioether gebildet. Wenn ein Mercaptan und ein Alkylierungsmittel verknüpft werden, werden Thioether gebildet. Wenn Aldehyd und ein Amin unter reduzierenden Bedingungen verknüpft werden, wird ein Alkylamin gebildet. Wenn eine Carbonsäure oder Phosphatsäure und ein Alkohol verknüpft werden, werden Ester gebildet.
Eine Gruppe oder Funktionalität, die Hydrophilie oder Wasserlöslichkeit verleiht -- ist eine hydrophile Funktionalität, die die Benetzbarkeit von Feststoffen mit Wasser und die Löslichkeit von Verbindungen, an die sie gebunden ist, in Wasser erhöht. Eine derartige funktionelle Gruppe oder Funktionalität kann ein Substituent mit 1 bis 50 oder mehr Atomen sein und kann ein Sulfonat, Sulfat, Phosphat, Amidin, Phosphonat, Carboxylat, Hydroxyl, insbesondere Polyole, Amin, Ether, Amid und dergleichen einschließen. Erläuternde funktionelle Gruppen sind Carboxyalkyl, Sulfonoxyalkyl, CONHOCH&sub2;COOH, CO-(Glucosamin), Zucker, Dextran, Cyclodextrin, SO&sub2;NHCH&sub2;COOH, SO&sub3;H, CONHCH&sub2;CH&sub2;SO&sub3;H, PO&sub3;H&sub2;, OPO&sub3;H&sub2;, Hydroxyl, Carboxyl, Keton und Kombinationen derselben. Die meisten der obigen Funktionalitäten können auch als anknüpfende Gruppen verwendet werden, welche die Anknüpfung eines sBp-Mitglieds an eine teilchenförmige Zusammensetzung gestatten, die den Photosensibilisator und die chemilumines zierende Verbindung umfaßt.
Eine Gruppe oder Funktionalität, die Lipophilie oder Lipidlöslichkeit verleiht -- ist eine lipophile Funktionalität, die die Benetzbarkeit von Oberflächen durch Wasser und die Löslichkeit von Verbindungen, an die sie gebunden ist, in Wasser verringert. Eine derartige funktionelle Gruppe oder Funktionalität kann 1 bis 50 oder mehr Atome enthalten, gewöhnlich Kohlenstoffatome, die mit Wasserstoff oder Halogen substituiert sind, und sie kann Alkyl, Alkyliden, Aryl und Aralkyl einschließen. Die lipophile Gruppe oder Funktionalität weist normalerweise 1 bis 6 gerad- oder verzweigtkettige aliphatische Gruppen mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, gewöhnlicher mindestens 10 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mindestens 12 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich nicht mehr als 30 Kohlenstoffatomen, auf. Die aliphatische Gruppe kann an Ringe mit 5 bis 6 Gliedern gebunden sein, welche alicyclisch, heterocyclisch oder aromatisch sein können. Lipophile Gruppen können an Photosensibilisatoren oder chemilumineszierende Verbindungen gebunden sein, um deren Löslichkeit in einer nicht-wäßrigen Matrix zu steigern.
Photosensibilisator -- eine Sensibilisator zur Erzeugung von Singulett-Sauerstoff, gewöhnlich durch Anregung mit Licht. Üblicherweise absorbiert der Photosensibilisator bei einer längeren Wellenlänge als die chemilumineszierende Verbindung und weist ein Triplett mit niedrigerer Energie als die chemilumineszierende Verbindung auf, obwohl keines der beiden für die erfolgreiche Durchführung der vorliegenden Erfindung kritisch ist. Der Photosensibilisator kann photoaktivierbar sein (ZcB. Farbstoffe und aromatische Verbindungen). Der Photosensibilisator ist gewöhnlich eine Verbindung, die kovalent gebundene Atome, gewöhnlich mit mehreren konjugierten Doppel- oder Dreifachbindungen, umfaßt. Die Verbindung sollte Licht im Wellenlängenbereich von 200 - 1100 nm, gewöhnlich 300 - 1000 nm, vorzugsweise 450 - 950 nm, mit einem Extinktionskoeffizienten an ihrem Absorbanz-Maximum von mehr als 500 M&supmin;¹ cm&supmin;¹, vorzugsweise mindestens 5000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹, bevorzugter mindestens 50000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹, bei der Anregungswellenlänge absorbieren. Die Halbwertszeit eines angeregten Zustandes, der nach der Absorption von Licht in Abwesenheit von Sauerstoff erzeugt wird, beträgt gewöhnlich mindestens 100 ns, vorzugsweise mindestens 1 ms. Im allgemeinen muß die Halbwertszeit hinreichend lang sein, um eine Energieübertragung auf Sauerstoff zu gestatten, welcher normalerweise bei Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;³ M, abhängig vom Medium, anwesend ist. Der angeregte Photosensibilisator-Zustand weist gewöhnlich eine andere Spinquantenzahl (S) auf als sein Grundzustand und ist gewöhnlich ein Triplett (S = 1), wenn, wie es gewöhnlich der Fall ist, der Grundzustand ein Singulett (S = 0) ist. Vorzugsweise weist der Photosensibilisator eine hohe Zwischensystemübergangs-Ausbeute auf. Das heißt, die Lichtanregung eines Photosensibilisators erzeugt den langlebigen Zustand (gewöhnlich Triplett) mit einem Wirkungsgrad von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 40%, vorzugsweise mehr als 80%. Der angeregte Zustand weist gewöhnlich eine Energie relativ zum Grundzustand von mindestens 20 kcal/Mol, vorzugsweise mindestens 22 kcal/Mol und gewöhnlich weniger als etwa 65 kcal/Mol auf, obwohl höhere Energien verwendet werden können. Der Photosensibilisator ist gewöhnlich unter den Assay-Bedingungen höchstens schwach fluoreszierend (Quantenausbeute von gewöhnlich weniger als 0,5, vorzugsweise weniger als 0,1).
Photosensibilisatoren, die mit Licht angeregt werden müssen, sind relativ lichtstabil und reagieren nicht auf effiziente Weise chemisch mit Singulett-Sauerstoff. Mehrere Strukturmerkmale liegen in den meisten nützlichen Photosensibilisatoren vor. Die meisten Photosensibilisatoren weisen mindestens eine und häufig drei oder mehr konjugierte Doppel- oder Dreifachbindungen auf, die in einer starren, häufig aromatischen Struktur gehalten werden. Sie enthalten häufig mindestens eine Gruppe, die einen Zwischensystemübergang beschleunigt, wie beispielsweise eine Carbonyl- oder Imingruppe oder ein Schweratom, das aus den Reihen 3 - 6 des Periodensystems ausgewählt ist, insbesondere bd oder Brom, oder sie können ausgedehnte aromatische Strukturen aufweisen. Typische Photosensibilisatoren umfassen Aceton, Benzophenon, 9-Thioxanthon, Eosin, 9,10-Dibromanthracen, Methylenblau, Porphyrine, Metalloporphyrine, wie Hämatoporphyrin, Phthalocyanine, Chlorophylle, Diodeosin, Buckminsterfulleren usw. und Derivate dieser Verbindungen mit Substituenten mit 1 bis 50 Atomen, um derartige Verbindungen lipophiler oder hydrophiler zu machen und/oder als Anknüpfungsgruppen für die Anknüpfung von beispielsweise einem sBp-Mitglied. Bevorzugte Photosensibilisatoren sind Farbstoffe, wie Methylenblau, Porphyrine, Phthalocyanine, Chlorophylle und Diodeosin. Beispiele für andere Photosensibilisatoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind diejenigen, welche die obigen Eigenschaften aufweisen und bei N. J. Turro, "Molecular Photochemistry", Seite 132, W. A. Benjamin Inc., N.Y., 1965, aufgezählt sind.
Die Photosensibilisatoren sind vorzugsweise relativ unpolar, um eine Auflösung in einem liphophilen Teil sicherzustellen, wenn der Photosensibilisator einem Öltröpfchen, Liposom, Latex-Teilchen usw. einverleibt wird.
Der Photosensibilisator unterstützt eine Photoaktivierung, bei der die Aktivierung durch Singulett-Sauerstoff stattfindet. Gewöhnlich absorbiert der Photosensibilisator Licht, und der so gebildete angeregte Photosensibilisator aktiviert Sauerstoff, um Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, welcher mit der chemilumineszierenden Verbindung reagiert, um ein metastabiles lumineszierendes Zwischenprodukt zu ergeben. Wünschenswerterweise ist keine Zugabe von chemischen Reagenzien erforderlich, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu aktivieren, und der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung werden innerhalb einer Zusammensetzung gefunden.
Ein Photosensibilisator kann in einer Anzahl von verschiedenen Vorgehensweisen verwendet werden, um Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, welcher die chemilumineszierende Verbindung aktiviert. Der Photosensibilisator kann in einem Teilchen gelöst oder daran gebunden werden, welches weiter an ein sBp-Mitglied gebunden sein kann. Im allgemeinen ist die Menge an verwendetem Photosensibilisator ausreichend, um eine Konzentration an Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, die eine Aktivierung der chemilumineszierenden Verbindung zur Folge hat.
Feste Matrix -- ein Träger oder eine Oberfläche, der bzw. die ein poröses oder nicht-poröses wasserunlösliches Material umfaßt. Die Oberfläche kann irgendeine einer Anzahl von Formen aufweisen, wie ein Streifen, ein Stab, ein Teilchen, einschließlich Perlen, und dergleichen. Die Oberfläche kann hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden und schließt anorganische Pulver, wie Siliciumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, insbesondere cellulosische Materialien und Materialien, die von Cellulose abstammen, wie Faserhaltige Papiere, z.B. Filterpapier, Chromatographiepapier usw.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) usw.; entweder als solche oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet; Glas, das als Bioglass erhältlich ist, Keramiken, Metalle und dergleichen ein.
Die Bindung von sBp-Mitgliedern an den Träger oder die Oberfläche kann durch wohlbekannte Techniken bewerkstelligt werden, welche in der Literatur verfügbar sind. Siehe zum Beispiel "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halstead Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245: 3059 (1970).
Die Oberfläche ist im allgemeinen polyfunktionell oder kann polyfunktionalisiert werden oder kann durch spezifische oder nichtspezifische kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen ein Oligonukleotid, ein sBp-Mitglied, einen Photosensibilisator und/oder eine photochemisch aktivierbare chemilumineszierende Verbindung binden. Eine breite Vielfalt von funktionellen Gruppen sind verfügbar oder können einverleibt werden. Funktionelle Gruppen schließen Carbonsäuren, Aldehyde, Amino gruppen, Cyano gruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen ein. Die Art der Verknüpfung einer breiten Vielfalt von Verbindungen an Oberflächen ist wohlbekannt und umfangreich in der Literatur erläutert. Siehe zum Beispiel Cautrecasas, J. Biol. Chem., 245: 3059 (1970). Die Länge einer das Oligonukleotid oder sBp- Mitglied anknüpfenden Gruppe kann in breitem Maß variieren, abhängig von der Natur der Verbindung, die angeknüpft wird, der Auswirkung der Entfernung zwischen der Verbindung, die angeknüpft wird, und der Oberfläche auf die spezifischen Bindungseigenschaften und dergleichen.
Teilchen -- Teilchen von mindestens etwa 20 nm und nicht mehr als etwa 20 µm, gewöhnlich mindestens etwa 40 nm und weniger als etwa 10 µm, vorzugsweise etwa 0,10 bis 2,0 µm Durchmesser, normalerweise mit einem Volumen von weniger als 1 Picoliter. Das Teilchen kann organisch oder anorganisch, quellbar oder nicht-quellbar, porös oder nicht-porös, fest oder fluide sein, mit irgendeiner Dichte, aber bevorzugt einer Dichte, die der von Wasser nahe kommt, im allgemeinen etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml, vorzugsweise in Wasser suspendierbar und aus Material zusammengesetzt, das transparent, teilweise transparent oder opak sein kann. Die Teilchen können eine Ladung aufweisen oder nicht, und wenn sie geladen sind, sind sie vorzugsweise negativ. Bei den Teilchen kann es sich um einen Feststoff (z.B. Polymer, Metall, Glas, organisch oder anorganisch, wie Mineralien, Salze und Diatomeene), Öltröpfchen (z.B. Kohlenwasserstoff, Fluorkohlenstoff, Silicon-Fluid) oder Vesikel (z.B. synthetische, wie Phospholipid, oder natürliche, wie Zellen und Organellen) handeln. Bei den Teilchen kann es sich um Latex-Teilchen oder andere Teilchen, die aus organischen oder anorganischen Polymeren zusammengesetzt sind; Lipid-Doppelschichten, z.B. Liposomen, Phospholipid-Vesikel; Öltröpfchen; Silicon-Teilchen; Metallsole; Zellen; Polysaccharide; Hydrogele; vernetzte Proteine; Diatomeene; und Farbstoff-Kristallite handeln.
Die organischen Teilchen sind normalerweise Polymere, entweder Additions- oder Kondensationspolymere, die leicht in dem Assaymedium dispergierbar sind. Die organischen Teilchen sind auch so adsorbierend oder funktionalisierbar, daß sie entweder direkt oder indirekt ein sBp- Mitglied an ihrer Oberfläche binden und einen Photosensibilisator oder eine photochemisch aktivierbare chemilumineszierende Verbindung an ihrer Oberfläche binden oder in ihrem Volumen einverleiben.
Die Teilchen können von natürlich vorkommenden Materialien, natürlich vorkommenden Materialien, die synthetisch modifiziert sind, und synthetischen Materialien abgeleitet sein. Natürliche oder synthetische Zusammenstellungen, wie Lipid-Doppelschichten, z.B. Liposomen, und Nicht- Phospholipid-Vesikel werden bevorzugt. Unter den organischen Polymeren von besonderem Interesse befinden sich Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide, wie Agarose, die als Sepharose erhältlich ist, Dextran, das als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose, Stärke und dergleichen; Additionspolymere, wie Polystyrol, Polyacrylamid, Homopolymere und Copolymere von Derivaten von Acrylat und Methacrylat, insbesondere Ester und Amide mit freien Hydroxyl-Funktionalitäten, einschließlich Hydrogelen, und dergleichen. Anorganische Polymere umfassen Silicone, Gläser, erhältlich als Bioglas, und dergleichen. Sole schließen Gold, Silber, Selen und andere Metalle ein. Bei Teilchen kann es sich auch um dispergierte, wasserunlösliche Farbstoffe, wie Porphyrine, Phthalocyanine usw. handeln, welche auch als Photosensibilisatoren wirken können. Teilchen können auch Diatomeene, Zellen, virale Teilchen, Magnetosome, Zellkerne und dergleichen einschließen.
Wenn die Teilchen im Handel erhältlich sind, kann die Teilchengröße abgewandelt werden, indem man größere Teilchen durch mechanische Mittel, wie Mahlen, Beschallung, heftiges Rühren usw., zu kleineren Teilchen aufbricht.
Die Teilchen sind gewöhnlich polyfunktionell oder können polyfunktionalisiert werden oder können durch spezifische oder nichtspezifische kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen an ein sBp- Mitglied gebunden und/oder an einen Photosensibilisator und/oder eine chemilumineszierende Verbindung gebunden werden. Eine große Vielfalt von funktionellen Gruppen ist verfügbar oder kann einverleibt werden. Beispielhafte funktionelle Gruppen umfassen Carbonsäuren, Aldehyde, Amino gruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen. Wenn eine kovalente Anknüpfung eines sBp- Mitglieds, einer chemilumineszierenden Verbindung oder eines Photosensibilisators an das Teilchen verwendet wird, ist die Weise der Verknüpfung wohlbekannt und umfangreich in der Literatur erläutert. Siehe zum Beispiel Cautrecasas, J. Biol. Chem., 245: 3059 (1970). Die Länge einer veknüpfenden Gruppe kann in breitem Umfang schwanken, abhängig von der Natur der verknüpften Verbindung, der Natur der Teilchen, der Wirkung der Entfernung zwischen der Verbindung, die angeknüpft wird, und dem Teilchen auf die Bindung von sBp-Mitgliedern und dem Analyten und dergleichen.
Wenn der Photosensibilisator und/oder die photoaktivierbare chemilumineszierende Verbindung nicht kovalent an das Teilchen gebunden werden, können sie so gewählt werden, daß sie sich in den Teilchen lösen oder nicht-kovalent an die Oberfläche derselben binden. In diesem Fall sind diese Verbindungen vorzugsweise hydrophob, so daß ihre Fähigkeit verringert wird, von dem Teilchen abzudissozueren. Im allgemeinen wird die Teilchenzusammensetzung so gewählt, daß sie die Assoziation des Photosensibilisators und der chemilumineszierenden Verbindung mit dem Teilchen begünstigt.
Die Zahl der Photosensibilisator-Moleküle oder der Moleküle der photoaktivierbaren chemilumineszierenden Verbindung, die mit einem Teilchen assoziiert ist, beträgt durchschnittlich gewöhnlich mindestens eins und kann ausreichend hoch sein, damit das Teilchen gänzlich aus Photosensibilisator-Molekülen und Molekülen der photochemisch aktivierbaren chemilumineszierenden Verbindung besteht. Die bevorzugte Zahl der Moleküle wird empirisch ausgewählt, um bei der speziellen Verwendung, wie einem Assay, für das höchste Signal gegenüber dem Hintergrund zu sorgen. In einigen Fällen wird dies am besten erreicht, indem man eine Vielheit von verschiedenen Photosensibilisator-Molekülen mit Teilchen assoziiert, oder es kann eine Vielheit gleicher oder verschiedener fluoreszierender Farbstoff-Moleküle, die Energie auf einen Photosensibilisator übertragen können, den Teilchen einverleibt werden, um Lichtenergie zu sammeln und sie an Photosensibilisator-Moleküle zu übertragen. Gewöhnlich sollte das Verhältnis Photosensibilisator oder photoaktivierbare chemilumineszierende Verbindung zu sBp-Mitlied in den Teilchen mindestens 0,1, vorzugsweise mindestens 10 und am bevorzugtesten über 100 zu 1 sein.
