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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von
Bindungstests, insbesondere derjenigen Tests, die die Anwesenheit
eines interessierenden Analyten über
die Messung von Lumineszenz bestimmen, die von einem oder mehreren
markierten Komponenten im Testsystem emittiert wird. Genauer betrifft
die Erfindung präzise,
reproduzierbare, akurate, homogene oder heterogene spezifische Bindungstests
mit verbesserter Sensitivität
oder Empfindlichkeit, bei denen die Lumineszenzkomponente in der Testzusammensetzung
konzentriert ist und auf dem Detektionssystem gesammelt wird, bevor
die Elektrochemolumineszenz ausgelöst wird.
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Hintergrund
der Erfindung
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Zahlreiche
Verfahren und Systeme sind zum Nachweis und zur Quantifizierung
von interessierenden Analyten in biochemischen und biologischen
Substanzen entwickelt worden. Verfahren und Systeme, die Spurenmengen
von Mikroorganismen, Pharmazeutika, Hormonen, Viren, Antikörpern, Nukleinsäuren und
anderen Proteinen messen können,
sind von großem
Wert für
Forscher und Kliniker.
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Ein
sehr beträchtlicher
Stand der Technik wurde entwickelt, beruhend auf den wohlbekannten
Bindungsreaktionen, beispielsweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken
und von Protein-Liganden-Systemen. Das hohe Maß an Spezifität in vielen
biochemischen und biologischen Bindungssystemen hat zu vielen Testverfahren
und Systemen geführt,
die in der Forschung und der Diagnose von Wert sind. Typischerweise
wird das Vorhandensein eines interessierenden Analyten durch die
Anwesenheit oder Abwesenheit eines beobachtbaren "Markers" angezeigt, der an
eine oder mehrere der Bindungsmaterialien angeheftet ist. Von besonderem
Interesse sind Marker, die über
fotochemische, chemische und elektrochemische Hilfsmittel zum Lumineszieren
gebracht werden können. "Fotolumineszenz" ist der Vorgang,
bei dem in einem Material Lumineszenz induziert wird, wenn es elektromagnetische
Strahlung absorbiert. Die Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Typen
der Fotolumineszenz. "Chemolumineszenz"-Prozesse machen
die Erzeugung von lumineszenten Spezies durch chemischen Energietransfer
notwendig. Die "Elektrochemolumineszenz" erfordert die elektrochemische
Erzugung lumineszenter Spezies.
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Es
sind Chemolumineszenz-Testverfahren entwickelt worden, bei denen
eine einen interessierenden Analyten enthaltende Probe mit einem
Reagenz gemischt wird, das mit einem chemolumineszenten Marker markiert
ist. Das reaktive Gemisch wird inkubiert und ein Teil des markierten
Reagenz' bindet
an den Analyten. Nach dem Inkubieren werden die gebundenen und nicht
gebundenen Fraktionen der Mischung getrennt und kann die Konzentration
des Markers in einer oder beiden Fraktionen über Chemolumineszenztechniken
bestimmt werden. Die Menge der in einem oder beiden Fraktionen bestimmten
Chemolumineszenz indiziert die Menge an interessierenden Analyten
in der biologischen Probe.
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Elektrochemolumineszenz-Testverfahren
(ECL-Testverfahren) stellen eine Verbesserung der Chemolumineszenzverfahren
dar. Sie bieten eine empfindliche und genaue Messung der Anwesenheit
und Konzentration eines interessierenden Analyten. Bei diesem Verfahren
wird die inkubierte Probe einer voltametrischen Arbeitselektrode
zum Triggern der Lumineszenz ausgesetzt. In einer geeigneten chemischen
Umgebung wird eine solche Elektrochemolumineszenz durch eine Spannung
getriggert, die zu einer vorgegebenen Zeit und in spezieller Weise
auf die Arbeitselektrode aufgebracht wird. Das vom Marker produzierte
Licht wird gemessen und zeigt die Anwesenheit oder Menge des Analyten
an. Für
eine genauere Beschreibung solcher ECL-Techniken wird auf die veröffentlichte
PCT-Anmeldung WO 86/02734, die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 87/06706
und die veröffentlichte
PCT-Anmeldung WO 89/4302 verwiesen.
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Es
ist wünschenswert,
Elektrochemolumineszenztests auszuführen, ohne daß die Notwendigkeit
eines Trennschritts während
des Testverfahrens besteht, und die Signalmodulation bei verschiedenen
Konzentrationen an Analyten so zu maximieren, daß eine präzise und empfindliche Messung
ausgeführt
werden kann. Unter den Verfahren des Standes der Technik für nichttrennende
Tests finden sich diejenigen, die in der Testprobe suspendiertes,
mikroteilchenförmiges
Material verwenden, um eine oder mehrere der Bindungskomponenten
des Tests zu binden.
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Die
US-A-4,305,925 betrifft den Nachweis und die Bestimmung von klinisch
relevanten Proteinen und Peptiden mittels nephelometrischer und
turbidimetrischer Verfahren. Die offenbarten Verfahren involvieren
die Bindung des Antigens oder Antikörpers an Latexteilchen, die
die Funktion der Lichtstreuung oder Adsorption haben.
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Die
US-A-4,480,042 betrifft Verfahren, welche Teilchenreagenzien verwenden,
die aus Teilchen mit Hülle
und Kern bestehen. Die Hülle
enthält
funktionale Gruppen, an die Verbindungen von biologischem Interesse
kovalent gebunden werden können;
und der hohe Brechungsindex des Kerns führt zu hoher Sensitivität bei Lichtstreuungsmessungen.
Das Verfahren beruht auf Agglutinationsreaktionen, die aus der Reaktion
zweiwertiger oder bivalenter Antikörper mit mehrwertigen oder
multivalenten interessierenden Antigenen resultieren, um Aggregate
zu erzeugen, die auf verschiedenen Wegen detektiert und/oder gemessen
werden können.
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Die
US-A-4,419,453 betrifft gleichermaßen die Verwendung von Agglutinationstestverfahren
mit gefärbtem
Latex, die für
den Nachweis der Anwesenheit von immunchemischen Stoffen wie Antikörpern und
Immunogenen geeignet sind.
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Ausgehend
von diesem Stand der Technik schien es nicht möglich zu sein, ein mikroteilchenförmiges Material
in Tests zu verwenden, in denen ein Lumineszenzphänomen gemessen
wird. Man würde
erwarten, daß die
Lumineszenz aus freien chemolumineszenten oder elektrochemolumineszenten
Gruppen absorbiert, gestreut oder andere Interferenzwirkungen aus
dem mikroteilchenförmigen
Material erleiden würde.
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Im
Gegensatz zu dieser Erwartung lehrt die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO
90/05301 empfindliche, spezifische Bindungstestverfahren auf Basis
eines Lumineszenzphänomens,
bei dem ein inertes mikroteilchenförmiges Material spezifisch
an eines der Bindungsreagenzien des Testsystems gebunden wird. Der Test
kann in einem heterogenen Testformat (ein oder mehrere Trennschritte)
durchgeführt
werden und kann sehr vorteilhaft in einem homogenen Testformat (ohne
Trennung) eingesetzt werden.
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Die
WO 90/05301 betrifft eine Zusammensetzung für einen Test auf Basis einer
Bindungsreaktion zur Messung von Lumineszenzphänomenen, wobei die Zusammensetzung
eine Vielzahl von suspendieren Teilchen mit einer Oberfläche umfaßt, die
eine Komponente der Testmischung binden kann. In einem weiteren
Aspekt betrifft sie ein System zum Nachweis oder zur Quantifizierung
eines interessierenden Analyten in einer Probe, welches System die
Testverfahren unter Verwendung der Testzusammensetzungen der Erfindungen durchführen kann.
Das System umfaßt
Mittel zum Induzieren der Lumineszenz im Marker im Testmedium und Mittel
zum Messen der Lumineszenz zum Nachweis der Anwesenheit des interessierenden
Analyten in der Probe.
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Es
wurde gefunden, daß die
Bindung derjenigen Komponente des Testsystems, an die eine Elektrochemolumineszenzgruppe
gebunden ist, an ein suspendiertes mikroteilchenförmiges Material
die Intensität des
Lumineszenzsignals in großem
Umfang moduliert, welches von der an die Komponente gebundenen elektrochemolumineszenten
Gruppe erzeugt wird, wodurch ein Mittel zum Überwachen der spezifischen
Bindungsreaktion des Testsystems bereitgestellt wird. Noch überraschender
hat sich gezeigt, daß die
suspendierten Teilchen nur geringe oder keine Auswirkung auf die
Intensität
des Lumineszenzsignals haben, das von der elektrochemolumineszenten
Gruppe erzeugt wird, welche an die Komponente des Systems gebunden
ist, die nicht an das suspendierte teilchenförmige Material gebunden wird
(ungebunden bleibt).
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Somit
betrifft die WO 90/05301 Verfahren zum Nachweis eines interessierenden
Analyten in einer Probe, welche Verfahren die Schritte umfassen:
(1) Bilden einer Zusammensetzung, umfassend (a) eine Probe, von
der vermutet wird, daß sie
einen interessierenden Analyten enthält, (b) eine aus der Gruppe
gewählte Test-Durchführungssubstanz,
die besteht aus (i) einem interessierenden Analyten oder einem Analogon des interessierenden
Analyten, (ii) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten
oder dessen Analogon und (iii) einer reaktiven Komponente, die mit
(i) oder (ii) binden kann, wobei eine dieser Substanzen an eine Markerverbindung
mit einer chemischen Gruppe gebunden ist, in der Lumineszenz induziert
werden kann, und (c) eine Vielzahl von suspendierten Teilchen, die
spezifisch mit denn Analyten und/oder einer Substanz definiert in
(b) (i), (ii) oder (iii) binden kann, (2) Inkubieren der Zusammensetzung
zur Bildung eines Komplexes, der ein Teilchen und die Markerverbindung
umfaßt,
(3) Induzieren der Lumineszenz in der Markerverbindung und (4) Messen
der von der Zusammensetzung emittierten Lumineszenz zum Nachweis
der Anwesenheit des interessierenden Analyten in der Probe. Dieselben
Verfahren können
zur Quantifizierung der Menge des Analyten in einer Probe verwendet
werden, indem man die Lumineszenz der Testzusammensetzung mit der
Lumineszenz einer Zusammensetzung vergleicht, die eine bekannte
Menge des Analyten enthält.
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Analoga
des interessierenden Analyten, die natürlichen oder synthetischen
Ursprungs sein können, sind
Verbindungen, die dem Analyten vergleichbare Bindungseigenschaften
aufweisen, schließen
jedoch Verbindungen von höherer
oder geringerer Bindungsfähigkeit
ebenso ein. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete
Bindungspartner sind wohlbekannt. Beispiele sind Antikörper, Enzyme,
Nukleinsäuren, Lectine,
Cofaktoren und Rezeptoren. Die reaktiven Komponenten, welche den
Analyten oder dessen Analogon und/oder seinen Bindungspartner binden
können,
können
ein zweiter Antikörper
oder ein Protein, wie Protein A oder Protein G, oder Avidin oder
Biotin oder andere Komponenten sein, von denen im Stand der Technik bekannt
ist, daß sie
Bindungsreaktionen eingehen.
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Vorteilhafterweise
entsteht die Lumineszenz aus Elektrochemolumineszenz (ECL), die
durch Exponieren der Markerverbindung, sei es gebunden an spezifische
Bindungspartner oder in ungebundenem Zustand, an eine voltametrische
Arbeitselektrode induziert wird. Die ECL-reaktive Mischung wird
steuerbar zur Emission von Licht getriggert über eine Spannung, die auf
die Arbeitselektrode zu einem speziellen Zeitpunkt in spezieller
Weise zur Erzeugung von Licht aufgebracht wird. Obwohl die Emission
von sichtbarem Licht ein vorteilhaftes Merkmal der Zusammensetzung
oder des Systems ist, kann dieses andere Arten von elektromagnetischer
Strahlung, wie Infrarot- oder ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen,
Mikrowellen usw. emittieren. Die Verwendung der Ausdrücke "Elektrochemolumineszenz", "elektrochemolumineszent", "Lumineszenz", "lumineszent" und "lumineszieren" umfaßt die Emission
von Licht und anderen Formen elektromagnetischer Strahlung.
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Die
in der US 89/04919 gelehrten Verfahren gestatten den Nachweis und
die Quantifizierung von extrem geringen Mengen eines Analyten in
einer Vielzahl von Tests, die in der Forschung und in klinischen
Szenarien durchgeführt
werden. Die Anforderungen der Forscher und Kliniker machen es jedoch
notwendig, die Nachweisgrenzen der über diese Verfahren durchgeführten Tests
zu senken, die Empfindlichkeit dieser Tests zu steigern und die
Geschwindigkeit, mit der sie durchgeführt werden können, zu
erhöhen.
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Verschiedene
Verfahren sind im Stand der Technik zum Vergrößern des Signals aus markierten
Spezies durch Aufkonzentrieren bekannt, bevor diese einem Meßschritt
unterworfen werden. In der US-A-4,652,333 werden beispielsweise
mit fluoreszenten, phosphoreszenten oder atomfluoreszenten Markern
markierte Teilchen durch Mikrofiltration aufkonzentriert, bevor
ein Meßschritt
durchgeführt
wird.
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Es
ist ebenso im Stand der Technik bekannt, markierte immunchemische
Spezies vor einem Meßschritt
aufzukonzentrieren, beispielsweise indem man magnetisch ansprechbare,
markierte Teilchen auf die Oberfläche eines Meßgefäßes zieht.
In den US-Patenten der Nrn. 4,731,337, 4,777,145 und 4,115,535 werden solche
Teilchen beispielsweise auf die Gefäßwandung gezogen und anschließend bestrahlt,
um Fluorophore zur Emission . von Licht anzuregen.
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In
der US-A-4,945,045 werden Teilchen auf einer magnetischen Elektrode
konzentriert. Eine elektrochemische Reaktion, die von einem markierten
chemischen Mediator erleichtert wird, findet an der Elektrode statt.
Die immunchemische Bindungsreaktion verändert die Effizienz des Mediators,
was bei Bindung zu einem modulierten Signal führt.
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Diese
Verfahren des Standes der Technik sind nicht relevant für die oberflächenselektiven
Anregungsprozesse der Erfindung. Ohne sich durch irgendeine spezielle
mechanistische Erklärung
der Oberflächenanregung,
beispielsweise der Elektrochemolumineszenz, binden zu wollen, wird
angenommen, daß der
Marker auf dem Festphasenkomplex an der Elektrode oxidiert werden
muß. Dieses
erfordert, daß ein
Elektron sich vom Marker zur Elektrode hinab bewegt. Es wird angenommen,
daß das
Elektron diesen "Sprung" über ein Phänomen, was als Tunneln bekannt
ist, macht, bei dem das Elektron durch einen Raum (einen Bereich,
in dem seine potentielle Energie sehr hoch ist, beispielsweise die
Lösung)
hindurchtritt, ohne daß es "über" die Sperre der potentiellen Energie
schreiten muß.
Es kann die Energiesperre durchtunneln und somit von einem Molekül zu einem
anderen oder von einem Molekül
zu einer Elektrode ohne weitere Energiezuführ wandern. Dieses Tunnelphänomen kann
jedoch nur über
sehr kurze Abstände
hinweg funktionieren. Die Wahrscheinlichkeit des Tunnelphänomens fällt mit
steigender Distanz zwischen den zwei Spezies exponentiell ab. Die Wahrscheinlichkeit
des Auftretens des Tunnelphänomens
zwischen zwei Spezies ist relativ hoch, wenn der Abstand unter 2,5
nm beträgt,
ist jedoch relativ gering, falls der Abstand größer ist. Der Abstand von 2,5
nm entspricht einer Daumenregel, die vom Fachmann angewandt wird,
stellt jedoch keine absolute Grenze dar.
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Dementsprechend
kann nur von denjenigen ECL-Markern innerhalb von 2,5 nm von der
Oberfläche der
Elektrode erwartet werden, daß diese
am ECL-Prozeß teilnehmen.
Die Fläche
der Teilchen, die sich innerhalb von 2,5 nm von der Oberfläche einer
Elektrode befinden, ist typischerweise extrem klein.
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Dementsprechend
würde man
nicht erwarten, daß die
ECL einer Teilchenoberfläche
in signifikantem Maße
meßbar
wäre. Darüber hinaus
muß das
Licht, das von dem ECL-Prozeß erzeugt
wird, durch das Teilchen hindurchtreten, um zum Fotomultiplier zu
gelangen. Da die Teilchen im wesentlichen opak sind (eine konzentrierte
Suspension der selben ist schwarz), würde man nicht erwarten, daß selbst
für den
Fall, daß signifikante
Mengen an Licht über
die ECL erzeugt werden könnten,
das Licht durch das Teilchen durchtritt und vom Fotomultiplier gemessen
werden könnte.
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Aufgaben der
Erfindung
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Es
ist daher ein primäres
Ziel dieser Erfindung, homogene (ohne Trennung) und heterogene (Trennung)
Verfahren, Reagenzien und einen Apparat zur Durchführung der
Bindungstests bereitzustellen.
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Es
ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, spezifische Bindungstests
ohne Trennung, Reagenzien und einen Apparat auf Grundlage der Messung
von Elektrochemolumineszenz bereitzustellen, die von einer Testzusammensetzung
emittiert wird, die ein mikroteilchenförmiges Material enthält.
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Es
ist ein weiteres und verwandtes Ziel, solche Tests, Reagenzien und
einen Apparat mit verbesserter Empfindlichkeit, schnellerer Testdauer,
größerer Spezifizität, niedrigeren
Detektionsgrenzen und größerer Präzision bereitzustellen,
als zuvor erreicht worden ist.
