JP3184894B2 - ハロペルオキシターゼ酸至適化学的発光分析系 - Google Patents
ハロペルオキシターゼ酸至適化学的発光分析系Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、化学的発光分析により試験溶液中の被分析
物の測定用の改良された系に関する。より詳しくは、本
発明は、ハロペルオキシターゼ（ハライド：過酸化水素
オキサイドレデゥーターゼ,EC 1.11.n）、オキシダント
および発光基質を試験検体における被分析物の存在また
は量の化学的発光シグナル表示を発生するのに利用する
酸pH至適、ハライド依存被分析体分析系に関する。
物の測定用の改良された系に関する。より詳しくは、本
発明は、ハロペルオキシターゼ（ハライド：過酸化水素
オキサイドレデゥーターゼ,EC 1.11.n）、オキシダント
および発光基質を試験検体における被分析物の存在また
は量の化学的発光シグナル表示を発生するのに利用する
酸pH至適、ハライド依存被分析体分析系に関する。
背景技術 高い精度で試験検体中での１種類またはそれ以上の被
分析物の濃度を測定する検定系が屡必要とされる。これ
らの検定系は、工業廃棄物中の毒性物質の測定から食品
供給における潜在的汚染に至るまでの幅広い用途範囲を
見出す。体液中の被分析物、例えば血清、血漿、尿等の
検定系の発展は、診断および治療活性を補助するための
患者の生理学的条件に関する正確な現在の情報に対する
医師の要求の故に非常に注目されてきている。その結
果、高い精度を有する体液中の種々の被分析物の濃度を
測定するための系が発展している。
分析物の濃度を測定する検定系が屡必要とされる。これ
らの検定系は、工業廃棄物中の毒性物質の測定から食品
供給における潜在的汚染に至るまでの幅広い用途範囲を
見出す。体液中の被分析物、例えば血清、血漿、尿等の
検定系の発展は、診断および治療活性を補助するための
患者の生理学的条件に関する正確な現在の情報に対する
医師の要求の故に非常に注目されてきている。その結
果、高い精度を有する体液中の種々の被分析物の濃度を
測定するための系が発展している。
かゝる系の１つは、被分析物の類縁体に接合された放
射線標識を利用する周知の放射線免疫検定である。その
古典的な形態において、既知の量の被分析物の放射線標
識された類縁体を被分析物に特異の制限量の抗体に対す
る被分析物と競合させる。別の形態において、放射線標
識は、試験検体中に存在する被分析物とともに「サンド
イッチ」を形成する被分析物−特異抗体と接合し得る。
試験フォーマットに無関係に、被分析物または残りの溶
液中の遊離物と結合した放射線標識は、試験検体におけ
る被分析物の量に直接または間接的に関連する表示とし
て測定される。高感度の放射線標識に基づく系が開発さ
れているが、放射線活性物質、特別の操作法または特別
の装置の要求および放射線活性廃棄物の製造が放射線標
識に基づく検定の使用を続けると拡散していくという重
大な欠点がをもたらす。
射線標識を利用する周知の放射線免疫検定である。その
古典的な形態において、既知の量の被分析物の放射線標
識された類縁体を被分析物に特異の制限量の抗体に対す
る被分析物と競合させる。別の形態において、放射線標
識は、試験検体中に存在する被分析物とともに「サンド
イッチ」を形成する被分析物−特異抗体と接合し得る。
試験フォーマットに無関係に、被分析物または残りの溶
液中の遊離物と結合した放射線標識は、試験検体におけ
る被分析物の量に直接または間接的に関連する表示とし
て測定される。高感度の放射線標識に基づく系が開発さ
れているが、放射線活性物質、特別の操作法または特別
の装置の要求および放射線活性廃棄物の製造が放射線標
識に基づく検定の使用を続けると拡散していくという重
大な欠点がをもたらす。
検定技術における放射線活性物質に対する要求は、放
射線標識の代わりに酵素標識物質の使用により低減され
ている。代表的な酵素免疫検定は、例えば対応する放射
線免疫検定に利用されるものと非常に類似した検定プロ
トコルに従うが、発光法で測定された酵素活性の量試が
試験検定中の被分析物の量により直接的または間接的に
変化する。酵素標識系の拡がった使用は、臨床学的検定
目的に別に利用されるが屡検定感度の損失、高いバック
グランドレベルおよび多用の検定結果となる。
射線標識の代わりに酵素標識物質の使用により低減され
ている。代表的な酵素免疫検定は、例えば対応する放射
線免疫検定に利用されるものと非常に類似した検定プロ
トコルに従うが、発光法で測定された酵素活性の量試が
試験検定中の被分析物の量により直接的または間接的に
変化する。酵素標識系の拡がった使用は、臨床学的検定
目的に別に利用されるが屡検定感度の損失、高いバック
グランドレベルおよび多用の検定結果となる。
より最近、その他の別の従来の検定系に放射線標識ま
たは酵素標識の代わりに使用する発光表示反応が提案さ
れている。検定系生成物便により放出された光の測定に
基づく発光反応が、検定フォーマットにおける放射線活
性および酵素標識の代用のためのおよびオキシダーゼお
よびホドロラーゼの基質のための検定のける等の従来の
発光またはスペクトル発光表示の代用として研究されて
いる。当該技術は、検定系−発光反応および化学的発光
反応に有効な２種類の発光表示が一般に認識されてい
る。蛍光検定系において発光分子は、エネルギーの光源
により製造された入射放射線から発光分子へのエネルギ
ーの移動により励起エネルギーに促進される。しかる後
この分子は、系に存在する発光分子の量に存在する方法
および量の光の放出により低いエネルギー状態に開放す
る。しかしながら化学的発光検定において、入射放射線
が必要とされない。化学的発光は、２種類またはそれ以
上の化学的反応体して光の放出により低エネルギー状態
（例えば基底状態）に開放する電気的に励起したエネル
ギー富化反応生成物を得る反応のエネルギー生成物とし
て広義に定義される。化学的発光技術を使用した溶液中
の被検体を測定する方法が当該技術分野において確立さ
れている。種々の化学的発光検定系を記載する特許の例
を、以下に記載する。
たは酵素標識の代わりに使用する発光表示反応が提案さ
れている。検定系生成物便により放出された光の測定に
基づく発光反応が、検定フォーマットにおける放射線活
性および酵素標識の代用のためのおよびオキシダーゼお
よびホドロラーゼの基質のための検定のける等の従来の
発光またはスペクトル発光表示の代用として研究されて
いる。当該技術は、検定系−発光反応および化学的発光
反応に有効な２種類の発光表示が一般に認識されてい
る。蛍光検定系において発光分子は、エネルギーの光源
により製造された入射放射線から発光分子へのエネルギ
ーの移動により励起エネルギーに促進される。しかる後
この分子は、系に存在する発光分子の量に存在する方法
および量の光の放出により低いエネルギー状態に開放す
る。しかしながら化学的発光検定において、入射放射線
が必要とされない。化学的発光は、２種類またはそれ以
上の化学的反応体して光の放出により低エネルギー状態
（例えば基底状態）に開放する電気的に励起したエネル
ギー富化反応生成物を得る反応のエネルギー生成物とし
て広義に定義される。化学的発光技術を使用した溶液中
の被検体を測定する方法が当該技術分野において確立さ
れている。種々の化学的発光検定系を記載する特許の例
を、以下に記載する。
Ullmanの米国特許第3,689,391号明細書は、化学的ま
たは電気化学的反応を使用して電気的に励起した、エネ
ルギー富化状態の分子を得、そしてこれらの分子から
（エネルギードナー）から反応体分子（エネルギーレセ
プター）へエネルギーを移動し、次いで放出光を得る光
化学的転移を受けることを記載している。
たは電気化学的反応を使用して電気的に励起した、エネ
ルギー富化状態の分子を得、そしてこれらの分子から
（エネルギードナー）から反応体分子（エネルギーレセ
プター）へエネルギーを移動し、次いで放出光を得る光
化学的転移を受けることを記載している。
Maier,Jrの米国特許第4,101,029号明細書は、水性反
応混合物中で興味ある化合物を含有すると疑われる媒
体、化学的発光標識されたリガンドおよびリガンドとお
よび化学的発光標識されたリガンドと結合することがで
きる可溶性レセプターとを化合することにより体液中の
生物学的活性化合物の検定の操作を記載している。次い
で、このリガンドおよび化学的発光標識されたリガンド
を、リガンドレセプター（抗体）と競合させる。平衡
後、レセプター（抗体）を、媒体から単離し、そして化
学的発光、検定される溶液中の非標識リガンドの量と関
連する抗体に結合された化学的発光体標識されたリガン
ドの量について測定する。
応混合物中で興味ある化合物を含有すると疑われる媒
体、化学的発光標識されたリガンドおよびリガンドとお
よび化学的発光標識されたリガンドと結合することがで
きる可溶性レセプターとを化合することにより体液中の
生物学的活性化合物の検定の操作を記載している。次い
で、このリガンドおよび化学的発光標識されたリガンド
を、リガンドレセプター（抗体）と競合させる。平衡
後、レセプター（抗体）を、媒体から単離し、そして化
学的発光、検定される溶液中の非標識リガンドの量と関
連する抗体に結合された化学的発光体標識されたリガン
ドの量について測定する。
Ullmanの米国特許第4,160,645号明細書は、リガンド
類縁体に接合された化学的発光体標識、一つの電子移動
により反応する第１のレドックス系反応体および二つの
電子移動により反応する第２のレドックス系反応体を利
用する第１および第２の反応体および化学的発光体標識
の反応の速度と既知量の被分析物中の対応する速度を比
較することによる触媒媒体競合タンパク質結合検定を記
載している。
類縁体に接合された化学的発光体標識、一つの電子移動
により反応する第１のレドックス系反応体および二つの
電子移動により反応する第２のレドックス系反応体を利
用する第１および第２の反応体および化学的発光体標識
の反応の速度と既知量の被分析物中の対応する速度を比
較することによる触媒媒体競合タンパク質結合検定を記
載している。
Ullmanの米国特許第4,161,516号明細書は、リガンド
に結合された発光体およびの量が未知検体に存在するル
ガンドの量および非結合蛍光体と抗体に結合された蛍光
体との相違に関連する発光体に接合されたリガンド類縁
体を利用する二重レセプター蛍光体免疫検定を記載して
いる。
に結合された発光体およびの量が未知検体に存在するル
ガンドの量および非結合蛍光体と抗体に結合された蛍光
体との相違に関連する発光体に接合されたリガンド類縁
体を利用する二重レセプター蛍光体免疫検定を記載して
いる。
Maggioの米国特許第4,220,450号明細書および同第4,2
77,437号明細書は、化学的標識が免疫学的対の一員と接
合し、消去剤分子が免疫学的対の別の一員と接合し、そ
して検定媒体に存在する被分析物の量が媒体から放出さ
れた光を観察することによって測定される化学的発光体
競合タンパク質結合検定を記載している。
77,437号明細書は、化学的標識が免疫学的対の一員と接
合し、消去剤分子が免疫学的対の別の一員と接合し、そ
して検定媒体に存在する被分析物の量が媒体から放出さ
れた光を観察することによって測定される化学的発光体
競合タンパク質結合検定を記載している。
Vogelhutの米国特許第4,231,754号明細書は、固形キ
ャリヤー、反応生成物を製造する被分析物の存在に応答
性のある第１の試薬系を含有する第１の層および発光を
製造する反応生成物の存在に応答性のある第２の試薬系
を含有する第２の層を含む多層式化学的発光試験装置を
記載している。第２の試薬系は、環式ヒドラジド、多ル
ミノール、第二鉄イオン、ヘモグロビン、ヘマチンまた
はマイクロペルオキシターゼ生成物触媒および化学的発
光反応媒体のpHを8.5ないし12.5に保持する緩衝液を含
むことができる。
ャリヤー、反応生成物を製造する被分析物の存在に応答
性のある第１の試薬系を含有する第１の層および発光を
製造する反応生成物の存在に応答性のある第２の試薬系
を含有する第２の層を含む多層式化学的発光試験装置を
記載している。第２の試薬系は、環式ヒドラジド、多ル
ミノール、第二鉄イオン、ヘモグロビン、ヘマチンまた
はマイクロペルオキシターゼ生成物触媒および化学的発
光反応媒体のpHを8.5ないし12.5に保持する緩衝液を含
むことができる。
Boguslaski等の米国特許第4,238,195号明細書は、蛍
光標識を化学的に励起しそして標識により放出された光
を測定することによってリガンド、例えば抗体または抗
原を測定する特異結合検定を記載している。蛍光標識
は、高エネルギー中間体、例えば過酸化水素およびオキ
シルクロライド、オキサミドまたはビスオキサレートエ
ステルのいずれかに曝露することによって化学的に励起
される。
光標識を化学的に励起しそして標識により放出された光
を測定することによってリガンド、例えば抗体または抗
原を測定する特異結合検定を記載している。蛍光標識
は、高エネルギー中間体、例えば過酸化水素およびオキ
シルクロライド、オキサミドまたはビスオキサレートエ
ステルのいずれかに曝露することによって化学的に励起
される。
Frankの米国特許第4,269,938号明細書は、検体をジア
セチルフルオレセインおよび過酸化水素源と接触させて
蛍光生成物を形成することによって行われるオエルオキ
シターゼを記載している。ペルオキシターゼが過剰に存
在する場合、蛍光増加の速度が検定される検体中のペル
オキシターゼの量に関連する。
セチルフルオレセインおよび過酸化水素源と接触させて
蛍光生成物を形成することによって行われるオエルオキ
シターゼを記載している。ペルオキシターゼが過剰に存
在する場合、蛍光増加の速度が検定される検体中のペル
オキシターゼの量に関連する。
Halmann等の米国特許第4,302,534号明細書は、化学的
発光が過酸化水素とフェノール性化合物、例えばピロガ
ロール、レソルシノール、フォログシノールまたはハイ
ドロキノンとの間の酵素触媒されたレソックス反応によ
って製造される異質免疫検定を記載している。この検定
において、ホースラディッシュペルオキシターゼ、ラク
トペルオキシターゼ、ターニップペルオキシターゼまた
はポテトペルオキシターゼを抗原または抗体と接合し、
この接合体を検体と反応させ、過剰の接合体を除去し、
発光基質を添加し、次いで系から放出された光を測定す
る。
発光が過酸化水素とフェノール性化合物、例えばピロガ
ロール、レソルシノール、フォログシノールまたはハイ
ドロキノンとの間の酵素触媒されたレソックス反応によ
って製造される異質免疫検定を記載している。この検定
において、ホースラディッシュペルオキシターゼ、ラク
トペルオキシターゼ、ターニップペルオキシターゼまた
はポテトペルオキシターゼを抗原または抗体と接合し、
この接合体を検体と反応させ、過剰の接合体を除去し、
発光基質を添加し、次いで系から放出された光を測定す
る。
Mndell等の米国特許第4,372,745号明細書は、被分析
物に特異な免疫学的結合パートナーに接合されたマイク
ロカプセル化された蛍光体材料、カプセルを破壊する手
段および蛍光体を活性化することができる電磁放射線以
外のエネルギー源を包含する生物的被分析物の決定用の
系を記載する。
物に特異な免疫学的結合パートナーに接合されたマイク
ロカプセル化された蛍光体材料、カプセルを破壊する手
段および蛍光体を活性化することができる電磁放射線以
外のエネルギー源を包含する生物的被分析物の決定用の
系を記載する。
化学的検定系、特にホースラディッシュペルオキシタ
ーゼにより触媒されるものが広く報告されており、そし
て当該技術分野に共通に使用されるその他の従来のシグ
ナル標識を上回る数多くの著しい利点、例えば比較的高
感度、低価格、拡張された線的範囲、比較的単純なシグ
ナル測定装置および放射線活性同位体の欠如を有してお
り、従って安全装置および特別の操作法を排除すること
が知られている。これらの利点にも係わらず、化学的発
光検定系は、問題がある。例えば、ルミノールのペルオ
キシターゼ触媒酸化は、pHの変化に高感度である。従来
のホースラデッシュペルオキシターゼ（HRP）化学的発
光ルミノール酸化は、代表的には約８ないし12のpHで行
われるが最も効率的な化学的発光は約10.4ないし11.5の
pHでもたらされる。化学的発光をもたらすためのHRP−
触媒されたジオキシ化は、第１の錯体（錯体Ｉ）を形成
するHRPと過酸化水素との反応、そして該第１の錯体を
順ににルミノールと反応させて第２の錯体（錯体II）お
よび酸化ルミノールラジカルを得ることを包含する高度
の錯化法である。次いで、錯体IIを第２のルミノール分
子と反応させ、その初期状態で第２酸化ルミノールラジ
カルとする。要するに、２つのルミノール分子（2LH2）
を、以下の反応に従ってヒドラジドから脱水素して２つ
のルミノールラジカル（2LH＋）とする。
ーゼにより触媒されるものが広く報告されており、そし
て当該技術分野に共通に使用されるその他の従来のシグ
ナル標識を上回る数多くの著しい利点、例えば比較的高
感度、低価格、拡張された線的範囲、比較的単純なシグ
ナル測定装置および放射線活性同位体の欠如を有してお
り、従って安全装置および特別の操作法を排除すること
が知られている。これらの利点にも係わらず、化学的発
光検定系は、問題がある。例えば、ルミノールのペルオ
キシターゼ触媒酸化は、pHの変化に高感度である。従来
のホースラデッシュペルオキシターゼ（HRP）化学的発
光ルミノール酸化は、代表的には約８ないし12のpHで行
われるが最も効率的な化学的発光は約10.4ないし11.5の
pHでもたらされる。化学的発光をもたらすためのHRP−
触媒されたジオキシ化は、第１の錯体（錯体Ｉ）を形成
するHRPと過酸化水素との反応、そして該第１の錯体を
順ににルミノールと反応させて第２の錯体（錯体II）お
よび酸化ルミノールラジカルを得ることを包含する高度
の錯化法である。次いで、錯体IIを第２のルミノール分
子と反応させ、その初期状態で第２酸化ルミノールラジ
カルとする。要するに、２つのルミノール分子（2LH2）
を、以下の反応に従ってヒドラジドから脱水素して２つ
のルミノールラジカル（2LH＋）とする。
次いで、このラジカルが付加的な過酸化水素と反応し
て、以下の通り窒素の放出およびフォトン（ｈν）の放
出を伴ってアミノフタレートを形成する。
て、以下の通り窒素の放出およびフォトン（ｈν）の放
出を伴ってアミノフタレートを形成する。
2LH+＋H2O2→LH2＋アミノフタレート＋N2＋ｈν 発光反応は、H2O2が接合体塩基形態,HO2−中に存在す
る際に最良に達成される。しかしながら、比較的に高い
pKa（11.6;Lange′s Handbook of Chemistry,第13版,19
86年）は、以下の通りに著しい量で存在するHO2−のた
めの比較的に高いpHを記載している。
る際に最良に達成される。しかしながら、比較的に高い
pKa（11.6;Lange′s Handbook of Chemistry,第13版,19
86年）は、以下の通りに著しい量で存在するHO2−のた
めの比較的に高いpHを記載している。
pH変化における［HO2 -］と［H2O2］との比率 pH ［HO2 -］／［H2O2］ 12.65 10 11.65 1 10.65 10-1 9.65 10-2 8.65 10-3 7.65 10-4 6.65 10-5 5.65 10-6 4.65 10-7 3.65 10-8 例えば、H2O2の１ミリモル溶液中のHO2−の効率的濃
度は、pH5.65において１ナノモルである。従ってルミノ
ールの効率的な酸化を得るために、アルカリ性pHレベル
で、特に約７ないし12のpH、より一般には９ないし11の
pHでHRP−触媒された酸化を行うことが一般的実施であ
る。しかしながら、高いpHレベルにおいて、ルミノール
は、触媒酵素の不存在下でも塩基触媒された酸化を受
け、過酸化物消費、高いバックグラウンド化学的発光と
なりそしてしばしば適用不能な低いシグナル−対ノイズ
比となる。
度は、pH5.65において１ナノモルである。従ってルミノ
ールの効率的な酸化を得るために、アルカリ性pHレベル
で、特に約７ないし12のpH、より一般には９ないし11の
pHでHRP−触媒された酸化を行うことが一般的実施であ
る。しかしながら、高いpHレベルにおいて、ルミノール
は、触媒酵素の不存在下でも塩基触媒された酸化を受
け、過酸化物消費、高いバックグラウンド化学的発光と
なりそしてしばしば適用不能な低いシグナル−対ノイズ
比となる。
これらのpH要求は、臨床的および研究用途へのペルオ
キシターゼ触媒されたルミノール発光広い使用に重大な
制限を与える。例えば、ペルオキシターゼ触媒作用は、
７ないし９のpH範囲にわたって最も効率的であり、９以
上のpHで、ペルオキシターゼは、実質的に低い活性を示
す。しかしながら、オキシターゼ酵素反応は、約５ない
し７の至適pH範囲を有している。オキシターゼ酵素反応
を利用してペルオキシターゼ触媒れた表示系による測定
用の基本的酵素法をもたらす場合に、過酸化水素を製造
する基本的酵素法は、発光反応（高いpHが最適である）
と発光強度並びに酵素−触媒反応の速度の過酷な前提条
件なしには同時に生じない。バックグラウンドを増加す
ることに加えて、ペルオキシターゼ触媒された発光反応
に必要とされる比較的に高いpHレベルが生物学的検体中
の過酸化水素と還元成分との反応速度を促進し、これに
よってルミノールと反応する前に過酸化水素を消費し、
系から観察される発光を減少し、そして興味ある被分析
物の正確な測定を人工的に干渉する。Seitx,W.R.Chemil
uminescence Detection of Enzymatically Generated P
eroxide′Meth.Enzymol.,57:第445〜462頁（1978年）を
参照のこと。
キシターゼ触媒されたルミノール発光広い使用に重大な
制限を与える。例えば、ペルオキシターゼ触媒作用は、
７ないし９のpH範囲にわたって最も効率的であり、９以
上のpHで、ペルオキシターゼは、実質的に低い活性を示
す。しかしながら、オキシターゼ酵素反応は、約５ない
し７の至適pH範囲を有している。オキシターゼ酵素反応
を利用してペルオキシターゼ触媒れた表示系による測定
用の基本的酵素法をもたらす場合に、過酸化水素を製造
する基本的酵素法は、発光反応（高いpHが最適である）
と発光強度並びに酵素−触媒反応の速度の過酷な前提条
件なしには同時に生じない。バックグラウンドを増加す
ることに加えて、ペルオキシターゼ触媒された発光反応
に必要とされる比較的に高いpHレベルが生物学的検体中
の過酸化水素と還元成分との反応速度を促進し、これに
よってルミノールと反応する前に過酸化水素を消費し、
系から観察される発光を減少し、そして興味ある被分析
物の正確な測定を人工的に干渉する。Seitx,W.R.Chemil
uminescence Detection of Enzymatically Generated P
eroxide′Meth.Enzymol.,57:第445〜462頁（1978年）を
参照のこと。
Kircka等の米国特許第4,598,044号明細書は、発光反
応からの全光放出が一定のフェノール化合物を発光反応
混合物中に添加することによって増加すると言われてい
る（またはシグナル／ノイズ比が高揚される）ペルオキ
シターゼ酵素、オキシダントおよび2,3−ジヒドロ−1,4
−フタラジンジオンの高められた発光反応を記載してい
る。しかしながら、この高められた検定法は、なおもア
ルカリpHで行うのが好ましい。その他の発光物質のペル
オキシターゼ触媒された酸化を高めるかあるいは促進す
るのにフェノール性化合物を使用すうことも米国特許第
4,521,511号明細書に記載されている。高揚剤の使用が
発光測定を改良するということが示されているが、検定
感度および乏しいシグナル対ノイズ比は、これらの発光
系を臨床環境で広範に使用するのを妨げ続けている。
応からの全光放出が一定のフェノール化合物を発光反応
混合物中に添加することによって増加すると言われてい
る（またはシグナル／ノイズ比が高揚される）ペルオキ
シターゼ酵素、オキシダントおよび2,3−ジヒドロ−1,4
−フタラジンジオンの高められた発光反応を記載してい
る。しかしながら、この高められた検定法は、なおもア
ルカリpHで行うのが好ましい。その他の発光物質のペル
オキシターゼ触媒された酸化を高めるかあるいは促進す
るのにフェノール性化合物を使用すうことも米国特許第
4,521,511号明細書に記載されている。高揚剤の使用が
発光測定を改良するということが示されているが、検定
感度および乏しいシグナル対ノイズ比は、これらの発光
系を臨床環境で広範に使用するのを妨げ続けている。
フェノール性高揚剤を光放出を増加するのに使用する
「高められた」発光検定において、試薬を化学的発光反
応を行うのに必要とされる高いpHで保持した際検定に使
用する試薬の保存安定性に関する別の問題が記載されて
いる。この問題点を解決するために、ヨーロッパ特許出
願公開第235,970号明細書は、使用前に試薬のpHを約３
ないし６の範囲で保持することを記載している。しかし
ながら、このヨーロッパ特許出願に記載された検定系に
おいて、アルカリ緩衝液を使用して反応混合物のpHを７
ないし９の範囲の値に増加して効率的な光放出を得なけ
ればならない。
「高められた」発光検定において、試薬を化学的発光反
応を行うのに必要とされる高いpHで保持した際検定に使
用する試薬の保存安定性に関する別の問題が記載されて
いる。この問題点を解決するために、ヨーロッパ特許出
願公開第235,970号明細書は、使用前に試薬のpHを約３
ないし６の範囲で保持することを記載している。しかし
ながら、このヨーロッパ特許出願に記載された検定系に
おいて、アルカリ緩衝液を使用して反応混合物のpHを７
ないし９の範囲の値に増加して効率的な光放出を得なけ
ればならない。
上記のこととは別に、光放出反応のpH依存性は、従来
の検定としてのペルオキシターゼ触媒された化学的技術
の有効性を著しく制限してきた。従来技術の化学的検定
に関連する問題点および制限を克服する改良された化学
的発光表示系に対する強い要望がある。
の検定としてのペルオキシターゼ触媒された化学的技術
の有効性を著しく制限してきた。従来技術の化学的検定
に関連する問題点および制限を克服する改良された化学
的発光表示系に対する強い要望がある。
上記の発光分析法に加えて、化学的発光をもたらす化
学的反応が種々の生物学的系で自然に生ずることが知ら
れている。例えばミエロペルオキシターゼ（MPO）は、
５％程度の哺乳類ポリモルホン核（PMN）白血球を構成
するオキサイドリダクターゼである。過酸化水素の存在
下でのジフテリア毒上のMPOの解毒活性は、最初にAgner
（Nature,Vol.159,p.271,1947）により、ハライド供因
子に対するその依存として（Agner,J.Exp.Med,Vol.74,p
334,1950;Agner,Res,trav,chim.,Vol.74,p.373,1955;Ag
ner,Abstr,Communs 4th Congr.Biochem.Vienna,p.64,19
58）により記載れた。Eecherichia coliまたはLactobac
illus acidphilusに対するMPO、ハライドおよび過酸化
水素のの抗微生物作用は、原生（すなわち、化学的発光
基質添加せず）化学的発光（Allen.Studies on the Gen
eration of Electronic Exicited State in Human Poly
morphonuclear Leukocytes and Their Participation i
n Microbiocidal ctivity,″Dissertation,Tulane Univ
ersity,1973年７月13日）に伴い、そしてこれはpH依存
性（Allen,The Role of pH in the Chemiluminescent R
esponse of the Myeloperoxidase−Halide−HOOH Antim
icrobial System,″Biochem.and Biophys.Res Comm.,Vo
l,63 No.3,pp.684−691,1975）およびハライド依存（Al
len,Halide Dependence ogf the Myeloperoxidase−Med
iated Antimicrobial System of Polymorphonuclear Le
ukocyte in the Phenomenon of Electric Excitatio
n,″Biochem.and Biophys,Res Comm.,Vol,63 No.3,pp.6
75−683,1975）である。
学的反応が種々の生物学的系で自然に生ずることが知ら
れている。例えばミエロペルオキシターゼ（MPO）は、
５％程度の哺乳類ポリモルホン核（PMN）白血球を構成
するオキサイドリダクターゼである。過酸化水素の存在
下でのジフテリア毒上のMPOの解毒活性は、最初にAgner
（Nature,Vol.159,p.271,1947）により、ハライド供因
子に対するその依存として（Agner,J.Exp.Med,Vol.74,p
334,1950;Agner,Res,trav,chim.,Vol.74,p.373,1955;Ag
ner,Abstr,Communs 4th Congr.Biochem.Vienna,p.64,19
58）により記載れた。Eecherichia coliまたはLactobac
illus acidphilusに対するMPO、ハライドおよび過酸化
水素のの抗微生物作用は、原生（すなわち、化学的発光
基質添加せず）化学的発光（Allen.Studies on the Gen
eration of Electronic Exicited State in Human Poly
morphonuclear Leukocytes and Their Participation i
n Microbiocidal ctivity,″Dissertation,Tulane Univ
ersity,1973年７月13日）に伴い、そしてこれはpH依存
性（Allen,The Role of pH in the Chemiluminescent R
esponse of the Myeloperoxidase−Halide−HOOH Antim
icrobial System,″Biochem.and Biophys.Res Comm.,Vo
l,63 No.3,pp.684−691,1975）およびハライド依存（Al
len,Halide Dependence ogf the Myeloperoxidase−Med
iated Antimicrobial System of Polymorphonuclear Le
ukocyte in the Phenomenon of Electric Excitatio
n,″Biochem.and Biophys,Res Comm.,Vol,63 No.3,pp.6
75−683,1975）である。
オキサイドリダクターゼエオシノフィルペルオキシダ
ーゼ（EPO）は、エオシノフィル中で高い濃度で存在
し、そしてMPOのものと同様な反粒子機能を有している
ことが知られている（Caulfield et al.,J.Cell.Biol.V
ol.86,pp.64−76,1980）。EPOは、酸性pHでの過酸化水
素の存在下での塩化物イオンの亜塩素酸への酸化を触媒
する（Ben et al.,Some Properties of Human Eosinoph
il Peroxidase,A Comparison With Other Peroxidase
s,″Biochin et Biophys.Acts.,Vol.784,pp177−186,19
84）。その他のクロロペルオキシターゼが知られてお
り、そして文献中で特徴付けられている。例えば、P.D.