Öltröpfchen -- sind Fluid-Teilchen, die aus einer lipophilen Verbindung zusammengesetzt sind, welche mit einem Emulgator beschichtet und stabilisiert ist, bei dem es sich um ein amphiphiles Molekül handelt, wie beispielsweise Phospholipide, Sphingomyelin, Albumin und dergleichen.
Die Phospholipide beruhen auf aliphatischen Carbonsäureestern von aliphatischen Polyolen, in denen mindestens eine hydroxylische Gruppe mit einem Carbonsäureester mit etwa 8 bis 36, gewöhnlicher etwa 10 bis 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist, welche 0 bis 3 Stellen, gewöhnlicher 0 bis 1 Stelle ethylenische Unsättigung und mindestens 1, normalerweise nur 1 Hydroxylgruppe aufweisen, die mit Phosphat substituiert ist, um einen Phosphatester zu bilden. Die Phosphatgruppe kann weiter mit kleinen aliphatischen Verbindungen substituiert sein, die von Di- oder höherer Funktionalität sind und im allgemeinen Hydroxyl- oder Aminogruppen aufweisen.
Die Öltröpfchen können gemäß üblicher Verfahren hergestellt werden, indem man die geeigneten lipophilen Verbindungen mit einem anionischen, kationischen oder nicht-ionischen Tensid vereinigt, wobei das Tensid zu etwa 0,1 bis 5, gewöhnlicher etwa 0,1 bis 2 Gewichtsprozent der Mischung vorliegt, und die Mischung in einem wäßrigen Medium einer heftigen Bewegung, wie Beschallung oder einem Wirbeln, unterzieht. Erläuternde lipophile Verbindungen schließen Kohlenwasserstofföle, Halogenkohlenstoffe, einschließlich Fluorkohlenstoffen, Alkylphthalate, Trialkylphosphate, Triglyceride usw. ein.
Gewöhnlich ist ein sBp-Mitglied an der Oberfläche des Öltröpfchens adsorbiert oder direkt oder indirekt an eine Oberflächen-Komponente des Öltröpfchens gebunden. Das sBp-Mitglied kann den flüssigen Teilchen entweder während oder nach der Herstellung der flüssigen Teilchen einverleibt werden. Das sBp-Mitglied liegt normalerweise zu etwa 0,5 bis 100, gewöhnlicher 1 bis 90, häufig etwa 5 bis 80 und vorzugsweise etwa 50 bis 100 Molprozent der Moleküle vor, die auf der Oberfläche des Teilchens anwesend sind.
Das folgende ist eine erläuternde und nicht-beschränkende Liste von amphiphilen Verbindungen, die zur Stabilisierung der Öltröpfchen verwendet werden können: Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidinsäure, Cardiolipin, Lecithin, Galactocerebrosid, Sphingomyelin, Dicetylphosphat, Phosphatidylinosit, 2- Trihexadecylammoniumethylamin, 1,3-Bis(octadecylphosphat)propanol, Stearoyloxyethylenphosphat, Phospholipide, Dialkylphosphate, Natriumdodecylsulfat, kationische Detergenzien, anionische Detergenzien, Proteine wie Albumin, nicht-ionische Detergenzien usw.
Es können ebenfalls anderen Verbindungen verwendet werden, welche lipophile Gruppen aufweisen und vorstehend beschrieben worden sind. Meistens handelt es sich bei diesen Verbindungen um Alkylbenzole, die Alkylgruppen mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich Mischungen von Alkylgruppen, die gerad- oder verzweigtkettig sein können, aufweisen und eine Carboxylgruppe, eine hydroxylische Gruppe, eine Polyoxyalkylengruppe (Alkylen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen), carboxylische Gruppe, Sulfonsäuregruppe oder Aminogruppe aufweisen. Aliphatische Fettsäuren können verwendet werden, welche normalerweise etwa 10 bis 36, gewöhnlicher etwa 12 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen. Auch Fettalkohole mit den Kohlenstoffgrenzen, die für Fettsäuren angegeben wurden, Fettamine mit ähnlichen Kohlenstoffbegrenzungen und verschiedene Steroide können ebenfalls Verwendung finden.
Die Öltröpfchen können ein Fluorkohlenstofföl oder ein Siliconöl (Silicon-Teilchen) umfassen. Derartige Tröpfchen werden von Giaever in den US-Patenten Nr. 4,634,681 und 4,619,904 beschrieben. Giaever beschreibt auch die Herstellung von Tröpfchen und die Weise, in der sBp-Mitglieder an die Tröpfchen gebunden werden können. Andere Öltröpfchen, die von Giaever beschrieben werden, finden ebenfalls in der vorliegenden Erfindung Verwendung.
Liposomen -- Mikrovesikel mit ungefähr kugelförmiger Gestalt, und sie sind eines der bevorzugten Materialien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Die Liposomen weisen einen Durchmesser auf, der mindestens 20 nm und nicht mehr als etwa 20 µm, gewöhnlich mindestens etwa 40 nm und weniger als etwa 10 µm beträgt. Vorzugsweise ist der Durchmesser der Liposomen kleiner als etwa 2 µm, um ein Absetzen oder eine Flotation zu begrenzen.
Die äußere Schale eines Liposoms besteht aus einer amphiphilen Doppelschicht, die ein Volumen von Wasser oder einer wäßrigen Lösung einschließt. Liposomen mit mehr als einer Doppelschicht werden als multilamellare Vesikel bezeichnet. Liposomen mit nur einer Doppelschicht werden als unilamellare Vesikel bezeichnet. Multilamellare Vesikel werden, wenn ein lipophiler Photosensibilisator oder eine liphophile chemilumineszierende Verbindung verwendet wird, wegen ihrer Fähigkeit, größere Mengen dieser Materialien als unilamellare Vesikel einzuverleiben, in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Die amphiphile Doppelschicht umfaßt häufig Phospholipide. Bei Phospholipiden, die bei der Herstellung von Teilchen verwendet werden, welche in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, kann es sich um irgendein Phospholipid oder irgendeine Phospholipid-Mischung, das bzw. die in natürlichen Membranen gefunden wird, einschließlich Lecithin, oder um synthetische Glycerylphosphatdiester von gesättigten oder ungesättigten linearen 12- Kohlenstoff- oder 24-Kohlenstoff-Festtsäuren handeln, worin das Phosphat als Monoester oder als Ester eines polaren Alkohols, wie Ethanolamin, Cholin, Inosit, Serin, Glycerin und dergleichen, vorliegt. Besonders bevorzugte Phospholipide umfassen L-α-Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC), Palmitoyloleoylphosphatidylglycerin (POPG), L-α- Dioleoylphosphatidylglycerin, L-α-(Dioleoyl)phosphatidylethanolamin (DOPE) und L-α-(Dioleoyl)phosphatidyl-(4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1- carboxyamido)ethanol (DOPE-MCC).
Die Phospholipide in der Doppelschicht können durch Cholesterol ergänzt sein und können durch andere amphiphile Verbindungen ersetzt werden, welche eine polare, gewöhnlich geladene Kopfgruppe und einen hydrophilen Teil aufweisen, welcher gewöhnlich zwei lineare Kohlenwasserstoffketten umfaßt. Beispiele für derartige Substitute umfassen Dialkylphosphat, Dialkoxypropylphosphate, worin die Alkylgruppen lineare Ketten mit 12 - 20 Kohlenstoffatomen aufweisen, N-(2,3-Di-(9-(Z)- octadecenyloxy))prop-1-yl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), wie im US-Patent Nr. 4,897,355, herausgegeben am 30. Januar 1990, offenbart, Sphingomyelin, Cardiolipin und dergleichen.
Liposomen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weisen vorzugsweise eine hohe negative Ladungsdichte auf, um die Suspension zu stabilisieren und eine spontane Aggregation zu verhindern.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sollten die Liposomen in der Lage sein, sich an ein sBp-Mitglied zu binden, und in der Lage sein, einen Photosensibilisator und/oder eine chemilumineszierende Verbindung entweder mit der wäßrigen oder mit der nicht-wäßrigen Phase assoziiert aufzuweisen. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposomen weisen gewöhnlich sBp-Mitglieder an die äußere Oberfläche der Lipidvesikel gebunden auf.
Liposomen können durch eine Vielfalt von Verfahren hergestellt werden, einschließlich Hydratation und mechanischer Dispergierung von getrocknetem Phospholipid oder Phospholipid-Substitut in einer wäßrigen Lösung. Liposomen, die auf diese Weise hergestellt sind, weisen eine Vielfalt von Abmessungen, Zusammensetzungen und Verhaltensweisen auf. Ein Verfahren, die Heterogenität und die Inkonsistenz des Verhaltens von mechanisch dispergierten Liposomen zu verringern, besteht in Beschallung. Ein derartiges Verfahren verringert die durchschnittliche Liposomengröße. Alternativ ist eine Extrusion als Endschritt bei der Herstellung der Liposomen verwendbar. Das US-Patent 4,529,561 offenbart ein Verfahren zum Extrudieren von Liposomen unter Druck durch eine Membran mit gleichförmiger Porengröße, um die Größengleichförmigkeit zu verbessern.
Die Herstellung von Liposomen, die einen hydrophoben oder amphiphilen Photosensibilisator und/oder eine chemilumineszierende Verbindung in der Lipid-Doppelschicht gelöst enthalten, kann mit einer Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden, einschließlich eines Verfahrens, das von Olsen et al., Biochemica et Biophysica Acta, 557 (9), 1979, beschrieben wird.
Das Markieren von Tröpfchen und Liposomen beinhaltet oft beispielsweise den Einschluß von Thiol- oder Maleimid- oder Biotingruppen auf den Molekülen, welche die Lipid-Doppelschicht umfassen. Photosensibilisatoren, chemilumineszierende Moleküle und/oder sBp- Mitglieder können dann durch Reaktion der Teilchen mit einem dieser Materialien, welches an ein mit Sulfhydryl reaktives Reagenz, eine Sulfhydrylgruppe bzw. Avidin gebunden ist, an die Oberfläche gebunden werden. Mit Sulfhydryl reaktive Gruppen schließen Alkylierungsmittel ein, wie Bromacetamid und Maleimid.
SBp-Mitglieder können durch schwache hydrophobe Wechselwirkungen an der Oberfläche der Lipsomen-Teilchen angezogen werden, jedoch sind derartige Wechselwirkungen im allgemeinen nicht ausreichend, um der Scherkraft standzuhalten, auf die man bei der Inkubation und beim Waschen trifft. Es ist vorzuziehen, sBp-Mitglieder kovalent an ein Liposomen- Teilchen zu binden, das beispielsweise durch die Verwendung von DOPE-MCC, wie oben gezeigt, funktionalisiert worden ist, indem man das Liposom mit dem ausgewählten, mit einer Mercaptangruppe funktionalisierten sBp- Mitglied vereinigt. Wenn das sBp-Mitglied beispielsweise ein Antikörper ist, kann es mit S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (SAMSA) umgesetzt und hydrolysiert werden, um einen Sulfhydryl-modifizierten Antikörper bereitzustellen.
Latex-Teilchen -- "Latex" bezeichnet ein teilchenförmiges, in Wasser suspendierbares, wasserunlösliches polymeres Material, das gewöhnlich Teilchenabmessungen mit einem Durchmesser von 20 nm bis 20 µm, bevorzugter 100 bis 1000 nm aufweist. Der Latex ist häufig ein substituiertes Polyethylen, wie beispielsweise: Polystyrol-Butadien, Polyacrylamid- Polystyrol, Polystyrol mit Aminogruppen, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Acrylnitril-Butadien, Styrol-Copolymere, Polyvinylacetatacrylat, Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat-Copolymere und dergleichen. Nicht-vernetzte Polymere von Styrol und carboxyliertem Styrol oder Styrol, das mit anderen aktiven Gruppen, wie Amino, Hydroxyl, Halogen und dergleichen, funktionalisiert ist, werden bevorzugt. Häufig werden Copolymere von substituierten Styrolen mit Dienen, wie Butadien, verwendet.
Die Assoziation des Photosensibilisators und der chemilumineszierenden Verbindung mit Latex-Teilchen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann eine Einverleibung während der Bildung der Teilchen durch Polymerisation beinhalten, beinhaltet aber gewöhnlich die Einverleibung in vorgeformte Teilchen, gewöhnlich durch nichtkovalente Auflösung in die Teilchen hinein. Üblicherweise wird eine Lösung der chemilumineszierenden Verbindung und des Photosensibilisators verwendet. Lösungsmittel, die verwendet werden können, umfassen Alkohole, einschließlich Ethanol, Ethylenglycol und Benzylalkohol; Amide, wie Dimethylformamid, Formamid, Acetamid und Tetramethylharnstoff und dergleichen; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid und Sulfolan; und Ether, wie Carbitol, Ethylcarbitol, Dimethoxyethan und dergleichen, und Wasser. Die Verwendung von Lösungsmitteln mit hohen Siedepunkten, in denen die Teilchen unlöslich sind, gestattet die Verwendung von erhöhten Temperaturen, um die Lösung der Verbindungen in die Teilchen hinein zu erleichtern, und sie sind besonders geeignet. Die Lösungsmittel können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Besonders bevorzugte Lösungsmittel zum Einverleiben des Photosensibilisators sind diejenigen, die den angeregten Triplett-Zustand des Photosensibilisators nicht quenchen, entweder wegen ihrer intrinsischen Eigenschaften oder weil sie anschließend dank ihrer Fähigkeit, in einem Lösungsmittel wie Wasser, das in den Teilchen unlöslich ist, gelöst zu werden, aus den Teilchen entfernt werden können. Hydroxylische Lösungsmittel, d.h. diejenigen, die eine oder mehrere Hydroxylgruppen enthalten, werden bevorzugt, und allgemein können Lösungsmittel, welche das Teilchen quellen lassen, aber nicht lösen, verwendet werden. Zur Einverleibung von chemilumineszierenden Verbindungen in Teilchen sollten Lösungsmittel so gewählt werden, daß sie, entweder auf Grund ihrer intrinsischen Eigenschaften oder weil sie aus den Teilchen entfernt werden können, die Lumineszenz nicht störend beeinflussen. Häufig werden ebenfalls hydroxylische Lösungsmittel bevorzugt. Typische aromatische Cosolvenzien, einschließlich Dibutylphthalat, Benzonitril, Naphthonitril, Dioctylterephthalat, Dichlorbenzol, Diphenylether, Dimethoxybenzol usw., werden bei genügend niedrigen Konzentrationen verwendet, um die Auflösung der Teilchen zu vermeiden, aber bei ausreichenden Konzentrationen, um die Teilchen quellen zu lassen.
Außer wenn der Photosensibilisator und/oder die chemilumineszierende Verbindung kovalent an die Teilchen gebunden werden, ist es gewöhnlich vorzuziehen, elektronisch neutrale Phototsensibilisatoren oder chemilumineszierende Verbindungen zu verwenden. Es ist vorzuziehen, daß das gewählte flüßsige Medium die Polymerperlen nicht bis zum Punkt der Klebrigkeit erweicht. Eine bevorzugte Technik umfaßt das Suspendieren der gewählten Latex-Teilchen in einem flüssigen Medium, in dem der Photosensibilisator und/oder die chemilumineszierende Verbindung zumindest eine beschränkte Löslichkeit aufweisen. Vorzugsweise werden die Konzentrationen des Photosensibilisators und der chemilumineszierenden Verbindung in dem flüssigen Medium so gewählt, daß Teilchen bereitgestellt werden, die den höchste Wirkungsgrad für eine Singulett-Sauerstoff-Bildung und die höchste Quantenausbeute der Emission aus der chemilumineszierenden Verbindung in dem Medium aufweisen, aber weniger konzentrierte Lösungen werden manchmal bevorzugt. Die Deformation oder Auflösung der Teilchen in dem Lösungsmittel kann verhindert werden, indem man ein mischbares Cosolvens zugibt, in dem die Teilchen unlöslich sind.
Im allgemeinen werden die während des Verfahrens verwendeten Temperaturen so gewählt, daß sie die Singulett-Sauerstoff- Bildungsfähigkeit des Photosensibilisators, der mit den Teilchen assoziiert ist, und die Quantenausbeute der chemilumineszierenden Verbindung, die mit den Teilchen assoziiert ist, maximieren, mit der Maßgabe, daß die Teilchen bei der gewählten Temperatur nicht schmelzen oder aggregiert werden. Normalerweise werden erhöhte Temperaturen verwendet. Die Temperaturen des Verfahrens liegen im allgemeinen im Bereich von 20ºC bis 200ºC, gewöhnlicher von 50ºC bis 170ºC. Es wurde beobachtet, daß einige Verbindungen, die bei Raumtemperatur nahezu unlöslich sind, bei erhöhten Temperaturen beispielsweise in Alkoholen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Ethanol und Ethylenglycol, löslich sind. Es ist gezeigt worden, daß carboxylierte modifizierte Latex-Teilchen bei solchen Temperaturen Alkohole mit niedrigem Molekulargewicht tolerieren.