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Beschreibung
der Erfindung
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Definition
von Ausdrücken
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Der
Ausdruck "ECL-Gruppe", "metallhaltige ECL-Gruppe", "Marker", "Markerverbindung" und "Markersubstanz" werden austauschbar
verwendet. Es ist im Bereich der Erfindung, daß die "ECL-Gruppe", "metallhaltige
ECL-Gruppe", "organometallische", "Metallchelat", "Übergangsmetallchelat", "Seltenerdmetallchelat", "Markerverbindung", "Markersubstanz" und "Marker" genannte Spezies
an ein Molekül
wie einen Analyten oder ein Analogen desselben, einen Bindungspartner
des Analyten oder ein Analogen desselben und weitere Bindungspartner
wie die oben genannten Bindungspartner oder eine reaktive Komponente
für die
Bindung mit dem Analyten, einen Analog derselben oder einen Bindungspartner,
wie oben genannt, gebunden ist. Die oben erwähnten Spezies können auch
an eine Kombination aus einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder einer
oder mehreren reaktiven Komponenten gebunden sein. Weiterhin können die
oben genannten Spezies auch an einen Analyten oder dessen Analogen,
gebunden an einen Bindungspartner, eine reaktive Komponente oder
eine Kombination aus einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder
einer oder mehreren reaktiven Komponenten gebunden sein. Es ist
ebenfalls im Bereich der Erfindung, daß eine Vielzahl der oben genannten
Spezies direkt oder über
andere Moleküle,
wie oben angesprochen, an den Analyten oder sein Analogon gebunden
ist. Für
Abkürzungszwecke
werden diese Liganden als Testdurchführungssubstanz bezeichnet.
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Die
Ausdrücke
Nachweis und Quantifizierung werden als "Messung" angesprochen, wobei zu verstehen ist,
daß die
Quantifizierung die Herstellung von Referenzzusammensetzungen und
Kalibrierungen erfordern kann.
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Die
Ausdrücke
Sammeln und Konzentrierung des Komplexes können austauschbar verwendet
werden, um die Aufkonzentrierung des Komplexes in der Testzusammensetzung
und die Sammlung des Komplexes beispielsweise an der Elektrodenoberfläche zu beschreiben.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung einer Zelle zur Durchführung der
auf Mikroteilchen beruhenden Tests der Erfindung mit und ohne Trennung.
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2 ist
ein vereinfachtes Diagramm einer Vorrichtung zum Steuern der Spannung
zur Verwendung in der Zelle aus 1.
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3 ist
eine schematische Darstellung eines PCR-Formats mit direktem Einbau
unter Verwendung elektrochemolumineszent markierter Oligonukleotide
und Biotin mit elektrochemolumineszent markierten Oligonukleotiden
als Primer.
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4 ist
eine schematische Darstellung eines normalen PCR-Formats unter Verwendung
eines biotinylierten Primers, um die Bildung eines biotinylierten
PCR-Produkts zu gestatten.
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5 ist
eine schematische Darstellung eines asymmetrischen PCR-Testformats,
welches einzelsträngige,
biotinylierte DNS für
die spätere
Hybridisierung an elektrochemolumineszent markierte Oligonukleotide
erzeugt.
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6 ist
eine Auftragung, welche Spezifitätsuntersuchungen
der direkten Inkorporation von elektrochemolumineszent markierten
Oligonukleotiden in biotinylierte PCR-Produkte zeigt.
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7 ist
eine Standardkurve für
direkt eingebaute, elektrochemolumineszente Marker und biotinylierte
Oligonukleotide in HPV16-PCR-Produkte.
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8 ist
eine Auftragung, welche einen Punktmutationstest für die Ha-ras-Onkogene
zeigt.
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9 ist
eine Auftragung, welche eine Bewertung der Spezifität für elektrochemolumineszent
markierte Sonden unter Verwendung P32-elektrochemolumineszent
markierten Sonden für
das Aa-ras-Onkogen zeigt.
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10 ist
eine Auftragung, welche die Bestimmung von relativen Werten eines
elektrochemolumineszenten Markers in P32-elektrochemolumineszenten
Markern für
die Bestimmung von Punktmutation im Ha-ras-Onkogen zeigt.
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11 ist
eine Standardkurve für
den Schnell-Hybridisierungstest für HPV18 ohne Waschen.
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12 ist
eine schematische Darstellung einer Testzelle, die zur Durchführung von
Tests verwendet wird und die Schwerkraft nutzt, um das Absetzen
des Komplexes zu verursachen.
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13 ist
eine Auftragung, welche die Entfernung angibt, die sich der Komplex
absetzt, und zwar als Funktion der Zeit unter Einfluß der Schwerkraft,
nämlich
die Sedimentationsrate von Dynalteilchen (y = –0,28 + 0,48x; Geschwindigkeit
= 0,5 mm pro Minute).
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14 ist
eine Auftragung, welche die Intensität der Elektrochemolumineszenz
als Funktion der Zeit in Schwerkraftzellen mit verschiedenen Höhen an Testzusammensetzung über der
Elektrode zeigt, das heißt einen
Vergleich der Intensitäts-Zeit-Beziehung
für zwei
Dichtungs- bzw. Probendicken, worin die von offenen Kreisen dargestellten
Werte für
eine 0,015-Inch-Dichtung und die von schwarzen Kreisen dargestellten
Werte für
eine 0,075-Inch-Dichtung stehen.
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15 ist
eine Auftragung, welche die Intensität der Elektrochemolumineszenz
in Schwerkraftzellen mit verschiedenen Höhen von Testzusammensetzungen über der
Elektrodenoberfläche
zeigt, wie sie in einem Test für
die Bestimmung von alphafetalem Protein gemessen wurden, das heißt einem
Vergleich von Zellen für einen
AFP-Test, worin die von offenen Kreisen dargestellten Werte für die 0,015-Inch-Dichtung
und die von schwarzen Kreisen dargestellten Werte für eine 0,075-Inch-Dichtung
stehen.
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16 ist
eine schematische Darstellung einer Sedimentationstestzelle, die
einen Elektromagneten nutzt, um das Absetzen des Komplexes auf der
Elektrodenoberfläche
zu veranlassen.
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17 ist
eine Auftragung, welche die relativen Geschwindigkeiten des Absetzens
eines mikroteilchenförmigen
Komplexes unter Einfluß eines
magnetischen Feldes bzw. der Schwerkraft zeigt, das heißt ein Vergleich
von Absetzzeiten von Mikroteilchen zwischen einem durch Magnetfeld
induzierten Absetzen und durch Schwerkraft verursachten Absetzen,
wobei die Werte für
das Magnetfeldabsetzen durch offene Kreise dargestellt sind und
die Werte für
Schwerkraftabsetzung von schwarzen Kreisen dargestellt werden.
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18 ist
eine schematische Darstellung einer Sammelzelle, umfassend einen
Permanentmagneten.
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19 ist
eine Auftragung, welche den Anstieg der ECL-Intensität als Funktion
der Zeit in Tests zeigt, die mit der Zelle aus 18 durchgeführt wurden,
das heißt
die Auswirkung der Sammelzeit auf die ECL-Intensität.
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20 ist eine schematische Darstellung der
Kraftlinien in der Nähe
der Elektrodenoberfläche
als Funktion der Orientierung des Magneten unter der Elektrodenoberfläche.
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21 ist
eine schematische Darstellung einer rotierenden Durchflußzelle,
worin die Komplexe auf der Oberfläche der Elektrode mittels Zentrifugation
abgeschieden werden; das Zentrifugationsverfahren und die Vorrichtung
der Erfindung zum Auffangen von Teilchen; die Zentrifugationsdurchflußzelle der
Erfindung.
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22 ist
eine schematische Darstellung einer Fluoreszenzdetektion mit abklingender
Welle.
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23 und 24 zeigen
eine Zelle und eine Vielzahl von Magneten zur Durchführung von
Trennungs- oder Nichttrennungs-Testverfahren der Erfindung auf Basis
magnetischer Mikroteilchen; die Vielzahl von Magneten des Magnetsystems
legen Feldlinien an, die wesentlich parallel zur Ebene der Elektrodenoberfläche liegen.
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25 ist
eine schematische Zeichnung einer Zelle zur Durchführung der
Nichttrennungs- und Trennungstest der Erfindung auf Basis von Mikoteilchen;
die Zelle umfaßt
eine Arbeitselektrode und eine Vielzahl von Magneten, wie in den 23 und 24.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung mit einem Testreagenz
zur Verwendung in einem Test eines Analyten von Interesse auf Grundlage
einer Bindungsreaktion und der Messung eines elektrochemolumineszenten
Phänomens
bereit, umfassend:
- a) eine Markierungsverbindung,
die einen elektrochemolumineszenten Rest enthält, der an einen Bindungspartner
des Analyten von Interesse oder eines Analogons des Analyten von
Interesse angehängt
ist; und
- b) eine Vielzahl magnetisch reagierender Partikel mit einer
Oberfläche,
die in der Lage ist, an eine Komponente der Testreagenz-Zusammensetzung
zu binden, wobei die Partikel magnetisch reagierende Partikel mit
einer Dichte sind, die von 0,5 bis 2 g/ml reicht, und mit einem
Durchmesser, der von 0,01 μm
bis 10 μm reicht.
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Eine
alternative Ausführungsform
der Erfindung stellt ein Kit bereit, das Reagenzien zur Verwendung in
einem auf Mikropartikel-basierten Bindungstest für einen Analyten von Interesse
enthält,
umfassend:
- a) magnetisch reagierende Partikel
mit einer Dichte, die von 0,5 bis 2 g/ml reicht, und mit einem Durchmesser,
der von 0,01 μm
bis 10 μm
reicht; und
- b) eine Markierungsverbindung, die einen elektrochemolumineszenten
Rest enthält,
welcher an einen Bindungspartner des Analyten von Interesse und
eines Analogons des Analyten von Interesse angehängt ist;
mit der
Maßgabe,
daß keine
zwei oder mehr Bestandteile des Kits miteinander unter Lagerbedingungen
reagieren, wodurch die Funktion der Reagenzien in dem beabsichtigen
Test gestört
werden könnte.
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Diese
Erfindung stellt weiter die Verwendung einer Zusammensetzung der
Erfindung in einem Elektrochemolumineszenz-Bindungstest bereit,
wobei diese Partikel magnetisch sind und auf einer Elektrodenoberfläche gesammelt
werden.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in
einem Test für
einen Analyten von Interesse bereit, umfassend:
- (a)
Bilden dieser Zusammensetzung;
- (b) Einsammeln der Partikel auf einer Elektrodenoberfläche, wobei
die Partikel magnetisch sind;
- (c) Anregen dieses Elektrochemolumineszenz-Rests, um Elektrochemolumineszenz
zu emittieren; und
- (d) Nachweisen der Elektrochemolumineszenz.
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Der
Komplex kann beispielsweise an einer Elektrodenoberfläche gesammelt
werden, wo er angeregt wird und zur Elektrochemolumineszenz gebracht
wird, wie beispielsweise durch Anlegen einer Spannung an der Elektrode,
oder er kann an einer Oberfläche
gesammelt werden und danach durch Oberflächenanregung, wie unten beschrieben
wird, angeregt werden, um zu fluoreszieren. Die totale interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF)
ist als eine oberflächenempfindliche
Technik zum Anregen und Nachweisen fluorophorer Markierungen beschrieben
worden, und die totale interne Reflexion ist mir RAMAN und der Infrarotabsorption
als einer anderen oberflächensensitiven
Technik zum Messen des Vorhandenseins einer Markierung verwendet
worden. Die Oberflächen-Plasmonresonanz
ist eine optische Technik, die nach Verfahren der Erfindung verwendet
werden kann, um Markierungen auf Oberflächen zu messen. Die Erfindung
ist daher auf Verfahren zum Anregen von Lumineszenz durch Oberflächenanregungstechniken
gerichtet.
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Während die
Erfindung vorzugsweise durchgeführt
wird, indem der Komplex in einem Meßbereich gesammelt wird, d.h.
auf einer Oberfläche,
an der er dazu gebracht werden kann, Lumineszenzsignale abzugeben,
umfaßt
die Erfindung auch Verfahren, in denen der Komplex außerhalb
eines Meßbereichs
gesammelt wird und danach Vorrichtungen in diesen Bereich gebracht
werden, oder andere Schritte unternommen werden, um die Lumineszenz
zu induzieren und zu messen.
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Das
Sammeln des Komplexes kann durch mehrere verschiedene Verfahren
durchgeführt
werden, einschließlich
der schwerkraftabhängigen
Ablagerung, Filtration, Zentrifugieren, und der magnetischen Anziehung
magnetisch reaktiver Teilchen, die einen Teil des Komplexes bilden.
Die verschiedenen Ausführungsformen
sind unten in genaueren Details beschrieben.
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Tests,
die auf der Messung der Elektrochemolumineszenz an einer Elektrodenoberfläche basieren, werden
vorzugsweise durch Verwendung der Schwerkraft durchgeführt, indem
- (a) eine Zusammensetzung gebildet wird, die
enthält
(i)
eine Probe
(ii) eine Substanz zur Durchführung des Tests, die einen
Bestandteil enthält,
der an eine Markierungsverbindung gebunden ist, die in der Lage
ist, angeregt zu werden, um Elektrochemolumineszenz zu zeigen, und
(iii)
eine Vielzahl suspendierter Partikel mit einer Dichte, die größer als
das Gleichgewicht dieser Zusammensetzung ist und die in der Lage
sind, spezifisch an den Analyten und/oder die Substanz zur Durchführung des
Tests zu binden;
- (b) Inkubieren der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden,
der einen Partikel und die Markierungsverbindung einschließt;
- (c) Einfüllen
der Zusammensetzung in eine Testzelle;
- (d) Einsammeln des Komplexes an der Oberfläche der Elektrode, die unterhalb
mindestens eines substantiellen Teils des Volumens dieser Testzelle
angebracht ist, indem der Zusammensetzung ermöglicht wird, für eine ausreichende
Zeit in der Zelle zu verbleiben, um den Partikeln zu ermöglichen,
sich auf der Elektrodenoberfläche
durch die Schwerkraft abzulagern;
- (e) Anregen der Markierungsverbindung in diesem gesammelten
Komplex, Lumineszenz zu zeigen, indem eine Spannung an diese Elektrode
angelegt wird; und
- (f) Messen der emittierten Elektrochemolumineszenz an der Elektrodenoberfläche, um
das Vorhandensein des Analyten von Interesse der Probe zu messen.
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Während Chargentests
oder Batchtests durchgeführt
werden können,
können
kontinuierliche oder semi-kontinuierliche Tests in Durchflußzellen
erfolgen. In einer Durchflußzelle
verbleibt die Festphase in der Meßzelle, während die Lösung durch diese hindurchströmt und die
Zelle verläßt. Ist
die Festphase (beispielsweise Teilchen) dichter als Wasser, das
heißt
weisen diese eine Dichte größer als
diejenige von Wasser auf (über
1,0 g/ml), veranlaßt
die Wirkung der Schwerkraft auf die Teilchen deren Fallen auf den
Boden der Zelle. Die Zelle kann so konstruiert sein, daß die Teilchen
sich auf dem Boden absetzen, während
das Fluid durch die Zelle strömt,
oder die Zelle kann so konstruiert sein, daß die Hauptmenge der Probe
in der Zelle in einem säulenförmigen Kompartment über der
Arbeitselektrode eines ECL-Systems enthalten ist. Vor dem Induzieren der
ECL muß eine
ausreichende Verweilzeit in der Zelle vorgesehen sein, damit die
Teilchen sich auf der Oberfläche
der Elektrode absetzen können.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung kann eine Testzusammensetzung, die suspendierte Teilchen
mit einer größeren Dichte
als derjenigen des Restes der Testzusammensetzung enthält, der Zentrifugation
unterworfen werden, um die Teilchen zu einer Meßzone zu entfernen, wo sie
anschließend
beispielsweise mit einer Elektrode in Kontakt gebracht werden, um
die Elektrochemolumineszenz zu induzieren, oder bei der sie direkt
während
des Zentrifugationsschrittes mit einer Elektrode in Kontakt gebracht
werden.
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Bei
dieser Ausführungsform
ist die Meßzelle
mit Mitteln zum schnellen Rotieren der Probe und dem Probenbehältnis versehen.
Zentrifugalkräfte
verursachen das Wandern der Teilchen in der Probe nach außen weg
von der Rotationsachse des Probenbehältnisses und ein Ansammeln
an der äußeren Oberfläche des
Probenbehältnisses.
Die äußere Oberfläche solcher
Probenbehältnisse
können
die Arbeitselektrode eines ECL-Meßsystemes aufbauen.
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In
einer dritten Ausführungsform
können
die Teilchen mittels Filtration aus der Testzusammensetzung entfernt
werden. Bei dieser Ausführungsform
müssen
die Teilchen keine größere Dichte
als diejenige des Rests der Testzusammensetzung aufweisen. Die Teilchen
werden aus der Lösung
abgetrennt und konzentriert, indem man die Lösung durch einen Filter beispielsweise
mittels Pumpen zieht und die Teilchen auf der Oberfläche des
Filters sammelt. Diese Filteroberfläche ist beispielsweise mit
einem dünnen
Metallfilm beschichtet, der als Arbeitselektrode in einem ECL-Detektionssystem
dienen kann.
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Die
suspendierten Teilchen sind magnetisch ansprechbar, das heißt sie können paramagnetisch
oder ferromagnetisch sein, und werden in einer Meßzone oder
vorzugsweise direkt an der Oberfläche einer Elektrode gesammelt,
indem man ein Magnetfeld auf die Teilchen aufbringt. Die Meßzelle ist
mit einem Magneten ausgestattet. Das Magnetfeld des Magneten bringt
eine Kraft auf die Teilchen auf, wenn sie in der Chargenzelle verweilen
oder wenn sie durch eine Durchflußzelle strömen, was die Trennung derselben
von der Hauptmenge der Lösung
auf die Oberfläche
der Zelle verursacht, die sich in nächster Nähe zum Magneten befindet. Wenn der
Magnet in geeigneter Orientierung und in nächster Nähe zur Arbeitselektrode eines
ECL-Detektionssystems angeordnet ist, konzentrieren sich die Teilchen
auf der Oberfläche
der Arbeitselektrode auf.
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Zahlreiche
verschiedene heterogene und homogene Formate des Bindungstests können unter
Anwendung der oben beschriebenen Verfahren zum Sammeln und Aufkonzentrieren
des Komplexes auf der Oberfläche
einer Elektrode implementiert werden. Bei einem heterogenen Bindungstest
wird der Komplex aus der Zusammensetzung abgetrennt, bevor die Lumineszenz
des Marken gemessenen wird. Bei homogenen Tests erfolgt keine Trennung
von gebundenem (an die Festphase) und ungebundenem markierten Reagenz.