Shaw and L.P.Hager（JACS,Vol.81,No.1001,p.6527,195
9;JBC,Vol.234,p2560,1959,Vol.234,p.2565,1960および
Vol236,p1626,1961）により記載されたモールドCaldrio
myces fumagoから単離されたものである。
ーゼ（EPO）は、エオシノフィル中で高い濃度で存在
し、そしてMPOのものと同様な反粒子機能を有している
ことが知られている（Caulfield et al.,J.Cell.Biol.V
ol.86,pp.64−76,1980）。EPOは、酸性pHでの過酸化水
素の存在下での塩化物イオンの亜塩素酸への酸化を触媒
する（Ben et al.,Some Properties of Human Eosinoph
il Peroxidase,A Comparison With Other Peroxidase
s,″Biochin et Biophys.Acts.,Vol.784,pp177−186,19
84）。その他のクロロペルオキシターゼが知られてお
り、そして文献中で特徴付けられている。例えば、P.D.
Shaw and L.P.Hager（JACS,Vol.81,No.1001,p.6527,195
9;JBC,Vol.234,p2560,1959,Vol.234,p.2565,1960および
Vol236,p1626,1961）により記載されたモールドCaldrio
myces fumagoから単離されたものである。
生体内原生MPO/EPO−ハライド−HOOH抗微生物系（化
学的発光性基質の添加なし）が研究され、そして文献に
報告れているが、検体中の被分析物の存在または量の測
定のためのハロペルオキシターゼ−ハライド−オキシダ
ント−発光基質表示系が当該技術分野において報告また
は提案されていない。
学的発光性基質の添加なし）が研究され、そして文献に
報告れているが、検体中の被分析物の存在または量の測
定のためのハロペルオキシターゼ−ハライド−オキシダ
ント−発光基質表示系が当該技術分野において報告また
は提案されていない。
発明の開示 高感度化学的発光表示系を利用して従来の化学的発光
表示系に固有の数多くの欠点なしに液状の検体中の被分
析物の存在または量の測定することができるということ
を見出した。新規の酸指摘化学的発光表示系は、ハロペ
ルオキシターゼ（ハライド：過酸化水素オキサイドレダ
クターゼ）、ハライド、オキシダントおよび化学的発光
性基質を含んでなる。かゝる表示系は、化学的発光性基
質と反応して励起状態の酸化反応生成物をもたらす高感
度のシングレット分子酸素（1O2）の合成剤として作用
する。次いで、励起状態の反応生成物は、測定可能な光
を放出しながら低いエネルギー状態（すなわち、基底状
態）に開放される。本発明の表示系への使用に好適なハ
ロペルオキシターゼして、ミエロペルオキシターゼ（MP
O）、エオシノフィルペルオキシターゼ（EPO）、ラクト
ペルオキシターゼ（LPO）およびクロロペルオキシター
ゼ（CPO）が挙げられる。好適なハライドとして、ブロ
マイド、クロライドまたはアイオダイドが挙げられ、ハ
ロペルオキシターゼがMPOまたはCPOの場合にクロライド
が好ましく、そしてハロペルオキシターゼがEPOまたはL
POの場合にはブロマイドが好ましい。オキシダントは、
過酸化物であることが好ましく、最も好ましくは過酸化
水素である。有効な化学的発光性基質として、シングレ
ット分子酸素により、亜ハロゲン化物によりまたは亜ハ
ロゲン化物および過酸化物により接触的に酸化されて測
定可能な光を放出しながら低いエネルギー状態に開放さ
れる励起状態酸化反応生成物を得るものが挙げられる。
好ましい化学的発光性基質として、エンドペルオキサイ
ド先駆体、例えば環式ヒヂラジン類およびジオキセタン
先駆体が挙げられる。
表示系に固有の数多くの欠点なしに液状の検体中の被分
析物の存在または量の測定することができるということ
を見出した。新規の酸指摘化学的発光表示系は、ハロペ
ルオキシターゼ（ハライド：過酸化水素オキサイドレダ
クターゼ）、ハライド、オキシダントおよび化学的発光
性基質を含んでなる。かゝる表示系は、化学的発光性基
質と反応して励起状態の酸化反応生成物をもたらす高感
度のシングレット分子酸素（1O2）の合成剤として作用
する。次いで、励起状態の反応生成物は、測定可能な光
を放出しながら低いエネルギー状態（すなわち、基底状
態）に開放される。本発明の表示系への使用に好適なハ
ロペルオキシターゼして、ミエロペルオキシターゼ（MP
O）、エオシノフィルペルオキシターゼ（EPO）、ラクト
ペルオキシターゼ（LPO）およびクロロペルオキシター
ゼ（CPO）が挙げられる。好適なハライドとして、ブロ
マイド、クロライドまたはアイオダイドが挙げられ、ハ
ロペルオキシターゼがMPOまたはCPOの場合にクロライド
が好ましく、そしてハロペルオキシターゼがEPOまたはL
POの場合にはブロマイドが好ましい。オキシダントは、
過酸化物であることが好ましく、最も好ましくは過酸化
水素である。有効な化学的発光性基質として、シングレ
ット分子酸素により、亜ハロゲン化物によりまたは亜ハ
ロゲン化物および過酸化物により接触的に酸化されて測
定可能な光を放出しながら低いエネルギー状態に開放さ
れる励起状態酸化反応生成物を得るものが挙げられる。
好ましい化学的発光性基質として、エンドペルオキサイ
ド先駆体、例えば環式ヒヂラジン類およびジオキセタン
先駆体が挙げられる。
表示系により放出された光の量は、反応溶液に存在す
る各反応関与物の量に関連する。従って、既知の非速度
制限量の３種の反応関与物を、検定系に提供して試験検
体における第４の反応関与物の存在または量を測定す
る。試験検体における第４の反応関与物は、興味ある被
分析物であることができあるいは興味ある最終的被分析
物を包含する１種類またはそれ以上の予備的反応を通じ
た試験検体中で製造または消費することができるが、第
４の関与物の量は試験溶液中の被分析物の量に関連す
る。従って、本発明の表示系種々の被分析物の測定に利
用できる。
る各反応関与物の量に関連する。従って、既知の非速度
制限量の３種の反応関与物を、検定系に提供して試験検
体における第４の反応関与物の存在または量を測定す
る。試験検体における第４の反応関与物は、興味ある被
分析物であることができあるいは興味ある最終的被分析
物を包含する１種類またはそれ以上の予備的反応を通じ
た試験検体中で製造または消費することができるが、第
４の関与物の量は試験溶液中の被分析物の量に関連す
る。従って、本発明の表示系種々の被分析物の測定に利
用できる。
非常に高感度であることに加えて、本発明の表示系
は、酸性ないし弱塩基生成物のpH範囲にわたって最も効
率的に操作でき、従って記述の従来技術の化学的発光反
応条件の問題点を避ける。好ましくは、本発明の表示反
応は、約３ないし８のpH範囲で行われ、より好ましくは
約4.0ないし約7.0である。
は、酸性ないし弱塩基生成物のpH範囲にわたって最も効
率的に操作でき、従って記述の従来技術の化学的発光反
応条件の問題点を避ける。好ましくは、本発明の表示反
応は、約３ないし８のpH範囲で行われ、より好ましくは
約4.0ないし約7.0である。
また、本発明の表示反応が利用できる種々の検定フォ
ーマット並びに本発明のハロペルオキシターゼ／ハライ
ド／オキシダント／発光基質表示系を利用する検定を行
うのに使用するキットも記載する。
ーマット並びに本発明のハロペルオキシターゼ／ハライ
ド／オキシダント／発光基質表示系を利用する検定を行
うのに使用するキットも記載する。
図面の簡単な説明 図１は、過酸化水素を代表的オキシダントとして利用
する本発明の表示系の略図である。
する本発明の表示系の略図である。
図２は、本発明の表示系におけるピーク化学的発光速
度に対する過酸化水素濃度の効果を示すプロットであ
る。
度に対する過酸化水素濃度の効果を示すプロットであ
る。
図3Aおよび3Bは、本発明の表示系における化学的発光
速度（VCL,光放出速度）に対する過酸化水素濃度の効果
を示す二重逆数プロットである。図3Aは、関係が一次で
ある場合期待されたようなVCL対過酸化水素濃度の標準
二重逆数プロットにおいて直線が得られなかったことを
示している。図3Bは、過酸化水素濃度対VCLの平方根の
逆数のプロッティングにより得られた略直線的関係、す
なわち、この反応が過酸化水素濃度に関して二次位数で
あることを示している。比較のため、図3C（従来技術）
は、従来のホースラディッシュペルオキシターゼ（HR
P）触媒された系における過酸化水素濃度に関して一次
位数であることを示している。
速度（VCL,光放出速度）に対する過酸化水素濃度の効果
を示す二重逆数プロットである。図3Aは、関係が一次で
ある場合期待されたようなVCL対過酸化水素濃度の標準
二重逆数プロットにおいて直線が得られなかったことを
示している。図3Bは、過酸化水素濃度対VCLの平方根の
逆数のプロッティングにより得られた略直線的関係、す
なわち、この反応が過酸化水素濃度に関して二次位数で
あることを示している。比較のため、図3C（従来技術）
は、従来のホースラディッシュペルオキシターゼ（HR
P）触媒された系における過酸化水素濃度に関して一次
位数であることを示している。
図４は、本発明の表示系におけるミエロペルオキシタ
ーゼ触媒された光放出速度に対するクロライド濃度の効
果を示す二重逆数プロットである。
ーゼ触媒された光放出速度に対するクロライド濃度の効
果を示す二重逆数プロットである。
図５は、本発明の表示系におけるミエロペルオキシタ
ーゼ（「Ｍ」）またはエオシノフィルペルオキシターゼ
（「Ｅ」）により触媒された光放出速度に対するクロラ
イド濃度の効果を示す二重逆数プロットである。
ーゼ（「Ｍ」）またはエオシノフィルペルオキシターゼ
（「Ｅ」）により触媒された光放出速度に対するクロラ
イド濃度の効果を示す二重逆数プロットである。
発明の具体的説明 本発明は広義には、検体中の被分析物の存在または量
の測定可能な化学的発光表示を発生するのにハロペルオ
キシターゼ依存表示系を使用することに関する。本発明
の表示系における一次反応体は、オキシダント、ハライ
ド供因子および化学的発光性基質を含んでなる。ハロペ
ルオキシターゼ、好ましくはミエロペルオキシターゼ
（MPO）またはエオシノフィルペルオキシターゼ（EPO）
は、酸性ないし弱塩基性pH範囲で化学的発光の製造を触
媒し、高いシグナル対ノイズ比を有する高感度被分析物
測定系を提供する。
の測定可能な化学的発光表示を発生するのにハロペルオ
キシターゼ依存表示系を使用することに関する。本発明
の表示系における一次反応体は、オキシダント、ハライ
ド供因子および化学的発光性基質を含んでなる。ハロペ
ルオキシターゼ、好ましくはミエロペルオキシターゼ
（MPO）またはエオシノフィルペルオキシターゼ（EPO）
は、酸性ないし弱塩基性pH範囲で化学的発光の製造を触
媒し、高いシグナル対ノイズ比を有する高感度被分析物
測定系を提供する。
本発明の実施に使用されるようなハロペルオキシター
ゼは、ハライド（Ｘ−）：過酸化水素オキサイドリデゥ
ーターゼとして作用する。触媒された反応は、２種類の
レドックス半反応と見なし得る。ハライドは、対応する
亜ハロゲン化物（OX−）および２価の還元等量（H+＋
e-）に酸化される。
ゼは、ハライド（Ｘ−）：過酸化水素オキサイドリデゥ
ーターゼとして作用する。触媒された反応は、２種類の
レドックス半反応と見なし得る。ハライドは、対応する
亜ハロゲン化物（OX−）および２価の還元等量（H+＋
e-）に酸化される。
オキシダント、例えば過酸化水素は、２価の還元等量
により還元されて水を形成する。
により還元されて水を形成する。
H2O2＋2H+＋2e-→2H2O （２） ネット反応（すなわち、反応１）および２）の合計）
は、過酸化水素とハライドからの亜ハロゲン化物のハロ
ペルオキシターゼ触媒された製造である。
は、過酸化水素とハライドからの亜ハロゲン化物のハロ
ペルオキシターゼ触媒された製造である。
表示系において製造された亜ハロゲン化物は、図１に
示す通り以下の２種類の交互経路を潜在的に反応する。
図１においてシグレット分子酸素として同定された第１
の経路において、亜ハロゲン化物は、付加的過酸化水素
分子と反応してハライドおよびシングレット多価分子酸
素（1O2）［Kasha et al.,The Physics,Chemistry and
Biology of Singlet Molecular Oxygen,″Annals of th
e New York Academy of Sciences,Vol.171,pp7−23,198
0（この文献は参考文献として本明細書に取り込まれて
いる）に記載されたシングレット酸素の製造の反応機構
に従って酸素化反応を認められたスピンにおける吸電試
薬として関与することができる酸素の高い反応性分子
種］となる。シングレット分子酸素の亜ハロゲン化物か
らの製造を以下に表す： H2O2＋OX-→X-＋H2O＋1O2 （４） 反応３）および４）から得られるネット反応は、１分
子のシングレット分子酸素をもたらすハロペルオキシタ
ーゼおよびハライド供因子の存在下の２分子の過酸化水
素の反応である。
示す通り以下の２種類の交互経路を潜在的に反応する。
図１においてシグレット分子酸素として同定された第１
の経路において、亜ハロゲン化物は、付加的過酸化水素
分子と反応してハライドおよびシングレット多価分子酸
素（1O2）［Kasha et al.,The Physics,Chemistry and
Biology of Singlet Molecular Oxygen,″Annals of th
e New York Academy of Sciences,Vol.171,pp7−23,198
0（この文献は参考文献として本明細書に取り込まれて
いる）に記載されたシングレット酸素の製造の反応機構
に従って酸素化反応を認められたスピンにおける吸電試
薬として関与することができる酸素の高い反応性分子
種］となる。シングレット分子酸素の亜ハロゲン化物か
らの製造を以下に表す： H2O2＋OX-→X-＋H2O＋1O2 （４） 反応３）および４）から得られるネット反応は、１分
子のシングレット分子酸素をもたらすハロペルオキシタ
ーゼおよびハライド供因子の存在下の２分子の過酸化水
素の反応である。
次いで、この系で製造されたシングレット分子酸素
を、好適な化学的発光基質（CLS）、例えば環式ヒドラ
ジドと反応させてエンドペルオキサイド中間体とするか
あるいは分子酸素と反応してジオキセタンまたはジオキ
セタノン中間体とする数多くの公知の有機分子基質と反
応させる。これらの高エネルギー、二酸化化中間体は、
分裂を受けて電子的に励起したカルボニル部分（このも
のは１）光の放出を伴って低エネルギーに開放されるか
あるいは２）そのエネルギーをその他の分子に移動し、
該分子は順に光の放出を伴って低エネルギーに開放され
る）を得る。
を、好適な化学的発光基質（CLS）、例えば環式ヒドラ
ジドと反応させてエンドペルオキサイド中間体とするか
あるいは分子酸素と反応してジオキセタンまたはジオキ
セタノン中間体とする数多くの公知の有機分子基質と反
応させる。これらの高エネルギー、二酸化化中間体は、
分裂を受けて電子的に励起したカルボニル部分（このも
のは１）光の放出を伴って低エネルギーに開放されるか
あるいは２）そのエネルギーをその他の分子に移動し、
該分子は順に光の放出を伴って低エネルギーに開放され
る）を得る。
図１におけるハロゲン化−過酸化経路として同定され
るような別の経路において、反応３）で製造された上記
亜ハロゲン化物は、直接化学的発光基質と反応してハロ
ゲン化化学的発光基質（CLS−Ｘ）を製造し、このもの
は順に過酸化水素と反応して高エネルギー、上記二酸化
中間体となる。いずれかの経路に関して、基質の酸化お
よび光の製造は、以下の通りに示される。
るような別の経路において、反応３）で製造された上記
亜ハロゲン化物は、直接化学的発光基質と反応してハロ
ゲン化化学的発光基質（CLS−Ｘ）を製造し、このもの
は順に過酸化水素と反応して高エネルギー、上記二酸化
中間体となる。いずれかの経路に関して、基質の酸化お
よび光の製造は、以下の通りに示される。
式中、CLSは化学的発光基質であり、CLS−O2は二酸化
化中間体（例えば過酸化物、エンドペルオキサイド、ジ
オキセタンまたはジオキセタノン）であり、Ｐ＊は高エ
ネルギー反応生成物であり、Ｐは低エネルギー状態反応
生成物であり、そしてｈνはフォトン（または放出され
た光量子）である。５）〜７）から得られる本発明の表
示系の全ネット反応は、以下の通りにして示される。
化中間体（例えば過酸化物、エンドペルオキサイド、ジ
オキセタンまたはジオキセタノン）であり、Ｐ＊は高エ
ネルギー反応生成物であり、Ｐは低エネルギー状態反応
生成物であり、そしてｈνはフォトン（または放出され
た光量子）である。５）〜７）から得られる本発明の表
示系の全ネット反応は、以下の通りにして示される。
表示系により放出された光の量,hνは、反応混合物中
に存在する一次反応関与物（オキシダント、ハロペルオ
キシターゼ、ハライドおよび化学的発光生成物基質）の
各量に関連する。従って、既知の非−制限量のいずれか
３つの一次反応関与物の好適な反応条件下に提供するこ
とによって、第４の一次反応関与物の存在または量が、
系から放出された光（エネルギー生成物）を測定し、そ
して既知量の制限反応体を含有する標準からのものと用
いて測定応答を比較することによってただちに測定でき
る。第４の一次関与物のうちの一つに加えて、その他の
被分析物が、以下に詳述するように３つの一次関与物の
うちの一つの製造または消費となる１種類またはそれ以
上の予備反応を通して本発明の表示系により測定し得
る。上記の反応機構を図１に略解する。但し、過酸化水
素を目下の好ましいオキシダントとして説明し、そして
Ｘ−、OX−、CLS、Ｐ＊およびＰは上記に定義した意味
を持つ。
に存在する一次反応関与物（オキシダント、ハロペルオ
キシターゼ、ハライドおよび化学的発光生成物基質）の
各量に関連する。従って、既知の非−制限量のいずれか
３つの一次反応関与物の好適な反応条件下に提供するこ
とによって、第４の一次反応関与物の存在または量が、
系から放出された光（エネルギー生成物）を測定し、そ
して既知量の制限反応体を含有する標準からのものと用
いて測定応答を比較することによってただちに測定でき
る。第４の一次関与物のうちの一つに加えて、その他の
被分析物が、以下に詳述するように３つの一次関与物の
うちの一つの製造または消費となる１種類またはそれ以
上の予備反応を通して本発明の表示系により測定し得
る。上記の反応機構を図１に略解する。但し、過酸化水
素を目下の好ましいオキシダントとして説明し、そして
Ｘ−、OX−、CLS、Ｐ＊およびＰは上記に定義した意味
を持つ。
本発明に有効なハロペルオキシターゼは、ハライドが
電子ドナーまたは還元剤であり、過酸化物が電子レシー
バーまたはオキシダントであるハライド：過酸化水素オ
キサイドリディゥーターゼ（例えば、International Uu
ion of Biochemistry下でEC No.1.11.1.7およびEC No.