Ein sBp-Mitglied kann physikalisch auf der Oberfläche des Latex- Teilchens adsorbiert oder kovalent an das Teilchen gebunden werden. In Fällen, bei denen das sBp-Mitglied nur schwach an die Oberfläche des Latex-Teilchens gebunden ist, kann die Bindung in einigen Fällen nicht in der Lage sein, die Teilchen-zu-Teilchen-Scherkräfte auszuhalten, auf die man während der Inkubation und des Waschens trifft. Deshalb kann es vorzuziehen sein, die sBp-Mitglieder unter Bedingungen, die eine Adsorption minimieren, kovalent an die Latex-Teilchen zu binden. Dies kann beispielsweise durch chemische Aktivierung der Oberfläche des Latex bewerkstelligt werden. Beispielsweise kann der N-Hydroxysuccinimidester von Oberflächen-Carboxylgruppen gebildet werden, und die aktivierten Teilchen werden dann, um die nicht-spezifische Bindung von Assay- Komponenten an die Teilchenoberfläche zu verringern, mit einer Verknüpfungsgruppe, welche Aminogruppen aufweisen, die mit den Estergruppen reagieren, oder direkt mit einem sBp-Mitglied, das eine Aminogruppe aufweist, in Kontakt gebracht. Die Verknüpfungsgruppe wird gewöhnlich so gewählt, daß sie eine nicht-spezifische Bindung von Assay- Komponenten an die Teilchenoberfläche verringert und vorzugsweise eine geeignete Funktionalität sowohl für die Anknüpfung an die Latex-Teilchen als auch für die Anknüpfung an das sBp-Mitglied bereitstellt. Geeignete Materialien umfassen maleimidisiertes Aminodextran (MAD), Polylysin, Aminosaccharide und dergleichen. MAD kann hergestellt werden, wie es von Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75 (7), 3143, 1978, beschrieben ist.
In einem Verfahren wird zuerst MAD unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids, beispielsweise 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid, an Carboxyl-haltige Latex-Teilchen geknüpft. Die beschichteten Teilchen werden dann in Reagenzien äquilibriert, um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern. Derartige Reagenzien schließen Proteine, wie Rinder-gamma-globulin (BGG), und Detergenzien, wie Tween 20, TRITON X-100 und dergleichen, ein. Ein sBp-Mitglied, das eine Sulfhydrylgruppe aufweist oder geeignet modifiziert ist, um eine Sulfhydrylgruppe einzuführen, wird dann zu einer Suspension der Teilchen gegeben, wonach eine kovalente Bindung zwischen dem sBp-Mitglied und dem MAD auf den Teilchen gebildet wird. Jeglicher Überschuß an unumgesetztem sBp-Mitglied kann dann durch Waschen entfernt werden.
Metallsole -- sind diejenigen Teilchen, die ein Schwermetall umfassen, d.h. ein Metall mit einer Ordnungszahl von mehr als 20, wie Metalle der Gruppe IB, z.B. Gold oder Silber, oder Chalkogene, wie Selen oder Tellur.
Metallsol-Teilchen werden beispielsweise von Leuvering im US-Patent Nr. 4,313,734 beschrieben. Derartige Sole schließen kolloidale wäßrige Dispersionen eines Metalls, einer Metallverbindung oder von mit einem Metall oder einer Metallverbindung beschichteten Polymerkernen ein.
Die Metallsole können aus Metallen oder Metallverbindungen, wie Metalloxiden, Metallhydroxiden und Metallsalzen, oder aus Polymerkernen, die mit Metallen oder Metallverbindungen beschichtet sind, bestehen. Beispiele für derartige Metalle sind Platin, Gold, Silber, Quecksilber, Blei, Palladium und Kupfer, und für derartige Metallverbindungen Silberiodid, Silberbromid, hydratisiertes Kupferoxid, Eisenoxid, Eisenhydroxid oder hydratisiertes Eisenoxid, Aluminiumnydroxid oder hydratisiertes Aluminiumoxid, Chromdioxid oder hydratisiertes Chromoxid, Vanadiumoxid, Arsensulfid, Manganhydroxid, Bleisulfid, Quecksilbersulfid, Banumsulfat und Titandioxid. Allgemein können die nützlichen Metalle oder Metallverbindungen leicht mittels bekannter Techniken aufgezeigt werden.
Es ist manchmal vorteilhaft, Sole zu verwenden, die dispergierte Teilchen umfassen, welche aus Polymerkernen bestehen, die mit den oben erwähnten Metallen oder Metallverbindungen beschichtet sind. Diese Teilchen weisen ähnliche Eigenschaften wie die dispergierte Phase von reinen Metallen oder Metallverbindungen auf, aber Größe, Dichte und Metallkontakt können optimal kombiniert werden.
Die Metallsol-Teilchen können auf einer großen Anzahl von Wegen hergestellt werden, welche an sich bekannt sind. Beispielsweise bezieht sich Leuvering für die Herstellung eines Gold-Sols auf einen Artikel von G. Frens in Nature Physical Science 241, 20 (1973).
Die Metallsol-Teilchen können so modifiziert werden, daß sie verschiedene funktionelle Gruppen enthalten, wie es oben für die Verknüpfung mit einem sBp-Mitglied, einem Photosensibilisator und einer chemilumineszierenden Verbindung beschrieben wurde. Beispielsweise können polymere Bindungsmittel verwendet werden, um die Teilchen zu beschichten, wie beispielsweise Polymere, die Thiolgruppen enthalten, welche sich stark an viele Schwermetalle binden, oder Silylierungsmittel, die beispielsweise durch Reaktion von Metallteilchen mit Trialkoxyaminoalkylsilanen, wie in der EPA-Patentanmeldung 84400952.2 von Advanced Magnetics für die Beschichtung von magnetischen Teilchen beschrieben, binden und polymere Beschichtungen bilden können.
Farbstoff-Kristallite -- Mikrokristalle von reinen oder gemischten, festen, wasserunlöslichen Farbstoffen, vorzugsweise Farbstoffen, die als die oben beschriebenen Photosensibilisatoren dienen können. Die Farbstoff- Kristallite, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen einen Größenbereich von 20 nm bis 20 mm auf.
Ein Verfahren zur Herstellung von Farbstoff-Kristalliten ist im US- Patent Nr. 4,373,932 (Gribnau et al.) beschrieben. Gribnau beschreibt kolloidale Farbstoff-Teilchen und wäßrige Dispersionen eines hydrophoben Farbstoffes oder Pigments, welche eine immunchemisch reaktive Komponente und eine chemilumineszierende Verbindung direkt oder indirekt angeknüpft aufweisen. Die Farbstoff-Teilchen werden im allgemeinen hergestellt, indem man einen Farbstoff in Wasser dispergiert und dann zentrifugiert.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Farbstoff-Kristalliten findet durch eine langsame Zugabe einer Lösung des Farbstoffes in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu Wasser statt. Ein anderes Verfahren besteht in der Beschallung einer Suspension des festen Farbstoffes in Wasser.
Die Bindung von sBp-Mitgliedern an die Farbstoff-Teilchen kann durch direkte oder indirekte Adsorption oder durch kovalente chemische Verknüpfung erreicht werden. Die letztgenannte kann auch für die Anknüpfung einer chemilumineszierenden Verbindung verwendet werden und wird von der Anwesenheit geeigneter funktioneller Gruppen in irgendeinem Beschichtungsmaterial und in dem Farbstoff gesteuert. Beispielsweise können funktionelle Gruppen auf der Oberfläche eines Farbstoff-Kristallits eingeführt werden, indem man eine Verbindung, die eine diazotierte aromatische Aminogruppe und die gewünschte funktionelle Gruppe enthält, an eine phenolische oder Anilinogruppe des Farbstoffes kuppelt.
Wenn der Farbstoff eine Carboxylgruppe aufweist, kann der Farbstoff- Kristallit durch ein Carbodiimid aktiviert und an eine primäre Amino- Komponente gekuppelt werden. Aliphatische primäre Aminogruppen und Hydroxylgruppen können beispielsweise durch Bromcyan oder Halogensubstituierte Di- oder Triazine aktiviert werden, wonach eine Verknüpfung mit einer primären Amino-Komponente oder beispielsweise mit einer Komponente, die eine SH- oder OH-Gruppe enthält, stattfinden kann. Auch bifunktionelle reaktive Verbindungen können verwendet werden. Beispielsweise kann Glutaraldehyd für die wechselseitige Kupplung von primären Amino-Komponenten des Farbstoffes und einem sBp-Mitglied verwendet werden, und es kann beispielsweise ein hetero-bifunktionelles Reagenz, wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, für die Kupplung einer primären Amino-Komponente an eine Komponente, die eine Thiolgruppe enthält, verwendet werden.
Emulsionen der vorliegenden Erfindung können wie folgt hergestellt werden. Metallsole können durch reduktive Ausfällung, beispielsweise durch die Einwirkung von Hydrazin auf Silbernitrat-Lösungen, hergestellt werden. Öle können durch Beschallung von wäßrigen Öl-Suspensionen und/oder durch Extrusion durch Mikroporen-Filter emulgiert werden. Öl-Emulsionen können auch durch Verdünnen einer Lösung eines Öls in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol, in Wasser erhalten werden. Stabile Emulsionen bilden sich nur, wenn im Wasser Tenside anwesend sind, wie anionische Detergenzien, Proteine, Phospholipide und dergleichen.
Chemilumineszierende Verbindung (CV) -- eine photoaktivierbare Substanz, welche bei direkter oder sensibilisierter Anregung durch Licht oder bei Reaktion mit Singulett-Sauerstoff eine chemische Reaktion eingeht, um ein metastabiles Reaktionsprodukt zu bilden, das in der Lage ist, sich unter gleichzeitiger oder anschließender Emission von Licht, gewöhnlich im Wellenlängenbereich von 250 bis 1200 nm, zu zersetzen. Der Ausdruck "photoaktivierbar" schließt "photochemisch aktivierbar" ein. CVs, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, sind diejenigen, die mit Singulett-Sauerstoff reagieren, um Dioxetane oder Dioxetanone zu bilden. Die letztgenannten sind gewöhnlich elektronenreiche Olefine (1). Beispiele für derartige elektronenreiche Olefine sind Enolether, Enamine, 9-Alkyliden-N-alkylacridane, Arylvinylether, Dioxene, Arylimidazole, 9- Alkylidenxanthene und Lucigenin. Von speziellem Interesse für die vorliegende Erfindung sind Enolether, Enamine und 9-Alkyliden-N- methylacridane. Andere Verbindungen, die in dem Ausdruck "CV" eingeschlossen sind, umfassen Luminol und andere Phthalhydrazide und chemilumineszierende Verbindungen, die dadurch vor dem Eingehen einer chemilumineszierenden Reaktion geschützt sind, daß sie durch eine photochemisch labile Schutzgruppe geschützt sind, wobei derartige Verbindungen beispielsweise Glühwürmchen-Luciferin, Aquaphorin, Luminol usw. einschließen.
Die interessierenden CVs emittieren vorzugsweise bei einer Wellenlänge oberhalb von 300 Nanometern, vorzugsweise oberhalb von 500 Nanometern und bevorzugter oberhalb von 550 nm. Verbindungen, die bei Wellenlängen jenseits des Bereiches, in dem die Proben-Komponenten signifikant zur Lichtabsorption beitragen, Licht absorbieren und emittieren, sind in der vorliegenden Erfindung von besonderer Nützlichkeit. Die Absorbanz von Serum fällt oberhalb von 500 nm rasch ab und wird oberhalb von 600 nm unbedeutend; deshalb sind chemilumineszierende Verbindungen, die Licht oberhalb von 600 nm emittieren, von besonderem Interesse. Jedoch sind chemilumineszierende Verbindungen, die bei kürzeren Wellenlängen absorbieren, nützlich, wenn eine Überlagerungsabsorbanz der Probe nicht vorliegt.
Um eine Autosensibilisierung der chemilumineszierenden Verbindung zu vermeiden, ist es vorzuziehen, daß die chemilumineszierenden Verbindungen kein Licht absorbieren, das verwendet wird, um den Photosensibilisator anzuregen. Da es im allgemeinen vorzuziehen ist, den Sensibilisator mit Lichtwellenlängen von mehr als 500 nm anzuregen, ist es demgemäß wünschenswert, daß die Lichtabsorption durch die chemilumineszierende Verbindung oberhalb von 500 nm sehr gering ist.
Wenn eine langwellige Emission aus der chemilumineszierenden Verbindung gewünscht wird, kann ein langwelliger Emitter, wie ein Pyren, der an die chemilumineszierende Verbindung gebunden ist, verwendet werden. Alternativ kann ein fluoreszierendes Molekül in das Medium eingeschlossen werden, das die chemilumineszierende Verbindung enthält. Bevorzugte fluoreszierende Moleküle werden durch die aktivierte chemilumineszierende Verbindung angeregt und emittieren bei einer Wellenlänge, die länger ist als die Emissionswellenlänge der chemilumineszierenden Verbindung, gewöhnlich größer als 550 nm. Es ist gewöhnlich auch wünschenswert, daß die fluoreszierenden Moleküle nicht bei den Lichtwellenlängen absorbieren, die verwendet werden, um den Photosensibilisator zu aktivieren. Beispiele für nützliche Farbstoffe umfassen Rhodamin, Ethidium, Dansyl, Eu(fod)&sub3;, Eu(TTA)&sub3;, Ru(bpy)&sub3;&spplus;&spplus; (worin bpy = 2,2'-Dipyridyl) usw. Im allgemeinen wirken diese Farbstoffe als Akzeptoren in Energieübertragungsprozessen und weisen vorzugsweise hohe Fluoreszenz-Quantenausbeuten auf und reagieren nicht rasch mit Singulett-Sauerstoff. Sie können gleichzeitig mit der Einverleibung der chemilumineszierenden Verbindung in die Teilchen den Teilchen einverleibt werden. Die CVs 1 unten enthalten im allgemeinen keine chemisch reaktiven allylischen CH- oder NH-Gruppen.
Die elektronenreichen Olefine 1 weisen im allgemeinen eine Elektronendonor-Gruppe in Konjugation mit dem Olefin auf:
worin A eine Elektronendonor-Gruppe ist, wie beispielsweise N(D)&sub2;, OD, p- C&sub6;H&sub4;N(D)&sub2;, Furanyl, N-Alkylimidazol, N-Alkylpyrrolyl, 2-Indoyl usw., worin D beispielsweise Alkyl oder Aryl ist und A entweder direkt an den olefinischen Kohlenstoff gebunden ist oder durch die Vermittlung von anderen konjugierten Doppelbindungen angebunden ist. Die anderen Valenzen der C-Atome im Olefin 1 sind Substituenten mit 1 bis 50 Atomen, welche zusammengenommen werden können, um einen oder mehrere Ringe zu bilden, die kondensiert oder unkondensiert sind, z.B. Cycloalkyl, Phenyl, 7-Norbornyl, Naphthyl, Anthracyl, Acridanyl, Adamantyl und so weiter.
Gewöhnlich liegt kein ein Wasserstoff tragendes Atom vor, welches direkt an das Olefin geknüpft ist, außer wenn das Atom in einer Position vorliegt, die keine Doppelbindung unterbringen kann, wie an einer Brückenkopf-Position eines kleinen bicyclischen Ringsystems Die bevorzugteren Olefine sind diejenigen, die ein Dioxetan liefern, das bei Raumtemperatur rasch zerfällt (weniger als 60 Minuten, vorzugsweise weniger als 5 Minuten, winschenswerterweise weniger als 30 s). Die Dioxetane können allein oder in Verbindung mit einem fluoreszierenden Energieakzeptor lumineszierend sein.
Enolether 2 weisen im allgemeinen die Struktur:
auf, worin R Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist und die verbleibenden Substituenten am Olefin aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H und Substituenten mit vorzugsweise 1 bis 50 Atomen besteht. Nützliche Enolether-Verbindungen sind diejenigen mit einem Aryl an demselben Kohlenstoff wie der Ether, wobei der Arylring mit einer Elektronendonor-Gruppe an einer Position substituiert ist, welche Fluoreszenz verleiht. Bei der Elektronendonor-Gruppe kann es sich beispielsweise um m-Hydroxyphenyl, m-Dimethylaminophenyl, 1-(5- Aminonaphthyl), Pyryl, 1-(3-Hydroxypyryl), Anthracyl, Chrysyl usw. handeln. Eine oder beide Gruppen an der Position 2 können Aryl sein, wobei das Keton, das durch Ersatz des 1-Kohlenstoffs durch Sauerstoff gebildet wird, fluoreszierend ist, beispielsweise β-Naphthyl oder 2-Anthryl. Erläuternde beispielhafte, nicht-beschränkende Enolether sind:
worin X&sub1; H, OC(O)CH&sub3;, OCH&sub3;, OH ist, beschrieben von Bronstein et al. im US- Patent Nr. 4,956,477;
beschrieben von Bronstein et al. im US-Patent Nr. 4,956,477;
worin X&sub2; H, OH, N(CH&sub3;)&sub2; oder OCH&sub3; ist, beschrieben von P. Schaap, J. Am. Chem. Soc., 104: 3504 (1982) und P. Schaap, Photochem. and Photobiology, 30: 35 (1979);
worin X&sub2; oben definiert ist, X&sub3; H, OCH&sub3; oder N(CH&sub3;)&sub2; ist, beschrieben von P. Schaap, Report to U.S. Army Research Office, 15. Oktober 1986, und S. D. Gagnon, Ph. D. Thesis, Wayne State University (1982);
worin X&sub4; = O, S, CH&sub3;N oder PhN und Y = O, S oder CH&sub3;N und Ph = Phenyl, beschrieben von P. Schaap, Report to Office of Naval Research, 17. März 1987;
beschrieben von P. Schaap, Report to U.S. Army Research, 15. Oktober 1986;
Enamine 7 weisen allgemein die Struktur:
auf, worin R¹ unabhängig Aryl oder Alkyl ist und die verbleibenden Substituenten am Olefin aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen besteht. Im allgemeinen werden nützliche Enamine durch die Regeln regiert, die oben für Enolether angeführt worden sind.
Nicht-beschränkende Beispiele für nützliche Enamine sind die obigen Enolether 3 - 5 mit N(CH&sub3;)&sub2; anstelle von OCH&sub3;. Ein weiteres Beispiel ist
9-Alkyliden-N-alkylacridane 10 weisen allgemein die Struktur:
auf, worin R³ Alkyl ist und die verbleibenden Substituenten am Olefin aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen besteht, vorzugsweise Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, m- Methoxyphenyl, Dimethylamino, Trityl, Methoxy, N-Morpholeno, und die zusammengenommen werden können, um einen Ring zu bilden, wie beispielsweise Adamantyl, N-Methylacridanylid, Xanthanylidin, 1-(3,4- Benzo-5-hydrofuryliden) und dergleichen.
Spezielle Beispiele für 9-Alkyliden-N-alkylacridane, die als Marker in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind auf erläuternde und nicht-beschränkende Weise:
beschrieben von Singer, J. Org. Chem., 41, 2685 (1976);
beschrieben von E. White, Chem. Letters, 1491 (1979);
worin R&sub4; und R&sub5; unabhängig H oder Phenyl sind, beschrieben von Singer et