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Bei
einem heterogenen Test ist das gemessene Signal des Markers, wenn
der Komplex auf der Oberfläche
der Arbeitselektrode aufkonzentriert ist, viel größer als
es in Abwesenheit eines Sammelschrittes wäre. Das Signal des nicht-komplexierten
markierten Reagenz bleibt im Gegensatz dazu unverändert. Somit
ist trotz der Anwesenheit des unkomplexierten markierten Reagenz
in der Meßzelle
das Signal des gesammelten Komplexes stärker als in einem Test ohne
die Ansammlung des Komplexes. Die Nachweisgrenze für den Bindungstest
ist als Folge des Sammelvorgangs wesentlich verbessert.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird in in-situ-Trennschritt in das homogene Bindungstestverfahren
aufgenommen. Nachdem die Testzusammensetzung, das heißt die Probe,
die Testdurchführungssubstanz
und die Teilchen in die Meßzelle
gepumpt worden sind und der Komplex auf der Arbeitselektrode gefangen
wurde, wird ein zweites Fluid durch die Zelle gepumpt, das frei
von Marker oder markiertem Reagenz ist, wodurch eine in-situ-Waschung
oder -Trennung des Komplexes von ungebundenen oder nicht gebundenen
Komponenten der Testzusammensetzung erfolgt. Dieses Testverfahren
ist technisch ein heterogener Bindungstest. Die Möglichkeit,
die Trennung innerhalb der Meßzelle
durchzuführen,
ist jedoch vorteilhaft dahingehend, daß sie keine zusätzliche
Trennvorrichtung erfordert und das Verfahren im . allgemeinen wesentlich
schneller als externe Trennverfahren ist.
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Heterogene
Bindungstests können
unter Verwendung der Erfindung durchgeführt werden, indem man die Komponenten
der Testzusammensetzung mischt und für eine bestimmte Zeitspanne
miteinander reagieren läßt. Die
Testzusammensetzung wird anschließend einem Trennschritt unterworfen,
währenddessen
die Lösung
von den Teilchen abgetrennt wird. Anschließend wird die Elektrochemolumineszenz
entweder des Komplexes oder der Lösung gemessen. Die Messung
der ECL des Komplexes nach dem Aufkonzentrierungsschritt gestattet
die Messung eines Analyten mit besserer Genauigkeit und mit einer
niedrigeren Nachweisgrenze als dies ohne Aufkonzentrierung möglich ist.
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Genaue Beschreibung der
Erfindung
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Die
Erfindung wie auch andere Aufgaben und Merkmale derselben werden
deutlicher und vollständiger
aus der folgenden Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen.
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Die
Erfindung ist in breitem Umfang auf interessierende Analyten anwendbar,
die Bindungsreaktionen eingehen können. Diese Reaktionen schließen beispielsweise
Antigen-Antikörper-,
Ligand-Rezeptor-, DNS- und RNS-Interaktionen sowie andere bekannte
Reaktionen ein. Die Erfindung betrifft verschiedene Verfahren und
Tests für
den qualitativen und quantitativen Nachweis der Anwesenheit solcher
interessierenden Analyten in einer Mehrkomponentenprobe.
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Die Proben
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Die
Probe, die den interessierenden Analyten enthalten kann und in fester
Form, als Emulsion, Suspension, Flüssigkeit oder Gas, vorliegen
kann, kann abgeleitet werden beispielsweise von Zellen und von Zellen
abgeleiteten Produkten, Wasser, Nahrungsmitteln, Blut, Serum, Haar,
Schweiß,
Urin, Feces (Kot), Gewebe, Speichel, Ölen, organischen Lösungsmitteln
oder Luft. Die Probe kann weiter beispielsweise Wasser, Acetonitril,
Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, n-Methylpyrrolidon oder Alkohole
oder Mischungen derselben umfassen.
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Die Analyten
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Typische
interessierende Analyten sind eine ganze Zelle oder ein Oberflächenantigen,
subzelluläre Teilchen,
ein Virus, ein Prion, ein Viroid, ein Antikörper, ein Antigen, ein Hapten,
eine Fettsäure,
eine Nukleinsäure,
ein Protein, ein Lipoprotein, ein Polysaccharid, ein Lipopolysaccharid,
ein Glycoprotein, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit,
ein Hormon, ein pharmazeutisches Mittel, ein synthetisches organisches
Molekül,
ein organometallisches Molekül,
ein Tranquilizer, ein Barbiturat, ein Alkaloid, ein Steroid, ein
Vitamin, eine Aminosäure,
ein Zucker, ein Lectin, ein rekombinantes oder abgeleitetes Protein,
Biotin, Avidin, Streptavidin oder ein anorganisches Molekül, vorhanden
in der Probe. Typischerweise liegt der interessierende Analyt in einer
Konzentration von 10–3 Molar oder darunter,
beispielsweise so niedrig wie 10–12 Molar
oder darunter, vor.
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Testdurchführungssubstanz
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Die
Testdurchführungssubstanz,
die mit der den interessierenden Analyten enthaltenden Probe kombiniert
wird, enthält
mindestens eine aus der Gruppe ausgewählte Substanz, die besteht
aus: (i) zugesetztem interessierendem Analyten oder dessen Analogon,
wie oben definiert, (ii) einem Bindungspartner des interessierenden
Analyten oder von dessen Analogon und (iii) eine reaktive Komponente,
wie oben definiert, die mit (i) oder (ii) binden kann, worin eine
der Substanzen an eine Verbindung oder Gruppe gebunden ist, beispielsweise
eine ECL-Gruppe, die zur Lumineszenz induziert werden kann. Die
markierte Substanz kann eine ganze Zelle oder ein Oberflächenartigen,
ein subzelluläres
Teilchen, ein Virus, ein Prion, ein Viroid, ein Antikörper, ein Antigen,
ein Hapten, ein Lipid, eine Fettsäure, eine Nukleinsäure, ein
Polysaccharid, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid,
ein Glycoprotein, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit,
ein Hormon, ein pharmazeutisches Mittel, ein Tranquilizer, ein Barbiturat,
ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, ein
Zucker, ein nichtbiologisches Polymer (vorzugsweise löslich),
ein Lectin, ein rekombinantes oder abgeleitetes Protein, ein synthetisches
organisches Molekül,
ein organometallisches Molekül,
ein anorganisches Molekül,
Biotin, Avidin oder Streptavidin sein. Bei einer Ausfuhrungsform
ist das Reagenz eine elektrochemolumineszente Gruppe, gebunden an
einen Antikörper,
ein Antigen, eine Nukleinsäure,
ein Hapten, eine kurze Nukleotidsequenz, ein Oligomer, einen Liganden,
ein Enzym oder Biotin, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein
G oder Komplexe derselben oder auch andere sekundäre Bindungspartner,
die an einem primären
Bindungspartner über
Proteinwechselwirkungen binden können.
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Analoga
des interessierenden Analyten, die natürlichen oder synthetischen
Ursprungs sein können, sind
typischerweise Verbindungen, die dem Analyten vergleichbare Bindungseigenschaften
aufweisen, können
jedoch ebenso Verbindungen mit höherer
oder geringerer Bindungsfähigkeit
sein. Die reaktive Komponente, welche den Analyten oder sein Analogon
und/oder mit einem Bindungspartner desselben binden kann und über die
die ECL-Gruppe an den Analyten gebunden werden kann, ist geeigneterweise
ein zweiter Antikörper oder
ein Protein wie Protein A oder Protein G oder Avidin oder Biotin
oder eine andere Komponente, von der im Stand der Technik bekannt
ist, daß sie
Bindungsreaktionen eingeht.
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Die Marker
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Vorteilhafterweise
stellen die ECL-Gruppen Metallchelate dar. Das Metall des Chelats
ist geeigneterweise ein solches Metall, daß das Metallchelat unter den
elektrochemischen Bedingungen, die auf das fragliche Reaktionssystem
aufgebracht werden, luminesziert. Bei dem Metall des Metallchelats
handelt es sich beispielsweise um ein Übergangsmetall (wie ein d-Block-Übergangsmetall)
oder ein Seltenerdmetall. Bei dem Metall handelt es sich vorzugsweise
um Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Indium,
Palladium, Molybdän,
Technetium, Kupfer, Chrom oder Wolfram. Besonders bevorzugt sind
Ruthenium und Osmium.
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Die
Liganden, die an das Metall in diesen Chelaten gebunden sind, sind üblicherweise
heterocyclischer oder organischer Natur und spielen bei der Bestimmung
eine Rolle, ob das Metallchelat in einer wäßrigen Umgebung, in einer organischen
oder anderen nichtwäßrigen Umgebung
löslich
ist oder nicht. Die Liganden können
mehrzähnig
sein und können
substituiert sein. Mehrzähnige
Liganden schließen
aromatische und aliphatische Liganden ein. Geeignete aromatische,
mehrzähnige
Liganden schließen
aromatische heterocyclische Liganden ein. Bevorzugte aromatische
heterocyclische Liganden sind stickstoffhaltig wie beispielsweise Bipyridyl,
Bipyrazyl, Terpyridyl und Phenathrolyl. Geeignete Substituenten
schließen
beispielsweise Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes
Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd,
Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl,
Amidin, Guanidin, Ureid, schwefelhaltige Gruppen, phosphorhaltige
Gruppen und die Carboxylatester des N-Hydroxysuccinimids ein. Das
Chelat kann einen oder mehrere einzähnige Liganden aufweisen, von
denen eine große
Vielzahl im Stand der Technik bekannt ist. Geeignete einzähnige Liganden
schließen
beispielsweise Kohlenmonoxid, Cyanide, Isocyanide, Halide und aliphatische,
aromatische und heterocyclische Phosphine, Amine, Stilbene und Arsine
ein.
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Beispiele
geeigneter Chelate sind das bis-[(4,4'-Carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]-2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolan-Ruthenium
(II); das bis-(2,2'-Bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]-Ruthenium
(II); das bis-(2,2'-Bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2-bipyridin-4'-yl)buttersäure]-Ruthenium
(II); das tris-(2,2'-Bipyridin)-Ruthenium
(II); das (2,2'-Bipyridin)-(bis-bis-(1,2-diphenylphosphino)ethylen]-2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-dioxolan-Osmium
(II); das bis-(2,2'-Bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin)butylamin]-Ruthenium (II);
das bis-(2,2'-Bipyridin)-[1-brom-4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan]-Ruthenium (II); und
das bis-(2,2'-Bipyridin)-maleimidohexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamid-Ruthenium
(II).
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Andere
ECL-Reste sind in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung WO 87/06706 und der veröffentlichten PCT-Anmeldung
WO 89/04302 beschrieben.
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Die
Funktion der ECL-Gruppen besteht darin, daß sie elektromagnetische Strahlung
als Folge der Einführung
von elektrochemischer Energie in das Reaktionssystem emittieren.
Um dies zu tun, müssen
sie zu einem angeregten Energiezustand stimuliert werden können und
auch elektromagnetische Strahlung wie ein Lichtphoton beim Absteigen
aus dem angeregten Zustand emittieren können. Ohne sich durch eine
theoretische Analyse des Mechanismus des Beitrags der ECL-Gruppen
zur Elektrochemolumineszenzreaktion binden zu wollen, nehmen wir
an, daß diese
durch die Einführung
von elektrochemischer Energie in das Reaktionssystem oxidiert wird
und anschließend
durch Wechselwirkung mit einem Reduktionsmittel, welches im System vorhanden
ist, in den angeregten Zustand überführt wird.
Dieser Zustand ist relativ instabil und das Metallchelat fällt schnell
in einen stabileren Zustand zurück.
Während
es dieses tut, gibt das Chelat elektromagnetische Strahlung wie
ein Lichtphoton ab, die detektierbar ist.
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Die
Menge an gemäß der Erfindung
inkorporiertem Metallchelat oder anderer metallhaltiger ECL-Gruppen
wird von System zu System variieren. Im allgemeinen wird diejenige
Menge einer solchen Gruppe verwendet, welche Menge wirksam zur Emission
einer detektierbaren und, falls gewünscht, quantifizierbaren Emission
elektromagnetischer Energie aus der oben erwähnten Zusammensetzung oder
System führt.
Die Detektion und/oder Quantifizierung eines interessierenden Analyten
erfolgt typischerweise über
einen Vergleich der Lumineszenz aus einer einen interessierenden
Analyten und eine ECL-Gruppe enthaltenden Probe mit der Lumineszenz,
die von einem Kalibrierungsstandard emittiert wird, der mit bekannten
Mengen des interessierenden Analyten und der ECL-Gruppe entwickelt
wurde. Dieses setzt ein homogenes Format voraus. Im heterogenem
Modus wird, wie oben angesprochen, vor der ECL-Analyse eine Trennung
durchgeführt.
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Wie
dem Durchschnittsfachmann ersichtlich ist, werden sich die Identität und die
Menge der metallhaltigen ECL-Gruppe von einem System zum anderen
unterscheiden in Abhängigkeit
von den vorliegenden Bedingungen. Die geeignete metallhaltige ECL-Gruppe und eine ausreichende
Menge derselben zum Erhalt des gewünschten Ergebnisses läßt sich
empirisch vom Durchschnittsfachmann ohne ungebührliches Experimentieren bestimmen,
sobald dieser mit der hier gegebenen Lehre ausgestattet wird.
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Die Teilchen
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Die
Teilchen umfassen mikroteilchenförmiges
Material mit einem Durchmesser von 0,01 um, vorzugsweise 0,5 μm bis 10 μm, einer
Dichte, die von 0,5 bis 2 g/ml reicht, und einer Oberflächenkomponente,
die mit dem Analyten und/oder einem oder mehreren der oben definierten
Substanzen binden kann, Beispielsweise kann das mikroteilchenförmige Material
quervernetzte Stärke,
Dextrane, Cellulose, Proteine, organische Polymere, ein Styrolcopolymer
wie ein Styrol/Butadien-Copolymer, ein Acrylnitril/Butadien/Styrol-Copolymer,
ein Vinylacetyl/Acrylat-Copolymer oder ein Vinylchlorid/Acrylat-Copolymer,
inerte anorganische Teilchen, Chromdioxid, Oxide des Eisens, Silika
(Siliziumdioxid), Silikagemische und proteinhaltiges Material oder
Mischungen derselben darstellen. Wünschenswerterweise sind die
Teilchen im ECL-System suspendiert. Die Teilchen können magnetisch
ansprechbare Teilchen sein oder diese umfassen.
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Testmedien
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Um
ein System zu betreiben, in das eine Elektrode elektrochemische
Energie einführt,
ist es notwendig, einen Elektrolyten bereitzustellen, in den die
Elektrode eingetaucht wird und welcher die ECL-Gruppe enthält. Der
Elektrolyt ist eine Phase, durch die eine Ladung mittels Ionen getragen
wird. Im allgemeinen ist der Elektrolyt in flüssiger Phase und stellt eine
Lösung
aus einem oder mehreren Salzen oder anderer Spezies in Wasser, einer
organischen Flüssigkeit
oder einer Mischung aus organischen Flüssigkeiten oder einer Mischung
aus Wasser und einem oder mehreren organischen Flüssigkeiten
dar. Andere Formen von Elektrolyten sind jedoch ebenso geeignet
in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung. Beispielsweise kann der Elektrolyt eine Dispersion
von einer oder mehreren Substanzen in einem Fluid – beispielsweise
einer Flüssigkeit, einem
Dampf oder einem superkritischen Fluid – oder eine Lösung von
einer oder mehreren Substanzen in einem Feststoff, einem Dampf oder
einem superkritischen Fluid darstellen.
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Bei
dem Elektrolyten handelt es sich geeigneterweise um eine Lösung eines
Salzes in Wasser. Bei dem Salz kann es sich vorzugsweise um ein
Natriumsalz oder ein Kaliumsatz handeln, die Einarbeitung anderer
Kationen ist jedoch in bestimmten Ausführungsformen ebenso geeignet,
solange das Kation nicht mit der elektrochemolumineszenten Wechselwirkungssequenz
interferiert. Bei dem Anion des Salzes kann es sich beispielsweise
um ein Phosphat handeln, die Verwendung anderer Anionen ist jedoch
in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung ebenfalls gestattet, wiederum solange das gewählte Anion
nicht mit der elektrochemolumineszenten Wechselwirkungssequenz interferiert.
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Die
Zusammensetzung kann außerdem
nichtwäßriger Natur
sein. Während
superkritische Fluide in bestimmten Fällen vorteilhaft verwendet
werden können,
ist es typischer, einen Elektrolyten zu verwenden, der eine organische
Flüssigkeit
in einer nichtwäßrigen Zusammensetzung
umfaßt.
Wie bei einem wäßrigen Elektrolyten
ist auch der nichtwäßrige Elektrolyt
eine Phase, durch die Ladung mittels Ionen getragen wird. Normalerweise
meint dies, daß ein
Salz in dem organischen flüssigen
Medium gelöst
ist. Beispiele geeigneter organischer Flüssigkeiten sind Acetonitril,
Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Methanol, Ethanol und
Mischungen aus zwei oder mehr der oben genannten. Als veranschaulichendes
Beispiel können
Tetraalkylammoniumsalze wie Tetrabutylammoniumtetrafluorborat, die
in organischen Flüssigkeiten
löslich
sind, mit diesen zur Bildung eines nichtwäßrigen Elektrolyten verwendet
werden.
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Bei
dem Elektrolyten handelt es sich in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung um ein gepuffertes System. Phosphatpuffer sind oft
von Vorteil. Beispiele sind eine wäßrige Lösung von Natriumphosphat/Natriumchlorid
und eine wäßrige Lösung von
Natriumphosphat/Natriumfluorid.
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Andere Testkomponenten
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Wie
in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung US 89/004859 mit dem Titel Elektrochemolumineszente Reaktionen
unter Verwendung eines von einem Amin abgeleiteten Reduktionsmittels
beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen
wird, ist es wünschenswert,
ein Reduktionsmittel, typischerweise ein Amin oder eine Amingruppe
(aus einem größeren Molekül) zu umfassen,
das oxidiert werden und sich spontan zersetzen kann, um es in eine
stark reduzierende Spezies umzuwandeln. Es wird angenommen, daß das Amin
oder die Amingruppe ebenfalls von der in das Reaktionssystem eingeführten elektrochemischen
Energie oxidiert wird. Das Amin oder die Amingruppe verliert ein
Elektron und wird dann deprotoniert oder lagert sich selbst zu einem
starken Reduktionsmittel um. Dieses Mittel wechselwirkt mit der
oxidierten metallhaltigen ECL-Gruppe und veranlaßt diese, den angeregten Zustand,
wie oben angesprochen, anzunehmen. Um seine Rolle zu erfüllen, weist
das Amin oder die Amingruppe vorzugsweise ein Radikal mit Kohlenstoffzentrum
und mit einem Elektron auf, das von einem solchen Kohlenstoff abgegeben
werden kann, sowie ein α-Kohlenstoffatom,
das anschließend
als Protonendonor während
der Deprotonierung fungieren kann, um das Reduktionsmittel zu bilden.