1.11.1.10）として定義される。好適な好適な化学的発
光性基質のハライド依存発光反応を触媒するいずれのも
の、例えば2,3−ジヒヒドロ−1,4−フタラジンジオン、
例えばルミノールを、本発明の実施に使用してもよい。
本発明で記載されるような好適なハロペルオキシターゼ
として、ミエロペルオキシターゼ（MPO）、エオシノフ
ィルペルオキシターゼ（EPO）、ラクトペルオキシター
ゼ（LPO）およびクロロペルオキシターゼ（CPO）が挙げ
られ、目下のところ好ましいハロペルオキシターゼはミ
エロペルオキシターゼおよびエオシノフィルペルオキシ
ターゼである。MPOおよびCPOが同様なハライド依存応答
を示しそして更に後述するようにEPOおよびLPOが同様な
ハライド依存応答を示すということを見出した。
電子ドナーまたは還元剤であり、過酸化物が電子レシー
バーまたはオキシダントであるハライド：過酸化水素オ
キサイドリディゥーターゼ（例えば、International Uu
ion of Biochemistry下でEC No.1.11.1.7およびEC No.
1.11.1.10）として定義される。好適な好適な化学的発
光性基質のハライド依存発光反応を触媒するいずれのも
の、例えば2,3−ジヒヒドロ−1,4−フタラジンジオン、
例えばルミノールを、本発明の実施に使用してもよい。
本発明で記載されるような好適なハロペルオキシターゼ
として、ミエロペルオキシターゼ（MPO）、エオシノフ
ィルペルオキシターゼ（EPO）、ラクトペルオキシター
ゼ（LPO）およびクロロペルオキシターゼ（CPO）が挙げ
られ、目下のところ好ましいハロペルオキシターゼはミ
エロペルオキシターゼおよびエオシノフィルペルオキシ
ターゼである。MPOおよびCPOが同様なハライド依存応答
を示しそして更に後述するようにEPOおよびLPOが同様な
ハライド依存応答を示すということを見出した。
ペルオキシターゼ酵素が本発明の発光反応に加わる形
態は、考慮される検定の種類に依存するであろう。ハロ
ペルオキシターゼが標識として使用される場合、ペルオ
キシターゼは、代表的にはリガンド、例えばタンパク
質、ホルモン、レクチン、ヘプテン、ステロイド、核
酸、代謝産物、抗原、抗体、核酸プローブ、バクテリオ
ファージまたはウイルスとカップリングされる。一般
に、ハロペルオキシターゼは、結合基または橋かけアー
ムを通してカップリングされる。好適な結合基または橋
かけアームおよびカップリング法は、当業者に明らかで
あり、そしてリガンドへの化学的発光基質のカップリン
グに関して本明細書に記載したものを包含する。別の検
定形態において、ハロペルオキシターゼ酵素は、溶液中
で遊離しており、あるいは従来法を用いて固形層または
マトリックスに固定されている。
態は、考慮される検定の種類に依存するであろう。ハロ
ペルオキシターゼが標識として使用される場合、ペルオ
キシターゼは、代表的にはリガンド、例えばタンパク
質、ホルモン、レクチン、ヘプテン、ステロイド、核
酸、代謝産物、抗原、抗体、核酸プローブ、バクテリオ
ファージまたはウイルスとカップリングされる。一般
に、ハロペルオキシターゼは、結合基または橋かけアー
ムを通してカップリングされる。好適な結合基または橋
かけアームおよびカップリング法は、当業者に明らかで
あり、そしてリガンドへの化学的発光基質のカップリン
グに関して本明細書に記載したものを包含する。別の検
定形態において、ハロペルオキシターゼ酵素は、溶液中
で遊離しており、あるいは従来法を用いて固形層または
マトリックスに固定されている。
上記のように表示反応が過酸化物とハライドと反応し
て亜ハロゲン化物を形成する反応および過酸化物と亜ハ
ロゲン化物と反応してシングレット分子酸素（1O2）を
形成する反応を伴うので、本発明の実施に使用する化学
的発光基質（CLS）は、シングレット分子酸素（1O2）に
より、亜ハロゲン化物によりあるいは亜ハロゲン化物お
よび過酸化物により接触酸化して測定可能な光の放出を
伴って低エネルギー状態に開放される励起状態の酸化反
応生成物を得るいずれの基質であってもよい。
て亜ハロゲン化物を形成する反応および過酸化物と亜ハ
ロゲン化物と反応してシングレット分子酸素（1O2）を
形成する反応を伴うので、本発明の実施に使用する化学
的発光基質（CLS）は、シングレット分子酸素（1O2）に
より、亜ハロゲン化物によりあるいは亜ハロゲン化物お
よび過酸化物により接触酸化して測定可能な光の放出を
伴って低エネルギー状態に開放される励起状態の酸化反
応生成物を得るいずれの基質であってもよい。
ある目下好ましい説明用の実施態様において、化学的
発光基質は、本明細書に記載する反応条件下に過酸化物
またはエンドペルオキサイド中間体を与える環式ヒドラ
ジドであることができる。好適な環式ヒドラジドは、
式： （式中、R1はアミノ、アミド、置換アミノまたは置換ア
ミドであり、R2、R3およびR4は互いに独立してC1〜C6ア
ルキルまたはアルケニル、ヒドロキシ、C1〜C6アルコキ
シ、カルボニル、アミノ、アミド、置換アミノまたは置
換アミドであり、あるいはR1とR2は一緒になってベンゾ
基のアミノ、アミド、チカンアミノまたは置換アミド誘
導体である）の化合物を包含する。目下特に好ましい本
発明の実施態様は、５−アミノ−2,3−ジヒドロ−1,4−
フタラジンジオン（ルミノール）、６−アミノ−2,3−
ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン（イソルミノール）
および７−ジメチルアミノ−ナフチレン−1,2−ジカボ
ン酸ヒドラジドである。
発光基質は、本明細書に記載する反応条件下に過酸化物
またはエンドペルオキサイド中間体を与える環式ヒドラ
ジドであることができる。好適な環式ヒドラジドは、
式： （式中、R1はアミノ、アミド、置換アミノまたは置換ア
ミドであり、R2、R3およびR4は互いに独立してC1〜C6ア
ルキルまたはアルケニル、ヒドロキシ、C1〜C6アルコキ
シ、カルボニル、アミノ、アミド、置換アミノまたは置
換アミドであり、あるいはR1とR2は一緒になってベンゾ
基のアミノ、アミド、チカンアミノまたは置換アミド誘
導体である）の化合物を包含する。目下特に好ましい本
発明の実施態様は、５−アミノ−2,3−ジヒドロ−1,4−
フタラジンジオン（ルミノール）、６−アミノ−2,3−
ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン（イソルミノール）
および７−ジメチルアミノ−ナフチレン−1,2−ジカボ
ン酸ヒドラジドである。
一般に、環式ヒドラジドは、シングレット分子酸素
（1O2）の存在下に求電子二酸化を受けて不安定な過酸
化物またはエンドペルオキサイド中間体を製造し、この
中間体は対応する電子的励起フタレートに再配列し、そ
して励起状態のフタレートは、以下の反応機構に従って
光の放出により開放される。
（1O2）の存在下に求電子二酸化を受けて不安定な過酸
化物またはエンドペルオキサイド中間体を製造し、この
中間体は対応する電子的励起フタレートに再配列し、そ
して励起状態のフタレートは、以下の反応機構に従って
光の放出により開放される。
（式中、R1〜R4は上記の通りである）。
別の目下のことろ好ましい説明用の本発明の実施態様
において、化学的発光性基質は、シングレット分子酸素
と反応して対応する不安定なまたは安定な1,2−ジオキ
セタン化合物を製造するジオキセタン先駆体であっても
よい。不安定な1,2−ジオキシエタンの製造は、光の放
出により開放される電子的に励起したカルボニル生成物
を得る速やかなジオキセタン分解に伴う。安定な1,2−
ジオキセタンは、以下に更に記載するように後の化合物
分解の「誘発」および化学的発光測定のために発生また
は保存することができる。本発明の実施において化学的
発光生成物基質として使用する好適な1,2−ジオキセタ
ンは、Kopecky,Synthesis of 1,2−Dioxetanes,″Biolo
gical Generation of Ecited State,Academic Press,p
p.85−144,1982に記載のようなシングレット分子酸素と
以下の通りに反応して対応する1,2−ジオキセタンを製
造する反応性アリル水素原子およびエネミンを欠くアル
カン類を包含する。
において、化学的発光性基質は、シングレット分子酸素
と反応して対応する不安定なまたは安定な1,2−ジオキ
セタン化合物を製造するジオキセタン先駆体であっても
よい。不安定な1,2−ジオキシエタンの製造は、光の放
出により開放される電子的に励起したカルボニル生成物
を得る速やかなジオキセタン分解に伴う。安定な1,2−
ジオキセタンは、以下に更に記載するように後の化合物
分解の「誘発」および化学的発光測定のために発生また
は保存することができる。本発明の実施において化学的
発光生成物基質として使用する好適な1,2−ジオキセタ
ンは、Kopecky,Synthesis of 1,2−Dioxetanes,″Biolo
gical Generation of Ecited State,Academic Press,p
p.85−144,1982に記載のようなシングレット分子酸素と
以下の通りに反応して対応する1,2−ジオキセタンを製
造する反応性アリル水素原子およびエネミンを欠くアル
カン類を包含する。
かゝるジオキセタン先駆体の代表例は公知である。例
えば、Wieringa et al.,Tetrahedron Lett.,pp169−17
2,1972;Bartlett et al.,J.Am.Chem.Soc.,Vol.96,pp627
−629,1974;Schaap,Tetrahedron Lett.,pp.1270等,197
7;Zaklika et al.,J.Am.Chem.Soc.,Vol.100,pp.318−32
0およびpp.4916−4918,1978;およびZaklika et al.,Pho
tochem.Photobiol.,Vol.30,pp.35−44,1974を参照のこ
と。化学的発光性基質は、1,2−ジオキセタン化合物に
対して安定なアルキレン先駆体、例えばヨーロッパ特許
出願公開第025051A2に記載のものであってもよい。例え
ば、化学的発光性基質は、式 （式中、ArORはＲの除去により酵素変性または化学変性
された際に不安定なオキサイド中間体1,2−ジオキセタ
ンを形成するＲ−オキシ基で置換されたアリール環を有
するアリール基である）の化合物であってもよい。特
に、1,2−ジオキセタン先駆体は、式 （式中、R1およびR2は一緒におよびR3およびR4はスピロ
融着したアルキレンまたはアリール環として結合でき、
そしてR1はアルキル、アルコキシ、アリロコシ、ジアル
キルまたはアリールアミノ、トリアルキルあるいはシリ
ルオキシおよびR2とスピロ融着したアリール基を包含す
るアリール基からなる群から選択され、R2はR1を包含で
きそして活性化により活性化されてＲが除去された際に
不安定なオキサイド中間体である1,2−ジオキセタン化
合物を形成するＲ−オキシ基で置換されてもよいアリー
ル基である、R3およびR4はスピロ融着した多環式アルキ
ルおよび多環式アリール基として一緒に結合できるアリ
ール基およびアルキル基からなる群から選択され、Ｒ−
オキシ基は、ヒドロキシ、アルキルまたはアリールカル
ボニルエーテル、無機オキシ酸塩、アルキルまたはアリ
ールシリルオキシまたは酸素ピラノシジルである）の化
合物であることができる。この群の化合物の特定の例と
して、（メトキシ（２−ナフチル）メチレン）アダマン
タン、（６−tert−ブチルジメチルシリルオキシ−２−
ナフチル）メトキシメチレン）アダマンタン、［（６−
tert−ブチルジフェニルシリルオキシ−２−ナフチル）
メトキシメチレン］アダマンタン、［（６−アセトキシ
−２−ナフチル）メトキシメチレン］アダマンタン、
［（６−アセトキシ−２−ナフチル）メトキシメチレ
ン］、２−tert−ブチル−ジメトキシシリルオキシ−9H
−イリデンアダマンタン、２−ヒドロキシ−9H−フルオ
レン−９−イリデンアダマンタン、（３−tert−ブチル
ジメトキシシリルオキシ）−9H−キサンテン−９−イリ
デンアダマンタン、３−ヒドロキシ−9H−キサンテン−
９−イリデンアダマンタン、３−アセトシシ−9H−キサ
ンテン−９−イリデンアダマンタン、３−ホスフェート
−9H−キサンテン−９−イリデンアダマンタン、ビス
（テトラエチルアンモニウム）塩および［（３−tert−
ブチルメチルシリルオキシフェニル）メトキシメチレ
ン］アダマンタンが挙げられる。この種のアルケンジオ
キシエタンは、本発明の実施において製造されたシング
レット分子酸素と反応して比較的長い半減期を有する安
定なジオキセタンを製造する。従って、この種のジオキ
シエタン先駆体を化学的発光性基質として使用すること
によって、安定なジオキセタンの製造が規定時間間隔本
発明の表示系の活性の化学的統一の提供するかゝる時間
にわたって保存できる。所望により、製造されたジオキ
セタンの化学的発光活性を、無機または有機活性剤、例
えば酸、塩基片、酵素またはヨーロッパ特許出願公開第
0254051A2号明細書に記載のようなジオキセタンを不安
定化して励起したカルボニル基および関連する化学的発
光活性を製造する触媒の添加によって誘発する。この方
法で、興味ある特定の被分析物に対する検定デザイン
を、ジオキセタン堆積の時間間隔および化学的発光放出
のタイミングを制御することによって最適化できる。
えば、Wieringa et al.,Tetrahedron Lett.,pp169−17
2,1972;Bartlett et al.,J.Am.Chem.Soc.,Vol.96,pp627
−629,1974;Schaap,Tetrahedron Lett.,pp.1270等,197
7;Zaklika et al.,J.Am.Chem.Soc.,Vol.100,pp.318−32
0およびpp.4916−4918,1978;およびZaklika et al.,Pho
tochem.Photobiol.,Vol.30,pp.35−44,1974を参照のこ
と。化学的発光性基質は、1,2−ジオキセタン化合物に
対して安定なアルキレン先駆体、例えばヨーロッパ特許
出願公開第025051A2に記載のものであってもよい。例え
ば、化学的発光性基質は、式 （式中、ArORはＲの除去により酵素変性または化学変性
された際に不安定なオキサイド中間体1,2−ジオキセタ
ンを形成するＲ−オキシ基で置換されたアリール環を有
するアリール基である）の化合物であってもよい。特
に、1,2−ジオキセタン先駆体は、式 （式中、R1およびR2は一緒におよびR3およびR4はスピロ
融着したアルキレンまたはアリール環として結合でき、
そしてR1はアルキル、アルコキシ、アリロコシ、ジアル
キルまたはアリールアミノ、トリアルキルあるいはシリ
ルオキシおよびR2とスピロ融着したアリール基を包含す
るアリール基からなる群から選択され、R2はR1を包含で
きそして活性化により活性化されてＲが除去された際に
不安定なオキサイド中間体である1,2−ジオキセタン化
合物を形成するＲ−オキシ基で置換されてもよいアリー
ル基である、R3およびR4はスピロ融着した多環式アルキ
ルおよび多環式アリール基として一緒に結合できるアリ
ール基およびアルキル基からなる群から選択され、Ｒ−
オキシ基は、ヒドロキシ、アルキルまたはアリールカル
ボニルエーテル、無機オキシ酸塩、アルキルまたはアリ
ールシリルオキシまたは酸素ピラノシジルである）の化
合物であることができる。この群の化合物の特定の例と
して、（メトキシ（２−ナフチル）メチレン）アダマン
タン、（６−tert−ブチルジメチルシリルオキシ−２−
ナフチル）メトキシメチレン）アダマンタン、［（６−
tert−ブチルジフェニルシリルオキシ−２−ナフチル）
メトキシメチレン］アダマンタン、［（６−アセトキシ
−２−ナフチル）メトキシメチレン］アダマンタン、
［（６−アセトキシ−２−ナフチル）メトキシメチレ
ン］、２−tert−ブチル−ジメトキシシリルオキシ−9H
−イリデンアダマンタン、２−ヒドロキシ−9H−フルオ
レン−９−イリデンアダマンタン、（３−tert−ブチル
ジメトキシシリルオキシ）−9H−キサンテン−９−イリ
デンアダマンタン、３−ヒドロキシ−9H−キサンテン−
９−イリデンアダマンタン、３−アセトシシ−9H−キサ
ンテン−９−イリデンアダマンタン、３−ホスフェート
−9H−キサンテン−９−イリデンアダマンタン、ビス
（テトラエチルアンモニウム）塩および［（３−tert−
ブチルメチルシリルオキシフェニル）メトキシメチレ
ン］アダマンタンが挙げられる。この種のアルケンジオ
キシエタンは、本発明の実施において製造されたシング
レット分子酸素と反応して比較的長い半減期を有する安
定なジオキセタンを製造する。従って、この種のジオキ
シエタン先駆体を化学的発光性基質として使用すること
によって、安定なジオキセタンの製造が規定時間間隔本
発明の表示系の活性の化学的統一の提供するかゝる時間
にわたって保存できる。所望により、製造されたジオキ
セタンの化学的発光活性を、無機または有機活性剤、例
えば酸、塩基片、酵素またはヨーロッパ特許出願公開第
0254051A2号明細書に記載のようなジオキセタンを不安
定化して励起したカルボニル基および関連する化学的発
光活性を製造する触媒の添加によって誘発する。この方
法で、興味ある特定の被分析物に対する検定デザイン
を、ジオキセタン堆積の時間間隔および化学的発光放出
のタイミングを制御することによって最適化できる。
化学的発光性基質が本発明の発光に加わる形態は、考
慮下の検定の種類に依存する。基質を標識として使用す
る検定において、基質は、リガンド例えばタンパク質、
ホルモン、ヘプテン、ステロイド、レクチン、核酸、代
謝産物、抗原、抗体、核酸プローブ、バクテリオファー
ジまたはウイルスとカップルしたCLSの置換誘導体であ
ることができる。例えば、CLSのアミノ基を直接リガン
ドにカップルでき、あるいは結合基または橋かけアーム
を通してカップルできる。好適な結合基、橋かけアーム
および基質をリガンドにカップルする方法は、米国特許
第4,380,580号明細書、同第4,104,029号明細書および英
国特許出願公開第2,008,274号明細書に記載されてい
る。別の種の検定において、基質は、リガンドとカップ
ルされなくてよい。この場合、基質は、溶液中遊離して
いるかあるいは従来方法を使用して固形層またはマトリ
ックス上に固定することができる。
慮下の検定の種類に依存する。基質を標識として使用す
る検定において、基質は、リガンド例えばタンパク質、
ホルモン、ヘプテン、ステロイド、レクチン、核酸、代
謝産物、抗原、抗体、核酸プローブ、バクテリオファー
ジまたはウイルスとカップルしたCLSの置換誘導体であ
ることができる。例えば、CLSのアミノ基を直接リガン
ドにカップルでき、あるいは結合基または橋かけアーム
を通してカップルできる。好適な結合基、橋かけアーム
および基質をリガンドにカップルする方法は、米国特許
第4,380,580号明細書、同第4,104,029号明細書および英
国特許出願公開第2,008,274号明細書に記載されてい
る。別の種の検定において、基質は、リガンドとカップ
ルされなくてよい。この場合、基質は、溶液中遊離して
いるかあるいは従来方法を使用して固形層またはマトリ
ックス上に固定することができる。
本発明の実施に使用するのに目下のところ好ましいオ
キシダントは、式 Ｒ−OOH （式中Ｒは水素原子または１〜３個の炭素原子を有する
短鎖アルキル基である）で表される過酸化水素またはヒ
ドロペルオキサイドを包含する。オキシダント活性は一
般に、以下の通りにＲ鎖長が増加するにつれて減少す
る。Ｒ＝Ｈ＞＞CH3＞CH3CH2＞CH3（CH2）２。目下のと
ころ特に好ましいオキシダントは、非常に効率的なオキ
シダント活性ゆえに過酸化水素（H2O2）である。化学的
発光オキシダントが標識として使用されるリガンドに接
合される検定フォーマット、例えば免疫検定において、
既知量のオキシダントを反応系に添加することができ
る。別の検定フォーマット、特に本発明の反応系がオキ
シダント、特に過酸化水素を発生する一次反応系、例え
ばオキシダーゼ触媒された反応系にカップリングされる
検定フォーマットにおいて、オキシダントは、未知とし
て反応系に存在することができる。更に別の検定フォー
マットにおいて、オキシダントをリガンドとまたは通常
の方法を用いた固形層またはマトリックスにカップリン
グすることができる。
キシダントは、式 Ｒ−OOH （式中Ｒは水素原子または１〜３個の炭素原子を有する
短鎖アルキル基である）で表される過酸化水素またはヒ
ドロペルオキサイドを包含する。オキシダント活性は一
般に、以下の通りにＲ鎖長が増加するにつれて減少す
る。Ｒ＝Ｈ＞＞CH3＞CH3CH2＞CH3（CH2）２。目下のと
ころ特に好ましいオキシダントは、非常に効率的なオキ
シダント活性ゆえに過酸化水素（H2O2）である。化学的
発光オキシダントが標識として使用されるリガンドに接
合される検定フォーマット、例えば免疫検定において、
既知量のオキシダントを反応系に添加することができ
る。別の検定フォーマット、特に本発明の反応系がオキ
シダント、特に過酸化水素を発生する一次反応系、例え
ばオキシダーゼ触媒された反応系にカップリングされる
検定フォーマットにおいて、オキシダントは、未知とし
て反応系に存在することができる。更に別の検定フォー
マットにおいて、オキシダントをリガンドとまたは通常
の方法を用いた固形層またはマトリックスにカップリン
グすることができる。
本発明の表示系は、好適なハライドイオンの存在に存
在している。本明細書において使用されるおるハライド
は、ブロマイド、クロライドまたはアイオダイドである
ことができる。特定の用途に利用されるハライドの選択
および量は、種々の因子、例えば検定系に使用するハロ
ペルオキシターゼ、反応混合物のpHおよび必要とする化
学的発光応答等に依存する。系に利用するハライドが電
子的に陰性であればあるほどあるレベルの化学的発光応
答を得るに必要とされるハライドの濃度が増加するとい
うことが見出されている。Allen,R.C.,Halide Dependen
ce of Myeloperoxidase−mediated Anticrobial System
of the Polymorphonuclear Leukocyte in the Phenome
na of Electronic Excitation,″Biochem.and Biophys.