al., J. Am. Chem. Soc., 102: 3823 (1983);
beschrieben von McCapra, Chem. Comm., 944 (1977) und Singer et alc, ebenda;
beschrieben von McCapra, ebenda;
beschrieben von McCapra, ebenda;
Die relevanten Teile der obigen Literaturstellen werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
9-Alkylidenxanthane weisen allgemein die Struktur:
auf, worin die Substituenten am Olefin aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen besteht, vorzugsweise Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, m-Methoxyphenyl, Dimethylamino, Trityl, Methoxy, N-Morpholeno, und die zusammengenommen werden können, um einen Ring zu bilden, wie beispielsweise Adamantyl, N-Methylacridanylid, Xanthanylidin, 1-(3,4-Benzo-5-hydrofuryliden) und dergleichen, zum Beispiel 9- Phenylmethylidenxanthen.
Bei einer anderen Familie von CVs handelt es sich um 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione. Die bekannteste Verbindung ist Luminol, bei der es sich um die 5-Amino-Verbindung handelt. Andere Mitglieder der Familie schließen das 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamino[ca]benz- Analogon ein. Es sollte bemerkt werden, dafl Luminol als Marker in Assays verwendet worden ist; jedoch ist die Anregung des Luminols chemisch bewerkstelligt worden, nicht durch Photoaktivierung, wie im Fall der vorliegenden Erfindung. Diese Verbindungen werden durch Singulett- Sauerstoff zu den 1,4-Phthalazinidionen oxidiert und gehen unter anschlieflender Reaktion mit Peroxid oder Wasserstoffperoxid eine Zersetzung unter Lichtemission ein.
Bei einer anderen Familie von CVs handelt es sich um die 2,4,5- Triphenylimidazole, wobei Lophin der gewöhnliche Name für die Mutterverbindung ist. Chemilumineszierende Analoga schließen para- Dimethylamino- und -Methoxy-Substituenten ein.
Andere chemilumineszierende Verbindungen, welche die oben angegebenen Erfordernisse erfüllen, können in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0345776 gefunden werden.
Dioxetane, die durch die Reaktion von Singulett-Sauerstoff mit der chemilumineszierenden Verbindung gebildet werden, weisen die nachstehende allgemeine Struktur auf, in der die Substituenten an den Kohlenstoff (C)- Atomen diejenigen sind, die in dem entsprechenden Olefin vorliegen:
Einige der Dioxetane zersetzen sich spontan, andere durch Erwärmen unter Emission von Licht. In einigen Fällen wird das Dioxetan spontan in ein Hydroperoxid überführt, wonach Base erforderlidh ist, um das Dioxetan zurückzubilden und eine Zersetzung und Lichtemission zu gestatten.
Energieakzeptor -- hierin auch als fluoreszierender Energieakzeptor bezeichnet. Ein Chromophor, der eine wesentliche Absorption oberhalb von 310 nm, gewöhnlich oberhalb von 350 nm und vorzugsweise oberhalb von 400 nm aufweist. Die Wahl des Energieakzeptors wird auch durch die spezielle CV regiert. Der Energieakzeptor sollte Licht absorbieren können, das von der CV emittiert wird. Vorzugsweise sollte das Absorptionsmaximum des Energieakzeptors bei einer ähnlichen Wellenlänge liegen wie das Emissionsmaximum der chemilumineszierenden Verbindung. Ein hoher Extinktionskoeffizient ist wünschenswert, gewöhnlich oberhalb von 10, vorzugsweise oberhalb von 10&sup4; und besonders bevorzugt oberhalb von 10&sup4;. Der Energieakzeptor muß fluoreszierend sein und weist bevorzugt eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute auf, gewöhnlich von mindestens 0,1, vorzugsweise von mehr als 0,4.
Eine Anzahl von verschiedenen Molekülen, die als Energieakzeptor nützlich sind, wird von Ullman et al., I, II, IV und V in den Spalten 8 und 9 beschrieben, deren relevante Teile hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Eine Gruppe von Fluoreszenzfarbstoffen mit einer Anzahl der oben beschriebenen wünschenswerten Eigenschaften sind die Xanthen-Farbstoffe, welche die Fluoresceine, die von 3,6-Dihydroxy-9- phenylxanthhydrol abgeleitet sind, und Rosamine und Rhodamine einschließen, die von 3,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol abgeleitet sind. Die Rhodamine und Fluoresceine weisen eine 9-o-Carboxyphenylgruppe auf und sind Derivate von 9-o-Carboxyphenylxanthhydrol.
Diese Verbindungen sind im Handel mit Substituenten an der Phenylgruppe erhältlich, welche als Stelle für eine Bindung oder als Bindungsfunktionalität verwendet werden können. Beispielsweise sind Aminound Isothiocyanat-substituierte Fluorescein-Verbindungen erhältlich.
Eine andere Gruppe von fluoreszierenden Verbindungen sind die Naphthylamine mit einer Aminogruppe in der alpha- oder beta-Stellung, gewöhnlich der alpha-Stellung. Eingeschlossen unter den Naphthylamino- Verbindungen sind 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8- naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat.
Farbstoff-Vorläufer, die aktiviert werden, um mit Proteinen zu reagieren, schließen 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin; Acridine, wie 9- Isothiocyanatoacridin; N-(p-(2-Benzoxazolyl)phenyl)maleimid; Benzoxadiazole
wie 4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol; Stilbene, wie 4-Dimethylamino- 4'-isothiocyanatostilben und 4-Dimethylamino-4'-maleimidostilben, ein. Andere Farbstoffe, die weiter funktionalisiert werden können, um sich mit einem sBp-Mitglied zu vereinigen, schließen Acridinorange, 7-(p- Methoxybenzylamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol; N,N'- Dioctadecyloxacarbocyanin-p-toluolsulfonat; Pyrene, wie 8-Hydroxy-1,3,6- pyrentrisulfonsäure und 1-Pyrenbuttersäure, Merocyanin 540, Diodeosin sowie andere leicht verfügbare fluoreszierende Moleküle ein.
Für Polynukleotid-Assays kann eine große Vielfalt von Energieakzeptoren verwendet werden, aber diejenigen, die eine verstärkte Fluoreszenz aufweisen, wenn sie an doppelsträngige Nukleinsäuren gebunden sind, werden bevorzugt. Farbstoffe, die interkalieren, wie Ethidiumbromid und Acridinorange, sind typische Beispiele. Ein Ruthenium-Derivat, das von Barton (J. Am. Chem. Soc. (1990), 112: 4960) entwickelt wurde, ist besonders attraktiv, da es dramatisch eingeschaltet wird, wenn es interkaliert ist. Alternativ kann der Energieakzeptor an eine Zweite Polynukleotid-Sonde gebunden werden, welche sich in der Nähe von der mit einer chemilumineszierenden Verbindung markierten Sonde anbinden kann, oder der Energieakzeptor kann ungebunden und frei in der Lösung dispergiert sein.
Der Photosensibilisator und die CV sind beide mit einem Teilchen assoziiert, um die Matrix der vorliegenden Erfindung zu bilden. Die Matrix ist mit einem sBp-Mitglied assoziiert. Dies kann auf einer Anzahl von Wegen bewerkstelligt werden, wie oben beschrieben. Beispielsweise kann der Photosensibilisator oder die CV oder das Teilchen eine Funktionalität zur Anknüpfung an ein sBp-Mitglied enthalten, oder das sBp-Mitglied kann eine Funktionalität zum Anknüpfen an den Photosensibilisator, die CV oder das Teilchen enthalten. Die Verknüpfung kann durch eine direkte Bindung zwischen Molekülen bewerkstelligt werden, oder es kann eine verknüpf ende Gruppe zischen dem sBp-Mitglied und dem Photosensibilisator, der CV oder dem Teilchen verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können der Photosensibilisator und die CV an ein Teilchen gebunden werden oder demselben einverleibt werden, an welches auch ein sBp-Mitglied geknüpft ist. Das sBp-Mitglied kann in der Lage sein, sich an den Analyten zu binden. Der Photosensibilisator und die CV können durch die Tatsache, daß sie in mindestens einer Phase des Teilchens löslich sind, dem Teilchen einverleibt werden. Der Photosensibilisator oder die CV können an das Teilchen gebunden werden, wenn er bzw. sie nicht dem Teilchen einverleibt werden. Für diesen Zweck wird der Photosensibilisator oder die CV oder das Teilchen oder eine Komponente desselben funktionalisiert, um ein Mittel zur Verknüpfung des Photosensibilisators und/oder der CV mit dem Teilchen bereitzustellen. Bei Teilchen, bei denen es sich um Öltröpfchen oder Lipid-Doppelschichten handelt, können der Photosensibilisator und/oder die CV durch Anknüpfen an eine lange Kohlenwasserstoffkette, die mit der Teilchenzusammensetzung kompatibel ist, an das Teilchen gebunden werden. Häufig werden mindestens eine und vorzugsweise zwei Kohlenwasserstoffketten mit 8 bis 20 oder mehr Kohlenstoffatomen verwendet. Wenn das Teilchen ein Tröpfchen aus einem Fluorkohlenstoff ist, können der Photosensibilisator und/oder die CV fluoriert werden, um die Löslichkeit zu verstärken und einen Austausch zu verringern, und die Kohlenwasserstoffkette, die für die Verknüpfung verwendet wird, wird vorzugsweise durch eine Fluorkohlenstoffkette ersetzt. Bei Silicon- Teilchen können der Photosensibilisator und/oder die CV an ein Polysiloxan gebunden werden. Gewöhnlich wird es wünschenswert sein, die Ladung und die Polarität des Photosensibilisators und der CV zu minimieren, so daß sie bei dieser Vorgehensweise innerhalb des nicht-wäßrigen Teils des Teilchens vorliegen. Die Bindung eines Photosensibilisators an ein sBp-Mitglied ist vollständig in der Anmeldung beschrieben.
Wie oben erwähnt, können der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung mittels der Tatsache, daß sie in mindestens einer Phase des Teilchens löslich sind, Teilchen einverleibt werden, in welchem Fall der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung bei einer viel höheren Konzentration innerhalb des Teilchens als in der Hauptmenge des Assaymediums vorliegen. Wenn der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung kovalent an Teilchen gebunden sind, werden der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung oder die Teilchen oder Komponenten derselben funktionalisiert, um ein Mittel zur Verknüpfung des Photosensibilisators und der chemilumineszierenden Verbindungen und der Teilchen bereitzustellen. Bei Teilchen, bei denen es sich um Öltröpfchen oder Liposomen handelt, können der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung an eine oder mehrere lange Kohlenwasserstoffketten geknüpft werden, von denen gewöhnlich jede mindestens 10 bis 30 Kohlenstoffatome aufweist. Falls die Teilchen Tröpfchen aus einem Fluorkohlenstoff sind, kann der Photosensibilisator oder die chemilumineszierende Verbindung, die diesen Teilchen einverleibt werden, fluoriert werden, um die Löslichkeit zu verstärken und den Austausch in andere an den anderen Marker gebundene Teilchen zu verringern, und die zur Verknüpfung verwendete Kohlenwasserstoffkette wird vorzugsweise durch eine Fluorkohlenstoffkette ersetzt. Bei Siliconfluid- Teilchen können der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung an ein Polysiloxan gebunden werden. Um die Zahl der Photosensibilisator-Moleküle und der Moleküle der chemilumineszierenden Verbindung pro Teilchen zu maximieren, ist es gewöhnlich wünschenswert, die Ladung und Polarität des Photosensibilisators und der chemilumineszierenden Verbindung zu minimieren, so daß diese innerhalb des nicht-wäßrigen Teiles des Teilchens vorliegen. Wenn das Teilchen ein Liposom ist und es gewünscht wird, den Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung in der wäßrigen Phase des Liposoms zu halten, wird es bevorzugt, Photosensibilisatoren und chemilumineszierende Verbindungen zu verwenden, die hoch polar oder geladen sind.
Das folgende ist auf erläuternde und nicht-beschränkende Weise eine typische Herstellung von Polystyrol-Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung. Polystyrol-Teilchen (175 nm) werden hergestellt, indem man sie in Anwesenheit einer Mischung von sowohl Photosensibilisator als auch CV erwärmt. Das verwendete Medium ist eine Mischung von Wasser, Ethylenglycol und Benzylalkohol in einem ungefähren Volumenverhältnis von 1:8:1. Diese Mischung sorgt für eine Ausgewogenheit von sowohl wäßrigen als auch organischen Eigenschaften. Ein wasserähnliches Lösungsmittel wird bevorzugt, um die kolloidale Stabilität der Kügelchen aufrechtzuerhalten, während ein Lösungsmittel der organischen Art bevorzugt wird, um die Farbstoffe zu solubilisieren. Andere Lösungsmittelmischungen können als das Medium verwendet werden; jedoch ist das obige Medium im allgemeinen für eine Vielfalt von Teilchenherstellungen gemäß der vorliegenden Erfindung annehmbar.
Photosensibilisator und CV werden gesondert als Lösungen (5 mM) in Benzylalkohol hergestellt. Aliquoten in variierenden Verhältnissen werden dann zu einer Mischung von Ethylenglycol, Benzylalkohol, 9:1 bezüglich Volumen, gegeben, und die Mischung wird auf 100 bis 110º erwärmt. Geeignete Aliquoten der Teilchen, welchen der Photosensibilisator und die CV einverleibt werden sollen, werden dann unter heftigem Rühren zu der heißen Mischung gegeben. Man erwärmt kurz weiter, und dann wird die Mischung abgekühlt und mit Ethanol verdünnt. Überschüssiger Farbstoff und überschüssige Lösungsmittelmischung werden durch wiederholtes Zentrifugieren entfernt. Schließlich werden die gewaschenen Teilchen in einem passenden Wasservolumen (im allgemeinen 100 mg pro 1 bis 10 ml Wasser) resuspendiert und im Dunkeln aufbewahrt.
Der Photosensibilisator, die CV und das sBp-Mitglied werden mit einem Teilchen "assoziiert", um die Matrix der vorliegenden Erfindung zu bilden. Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruch "assoziiert mit" das folgende ein: Die Assoziation kann durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung oder, wie bei dem Photosensibilisator und der CV, durch Einverleibung in ein Teilchen vorliegen. Im allgemeinen wird ein suspendierbares Teilchen, dem der Photosensibilisator und die CV einverleibt sind, das sBp-Mitglied an dasselbe gebunden aufweisen. Dieses sBp-Mitglied ist im allgemeinen in der Lage, sich an den Analyten oder ein sBp-Mitglied zu binden, welches in der Lage ist, sich an den Analyten zu binden. Wenn ein anderes sBp-Mitglied verwendet wird und dieses ebenfalls in der Lage ist, sich an den Analyten zu binden, ist ein Sandwichassay- Protokoll die Folge. Das sBp-Mitglied der Matrix kann auch ein Analogon zum Analyten sein, in welchem Fall ein kompetitives Assay-Protokoll die Folge sein kann.
Ergänzende Materialien -- Verschiedene ergänzende Materialien werden häufig in dem Assay gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Beispielsweise sind normalerweise Puffer in dem Assaymedium sowie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assay-Komponenten anwesend. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven Proteine, wie Albumine; organische Lösungsmittel, wie Formamid; quaternäre Ammoniumsalze; Polyanionen, wie Dextransulfat; Tenside, insbesondere nicht-ionische Tenside; Bindungsbeschleuniger, z.B. Polyalkylenglycole; oder dergleichen eingeschlossen sein.
Ganz oder teilweise aufeinanderfolgend -- wenn die Probe und verschiedene in der vorliegenden Erfindung verwendete Mittel auf andere Weise als zur selben Zeit (gleichzeitig) vereinigt werden, können eines oder mehrere mit einem oder mehreren der verbleibenden Mittel vereinigt werden, um eine Unterkombination zu bilden. Jede Unterkombination kann dann einem oder mehreren Schritten des vorliegenden Verfahrens unterzogen werden. So kann jede der Unterkombinationen unter Bedingungen inkubiert werden, um eines oder mehrere der gewünschten Ergebnisse zu erreichen.
Die Erfindung weist eine spezielle Anwendung auf dem Gebiet des diagnostischen Assays auf. Eine Kombination wird bereitgestellt, welche (1) ein Medium, von dem man vermutet, daß es einen Analyten enthält, und (2) ein Markerreagenz umfaßt, welches ein erstes spezifisches Bindungspaar (sBp)-Mitglied mit einer einzigen Zusammensetzung assoziiert umfaßt, welche sowohl einen Photosensibilisator als auch eine CV aufweist. Es werden solche Bedingungen gewählt, daß ein sBp-Mitglied-Komplex in Beziehung zur Anwesenheit des Analyten gebildet wird. Beispielsweise kann das erste sBp-Mitglied in der Lage sein, sich an den Analyten oder ein zweites sBp-Mitglied zu binden, um einen Komplex zu bilden, der mit der Anwesenheit des Analyten in Beziehung steht. Das Verfahren umfaßt weiter die Photoaktivierung des Photosensibilisators und den Nachweis der Menge an Lumineszenz, die von der CV erzeugt wurde. Die Menge an Lumineszenz steht mit der Menge an Analyt in dem Medium in Beziehung.