Das von einem Amin abgeleitete Reduktionsmittel stellt den notwendigen
Stimulus zur Überführung der
metallhaltigen ECL-Gruppe in ihren angeregten Zustand bereit, aus
dem nachweisbare elektromagnetische Strahlung emittiert wird.
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Ein
weiter Bereich von Aminen und entsprechenden Amingruppen kann bei
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Im allgemeinen wird
das Amin oder die Amingruppe so gewählt, daß es bzw. sie zum pH des Systems
paßt,
das elektrochemolumineszent analysiert werden soll. Ein anderer
relevanter Faktor besteht darin, daß das Amin oder die Amingruppe
mit der Umgebung, in der es bzw. sie während der Analyse funktionieren
muß, kompatibel
sein muß,
das heißt
kompatibel mit einer wäßrigen oder
nichtwäßrigen Umgebung
je nach Lage des Falles. Eine weitere Betrachtung besteht darin,
daß das
gewählte
Amin oder die gewählte
Amingruppe ein von einem Amin abgeleitetes Reduktionsmittel unter
den vorliegenden Bedingungen bilden sollte, welches stark genug
ist, um die oxidierte metallhaltige ECL-Gruppe im System zu reduzieren.
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Amine
(und entsprechende, davon abgeleitete Gruppen), die vorteilhaft
in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind
aliphatische Amine, wie primäre, sekundäre und tertiäre Alkylamine,
deren Alkylgruppen jeweils ein bis drei Kohlenstoffatome aufweisen,
sowie auch substituierte aliphatische Amine. Tripropylamin ist ein
besonders bevorzugtes Amin, da es zu, vergleichend gesagt, besonders
hochintensiver Emission von elektromagnetischer Strahlung fährt, was
die Sensitivität
bzw. Empfindlichkeit und Genauigkeit des Nachweises und der Quantifizierung
der Ausführungsformen,
in denen es verwendet wird, fördert.
Ebenso geeignet sind Diamine wie Hydrazin und Polymine wie Poly(ethylenimin).
Beispiele anderer für
die Ausführung der
Erfindung geeigneter Amine sind Triethanolamin, Triethylamin, 1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-octan, 1-Piperidinethanol,
1,4-Piperazin-bis-(ethansulfonsäure),
Triisopropylamin und Poly(ethylenimin).
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Typischerweise
ist die in der vorliegenden Erfindung verwendete metallhaltige ECL-Gruppe der reaktionsbegrenzende
Bestandteil. Dementsprechend ist es ebenfalls typisch, daß das Amin
oder die Amingruppe in stöchiometrischem Überschuß bezogen
auf dieselbe bereitgestellt wird. Veranschaulichend wird das Amin oder
die Amingruppe in einer Konzentration von 50 bis 150 mM verwendet.
Für die
Verwendung bei einem pH von etwa 7 ist eine Konzentration von 100
mM häufig
vorteilhaft. In bestimmten Ausführungsformen
wird die obere Grenze der Amin- oder Amingruppen-Konzentration durch
die maximale Löslichkeit
des Amins oder der Amingruppe in der Umgebung bestimmt, in der es
verwendet werden soll, beispielsweise in Wasser. Im allgemeinen
wird diejenige Menge an Amin oder Amingruppe verwendet, die ausreicht,
die Umwandlung der oxidierten metallhaltigen ECL-Gruppe in ihren
angeregten Zustand zu bewirken, so daß Lumineszenz auftritt. Der mit
der hier gegebenen Lehre ausgestattete Durchschnittsfachmann kann
die Menge an Amin oder Amingruppe, die für das spezielle, zu analysierende
System vorteilhafter Weise verwendet werden sollte, empirisch ohne übermäßiges Experimentieren
bestimmen.
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Wie
in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung WO 90/05302 beschrieben, werden die Tests der Erfindung
wünschenswerter weise
in Anwesenheit eines Verstärkers
durchgeführt,
typischerweise einer Verbindung der Formel
worin R Wasserstoff oder
C
nH
n2+1, R' C
nH
n2n, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist. Vorzugsweise
kann n von 1 bis 4 sein. Spezifische Beispiele sind im Handel unter
dem Namen Triton X-100 erhältliche
Substanzen der Formel
worin
x 9 bis 10 ist sowie eine Substanz, die im Handel unter dem Namen
Triton N-401 (NPE-40)
erhältlich
ist, der Formel
worin x = 40 ist. Der Verstärker wird
im allgemeinen in einer ausreichenden Menge verwendet, so daß in seiner Anwesenheit
die gewünschte
Steigerung der Emission an elektromagnetischer Strahlung auftritt.
Typischerweise liegt die Menge bei 0,01 % bis 5,0 %, spezifischer
bei 0,1 % bis 1,0 % (Volumen/Volumen).
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Die
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendete ECL-Gruppe wird zur Emission elektromagnetischer
Strahlung induziert, indem man sie in einen angeregten Zustand stimuliert.
Dies erfolgt durch Exposition des Systems, in dem sich die ECL-Gruppe befindet,
an elektrochemische Energie. Das Potential, bei dem die Oxidation
der ECL-Gruppe und
der ein starkes Reduktionsmittel bildenden Spezies auftritt, hängt von
den genauen chemischen Strukturen derselben sowie von Faktoren wie
dem pH des Systems und der Natur der Elektrode, die zum Einführen der
elektrochemischen Energie verwendet wird, ab. Es ist dem Durchschnittsfachmann
bekannt, wie das optimale Potential und die Emissionswellenlänge eines
Elektrochemolumineszenzsystems bestimmt werden. Bestimmte bevorzugte
Verfahren der Stimulation des ECL-Systems sind in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung WO 89/10551 offenbart.
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Vorrichtung
zum Messen der Elektrochemolumineszenz
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Eine
Vorrichtung zur Durchführung
der Tests der Erfindung wird in den 1 und 2 beschrieben. 1 offenbart
eine vorteilhafte ECL-Vorrichtung, die Verfahren der vorliegenden
Erfindung sind jedoch nicht auf die Anwendung in Vorrichtung 10 beschränkt, sondern
können
ebenso in anderen Arten von ECL-Vorrichtungen angewandt werden,
die eine Arbeitselektrode oder eine andere Oberfläche zum
Triggern umfassen, um elektrochemische Energie zum Triggern der
ECL-Gruppe zur Elektrochemolumineszenz bereitzustellen. Während die
Verfahren der Erfindung sowohl im statischen als auch im Durchflußmodus durchgeführt werden
können,
schließt
die Vorrichtung 10 eine Durchflußzelle ein, die bestimmte Vorteile
für zahlreiche
Probenarten bietet, eingeschlossen Proben für Bindungstests. Weitere Details
der Vorrichtung zum Durchführen
der ECL-Tests der Erfindung sind in der WO 90/05411 und WO 90/11511
offenbart.
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Die
Vorrichtung 10 umfaßt
eine elektrochemische Zelle 12, ein Lichtnachweis/-meßbauteil 14,
bei dem es sich vorteilhafterweise um eine Fotomultiplier-Röhre (PMT),
eine Fotodiode, ein ladungsgekoppeltes Bauteil, einen fotografischen
Film oder Emulsion oder ähnliches
handeln kann, sowie eine Pumpe 16, die vorzugsweise eine
peristaltische Pumpe ist, um für
den Fluidtransport zur, durch und aus der Zelle 12 zu sorgen.
Alternativ kann eine Verdränger-Vakuumpumpe
verwendet werden. Ein Shutter- oder Blendenmechanismus 18 ist
zwischen der Zelle 12 und der PMT 14 vorgesehen
und wird steuerbar soweit betrieben, daß er sich nur soweit öffnet, damit
die PMT 14 während
der ECL-Meßperioden
an die Zelle 12 exponiert wird. Der Blendenmechanismus
kann beispielsweise während
der Reinigung oder des Haltens geschlossen sein. Ebenfalls in der
Vorrichtung 10 umfaßt,
jedoch in 1 nicht gezeigt, ist ein lichtdichtes
Gehäuse,
in dem die verschiedenen Komponenten befestigt werden sollen und
welches die PMT 14 vor jeglichem äußeren Licht während der ECL-Messungen
abschirmen soll.
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Die
Zelle 12 selbst umfaßt
einen ersten Befestigungsblock 20, durch den eine Einlaßleitung 22 und eine
Auslaßleitung 24 hindurchführen, die
vorteilhafterweise aus rostfreiem Stahl bestehen. Der Befestigungsblock 20 weist
eine erste äußere Oberfläche 26 und
eine zweite innere Oberfläche 28 auf,
die eine Seite eines Probenaufnahmevolumens 30 der Zelle 12 definiert,
in dem die Zelle 12 die Reinigungs- und/oder Konditionier- und/oder
Meßlösungen während der
entsprechenden Operationen der Vorrichtung 10 aufnimmt.
Die Einlaß- und
Auslaßleitungen 22 und 24 führen durch
den Befestigungsblock 20 von der äußeren Oberfläche 26 zur inneren
Oberfläche 28 und öffnen sich
in das Probeaufnahmevolumen 30. Ein zweiter Befestigungsblock 32, der
vorteilhafterweise aus rostfreiem Stahl besteht, weist ebenfalls
eine erste äußere Oberfläche 34 und
eine zweite innere Oberfläche 36 auf.
Der zweite Befestigungsblock 32 ist vom ersten Befestigungsblock 20 mit
Hilfe eines ringförmigen
Abstandshalters 38 getrennt, der vorteilhafterweise aus
Teflon oder einem anderen nicht kontaminierbaren Material besteht.
Somit definiert die äußere Oberfläche 34 des
Befestigungsblocks 32 einen Teil der zweiten Seite des
Probeaufnahmevolumens 30. Der Abstandshalter 38 weist
einen äußeren Teil 40 und
eine zentrale Öffnung 42 auf,
deren innere Kante 44 die Seitenwandung des Probenaufnahmevolumens 30 definiert.
Der äußere Teil 40 versiegelt
die innere Oberfläche 28 des
ersten Befestigungsblocks 20 mit der äußeren Oberfläche 34 des
zweiten Befestigungsblocks 32, um das Austreten jeglicher
Lösung
aus dem Probeaufnahmevolumen 30 zwischen den beiden Oberfläche 28 und 34 zu
verhindern. Der Befestigungsblock 32 weist weiterhin eine
zentrale Öffnung 46 auf,
in der ein Fenster 48 versiegelt eingepaßt ist,
um den Rest der zweiten Seite des Probeaufnahmevolumens 30 als
Fortsetzung der äußeren Oberfläche 34 zu
definieren. Das Fenster 48 besteht aus einem Material,
das bei der Wellenlänge
des von der ECL-Gruppe emittierten Elektrochemolumineszenzlichts
im wesentlichen transparent ist. Das Fenster 48 ist daher
vorteilhafterweise aus Glas, Plastik, Quarz oder dergleichen gebildet.
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Die
Einlaßleitung 22 trifft
an einem ersten Ende 50 desselben auf das Probeaufnahmevolumen 30,
in der Nähe
des Abstandshalters 38, und die Auslaßleitung 24 schneidet
das Probeaufnahmevolumen 38 an einem zweiten Ende 52 desselben,
in der Nähe
des Abstandshalters 38. Die Kombination aus Einlaßleitung 22, Probeaufnahmevolumen 30 und
Auslaßleitung 24 stellt
so einen kontinuierlichen Durchstrompfad für den engen, im wesentlichen
laminaren Strom einer Lösung
zur, durch und aus der Zelle 12 bereit. Die Pfeile A und
B zeigen die Strömung
in die Einlaßleitung 22 bzw.
aus der Auslaßleitung 24 heraus
an.
-
Auf
der inneren Oberfläche 28 des
ersten Befestigungsblocks 20 ist ein Arbeitselektrodensystem 54 befestigt,
welches in der veranschaulichten Ausführungsform eine erste und zweite
Arbeitselektrode 56 bzw. 58 umfaßt. Bei
anderen Ausführungsformen
kann eine einzelne Arbeitselektrode vorteilhafterweise bereitgestellt
werden oder kann nur die Elektrode 56 eine Arbeitselektrode
sein. Die Arbeitselektroden 56, 58 sind die Orte,
an denen die elektrochemischen und ECL-Reaktionen von Interesse
ablaufen können.
Die Arbeitselektroden 56, 58 sind feste voltametrische
Elektroden und können
daher vorteilhafterweise aus Platin, Gold, Kohlenstoffen oder anderen
Materialien aufgebaut sein, die zu diesem Zweck wirksam sind. Drahtverbindungen 60 und 62,
die mit den Arbeitselektroden 56 bzw. 58 verbunden
sind, führen
durch den ersten Befestigungsblock 20 nach außen.
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Die
Verbindungen 60 und 62 werden beide mit einem
ersten Arbeitselektrodenterminal 64 einer Spannungssteuerung 66 verbunden,
wie in 2 gezeigt. Die Spannungssteuerung 66 arbeitet
vorteilhafterweise in der Art eines Potentiostaten, um Spannungssignale
an den Arbeitselektroden 56, 58 bereitzustellen
und wahlweise während
einer ECL-Messung von diesen abfließende Ströme zu messen. Alternativ können die
Leitun gen 60 bzw. 62 mit verschiedenen Terminals
der Spannungskontrolle 66 für unabhängigen Betrieb verbunden sein.
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Der
Potentiostatbetrieb der Spannungskontrolle 66 wird außerdem über eine
Gegenelektrode 68 und wahlweise, jedoch vorteilhafterweise
eine Bezugs- oder Referenzelektrode 70 bewirkt. In der
veranschaulichten Ausführungsform
besteht der Befestigungsblock 32 aus rostfreiem Stahl und
die Gegenelektrode 68 besteht aus den exponierten Oberflächen 72, 74 des
Befestigungsblockes 32. Die Gegenelektrode 72, 74 und die
Arbeitselektroden 56, 58 stellen die Schnittfläche zum
Aufbringen der Spannung auf die Lösung im Probeaufnahmevolumen 30 bereit,
welche die chemischen Reaktionen energetisiert und die Elektrochemolumineszenz
in der Probe triggert und/oder die Energie für Reinigung und Konditionierung
der Oberflächen
der Zelle 12 bereitstellt. Die Gegenelektrode 72, 74 ist über eine
Drahtleitung 76 mit einem zweiten "Gegenelektroden"-Terminal 78 der Spannungssteuerung 66 verbunden.
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Die
Referenzelektrode 70 stellt eine Bezugsspannung bereit,
auf die die auf die Arbeitselektroden 56, 58 aufgebrachte
Spannung bezogen wird, beispielsweise +1,2 Volt gegenüber der
Referenz. Die Referenzelektrode 70 ist vorteilhafterweise
in der Auslaßleitung 24 in
einer Position 80 angeordnet, die von der Zelle 12 beabstandet
ist, und ist über
eine Drahtleitung 82 mit einem dritten, "Referenzelektroden"-Terminal 84 der Spannungssteuerung 66 verbunden.
Im Drei-Elektroden-Modus muß kein
Strom durch die Referenzelektrode 70 fließen. Die
Referenzelektrode 70 kann im Drei-Elektroden-Modus des Betriebs
eingesetzt werden, um eine vergiftete, bekannte und stabile Spannung
bereitzustellen und besteht daher vorteilhafterweise aus Silber/Silberchlorid
(Ag/AgCl) oder stellt eine gesättigte
Calomelelektrode (SCE) dar. Die Spannungssteuerung 66 kann in
einem Zwei-Elektroden-Modus des Betriebs unter Verwendung nur der
Arbeitselektrode 56 und der Elektrode 58 als Gegen-/Referenzelektrode
betreibbar sein. In diesem Zwei-Elektroden-Modus des Betriebs ist
die Gegen-/Referenzelektrode 58 elektrisch mit den Spannungssteuerungsterminals 78 und 84 auf
der Spannungssteuerung 66 verbunden. In diesem Falle arbeitet
die Spannungssteuerung 66 im wesentlichen als Batterie.
Die Spannungssteuerung 66 stellt Spannungssignale an den Arbeits-
und Gegenelektroden 56 und 58 zur Verfügung und
mißt wahlweise
den durch die jeweiligen Elektroden fließenden Strom. Die Referenzelektrode 70 kann
alternativ eine sog. "Quasi-Referenzelektrode" darstellen, die
aus Platin, Gold, rostfreiem Stahl oder anderen Materialien besteht,
die für
eine weniger stabile Spannung sorgen, jedoch eine, die bezüglich der
kontaktierten Lösung
meßbar
ist. Sowohl im Zwei- als auch im Drei-Elektroden-Modus dient die
Referenzelektrode 70 bzw. 58 dem Zweck der Bereitstellung
einer Referenz, gegen die die auf die Arbeitselektroden 56 aufgebrachte
Spannung gemessen wird. Die vergiftete Spannungsreferenz wird gegenwärtig als
vorteilhafter betrachtet. Die Spannungssteuerung 66 steuert
im Potentiostatbetrieb die verschiedenen Elektroden, indem sie eine
bekannte Spannung an der Arbeitselektrode 56, 58 bezogen
auf die Referenzelektrode 70 bereitstellt, während sie
den Stromfluß zwischen
den Arbeitselektroden 56, 58 und der Gegenelektrode 72, 74 mißt. Potentiostaten
für diese
Zwecke sind wohlbekannt und die Innenstruktur der Spannungssteuerung 66 kann
daher jedem der herkömmlichen,
im Handel erhältlichen
Potentiostaten entsprechen, die die oben genannten Funktionen erfüllen, und
stellt dementsprechend per se keinen Teil der Erfindung dar. Tatsächlich kann
die Vorrichtung 10 alternativ ohne eine interne Spannungssteuerung 66 konstruiert
sein und kann so ausgelegt werden, daß sie an einen externen Potentiostaten
angeschlossen wird, der getrennt gesteuert wird, um die erforderlichen
Spannungssignale an den Elektroden 56, 58, 72, 74 und 70 bereitzustellen.