Res.Comm.,Vol.63,pp.675−683,1975を参照のこと。本
発明の表示系におけるハライドイオンの活性は一般に、
Br−＞Cl−＞Ｉ−＞＞Ｆ−であり、フルオライドイオン
は通常ほとんどまたは全く応答を与えない。アイオダイ
ドイオンの存在が測定可能な化学的発光をもたらすが、
アイオダイドおよびその酸化生成物の既知の発光消去活
性がいくつかの用途への使用、特に高いレベルの感度が
必要とされる際にその望ましさを制限する。更にハライ
ドの選択は、表示系に存在するハロペルオキシターゼに
依存する。ハロゲンペルオキシターゼがMPOまたはCPOで
ある場合、ハライドは、ブロマイド、クロライドまたは
アイオダイドであり得、好ましくはブロマイドまたはク
ロライドである。しかしながら、ハロペルオキシターゼ
がEPOまたはLPOである場合、供因子としてクロライドは
比較的効率が悪く、従って好ましいハライドはブロマイ
ドである。好適なハロペルオキシターゼ／ハライドの組
み合わせを利用しそして表示系のその他の要員が速度制
限でない場合、ハライド濃度と化学的発光との関係は、
実験速度式： 速度CL＝Imax＝ｋ［Ｘ−］１ （式中、速度CLは化学的発光応答のピーク測定速度であ
り（Imax、最大強度としても記載される）、ｋは比例定
数または速度定数であり、Ｘ−は試験ハライドである
（すなわち、ハロペルオキシターゼがMPOまたはCPOであ
る場合Ｘ−はCl−またはBr−であり、ハロペルオキシタ
ーゼがEPOまたはLPOである場合Ｘ−はBr−である）によ
り記載される。指数用語「１」は、その他の反応体が非
速度制限濃度で存在する場合反応がハライド濃度に関し
て第１オーダーで適用することを意味する。
在している。本明細書において使用されるおるハライド
は、ブロマイド、クロライドまたはアイオダイドである
ことができる。特定の用途に利用されるハライドの選択
および量は、種々の因子、例えば検定系に使用するハロ
ペルオキシターゼ、反応混合物のpHおよび必要とする化
学的発光応答等に依存する。系に利用するハライドが電
子的に陰性であればあるほどあるレベルの化学的発光応
答を得るに必要とされるハライドの濃度が増加するとい
うことが見出されている。Allen,R.C.,Halide Dependen
ce of Myeloperoxidase−mediated Anticrobial System
of the Polymorphonuclear Leukocyte in the Phenome
na of Electronic Excitation,″Biochem.and Biophys.
Res.Comm.,Vol.63,pp.675−683,1975を参照のこと。本
発明の表示系におけるハライドイオンの活性は一般に、
Br−＞Cl−＞Ｉ−＞＞Ｆ−であり、フルオライドイオン
は通常ほとんどまたは全く応答を与えない。アイオダイ
ドイオンの存在が測定可能な化学的発光をもたらすが、
アイオダイドおよびその酸化生成物の既知の発光消去活
性がいくつかの用途への使用、特に高いレベルの感度が
必要とされる際にその望ましさを制限する。更にハライ
ドの選択は、表示系に存在するハロペルオキシターゼに
依存する。ハロゲンペルオキシターゼがMPOまたはCPOで
ある場合、ハライドは、ブロマイド、クロライドまたは
アイオダイドであり得、好ましくはブロマイドまたはク
ロライドである。しかしながら、ハロペルオキシターゼ
がEPOまたはLPOである場合、供因子としてクロライドは
比較的効率が悪く、従って好ましいハライドはブロマイ
ドである。好適なハロペルオキシターゼ／ハライドの組
み合わせを利用しそして表示系のその他の要員が速度制
限でない場合、ハライド濃度と化学的発光との関係は、
実験速度式： 速度CL＝Imax＝ｋ［Ｘ−］１ （式中、速度CLは化学的発光応答のピーク測定速度であ
り（Imax、最大強度としても記載される）、ｋは比例定
数または速度定数であり、Ｘ−は試験ハライドである
（すなわち、ハロペルオキシターゼがMPOまたはCPOであ
る場合Ｘ−はCl−またはBr−であり、ハロペルオキシタ
ーゼがEPOまたはLPOである場合Ｘ−はBr−である）によ
り記載される。指数用語「１」は、その他の反応体が非
速度制限濃度で存在する場合反応がハライド濃度に関し
て第１オーダーで適用することを意味する。
本発明のある実施態様において、試験検体におけるMP
OおよびEPOの存在が測定でき、そしてMPOおよびEPOが本
発明の表示系を使用して検体の化合したBr−依存MPOお
よびEPO発光活性を測定することによって識別される
（すなわち、分別定量できる）。本質的にEPO−依存で
ある検体のCl−−依存発光活性も測定される。測定の好
適な条件下に、検体のMPO含量は、直接測定されたBr−
−依存またはCr−−依存発光に比例し、一方EPO含量
は、検体のBr−−依存活性マイナスCl−−依存発光活性
に直接比例する。別に言うと、単独のハライド供因子と
してBr−を使用する本発明の反応条件下での試験検体の
発光苛性は、試験検体におけるMPOおよびEPOの両方の活
性を定量的に反射し、一方供因子としてCl−を使用する
発光活性は、MPOの活性を主として反射する。Cl−−依
存発光活性とBr−−依存発光活性との比率を形成するこ
とによって、MPO活性が試験検体において顕著である際
に統一性に到達し、そしてEPO活性が支配する場合非常
に少なくなる定量的測定が得られる。測定値を既知量の
MPOおよびEPOを含有する標準溶液からのものと比較する
ことによって、試験検体のMPOおよびEPO含量を定量する
高感度法が得られる。
OおよびEPOの存在が測定でき、そしてMPOおよびEPOが本
発明の表示系を使用して検体の化合したBr−依存MPOお
よびEPO発光活性を測定することによって識別される
（すなわち、分別定量できる）。本質的にEPO−依存で
ある検体のCl−−依存発光活性も測定される。測定の好
適な条件下に、検体のMPO含量は、直接測定されたBr−
−依存またはCr−−依存発光に比例し、一方EPO含量
は、検体のBr−−依存活性マイナスCl−−依存発光活性
に直接比例する。別に言うと、単独のハライド供因子と
してBr−を使用する本発明の反応条件下での試験検体の
発光苛性は、試験検体におけるMPOおよびEPOの両方の活
性を定量的に反射し、一方供因子としてCl−を使用する
発光活性は、MPOの活性を主として反射する。Cl−−依
存発光活性とBr−−依存発光活性との比率を形成するこ
とによって、MPO活性が試験検体において顕著である際
に統一性に到達し、そしてEPO活性が支配する場合非常
に少なくなる定量的測定が得られる。測定値を既知量の
MPOおよびEPOを含有する標準溶液からのものと比較する
ことによって、試験検体のMPOおよびEPO含量を定量する
高感度法が得られる。
MPOがポリモルファ核白血球（PMNL）および血液単球
の主要成分であり、そしてEPOがエオシノフィル白血球
の主要成分であるので、ハライド−依存分別および定量
の能力を、生物学的検体、例えば血液または血液成分、
組織生体検査検体、浸出液並びに分泌物および排出物
（例えば、尿、唾液および便）等におけるPMNL、単球お
よび／またはエオシノフィル白血球の存在または量の検
定に利用でき、それによって炎症プロセスに関連する重
要な診断情報を提供する。体液に存在する好中球の量
は、自ずと感染、例えば骨髄炎、骨炎媒体、卵管炎、敗
血病、淋病、心内膜炎、水痘、ヘルペスおよびロッキー
マウンティンスポット熱；心筋梗塞、火傷および癌によ
つ墟血壊死病；代謝疾患、例えば糖尿病性アシドーシ
ス、類子かん症、尿毒症および甲状腺中毒、急性出血、
外科手術、過労によるストレス、妊娠の第３分の１期お
よび出産；および炎症性疾患、例えばリウマチ性関節
炎、痛風、脈管症および筋炎により増加され、そして放
射線および色素剤による骨髄変形；感染、例えばチフ
ス、ツラレミア、ブルセフ病、肝炎、インフルエンザ、
麻疹、おたふくかぜ、風疹および感染性単核細胞症；肝
臓または保存疾患からの脾機能亢進症；コラーゲン小管
疾患、例えば系狼瘡紅斑症；および葉酸およびビタミン
B2の欠乏症により自ずと減少される。これに対して、体
液中のエノシフィルの量は、アレルギー疾患、例えば喘
息、枯草熱、食品および薬剤過敏症、血清症および血管
神経組織浮腫；寄生物症、例えば施血出症、鈎血症、回
虫およびアメーバー症；皮膚疾患、例えば湿疹、天疱
瘡、乾癬、皮膚炎およびヘルペス；腫瘍性疾患、例えば
慢性ミエローマ細胞白血病、ホジキンス病、固体腫瘍の
転移およびメクローシスによりそしてコラーゲン子管疾
患、副腎皮質機能低下、潰瘍性大腸炎、多発関節結節
症、脾摘後、悪性貧血、深紅熱および過労により自ずと
増加され、そして外傷、ショック、火傷、外科手術およ
びメンタルジストレスによりそしてクッシン症候群によ
り自ずと低下される。従って、本発明の表示系をよび定
量は、貴重な診断情報、例えばバクテリア（発熱原）感
染対寄生物感染等の診断において貴重な診断情報を提供
できる。
の主要成分であり、そしてEPOがエオシノフィル白血球
の主要成分であるので、ハライド−依存分別および定量
の能力を、生物学的検体、例えば血液または血液成分、
組織生体検査検体、浸出液並びに分泌物および排出物
（例えば、尿、唾液および便）等におけるPMNL、単球お
よび／またはエオシノフィル白血球の存在または量の検
定に利用でき、それによって炎症プロセスに関連する重
要な診断情報を提供する。体液に存在する好中球の量
は、自ずと感染、例えば骨髄炎、骨炎媒体、卵管炎、敗
血病、淋病、心内膜炎、水痘、ヘルペスおよびロッキー
マウンティンスポット熱；心筋梗塞、火傷および癌によ
つ墟血壊死病；代謝疾患、例えば糖尿病性アシドーシ
ス、類子かん症、尿毒症および甲状腺中毒、急性出血、
外科手術、過労によるストレス、妊娠の第３分の１期お
よび出産；および炎症性疾患、例えばリウマチ性関節
炎、痛風、脈管症および筋炎により増加され、そして放
射線および色素剤による骨髄変形；感染、例えばチフ
ス、ツラレミア、ブルセフ病、肝炎、インフルエンザ、
麻疹、おたふくかぜ、風疹および感染性単核細胞症；肝
臓または保存疾患からの脾機能亢進症；コラーゲン小管
疾患、例えば系狼瘡紅斑症；および葉酸およびビタミン
B2の欠乏症により自ずと減少される。これに対して、体
液中のエノシフィルの量は、アレルギー疾患、例えば喘
息、枯草熱、食品および薬剤過敏症、血清症および血管
神経組織浮腫；寄生物症、例えば施血出症、鈎血症、回
虫およびアメーバー症；皮膚疾患、例えば湿疹、天疱
瘡、乾癬、皮膚炎およびヘルペス；腫瘍性疾患、例えば
慢性ミエローマ細胞白血病、ホジキンス病、固体腫瘍の
転移およびメクローシスによりそしてコラーゲン子管疾
患、副腎皮質機能低下、潰瘍性大腸炎、多発関節結節
症、脾摘後、悪性貧血、深紅熱および過労により自ずと
増加され、そして外傷、ショック、火傷、外科手術およ
びメンタルジストレスによりそしてクッシン症候群によ
り自ずと低下される。従って、本発明の表示系をよび定
量は、貴重な診断情報、例えばバクテリア（発熱原）感
染対寄生物感染等の診断において貴重な診断情報を提供
できる。
同様な方法で、CPOおよびLPO、LPOおよびCPOおよびEP
Oを定量・分別できる。従って、二種類のハライド−分
別ハロペルオキシターゼを使用する検定は、多重検定測
定を満たす。
Oを定量・分別できる。従って、二種類のハライド−分
別ハロペルオキシターゼを使用する検定は、多重検定測
定を満たす。
本発明の更に別の実施態様において、既知に量のハロ
ペルオキシターゼを利用し、検体の化合したMOP−（ま
たはCPO−）依存発光活性を測定し、そして検体のEPO−
（またはLPO−）依存活性を測定することによって試験
検体中のBr−およびCl−の存在および量を分別定量でき
る。好適な反応条件下に、検体のBr−含量は、検体のEP
O−（またはLPO−）依存活性またはMPO−（またはCPO
−）依存活性のいずれかと直接比例関係にあり、一方検
体のCl−含量は、MOP−（またはCPO−）依存活性マイナ
スEPO−（またはLPO−）依存活性に直接比例関係にあ
る。MPOおよびEPO分別測定と同様な方法で、EPO−また
はLPO−依存活性（Br−−依存）とMPO−またはCPO−依
存活性（Cl−およびBr−−依存）との比率が、試験検体
中のブロマイドまたはクロライドの有効な尺度として形
成できる。
ペルオキシターゼを利用し、検体の化合したMOP−（ま
たはCPO−）依存発光活性を測定し、そして検体のEPO−
（またはLPO−）依存活性を測定することによって試験
検体中のBr−およびCl−の存在および量を分別定量でき
る。好適な反応条件下に、検体のBr−含量は、検体のEP
O−（またはLPO−）依存活性またはMPO−（またはCPO
−）依存活性のいずれかと直接比例関係にあり、一方検
体のCl−含量は、MOP−（またはCPO−）依存活性マイナ
スEPO−（またはLPO−）依存活性に直接比例関係にあ
る。MPOおよびEPO分別測定と同様な方法で、EPO−また
はLPO−依存活性（Br−−依存）とMPO−またはCPO−依
存活性（Cl−およびBr−−依存）との比率が、試験検体
中のブロマイドまたはクロライドの有効な尺度として形
成できる。
ハライドが被分析物でない用途において、ハライドは
一般に、反応混合物中に非速度制限的に最適な量で、通
常は塩、例えばナトリウムハライドまたはカリウムハラ
イド等として供給される。別の用途において、ハライド
を、被分析物、例えばテンカン治療に関連して血液また
は汗クロライドまたは血液ブロマイドであってよい。
一般に、反応混合物中に非速度制限的に最適な量で、通
常は塩、例えばナトリウムハライドまたはカリウムハラ
イド等として供給される。別の用途において、ハライド
を、被分析物、例えばテンカン治療に関連して血液また
は汗クロライドまたは血液ブロマイドであってよい。
本発明に従って測定される被分析は、通常液状媒体ま
たは検体に存在するであろう。分析される検体は、被分
析物を含有すると疑われた自然発生的または人工的に形
成された液体であり得る。多くの場合、液状検体は、体
液または体液を処理または希釈して得られた液体、例え
ば血清、血漿、尿、便および羊水、大脳皮質液および骨
髄液である。固形物質、例えば食品、便および生体組織
並びに気体を本発明によりこれらを液状に還元すること
によって、例えば液体中への溶解、液体中への懸濁また
は液体中げの抽出によって検定できる。
たは検体に存在するであろう。分析される検体は、被分
析物を含有すると疑われた自然発生的または人工的に形
成された液体であり得る。多くの場合、液状検体は、体
液または体液を処理または希釈して得られた液体、例え
ば血清、血漿、尿、便および羊水、大脳皮質液および骨
髄液である。固形物質、例えば食品、便および生体組織
並びに気体を本発明によりこれらを液状に還元すること
によって、例えば液体中への溶解、液体中への懸濁また
は液体中げの抽出によって検定できる。
従来化学的発光表示系、特にペルオキシターゼ（例え
ば、ホースラディッシュペルオキシターゼ等）触媒ルミ
ノール酸化を使用したものとの際立って対照的に、本発
明の表示系は、酸性pHで効率的に作用する。好ましい実
施態様において、表示系は、約３ないし約８、より好ま
しくは約４ないし約７のpHで上記の反応（１）ないし
（８）に記載された表示反応の際に保持される。酸性pH
で操作することによって、高感度およびハロペルオキシ
ターゼ−特異性表示が、従来のペルオキシターゼ化学的
発光系を困難にした塩基触媒バックグラウンド化学的発
光なしで得られる。従って、本発明の検定系は更に、表
示反応の際に酸性pHを保持するのに好適な緩衝液、例え
ば酢酸エチル／酢酸緩衝溶液を含んでなる。反応系に特
に干渉しないいかなる緩衝液もこのために使用できる。
ば、ホースラディッシュペルオキシターゼ等）触媒ルミ
ノール酸化を使用したものとの際立って対照的に、本発
明の表示系は、酸性pHで効率的に作用する。好ましい実
施態様において、表示系は、約３ないし約８、より好ま
しくは約４ないし約７のpHで上記の反応（１）ないし
（８）に記載された表示反応の際に保持される。酸性pH
で操作することによって、高感度およびハロペルオキシ
ターゼ−特異性表示が、従来のペルオキシターゼ化学的
発光系を困難にした塩基触媒バックグラウンド化学的発
光なしで得られる。従って、本発明の検定系は更に、表
示反応の際に酸性pHを保持するのに好適な緩衝液、例え
ば酢酸エチル／酢酸緩衝溶液を含んでなる。反応系に特
に干渉しないいかなる緩衝液もこのために使用できる。
本発明の発光表示系からの光またはフォトン放出も、
第２の因子、例えば試薬濃度、混合速度および散乱光の
測定法によって影響される。利用する正確な反応条件
は、酵素触媒活性、反応運動、装置制限、反応感度およ
びバックグラウンドノイズ干渉を包含する全反応パラメ
ータを最適化するように選択する。
第２の因子、例えば試薬濃度、混合速度および散乱光の
測定法によって影響される。利用する正確な反応条件
は、酵素触媒活性、反応運動、装置制限、反応感度およ
びバックグラウンドノイズ干渉を包含する全反応パラメ
ータを最適化するように選択する。
本明細書で記載する発光反応から得られる光（フォト
ン）放出の物性は、化学的発光性基質の特質に主として
依存しそしてハロペルオキシターゼ、オキシダントおよ
びハライドの特質に二次的に依存する。ルミノールを化
学的発光性基質として使用する場合、最大スペクトル放
出は、430〜500nm（青緑光）の範囲内である。検定法で
製造された光放出は、発光基質がその最大スペクトル放
出を示す部分のスペクトルにおいて適当な感度を有する
光感受性測定機により測定できる。一般には、350ない
し650nmの範囲にわたって適当な感度を有する光電池、
光ダイオード、光抵抗またはビアルカリフォトマルチプ
ライヤーが本発明の実施に使用するのに好適である。
ン）放出の物性は、化学的発光性基質の特質に主として
依存しそしてハロペルオキシターゼ、オキシダントおよ
びハライドの特質に二次的に依存する。ルミノールを化
学的発光性基質として使用する場合、最大スペクトル放
出は、430〜500nm（青緑光）の範囲内である。検定法で
製造された光放出は、発光基質がその最大スペクトル放
出を示す部分のスペクトルにおいて適当な感度を有する
光感受性測定機により測定できる。一般には、350ない
し650nmの範囲にわたって適当な感度を有する光電池、
光ダイオード、光抵抗またはビアルカリフォトマルチプ
ライヤーが本発明の実施に使用するのに好適である。
特定の時間点において放出された光の強度は、反応系
の反応速度に比例し、従って反応系における未知の量と
関連する。反応系から放出された光の速度（dhν/dt）
または強度（Ｉ）は、反応成分および未知物質を混合し
た際に基底バックグラウンドレベルから最大値（Imax）
またはピーク速度に増加し、従って未知物質が消費され
るにつれて基底バックグラウンドレベルに減少する。従
って、系のImaxは、反応混合物中の未知物質の存在また
は量の相対的尺度として使用できる。Imaxに加えて、系
から放出されたその他の運動表示を使用して直接的にま
たは間接的に検体における未知物質の存在または量を測
定することができる。例えば、全放出光（すなわち、主
要時間間隔にわたって放出されたフォトンの数の積分ま
たは和）、ピーク放出光強度、光放出のピーク加速度
（すなわち、d2hν／（dt）２またはdv/dtまたはdl/d
t）または主要時間間隔内での発光の速度または加速度
の最高値を、測定尺度として使用できる。従って、検定
系により放出された光を測定するのに利用する装置は、
データ、データ保管、検定関数の尺度、誘導または統一
を行うのに必要とされ望ましいので付加的に好適な機械
的または電子的装置を含んでなることができる。
の反応速度に比例し、従って反応系における未知の量と
関連する。反応系から放出された光の速度（dhν/dt）
または強度（Ｉ）は、反応成分および未知物質を混合し
た際に基底バックグラウンドレベルから最大値（Imax）
またはピーク速度に増加し、従って未知物質が消費され
るにつれて基底バックグラウンドレベルに減少する。従
って、系のImaxは、反応混合物中の未知物質の存在また
は量の相対的尺度として使用できる。Imaxに加えて、系
から放出されたその他の運動表示を使用して直接的にま
たは間接的に検体における未知物質の存在または量を測
定することができる。例えば、全放出光（すなわち、主
要時間間隔にわたって放出されたフォトンの数の積分ま
たは和）、ピーク放出光強度、光放出のピーク加速度
（すなわち、d2hν／（dt）２またはdv/dtまたはdl/d
t）または主要時間間隔内での発光の速度または加速度
の最高値を、測定尺度として使用できる。従って、検定
系により放出された光を測定するのに利用する装置は、
データ、データ保管、検定関数の尺度、誘導または統一
を行うのに必要とされ望ましいので付加的に好適な機械
的または電子的装置を含んでなることができる。
本発明のハロペルオキシターゼ表示系は、検体におけ
る被分析物の存在または量の測定用のあるいは被分析物
の局所化のための広い範囲の検定フォーマットおよび環
境に利用できる。例えば、ハロペルオキシターゼ反応系
を、検定系の反応体のうちの１つの存在または量の測定
に、免疫検定およびタンパク質結合検定に、ターンオー
バー検定に組織内染色のため、再分布を行うトレース検
定のためにまたは当該技術分野に周知のその他の検定に
使用できる。
る被分析物の存在または量の測定用のあるいは被分析物
の局所化のための広い範囲の検定フォーマットおよび環
境に利用できる。例えば、ハロペルオキシターゼ反応系
を、検定系の反応体のうちの１つの存在または量の測定
に、免疫検定およびタンパク質結合検定に、ターンオー
バー検定に組織内染色のため、再分布を行うトレース検
定のためにまたは当該技術分野に周知のその他の検定に
使用できる。
本発明のある実施態様において、ハロペルオキシター
ゼ検定系を利用して検体中の存在または未知量のオキシ
ダント、例えば過酸化水素を測定できる。図3Cに示すよ
うに過酸化水素に関して一次反応である過酸化反応によ
るルミノールの非−ハライド依存ペルオキシターゼ触媒
酸化とは際立って対照的に（Dure et al,m Studies on
the Bioluminescence of Balanoglossus bimeniensis E
xtracts,″J.Biol.Chem.,Vol.239,No.7,pp.2351−2359,
1964）、本発明のハロペルオキシターゼ発光表示系は、
図3Bに示すように過酸化水素に関して二次反応である。
この反応は、実験速度式： ピーク速度CL＝Imax＝ｋ［H2O2］２ （12） （式中、Imaxまたはピーク速度はピーク測定化学的発光
強度（速度）であり、ｋは速度定数または比例定数であ