Im allgemeinen wird der Photosensibilisator durch Bestrahlung mit Licht aktiviert, und dieser veranlaßt dann bei Bestrahlung, daß molekularer Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff überführt wird. Der Singulett-Sauerstoff aktiviert dann die CV. Das durch die Aktivierung der CV mit Singulett-Sauerstoff gebildete Produkt zersetzt sich vorzugsweise spontan unter Emission von Licht, gewöhnlich mit einer Lebensdauer von 10 Mikrosekunden bis 10 Stunden, bevorzugt 100 Mikrosekunden bis 2 Stunden, bevorzugter 1 Sekunde bis 10 Minuten.
Einer der Faktoren, der die Steuerung der Zeit bis zur Lumineszenz gestattet, ist die Struktur der CV. Strukturelle Merkmale, die zu einer Verzögerung bei der Lumineszenz beitragen, sind komplex und nur teilweise vorhersagbar. Schaap, oben, und McCapra, oben, besprechen einige der beteiligten Prinzipien, und die relevanten Teile dieser Literaturstellen werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Ein anderer Faktor, der die Steuerung der Zeit bis zur Lumineszenz gestattet, ist die Zusammensetzung des Teilchens. Im allgemeinen werden, wenn das Teilchen aus einem nicht-polaren Material zusammengesetzt ist, in welchem die CV gelöst ist, die Abfallszeiten und Quantenwirkungsgrade im Vergleich zu polaren Materialien gesteigert.
Ein anderer Faktor, der verwendet werden kann, um die Zeit bis zur Lumineszenz zu steuern, ist die Temperatur. Im allgemeinen verringert eine Steigerung der Temperatur die Abfallszeit.
Ein anderer Faktor bei der Steuerung der Zeit bis zur Lumineszenz ist die Anwesenheit von Aktivatoren, die die Zersetzungsgeschwindigkeit der in der Reaktion erzeugten Dioxetane vergrößern. Derartige Aktivatoren schließen polarisierbare Lösungsmittel, wie Halogenkohlenstoffe, und gewisse Metallchelate, wie Europiumchelate, ein. Der Aktivator ist gewöhnlich in einer Menge anwesend, die ausreichend ist, um die gewünschte Verzögerung in der Zeit bis zur Lumineszenz zu erreichen. Diese Menge hängt von der Natur des Aktivators ab und beträgt im allgemeinen etwa 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹ M.
Der Photosensibilisator dient dazu, die CV zu aktivieren, wenn das Medium, das die obigen Reaktanten enthält, bestrahlt wird. Die Matrix wird mit Licht bestrahlt, das eine Wellenlänge mit ausreichender Energie aufweist, um den Photosensibilisator in einen angeregten Zustand zu überführen und ihn in die Lage zu versetzen, molekularen Sauerstoff zu Singulett-Sauerstoff zu aktivieren. Die Photosensibilisator-Konzentration der Matrix wird gewöhnlich optimiert, um die maximale Ausbeute an Singulett-Sauerstoff zu liefern, und beträgt häufig 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;¹ M.
Der angeregte Zustand des Photosensibilisators ist gewöhnlich der niedrigste Triplett-Zustand und ist mindestens 20 kcal/Mol, vorzugsweise mindestens 23 kcal/Mol energiereicher als der Grundzustand. Im allgemeinen wird die Matrix mit Licht mit einer Wellenlänge von etwa 300 bis 1200 nm, gewöhnlich 450 bis 950, bevorzugt 550 bis 800 nm bestrahlt. Die Zeitspanne der Bestrahlung hängt von der Lebensdauer der aktivierten CV, der Lichtintensität und der gewünschten Emissionsintensität ab. Bei kurzlebigen aktivierten CVs kann die Zeitspanne weniger als eine Sekunde, gewöhnlich etwa eine Millisekunde, betragen, kann aber so kurz sein wie eine Mikrosekunde, wenn eine intensive Blitzlampe oder ein Laser verwendet wird. Bei längerlebigen aktivierten CVs kann die Bestrahlungszeitspanne länger sein, und es kann eine weniger intensive stationäre Lichtquelle verwendet werden. Im allgemeinen sollte die integrierte Lichtintensität über den Bestrahlungszeitraum ausreichend sein, um mindestens 0,1% der Photosensibilisator-Moleküle, vorzugsweise mindestens 30%, anzuregen, und am bevorzugtesten wird jedes Photosensibilisator-Molekül mindestens einmal angeregt.
Die Lumineszenz oder das Licht, die bzw. das bei jeder der obigen Vorgehensweisen erzeugt wird, kann visuell, photographisch, aktinometrisch, spektrophotometrisch oder durch irgendein anderes bequemes Mittel gemessen werden, um ihre bzw. seine Menge zu bestimmen, welche mit der Menge an Analyt in dem Medium in Beziehung steht.
Ein Helium-Neon-Laser ist eine preiswerte Lichtquelle für eine Anregung bei 632,6 nm. Photosensibilisatoren, die bei dieser Wellenlänge Licht absorbieren, sind mit der Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers kompatibel und sind deshalb in der vorliegenden Erfindung besonders nützlich. Andere Lichtquellen schließen beispielsweise andere Laser, wie Argon, YAG, He/Cd und Rubin; Photodioden; Quecksilber-, Natrium- und Xenondampflampen; Glühlampen, wie Wolfram und Wolfram/Halogen; und Blitzlampen ein.
Eine spezielle Anwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten. Das Verfahren umfaßt die Schritte, daß man ein Medium, von dem man vermutet, daß es einen Analyten enthält, Bedingungen unterzieht, unter denen ein Komplex von sBp-Mitgliedern in Beziehung zur Anwesenheit des Analyten gebildet wird, und bestimmt, ob der spb-Mitglied-Komplex gebildet worden ist. Eine teilchenförmige Zusammensetzung der Erfindung wird als Marker verwendet, um die Bestimmung zu unterstützen. Ein sBp-Mitglied-Komplex, an dem das Markerreagenz beteiligt ist, wird in Beziehung zu der Anwesenheit von Analyt in dem Medium gebildet. Die Zusammensetzung wird dann mit Licht bestrahlt, und die Lichtenergie aus der chemilumineszierenden Verbindung wird beispielsweise durch visuelle Betrachtung, durch ein Instrument oder durch die Verwendung eines fluoreszierenden Energieakzeptors gemessen, wobei die Anwesenheit oder Intensität derselben mit der Menge an Analyt in dem Medium in Beziehung steht.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die eine feste Matrix umfaßt, welche darin einverleibt einen Photosensibilisator, der bei Aktivierung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung aufweist, welche durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann. Der Photosensibilisator kann kovalent an die chemilumineszierende Verbindung gebunden sein, ist aber gewöhnlich nicht gebunden. Der Photosensibilisator oder die chemilumineszierende Verbindung oder beide können kovalent an die Matrix geknüpft sein oder können ohne kovalente Bindungen mit der Matrix assoziiert sein. Die Zusammensetzung kann eine oder eine Mehrzahl unterschiedlicher chemilumineszierender Verbindungen und einen oder eine Mehrzahl unterschiedlicher Photosensibilisatoren umfassen und kann weiter eine oder eine Mehrzahl fluoreszierender Verbindungen umfassen, die Lichtenergie sammeln und diese auf den Photosensibilisator übertragen oder Energien aus der chemilumineszierenden Verbindung aufnehmen können. Die unterschiedlichen chemilumineszierenden Verbindungen können sich durch unterschiedliche Abfallsgeschwindigkeiten der Emission nach Aktivierung durch Singulett-Sauerstoff unterscheiden. Die Zusammensetzung kann auch einen Aktivator umfassen, der fluoreszierend sein kann oder nicht und der den Zerfall einer aktivierten chemilumineszierenden Verbindung beschleunigt. Die Zusammensetzung kann weiter ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sBp) daran gebunden aufweisen, wobei die Zusammensetzung gewöhnlich teilchenförmig ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die ein Teilchen umfaßt, welches darin einverleibt einen Photosensibilisator, der Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung umfaßt, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, wobei das Teilchen an ein Molekül gebunden ist, das beim Nachweis eines Analyten nützlich ist. Das Molekül ist ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares.
Der Photosensibilisator kann kovalent an die chemilumineszierende Verbindung gebunden sein, ist aber normalerweise nicht-kovalent mit der CV in dem Teilchen assoziiert. Der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung können in dem Teilchen gelöst sein.
Das Verfahren und die Zusammensetzungen der Erfindung können an die meisten Assays angepaßt werden, an denen sBp-Mitglieder beteiligt sind, wie Ligand-Rezeptor-, z.B. Antigen-Antikörper-Reaktionen, Polynukleotid- Bindungsassays und so weiter. Die Assays sind gewöhnlich heterogen, kompetitiv und Sandwich-artig eingeschlossen, können aber homogen sein, insbesondere, wenn ein Energieakzeptor verwendet wird.
Die Fähigkeit zur Lumineszenz, die von einer aktivierten CV erzeugt wird, um einen fluoreszierenden Energieakzeptor zu aktivieren, kann durch die Bindung der zwei sBp-Mitglieder gesteuert werden oder kann die Folge einer relativ hohen Konzentration des Energieakzeptors in der Matrix sein, welche die aktivierte CV enthält, wobei die Konzentration üblicherweise mindestens mikromolar, gewöhnlich mindestens millimolar ist. Wenn die Aktivierung durch Bindung gesteuert wird, ist die anfängliche Konzentration des Energieakzeptors in dem Assaymedium ziemlich gering, häufig 10&supmin;¹&sup5; bis 10&supmin;&sup6; M, gewöhnlich 10&supmin;¹² bis 10&supmin;&sup8; M.
Bei einer heterogenen Assay-Vorgehensweise wird eine Probe, von der man vermutet, daß sie einen Analyten enthält, der ein sBp-Mitglied ist, mit einer teilchenförmigen Matrix der vorliegenden Erfindung vereinigt, welche ein komplementäres sBp-Mitglied umfaßt. Die Matrix wird dann aus der flüssigen Phase abgetrennt, und entweder die feste Phase oder die flüssige Phase wird auf die Anwesenheit von Lumineszenzenergie überprüft, gewöhnlich durch Bestrahlung der speziellen fraglichen Phase und Messen der emittierten Lichtmenge. Alternativ kann der Assay auf homogene Weise durchgeführt werden, bei der ein Abtrennungsschritt nicht erforderlich ist. In dieser Situation wird ein Energieakzeptor verwendet, der mit einem anderen sBp-Mitglied assoziiert ist, wobei das sBp-Mitglied entweder komplementär zu (Sandwich) oder analog zu (kompetitiv) dem Analyten ist. Der Energieakzeptor ist häufig einem Teilchen einverleibt, an welches das sBp-Mitglied gebunden ist. Diese Materialien werden im allgemeinen entweder gleichzeitig oder ganz oder teilweise aufeinanderfolgend vereinigt. Die Bindung der sBp-Mitglieder findet im Verhältnis zu der Menge an anwesendem Analyten statt und hat zum Ergebnis, daß der Energieakzeptor in enge Nachbarschaft zu der aktivierten CV gebracht wird und die emittierte Energie aufnehmen kann. Der Vergleich von Werten, die bei der Testdurchführung erhalten werden, mit denjenigen, die unter Verwendung von Kontrollen mit bekannter Konzentration erhalten werden, ermöglicht die Bestimmung der Anwesenheit und/oder Menge des Analyten.
In einem spezifischen Bindungs-Assay kann die Probe, falls erforderlich, vorbehandelt werden, um unerwünschte Materialien zu entfernen. Die immunologische Reaktion bei einem Assay vom Sandwich-Typ beinhaltet gewöhnlich ein sBp-Mitglied, z.B. einen Antikörper, das komplementär zum Analyten und an die teilchenförmige Matrix gebunden ist, ein zweites sBp-Mitglied, z.B. Antikörper, das ebenfalls komplementär zum Analyten ist, und die interessierende Probe. Die immunologische Reaktion bei einem kompetitiven Protokoll beinhaltet gewöhnlich ein sBp-Mitglied, das komplementär zum Analyten ist, und ein sBp-Mitglied, das analog zum Analyten ist, gewöhnlich ein Derivat desselben. Eines dieser sBp- Mitglieder ist mit der teilchenförmigen Matrix assoziiert.
Ein Assay für den Analyten wird normalerweise in einem wäßrigen gepufferten Medium bei einem mäßigen pH durchgeführt, gewöhnlich bei demjenigen, der für die optimale Assay-Empfindlichkeit sorgt. Wie oben erklärt, wird der Assay üblicherweise unter Abtrennung (heterogen) von gebundener und ungebundener Fraktion der teilchenförmigen Matrix durchgeführt.
Bei dem wäßrigen Medium kann es sich um Wasser allein handeln, oder es kann 0,01 bis 80 oder mehr Volumenprozent eines Cosolvens einschließen. Der pH des Mediums liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 4 bis 13, gewöhnlicher im Bereich von etwa 5 bis 10 und vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Der pH ist gewöhnlich ein Kompromiß zwischen einer optimalen Bindung der Bindungsmitglieder und dem pH-Optimum zur Minimierung nicht-spezifischer Bindung und Maximierung des Quantenwirkungsgrades. Beispielsweise kann die aktivierte CV einen gewissen pH-Bereich erfordern, um zur Erzeugung von Lumineszenz zu zerfallen.
Es können verschiedene Puffer verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während der Bestimmung beizubehalten. Erläuternde Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen ein. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch für diese Erfindung, aber in einem einzelnen Assay kann ein Puffer gegenüber einem anderen bevorzugt werden.
Normalerweise werden mäßige Temperaturen für die Durchführung des Assays verwendet, und gewöhnlich konstante Temperaturen während der Zeitspanne der Messung, vorzugsweise Raumtemperatur. Inkubationstemperaturen liegen normalerweise im Bereich von etwa 5 bis 99ºC, gewöhnlich etwa 15 bis 70ºC, gewöhnlicher 20 bis 45ºC. Die Temperaturen während der Messungen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 70ºC, gewöhnlicher von etwa 20 bis 45ºC, gewöhnlicher 20 bis 25ºC. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, die aktivierte CV bis auf 100ºC zu erwärmen, damit sie zur Erzeugung von Lumineszenz zerfällt.
Die Analytenkonzentration, die getestet werden kann, variiert im allgemeinen von etwa 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹&sup7; M, gewöhnlicher von etwa 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup4; M. Überlegungen wie beispielsweise, ob der Assay qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ ist, die spezielle Nachweistechnik und die Konzentration des interessierenden Analyten bestimmen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien.
Während die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien in dem Assaymedium im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des Analyten bestimmt werden, wird die Endkonzentration von jedem der Reagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays über den Bereich zu optimieren. Das heißt, eine Schwankung in der Konzentration des Analyten, die signifikant ist, sollte für einen genau meßbaren Signalunterschied sorgen.
Während die Reihenfolge der Zugabe in breitem Maß variiert werden kann, gibt es bestimmte Präferenzen, abhängig von der Natur des Assays. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe ist, alle Materialien gleichzeitig zuzugeben. Alternativ können die Reagenzien ganz oder teilweise aufeinanderfolgend zusammengeben werden. Gegebenenfalls kann ein Inkubationsschritt beteiligt sein, nachdem die Reagenzien vereinigt sind, im allgemeinen im Bereich von etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, gewöhnlicher von etwa 2 Minuten bis 1 Stunde.
Nachdem alle Reagenzien vereinigt worden sind, können sie in einem heterogenen Assay inkubiert werden, falls gewünscht. Dann werden die feste und die flüssige Phase getrennt, und eine der Phasen wird bestrahlt, und das resultierende emittierte Licht wird gemessen. Das emittierte Licht steht mit der Menge an Analyt in der getesteten Probe in Beziehung. Die Mengen der Reagenzien der Erfindung, die in einem heterogenen Assay verwendet werden, hängen von der Natur des Analyten ab.
Die folgenden Zusammensetzungen und Assays werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angegeben, um den Fachmann in die Lage zu versetzen, den Bereich der vorliegenden Erfindung zu erkennen und die Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren durchzuführen. Es versteht sich, daß die Wahl von Analyten, Photosensibilisatoren, CVs, Oberflächen, Teilchen und Reaktionsbedingungen dem Fachmann im Hinblick auf die Offenbarung hierin und die Beispiele, die folgen, vorgeschlagen werden.