Diese Spannungssignale, die auf spezifische Weise, wie unten beschrieben,
aufgebracht werden, sorgen für
wiederholbare Anfangsbedingungen für die Oberflächen der
Arbeitselektroden 56, 58 und vorteilhafterweise
für die
Oberflächen
der Zelle 12 insgesamt, ein Merkmal, das signifikant zur
verbesserten Präzision
bei den ECL-Messungen beiträgt.
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Die
Pumpe 16 ist vorteilhafterweise an der Auslaßleitung 24 angeordnet,
um die Lösung
aus einem Probenvolumen in Richtung des Pfeiles A in die Einlaßleitung 22 zu "ziehen". Die Lösung wird
durch die Einlaßleitung 22,
das Probeaufnahmevolumen 30 und die Auslaßleitung 22 an
der Referenzelektrode 70 vorbei und hinaus in Richtung
des Pfeiles B fließen.
Alternativ kann die Pumpe 16 an der Einlaßleitung 22 angeordnet sein,
um die Lösung
durch die Vorrichtung 10 zu "drücken". Vorteilhafterweise
wird derselbe Durchflußweg durch
die Einlaßleitung 22,
das Probeaufnahmevolumen 30 und die Auslaßleitung 24 für alle Lösungen und Fluide
verwendet, die durch die Zelle 12 gelangen, wobei jedes
Fluid eine hydrodynamische Reinigung durchführt, indem es das vorhergehende
Fluid aus der Zelle 12 drängt. Die Pumpe 16 kann
so gesteuert werden, daß sie
ihre Wirkung aussetzt, um eine spezielle Lösung für eine beliebige Zeitspanne
in der Zelle 12 zu halten.
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Die
Durchflußkonstruktion
der Vorrichtung 10 gestattet es, auf die Arbeitselektroden
eine variable Spannung aufzubringen oder diese kontinuierlich bei
einem Prä-Betriebspotential
zu halten, während
sie kontinuierlich an eine oder mehrere Lösungen ausgesetzt sind, ohne
die Arbeitselektroden 56, 58 (oder die Gegen-
und Referenzelektroden 72, 74, 70) an
Luft zu exponieren. Das Exponieren an Luft, das den Stromkreis zur
Referenzelektrode 70 öffnet,
gestattet unbekannte, statistische Spannungsschwankungen, die die
Wiederholbarkeit bzw. Reproduzierbarkeit von Oberflächenbedingungen
auf den Arbeitselektroden 56, 58 zerstören. Die
Durchflußkonstruktion
gestattet den schnellen Wechsel bzw. die schnelle Folge von initialisierenden
Schritten, in denen das Elektrodensystem 54 gereinigt und
konditioniert wird, und Meßschritten,
in denen eine oder mehrere Meßwellenformen
oder "Sweeps" die ECL triggern
bzw. auslösen.
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Die 23 und 24 zeigen
schematisch eine Zelle und Magneten 27/37, die
mit einem Magnetsystem ausgestattet ist, welches vorteilhaft Feldlinien
aufbringt, die weitgehend parallel zur Ebene der Elektrodenoberfläche 56, 58 sind.
Das Magnetsystem besteht aus einer Vielzahl von einzelnen Permanent-
oder Elektromagneten, die gestapelt und so orientiert sind, daß sich die
Nordpole und Südpole
der Magneten 27/37 im Stapel abwechseln. Die einzelnen
Magnete der Magnete 27/37 sind durch Luft oder
anderes nichtmagnetisch ansprechbares Material getrennt. Die Anordnung,
wie sie in den 23 und 24 gezeigt
ist, bringt vorteilhafterweise magnetische Kraftlinien in den Bereich über der
Arbeitselektrode ein, die nahezu horizontal zur Ebene der Elektrode
sind. Dieses induziert eine Orientierung von magnetisch ansprechbaren
Teilchen, in der die Teilchen auf der Oberfläche der Elektrode liegen und
somit für
die elektrochemische Energie, die von der Elektrode bereitgestellt
wird, leicht zugänglich
sind (siehe 20).
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Das
in den 23 und 24 gezeigte
Magnetsystem 27/37 ist außerdem in der Hinsicht vorteilhaft, daß die magnetischen
Feldlinien sich nicht über
weiten Abstand von der Magnetstruktur erstrecken (siehe 20). Es ist daher nicht wahrscheinlich,
daß das
Magnetfeld aus einem solchen Magnetsystem ein permanentmagnetisches
Verhalten oder ferromagnetische Materialien in der Nähe der Elektrodenvorrichtung
induziert oder den Betrieb der Fotomultiplienöhre in der Nähe der Durchflußzelle stark
beeinträchtigt.
Die in 25 gezeigte Vorrichtung entspricht
der in den 1 und 2 gezeigten
und ist, wie oben im Hinblick auf die 1 und 2 beschrieben,
mit der Ausnahme, daß in 25
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung
-
Obwohl
ein großer
Bereich an Teilchen in den auf Teilchen basierenden Tests der Erfindung
verwendet werden kann, haben die Teilchen eine Dichte von 0,5 bis
2 g/ml. Die Auswahl der optimalen Dichte liegt im allgemeinen Fachwissen,
die Ablagerungsrate in auf Schwerkraft beruhenden Tests ist ein
Kompromiß aus
der Geschwindigkeit des Tests und dem Wunsch, eine gleichförmige Schicht
des Komplexes auf der Elektronenoberfläche zu generieren.
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Partikel
mit einem breiten Bereich mittlerer Durchmesser können ebenfalls
verwendet werden. Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser
von 0,01 bis 10 μm
können
verwendet werden.
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Weite
Bereiche der Konzentration der Teilchen in der Testzubereitung können ebenfalls
angewandt werden. Beispielsweise kann die Konzentration von 1 bis
10.000 μg/ml
bis vorzugsweise von 5 bis 1000 μg/ml reichen.
Wünschenswerterweise
werden die Dichte der Teilchen, ihre Größe und ihre Konzentration so
gewählt,
daß sich
die Teilchen mit einer Geschwindigkeit von mindestens 0,5 mm/Minute
und vorzugsweise mit höherer
Geschwindigkeit absetzen.
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Im
Filtermodus der Durchführung
der Erfindung weist die Filtriervorrichtung wünschenswerterweise eine Porengröße, gemessen
als mittlerer Durchmesser, von grob 0,01 bis 90 % des mittleren
Durchmessers der Teilchen und vorzugsweise von 10 bis 90 % dieses
Durchmessers auf.
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Der
Stand der Technik hat eine Anzahl magnetischer Teilchen beschrieben,
die in den Tests der Erfindung eingesetzt werden können. Beispielsweise
beschreiben die US-Patente
der Nrn. 4,628,037, 4,695,392, 4,695,393, 4,698,302, 4,554,088,
die britische Patentanmeldung
GB 2,005,019 A und die
EP 0 180 384 eine Vielzahl von magnetischen
Teilchen, die erfolgreich angewandt werden können. Die Teilchen können paramagnetisch
oder ferromagnetisch sein und können
mit verschiedenen Materialien beschichtet sein, an die bindende
Verbindungen (Andock-Verbindungen) gekuppelt sind, so daß die magnetischen
Teilchen in einem Immunassay genutzt werden können. Wünschenswerterweise zeigen die
in der Erfindung verwendeten magnetischen Teilchen eine Suszeptibilität von mindestens
0,001 cgs-Einheiten; wünschenswerterweise
beträgt
die Suszeptibilität
mindestens 0,01 cgs-Einheiten. Die magnetischen Teilchen können einen
breiten Bereich von Dichten haben, das heißt von im wesentlichen unterhalb
derjenigen von Wasser, 0,01 bis 5 g/ml und vorzugsweise von 0,5
bis 2 g/ml. Die Teilchengröße kann
von 0,001 bis 200, wie 0,001 bis 200 oder 0,05 bis 200 μm reichen
und beträgt
vorzugsweise von 0,01 bis 10 μm.
Die Konzentration der Teilchen kann grob von 1 bis 10.000 μg/ml und
vorzugsweise von 5 bis 1000 μg/ml
betragen.
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Wünschenswerterweise
zeigen die verwendeten magnetischen Teilchen eine niedrige magnetische Resonanz,
wie beispielsweise durch die
EP
0 180 384 beschrieben, so daß sich die Teilchen nach Entfernen des
magnetischen Feldes von der Elektrodenoberfläche entmagnetisieren und aus
der Testzelle gespült
werden können.
Wünschenswerterweise
werden die Dichte, die Konzentration und die Teilchengröße der magnetischen
Teilchen so gewählt,
daß die
Absetzzeit mindestens 0,5 mm/Minute und wünschenswerterweise über dieser
Geschwindigkeit beträgt.
Beim Betrieb der magnetischen Zelle ist es oft wünschenswert, die Magnetvorrichtung
vor dem Induzieren der Elektrochemolumineszenz von der Elektrodenoberfläche zu entfernen,
um nicht mit dem Betrieb der Fotomultiplienöhre wechselzuwirken.
-
Tests
-
Unter
Verwendung der Verfahren der Erfindung können eine Vielzahl von Tests
durchgeführt
werden.
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Ein
Test wurde, wie in 3 gezeigt, durchgeführt. Aus
der Reaktion hervorgehende PCR-Produkte wurden mit Biotin und einem
ECL-Marker (tris-(2,2'-Bipyridin)-Ru
II, Ru (bpy)3 2+)
markiert. Streptavidinkügelchen
fingen die bifunktionalisierte DNS über die Bindung von Biotin
an Streptavidin ein; an dieses schloß sich ein Waschschritt an.
Das an die Kugeln gebundene Produkt wurde anschließend der
Analyse zum Nachweis des ECL-Markers unterworfen.
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Ein
Test wurde, wie in 4 gezeigt, durchgeführt. Das
biotinylierte PCR-Produkt wurde auf Streptavidinkügelchen
gefangen und der nicht-biotinylierte Strang entfernt. Das an die
Kugeln gebundene PCR-Produkt wurde anschließend mit einem ECL-markierten Oligonukleotid
hybridisiert (Ru (bpy)3 2+).
An dieses schloß sich
die ECL-Analyse
zum Nachweis des Markers an.
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Ein
Test wurde, wie in 5 gezeigt, durchgeführt. Die
Hybriden wurden auf Streptavidinkügelchen gefangen. An dieses
schloß sich
eine ECL-Analyse ohne Waschen an.
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Ein
Test wurde durchgeführt
und die Ergebnisse waren wie in 6 gezeigt.
Der Test betraf die Anwesenheit von HPV16 und 18 unter Verwendung
von DNS-Proben, die aus den Zell-Linien SiHa und HeLa, positiv für beide
Virustypen, und von für
jeden Virustyp spezifischen Oligonukleotiden durchgeführt wurden. Die
Primer 2PV16, 2PV18 wurden biotinyliert, und die Primer 3PV16 und
3PV18 waren ECL-markierte Oligonukleotide. Die Oligonukleotide 2/3PV16
bzw. 2/3PV18 waren spezifisch für
HPV16 bzw. HPV18. Die erhaltenen, auf Kugeln gefangenen ECL-Marker
wurden unter Verwendung eines in 1 beschriebenen
Analysators auf ECL analysiert. Die Ergebnisse wurden für jede Kombination
von Probe und Primer als ECL-Zählraten aufgetragen.
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Ein
Test wurde durchgeführt
und die Ergebnisse waren wie in 7 gezeigt.
Der erhaltene, an Kugeln gebundene ECL-Marker wurde auf ECL unter
Verwendung eines in 1 beschriebenen Analysators
analysiert. Die Photonenzählraten
der ECL-Peaks wurden gegen steigende Konzentrationen der HPV16-DNS,
ausgedrückt
als Verhältnis
der vitalen Kopien zu gesamtzellulären DNS-Kopien, aufgetragen.
Bei den in dieser Analyse auf HPV16 verwendeten Primern handelt
es sich um 1PV16 (Biotin-Marker) und 2PV16 (ECL-Marker). Die für jede PCR
verwendete DNS wurde unter Verwendung von Kalbsthymus-DNS konstant
auf 1 μg
gehalten.
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Ein
Test wurde durchgeführt
und die Ergebnisse waren wie in 8 gezeigt.
Die PCR wurde unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nicht
markiertem HRP1 (für
die Sonden 1T24 und 1CHR) und biotinyliertem HRP1 mit nicht markiertem
HRP2 (für
die Sonden 2T24 und 2CHR) durchgeführt, wodurch an Kugeln gebundene
einzelsträngige
Ziele für
die Hybridisierung erzeugt wurden. Bei den DNA-Proben handelt es
sich um das normale Ha-ras-Gen (Placenta) und das mutante Ha-ras-Gen
(NIH3T3-T24). Der Hybridisierung der an die Kügelchen gebundenen DNS mit
ECL-markiertem 1T24 (1T24), ECL-markiertem 2T24 (2T24), ECL-markiertem
1CHR (1CHR) und ECL-markiertem
2CHR (2CHR) folgten Waschungen mit TEMAC. Die daraus resultierenden,
an Kügelchen
gebundenen ECL-Marker wurden auf ECL unter Verwendung eines in 1 beschriebenen
Analysators analysiert. Die Ergebnisse wurden als ECL-Zählraten
für jede
Kombination aus Probe und Sonde aufgetragen.
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Ein
Test wurde durchgeführt
und die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Die PCR wurde, wie in 8 beschrieben, durchgeführt, unter
alleiniger Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nicht markiertem
HRP1 (für
die Sonden 1T24 und 1CHR). Die eingesetzten Sonden waren 1T24 und
1CHR, enthaltend P32 (1T24-P, 1CHR-P) als
Kontrolle. Mit 1T24 und 1CHR, enthaltend sowohl P32 und
den ECL-Marker, zur Bestimmung der Auswirkungen des ECL-Markers.
Die Proben wurden wie zuvor mit TEMAC gewaschen. Das erhaltene,
an Kügelchen
gebundene P32 wurde nach Zugabe eines Szintillisations-Cocktails
in einem Szintillisations-Zählgerät analysiert.
Die Ergebnisse wurden als P32-Zählrate pro
Sekunde für
jede Kombination von Probe und Sonde aufgetragen.
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Ein
Test wurde durchgeführt
und die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
Der Test wurde, wie in 4 beschrieben, durchgeführt. Bei
der Probe handelte es sich um Placenta-DNS und die Amplifikation
erfolgte unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nicht markiertem
HRP1 (für
die Sonden 1T24 und 1CHR). Das erhaltene PCR-Produkt wurde anschließend in
Proben aufgeteilt, um ein Probenset zu erhalten, welches verschiedene
Mengen an Produkt enthielt. Diese Probensets wurden anschließend entweder
mit P32-markierten Sonden (1T24-P32 und
1CHR-P32) oder ECL-markierten
Sonden (1T24-ECL und 1CHR-ECL) hybridisiert. Die Ergebnisse jeder
Untersuchung wurden anschließend
unter Verwendung des mittleren Peaks jedes Markers für die 90 μl Probe normalisiert.
Die normalisierten Werte gestatten einen effektiveren Vergleich
des Verhältnisses
Signal zu Rauschen und den Vergleich des Ansprechens der beiden
Verfahren. Die eingefügte
Abbildung veranschaulicht das Ansprechen im unteren Bereich der
Verdünnungskurve.
Die Proben wurden, wie zuvor beschrieben, behandelt (6 und 8).
-
Ein
Test wurde durchgeführt
und die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
Die PCR wurde unter Verwendung von biotinyliertem 2PV18 und nicht
markiertem 1PV18 unter Verwendung von HeLa-DNS (400 Kopien pro Zelle)
und des in 3 veranschaulichten PCR-Formats
durchgeführt.
Die erhaltene PCR-Reaktion wurde anschließend mit der spezifischen,
ECL-markierten Sonde 3PV18 hybridisiert. Das Hybridisierungsgemisch wurde
anschließend
zu mit Streptavidin beschichteten Kügelchen hinzugefügt und der
daraus erhaltene, an Kügelchen
gebundene ECL-Marker wurde direkt unter Verwendung eines ECL-Analysators,
wie in 1 beschrieben, auf ECL analysiert. Die Ergebnisse
wurden als ECL-Zählraten über der
PCR zugesetzten HPV18-Kopien aufgetragen.
-
Die
folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung gegeben.
-
BEISPIELE
-
Instrumente, Materialien
und Verfahren
-
(1) Instrumente
-
Eine
Durchflußvorrichtung
mit drei Elektroden, wie in
1 und
2 beschrieben,
wurde eingesetzt.
Arbeitselektrode: | Au-Scheibe,
3 mm Durchmesser |
Gegenelektrode: | Au-Scheibe,
3 mm Durchmesser |
Referenzelektrode: | Ag/AgCl |
Dichtungsring
aus Teflon (0,15'' dick) | |
Frontplatte
aus Plexiglas | |
Einlaßleitung: | 0,042'' Innendurchmesser, Polypropylen |
Ansaugraten: | variabel
von 0,01 bis 5 ml/Minute |
Potentiostat: | mikroprozessorgesteuert |
Luminometer, mit Hamamtsu R374 Fotomultiplienöhre (niedrige
Verstärkung,
rotempfindliche Röhre),
Fotomultiplierspannung variabel von 0 bis 1400 Volt. (2)
Materialien
(a)
ECL-Marker: | Ru(bpy)3 2+ |
(b)
ECL-Puffer: | 112
mM KH2PO4, 88 mM
K2HPO4·3H2O, 50 μM
NaCl, 6,5 mM NaN3, 0,8 μM Triton X-100, 0,4 mM Tween
20, 100 mM Tripropylamin in H2O |
(c)
ECL-Verdünner: | 37,5
mM KH2PO4, 109,2
mM K2HPO4·3H2O, 151,7 mM NaCl, 0,65 mM NaN3,
0,43 mM Rinderserumalbumin in H2O |
(d)
Ru(bpy)3 2+-NHS: | Ru(2,2'-bipyridyl)2(4-[3-(1,3-dioxolan-2-yl)-propyl]-4'-methyl-2,2'-bipyridin)2+ |
(e)
Dynal-Teilchen: | (i)
Dynal M-450 Dynakügelchen,
4,5 μm Durchmesser,
superparamagnetische Teilchen, 30 mg/ml, erhalten von Dynal, 45
North Station Plaza, Great Neck, NY 11021
(ii) Dynal M-280
Dynakügelchen,
2,8 μm Durchmesser,
superparamagnetische Teilchen, 10 mg/ml, erhalten von Dynal, 45
North Station Plaza, Great Neck, NY 11021 |
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(3) ECL-Meßzyklus
(Drei-Elektroden-Zellbetrieb)
-
Der
ECL-Meßzyklus
besteht aus drei Stufen: (1) Vorkonditionieren, (2) Messen und (3)
Reinigen. Der Vorkonditionierschritt umfaß das Aufbringen einer Spannungsdreieckswelle
von 0,0 Volt bis +2,2 Volt auf –1,0 Volt
auf +0,6 Volt bei 2,0 Volt/Sekunde. Der Meßschritt umfallt das Ausbringen
einer dreieckigen Wellenform von +0,6 Volt auf 2,8 Volt auf +2,0
Volt bei 1,0 Volt/Sekunde. Der Reinigungsschritt umfaßt das Ausbringen einer
Spannungsviereckswelle von +0,0 Volt auf +3,0 Volt auf –0,5 Volt
auf 0,0 Volt. Alle Spannungen sind auf die Ag/AgCl-Referenzelektrode
bezogen.