り、［H2 O2］は過酸化水素濃度である）によって表す
ことができる。次数「２」は、その他の反応成分が非速
度制限的である場合反応が過酸化水素に関して二次にあ
てはまることを示す。従って、本検定系は、従来のペル
オキシターゼ触媒系で得られた正比例とは反対に過酸化
水素濃度の平方に比例する高感度発光応答を提供する。
ゼ検定系を利用して検体中の存在または未知量のオキシ
ダント、例えば過酸化水素を測定できる。図3Cに示すよ
うに過酸化水素に関して一次反応である過酸化反応によ
るルミノールの非−ハライド依存ペルオキシターゼ触媒
酸化とは際立って対照的に（Dure et al,m Studies on
the Bioluminescence of Balanoglossus bimeniensis E
xtracts,″J.Biol.Chem.,Vol.239,No.7,pp.2351−2359,
1964）、本発明のハロペルオキシターゼ発光表示系は、
図3Bに示すように過酸化水素に関して二次反応である。
この反応は、実験速度式： ピーク速度CL＝Imax＝ｋ［H2O2］２ （12） （式中、Imaxまたはピーク速度はピーク測定化学的発光
強度（速度）であり、ｋは速度定数または比例定数であ
り、［H2 O2］は過酸化水素濃度である）によって表す
ことができる。次数「２」は、その他の反応成分が非速
度制限的である場合反応が過酸化水素に関して二次にあ
てはまることを示す。従って、本検定系は、従来のペル
オキシターゼ触媒系で得られた正比例とは反対に過酸化
水素濃度の平方に比例する高感度発光応答を提供する。
いくつかの適用において、自ずと検体に存在するオキ
シダント例えば過酸化水素の存在または量を測定するこ
とが望ましい。付加的に、過酸化水素発生または消費酵
素の活性の尺度としての過酸化水素の測定または過酸化
水素発生または消費酵素に対する被分析基質の存在また
は量の測定に主として基づいている数多くの診断検定系
が公知である。例えば、種々の被分析物、例えばグルコ
ース、ガラクトース、コレステロールおよび尿酸の測定
は、特定のオキシターゼ酵素（例えば、グルコースオキ
シターゼ、ガラクトースオキシターゼ、コレステロール
オキシターゼおよびウリカーゼ）の作用に基づいて過酸
化水素を製造し、製造された過酸化水素の量の測定を行
う。生成物過酸化水素の基質被分析物との比率が統一さ
れると（すなわち、H2 O2の発生が基質被分析物に関し
て一次である際）、例えばグルコース／グルコースオキ
シターゼ反応の場合および一次酵素反応が制限的でない
場合、本発明のハロペルオキシターゼ表示系は、以下の
実験式を得る。
シダント例えば過酸化水素の存在または量を測定するこ
とが望ましい。付加的に、過酸化水素発生または消費酵
素の活性の尺度としての過酸化水素の測定または過酸化
水素発生または消費酵素に対する被分析基質の存在また
は量の測定に主として基づいている数多くの診断検定系
が公知である。例えば、種々の被分析物、例えばグルコ
ース、ガラクトース、コレステロールおよび尿酸の測定
は、特定のオキシターゼ酵素（例えば、グルコースオキ
シターゼ、ガラクトースオキシターゼ、コレステロール
オキシターゼおよびウリカーゼ）の作用に基づいて過酸
化水素を製造し、製造された過酸化水素の量の測定を行
う。生成物過酸化水素の基質被分析物との比率が統一さ
れると（すなわち、H2 O2の発生が基質被分析物に関し
て一次である際）、例えばグルコース／グルコースオキ
シターゼ反応の場合および一次酵素反応が制限的でない
場合、本発明のハロペルオキシターゼ表示系は、以下の
実験式を得る。
Imax＝ｋ［被分析基質］２ （13） （式中、Imaxおよびｋは既に定義された意味を持つ）。
全酸素並びにPO2（酸素分圧）もこのアプローチを使
用して測定できる。酸素は、オキシターゼ、例えばグル
コースオキシターゼ用の基質であり、そしてそれゆえ酸
素消費の速度は、過酸化物製造の速度に定量的に比例す
る。系のその他の成分が制限的でない場合、酸素をハロ
ペルオキシターゼ表示系を使用して発光度として定量で
きる。
用して測定できる。酸素は、オキシターゼ、例えばグル
コースオキシターゼ用の基質であり、そしてそれゆえ酸
素消費の速度は、過酸化物製造の速度に定量的に比例す
る。系のその他の成分が制限的でない場合、酸素をハロ
ペルオキシターゼ表示系を使用して発光度として定量で
きる。
従って、例えば興味ある被分析物が１種類またはそれ
以上の酵素段階または非酵素段階で反応して生成物を製
造し、ついでこの生成物を１種類またはそれ以上の付加
的酵素段階または非酵素段階で反応して過酸化水素また
はその他のオキシダントを主として得るまたは消費する
際に（その存在および量を次いで本発明に従って測定す
る）、その他の反応系を本発明のハロペルオキシターゼ
表示系とカップリングできる。従ってこの実施態様にお
いて、本発明のハロペルオキシターゼ表示系は、被分析
物が１種類またはそれ以上の過酸化水素（またはオキシ
ダント）を反応生成物として製造するかまたは反応体と
して消費する１種類またはそれ以上の予備反応（または
補助反応）に添加し、次いで反応混合物中に存在する過
酸化水素の量を検体に元々存在する被分析物の存在また
は量の測定として本明細書に記載された方法に従って測
定する。オキシダントを製造する本発明のカップリング
された反応は、以下の反応経路に従うであろう。
以上の酵素段階または非酵素段階で反応して生成物を製
造し、ついでこの生成物を１種類またはそれ以上の付加
的酵素段階または非酵素段階で反応して過酸化水素また
はその他のオキシダントを主として得るまたは消費する
際に（その存在および量を次いで本発明に従って測定す
る）、その他の反応系を本発明のハロペルオキシターゼ
表示系とカップリングできる。従ってこの実施態様にお
いて、本発明のハロペルオキシターゼ表示系は、被分析
物が１種類またはそれ以上の過酸化水素（またはオキシ
ダント）を反応生成物として製造するかまたは反応体と
して消費する１種類またはそれ以上の予備反応（または
補助反応）に添加し、次いで反応混合物中に存在する過
酸化水素の量を検体に元々存在する被分析物の存在また
は量の測定として本明細書に記載された方法に従って測
定する。オキシダントを製造する本発明のカップリング
された反応は、以下の反応経路に従うであろう。
（式中、OAは被分析物の酸化誘導体であり、CLSおよび
Ｐは上記に定義された通りである）。被分析物を、例え
ば被分析物オキシターゼの作用により直接酸化してもよ
い。代わりに、被分析物を１種類またはそれ以上の反応
生成物であってこれを反応（14）に従って酸化して過酸
化水素を製造するその他の予備反応を行ってもよい。更
に別の実施態様において、被分析物は、その活性が本発
明の表示系により説明される酵素、例えばオキシターゼ
であることができる。オキシダントを消費する本発明の
カップリングされた反応は、例えば以下の反応経路であ
ることができる。
Ｐは上記に定義された通りである）。被分析物を、例え
ば被分析物オキシターゼの作用により直接酸化してもよ
い。代わりに、被分析物を１種類またはそれ以上の反応
生成物であってこれを反応（14）に従って酸化して過酸
化水素を製造するその他の予備反応を行ってもよい。更
に別の実施態様において、被分析物は、その活性が本発
明の表示系により説明される酵素、例えばオキシターゼ
であることができる。オキシダントを消費する本発明の
カップリングされた反応は、例えば以下の反応経路であ
ることができる。
（式中、OAは被分析物の酸化誘導体である）。再び、被
分析物は、反応（15）に従って過酸化水素と反応性のま
たは過酸化水素を消費する１種類またはそれ以上の生成
物を形成するその他の予備的反応を行うことができる。
被分析物が１種類またはそれ以上の予備的反応で反応し
て過酸化水素を消費する場合、既知量の過酸化水素を、
代表的に添加して、そして過酸化水素の消費を表示反応
（８）に従って監視または測定する。
分析物は、反応（15）に従って過酸化水素と反応性のま
たは過酸化水素を消費する１種類またはそれ以上の生成
物を形成するその他の予備的反応を行うことができる。
被分析物が１種類またはそれ以上の予備的反応で反応し
て過酸化水素を消費する場合、既知量の過酸化水素を、
代表的に添加して、そして過酸化水素の消費を表示反応
（８）に従って監視または測定する。
種々の被分析物を測定するための本発明の表示系とカ
ップリングした反応をもたらす予備的オキシダント反応
の代表例は以下の通りである。
ップリングした反応をもたらす予備的オキシダント反応
の代表例は以下の通りである。
一般に、本発明の表示系は、表示系で操作可能な１ま
たはそれ以上の反応段階でオキシダント、例えば過酸化
水素を製造する酵素反応とカップリングできる。限定さ
れるものではないがかゝる酵素の代表例は、グリコレー
オトキシターゼ、グルコースオキシターゼ、ヘキソース
オキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、アリール
アルコールオキシターゼ、Ｌ−グロノアセトンオキシタ
ーゼ、ガラクターゼ、ピラノースオキシターゼ、Ｌ−ソ
ルボースオキシターゼ、ピリドキシンオキシターゼ、ア
ルコールオキシターゼ、Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシタ
ーゼ、エクドソームオキシターゼ、コリンオキシター
ゼ、アルデヒドオキシターゼ、キサンチンオキシター
ゼ、ピルベートオキシターゼ、Ｄ−アスパラテートオキ
シターゼ、Ｌ−アミノ酸オキシターゼ、アミンオキシタ
ーゼ、ピリドキサミンホスフェートオキシターゼ、Ｄ−
グルタメートオキシターゼ、エタノールアミンオキシタ
ーゼ、チラミンオキシターゼ、プラスシンオキシター
ゼ、サルコシンオキシターゼ、Ｎ−メチルアミノ酸オキ
シターゼ、Ｎ−メチルリシンオキシターゼ、ヒドロキシ
ルニコチンオキシターゼ、ニトロエタンオキシターゼ、
アセチルインドキシルオキシターゼ、ウレートオキシタ
ーゼ、ヒドロキシルアミンアミンオキシターゼおよびサ
ルフィットオキシターゼを包含する。
たはそれ以上の反応段階でオキシダント、例えば過酸化
水素を製造する酵素反応とカップリングできる。限定さ
れるものではないがかゝる酵素の代表例は、グリコレー
オトキシターゼ、グルコースオキシターゼ、ヘキソース
オキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、アリール
アルコールオキシターゼ、Ｌ−グロノアセトンオキシタ
ーゼ、ガラクターゼ、ピラノースオキシターゼ、Ｌ−ソ
ルボースオキシターゼ、ピリドキシンオキシターゼ、ア
ルコールオキシターゼ、Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシタ
ーゼ、エクドソームオキシターゼ、コリンオキシター
ゼ、アルデヒドオキシターゼ、キサンチンオキシター
ゼ、ピルベートオキシターゼ、Ｄ−アスパラテートオキ
シターゼ、Ｌ−アミノ酸オキシターゼ、アミンオキシタ
ーゼ、ピリドキサミンホスフェートオキシターゼ、Ｄ−
グルタメートオキシターゼ、エタノールアミンオキシタ
ーゼ、チラミンオキシターゼ、プラスシンオキシター
ゼ、サルコシンオキシターゼ、Ｎ−メチルアミノ酸オキ
シターゼ、Ｎ−メチルリシンオキシターゼ、ヒドロキシ
ルニコチンオキシターゼ、ニトロエタンオキシターゼ、
アセチルインドキシルオキシターゼ、ウレートオキシタ
ーゼ、ヒドロキシルアミンアミンオキシターゼおよびサ
ルフィットオキシターゼを包含する。
種々の被分析物の存在を量を測定するための本発明の
表示系とカップリングされる予備オキシダント消費反応
の代表例は、以下の通りである。
表示系とカップリングされる予備オキシダント消費反応
の代表例は、以下の通りである。
本発明のハロペルオキシターゼ表示系はまた、特定の
結合検定、例えば本発明の検定系により測定可能な標識
基質を使用する免疫検定にも適用可能である。特定の結
合検定としては、ハロペルオキシターゼを当該技術分野
に周知の均一または不均質検定系における標識として使
用する系、例えば米国特許第3,654,090号明細書、同第
3,817,837号明細書、同3,839,153号明細書、同第3,850,
752号明細書、同第3,879,262号明細書および同第4,380,
580号明細書に記載の系、または発光基質、オキシダン
トまたはハライドを同様に周知の系における標識として
使用する系、例えば米国特許第4,134,792号明細書、同
第4,238,195号明細書、同第4,238,565号明細書、同第4,
273,866号明細書、同第4,279,992号明細書、4,372,745
号明細書、同第4,380,580号明細書および同第4,383,031
号明細書に記載の系が挙げられる。
結合検定、例えば本発明の検定系により測定可能な標識
基質を使用する免疫検定にも適用可能である。特定の結
合検定としては、ハロペルオキシターゼを当該技術分野
に周知の均一または不均質検定系における標識として使
用する系、例えば米国特許第3,654,090号明細書、同第
3,817,837号明細書、同3,839,153号明細書、同第3,850,
752号明細書、同第3,879,262号明細書および同第4,380,
580号明細書に記載の系、または発光基質、オキシダン
トまたはハライドを同様に周知の系における標識として
使用する系、例えば米国特許第4,134,792号明細書、同
第4,238,195号明細書、同第4,238,565号明細書、同第4,
273,866号明細書、同第4,279,992号明細書、4,372,745
号明細書、同第4,380,580号明細書および同第4,383,031
号明細書に記載の系が挙げられる。
免疫検定と関連して使用する場合、本発明の表示系を
用いて検定しようとする被分析物は、リガンドおよびリ
ガンドレセプターを包含する免疫学的対の一員であって
よい。本発明の表示系のうちの１つの成分を免疫学的の
１つに接合することによって反応混合物中の被分析物の
存在は、表示系によってもたらされる光の性質または量
を影響する。次いで、光の散乱が測定しようとする検体
中の被文型物の存在または量に定性的にまたは定量的に
関連する。本発明の表示系は、当該技術分野に周知の直
接結合または競合結合免疫検定技術のいずれにも利用で
きる。
用いて検定しようとする被分析物は、リガンドおよびリ
ガンドレセプターを包含する免疫学的対の一員であって
よい。本発明の表示系のうちの１つの成分を免疫学的の
１つに接合することによって反応混合物中の被分析物の
存在は、表示系によってもたらされる光の性質または量
を影響する。次いで、光の散乱が測定しようとする検体
中の被文型物の存在または量に定性的にまたは定量的に
関連する。本発明の表示系は、当該技術分野に周知の直
接結合または競合結合免疫検定技術のいずれにも利用で
きる。
直接結合技術において、被分析物（すなわち、リガン
ド）を含有する疑いのある検体を、表示系および特定の
リガンドのパートナーを含んでなる接合体と接触させ
る。次いで、接合体の活性が検体中のリガンドと接合体
における特定の結合パートナーとの結合の範囲に直接関
連する。定量的結果を得るために、特定の結果パートナ
ー接合体の量は、通常検体に存在すると考えられる全て
のリガンドと結合できるものの過剰量で用意する。
ド）を含有する疑いのある検体を、表示系および特定の
リガンドのパートナーを含んでなる接合体と接触させ
る。次いで、接合体の活性が検体中のリガンドと接合体
における特定の結合パートナーとの結合の範囲に直接関
連する。定量的結果を得るために、特定の結果パートナ
ー接合体の量は、通常検体に存在すると考えられる全て
のリガンドと結合できるものの過剰量で用意する。
競合結合技術において、検体をリガンドの特定の結合
パートナーと、そしてリガンド（またはリガンド類縁
体）と接合される表示系の成分と接触できる。検体にお
けるリガンドが特定の結合パートナー上の結合部位にお
関するリガンド（またはリガンド類縁体）接合体と競合
するので、複合特定結合パートナーの化学的発光活性
は、検体におけるリガンドと特定の結合パートナーとの
結合の範囲に反比例して変化する。定量的結果を得るた
めに、利用する特定の結合パートナーの量は、代表的に
は検体に存在すると考えられる全てのリガンドおよび表
示系の成分と接合する全てのリガンド（またはリガンド
類縁体）と結合できるものより少ない。
パートナーと、そしてリガンド（またはリガンド類縁
体）と接合される表示系の成分と接触できる。検体にお
けるリガンドが特定の結合パートナー上の結合部位にお
関するリガンド（またはリガンド類縁体）接合体と競合
するので、複合特定結合パートナーの化学的発光活性
は、検体におけるリガンドと特定の結合パートナーとの
結合の範囲に反比例して変化する。定量的結果を得るた
めに、利用する特定の結合パートナーの量は、代表的に
は検体に存在すると考えられる全てのリガンドおよび表
示系の成分と接合する全てのリガンド（またはリガンド
類縁体）と結合できるものより少ない。
直接または競合検定フォーマットのいずれかにおい
て、表示系によりもたらされた化学的発光は、検体中の
被分析物の存在（定性）または量（定量）の表示であ
る。被分析物の定性測定は、化学的発光反応の特徴を被
分析物のない監視反応のものと比較することを包含する
が、相違は検体における被分析物の存在の表示である。
検体の定量測定は、代表的に化学的発光反応の特徴を既
知量の被分析物を含有する監視反応のものと比較するこ
とを包含する。検定が被分析物とその特異結合パートナ
ーとの間で形成された複合体を反応混合物から分離する
分離段階を含んでなる場合、定性または定量的則的は、
検定の分離または非分離成分のいずれかに対して行い得
る。
て、表示系によりもたらされた化学的発光は、検体中の
被分析物の存在（定性）または量（定量）の表示であ
る。被分析物の定性測定は、化学的発光反応の特徴を被
分析物のない監視反応のものと比較することを包含する
が、相違は検体における被分析物の存在の表示である。
検体の定量測定は、代表的に化学的発光反応の特徴を既
知量の被分析物を含有する監視反応のものと比較するこ
とを包含する。検定が被分析物とその特異結合パートナ
ーとの間で形成された複合体を反応混合物から分離する
分離段階を含んでなる場合、定性または定量的則的は、
検定の分離または非分離成分のいずれかに対して行い得
る。
免疫学的対の一員とは、検定が２種類の異なる分子で
あって分子のうちの一方が特定の他方の分子の特定の空
間的および／または極性組織と特異に結合する表面上ま
たは孔中の領域を有する分子を包含することを意味す
る。免疫学的対または特定の結合パートナーは、当該技
術分野において一般にリガンドまたはレセプター（また
はアンチリガンド）と言われている。リガンドは、レセ
プターが自ずと存在するまたは製造できる有機化合物で
あることができ、代表的には抗原またはヘプテンであ
る。レセプター（またはアンチリガンド）は、独立部
分、例えばリガンドのエピトープ、を認識または特異に
結合することができる化合物または組成物であり、そし
て抗体、酵素Fabフラグメント、レクチン、核酸プロー
ブ等であることができる。
あって分子のうちの一方が特定の他方の分子の特定の空
間的および／または極性組織と特異に結合する表面上ま
たは孔中の領域を有する分子を包含することを意味す
る。免疫学的対または特定の結合パートナーは、当該技
術分野において一般にリガンドまたはレセプター（また
はアンチリガンド）と言われている。リガンドは、レセ
プターが自ずと存在するまたは製造できる有機化合物で
あることができ、代表的には抗原またはヘプテンであ
る。レセプター（またはアンチリガンド）は、独立部
分、例えばリガンドのエピトープ、を認識または特異に
結合することができる化合物または組成物であり、そし
て抗体、酵素Fabフラグメント、レクチン、核酸プロー
ブ等であることができる。
免疫検定等のいくつかの実施態様において、レセプタ
ー上の結合部位に対するリガンドと競合するリガンド類
縁体を利用できる。リガンド類縁体は代表的には別の分
子を有する類縁体、例えば表示系の成分のうちの１つを
接合する意味を有する変性されたリガンドである。
ー上の結合部位に対するリガンドと競合するリガンド類
縁体を利用できる。リガンド類縁体は代表的には別の分
子を有する類縁体、例えば表示系の成分のうちの１つを
接合する意味を有する変性されたリガンドである。
本発明の免疫検定は、検体からの被分析物の分離を促
進する固形相を含んでなる。好適な固形相は、免疫額的
対の一員をその表面に共有結合または非共有結合するこ
とができる多孔性または非多孔性表面であり得る。数多
くの好適な固形相物質、例えばポリマー状物質、例えば
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等が当該
技術分野に公知である。多くの官能性基を、免疫学的対
の一員の共有結合用の非反応性固形相表面を変性するの
に利用でき、ハライド、エポキシド、非−オキシカルボ
ニル部位、メルカプタン等を包含する。免疫学的対の一
員の結合は、直接的または例えば特定の結合対の仲介を
介して間接的であることができる。固形相は、例えばポ
リ（アミノ酸）、例えばポリリシンで、検定の必要な成
分への固形相への結合を補助するために、あるいは検体
成分の固形相の非特異結合を禁止するための被覆しても
しなくともよい。代表的な固形相として、コンテナー
壁、例えばマイクロタイタープレートのウェル、バン、
ビーズ、粒子、磁性ビーズ、ゲル、計量棒、フィルタ
ー、好アルコールまたは非好アルコールマトリックス等
が挙げられる。物質改良剤および形状を包含する固形相
の特徴および形状は、固形相が本発明の検定の性能に必
要な性質を保持する化合物グリコール本発明に臨界的で
ない。
進する固形相を含んでなる。好適な固形相は、免疫額的
対の一員をその表面に共有結合または非共有結合するこ
とができる多孔性または非多孔性表面であり得る。数多
くの好適な固形相物質、例えばポリマー状物質、例えば
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等が当該
技術分野に公知である。多くの官能性基を、免疫学的対
の一員の共有結合用の非反応性固形相表面を変性するの
に利用でき、ハライド、エポキシド、非−オキシカルボ
ニル部位、メルカプタン等を包含する。免疫学的対の一
員の結合は、直接的または例えば特定の結合対の仲介を
介して間接的であることができる。固形相は、例えばポ
リ（アミノ酸）、例えばポリリシンで、検定の必要な成
分への固形相への結合を補助するために、あるいは検体
成分の固形相の非特異結合を禁止するための被覆しても
しなくともよい。代表的な固形相として、コンテナー
壁、例えばマイクロタイタープレートのウェル、バン、
ビーズ、粒子、磁性ビーズ、ゲル、計量棒、フィルタ