In den folgenden Assays werden die Komponenten in einem vorwiegend wäßrigen Medium mit pH 6 bis 8,5 vereinigt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die chemilumineszierende Verbindung 9-Benzal-10-methylacridan kovalent an einen Antikörper gegen Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) geknüpft. Das 9-Benzal-10- methylacridan, das mit einem N-Hydroxysuccinimidylester einer an den Phenylring geknüpften Carboxylgruppe funktionalisiert ist, reagiert mit den Aminogruppen des Antikörpers. Die verknüpfende Gruppe ist ein Carboxamid. Der verwendete Photosensibilisator ist Diodeosin. Der Photosensibilisator und die an Antikörper gebundene chemilumineszierende Verbindung werden kovalent an Latex-Teilchen gebunden, die eine durchschnittliche Abmessung von 0,5 µm aufweisen, um das Reagenz 1 zu ergeben. Die Latex-Teilchen und Diodeosin und die chemilumineszierende Verbindung werden mittels Chlormethylgruppen am Latex kovalent aneinandergebunden. Die kovalente Bindung von Diodeosin an chlormethylierten Latex, um eine Ester-Verknüpfungsgruppe bereitzustellen, wird in J. Am. Chem. Soc., 97: 3741 (1975) beschrieben. Ein zweiter Antikörper gegen TSH wird auf einer Mikrotiterplatten-Vertiefung absorbiert (Reagenz 2). Beide verwendeten Antikörper sind monoklonale Antikörper, die durch Standard-Hybridzellinien-Technologie hergestellt werden. Ein Antikörper erkennt die α-Untereinheit von TSH, und der andere erkennt die β-Untereinheit von TSH. Bei der Durchführung des Assays wird eine Serumprobe, von der man vermutet, daß sie TSH enthält, von einem Patienten erhalten.
Fünfzig Mikroliter der Probe werden in 500 ml wäßrigem Medium, mit Tris-Puffer bei pH 8,0 gepuffert, mit dem obigen Reagenz 1 vereinigt. Die Menge an Reagenz 1 ist ausreichend, um für eine Konzentration an Antikörper von etwa 10&supmin;³ molar zu sorgen. Die Reaktionsmischung wird dann zu der Mikrotiterplatten-Vertiefung (Reagenz 2) gegeben und über eine Zeitspanne von einer Stunde bei 25ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wird dann aus der Vertiefung entfernt, und die Platte wird mit einem gepufferten wäßrigen Medium bei pH 8,0 gewaschen und dann 30 Sekunden mit 560 nm-Licht bestrahlt. Die Lichtintensität, die nach der Bestrahlung emittiert wird, wird gemessen, und die gesamte Lichtenergie, die über eine Zeitspanne von 30 Sekunden nachgewiesen wird, wird mit Werten verglichen, die in einem ähnlichen Verfahren mit Proben mit bekannten Konzentrationen an TSH erhalten wurden, um die Konzentration an TSH in der unbekannten zu bestimmen. Alternativ wird nach Inkubation und Entfernung aus der Vertiefung die Reaktionsmischung, die ungebundene Latex-Teilchen enthält, ähnlich bestrahlt, und die Lichtmenge, die aus dem System emittiert wird, wird wie zuvor gemessen und mit Kontrollwerten verglichen.
Bei einer anderen alternativen Vorgehensweise wird das gleiche Reagenz 1 verwendet. Reagenz 2 ist ein Kohlenstoffteilchen (ein Energieakzeptor), an welches der zweite Antikörper nicht-kovalent gebunden ist. Der Assay wird durchgeführt, indem man 50 Mikroliter Probe, 50 µl einer Suspension von Reagenz 1, 50 µl einer Suspension von Reagenz 2 und 500 µl Tris-Puffer mit pH 8,0 mischt, eine Stunde inkubiert und mit Licht bestrahlt. Die Anwesenheit des Analyten wird durch eine Verringerung der Lichtemission im Vergleich zu Kontrollen angezeigt, die auf der Tatsache beruht, daß das Kohlenstoffteuchen auf Grund der Anwesenheit von TSH in der Probe in enge Nachbarschaft mit der aktivierten chemilumineszierenden Verbindung gebracht wird.
In einer anderen Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung werden Öltröpfchen (Reagenz 3) gemäß Giaever, oben, aus einer Lösung des Photosensibilisators Chlorophyll in Mineralöl hergestellt. Die Öltröpfchen, deren Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 2 µm liegt, werden funktionalisiert und mit einem monoklonalen Antikörper gegen menschliches Choriongonadotropin (hCG) verknüpft. Das Chlorophyll ist lipophil und wird deshalb irreversibel in den lipophilen Öltröpfchen gelöst. 9-(Diphenylmethyliden)-N-methylacridan wird ebenfalls irreversibel in den liphophilen Öltröpfchen gelöst, indem man eine N,N-Didodecylcarboxamidgruppe einschließt, welche an eine der Phenylgruppen des Acridans gebunden ist. Ein zweiter monoklonaler Antikörper gegen hCG, der einen anderen Teil des hCG-Moleküls erkennt als denjenigen, der von dem ersten, oben erwähnten monoklonalen Antikörper erkannt wird, wird auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Die monoklonalen Antikörper werden durch Standard-Hybridzellinien-Technologie hergestellt. Eine Urinprobe, von der vermutet wird, daß sie hCG enthält (50 Mikroliter), wird in einem wäßrigen gepufferten Medium (500 ml) bei pH 7,5 mit überschüssigen Mengen an Reagenz 3 vereinigt und dann in die Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben. Das Medium wird über eine Zeitspanne von 20 Minuten bei 25ºC inkubiert. Das Medium wird dann von der Platte abgetrennt, und die Platte wird mit Puffer bei pH 8 gewaschen. Die Platte wird unter Verwendung einer Wolfram/Halogen-Lampe mit einem Sperrfilter über eine Zeitspanne von einer Minute bei > 650 nm bestrahlt, und das emittierte Licht wird, wie oben beschrieben, gemessen. Die Lichtmenge wird mit der Menge verglichen, die unter Befolgen des obigen Verfahrens unter Verwendung von Proben emittiert wird, die bekannte Mengen an hCG enthalten, und die Menge an hCG in der unbekannten Probe wird durch Vergleich der Werte bestimmt. Auf diese Weise wird ein bequemer und empfindlicher Immunassay für hCG durchgeführt. Indem man
(hergestellt, wie im US-Patent Nr.5,039,818 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) zusammen mit dem Chlorophyll in dem Mineralöl einschließt, wird mehr Licht absorbiert und auf das Chlorophyll übertragen, und die Intensität des emittierten Lichts bei einer gegebenen Konzentration von hCG kann gesteigert werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Liposomen (0,2 µm Durchmesser) durch Hochdruckextrusion einer Suspension von x% Phosphatidylserin, y% Phosphatidylglycerin, z% Phosphatidylethanolamin und q% Phosphatidylethanolamin, das über eine Amid-Verknüpfung an n-Acetylthyroxin konjugiert ist, in einem Puffer bei pH 7,4 durch eine Membran mit 0,2 µm-Poren gebildet, wobei ein im Handel erhältliches Instrument verwendet wird, das für einen derartigen Zweck konstruiert ist.
Tripyrroldimethin-Farbstoff (34) wird in dem lipophilen Teil des Liposoms gelöst. Ein Enolether, 1-[1-(10-Carboxydecyloxy)-2-vinyl]pyren (33) und die Liposomen werden mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids durch eine Carboxamid-Verknüpfungsgruppe kovalent verknüpft (Reagenz 4).
Ein monoklonaler Antikörper gegen Thyroxin wird auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Das Reagenz 4 wird in einem wäßrigen gepufferten Assaymedium (500 ml) bei pH 8,0 mit einer Serumprobe vereinigt, von der man vermutet, daß sie Thyroxin enthält, und die Anilinonaphthalinsulfonsäure enthält, um Thyroxin aus bindenden Proteinen zu verdrängen (50 Mikroliter). Das Assaymedium wird dann mit der Mikrotiterplatte vereinigt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium wird von der Platte abgetrennt, welche mit Puffer bei pH 8 gewaschen und dann über eine Zeitspanne von 1 Minute bei 650 nm bestrahlt wird, und das resultierende emittierte Licht wird mittels eines Luminometers gemessen. Der erhaltene Wert wird mit Werten verglichen, die durch Durchführung eines ähnlichen Assays mit bekannten Mengen an Thyroxin erhalten wurden. Auf diese Weise wird die Menge an Thyroxin in der Serumprobe quantitativ bestimmt.
In einer anderen Ausführungsform dient der Assay zur Bestimmung eines speziellen Blutgruppen-Antigens auf der Oberfläche einer roten Blutzelle, nämlich eines Antigens der Gruppe A. Kommerzielle Latex- Teilchen mit einer Oberfläche, die Carboxylgruppen umfaßt, und mit einer Teilchengröße von 150 - 500 nm werden verwendet. Die Latex-Teilchen werden in Ethylenglycol mit dem Sensibilisator, nämlich Chlorophyll, und der chemilumineszierenden Verbindung 36, nämlich dem Dioxen
erwärmt, wobei die zwei Verbindungen nicht-kovalent in den Teilchen gelöst werden. Die Teilchen werden dann kovalent an einen Antikörper gegen das Antigen der Gruppe A geknüpft, indem man eine Suspension der Teilchen mit einem wasserlöslichen Carbodiimid behandelt, gefolgt von der Zugabe des Antikörpers, Inkubation, Abtrennung der Teilchen durch Chromatographie auf einer G100-Größenausschluß-Säule und Verdünnung der Teilchen enthaltenden Fraktionen mit Tris-Puffer bei pH 8. Dieses Latex-Teilchen-Reagenz wird in dem wäßrigen Medium (500 ml) mit Vollblut (100 ml) vereinigt. Das Medium wird über eine Zeitspanne von 10 Minuten bei 25ºC inkubiert. Als nächstes werden die Zellen durch kurze Zentrifugation abgetrennt, mit Puffer gewaschen und über eine Zeitspanne von 30 Sekunden mit einer Wolfram-Quelle, die mit einem 650 nm-Sperrfilter versehen ist, mit Licht bei > 650 nm bestrahlt. Das Licht, das nach dem Bestrahlungszeitraum von den Zellen emittiert wird, wird gemessen und mit der Menge an Licht verglichen, die in Proben erhalten wird, von denen bekannt ist, daß sie frei von roten Blutzellen mit Antigen der Gruppe A sind. Demgemäß zeigt die Menge an Licht oberhalb eines Schwellenwertes die Anwesenheit von Antigen der Blutgruppe A an.
In einer anderen Ausführungsform werden die Latex-Perlen des vorstehenden Beispiels zusammen mit Latex-Perlen verwendet, welche identisch sind, außer daß in den Perlen Eu(TTA)&sub3; 35 zusammen mit dem Photosensibilisator und der chemilumineszierenden Verbindung gelöst wird und die an deren Oberfläche gebundenen Antikörper gegen das Antigen der Blutgruppe B gerichtet sind.
Das Eu(TTA)&sub3; ist in der Lage, die Abfallsgeschwindigkeit der Lumineszenz der aktivierten CV zu vergrößern und die Lichtenergie aufzunehmen und sie bei längerer Wellenlänge (615 nm anstelle von 360 nm) wieder zu emittieren. Der Assay wird wie in dem vorangehenden Beispiel durchgeführt. Nach der Bestrahlung wird die Lichtemission aus den Zellen überprüft. Eine Emission bei 380 nm steht mit der Anwesenheit des Antigens A in Beziehung; eine Emission bei 615 nm steht mit der Anwesenheit des Antigens B in Beziehung. Wegen der unterschiedlichen Abfallsgeschwindigkeiten kann die 615 nm-Emission während der ersten 20 Sek. beobachtet werden, und die 360 nm-Emission kann nach etwa einer Minute beobachtet werden. Die zwei Intensitäten können durch Auflösung der Form der Abfallskurve und/oder durch die Verwendung von Filtern bestimmt werden, welche so ausgelegt sind, daß sie selektiv nur eine der Emissionswellenlängenbanden zu einem Photodetektor durchlassen. Die Menge jeder Lichtwellenlänge über einem Schwellenwert steht mit der Anwesenheit des entsprechenden Blutgruppen-Antigens in Beziehung.
In einem Assay für eine Ziel-Polynukleotidsequenz in einer Probe, die DNA enthält, wird ein Oligonukleotid mit 25 Basen, das komplementär zu der Ziel-Sequenz ist, mit der CV 23 assoziiert, bei der es sich um 9- Phenylmethylidenxanthan handelt. Die CV und der Photosensibilisator Tetraoctadecylporphyrin werden beide, wie oben beschrieben, in einem Latex-Teilchen gelöst. Die Carboxylgruppen auf der Latex-Oberfläche werden mit Carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid in Ethylenglycol aktiviert und dann an das Oligonukleotid gekuppelt, an welchem eine Aminogruppe für die Zwecke der Bindung an die Teilchen angeknüpft ist. Das Latex-Teilchen- Reagenz wird mit der Probe und einer Suspension von magnetischen Teilchen gemischt, welche ein zweites Oligonukleotid mit 25 Basen daran gebunden aufweisen, das sich an eine verschiedene Stelle der Ziel-Sequenz binden kann. Das Medium wird dann auf 75ºC erwärmt und auf 55ºC abgekühlt, um die Hybridisierung des Oligonukleotids an jegliche vorhandene Ziel-Sequenz zu gestatten. Die magnetischen Teilchen werden dann mittels eines Magneten abgetrennt. Das Pellet wird dann mit 115 nm-Licht aus einem Heine-Laser bestrahlt, und die Intensität des Lichts, das von der chemilumineszierenden Verbindung 23 (etwa 350 nm) nach Beendigung der Bestrahlung emittiert wird, wird gemessen. Die Lichtintensität steht direkt mit der Anwesenheit der Ziel-Sequenz in Beziehung.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Teilchen der Erfindung als Bezugs-Perlen verwendet, um für eine Kalibrierung in einem Assay zu sorgen. Ein Satz von Latex-Perlen (180 nm) wird mit Chlorophyll angef ärbt. Ein anderer Satz von Latex-Perlen (180 nm), der als "Akzeptor-Perlen" bezeichnet wird, wird hergestellt, welcher den chemilumines zierenden Akzeptor 1,2-Diphenyl-3-p-dimethylaminophenyl- Δ5,6-morpholin enthält, der mit einer Halbwertszeit von 2 Sekunden zerfällt. Die mit Chlorophyll angefärbten Perlen werden mit Anti- Fluorescein-Antikörpern beschichtet, und die Akzeptor-Perlen weisen Avidin an ihre Oberfläche gebunden auf. Eine 50 µl-Serumprobe, von der vermutet wird, daß sie menschliches Choriongonadotropin (hCG) enthält, wird mit 200 µl Lösung vereinigt, die einen Anti-α-Ketten-Antikörper, markiert mit Fluorescein, und einen Anti-hCG-β-Ketten-Antikörper, markiert mit Biotin, enthält. Nach 10-minütiger Inkubation der Mischung werden der Mischung 200 µl einer Suspension zugesetzt, die 2 µg von jeder der obigen Perlen und 1 µg 180 nm-Bezugsperlen (Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung) enthält, welche sowohl Chlorophyll als auch 1-Phenyl-2-p- dimethylaminophenyl-5,6-dihydro-1,4-dioxen, einen chemilumineszierenden Akzeptor, der mit einer Halbwertszeit von 2 Minuten zerfällt, enthalten. Die Mischung wird 10 Minuten inkubiert und dann während einer Sekunde mit einer Wolfram-Halogen-Lampe bestrahlt, die mit einem 650 nm-Langpaß- Sperrfilter versehen ist. Das während der nächsten 10 Sekunden aus der Probe emittierte Licht (ST) wird gemessen, gefolgt von der Messung des emittierten Lichts (SC) über einen anderen 10-sekündigen Zeitraum. Das Licht, das während des zweiten Zeitraumes emittiert wird, stammt vollständig aus den Bezugsperlen. Das Signal B, das bezüglich Variablen wie Lichtintensität, Photozellenempfindlichkeit, Schwankungen der Belichtungszeit, Temperatur usw. korrigiert ist, wird dann aus dem Ausdruck: B = ST/CSC - 1 berechnet, wobei C = ST/SC, wenn kein Analyt anwesend ist. Falls gewünscht, können die einsekündige Bestrahlung und die 10-sekündige Ablesesequenz mehrere Male vor der 10-sekündigen Endmessung von SC wiederholt werden. In diesem Fall ist ST die Summe von jeder der Ablesungen, außer der Endablesung, und B wird auf die gleiche Weise berechnet. B wird dann für einen oder mehrere Kalibratoren bestimmt, die bekannte Mengen an hCG enthalten. Schließlich wird das Signal B mit dem bzw. den Signal(en) B aus dem bzw. den Kalibrator(en) verglichen, um die Konzentration an hCG in der Probe zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter Zusammensetzungen, welche ein suspendierbares Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 20 Nanometern bis 20 Mikrometern umfassen, das mit einer chemilumineszierenden Verbindung und einem Photosensibilisator assoziiert ist. Die chemilumineszierende Verbindung und der Photosensibilisator können kovalent an die Teilchenmatrix gebunden sein, oder sie können nichtkovalent an die Teilchenmatrix gebunden oder in derselben gelöst sein. Die Teilchen sind vorzugsweise polymer, oder sie sind Öltröpfchen oder Vesikel, wie Liposomen. Wenn das Teilchen ein Liposom ist, können die chemilumineszierende Verbindung und der Photosensibilisator mit der Lipid- Doppelschicht assoziiert sein oder in dem wäßrigen Inneren des Liposoms gelöst sein. Zur Verwendung in Assays kann ein sBp-Mit glied an die Teilchen gebunden sein. Vorzugsweise weisen sBp-gebundene Teilchen einen Durchmesser von 100 bis 1000 nm auf. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Testsätze, die zur bequemen Durchführung eines Assayverfahrens der Erfindung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe, von der man vermutet, daß sie den Analyten enthält, nützlich sind. Um die Anpassungsfähigkeit der vorliegenden Erfindung zu vergrößern, können die Reagenzien in abgepackter Kombination in denselben oder gesonderten Behältern bereitgestellt werden, so daß das Verhältnis der Reagenzien für eine wesentliche Optimierung des Verfahrens und Assays sorgt. Die Reagenzien können jeweils in gesonderten Behältern vorliegen, oder es können verschiedene Reagenzien in einem oder mehreren Behältern vereinigt sein, abhängig von der Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagenzien. Der Testsatz umfaßt eine Zusammensetzung, die ein suspendierbares Teilchen umfaßt, das damit assoziiert eine chemilumineszierende Verbindung und einen Photosensibilisator aufweist, wobei das Teilchen ein sBp-Mitglied daran gebunden aufweist. Der Photosensibilisator kann mit einem Teilchen assoziiert sein, an welches ein sBp-Mitglied gebunden ist. Der Testsatz kann weiter andere gesondert abgepackte Reagenzien zur Durchführung eines Assays einschließen, wie einen Energieakzeptor, der an ein sBp-Mitglied gebunden ist, zusätzliche sBp-Mitglieder, ergänzende Reagenzien und so weiter.