-
BEISPIEL 1
-
Vorrichtung und Verfahren
zum Sammeln von Mikroteilchen mittels Schwerkraft
-
Die
Messung erfolgt in einer Zelle, wie sie in 12 gezeigt
ist. Es wird Bezug genommen auf 12, die
eine Vorrichtung zur Durchführung
eines Tests unter Ausnutzung der Schwerkraft zeigt. Die Komponenten der
Vorrichtung umfassen ein transparentes Fenster mit der Bezugsnummer 48,
einen Dichtungsring mit der Bezugsnummer 222, einen Block 20,
der einen Einlaß 22,
eine. Arbeitselektrode 56/58, eine Gegenelektrode 72/74 und
eine Auslaßöffnung 24 umfaßt. Die
Ebene des Zellblocks ist horizontal, das heilst senkrecht zur Richtung
des Schwerkraftfeldes der Erde. Markierte Mikroteilchen (Dynal)
in einem ECL-Puffer werden mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe
zur Zelle gezogen. Die Pumpe wird abgestellt, nachdem die Teilchen
die Zelle erreichten. Die Mikroteilchen in der Zellkammer fallen
auf die Oberfläche
der Arbeitselektrode. Die Geschwindigkeit des Fallens der Mikroteilchen
wird bestimmt, so daß sie
etwa konstant 0,5 mm/Minute über
eine Distanz von 10 mm beträgt,
wie in 13 gezeigt. Die Anzahl der Teilchen,
die sich absetzen, ist eine Funktion der Zeit und der Fallgeschwindigkeit.
Die ECL-Intensität
ist proportional der Anzahl der Teilchen, die sich auf der Arbeitselektrode
absetzen. Die Anzahl der Teilchen, welche die Oberfläche erreichen,
und somit die ECL-Intensität
ist durch die Höhe
der Probenflüssigkeit über der
Arbeitselektrode beschränkt. 14 zeigt
die ECL-Intensität
als Funktion der Ablagerungszeit für zwei Zellen mit verschiedenen
Dichtungsdicken, 0,38 mm (0,015')
bzw. 2 mm (0,075''). Beide Zellen weisen ähnliche
Absetzgeschwindigkeiten der Mikroteilchen auf, die Zelle mit der
dickeren Dichtung ergibt jedoch einen Maximalwert der Ablesung,
der um das fünffache
größer ist.
Die Ergebnisse eines AFP-Tests (Alpha-Fetal-Protein) ist in 15 gezeigt,
welche die beiden Zellen vergleicht. Wiederum ergibt die Zelle mit
der dickeren Dichtung das fünffache
der ECL-Signalintensität.
-
BEISPIEL 2
-
ECL-Vorrichtung und -Verfahren
zur Absetzung von Mikroteilchen
-
Magnetisches Sammeln unter
Verwendung einer Sedimentationszelle.
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Eine
Zelle zur Ausführung
eines Tests unter Anwendung von Magnetkräften, um ein Absetzen von Mikroteilchen
zu verursachen, ist in 16 gezeigt. Die Bezugszahl 48 bezeichnet
ein transparentes Fenster, die Bezugszahl 122 eine Dichtung,
die Bezugszahl 22 den Einlaß in den Zellblock, die Bezugszahl 56/58 die Arbeitselektrode,
die Bezugszahl 24 den Probenauslaß, die Bezugszahl 20 den
Zellblock selbst und die Bezugszahl 27 einen Elektromagneten.
-
Die
Ebene des Zellblocks ist horizontal orientiert. Markierte Mikroteilchen
(Dynal) in ECL-Puffer werden mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe
in die Zelle gezogen. Die Pumpe wird abgestellt, nachdem die Mikroteilchen
die Zelle erreichen. Die Mikroteilchen in der Zellkammer werden
mit Hilfe eines Magnetfeldes zur Arbeitselektrode gezogen, das unter
Verwendung des Elektromagneten 27 erzeugt wird, der bei
12 Volt und 1,5 Ampere arbeitet. Durch Einsatz des Elektromagneten
ist die Absetzgeschwindigkeit der Mikroteilchen wesentlich gegenüber derjenigen
gesteigert, die beobachtet wird, wenn die Mikroteilchen ausschließlich aufgrund
der Schwerkraft absetzen. Dies ist in 17 gezeigt.
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BEISPIEL 3
-
ECL-Vorrichtung und -Verfahren zur Absetzung von Mikoteilchen
-
Magnetisches Sammeln unter
Verwendung einer Sammelzelle.
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Ein
Test wird in einer Zelle durchgeführt, wie in 18 beschrieben.
Unter Bezugnahme auf 18 bezeichnet die Bezugsziffer 48 ein
transparentes Fenster, die Bezugsziffer 132 eine Dichtung,
die Bezugsziffer 22 einen Einlaß in den Zellblock, die Bezugsziffer 56/58 eine
Arbeitselektrode, die Bezugsziffer 20 den Zellblock selbst,
die Bezugsziffer 24 den Probenauslaß und die Bezugsziffer 37 einen
Permanentmagneten.
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Die
Ebene des Zellblocks ist horizontal orientiert. Markierte Mikroteilchen
(Dynal) in ECL-Puffer werden mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe
zur elektrochemischen Zelle gezogen. Vor der Einführung der
Probe wird der Permanentmagnet 37 unmittelbar unterhalb
der Grenzfläche
zwischen Arbeitselektrode/Lösung
in einem Abstand von 0,035 Inch angeordnet. Wenn die Probe zur Zelle
gezogen wird, setzen sich die Mikroteilchen auf einer Fläche über der
Arbeitselektrode ab, wie sie von der Fläche des Magneten definiert
wird. Die Pumpe wird abgestellt und der Magnet entfernt, nachdem
sich die gesamte Probe abgesetzt hat. Je länger die Sammelzeit, desto
mehr Teilchen werden abgelagert. Die Erhöhung der Konzentration der
Teilchen auf der Arbeitselektrode führt zu erhöhter ECL-Intensität, wie in 19 gezeigt.
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BEISPIEL 4
-
Verwendung eines Magneten
zur Ablagerung von Mikroteilchen
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Orientierung des Magnetfelds
-
Mikroteilchen 96, 96', die von einem
Magneten 27/37 angezogen werden, der ein Permanentmagnet oder
ein Elektromagnet sein kann, richten sich mit der Orientierung des
Magnetfeldes 98, 98' wie
in 20 aus, die Magnetfelder 98 und 98' sowie die erhaltenen
Teilchenanordnungen 96 und 96' zeigt, die parallel (A) und senkrecht
(B) zur Oberfläche
der Arbeitselektrode 56/58 in der Nähe dieser
Oberfläche
sind.
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BEISPIEL 5
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Teilchensammlung und Konzentrierung
mittels Filtration
-
Mikroteilchen,
die magnetisch ansprechbar sind, nichtmagnetisch ansprechbar sind
und einen weiten Bereich von Dichten aufweisen, können vorteilhaft
mittels Filtration auf der Oberfläche eines Membranfilters gesammelt
werden. Bei einer Ausführungsform
der Erfindung werden die Teilchen durch einen Teil einer Filtermembran
gepumpt, die Porengrößen aufweist,
die kleiner als der Durchmesser der Teilchen, jedoch vorzugsweise
wesentlich kleiner als der Teilchendurchmesser sind, und zwar bei
einer ausreichend hohen Oberflächendichte,
so daß die
Sammlung der Teilchen kein Verstopfen der Poren verursacht. Der
Filter ist vorteillhfterweise weitgehend transparent, so daß der Filter
nach dem Sammeln der Teilchen auf der Oberfläche einer Arbeitselektrode
zum Zweck des Induzierens der ECL von den Teilchen und Messen der
Lumineszenz angeordnet werden kann, um die Menge des ECL-Markers
auf den Teilchen zu messen.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
wird der Membranfilter mit Porengrößen, wie oben beschrieben, auf
der Oberfläche
eines absorbierenden Materials angeheftet oder auf diesem angeordnet,
so daß Kapillarkräfte oder "Dochtwirkung" spontan die Mikroteilchen
enthaltenden Fluide durch den Membranfilter ziehen, ohne eine Vorrichtung
zum Induzieren eines Fluidstromes durch den Filter zu erfordern.
-
Bei
der bevorzugten Ausführungsform
wird der Membranfilter mit Porengrößen, wie oben beschrieben, mit
einem dünnen
Film aus Metall oder einem anderen elektrisch leitfähigen Material
beschichtet, so daß die Oberfläche der
Membran als Arbeitselektrode in einer ECL-Vorrichtung dienen kann.
Die leitfähigen
Filme lassen sich leicht auf die Oberfläche einer Membran mittels herkömmlich,
bei der Herstellung von mikroelektronischen Bauteilen verwendeten
Verfahren aufbringen, beispielsweise der thermischen Verdampfung
oder dem Sputtern. Eine derartige Filterelektrode läßt sich
leicht in einer Durchflußzelle
befestigen, so daß der
Strömungsweg
für das
Fluid durch die Filterelektrode führt. Teilchen im Strom werden
von der Filterelektrode gefangen und lassen sich leicht in-situ
waschen, wodurch ein schnelles und einfaches Mittel zum Durchführen heterogener
Tests ohne externe Waschvorrichtung bereitgestellt wird.
-
BEISPIEL 6
-
Teilchensammlung und -konzentrierung
mittels eines Zentrifugationsverfahrens
-
Die
in 21 gezeigte, rotierende Durchflußzelle stellt
ein anderes Mittel zum Fangen des Komplexes auf der Oberfläche der
Arbeitselektrode zum Messen der Lumineszenz bereit. Die Testlösung tritt
in die Vorrichtung über
den Einlaß 261 ein
und wird in die Zelle 262 durch die Rotationsdichtung 263 gepumpt,
während die
Zelle in Rotationsbewegung versetzt wird, wie vom Pfeil R angezeigt.
Die dichteren Teilchen des Komplexes werden auf der Oberfläche der
Arbeitselektrode 264 konzentriert. Während die Zelle noch rotiert,
tritt die Lösung
aus der Zelle über
den Auslaß 268 aus.
Der durch das Zellfenster 267 durchtretende Lichtausstoß wird von
der Fotomultiplienöhre 265 gemessen.
Der Lichtausstoß wird
von der vertikalen Arbeitselektrodenoberfläche(n) 264 durch Brechung
an (einer) gebogene(n) Spiegeloberfläche(n) 266 gerichtet,
die in der Mitte der Zelle angeordnet sind; die Gegenelektrode(n) 269 ist
(sind) ebenso gezeigt. Die Zelle wird anschließend gespült und für den nächsten Zyklus gereinigt. Dies
kann bei gestoppter oder rotierender Zelle erfolgen. Die 21 zeigt
somit ein Zentrifugalverfahren und eine Zentrifugationsvorrichtung
der Erfindung zum Fangen von Teilchen, wie auch eine Zentrifugationsdurchflußzelle der
Erfindung.
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BEISPIEL 7
-
Beschichten von Teilchen
mit markiertem, unspezifischen Protein bei mäßiger Oberflächenkonzentration
-
30
mg (1 ml) von unbeschichteten, magnetisch ansprechbaren Polystyrol-M-450-DYNA-BEADS mit 4,5 μm (DYNAL,
Oslo, Norwegen) wurden mittels magnetischer Trennung mit einer 150
mM Phosphatpufferlösung,
pH 7,5, unter Verwendung von 2 ml pro Waschung gewaschen. 150 μg Ru(bpy)3 2+-markierte Mäuse-IgG
(Jackson Immunochemicals) in 1 ml phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS)
mit 0,05 % Thimerasol wurden zu den Teilchen zugefügt. Man
ließ diese
Mischung über
Nacht bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren. Die Lösung wurde
anschließend
magnetisch von den Teilchen getrennt und entfernt. Um nichtreagierte Stellen
zu blockieren, gab man 1 ml 3% BSA/PBS mit 0,05 % Natriumazid zu
den Teilchen hinzu und ließ die erhaltene
Lösung
2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die Teilchen wurden fünfmal (2
ml pro Waschschritt) gewaschen und anschließend letztlich in 6 ml desselben
Puffers zur Lagerung resuspendiert.
-
BEISPIEL 8
-
Elektrochemolumineszenz-Messung
(ECL-Messung) unter Verwendung magnetisch ansprechbarer Teilchen
-
Uniforme
und nicht-uniforme, polymere und nicht-polymere, magnetisch ansprechbare
Teilchen (Dynal, Oslo, Norwegen; Polysciences, Warrington, PA 18976;
Cortex Biochem, San Leandro, CA 94577; Aldrich, Milwaukee, WI 53201)
wurden mit markierten Proteinen, wie in Beispiel 1 beschrieben,
beschichtet. Die beschichteten Teilchen wurden dreimal mit ECL-Puffer
gewaschen, bevor 2 ml einer Suspension mit 300 μg/ml hergestellt wurden. Unter
Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurden 500 μl der Teilchensuspension
in die Durchflußzelle
(Beispiel 3) gezogen. Sowie die Teilchen zur Arbeitselektrode strömten, wurden
sie mit Hilfe eines Magneten angezogen und auf der Oberfläche der
Arbeitselektrode konzentriert. Unter Verwendung der magnetischen
Teilchen wurde die Elektrochemolumineszenz mit Hilfe einer Hamamatsu-R374-Fotomultiplierröhre gemessen,
die über
der Durchflußzelle
dort zentriert war, wo die Teilchen sich auf der Arbeitselektrodenoberfläche konzentriert
hatten. Tabelle I zeigt ECL-Fotoemissionsmengen, die von den mit
markierten Proteinen beschichteten, magnetisch ansprechbaren Teilchen
erhalten wurden.
-
Tabelle
I ECL-Messungen
aus verschiedenen magnetisch ansprechbaren Teilchen
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BEISPIEL 9
-
Elektrochemolumineszenz-Messung
(ECL-Messung) unter Verwendung nicht-magnetischer Teilchen
-
Uniforme
und nicht-uniforme, polymere und nicht-polymere, nicht magnetisch
ansprechbare Teilchen (Aldrich, Milwaukee, WI 53201; Duke Scientific,
Palo Alto, CA 94303) wurden mit markierten Proteinen, wie in Beispiel
7 beschrieben, beschichtet. Die beschichteten Teilchen wurden dreimal
mit ECL-Puffer gewaschen, bevor 2 ml einer Suspension mit 300 μg/ml hergestellt
wurden. Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurden 500 μl der Teilchensuspension
in die Durchflußzelle
gezogen. Die beschichteten Teilchen wurden anschließend auf
der Arbeitselektrode über
eine Gravitationsvorrichtung konzentriert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die nicht magnetische Teilchen verwendende Elektrochemolumineszenz
wurde mir einer Hamamatsu-R374-Fotomultiplienöhre gemessen,
die über
der Durchflußzelle
dort zentriert war, wo sich die Teilchen auf der Arbeitselektrodenoberfläche konzentriert
hatten. Tabelle II zeigt die von den beschichteten nicht magnetischen
Teilchen erhaltenen ECL-Fotoemissionsmengen.
-
Tabelle
II ECL-Messung
von nicht magnetisch ansprechbaren Teilchen mittels Sammlung über Schwerkraft
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BEISPIEL 10
-
Herstellung von beschichteten
Dynal-Teilchen, auf denen Schaf Anti-Thyroid Stimulierendes Hormon
(TSH) physilcalisch adsorbiert ist (REAGENZ I)
-
1
ml von 4,5 μm
unbeschichteten, magnetischen Polystyrolteilchen mit -OH-Resten
auf ihrer Oberfläche
(DYNAL, DYNABEADS M-450, DYNAL A.S. Oslo, Norwegen) wurde mittels
magnetischer Trennung mit einer 150 mM Natriumcarbonat/Bicarbonat-Lösung, pH 9,6, unter Verwendung
von 2 ml pro Waschung gewaschen. 0,5 mg affinitätsgereinigte Schaf Anti-TSH,
HCG-gereinigte Antikörper
(CIBA) in 1 ml der Carbonat/Bicarbonat-Lösung wurden zu den Teilchen
zugegeben. Diese Mischung wurde über
Nacht bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Die Lösung wurde
anschließend
magnetisch von den Teilchen getrennt und entfernt. Man gab 1 ml
3 BSA/PBS w/ mit 0,05 % Natriumazid hinzu und inkubierte 2 Stunden
bei Raumtemperatur unter Rühren,
um nicht reagierte Stellen zu blockieren. Die Teilchen wurden fünfmal gewaschen
(2 ml pro Waschung) und dann letztlich in 1 ml desselben Puffers
zum Lagern resuspendiert. Die Endkonzentration des Kugelreagenz
I betrug 3 Gew.-%.
-
BEISPIEL 11
-
Herstellung eines Ouabain-BSA-Konjugats
(REAGENZ II)
-
AKTIVIERUNG DES OUABAINS:
-
60,4
mg Ouabinoctahydrat (Aldrich, Katalog # 14, 193-3) in 6 ml entionisiertem
H2O (di) (in Folie gewickelt) wurde mit
87 mg Natriummetaperiodat (Mallinckrodt, Katalog # 1139) gemischt
und die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang unter Rotation
inkubiert. Die Reaktion wurde durch Überleiten des Reaktionsgemisches über ein
Dowex 1 × 8 – 50 Ionenaustauscherharz
(Aldrich, Katalog # 21, 740–9)
mir entionisiertem Wasser beendet. 200 μl 1 M Natriumphosphat, pH 7,2,
wurde zum Einstellen des pH der Lösung auf 7,0 hinzugegeben.