ー、好アルコールまたは非好アルコールマトリックス等
が挙げられる。物質改良剤および形状を包含する固形相
の特徴および形状は、固形相が本発明の検定の性能に必
要な性質を保持する化合物グリコール本発明に臨界的で
ない。
上記から明らかな通り、本発明の表示系は、特定の検
定に依存するものではなく、そして当該技術分野に公知
の数多くの従来の均質および不均質検定機構に広く適用
可能である。
定に依存するものではなく、そして当該技術分野に公知
の数多くの従来の均質および不均質検定機構に広く適用
可能である。
本発明の更に別の実施態様において、使用の容易性、
結果の再現性を促進しそして検定表示系の感度を高める
ためにキット形態で試薬が提供される。本発明のキット
は、１種類またはそれ以上の第１表示系試薬、すなわ
ち、ハロペルオキシターゼ、ハライド、オキシダントお
よび化学的発光性基質を規定の形態で希釈または直接適
用するのに好適な濃度で含んでなる。特定の検定系、例
えば免疫検定に使用するために、本発明のキットは更
に、助剤、例えば緩衝液、希釈剤、不活性タンパク質、
安定剤等が特定の性能に必要とされる場合含んでなる。
結果の再現性を促進しそして検定表示系の感度を高める
ためにキット形態で試薬が提供される。本発明のキット
は、１種類またはそれ以上の第１表示系試薬、すなわ
ち、ハロペルオキシターゼ、ハライド、オキシダントお
よび化学的発光性基質を規定の形態で希釈または直接適
用するのに好適な濃度で含んでなる。特定の検定系、例
えば免疫検定に使用するために、本発明のキットは更
に、助剤、例えば緩衝液、希釈剤、不活性タンパク質、
安定剤等が特定の性能に必要とされる場合含んでなる。
先の記載は、以下の代表的な実施例により良好に理解
されるであろう。実施例は、説明のために与えたもので
ありこれに限定されるものではない。
されるであろう。実施例は、説明のために与えたもので
ありこれに限定されるものではない。
実施例 実施例の方法に使用する検定試薬のストック溶液は、
実施例において特に断りのない限り以下の通りにして製
造した。
実施例において特に断りのない限り以下の通りにして製
造した。
0.05Mルミノールのジメチルスルホキシド溶液0.4mlを
50mM酢酸緩衝液,pH5.01lに添加することによって約0.2m
Mルミノールストック溶液を製造した。ルミノールの実
際の最終濃度（すなわち、0.17mM）を、347nmにおける
7.6mM−1cm−１の消失係数を使用して測定した（Lee,J
およびH.H.Seliger,Photochem.Photobiol.,Vol.15,pp.2
27−237,1972年）。
50mM酢酸緩衝液,pH5.01lに添加することによって約0.2m
Mルミノールストック溶液を製造した。ルミノールの実
際の最終濃度（すなわち、0.17mM）を、347nmにおける
7.6mM−1cm−１の消失係数を使用して測定した（Lee,J
およびH.H.Seliger,Photochem.Photobiol.,Vol.15,pp.2
27−237,1972年）。
過酸化水素標準濃度溶液を、30％H2O2ストック溶液を
H2Oで希釈することによって調製した。実際の過酸化水
素濃度を、350nmにおける43.6mM−1cm−１の消失係数を
使用して測定した（Nobel,R.W.およびQ.H.Gibson,J.Bio
l.Chem.Vol.245,pp.2409−2413,1976）。
H2Oで希釈することによって調製した。実際の過酸化水
素濃度を、350nmにおける43.6mM−1cm−１の消失係数を
使用して測定した（Nobel,R.W.およびQ.H.Gibson,J.Bio
l.Chem.Vol.245,pp.2409−2413,1976）。
ミエロペルオキシターゼ（MPO）およびエオシノフィ
ルペルオキシターゼ（EPO）を、ブタ白血球から調製し
た。クロロpHl（CPO,E.C.No.1.11.1.10）、ラクトペル
オキシターゼ（LPO）およびホースラデッィシュペルオ
キシターゼ（HRP）を、Sigma Chemical社（米国，ミズ
リー州，セントルイス）からの凍結粉末として得、そし
てMPO、EPO、LPOおよびHRPを0.5％ツイーン80を含有す
る0.15mMハライドのない燐酸緩衝液中で再構成し、同一
のハライドのない燐酸緩衝液で透析し、そして使用まで
４℃で保存した。CPOを、透析しない以外は同様の方法
で再構成および操作した。各ハロペルオキシターゼ（XP
O）製剤は、ペルオキシダーゼまたはヘム含有タンパク
質と汚染が実質的にないことを測定した。実際の最終濃
度は、MPOについては473nmで50mM−1cm−１、EPOおよび
LPOについては450nmで56mM−1cm−１の吸収−差異消失
係数を使用してジチオニット還元対酸化差異吸収スペク
トルにより測定した（Wever,R et al.,FEBS Letters,Vo
l.123,pp.327−331,1981）。HRPを403nmで90mM−1cm−
１の吸収消失スペクトルを用いて直接吸収により測定し
た（Keilin,D.およびHartee,E,Biochem,J.Vol.49,p88,1
951）。
ルペルオキシターゼ（EPO）を、ブタ白血球から調製し
た。クロロpHl（CPO,E.C.No.1.11.1.10）、ラクトペル
オキシターゼ（LPO）およびホースラデッィシュペルオ
キシターゼ（HRP）を、Sigma Chemical社（米国，ミズ
リー州，セントルイス）からの凍結粉末として得、そし
てMPO、EPO、LPOおよびHRPを0.5％ツイーン80を含有す
る0.15mMハライドのない燐酸緩衝液中で再構成し、同一
のハライドのない燐酸緩衝液で透析し、そして使用まで
４℃で保存した。CPOを、透析しない以外は同様の方法
で再構成および操作した。各ハロペルオキシターゼ（XP
O）製剤は、ペルオキシダーゼまたはヘム含有タンパク
質と汚染が実質的にないことを測定した。実際の最終濃
度は、MPOについては473nmで50mM−1cm−１、EPOおよび
LPOについては450nmで56mM−1cm−１の吸収−差異消失
係数を使用してジチオニット還元対酸化差異吸収スペク
トルにより測定した（Wever,R et al.,FEBS Letters,Vo
l.123,pp.327−331,1981）。HRPを403nmで90mM−1cm−
１の吸収消失スペクトルを用いて直接吸収により測定し
た（Keilin,D.およびHartee,E,Biochem,J.Vol.49,p88,1
951）。
他に断りのない限り、すべての反応混合物は、50mM酢
酸緩衝液,pH5中の1mlの最終容量を有し、そしてすべて
の測定を、Berthold CliniLumat LB952発光計（Berthol
d Analytical Industries,Inc,米国，ニューハンプシャ
ー州）を用いて周囲温度、約22℃で行った。
酸緩衝液,pH5中の1mlの最終容量を有し、そしてすべて
の測定を、Berthold CliniLumat LB952発光計（Berthol
d Analytical Industries,Inc,米国，ニューハンプシャ
ー州）を用いて周囲温度、約22℃で行った。
例１ 過酸化水素の測定 0.011ないし1.407μモルの範囲の量の過酸化水素を含
有する標準0.1ml溶液を、上記の通りにH2O2ストック溶
液を希釈することによって調製した。ポリスチレン製試
験管内の標準過酸化水素溶液にストックルミノール溶液
0.5ml（85nモルルミノール）を添加した。酢酸緩衝液,p
H5中のMPO（78pモル）およびクロライドオン（100μモ
ルNaCl換算）を含有するハロペルオキシターゼ／ハライ
ドイオン溶液0.3mlを各試験管に添加することによって
発光表示反応を開始し、そして化学的発光速度（毎秒の
相対カウント）をハロペルオキシターゼ／ハライドイオ
ン溶液の過酸化水素／ルミノール溶液への添加の後に10
ないし60秒間測定した。最終反応容量を0.9mlとした。
ピーク速度（vCL）を、下記表１に示す。
有する標準0.1ml溶液を、上記の通りにH2O2ストック溶
液を希釈することによって調製した。ポリスチレン製試
験管内の標準過酸化水素溶液にストックルミノール溶液
0.5ml（85nモルルミノール）を添加した。酢酸緩衝液,p
H5中のMPO（78pモル）およびクロライドオン（100μモ
ルNaCl換算）を含有するハロペルオキシターゼ／ハライ
ドイオン溶液0.3mlを各試験管に添加することによって
発光表示反応を開始し、そして化学的発光速度（毎秒の
相対カウント）をハロペルオキシターゼ／ハライドイオ
ン溶液の過酸化水素／ルミノール溶液への添加の後に10
ないし60秒間測定した。最終反応容量を0.9mlとした。
ピーク速度（vCL）を、下記表１に示す。
表１ ［H2O2］ vCL （μモル） （キロカウント／秒） 1.407 430.29 0.703 154.96 0.352 48.56 0.176 13.15 0.088 3.45 0.044 0.87 0.022 0.19 0.011 0.05 図２に記載のようにこの表示計に対する過酸化水素濃
度の関数としてピークCL速度（vCL）のプロットは、双
曲線となる。この表示系に関する速度等式の計算vCL＝
ｋ［H2O2］ｉは、ｋ＝300.8キロカウント／秒であり、
そしてｉ＝1.90であり（ここでｉは過酸化水素に関する
反応のオーダーである）、測定の係数（r2）は0.99であ
る。過酸化水素濃度に関するこの反応の略２次性質も、
このデータの二重逆数プロットにより同定される。ミカ
エル−メンテ運動が図3Aに表した標準プロットに従って
作用する。しかしながら、二次反応に関して、ｖ＝ｃ
［H2O2］１（式中、ｃは過酸化水素濃度と速度の平方根
に関する比例定数である）が式ｖ＝ｋ［H2O2］２に等し
く、そして、略直線関係が過酸化水素濃度の逆数の関数
としてvCLの平方根の逆数をプロットすることによって
図3Bに示した通り略直線関係が得られる。すなわち、化
学的発光応答は、表示系のその他の成分が速度制限的で
ない際に過酸化水素濃度に関して二次にあてはまる。G.
N.Wilkensen,Biochem,J.Vol.80,pp.324等の方法を使用
してvCLの平方根の逆数に関する値および過酸化水素濃
度の逆数を使用してkmおよび概算最大速度vmaxを計算
し、2.82±0.05（SE）のkmおよび3900±１（SE）キロカ
ウント／秒のvmax（ここで、SEは標準誤差である）を得
る。
度の関数としてピークCL速度（vCL）のプロットは、双
曲線となる。この表示系に関する速度等式の計算vCL＝
ｋ［H2O2］ｉは、ｋ＝300.8キロカウント／秒であり、
そしてｉ＝1.90であり（ここでｉは過酸化水素に関する
反応のオーダーである）、測定の係数（r2）は0.99であ
る。過酸化水素濃度に関するこの反応の略２次性質も、
このデータの二重逆数プロットにより同定される。ミカ
エル−メンテ運動が図3Aに表した標準プロットに従って
作用する。しかしながら、二次反応に関して、ｖ＝ｃ
［H2O2］１（式中、ｃは過酸化水素濃度と速度の平方根
に関する比例定数である）が式ｖ＝ｋ［H2O2］２に等し
く、そして、略直線関係が過酸化水素濃度の逆数の関数
としてvCLの平方根の逆数をプロットすることによって
図3Bに示した通り略直線関係が得られる。すなわち、化
学的発光応答は、表示系のその他の成分が速度制限的で
ない際に過酸化水素濃度に関して二次にあてはまる。G.
N.Wilkensen,Biochem,J.Vol.80,pp.324等の方法を使用
してvCLの平方根の逆数に関する値および過酸化水素濃
度の逆数を使用してkmおよび概算最大速度vmaxを計算
し、2.82±0.05（SE）のkmおよび3900±１（SE）キロカ
ウント／秒のvmax（ここで、SEは標準誤差である）を得
る。
上記のハロペルオキシターゼ／ハライド溶液中のクロ
ライドをブロマイドイオン（５μモルNaBr換算）に置換
し、そしてハライドとしてクロライドまたはブロマイド
のいずれかを使用してハロペルオキシターゼ／ハライド
溶液中のMPOをEPO（30pモル）に変えて上記の操作を繰
り返した。比較の目的で、ホースラディッシュペルオキ
シターゼ（HRP,10pモル）、非ハロペルオキシターゼを
反応系にハロペルオキシターゼに対して付加的に置換し
た。結果を以下の表２に示す。
ライドをブロマイドイオン（５μモルNaBr換算）に置換
し、そしてハライドとしてクロライドまたはブロマイド
のいずれかを使用してハロペルオキシターゼ／ハライド
溶液中のMPOをEPO（30pモル）に変えて上記の操作を繰
り返した。比較の目的で、ホースラディッシュペルオキ
シターゼ（HRP,10pモル）、非ハロペルオキシターゼを
反応系にハロペルオキシターゼに対して付加的に置換し
た。結果を以下の表２に示す。
反応は55nモルのルミノールを含有する50mM酢酸緩衝
液,0.9ml最終容量中である。温度は22℃である。Vmaxお
よび速度（ｖ）は、キロカウント／秒として表す。＊は
運動計算が速度の平方根に基づいていることを示す。
液,0.9ml最終容量中である。温度は22℃である。Vmaxお
よび速度（ｖ）は、キロカウント／秒として表す。＊は
運動計算が速度の平方根に基づいていることを示す。
表２に記載された通り、ピークCL速度（ｖ）は、
（ｉ）MPOおよびEPO表示系に関して過酸化水素濃度の平
方に定量的に比例し、すなわち表２においてアスターリ
スク（＊）で示されたように系のその他の成分が速度制
限的でない場合化学的発光応答が過酸化水素濃度に関し
て二次オーダーにあてはまる。また表２から、クロライ
ドイオンがEPO表示系における供因子として実質的に有
効性が少ないことも明らかである。更に表２に示すよう
に、化学的発光応答は、ホースラディシュペルオキシタ
ーゼ（HPO）系に対する過酸化水素濃度に関して二次オ
ーダーでなく、しかして計算は、標準ミカエル−メンテ
ン運動に基づいた。この結果は、更に従来に二重逆数プ
ロットが直線にあてはまりこの関係が一次であることを
示し（Dure et al.,J.Biol.Chem.Vol.239,No.7,pp.2351
等,1964を確認）、そして本明細書のハロペルオキシタ
ーゼ表示系と異なることを示す図3Cに示される。
（ｉ）MPOおよびEPO表示系に関して過酸化水素濃度の平
方に定量的に比例し、すなわち表２においてアスターリ
スク（＊）で示されたように系のその他の成分が速度制
限的でない場合化学的発光応答が過酸化水素濃度に関し
て二次オーダーにあてはまる。また表２から、クロライ
ドイオンがEPO表示系における供因子として実質的に有
効性が少ないことも明らかである。更に表２に示すよう
に、化学的発光応答は、ホースラディシュペルオキシタ
ーゼ（HPO）系に対する過酸化水素濃度に関して二次オ
ーダーでなく、しかして計算は、標準ミカエル−メンテ
ン運動に基づいた。この結果は、更に従来に二重逆数プ
ロットが直線にあてはまりこの関係が一次であることを
示し（Dure et al.,J.Biol.Chem.Vol.239,No.7,pp.2351
等,1964を確認）、そして本明細書のハロペルオキシタ
ーゼ表示系と異なることを示す図3Cに示される。
例２ クロライドの決定 クロライド濃度に対する表示系の依存およびクロライ
ド定量へのこの依存の潜在的使用を、ルミノール溶液
（50nモルルミノール）0.3ml、MPOに関して0.2ないし7.
7μモルのクロライドイオン（NaCl換算）またはEPOおよ
びHRPに関して0.1モルの般に0.2ないし100μモルのクロ
ライドイオン（NaCl換算）、MPO、EPOまたはHRP0.3mlを
含有する酢酸緩衝液、pH5.0中のハライド有するおよび
駅0.3mlを使用しそして0.16ないし6.30μモルの範囲の
量の過酸化水素を含有する標準0.3ml溶液を添加して表
示系を誘発して例１の基礎的方法に従って測定した。反
応混合物中の酢酸緩衝液の最終濃度は、50mM、pH5.0と
した。結果を下記表３に示す。
ド定量へのこの依存の潜在的使用を、ルミノール溶液
（50nモルルミノール）0.3ml、MPOに関して0.2ないし7.
7μモルのクロライドイオン（NaCl換算）またはEPOおよ
びHRPに関して0.1モルの般に0.2ないし100μモルのクロ
ライドイオン（NaCl換算）、MPO、EPOまたはHRP0.3mlを
含有する酢酸緩衝液、pH5.0中のハライド有するおよび
駅0.3mlを使用しそして0.16ないし6.30μモルの範囲の
量の過酸化水素を含有する標準0.3ml溶液を添加して表
示系を誘発して例１の基礎的方法に従って測定した。反
応混合物中の酢酸緩衝液の最終濃度は、50mM、pH5.0と
した。結果を下記表３に示す。
反応は50nモルルミノールを含有する50mM酢酸緩衝液,
pH5.0,1ml最終容量中である。Vmaxおよび速度（ｖ）
は、キロカウント／秒として表す。
pH5.0,1ml最終容量中である。Vmaxおよび速度（ｖ）
は、キロカウント／秒として表す。
表３に示した結果から、反応混合物中のクロライドの
存在が同定されそしてクロライドの量がハロペルオキシ
ターゼとしてMPOを使用して本発明の表示系を用いて測
定できるということが直ちに明らかとなる。クロライド
をハロゲン供因子として使用する場合、MPOを使用する
表示系は、EPOを使用する表示系よりもより効率的であ
る。MPOを使用する反応はクロライド濃度に関して一次
であり、そして図４に示す通り標準ミカエル−メンテン
運動に従う。EPOおよびHRPデータも図３に考慮したが、
これらのデータは、プロット範囲に入らなかった。更に
図３に示すように、MPOおよびEPOの両者は、これらの反
応条件下に反応次数−ｉの負のサインで示されるように
クロライドの存在によち実際に禁止されたらしいHRPよ
りも効率的である。
存在が同定されそしてクロライドの量がハロペルオキシ
ターゼとしてMPOを使用して本発明の表示系を用いて測
定できるということが直ちに明らかとなる。クロライド
をハロゲン供因子として使用する場合、MPOを使用する
表示系は、EPOを使用する表示系よりもより効率的であ
る。MPOを使用する反応はクロライド濃度に関して一次
であり、そして図４に示す通り標準ミカエル−メンテン
運動に従う。EPOおよびHRPデータも図３に考慮したが、
これらのデータは、プロット範囲に入らなかった。更に
図３に示すように、MPOおよびEPOの両者は、これらの反
応条件下に反応次数−ｉの負のサインで示されるように
クロライドの存在によち実際に禁止されたらしいHRPよ
りも効率的である。
例３ ブロマイドの決定 ブロマイド濃度に対する表示系の依存およびブロマイ
ド定量へのこの依存の潜在的使用を、MPOに対して0.015
ないし0.98μモルのブロマイドイオン（NaBr換算）、EP
Oに対して0.015ないし0.49μモルのブロマイドイオンお
よびHRPに対して0.015ないし1000μモルのブロマイドイ
オン酵素／ハライド溶液を例２におけるクロライドイオ
ンの代わりに使用して例２の方法に従って測定した。結
果を下記表４に示す。
ド定量へのこの依存の潜在的使用を、MPOに対して0.015
ないし0.98μモルのブロマイドイオン（NaBr換算）、EP
Oに対して0.015ないし0.49μモルのブロマイドイオンお
よびHRPに対して0.015ないし1000μモルのブロマイドイ
オン酵素／ハライド溶液を例２におけるクロライドイオ
ンの代わりに使用して例２の方法に従って測定した。結
果を下記表４に示す。
反応は50nモルルミノールを含有する50mM酢酸緩衝液,
pH5.0,1ml最終容量中である。Vmaxおよび速度（ｖ）
は、キロカウント／秒として表す。
pH5.0,1ml最終容量中である。Vmaxおよび速度（ｖ）
は、キロカウント／秒として表す。
表４に示す通り、反応混合物中のブロマイドイオンの
存在およびブロマイドの量が同定され、そしてブロマイ
ドの量が表示反応のハロペルオキシターゼ成分としてMP
OまたはEPOのいずれかを使用して直ちに測定できる。し
かしながら、例２の結果とは著しく対照的に、MPOおよ
びEPOの両者は、ハライド供因子としてブロマイドを使
用した場合に非常に効率的である。EPOがブロマイドの
存在舌でしか効率的に操作できないがハライド供因子と
してクロライドまたはブロマイドのいずれかを効率的に
利用するMPOの能力を、試験検体におけるこれらのハラ
イドの分別分析に並びにMPOまたはEPOあるいはこれらの
由来細胞（例えば、MPOに関しては好中球顆粒細胞およ
び血液単球およびEPOに関してエオシノフィル）の分別
定量に使用できる。MPO系におけるクロライド依存と同
様にして、反応は、MPOに対するおよびEPOに対するブロ
マイド濃度に関して一次である。図５は、MPO（図５中
「Ｍ％で示す）またはEPO（図５中「Ｅ」で示す）によ
るブロマイドに対して標準ミカエル−メンテン運動特性
を示したがHRP（図４のプロット範囲に入るHRPなし）に
ついては示さない。利用した反応条件下において、MPO
およびEPOの両方は、非ハロペルオキシターゼHRPより４
倍のオーダーで化学的発光活性を示す。
存在およびブロマイドの量が同定され、そしてブロマイ
ドの量が表示反応のハロペルオキシターゼ成分としてMP
OまたはEPOのいずれかを使用して直ちに測定できる。し
かしながら、例２の結果とは著しく対照的に、MPOおよ
びEPOの両者は、ハライド供因子としてブロマイドを使
用した場合に非常に効率的である。EPOがブロマイドの
存在舌でしか効率的に操作できないがハライド供因子と
してクロライドまたはブロマイドのいずれかを効率的に
利用するMPOの能力を、試験検体におけるこれらのハラ
イドの分別分析に並びにMPOまたはEPOあるいはこれらの
由来細胞（例えば、MPOに関しては好中球顆粒細胞およ
び血液単球およびEPOに関してエオシノフィル）の分別
定量に使用できる。MPO系におけるクロライド依存と同
様にして、反応は、MPOに対するおよびEPOに対するブロ
マイド濃度に関して一次である。図５は、MPO（図５中
「Ｍ％で示す）またはEPO（図５中「Ｅ」で示す）によ
るブロマイドに対して標準ミカエル−メンテン運動特性
を示したがHRP（図４のプロット範囲に入るHRPなし）に
ついては示さない。利用した反応条件下において、MPO
およびEPOの両方は、非ハロペルオキシターゼHRPより４
倍のオーダーで化学的発光活性を示す。
例４ ハロペルオキシターゼの測定 2.5μモルの過酸化水素を含有する標準過酸化水素溶
液を使用して表示系を誘発し、そして125μモルのルミ
ノールを含有するルミノール溶液0.3mlおよびハロペル
オキシターゼ溶液（0.1ml）および0.86ないし220pモル
の範囲の量のMPOおよび6.3、25または100μモルのクロ
ライド;0.024ないし220pモルの範囲の量のMPOおよび6.