BEISPIELE

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden erläuternden Beispiele veranschaulicht. Darin angeführte Teile und Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben. Temperaturen sind in Grad Celsius (ºC).

Beispiel 1

Herstellung von Polystyrol-Teilchen mit einem Photosensibilisator und einer chemilumineszierenden Verbindung darin einverleibt

Die verwendeten Teilchen waren Carboxylat-modifizierter 0,716 µm- Latex (CML) (Duke Scientific, Artikel Nr. 7638).
Der Photosensibilisator-Farbstoff war Tetra-nC&sub1;&sub0;-phthalocyanin (nC&sub1;&sub0;PC) (Ultra Diagnostics, Artikel Nr. GR11-82), 2,5 mg/ml in Benzylalkohol. MG 1180 (2,1 mM).
Die chemilumineszierende Verbindung war p-(N,N-Dioctadecylcarboxamidomethoxy)benzal-9-methylacridan (C&sub1;&sub8;-Benzalacridan), 10 mM in Benzylalkohol, hergestellt wie folgt: Zu 10-Dimethoxyphosphinyl-9- methylacridan (Monatsh. Chem. 114: 3 (1988)) (MG 303,27, 0,100 g, 3,3 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) wurden bei -78ºC (Aceton/Trockeneis-Bad) unter Argon 0,413 ml 1,6 M n-Butyllithium-Lösung in Hexan gegeben. Nach der Zugabe der n-Butyllithium-Lösung sah die Lösung gelb aus. Eine Lösung des obigen Amids in THF wurde 20 Minuten nach der Zugabe von n-Butyllithium dazugegeben Man ließ die Reaktionslösung sich über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen.
Am folgenden Tag wurde das Produkt durch TLC isoliert (Kieselgel - 3:7 - Ethylacetat/Hexan). Das isolierte Produkt wurde durch Massenspektrum-Analyse und NMR analysiert und im Dunkeln aufbewahrt.
Vorschrift für Teilchen-Herstellung: 0,8 ml Ethylenglycol, 0,1 ml Benzylalkohol, 1, 2, 4 bzw. 8 µl Photosensibilisator-Farbstoff (nC&sub1;&sub0;PC) (Teilchen-Präparate A, B, C bzw. D) und 10 µl C&sub1;&sub8;-Benzalacridan wurden zusammengemischt, und die Mischung wurde 1 Min. auf 100 bis 110ºC erwärmt. Dann wurden 0,1 ml 0,716 µm-CML zu der Mischung gegeben, welche 5 Min. bei 100 bis 110ºC erwärmt wurde. Man ließ die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen. Gleiche Volumina von Ethanol wurden dazugegeben, und die Mischung wurde 30 Min. bei 15 K zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde dekantiert, und die Teilchen wurden mit 2 ml Ethanol vereinigt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Wasch- und Zentrifugationsschritte wurden unter Verwendung von Wasser wiederholt. Die Teilchen wurden in Wasser auf ein Endvolumen von etwa 1 ml und 1,0% Feststoffe, d.h. 4,95 x 10¹&sup0; Teilchen pro ml, resuspendiert.
Das von den Teilchen emittierte Licht wurde unter Verwendung eines Turner TD-20e-Luminometers aufgezeichnet. Die Verzögerungszeit war 0, und das Integral war 20 Sekunden. Häufig wurden zusätzliche 20 Sekunden- Ablesungen vorgenommen, um die Abfallshalbwertszeit der Teilchen zu bestimmen. Die Teilchen wurden 60 Sekunden unter Verwendung einer Halogenlampe und eines 650 nm-Sperrfilters belichtet.
Typischerweise wurden 10 µl Teilchen-Suspension von oben in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf 1 ml verdünnt; 100 µl der verdünnten Teilchen wurden verwendet, um die emittierten relativen Lichteinheiten (RLE) zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt: Tabelle 1
Wirkung von Detergens: 10 µl Teilchen wurden in 1 ml 1%-igem Triton X-100 (Präparat F) anstelle der oben beschriebenen Verdünnung mit PBS verdünnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt: Tabelle 2
Es wurde eine sehr geringe Detergens-Wirkung beobachtet. Daraus könnte man die Schlußfolgerung ziehen, daß der Photosensibilisator und die CV tief in den Polystyrol-Teilchen interkaliert waren.

Beispiel 2

Herstellung von Polystyrol-Teilchen mit Photosensibilisator, chemilumineszierender Verbindung und Energieakzeptor darin einverleibt

Versuch A. Reagenzien: (1) 1 ml 0,175 µm CML (10%-ige wäßrige Suspension), (2) Reaktionsmedium (1 ml Ethoxyethanol, das 10 mM Dioxen 10, worin X&sub2; N(CH&sub3;)&sub2; ist, 20 mM Europiumthenoyltrifluoracetonat (EuTTA), 60 mM Trioctylphosphinoxid (TOPO) enthielt) und (3) Photosensibilisator- Vorratslösung (Tetra-nC&sub1;&sub0;-phthalocyanin (siehe Beispiel 1) (nC&sub1;&sub0;PC), hergestellt als gesonderte Lösung in Benzylalkohol, 2,5 mg/ml (MG = 1180), etwa 2,1 mM).
Ein ml CML-Teilchen wurde mit 1 ml Ethoxyethanol vereinigt und in einem Ölbad auf etwa 100º erwärmt. Während man heftig rührte, wurde 1 ml des obigen Reaktionsmediums zu den Teilchen gegeben. Darauffolgte sofort eine Aliquote von nC&sub1;&sub0;PC (10, 25 oder 50 µl). Das Erwärmen wurde 10 Min. fortgesetzt. Man versuchte, die Mischung gerade etwas unterhalb des Siedepunktes des Wassers zu halten, beobachtete aber ein gelegentliches Sieden.
Versuch B. Ein zu A oben ähnliches Verfahren wurde verwendet, um die Teilchen herzustellen, bei denen der Photosensibilisator in der Photosensibilisator-Vorratslösung Chlorophyll a (Chlor a) anstelle von nC&sub1;&sub0;PC war. Die Konzentration von Chlor a in der Photosensibilisator- Vorratslösung war 5 mM in Benzylalkohol. 10, 25 und 50 µl-Aliquoten von Chlor a wurden verwendet.
Nach dem 10-minütigen Erwärmungszeitraum wurden die Mischungen aus dem Ölbad entfernt, und man ließ sie auf Raumtemperatur abkühlen. Die Mischungen wurden dann mit 6 ml Ethanol verdünnt und 30 Min. bei 15 K zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen, und die Pellets wurden durch Beschallung in 50%-iger Ethanol-Lösung resuspendiert. Das Zentrifugieren wurde wiederholt, gefolgt von einem weiteren Waschen mit 50%-igem Ethanol. Das End-Pellet aus der Zentrifugation wurde in 10%-iger Ethanol-Lösung resuspendiert, um eine Teilchenkonzentration von 1 Gewichts-%, d.h. 10 mg/ml (3,35 x 10¹² Teilchen pro ml), zu ergeben.
Die Chemilumineszenz der oben hergestellten Teilchen wurde untersucht. Die Teilchen (Versuch A oder Versuch B) wurden in 0,1 M Tris, 0,3 M NaCl, 25 mM EDTA, 1 mg/ml BSA, pH 8,2, auf 10 µg/ml verdünnt. 0,1 ml dieser verdünnten Mischung wurde 60 Sek. mit einer Halogenlampe belichtet, die mit einem 610 nm-Langpaßfilter versehen war. Das erste 20sekündige Integral der Chemiluminszenz wurde auf einem Turner TD-20e- Luminometer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3
Nachweisbarkeit der Teilchen: 1 µg = 3,35 x 10&sup8; Teilchen oder 5,56 x 10&supmin;¹&sup6; Mol. Wenn die Nachweisbarkeit als 1 RLE definiert wird, dann sind 10&supmin;¹&sup8; Mol der obigen Teilchen (Versuch A) nachweisbar. Dies ist etwas weniger als 1 Million Teilchen.
Eine Teilchen-Suspension (Versuch A) zu etwa 1 mg/ml wurde 30 Sek. mit der Halogenlampe und dem 610 nm-Filter belichtet. Die Teilchen wurden dann in ein Fluorometer gegeben, und die Emissionswellenlänge wurde durchmustert. Etwas schwache Dioxan 10-Emission wurde bei etwa 420 nm beobachtet, aber der Hauptteil des emittierten Lichtes stammte aus EuTTA bei etwa 613 nm.
Das gleiche Experiment wurde mit den Teilchen aus Versuch B durchgeführt, und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

Beispiel 3

Assay für Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH)

Abkürzungen:

Ab&sub1;-Biotin - biotinylierter Antikörper gegen TSH
Ab&sub2;-Fluorescein (Ab&sub2;-F) - monoklonaler Antikörper gegen TSH, an den Fluorescein konjugiert ist
AbF oder IgG (AbF) - Antikörper gegen Fluorescein aus der Zellinie 3G1, hergestellt durch Standard-Hybridzellen-Technologie, wie oben angegeben BSA - Rinderserumalbumin, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, Kat.-Nr. A-7888
D-H&sub2;O - entionisiertes Wasser
EDAC - 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, Sigma Chemical Company
GB-Avidin - Glasperlen (0,5 cm Durchmesser), die mit Avidin beschichtet sind; von Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, Kalifornien
NaPi - Natriumphosphat
PBS - Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,02 M NaPi, 0,15 M NaCl, pH 7,3
RLE - relative Lichteinheiten
SATA - S-Acetylthioglycolsäure-NHS-Ester, von Sigma Chemical Company Sulfo-NHS - Sulfo-N-hydroxysuccinimid, von Pierce Chemical Company

Herstellung des Konjugats von Antikörper gegen β-TSH und Fluorescein (Ab&sub2;-F):

A. Materialien:

6-Carboxyfluorescein (Kodak, Rochester, N.Y.); 4,9-Dioxa-1,12- dodecandiamin (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin); trockenes DMF, über Calciumoxid destilliert; Ag-MP-1 (Cl&supmin;)-Anionenaustauscherharz (Biorad Laboratories, Richmond, Kalifornien); monoklonaler Antikörper gegen TSH (Ab&sub2;) von der Hybridzellinie 9G3, hergestellt durch Standard-Hybridzellen- Kulturtechnologie unter Verwendung eines Verfahrens, das dem von Köhler und Milstein beschriebenen, Nature (1975), 265: 495 - 497, ähnlich war.