-
KONJUGIEREN DES AKTIVIERTEN
OUABAINS AN BSA:
-
50
mg des aktivierten Ouabains (4,6 ml) wurden dann tropfenweise zu
108 mg Rinder– serumalbumin BSA,
Miles-Fraktion V) in 5 ml 0,15 M PBS, pH 7,8, zugegeben. Dies ist
ein Verhältnis
von 40:1 (Ouabain:BSA). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2
Stunden lang inkubiert, gemischt, gefolgt von schneller Zugabe von 30
mg Natriumcyanoborhydrid unter Mischen. Freies Ouabain und überschüssiges Natriumcyanobor hydrid wurden
mittels Dialyse bei 4 °C
in 0,15 M PBS w/ 0,05 % Natriumazid, 7,8 pH, entfernt. Das Ouabain-BSA-Konjugat
als Reagenz II wurde bei 4 °C
gelagert.
-
BEISPIEL 12
-
Herstellung von Dynal-Teilchen,
beschichtet mit physikalisch adsorbiertem Ouabain-BSA (REAGENZ II)
-
5
mg 4,5 μm
unbeschichtete, magnetische Polystyrolteilchen mit -OH-Resten auf
ihrer Oberfläche (DYNAL,
DYNABEADS M-450, DYNAL A.S. Oslo, Norwegen) wurden mittels magnetischer
Trennung mit einer 150 mM Natriumcarbonat/Bicarbonat-Lösung, pH
9,6, unter Verwendung von 10 ml pro Waschung gewaschen. 3 mg des
Ouabain-BSA-Konjugats
(Konjugatreagenz II) wurden in 5 ml der Carbonat/Bicarbonat-Lösung zu den
Teilchen zugegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur
unter Rotation inkubiert. Die Lösung
wurde anschließend
magnetisch von den Teilchen getrennt und entfernt. Man gab 5 ml
3 % BSA/PBS w/ 0,05 % Natriumazid hinzu und inkubierte 2 Stunden
bei Raumtemperatur unter Rotation zum Blockieren nicht reagierter
Stellen. Die Teilchen wurden fünfmal
gewaschen (10 ml pro Waschung) und dann letztlich in 1 ml desselben
Puffers zur Lagerung resuspendiert. Die Endkonzentration des Kugelreagenz
III betrug 3 Gew.-%.
-
BEISPIEL 13
-
Herstellung von mit Ru(bpy)3 2+-markiertem Maus
Anti-Dioxin (REAGENZ IV)
-
1
mg Maus Anti-Digoxin (Cambridge Medical Technologies, Katalog #
200-014 Charge A3574) wurde mit Ru(bpy)3 2+ markiert. Der monoklonale Antikörper (MAb)
Anti-Digoxin-Antikörper wurde
unter Verwendung eines Centricon-30-Mikrokonzentrators (Amicon)
in 0,15 M Kaliumphosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,8, puffergetauscht,
wobei das Endvolumen 0,5 ml betrug. Unmittelbar vor der Verwendung
wurden 0,5 mg Ru(bpy)3 2+-NHS
mit 125 μl
wasserfreiem Dimethylsulfoxid (Aldrich) gelöst. Um ein Molverhältnis von
25:1 von Ru(bpy)3 2+ zu
Protein auf Basis von Molekulargewichten von 1057 bzw. 150.000 zu
erzielen, wurden 0,18 mg Ru(bpy)3 2+-NHS (45 μl) zur Proteinlösung unter
Schütteln
zugegeben. Das Reaktionsröhrchen
wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 Minuten unter Schütteln inkubiert.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl 1 M Glyzin beendet und 10
Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Überleiten über eine
Sephadex G – 25
Säule (1 × 20
cm in 0,15 M Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl mit 0,05 % Natriumazid,
pH 7,2) gereinigt. Die mit Ru(bpy)3 2+-markierten Maus Anti-Digoxin-Fraktionen
wurden gesammelt und vereinigt. Das markierte Protein (Reagenz IV)
wies gemäß Bestimmung
12 Marker pro Proteinmolekül
auf.
-
BEISPIEL 14
-
Herstellung von mit Ru(bpy)3 2+-markiertem Maus
Anti-Thyroid Stimulisierendes Hormon (TSH)
-
(REAGENZ V)
-
0,5
mg Maus Anti-TSH (CIBA) wurde mit Ru(bpy)3 2+ markiert. Der MAb Anti-TSH-Antikörper wurde
einem Pufferaustausch unter Verwendung eines Centricon-30-Mikrokonzentrators
(Amicon) in 0,15 M Kaliumphosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,8, unterzogen,
wobei das Endvolumen 0,35 ml betrug. Unmittelbar vor der Anwendung
wurden 0,5 mg Ru(bpy)3 2+-NHS
in 75 μl
wasserfreiem Dimethylsulfoxid (Aldrich) gelöst. Um ein Molverhältnis von
50:1 von Ru(bpy)3 2+ als
Marker zu Protein zu erzielen, bezogen auf Molekulargewichte von 1057
bzw. 150.000, wurden 0,176 mg Ru(bpy)3 2+-NHS (26,4 μl) zur Proteinlösung unter
Schütteln
hinzugegeben. Das Reaktionsröhrchen
wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 Minuten lang unter Schütteln inkubiert. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl 1 M Glyzin beendet und 10
Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Überleiten über eine
Sephadex G – 25
Säule (1 × 20
cm in 0,15 M Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl mit 0,05 % Natriumazid,
pH 7,2) gereinigt. Die mit Ru(bpy)3 2+-markierten Maus Anti-TSH-Fraktionen wurden
gesammelt und vereinigt. Das markierte Protein (Reagenz V) wies
nach Bestimmung 14 Marker pro Protein auf.
-
BEISPIEL 15
-
Einstufiger Trenn-Sandwich-Test
auf das Thyroid-stimulierende Hormon (Thyroid Stimulating Hormone)
(TSH)
-
100 μl Serum-Kalibratoren
(London Diagnostics TSH LumiTAG Kit), 25 μl Ru(bpy)3 2+-markiertes Maus Anti-TSH (Reagenz V) in
ECL-Puffer und 25 μl
Schaf Anti-TSH-Dynal-Teilchen (Reagenz n in ECL-Puffer wurden vereinigt
und in Polypropylenröhrchen
15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Anschließend wurden
die Teilchen mittels magnetischer Trennung gewaschen und dann in
500 μl ECL-Puffer
resuspendiert. Dieses Waschverfahren wurde zwei weitere Male wiederholt.
Schließlich
wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer resuspendiert. Die Elektrochemolumineszenz
(ECL) wurde für
jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten
sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten direkt
proportional (steigende Zählraten
mit steigenden Konzentrationen an Analyten). Tabelle III zeigt eine
repräsentative
Testkurve.
-
Tabelle
III Einstufiger
Trenn-Sandwich-Test: Nachweis von TSH
-
BEISPIEL 16
-
Einstufiger Sandwich-Test
ohne Trennung auf das Thyroid-stimulierende Hormon (Thyroid Stimulating
Hormone) (TSH)
-
100 μl Serum-Kalibratoren
(London Diagnostics), 25 μl
Ru(bpy)3 2+-markiertes
Maus Anti-TSH (Reagenz V) in ECL-Puffer und 25 μl Schaf Anti-TSH-Dynal-Teilchen
(Reagenz n in ECL-Puffer wurden vereinigt und in Polypropylenröhrchen 15
Minuten lang bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Vor dem
Ablesen der Ergebnisse wurde 1 ml ECL-Puffer zugegeben. Die Elektrochemolumineszenz
(ECL) wurde für
jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten
sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten direkt
proportional (steigende Zählraten
mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle IV zeig eine
repräsentative
Testkurve.
-
Tabelle
IV Einstufiger
Sandwich-Test ohne Trennung: Nachweis von TSH
-
BEISPIEL 17
-
Zweistufiger kompetitiver
Test auf Digoxin mit Trennung
-
50 μl Serum-Kalibrator
(TDx-Test, Abbott Labs, Chicago; II,) und 25 μl mit Ru(bpy)3 2+-markierter Maus Anti-Digoxin (Reagenz
In in ECL-Puffer wurden vereinigt und 20 Minuten bei Raumtemperatur
unter Mischen inkubiert. Man gab 25 μl Ouabain-BSA-DYNAL-Teilchen (Reagenz III) in
ECL-Puffer hinzu und inkubierte weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur
unter Mischen. Die Teilchen wurden anschließend mittels magnetischer Trennung
gewaschen und dann in 500 μl
ECL-Puffer resuspendiert. Dieser Waschvorgang wurde zwei weitere Male
wiederholt. Schließlich
wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer resuspendiert. Die Elektrochemolumineszenz
(ECL) wurde für
jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten
sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten umgekehrt
proportional (abneh mende Zählraten
mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle V zeigt eine
repräsentative
Testkurve.
-
Tabelle
V Zweistufiger
kompetitiver Test mit Trennung: Nachweis von Dioxin
-
BEISPIEL 18
-
Zweistufiger kompetitiver
Test auf Digoxin ohne Trennung
-
50 μl Serum-Kalibrator
(TDx-Test, Abbott Labs, Chicago, IL) und 25 μl mit Ru(bpy)3 2+ -markierter Maus Anti-Digoxin (Reagenz
IV) in ECL-Puffer wurden vereinigt und 20 Minuten bei Raumtemperatur
unter Mischen inkubiert. Man gab 25 μl Ouabain-BSA-DYNAL-Teilchen (Reagenz
III) in ECL-Puffer hinzu und inkubierte weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur
unter Mischen. Vor dem Ablesen wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer resuspendiert.
Die Elektrochemolumineszenz (ECL) wurde für jede Probe, wie in Beispiel
3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten sind der Konzentration
des in der Probe vorhandenen Analyten umgekehrt proportional (absteigende
Zählraten
mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle VI zeigt eine
repräsentative
Testkurve.
-
Zweistufiger
kompetitiver Test ohne Trennung: Nachweis von Digoxin Tabelle
VI
-
BEISPIEL 19
-
Zweistufiger kompetitiver
Test auf Digoxin ohne Trennung unter Anwendung eines Ablesezyklus
mit zusätzlichem
Waschen vor der letztlichen Reaktion der Probe auf der Elektrode
-
50 μl Serum-Kalibrator
(TDx-Test, Abbott Labs, Chicago, II.) und 25 μl mit Ru(bpy)3 2+ -markierter Maus Anti-Digoxin (Reagenz
IV) in ECL-Puffer wurden kombiniert und 20 Minuten bei Raumtemperatur
unter Mischen inkubiert. Man gab 25 μl Ouabain-BSA-DYNAL-Teilchen (Reagenz III) in
ECL-Puffer hinzu und inkubierte weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur
unter Mischen. Vor dem Ablesen wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer
resuspendiert. Die Elektrochemolumineszenz (ECL) wurde für jede Probe,
wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten
sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten umgekehrt
proportional (abnehmende Zählraten
mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle VII zeigt eine repräsentative
Testkurve.
-
Tabelle
VII Zweistufiger
kompetitiver Test mit Trennung: Nachweis von Digoxin
-
BEISPIEL 20
-
Oligonukleotid-Synthese
-
Die
Oligonukleotide wurden auf einem automatischen Oligonukleotid-Synthesegerät von Applied
Biosystems unter Verwendung des ß-Cyanoethylphosphoramidits
(1) hergestellt. Die Aminomodifikationen am 5'-Ende des Oligonukleotids erfolgte beim
letzten Kupplungsschritt und am 3'-Ende unter Verwendung einer modifizierten
festen Phase (Glas mit kontrollierten Poren). Clontech (San Diego,
CA) stellte die Aminomodifikatoren zur Verfügung. Die erhaltenen, am 5'-Terminus modifizierten
Oligonukleotide enthielten alle einen Spacer-Arm von sechs Kohlenstoffatomen
an der bezeichneten Aminogruppe (C6, NH2). Die am 3'-Ende modifizierten
Oligonukleotide enthielten alle einen Drei-Kohlenstoff-Spacer an
der Aminogruppe. Die konstruierten Oligonukleotide, deren Modifikationen
und Verwendungen sind unten beschrieben.
-
Die
Oligonukleotide für
die Untersuchung von HPV wurden gegen die E6-Region, wie zuvor beschrieben
(2), gerichtet.
-
Die
Oligonukleotid-Sequenzen waren wie folgt:
-
Diese
Oligonukleotide ermöglichen
die PCR-Erzeugung verschiedener Fragmente; 3PV16 oder 3PV18 mit
2PV 16 oder 2PV18 bilden ein 62 bp-Fragment; 1PV16 mit 2PV16 bilden
ein 100 bp-Fragment; 1PV18 mit 2PV18 bildet ein 103 bp-Fragment.
Es ist ersichtlich, daß die
3PV16- und 3PV 18-Oligonukleotide ebenfalls als Sonden verwendet
werden können,
die an die Produkte aus der PCR-Reaktion von 1PV16 mit 2PV16 und
1PV18 mit 2PV18 hybridisieren, wie auch mit dem Strang hybridisieren,
der von den Oligonukleotiden 2PV16 und 2PV18 in der PCR erzeugt
wird. Bei den Oligonukleotiden für
die Tests auf die Ha-ras-Punktmutation handelte es sich um folgende:
HRP1
5' (C6, NH2) GCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTG;
HRP2
5' (C6, NH2) TTCTGGATCAGCTGGATGGTCAGCGCACTC;
-
Diese
zwei Oligonukleotid-Primer dirigieren die PCR-Synthese eines 80
bp-Fragments. Die Sequenzen der für diese Untersuchung der Punktmutation
verwendeten Sonden waren wie folgt:
-
Neben
diesen Sequenzen haben wir außerdem
die obigen 1CHR- und 2T24-Sequenzen ohne die 5'-Aminomodifikation jedoch mit einer
3'-Aminogruppe synthetisiert.
Diese am 3'-Ende
aminomodifizierten Oligonukleotide wurden mit dem ECL-Marker markiert
und bei den Hybridisierungen verwendet. Die Stelle einer Mutation/einer
Fehlpaarung wird vom Nukleotid insgesamt angezeigt. Die Sonden 1T24
und 1CHR hybridisieren mit dem durch das Oligonukleotid HRP2 in
der PCR erzeugten Strang. Die Sonden 2T24 und 2CHR hybridisieren
mit dem über
das Oligonukleotid HRP1 in der PCR erzeugten Strang.
-
Die
Oligonukleotide JK8 und JK8C zum Kuppeln an die Teilchen sind:
JK8
5' (C6, NH2)GTCCAATCCATCTTGGCTTGTCGAAGTCTGA
JK8C
5' (C6, NH2)TCAGACTTCGACAACCCAAGATGGATTGGA1C.
-
Diese
beiden Sequenzen leiten sich von Aequorin-Sequenzen ab und sind
einander komplementär.
JK7
5'TCAGACTTCGACAA
(NH2) CCCAAGATGGATTGGA:
-
Dieses
Oligonukleotide wurde unter Verwendung eines Amino-Modifikators
von Clontech (San Diego, CA) aminomodifiziert, der Amino-Modifikationen
innerhalb der Sequenz gestattet. JK7 wurde unter Verwendung des
Ru(bpy)3 2+-Markers
markiert. Die Oligonukleotidsonde auf Aequorin-RNS, erzeugt durch
in-vitro-Transkription:
T35 5' (NH2)GATTTTTCCATTGTGGTTGACATCAAGGAA;
-
Dieses
Oligonukleotid wurde sowohl mit Biotin als auch dem Ru(bpy)3 2+-Marker markiert.
Zum Nachweis von Escherichia-coli-DNS haben wir Oligonukleotide
synthetisiert, die spezifisch für
den Trp E/D-Bereich des Genoms (3) sind, wie folgt:
TRP.C03
5' (C6,NH2)GCCACGCAAGCGGGTGAGGAGTTCC(NH2);
diese
Sequenz wurde mit dem Ru(bpy)3 2+-Marker
markiert und das
TRP.C04 5' (C6,
NH2)GTCCGAGGCAAATGCCAATAATGG
wurde mit Biotin, wie im folgenden
beschrieben, markiert.
-
BEISPIEL 21
-
Markierung von Oligonukleotiden
-
Alle
synthetischen Oligonukleotide wurden mittels Gelfiltration auf einer
Biogel-P6-Säule (BioRad Labs)
gereinigt, um alle kontaminierenden Aminogruppen zu entfernen. Biotin
wurde über
die 5'-Aminogruppe des
PCR-Primers unter Verwendung von NHS-Biotin (Clontech, San Diego, CA) (4)
eingeführt.
Das Ru(bpy)3 2+-NHS
wurde über
die Aminogruppe des modifizierten Oligonukleotids wie folgt eingeführt. Die
Oligonukleotide (0,1 μMol)
in 100 μl
PBS (pH 7,4) wurden mit 5 μMol
in DMSO gelöstem
Ru(bpy)3 2+-Marker über Nacht
bei Raumtemperatur im Dunkeln umgesetzt. Die Oligonukleotide wurden
aus diesen Markierungsreaktionen mittels Ethanolfällung wiedergewonnen.
Jüngste
Untersuchungen haben die Möglichkeit
belegt, unter Verwendung 0,5 μMol
des Ru(bpy)3 2+-Markers
effektiv zu markieren (> 80
% ) (Daten nicht gezeigt).
-
Die
markierten Oligonukleotide wurden weiter mittels HPLC auf einer
Umkehrphasen-Vydac-C-18-Semiprep-Säule mit
mobilen Phasen von A) 100 mM Tetraethylammoniumacetat, pH 7,0, und
B) 50 % A) und 50 % Acetonitril weiter gereinigt, wobei der Gradient
von 20 % bis 40 % B gefahren wurde.
-
Die
Sonden 1CHR und 1T24 wurden außerdem
mit P32 unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase und
Anwendung etablierter Verfahren markiert, wodurch Proben mit einer
spezifischen Aktivität
von 77.000 cpm/ng erzeugt wurden (5).