3、25または100μモルのブロマイド;13.8ないし220pモ
ルの範囲の量のMPOおよびハライドなし（対照）；およ
び2.7ないし344pモルの範囲の量のCPOおよび6.3、25ま
たは100μモルのクロライドまたは6.3、25または100μ
モルのブロマイドを含有するハライド溶液を使用して例
２に従って、表示系のハロペルオキシターゼ濃度に対す
る依存およびハロペルオキシターゼ定量に対するこの依
存の使用を、ハライド供因子としてブロマイドおよびク
ロライドを効率的に利用できるハロペルオキシターゼMP
OおよびCPOに関して測定した。結果を下記表５に示す。
但し、Vmaxはキロカウント／秒として表す。
液を使用して表示系を誘発し、そして125μモルのルミ
ノールを含有するルミノール溶液0.3mlおよびハロペル
オキシターゼ溶液（0.1ml）および0.86ないし220pモル
の範囲の量のMPOおよび6.3、25または100μモルのクロ
ライド;0.024ないし220pモルの範囲の量のMPOおよび6.
3、25または100μモルのブロマイド;13.8ないし220pモ
ルの範囲の量のMPOおよびハライドなし（対照）；およ
び2.7ないし344pモルの範囲の量のCPOおよび6.3、25ま
たは100μモルのクロライドまたは6.3、25または100μ
モルのブロマイドを含有するハライド溶液を使用して例
２に従って、表示系のハロペルオキシターゼ濃度に対す
る依存およびハロペルオキシターゼ定量に対するこの依
存の使用を、ハライド供因子としてブロマイドおよびク
ロライドを効率的に利用できるハロペルオキシターゼMP
OおよびCPOに関して測定した。結果を下記表５に示す。
但し、Vmaxはキロカウント／秒として表す。
反応は50mM酢酸緩衝液,pH5.0中ミエロペルオキシター
ゼ（MPO）またはフンガルクロロペルオキシターゼ（CP
O）のいずれかを含有する,1ml最終容量中である。Vmax
および速度（ｖ）は、キロカウント/10秒として表す
（初期）。ミカエル−メンテン運動計算は、速度Ｖの平
方根に基づく。
ゼ（MPO）またはフンガルクロロペルオキシターゼ（CP
O）のいずれかを含有する,1ml最終容量中である。Vmax
および速度（ｖ）は、キロカウント/10秒として表す
（初期）。ミカエル−メンテン運動計算は、速度Ｖの平
方根に基づく。
表５に示したように、試験検体中のMPOまたはCPOの存
在または量は、本発明の表示反応の発光測定により供因
子としてブロマイドまたはクロライドのいずれかを使用
して広い範囲の酵素濃度にわたって測定できる。発光応
答は、MPOおよびCPO濃度に関して二次である。上記例記
載の条件下で、MPOはCPOより効率的であるが、上記の通
りクロライドもブロマイドも表示系に添加しないハライ
ドの不存在下でなMPOもCPOも効率的に作用しない。
在または量は、本発明の表示反応の発光測定により供因
子としてブロマイドまたはクロライドのいずれかを使用
して広い範囲の酵素濃度にわたって測定できる。発光応
答は、MPOおよびCPO濃度に関して二次である。上記例記
載の条件下で、MPOはCPOより効率的であるが、上記の通
りクロライドもブロマイドも表示系に添加しないハライ
ドの不存在下でなMPOもCPOも効率的に作用しない。
8.5ないし220pモルの範囲の量のMPOおよび6.3、25ま
たは100μモルのクロライド;0.024ないし220pモルの範
囲の量のMPOおよび6.3、25または100μモルのブロマイ
ド;13.8ないし272pモルの範囲の量のMPOおよび6.3、25
または100μモルのクロライドまたは13.8ないし272pモ
ルの範囲の量のEPOおよび6.3、25または100μモルのブ
ロマイド;4.0ないし258pモルの範囲のLPOおよび6.3、25
または100μモルのクロライド;2.0ないし258pモルの範
囲のLPOおよび6.3、25または100μモルのブロマイドを
含有するハライド溶液を使用してハロペルオキシターゼ
／ハライド溶液を使用してEPOおよびLPOに関して上記方
法を続けた。結果を表６に示す。
たは100μモルのクロライド;0.024ないし220pモルの範
囲の量のMPOおよび6.3、25または100μモルのブロマイ
ド;13.8ないし272pモルの範囲の量のMPOおよび6.3、25
または100μモルのクロライドまたは13.8ないし272pモ
ルの範囲の量のEPOおよび6.3、25または100μモルのブ
ロマイド;4.0ないし258pモルの範囲のLPOおよび6.3、25
または100μモルのクロライド;2.0ないし258pモルの範
囲のLPOおよび6.3、25または100μモルのブロマイドを
含有するハライド溶液を使用してハロペルオキシターゼ
／ハライド溶液を使用してEPOおよびLPOに関して上記方
法を続けた。結果を表６に示す。
（表注） 反応は50mMの酢酸緩衝液中にエオシノフィルペルオキ
シターゼ（EPO）又はラクトペルオキシターゼ（LPO）の
いずれかを含有する。
シターゼ（EPO）又はラクトペルオキシターゼ（LPO）の
いずれかを含有する。
反応はまずH2O22.5μモルの注入で開始した。Vmaxお
よび速度Ｖはキロカウント/10sec（初期値）として表わ
す。
よび速度Ｖはキロカウント/10sec（初期値）として表わ
す。
ミカエルメンテン運動計算は速度Ｖの平行根に基づ
く。
く。
表６はここでもEPOとLPOを共にブロマイド依存発光の
関数として定量決定されるある程度の発光活動が塩素を
共通因子として得られたものの、EPOとLPOはブロマイド
が存在した場合発光度からいって一層効果的な発光性能
を示した。
関数として定量決定されるある程度の発光活動が塩素を
共通因子として得られたものの、EPOとLPOはブロマイド
が存在した場合発光度からいって一層効果的な発光性能
を示した。
今回使用した反応条件下ではブロマイド又はクロライ
ドのいずれかを共通因子として使用した場合EPOがLPOよ
り一層効果的な発光性能を示した。
ドのいずれかを共通因子として使用した場合EPOがLPOよ
り一層効果的な発光性能を示した。
例 ５ 化学的発光基質への依存性 表示反応の基質濃度に対する依存度は下記実施例１の
基本的手順で決定した。この手順は表７に示す如く、使
用ルミノール0.0018から15.0mmolの範囲のルミノール量
を含むルミノール溶液0.3mlのハロペルオキシターゼ／
ハライド溶液で液中に10PモルのMPO,EPO又はHRPを含
み、150mモルの酢酸緩衝液又は燐酸緩衝液中にそれぞれ
100μモルのクローライド10μモルのブロマイド、又は
ハライドを含まず、2.5μモルの過酸化水素を含む過酸
化水素溶液0.3mlを添加することで発光性能を示現す
る。
基本的手順で決定した。この手順は表７に示す如く、使
用ルミノール0.0018から15.0mmolの範囲のルミノール量
を含むルミノール溶液0.3mlのハロペルオキシターゼ／
ハライド溶液で液中に10PモルのMPO,EPO又はHRPを含
み、150mモルの酢酸緩衝液又は燐酸緩衝液中にそれぞれ
100μモルのクローライド10μモルのブロマイド、又は
ハライドを含まず、2.5μモルの過酸化水素を含む過酸
化水素溶液0.3mlを添加することで発光性能を示現す
る。
この場合、最終的反応量は0.9mlであった。
さらに反応溶液のPHはいずれも最終濃度50mモルで酢
酸緩衝液PH4.9又は5.9のもの、あるいは燐酸緩衝液でPH
5.8又は7.0を実施例１のPH5.0の酢酸緩衝液の代りに使
用して変化せしめた。
酸緩衝液PH4.9又は5.9のもの、あるいは燐酸緩衝液でPH
5.8又は7.0を実施例１のPH5.0の酢酸緩衝液の代りに使
用して変化せしめた。
結果表７に示す。
反応混合物は、各々50mM酢酸（AB）または燐酸（PB）
緩衝液中100μモルのCl−,10μモルのBr−を含有しそし
てミエロペルオキシターゼ［MPO］、エシソフィルペル
オキシターゼ［EPO］およびホースラディッシュペルオ
キシターゼ［HRP］についてはハライドを含有しない。
反応は、先ず2.5μモルのH2O2の注入により開始した。
最終容量は、0.9mlとした。Vmaxおよび速度（ｖ）は、
キロカウント／秒として表す。＊は運動計算が速度の平
方根に基づいていることを示す。
緩衝液中100μモルのCl−,10μモルのBr−を含有しそし
てミエロペルオキシターゼ［MPO］、エシソフィルペル
オキシターゼ［EPO］およびホースラディッシュペルオ
キシターゼ［HRP］についてはハライドを含有しない。
反応は、先ず2.5μモルのH2O2の注入により開始した。
最終容量は、0.9mlとした。Vmaxおよび速度（ｖ）は、
キロカウント／秒として表す。＊は運動計算が速度の平
方根に基づいていることを示す。
表７に記載された通り、ルミノール濃度は、4.9ない
し7.0のpH範囲にわたったMPOおよびEPO発光表示系によ
り定量的に測定された。著しく対照的に、ルミノール
は、非−ペルオキシターゼHRPを用いてより酸性条件下
に効率的に定量されなかった。発光反応は、MPOおよびE
PO表示反応において一次であったが、HRP反応系におい
ては二次であり、表７に示すミカエル−メンテン運動デ
ータの前に示した通りDure et al,J.Biol.Chem,Vol,23
9,No.7,pp.2351等1964を確認した。図１に示した提案さ
れたハロpH1反応と一致して、これらの運動差異は、非
ハロペルオキシターゼからハロペルオキシターゼを分離
する機構相違を強調する。
し7.0のpH範囲にわたったMPOおよびEPO発光表示系によ
り定量的に測定された。著しく対照的に、ルミノール
は、非−ペルオキシターゼHRPを用いてより酸性条件下
に効率的に定量されなかった。発光反応は、MPOおよびE
PO表示反応において一次であったが、HRP反応系におい
ては二次であり、表７に示すミカエル−メンテン運動デ
ータの前に示した通りDure et al,J.Biol.Chem,Vol,23
9,No.7,pp.2351等1964を確認した。図１に示した提案さ
れたハロpH1反応と一致して、これらの運動差異は、非
ハロペルオキシターゼからハロペルオキシターゼを分離
する機構相違を強調する。
例６ pHへの依存 2.5μモルの過酸化水素を含有する標準過酸化水素溶
液を使用して表示系を誘発し、100μモルのクロライド
（NaCl換算）および表８に示した通り1.7ないし68pモル
の範囲の酵素の濃度を有する酵素／ハライド溶液を使用
し、そして50mM酢酸緩衝液,pH3.7または3.7,5.0または
5.9あるいは50mM燐酸緩衝液,pH5.8,6.9,または8.2を使
用して表示系のpHを反応および発光測定の際に表示pHで
保持して表示系の反応混合物のpHに対する依存を更に測
定した。キロカウント/10秒として測定した結果を表８
に示す。
液を使用して表示系を誘発し、100μモルのクロライド
（NaCl換算）および表８に示した通り1.7ないし68pモル
の範囲の酵素の濃度を有する酵素／ハライド溶液を使用
し、そして50mM酢酸緩衝液,pH3.7または3.7,5.0または
5.9あるいは50mM燐酸緩衝液,pH5.8,6.9,または8.2を使
用して表示系のpHを反応および発光測定の際に表示pHで
保持して表示系の反応混合物のpHに対する依存を更に測
定した。キロカウント/10秒として測定した結果を表８
に示す。
反応データは、キロカウント/10秒である。バックグ
ラウンド（暗色）カウントは、0.13キロカウント/10秒
とした。反応を2.5μモルH2O2の注入により開始した。
ラウンド（暗色）カウントは、0.13キロカウント/10秒
とした。反応を2.5μモルH2O2の注入により開始した。
上記のクロライドの代わりに2.5μモルのブロマイド
（NaBr換算）を含有する酵素／ハライド溶液を使用して
上記の操作を続けた。キロカウント/10秒として測定し
た結果を再び表９に示す。
（NaBr換算）を含有する酵素／ハライド溶液を使用して
上記の操作を続けた。キロカウント/10秒として測定し
た結果を再び表９に示す。
反応データは、キロカウント/10秒である。バックグ
ラウンド（暗色）カウントは、0.13キロカウント/10秒
とした。反応を2.5μモルH2O2の注入により開始した。
ラウンド（暗色）カウントは、0.13キロカウント/10秒
とした。反応を2.5μモルH2O2の注入により開始した。
表８および表９に示す通り、クロライドまたはブロマ
イドを持つMPOおよびブロマイドを持つEPOの両者は、試
験した酸性pH範囲においてルミノール発光を効率的に触
媒した。事実、ハロペルオキシターゼ依存発光活性が定
量され、そしてpH8.2でさえも比較的に充分に保持され
た。HRP系の感度は、pHに従って増加する。しかしなが
ら、禁止活性は、高いHRP濃度で際立っていた。ハロペ
ルオキシターゼ依存発生応答とは異なって、HRP発光
は、ハライドの存在により本質的に影響されない。非酵
素、塩基触媒された発光活性を試験した高いpHで決定す
る。かゝる活性は、HRPが最も活性な高いpH値でシグナ
ル対ノイズ比を悪く制限する。
イドを持つMPOおよびブロマイドを持つEPOの両者は、試
験した酸性pH範囲においてルミノール発光を効率的に触
媒した。事実、ハロペルオキシターゼ依存発光活性が定
量され、そしてpH8.2でさえも比較的に充分に保持され
た。HRP系の感度は、pHに従って増加する。しかしなが
ら、禁止活性は、高いHRP濃度で際立っていた。ハロペ
ルオキシターゼ依存発生応答とは異なって、HRP発光
は、ハライドの存在により本質的に影響されない。非酵
素、塩基触媒された発光活性を試験した高いpHで決定す
る。かゝる活性は、HRPが最も活性な高いpH値でシグナ
ル対ノイズ比を悪く制限する。
例７ グルコースオキシターゼ測定 カップリングされた一次反応を通した試験検体におけ
る被分析物の存在または量の測定への表示系の使用を、
以下の方法でグルコース濃度について分析することによ
って測定した。表10に示すように0.0033ないし4.44の範
囲の量のグルコースを含有する試験検体100μｌを、好
適量のグルコースを50mM酢酸緩衝液,pH5.4に溶解するこ
とによって調製した。各試験溶液溶液をルミノール（12
5μモル）水溶液300μｌに併せそしてポリエステル試験
管に配置した。各試験溶液に、2.3ないし144pモル（1p
モルは0.028単位である、但し１単位はpH5.1および35℃
で１分間当たりＤ−グルコースをＤ−グルコン酸に酸化
する）の範囲のグルコースオキシターゼ（「GOX」,Type
Xs,150,000単位/g,G−7141 Sigma Chemicals,米国，ミ
ズリー州，セントルイス）を表10に示したような量を含
有する100mM酢酸緩衝液pH5.4中のグルコオキシターゼ30
0μｌを添加した。次いで、試験検体を、発光計に直ち
に配置し、そして周囲温度で8.5ないし49.9分の規定イ
ンキュベート時間（インキュベート時間，表10）インキ
ュベートした。規定インキュベート時間の終了の際、50
mM（1ml反応混合物中の最終濃度）酢酸緩衝液pH5.4中に
30pモルのMPOおよび50μモルのクロライドイオン（NaCl
換算）を含有する溶液300μｌの添加により蛍光反応を
誘発した。結果を表10に示す。蛍光応答がグルコース濃
度に関して二次であり、従って化学的発光速度の平方根
が例１の方法を使用して各反応について、VmaxおよびKm
を測定するための計算に利用された。表10において、Vm
axは、はキロカウント／秒として表す。
る被分析物の存在または量の測定への表示系の使用を、
以下の方法でグルコース濃度について分析することによ
って測定した。表10に示すように0.0033ないし4.44の範
囲の量のグルコースを含有する試験検体100μｌを、好
適量のグルコースを50mM酢酸緩衝液,pH5.4に溶解するこ
とによって調製した。各試験溶液溶液をルミノール（12
5μモル）水溶液300μｌに併せそしてポリエステル試験
管に配置した。各試験溶液に、2.3ないし144pモル（1p
モルは0.028単位である、但し１単位はpH5.1および35℃
で１分間当たりＤ−グルコースをＤ−グルコン酸に酸化
する）の範囲のグルコースオキシターゼ（「GOX」,Type
Xs,150,000単位/g,G−7141 Sigma Chemicals,米国，ミ
ズリー州，セントルイス）を表10に示したような量を含
有する100mM酢酸緩衝液pH5.4中のグルコオキシターゼ30
0μｌを添加した。次いで、試験検体を、発光計に直ち
に配置し、そして周囲温度で8.5ないし49.9分の規定イ
ンキュベート時間（インキュベート時間，表10）インキ
ュベートした。規定インキュベート時間の終了の際、50
mM（1ml反応混合物中の最終濃度）酢酸緩衝液pH5.4中に
30pモルのMPOおよび50μモルのクロライドイオン（NaCl
換算）を含有する溶液300μｌの添加により蛍光反応を
誘発した。結果を表10に示す。蛍光応答がグルコース濃
度に関して二次であり、従って化学的発光速度の平方根
が例１の方法を使用して各反応について、VmaxおよびKm
を測定するための計算に利用された。表10において、Vm
axは、はキロカウント／秒として表す。
検体を規定時間酢酸緩衝液pH5.4中でGOXでインキュベ
ートした。反応を30pモルMPO＋50μモルCl−,1ml最終濃
度の注入により開始した。温度は22℃とした。Vmaxおよ
び速度（ｖ）は、キロカウント/10秒（初期）として表
す。ミカエル−メンテン運動計算は、速度Ｖの平方根に
基づいている。
ートした。反応を30pモルMPO＋50μモルCl−,1ml最終濃
度の注入により開始した。温度は22℃とした。Vmaxおよ
び速度（ｖ）は、キロカウント/10秒（初期）として表
す。ミカエル−メンテン運動計算は、速度Ｖの平方根に
基づいている。
表10に記載されたように、本発明の表示系は、幅広い
範囲のグルコースおよびグルコースオキシターゼ濃度に
わたって試験検体中のグルコース濃度を測定する高感度
の手段を提供する。グルコースのグルコースオキシター
ゼ触媒酸化が消費された各分子当たり過酸化水素１分子
の製造をもたらし、そして先に記載した通りに表示系に
おける発光の製造が過酸化水素濃度の平方に比例するの
で、測定された発光は、このカップリングした反応系を
使用して試験検体中のグルコースの濃度の平方に比例す
る（すなわち、発光反応はグルコース濃度に関して二次
である）。この結果は、表10に示された結果により確認
される。
範囲のグルコースおよびグルコースオキシターゼ濃度に
わたって試験検体中のグルコース濃度を測定する高感度
の手段を提供する。グルコースのグルコースオキシター
ゼ触媒酸化が消費された各分子当たり過酸化水素１分子
の製造をもたらし、そして先に記載した通りに表示系に
おける発光の製造が過酸化水素濃度の平方に比例するの
で、測定された発光は、このカップリングした反応系を
使用して試験検体中のグルコースの濃度の平方に比例す
る（すなわち、発光反応はグルコース濃度に関して二次
である）。この結果は、表10に示された結果により確認
される。
１モルのグルコースの酸素が１モルの酸素を消費する
ので、上記グルコース／グルコースオキシターゼカップ
リングされた反応またはその他のオキシターゼ反応は、
既知の非速度制限量のオキシターゼおよび基質（例えば
グルコース）を提供し、従ってカップリングされた反応
系に可変の未知量として酸素を放出することによって試
験検体中の酸素に関する高感度の検定としてハロペルオ
キシターゼ／ハライド発光表示系により使用できる。
ので、上記グルコース／グルコースオキシターゼカップ
リングされた反応またはその他のオキシターゼ反応は、
既知の非速度制限量のオキシターゼおよび基質（例えば
グルコース）を提供し、従ってカップリングされた反応
系に可変の未知量として酸素を放出することによって試
験検体中の酸素に関する高感度の検定としてハロペルオ
キシターゼ／ハライド発光表示系により使用できる。
77pモルのグルコースオキシターゼを含有するグルコ
ースオキシターゼ溶液および0.016ないし3.33μモルの
グルコース（表11に記載）を含有するグルコース検体溶
液および1.9ないし60μモルのMPO（両者とも表11に記
載）および1.6ないし50μモルのクロライドを含有するM
PO/クロライド溶液を使用して上記操作を続けた。結果
は表11に記載する。但し、Vmaxは、はキロカウント／秒
として表す。
ースオキシターゼ溶液および0.016ないし3.33μモルの
グルコース（表11に記載）を含有するグルコース検体溶
液および1.9ないし60μモルのMPO（両者とも表11に記
載）および1.6ないし50μモルのクロライドを含有するM
PO/クロライド溶液を使用して上記操作を続けた。結果
は表11に記載する。但し、Vmaxは、はキロカウント／秒
として表す。
表示量のMPOおよびCl−を射出し、続いて125モルのル
ミノール、を含有する50mM酢酸緩衝液pH5.4 1ml最終容
量中の77pモルGOXで以下の検体をインキュベートした。
温度は22℃とした。Vmaxおよび速度（ｖ）は、キロカウ
ント/10秒（初期）として表す。ミカエル−メンテン運
動計算は、速度Ｖの平方根に基づいている。
ミノール、を含有する50mM酢酸緩衝液pH5.4 1ml最終容
量中の77pモルGOXで以下の検体をインキュベートした。
温度は22℃とした。Vmaxおよび速度（ｖ）は、キロカウ
ント/10秒（初期）として表す。ミカエル−メンテン運
動計算は、速度Ｖの平方根に基づいている。
表11の結果は、表示系が幅広い範囲のMPOおよびクロ
ライド濃度に渡ってグルコース濃度のカップリングした
測定に関して高い程度の安定性を示すことを表す。
ライド濃度に渡ってグルコース濃度のカップリングした
測定に関して高い程度の安定性を示すことを表す。
例８ サルモネラに関する固形免疫検定 ラビット抗サルモネラ抗血清のγ−グロブリンフラクシ
ョンの調製 バクトサルモネラＯ抗血清（ポリＡ−ＩおよびVi）お
よびバクトサルモネラＨ抗血清（ポリａ−ｚ）（Drfco
Laboratories米国、ミシガン州，デトロイト）のγ−グ
ロブリンフラクションをMethod in Immunology,A Labor
atory Text for Instruction and Research,第３版,J.