B. Fluoresceinaminhydrochlorid (F-LC-Amin):

6-Carboxyfluorescein (10 g, 26,6 mMol) wurde in trockenem Dimethylformamid (DMF) (25 ml) gelöst. N-Hydroxysuccinimid (NHS) (Sigma Chemical Co.) (3,22 g, 28 mmol) wurde als Festkörper zu der DMF-Lösung gegeben, und man ließ es sich auflösen. Die Mischung wurde dann in einem Eisbad gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid (Aldrich Chemical Co.) (5,8 g, 28 mmol) wurde in trockenem DMF (10 ml) gelöst und auf einmal zu der kalten DMF-Lösung gegeben. Die Mischung wurde 30 Min. bei Eisbadtemperatur gerührt, und dann ließ man sie auf Raumtemperatur kommen. Der Verlauf der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (10% Methanol-CH&sub2;Cl&sub2;, das 1% Essigsäure enthielt). Nach 3 Stunden war die Bildung des Fluorescein-NHS-Esters vollständig.
4,9-Dioxa-1,12-dodecandiamin (25,5 g, 125 mMol) wurde mit trockenem DMF (10 ml) verdünnt. Die Fluorescein-NHS-Ester-Reaktionsmischung wurde unter einer Argonatmosphäre in Eis gekühlt, und die Diamin-Lösung wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 5 Minuten dazugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt, und das Rühren wurde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Der Verlauf der Reaktion wurde durch TLC unter Verwendung des obigen Systems verfolgt. Als die Reaktion als beendet angesehen wurde, wurde die Mischung mit Wasser (100 ml) verdünnt und in Eis gekühlt, um Dicyclohexylharnstoff auszufällen, der durch Filtration entfernt wurde.
Das Filtrat wurde mit AG-MP-1-(Cl-)-Anionenaustauscherharz aufgeschlämmt und in eine Chromatographiesäule gegossen. Das Harz wurde mit 50%-igem wäßrigen Methanol gewaschen, bis kein freies Diamin mehr durch Ninhydrin nachweisbar war. Das Harz wurde dann mit 0,1 N Chlorwasserstoffsäure in 50%-igem wäßrigem Methanol eluiert. Fluoresceinaminhydrochlorid wurde zuerst eluiert, gefolgt von 6- Carboxyfluorescein. Reine Fraktionen wurden zusammengegeben und am Rotationsverdampfer (Rotovap) zur Trockene gebracht. Nach Trocknen unter Hochvakuum wurden 3,4 g reines Fluoresceinaminhydrochlorid gewonnen.

c. Herstellung von F-LC-Diglycolat (F-LC&sub1;&sub8;-COOH):

F-LC-Amin (500 mg, 0,87 mMol), hergestellt wie in Teil B oben beschrieben, wurde in 6 ml DMF gelöst. Triethylamin (TEA) (121 µ, 0,87 mMol) wurde zu der DMF-Lösung gegeben. Diglycolsäureanhydrid (Aldrich Chemical Co.) (101 mg, 0,87 mMol) wurde in 1 ml DMF gelöst und zu der Mischung gegeben. Zusätzliche 25 mg Diglycolsäureanhydrid wurden dazugegeben, um die Reaktion vollständig zu machen, wie durch Kieselgel- TLC, Methanol - Dichlormethan - Essigsäure (20:79:1) beurteilt.
Das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol gelöst. Die Methanol-Lösung wurde mit Polystyrol-Biobeads SM-2 (BioRad Laboratories) aufgeschlämmt. Die Perlen wurden mit Wasser gewaschen, um Diglycolsäure und TEA zu entfernen. Das Produkt wurde dann von den Biobeads in ein großes Volumen Methanol abgezogen. Nach Entfernung des Methanols auf einem Rotationsverdampfer wurden 560 mg Produkt gewonnen. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung oder Charakterisierung verwendet.

D. Herstellung von F-LC&sub1;&sub9;-NHS-Ester:

F-LC&sub1;&sub9;-NHS-Ester wurde hergestellt, indem man 20 mg F-LC&sub1;&sub8;-COOH (in 300 µ wasserfreiem DMF, hergestellt wie oben in Teil C beschrieben) mit 12 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (in 100 µ wasserfreiem DMF) mischte. Die Reaktionsmischung wurde in einem dicht verschlossenen Glasfläschchen sanft 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung durch Glaswolle filtriert, um Cyclohexylharnstoff (Nebenprodukt dieser Reaktion) zu entfernen. Die filtrierte Reaktionsmischung wurde mit 2 ml Hexan extrahiert (um unumgesetztes DCC zu entfernen). Die Bildung von F-LC&sub1;&sub9;-NHS wurde durch TLC unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems von Dichlormethan:Methanol (80:20) bestätigt.

E. Ab&sub2;-F

Ab&sub2;IgG wurde durch Reinigung von Ab&sub2; mittels immobilisierten Proteins A (Repligen, Inc., Cambridge, MA) gemäß Standardverfahren hergestellt. Ab&sub2;-F wurde hergestellt, indem man 1 ml 5,6 mg/ml Ab&sub2;IgG in 0,05 M NaPi, 0,1 M NaCl/pH 7,6 mit 20 µ wasserfreiem DMF, das F-LC&sub1;&sub9;-NHS enthielt (IgG: F-LC&sub1;&sub9;-NHS = 1:20), 2 Std. bei Raumtemperatur umsetzte. Dann wurde die Reaktion mittels einer Sephadex G-25-Säule (1,5 x 20 cm) gereinigt, welche in 0,02 M NaPi, 0,15 M NaCl, pH 7,4, äquilibriert war. Die Hapten-Zahl wurde durch Standardverfahren bestimmt, und man fand, daß sie 2,9 war (2,9 Fluorescein-Moleküle pro IgG). Das Endprodukt wurde in Aliquoten aufgeteilt und gefroren aufbewahrt.

Herstellung von biotinyliertem Antikörper gegen TSH (Ab&sub1;-Biotin):

Antikörper gegen beta-TSH (Ab&sub1;) stammte von der Hybrid-Zellinie 2101 von BiosPacific, 405 Harlan St., Emeryville, Kalifornien, ab. Antikörper gegen TSH (Ab&sub1;, etwa 2 - 2,5 mg/ml in 0,05 M NaPi, 0,05 M NaCl/pH 7,8) und Biotin-LC&sub7;-NHS (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) (zuerst in DMF solubilisiert, und eine kleine Aliquote für die Reaktion verwendet) wurden zusammengemischt und drei Stunden bei 4ºC inkubiert. In der Reaktionsmischung betrug das Molverhältnis der Reaktanten Ab&sub1;:Biotin-LC&sub7;- NHS = 1:25. Das ungekuppelte Biotin wurde durch eine Sephadex G-25-Säule entfernt. Das Endkonjugat wurde in 0,05 M NaPi, 0,001% Thimerosal/pH = 7,4 bei 4ºC oder gefroren aufbewahrt.

Herstellung von Rit Anti-Fluorescein-Antikörper beschichteten Teilchen:

Die in diesem Beispiel verwendeten Teilchen waren carboxylierte 0,04 µm-Polystyrol-Perlen mit dem Singulett-Sauerstoff-Akzeptorfarbstoff C&sub1;&sub8;- Benzalacridan und dem Singulett-Sauerstoff-Erzeuger oder Sensibilisator- Farbstoff (nC&sub1;&sub0;PC), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
EDAC/Sulfo-NHS-Konjugationschemie wurde verwendet, um den AbF an diese Polystyrol-Perlen zu kuppeln (AbF-Perlen). Typischerweise wurden 10 ml 0,02 M NaPi, die 6 mg/ml der carboxylierten Polystyrol-Perlen aus Beispiel 1 und 11 mg/ml Sulfo-NHS (pH auf 5,5 eingestellt) enthielten, mit frisch hergestelltem EDAC, 1 ml, 200 mglml, in D-H&sub2;O gemischt. Nach 25- minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur (dunkel) wurden die Perlen zentrifugiert, um überschüssiges EDAC zu entfernen (da EDAC eine Mikroaggregation dieser Perlen verursacht, ist es möglich, sie mit herkömmlichem Zentrifugieren mittels einer Sorval-Zentrifuge unter Verwendung eines SA-600-Rotors bei 15000 U/min zu pelletieren). Die pelletierten Perlen wurden durch Beschallung in 3 ml 0,005 M NaPi/5,8 resuspendiert und dann in die gerührte Protein-Lösung überführt, welche 15 ml 0,02 M Borax (Sigma Chemical Company), 0,08 M NaCl, 2 mg/ml 3G1 IgG(AbF) und 8 mg/ml BSA/pH 8,9 enthielt. Die Mischung wurde sanft bei 4ºC über Nacht (kein Rühren) gemischt. Die verbleibenden reaktiven Gruppen auf den Perlen (falls vorhanden) wurden blockiert, indem man diese mit 0,083 M Glycin und 15 mg/ml BSA bei pH 8,9 60 Minuten bei 4ºC behandelte. Ungekuppelte Proteine wurden durch aufeinanderfolgendes Waschen mit 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl bei pH 7,6 entfernt. Das End-Pellet wurde in dem Waschpuffer resuspendiert, beschallt und wie es war bei 4ºC aufbewahrt. Die Endgröße dieser Perlen betrug 140 nm.

TSH-Assay:

Ein TSH-Assay wurde durchgeführt, indem man 200 µl TSH-Kalibratoren in TSH-freiem Serum (0, 0,1, 1, 10 und 100 ng/ml) in 12 x 75 nm- Glasteströhrchen überführte, dann gefolgt von 100 µl 2 µg/ml Ab&sub1;-Biotin und 1 µg/ml Ab&sub2;-Fluorescein (9G3) in Assay-Puffer (0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6). Diese Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zu dieser Mischung wurden 100 µl 1 M Na&sub3;- Citrat/pH 7,17 gegeben, gefolgt von 100 µl 1,0 mg/ml AbF-Perlen in Assay- Puffer. Der gebildete Immunkomplex wurde mittels 0,5 cm-Glasperlen, die mit Avidin beschichtet waren (eine Glasperle wurde pro Röhrchen verwendet) von der ungebundenen Fraktion abgetrennt. Die Assay-Mischung wurde 2,5 Stunden bei Raumtemperatur mit den Glasperlen inkubiert (Schütteln im Dunkeln). Nach Inkubation wurde jede Glasperle mit 4 x 1 ml PBS, 1% Triton X-100, 0,5 M NaCl/pH 7,2 gewaschen. Schließlich wurde jede Glasperle 1 Minute belichtet, und das emittierte Licht wurde 20 Sekunden unter Verwendung eines Luminometers von Turner Designs, Modell 20 e, gezählt.
Die in Tabelle 4 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß ein mit TSH in Bezug stehendes spezifisches Signal erzeugt wurde (Empfindlichkeit 0,1 - 0,5 ng/ml TSH im Kalibrator). Tabelle 4 TSH-Assay
Obwohl die vorangehende Erfindung mittels Erläuterung und Beispiel für die Zwecke der Klarheit und des Verständnisses in einiger Ausführlichkeit beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß gewisse Anderungen oder Abwandlungen innerhalb des Bereiches der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Detektions-Materials, umfassend:

Kombinieren des Materials mit (a) einem Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und (b) einer chemilumineszierenden Verbindung, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, wobei der Photosensibilisator und die chemilumineszierende Verbindung in eine nicht-teilchenförmige feste Matrix oder eine teilchenförmige Matrix inkorporiert sind.

2. Verfahren zur Detektion eines gemäß Anspruch 1 hergestellten Materials, weiter umfassend:

(a) Bestrahlung des Materials mit Licht einer Wellenlänge von 200 - 1000 nm und

(b) Detektion des von der chemilumineszierenden Verbindung emittierten Lichts.

3. Verfahren zur Erzeugung einer verzögerten Lumineszenz, umfassend die Stufe der Bestrahlung einer Zusammensetzung, welche eine feste oder teilchenförmige Matrix und darin inkorporiert (a) einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und (b) eine chemilumineszierende Verbindung, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, umfaßt, und die Detektion von Licht, das von der chemilumineszierenden Verbindung emittiert wird.

4. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, umfassend:

die Bereitstellung in Kombination (1) eines Mediums, von dem vermutet wird, daß es den Analyten enthält, (2) eines Markierungsreagenz, das ein erstes Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sbp) umfaßt, das mit einer teilchenförmigen Matrix assoziiert ist, die einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, derart, daß bei Aktivierung des Photosensibilisators Singulett- Sauerstoff erzeugt wird und dieser die chemilumineszierende Verbindung aktiviert, aufweist, wobei das erste sbp-Mitglied an den Analyten oder an ein zweites sbp-Mitglied binden kann, um einen in Beziehung zur Anwesenheit des Analyten stehenden Komplex zu bilden,

die Aktivierung des Photosensibilisators und

die Detektion der Menge an Lumineszenz, die durch die chemilumineszierende Verbindung erzeugt wird, wobei die Menge derselben in Beziehung zur Menge des Analyten in dem Medium steht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem der Photosensibilisator ein Farbstoff ist, der aus der aus Methylenblau, Diodeosin, Porphyrin, Chlorophyll und Phthalocyaninen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die chemilumineszierende Verbindung eine Olefingruppe und einen oder mehrere Elektronendonor-Substituenten in Konjugation mit dem Olefin enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die chemilumineszierende Verbindung aus der aus 9-Alkyliden-N-methylacridanen, Enolethern und Enaminen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

8. Zusammensetzung, umfassend eine feste Matrix, die darin inkorporiert einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, aufweist.

9. Zusammensetzung, umfassend eine fluide teilchenförmige Matrix, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Öltröpfchen, Liposomen und Emulsionen, die darin inkorporiert einen Photosensibilisator, der bei Bestrahlung Singulett- Sauerstoff erzeugen kann, und eine chemilumineszierende Verbindung, die durch Singulett-Sauerstoff aktiviert werden kann, aufweist.

10. Testsatz, umfassend:

(a) die Zusammensetzung von Anspruch 8 und

(b) ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares, oder

(a) die Zusammensetzung von Anspruch 9 und

(b) ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares.

11. Verfahren zur Kalibrierung der Intensität von Licht, das von einer lumineszierenden Zusammensetzung emittiert wird, umfassend die folgenden Stufen:

(a) Vereinigen in einem Medium einer lumineszierenden Zusammensetzung, die bei Bestrahlung Licht emittieren kann, und der Zusammensetzung von Anspruch 8, wobei eine dieser Zusammensetzungen bei Aktivierung durch Licht eine Abfaliszeit für die Lichtemission aufweist, die wesentlich größer ist als die Abfaliszeit für die andere,

(b) Bestrahlung des Mediums, um die lumineszierende Zusammensetzung und die Zusammensetzung von Anspruch 8 zu aktivieren,

(c) Messung der Intensität von während des Abfalls der aktivierten Zusammensetzung mit der kürzeren Abfallszeit emittierten Lichts,

(d) Messung der Intensität von Licht, das nach der Messung von Stufe (c) und nach einem mindestens teilweisen Abfall der aktivierten Zusammensetzung mit der klirzeren Abfallszeit emittiert wird, und

(e) Vergleich der Intensität des Lichts, das während des Abfalls der aktivierten Zusammensetzung mit der kürzeren Zerfallszeit emittiert wurde, mit der Intensität von Licht, das in Stufe (d) emittiert wurde, um eine interne Kalibrierung zu bewerkstelligen.