S.Garvey,N.E.CremerおよびD.H.Sussdorf,pp.218−219,
1977,W.A.Benjamin,Ino,米国，マサツセチュー州，リー
ディング）に記載の通りにアンモニウムサルファイド沈
降により調製した。ＯとＨ抗血清との比率は３対１と
し、そして得られた溶液の全グロブリンタンパク質濃度
は30mg/mlであった。
ョンの調製 バクトサルモネラＯ抗血清（ポリＡ−ＩおよびVi）お
よびバクトサルモネラＨ抗血清（ポリａ−ｚ）（Drfco
Laboratories米国、ミシガン州，デトロイト）のγ−グ
ロブリンフラクションをMethod in Immunology,A Labor
atory Text for Instruction and Research,第３版,J.
S.Garvey,N.E.CremerおよびD.H.Sussdorf,pp.218−219,
1977,W.A.Benjamin,Ino,米国，マサツセチュー州，リー
ディング）に記載の通りにアンモニウムサルファイド沈
降により調製した。ＯとＨ抗血清との比率は３対１と
し、そして得られた溶液の全グロブリンタンパク質濃度
は30mg/mlであった。
抗サルモネラ抗体と磁性粒子とのカップリング サルモネラＯおよびＨ抗血清のグロブリンフラクショ
ンを、J.L.GuesdonおよびS.A.ramea（Immunochemistry,
Vol.14,pp.443−437,1971）のグルタールアルデヒド法
により磁性粒子とカップリングした。２種類の源の磁性
粒子を試験した。すなわち、１）。0.5〜1.5ミクロンサ
イズ範囲のBio−Mag 4100末端アミノ磁性粒子,50mg/ml
懸濁液（Advanced Magnetics,米国，マサツセッチュー
州，ケンブリッジ、ムーニー61）および２）40〜80ミク
ロンサイズ範囲のMagnogel ACA 44磁性粒子,100mg/ml懸
濁液（IBF Biotecxhnics,フランス，ビレニュー ラ
ガーレン）である。
ンを、J.L.GuesdonおよびS.A.ramea（Immunochemistry,
Vol.14,pp.443−437,1971）のグルタールアルデヒド法
により磁性粒子とカップリングした。２種類の源の磁性
粒子を試験した。すなわち、１）。0.5〜1.5ミクロンサ
イズ範囲のBio−Mag 4100末端アミノ磁性粒子,50mg/ml
懸濁液（Advanced Magnetics,米国，マサツセッチュー
州，ケンブリッジ、ムーニー61）および２）40〜80ミク
ロンサイズ範囲のMagnogel ACA 44磁性粒子,100mg/ml懸
濁液（IBF Biotecxhnics,フランス，ビレニュー ラ
ガーレン）である。
抗サルモネラ抗体のビオチン化 サルモネラ共通構造抗原CSA−１に特異性のある親和
生成抗体2.0mg（Kirkegard and Perry Laboratories,米
国，メリーランド州，ゲイサーブルグ）に、0.1M重炭酸
ナトリウム緩衝液pH8.3 1.0mlに溶解した。この抗体溶
液を、ジメチルホルムアルデヒド（DMF）100μｌ中のビ
オチン−アミノカプロエートＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル（BAC−NHS,Sigma Chemicals）0.5mgを添
加し、そしてこの混合物を室温で１時間放置した。この
混合物を２回緩衝液を変えて一晩0.05M燐酸緩衝生理食
塩水,pH7.2に対して透析し、次いで４℃で更に使用する
まで保存した。上記の通りにして調製した精製ラビット
抗サルモネラγ−グロブリンを使用して上記方法を繰り
返した。
生成抗体2.0mg（Kirkegard and Perry Laboratories,米
国，メリーランド州，ゲイサーブルグ）に、0.1M重炭酸
ナトリウム緩衝液pH8.3 1.0mlに溶解した。この抗体溶
液を、ジメチルホルムアルデヒド（DMF）100μｌ中のビ
オチン−アミノカプロエートＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル（BAC−NHS,Sigma Chemicals）0.5mgを添
加し、そしてこの混合物を室温で１時間放置した。この
混合物を２回緩衝液を変えて一晩0.05M燐酸緩衝生理食
塩水,pH7.2に対して透析し、次いで４℃で更に使用する
まで保存した。上記の通りにして調製した精製ラビット
抗サルモネラγ−グロブリンを使用して上記方法を繰り
返した。
バクテリオファージのビオチン化 ml当たり約1011ないし1012プラーク形成単位（pfu）
を含有するバクテリオファージΦ27869−β１（America
n Type Culture Collection,米国，メリーランド州，ロ
ックビレ）10mlを２回緩衝液を変えて４℃で16時間0.05
M燐酸緩衝生理食塩水,pH8.3に対して透析した。透析物
質にDMF 400μｌ中のBAC−NHS 75mgを添加し、そしてこ
の混合物を傾斜台上で15分間室温で攪拌した。次いで、
懸濁液を5mM MgSO4および80mM NaClを含有する0.05M燐
酸緩衝生理食塩水,pH6.8で20mlとし、そして16時間３回
緩衝液を変えて燐酸緩衝液に対して透析した。透析物質
を４℃で更に使用するまで保存した。
を含有するバクテリオファージΦ27869−β１（America
n Type Culture Collection,米国，メリーランド州，ロ
ックビレ）10mlを２回緩衝液を変えて４℃で16時間0.05
M燐酸緩衝生理食塩水,pH8.3に対して透析した。透析物
質にDMF 400μｌ中のBAC−NHS 75mgを添加し、そしてこ
の混合物を傾斜台上で15分間室温で攪拌した。次いで、
懸濁液を5mM MgSO4および80mM NaClを含有する0.05M燐
酸緩衝生理食塩水,pH6.8で20mlとし、そして16時間３回
緩衝液を変えて燐酸緩衝液に対して透析した。透析物質
を４℃で更に使用するまで保存した。
アビジン化グルコースオキシターゼの調製 親和精製アビジン（Sigma Chemicals,No.A−9275）10
mgを0.1M燐酸緩衝液,pH6.8 0.5mlに溶解し、290mOsmにN
aClで調節し、次いで二回緩衝液を変えて４℃で18時間
0.15M NaClに対して透析した。透析溶液1.0mlに0.15M N
aClに溶解したグコースオキシターゼ25mgおよび1.0M炭
酸−重炭酸緩衝液,pH9.5を添加した。この混合物を室温
で２時間、次いで４℃で一晩反応させた。
mgを0.1M燐酸緩衝液,pH6.8 0.5mlに溶解し、290mOsmにN
aClで調節し、次いで二回緩衝液を変えて４℃で18時間
0.15M NaClに対して透析した。透析溶液1.0mlに0.15M N
aClに溶解したグコースオキシターゼ25mgおよび1.0M炭
酸−重炭酸緩衝液,pH9.5を添加した。この混合物を室温
で２時間、次いで４℃で一晩反応させた。
検定プロトコール 表示した（表13）のコロニー形成単位（CFU）のSalmo
nella thphiurium ATCC No.14028（American Type Cult
ure Collection,米国，メリーランド州，ロックビレ）
を含有する溶液1.0mlを上記の通りにして調製した抗サ
ルモネラγ−グロブリンフラクション被覆Bio−Mag粒子
の種々の希釈により30分間インキュベートした。インキ
ュベーション懸濁液を磁性分離機上に配置して粒子を分
離し、そして粒子を２度0.1M燐酸緩衝液pH7.3で洗浄し
て非結合バクテリアを除去した。次いで粒子を少しの
（約200ないし500μｌ）容量の洗浄溶液に再懸濁し、次
いで1:200希釈度のストックビオチン化抗サルモネラγ
−グロブリンフラクションで35℃で30分間インキュベー
トした。ビーズを上記のとおりにして再び溶液から分離
し、そして二度洗浄した。1:25希釈度の上記アビジン化
グルコースオキシターゼ500μｌを粒子に添加し、そし
て混合物を30分間35℃でインキュベートした。ビーズを
上記のとおりにして再び溶液から分離し、そして三度洗
浄し、次いで3.3μモルのＤ−グルコースおよび3.0nモ
ルのルミノールを含有する0.1M燐酸緩衝液600μｌに再
懸濁した。次いで粒子を発光計（Berthold model 952）
に配置し、そして暗所で30分間室温でインキュベートし
た。MPO（約10pモル）およびEPO（約10mモル）およびブ
ロマイド（15μモル,NaBr換算）を含有する溶液300μｌ
をこの懸濁液に添加し、そしてVCLを20秒間測定した。
結果を表12に示す。
nella thphiurium ATCC No.14028（American Type Cult
ure Collection,米国，メリーランド州，ロックビレ）
を含有する溶液1.0mlを上記の通りにして調製した抗サ
ルモネラγ−グロブリンフラクション被覆Bio−Mag粒子
の種々の希釈により30分間インキュベートした。インキ
ュベーション懸濁液を磁性分離機上に配置して粒子を分
離し、そして粒子を２度0.1M燐酸緩衝液pH7.3で洗浄し
て非結合バクテリアを除去した。次いで粒子を少しの
（約200ないし500μｌ）容量の洗浄溶液に再懸濁し、次
いで1:200希釈度のストックビオチン化抗サルモネラγ
−グロブリンフラクションで35℃で30分間インキュベー
トした。ビーズを上記のとおりにして再び溶液から分離
し、そして二度洗浄した。1:25希釈度の上記アビジン化
グルコースオキシターゼ500μｌを粒子に添加し、そし
て混合物を30分間35℃でインキュベートした。ビーズを
上記のとおりにして再び溶液から分離し、そして三度洗
浄し、次いで3.3μモルのＤ−グルコースおよび3.0nモ
ルのルミノールを含有する0.1M燐酸緩衝液600μｌに再
懸濁した。次いで粒子を発光計（Berthold model 952）
に配置し、そして暗所で30分間室温でインキュベートし
た。MPO（約10pモル）およびEPO（約10mモル）およびブ
ロマイド（15μモル,NaBr換算）を含有する溶液300μｌ
をこの懸濁液に添加し、そしてVCLを20秒間測定した。
結果を表12に示す。
1:2000希釈度の上記の通りにして調製されそして抗サ
ルモネラ抗体で被覆されたあるいは未被覆対照のストッ
クMagnogel ACA 44粒子を使用し、を使用し、105 CFUの
S.チフィムリンを含有するおよびなにも含有しない（対
照として）およびビオチン化サルモネラ結合種として1:
100または1:1000希釈度のエーテルビオチン化親和精製
抗サルモネラ血清、ビオチン化抗サルモネラγ−グロブ
リンフラクションまたはビオチン化バクテリオファージ
Φ27869−S1を含有する試験検体を使用し、上記の操作
を続けた。キロカウント/10秒（初期）として測定した
結果を表13に示す。
ルモネラ抗体で被覆されたあるいは未被覆対照のストッ
クMagnogel ACA 44粒子を使用し、を使用し、105 CFUの
S.チフィムリンを含有するおよびなにも含有しない（対
照として）およびビオチン化サルモネラ結合種として1:
100または1:1000希釈度のエーテルビオチン化親和精製
抗サルモネラ血清、ビオチン化抗サルモネラγ−グロブ
リンフラクションまたはビオチン化バクテリオファージ
Φ27869−S1を含有する試験検体を使用し、上記の操作
を続けた。キロカウント/10秒（初期）として測定した
結果を表13に示す。
表12および13の実験データは、バクテリア決定する方
法としてリガンド−（抗サルモネラ）特異性抗体と組み
合わせた表示系の感度を表す。ハロペルオキシターゼ／
ハライド発光表示系は、本質的にリガンド／リガンドバ
インダー検定に適合する。表13において、サルモネラ決
定は、抗体−またはバクテリオファージ−特異性機構を
介している。ビオチン化リガンドバインダーをビオチン
を介してグルコースオキシターゼに結合する。非速度制
限濃度のグルコースでのインキュベーションは、グルコ
ースオキシターゼ濃度に比例して、従った検体に存在す
るサルモネラに比例して過酸化水素を発生する。ハロペ
ルオキシターゼ／ハライド表示系を一定にかつ非速度制
限的に保持しそして決定した発光は、上記結合リガンド
−酵素関係に比例する。
法としてリガンド−（抗サルモネラ）特異性抗体と組み
合わせた表示系の感度を表す。ハロペルオキシターゼ／
ハライド発光表示系は、本質的にリガンド／リガンドバ
インダー検定に適合する。表13において、サルモネラ決
定は、抗体−またはバクテリオファージ−特異性機構を
介している。ビオチン化リガンドバインダーをビオチン
を介してグルコースオキシターゼに結合する。非速度制
限濃度のグルコースでのインキュベーションは、グルコ
ースオキシターゼ濃度に比例して、従った検体に存在す
るサルモネラに比例して過酸化水素を発生する。ハロペ
ルオキシターゼ／ハライド表示系を一定にかつ非速度制
限的に保持しそして決定した発光は、上記結合リガンド
−酵素関係に比例する。
本発明の表示系の種々の変更および適用が上記から当
業者から明らかである。かゝる変更および用途は、従来
技術により予め排除されない限り添付の請求範囲の範囲
内に入ることを意図する。
業者から明らかである。かゝる変更および用途は、従来
技術により予め排除されない限り添付の請求範囲の範囲
内に入ることを意図する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−200167（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（1975）Ｖｏｌ. 63，Ｎｏ．３，ｐ．684−691 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (32)
- 【請求項１】（１）過酸化物、（２）ハライド、（３）
ハロペルオキシターゼ酵素、（４）該酵素用の化学的発
光基質、および（５）１種類またはそれ以上の予備反応
で該過酸化物、ハライド、ハロペルオキシターゼ酵素ま
たは該酵素の化学的発光基質の１つを製造できる物質か
らなる群から選択された被分析物の存在または量を、未
知量の該被分析物を含有する疑いのある検体において測
定する方法であって、以下： a.該検体が該被分析物として（１）〜（４）の１つを含
有すると疑われる場合、該検体を、既知の非速度制限量
の該被分析物以外の該群の各要因を含む検定溶液に接触
させる工程、または 該検体が該被分析物として（５）を含有し、そして
（５）が１種類またはそれ以上の予備反応で該過酸化
物、ハライド、ハロペルオキシターゼ酵素または該酵素
の化学的発光基質の１つを製造できる物質であることが
疑われる場合、該検体を、既知の非速度制限量の（１）
〜（４）の各々を含む検定溶液に接触させる工程であっ
て、ただし該被分析物によって製造される（１）〜
（４）いずれかの濃度はゼロであり得る、工程、 b.該検定溶液をpHを８未満に保持する工程、 c.該検定溶液により放出された光の、少なくとも１種類
の特性を測定する工程、および d.該測定した光の特性を、該検体における該被分析物の
存在または量の尺度として、既知量の該被分析物を含有
する標準溶液のものと比較する工程 を含む、方法。 - 【請求項２】（１）過酸化物、（２）ハライド、（３）
ハロペルオキシターゼ酵素、（４）該酵素用の化学的発
光基質、および（５）１種類またはそれ以上の予備反応
で該過酸化物、ハライド、ハロペルオキシターゼ酵素ま
たは該酵素の化学的発光基質の１つを消費できる物質か
らなる群から選択された被分析物の存在または量を、未
知量の該被分析物を含有する疑いのある検体において測
定する方法であって、以下： a.該検体が該被分析物として（１）〜（４）の１つを含
有すると疑われる場合、該検体を、既知の非速度制限量
の該被分析物以外の該群の各要因を含む検定溶液に接触
させる工程、または 該検体が該被分析物として（５）を含有し、そして
（５）が１種類またはそれ以上の予備反応で該過酸化
物、ハライド、ハロペルオキシターゼ酵素または該酵素
の化学的発光基質の１つを消費できる物質であることが
疑われる場合、該検体を、既知の非速度制限量の（１）
〜（４）の各々を含む検定溶液に接触させる工程であっ
て、ただし該被分析物によって消費される（１）〜
（４）いずれかの濃度は既知の速度制限量であり得る、
工程 b.該検定溶液のpHを８未満に保持する工程、 c.該検定溶液により放出された光の、少なくとも１種類
の特性を測定する工程、および d.該測定した光の特性を、該検体における該被分析物の
存在または量の尺度として、既知量の該被分析物を含有
する標準溶液のものと比較する工程 を含む、方法。 - 【請求項３】前記検定溶液が均一検定溶液である、請求
の範囲第１項または第２項記載の方法。 - 【請求項４】前記検定溶液が、不溶性の相、該不溶性の
相上に固定され、そして前記被分析物に対する結合特異
性を有する第１の特異結合物質、および前記ハロペルオ
キシターゼにまたは過酸化物を発生できるオキシターゼ
にあるいは前記化学的発光性基質のいずれかに接合した
第２の特異結合物質を更に含む非均質検定溶液であり、
ここで、該第２の特異結合物質が該被分析物に対する結
合特異性を有する、請求の範囲第１項または第２項記載
の方法。 - 【請求項５】更に、前記固定された第１の特異結合物質
を、前記検体と、そして前記第２の特異結合物質と接触
させる工程、前記可溶性の相を前記不溶性の相から分離
する工程、および該可溶性または該不溶性の相における
光の特性を測定する工程を含む、請求の範囲第４項記載
の方法。 - 【請求項６】更に、前記放出された光の特性を測定する
工程に先立って、前記検定溶液のpHを３から８の範囲の
pHに調整する工程を含む、請求の範囲第１項から第５項
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】前記被分析物が、過酸化物かあるいは１種
類またはそれ以上の予備反応で過酸化物を製造または消
費できる被分析物である、請求の範囲第１項から第６項
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】前記過酸化物が、１種類またはそれ以上の
予備反応で前記検体中で製造され、該予備反応におい
て、該過酸化物が反応生成物であり、前記被分析物が反
応体である、請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】前記過酸化物が、１種類またはそれ以上の
予備反応で前記検体中で消費され、該予備反応におい
て、該過酸化物および前記被分析物が反応体である、請
求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項１０】前記被分析物が、ハライドかあるいは１
種類またはそれ以上の予備反応でハライドを製造または
消費できる被分析物である、請求の範囲第１項から第６
項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】前記被分析物がハロペルオキシターゼで
ある、請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１２】前記過酸化物が過酸化水素である、請求
の範囲第１項から第11項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】前記ハロペルオキシターゼが、ミエロペ
ルオキシターゼ（MPO）、エオシノフィルペルオキシタ
ーゼ（EPO）、ラクトペルオキシターゼ（LPO）またはク
ロロペルオキシターゼ（CPO）である、請求の範囲第１
項から第12項のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項１４】前記ハロペルオキシターゼがMPOまたはC
POであり、そして前記ハライドがブロマイドまたはクロ
ライドである、請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】前記検体が液状検体であり、該検体中の
MPOの量が該検体中のポリモルフォヌクレアー白血球ま
たは血液単球の量の尺度として測定される、請求の範囲
第14項記載の方法。 - 【請求項１６】前記ハロペルオキシターゼがEPOまたはL
POであり、そして前記ハライドがブロマイドである、請
求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１７】前記検体が液状検体であり、該検体中の
EPOの量が該検体中のエオシノフィルの量の尺度として
測定される、請求の範囲第16項記載の方法。 - 【請求項１８】前記ハライドがブロマイドまたはクロラ
イドである、請求の範囲第１項から第17項のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項１９】前記被分析物がクロライドであり、そし
て更に、（前記検定系により放出された光のMPO−また
はCPO−依存特性）−（該検定系により放出された光のE
PO−またはLPO−依存特性）を、前記検体におけるクロ
ライドの存在または量の尺度として測定する工程を含
む、請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項２０】前記被分析物がブロマイドであり、そし
て更に、（前記検定系により放出された光のEPO−また
はLPO−依存特性）÷（該検定系により放出された光のM
PO−またはCPO−依存特性）を、前記検体におけるブロ
マイドの存在または量の尺度として測定する工程を含
む、請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項２１】前記化学的発光性基質が、環式ヒドラジ
ドか、あるいはシングレット多重酸素と反応してジオキ
セタンまたはジオキセタノンを製造することができるジ
オキセタン先駆体である、請求の範囲第１項から第20項
のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項２２】前記環式ヒドラジドが2,3−ジヒドロ−
1,4−フタラジンジオンである、請求の範囲第21項記載
の方法。 - 【請求項２３】以下の、すなわち、 ａ）ハロペルオキシターゼ； ｂ）過酸化物； ｃ）ハライド；および ｄ）化学的発光性基質 のうち少なくとも３種類、ならびに検定のpHを３ないし
８の範囲内に保持するための緩衝溶液を含む、化学発光
または化学発光測定検定に使用するためのキット。 - 【請求項２４】前記過酸化物が過酸化水素である、請求
の範囲第23項記載のキット。 - 【請求項２５】前記ハロペルオキシターゼが、ミエロペ
ルオキシターゼ（MPO）、エオシノフィルペルオキシタ
ーゼ（EPO）、ラクトペルオキシターゼ（LPO）またはク
ロロペルオキシターゼ（CPO）である、請求の範囲第23
項または第24項記載のキット。 - 【請求項２６】前記ハロペルオキシターゼがMPOまたはC
POであり、そして前記ハライドがブロマイドまたはクロ
ライドである、請求の範囲第25項記載のキット。 - 【請求項２７】前記検体が液状検体であり、該検体中の
MPOの量が該検体中のポリモルフォヌクレアー白血球ま
たは血液単球の量の尺度として測定される、請求の範囲
第26項記載のキット。 - 【請求項２８】前記ハロペルオキシターゼがEPOまたはL
POであり、そして前記ハライドがブロマイドである、請
求の範囲第25項記載のキット。 - 【請求項２９】前記検体が液状検体であり、該検体中の
EPOの量が該検体中のエオシノフィルの量の尺度として
測定される、請求の範囲第28項記載のキット。 - 【請求項３０】前記ハライドがブロマイドまたはクロラ
イドである、請求の範囲第23項から第29項のいずれかに
記載のキット。 - 【請求項３１】前記化学発光性基質が、環式ヒドラジド
か、あるいはシングレット多重酸素と反応してジオキセ
タンまたはジオキセタノンを製造することができるジオ
キセタン先駆体である、請求の範囲第23項から第30項の
いずれか１つに記載のキット。 - 【請求項３２】以下の試薬、すなわち、 ａ）ハロペルオキシターゼ； ｂ）過酸化物； ｃ）ハライド；または ｄ）化学的発光性基質； あるいはこれらのうちの１つを製造することができる試
薬のうち３種類を、第４番目の試薬の検出用検定溶液の
製造に使用する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41727689A | 1989-10-05 | 1989-10-05 | |
| US417,276 | 1989-10-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05500902A JPH05500902A (ja) | 1993-02-25 |
| JP3184894B2 true JP3184894B2 (ja) | 2001-07-09 |
Family
ID=23653296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51453490A Expired - Fee Related JP3184894B2 (ja) | 1989-10-05 | 1990-10-01 | ハロペルオキシターゼ酸至適化学的発光分析系 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5556758A (ja) |
| EP (1) | EP0421788B1 (ja) |
| JP (1) | JP3184894B2 (ja) |
| AT (1) | ATE143055T1 (ja) |
| AU (1) | AU6602890A (ja) |
| CA (1) | CA2026809C (ja) |
| DE (1) | DE69028591T2 (ja) |
| IE (1) | IE903535A1 (ja) |
| IL (1) | IL95900A (ja) |
| WO (1) | WO1991005063A1 (ja) |
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