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BEISPIEL 22
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Herstellung
von magnetischen Nukleinsäure-Teilchen
-
Dynal-M-450-Teilchen
wurden mit 2-Fluor-1-methylpyridintoluol-4-sulfonat unter Verwendung
von Standardverfahren (6) aktiviert. Diese aktivierten Teilchen
wurden anschließend
mit den Oligonukleotiden JK8 und und JK8C umgesetzt. Zu 100 mg der
aktivierten Dynal-Teilchen wurden 33 nMol der Oligonukleotide in 650 μl 0,1 M NaHCO3 zugegeben, gefolgt von Inkubieren für 3 Stunden
unter Mischen. Die Teilchen wurden durch Zugabe von Ethanolamin
(4 ml, 0,1 M) blockiert. Die gekoppelten Teilchen wurden mit 0,5
mg/ml Einzelstrang-Lachssperma-DNS in ECL-Puffer gemischt, vier-
bis fünmal
mit ECL-Puffer gewaschen und auf 10 mg/ml in ECL-Puffer resuspendiert,
der 100 μg/ml
Einzelstrang-Lachssperma-DNS enthielt.
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BEISPIEL 23
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Herstellung
von magnetischen Streptavidin-Teilchen I
-
Dynal-M-450-Teilchen
wurden mit 2-Fluor-1-methylpyridintoluol-4-sulfonat unter Verwendung
von Standardverfahren (6) aktiviert. Die aktivierten Teilchen wurden
anschließend
mit Streptavidin (Sigma Ltd.) umgesetzt. Die aktivieren Teilchen
(50 mg) wurden mit 0,1 M NaHCO3 gewaschen,
gefolgt von Zugabe des Streptavidins (1,5 mg), und über Nachr
reagieren gelassen. Die Teilchen wurden durch Zugabe von Ethanolamin
(4 ml, 0,1 M) blockiert. Die gekoppelten Teilchen wurden mit 0,5
mg/ml Einzelstrang-Lachssperma-DNS in ECL-Puffer gemischt, vier-
bis fünfmal
in ECL-Puffer gewaschen und bei 10 mg/ml in ECL-Puffer resuspendiert,
der 100 μg/ml
Einzelstrand Lachssperma-DNS enthielt. Die Streptavidin-Teilchen
aus Dynal M-280 erwiesen sich ebenfalls als wertvoll, ergaben jedoch
mit der gegenwärtigen
Testsequenz niedrigere Signale. Für Anwendungen in Immunoassays
wurden die Teilchen mit BSA nach der Antigen- oder Antikörper-Kupplung blockiert,
unter Verwendung von für
die passive Beschichtung verwendeten Puffern.
-
BEISPIEL 24
-
Herstellung
von magnetischen Streptavidin-Teilchen II
-
Zu
15 mg BSA (in 2–3
ml BPS) gab man 105 μl
Dimethylsulfoxid, enthaltend 50 mg/ml Biotin-x-NHS (Clontech, San
Diego, CA. 5002-1) hinzu, gefolgt von Mischen und Inkubieren bei
Raumtemperatur für
30 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 30 μl 1 M Glyzin
und Inkubation bei Raumtemperatur 10 Minuten gestoppt. Das Reaktionsgemisch
wurde durch Gelfiltrationschromatographie (BioRad, Bio-Gel P6) gereinigt. Dieses
Biotin-BSA wurde unter Verwendung einer 0,2 μm Spritze filtriert. 5 mg Biotin-BSA
in 10 ml 0,2 M Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, (Carbonat/Bicarbonat)-Puffer
wurde zu 300 mg Dynabeads zugegeben, gewaschen mit Carbonat/Bicarbonat
(Dynal 14002). Diese Mischung wurde auf einem Vortex-Mischer gemischt
und über
Nacht bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Diese Teilchen
wurden magnetisch getrennt, gefolgt von Zugabe von 10 ml ECL-Verdünner und
100 μl tRNS
(10 mg/ml). Diese Mischung wurde 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur
unter Mischen inkubiert. Die Teilchen wurden einmal mit 10 ml ECL-Verdünner gewaschen
und in 10 ml ECL-Verdünner
und 100 μl
tRNS (10 mg/ml) resuspendiert. Diese Mischung wurde gemischt und
bei 2 bis 6 °C über Nacht
zum Stabilisieren der Proteine auf den Teilchen inkubiert. Die Teilchen
wurden magnetisch getrennt und in 10 ml PBS, enthaltend 15 mg Streptavidin
(Scripps S1214), suspendiert, gefolgt von Mischen für eine Stunde.
Die Teilchen wurden viermal in 10 ml ECL-Verdünner gewaschen, mit 5 Minuten
Mischen für
jeden Waschschritt. Die Teilchen wurden schließlich in 29,7 ml ECL-Verdünner und
300 μl tRNS
(10 mg/ml) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml Teilchen + 100 μg/ml tRNS
resuspendiert.
-
BEISPIEL 25
-
Nachweis immobilisierter
DNS auf Teilchen mittels Hybridisierung mit ECL-DNS-Sonden
-
Die
Möglichkeit,
eine ECL-Nachhybridisierung an Teilchen nachzuweisen, wurde durch
die Hybridisierung von an JK8 und JK8C gekoppelten Teilchen (Beispiel
22) mit dem mit Ru(bpy)3 2+-markierten
Oligonukleotid JK7 belegt. Einzelne Chargen von Teilchen (300 μg) in ECL-Puffer
wurden mit 50 μl
ECL-Puffer, enthaltend 12,5, 6,3, 3,01 und 1,5 fMol markiertem JK7,
gemischt. Diese Mischungen wurden vier Stunden bei 52 °C hybridisiert,
gefolgt von Waschen mit 1 ml ECL-Puffer und Resuspension in 830 μl ECL-Puffer.
Diese Proben wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert.
Die Sonde JK7 ist der JK8-Sequenz komplementär und der Sequenz JK8C nicht
komplementär.
-
-
Die
in Tabelle VIII gezeigten Ergebnisse belegen die Möglichkeit,
mittelspezifischer Hybridisierung die Anwesenheit spezifischer Sequenzen
mittels ECL nachzuweisen, die direkt auf der Oberfläche von
Teilchen immobilisiert sind.
-
BEISPIEL 26
-
RNS-Test auf Basis einer
an Kügelchen
gebundenen ECL
-
Dynal
M450-Teilchen wurden mit einem Antikörper beschichtet, der spezifisch
für RNS/DNS-Antikörper ist
(7), indem man Standardverfahren folgte (Beispiel 10). Spezifische
RNS-Spezies wurden erzeugt unter Verwendung von Plasmiden, die von
unserem clonierten Aequorin-Gen abgeleitet waren (8). Kurz gesagt,
wurde das Plasmid pA5' mit
EcoRI geschnitten, gereinigt und der in-vitro-Transkription unter
Verwendung von T3-RNS-Polymerase unterworfen, wodurch T3-RI RNS
(negative RNS) erzeugt wurde. Ebenso wurde das Plasmid pA5' mit BamHI geschnitten,
gereinigt und der in-vitro-Transkription
unter Verwendung der T7-RNS-Polymerase zur Erzeugung der T7-Bam RNS (positive
RNS) unterworfen. Diese beiden RNS-Spezies stellen somit zwei komplementäre RNS-Spezies
dar. Diese RNS-Spezies wurden gereinigt mittels Extraktion mit einem
gleichen Volumen von Phenol:Chloroform (50:50), gefolgt von Chloroform-Extraktion
und Präzipitation
des Überstandes,
unter Verwendung von 2,5 Volumen Ethanol. Die RNS-Menge wurde unter
Verwendung der Gelelektrophorese und Spektrophotometrie bestimmt.
Diese Verfahren sind gut etabiliert und dem Fachmann bekannt (9).
Streptavidin wurde mit dem Ru(bpy)3 2+-Marker unter Verwendung etablierter Verfahren
und eines 25:1 Molüberschusses
von Ru(bpy)3 2+-Marker über Streptavidin
markiert (Beispiel 13). Dieses markierte Streptavidin wurde unter
Verwendung einer Iminobiotin-Säule
nach etablierten Verfahren (10) gereinigt. Das Streptavidin enthielt
schätzungsweise
10 Ru(bpy)3 2+-Marker
pro Streptavidintetramer. Dieses markierte Streptavidin wurde anschließend mit
biotinyliertem T35 komplexiert, was unter Verwendung eines 1:1-Gemisches an
Oligonukleotid zu markiertem Streptavidin erzielt wurde. Spezifisch
wurden 20 pMol von jedem in einem Endvolumen von 15 μl ECL-Puffer
gemischt und über
Nacht bei 4 °C
zur Bildung des markierten Streptavidin-Oligonukleotid-Komplexes
(SA-T35) inkubiert. Die Proben der positiven und negativen RNS (10
ng) wurden mit 2 μl
des SA-T35-Komplexes (einstufiger Test) oder 25 ng des biotinylierten
T35 (zweistufiger Test) hybridisiert. Die Proben wurden auf 50 μl ergänzt und
3 Stunden bei 50 °C
hybridisiert, gefolgt von Zugabe von 200 μg mit Anti-DNS/R-NS-Antikörper beschichteten
Teilchen in 20 μl
PBS 0,1 % BSA. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde
lang gemischt, gefolgt von zwei Waschungen in ECL-Puffer. Proben
aus der Hybridisierung mit dem SA-T35-Komplex wurden in 530 μl ECL-Puffer
resuspendiert und, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Diejenigen
Proben aus der Hybridisierung nur mit biotinyliertem T35 wurden
anschließend
mit 50 pMol des markierten Streptavidins inkubiert und für eine Stunde
unter Mischen inkubiert, gefolgt von zwei Waschungen in ECL-Puffer.
Proben aus der Hybridisierung wurden in 530 μl ECL-Puffer resuspendiert und,
wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse sind in
Tabelle IX dargestellt.
-
-
BEISPIEL 27
-
Polymerase Kettenreaktionen
(Polymerase Chain Reactions: PCR)
-
Polymerase
Kettenreaktionen wurden im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (11,
12, 13). Reaktionsansätze
betrugen typischerweise 100 μl,
wenn nicht anders angegeben. Die im asymmetrischen Modus ausgeführte PCR
dirigierte den Einbau des Markers Ru(bpy)3 2+ unter Verwendung von 5 pMol des biotinylierten Oligonukleotids
und 50 pMol des mit Ru(bpy)3 2+-markierten
Oligonukleotids. Wir haben den Test für die Haras-Punktmutation unter
identischen Bedingungen, jedoch ohne das mit Ru(bpy)3 2+-markierte
Oligonukleotid durchgeführt.
Ebenfalls haben wir den HPV-Test asymmetrisch ohne Trennung durchgeführt, jedoch
unter Anwendung eines zehnfachen Überschusses des biotinylierten
Oligonukleotids, typischerweise 40 pMol. Die Bedingungen des Thermozyklus
waren wie folgt, für
den HPV18- und 16-Test mit direktem Einbau war das Profil 93 °C 1 Sekunde,
50 °C 1
Sekunde, 60 °C
2 Minuten; für
den Ha-ras-Punktmutationstest
93 °C 1
Sekunde, 69 °C
2 Minuten; für
den HPV-Test ohne Trennung 93 °C
10 Sekunden, 50 °C
30 Sekunden, 60 °C
2 Minuten. Die Zykluszahlen für
diese PCR-Durchläufe
lagen bei 30 bis 40, je nach Test und dem erforderlichen Grad an
Sensitivität.
-
BEISPIEL 28
-
DNS-SONDENTESTFORMAT I.
Nachweis und Ouantifizierung der Human-Papilloma-Virus-(HPV)-PCR-Produkte
mittels enzymatischer Inkorporation
-
Im
Anschluß an
die PCR unter Verwendung des direkten Einbaus des mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotids
wurde das gesamte Reaktionsgemisch (90–100 μl) zu 600 μg an magnetische Teilchen I
gekoppeltem Streptavidin gegeben, gefolgt von Inkubation für 20 Minuten
bei Raumtemperatur unter Schütteln.
Die Festphase in diesen Proben wurde unter Verwendung magnetischer
Gestelle abgetrennt, zweimal mit ECL-Puffer gewaschen, in 530 μl ECL-Puffer
resuspendiert und anschließend,
wie in Beispiel 1 beschrieben, auf Elektrochemolumineszenz analysiert. 3 veranschaulicht
dieses Testformat. Die Ergebnisse für dieses Testformat wurden
mit Proben von Human-Papilloma-Virus gezeigt (2,14). Spezifitätsuntersuchungen
des direkten Einbaus bzw. der direkten Inkorporation des mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotids
in biotinylierte PCR-Produkte setzten die eng verwandten Virustypen
HPV16 und HPV18 ein. Der Test auf die Anwesenheit von HPV16 und
18 wurde durchgefürt
unter Verwendung von DNS-Proben, die für beide Virustypen positiv sind,
und von Oligonukleotiden, die für
jeden Virustyp spezifisch sind. Die Primer waren wie folgt: 2PV16, 2PV18,
biotinyliert, und 3PV16, 3PV18, mit Ru(bpy)3 2+-markierte Oligonukleotide. Die 2/3PV16-
und 2/3PV 18-Oligonukleotide waren spezifisch für HPV16 bzw. 18. Die erhaltenen,
auf Kügelchen
gefangenen Ru(bpy)3 2+-Marker
wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf ECL analysiert. Die Ergebnisse
wurden als ECL-Zählrate
für jede
Kombination von Probe und Probe aufgetragen (siehe 6).
-
Um
die quantitative Art unseres Testformats zu demonstrieren, wurde
eine Standardkurve aus direkt eingebautem Ru(bpy)3 2+-Marker und biotinylierten Oligonukleotiden
in die HPV16-PCR-Produkte erzeugt. Die erhaltene, an Kügelchen
gebundene Ru(bpy)3 2+-Markierung wurde,
wie in Beispiel 1 beschrieben, auf ECL analysiert. Die Photon-Zählraten des ECL-Peaks wurden über steigenden
Konzentration der HPV16-DNS aufgetragen, ausgedrückt als Verhältnis viraler
Kopien zu gesamtzellulären
DNS- Kopien. Die
in dieser Analyse auf HPV16 verwendeten Primer waren 1PV16 (Biotin-Marker) und 2PV16
(Ru(bpy)3 2+-Marker).
Die für
jede PCR verwendete DNS wurde unter Verwendung von Kalbsthymus-DNS
bei konstant 1 μg
gehalten. Die Ergebnisse für
diese Standardkurve sind in 7 gezeigt.
Diese Ergebnisse hinsichtlich Spezifität und Quantifizierung demonstriert
für dieses
Format die Fähigkeit
der ECL-Marker, einfache und schnelle Tests auf DNS-Basis zu erzeugen.
Ebenfalls belegt wird die Fähigkeit
des Markers, sich leicht in Enzymreaktionen einzuschalten, ohne
mit dem enzymatischen Prozeß zu
interferieren.
-
BEISPIEL 29
-
DNS-SONDENTESTFORMAT II.
Nachweis und Bestimmung von Punktmutationen im über die PCR amplifizierten
human Ha-ras-Onkogen-Produkt
-
Wir
haben die PCR-Reaktionen des Ha-ras-Gens unter Verwendung der Oligonukleotide
HRP1 und HRP2 durchgeführt.
Unter Verwendung von biotinyliertem HRP1 mit unmarkiertem HRP2 kann
das resultierende PCR-Produkt mit den Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden 2CHR und 2T24 hybridisieren.
Umgekehrt können die
unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit unmarkiertem HRP1 erhaltenen
PCR-Produkte mit den Ru(bpy)3 2+-markierten
Sonden 1CHR und 1T24 hybridisieren. Die verwendete DNS war human
Placenta-DNS (normal) und Maus-NIH3T3-Zell-DNS, die mit dem mutanten
Haras-Gen aus dem Blasenkarzinom T24 transfiziert war (15).
-
Das
Testprotokoll war wie folgt: 90 μl
PCR-Reaktionsgemisch wurden zu 600 μg an magnetische Teilchen I
gekoppeltem Streptavidin zugegeben, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur
für 30
Minuten. Die feste Phase in diesen Proben wurde unter Verwendung
von magnetischen Gestellen abgetrennt, mit 50 mM NaOH und Hypridisierungspuffer
(0,9 M NaCL, 50 mM NaPO4, pH 7,7, 5 mM EDTA,
0,1 % (w/v) Ficoll, 0,1 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % (w/v)
Rinderserumalbumin) gewaschen und in 10 μg/ml des mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotids
enthaltendem Hybridisierungspuffer resuspendiert. Diese Proben wurden
15 Minuten bei 66°C
hybridisiert.
-
Die
feste Phase wurde unter Verwendung von magnetischen Gestellen abgetrennt,
zweimal mit 0,9 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH
7,7, 5 mM EDTA, gewaschen und dann mit 3 M Tetramethylammoniumchlorid,
50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 0,025 Triton X-100 einmal bei
Raumtemperatur und zweimal bei 66 °C für je 20 Minuten gewaschen.
Die feste Phase wurde dreimal mit ECL-Puffer gewaschen, in 530 μl ECL-Puffer resuspendiert
und die Elektrochemolumineszenz, wie in Beispiel 1 beschrieben,
detektiert. 4 veranschaulicht dieses Testformat.
-
Die
Tests auf Ha-ras-PCR-Produkte unter Verwendung von P32-markierten
Sonden waren denjenigen unter Verwendung von Ru(bpy)3 2+-Markierungen vergleichbar, mit der Ausnahme,
daß die
feste Phase schließlich
in 250 μl
ECL-Puffer resuspendiert wurde. Diese suspendierten Proben wurden
anschließend
in 5 ml Szintillisationsflüssigkeit überführt und
auf einem Beckman LS-100C-Flüssigszintillisationszählgerät gezählt.
-
In 8 zeigen
wir die Daten für
einen Punktmutationstest für
das Ha-ras-Onkogen. Die PRC wurde, wie in 4 veranschaulicht,
durchgeführt
unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit unmarkiertem HRP1 (für die Sonden
1T24 und 1CHR) und biotinyliertem HRP1 mit unmarkiertem HRP2 (für die Sonden
2T24 und 2CHR), wodurch an Kügelchen
gebundene einzelsträngige
Ziele für
die Hybridisierung erzeugt wurden. Die DNS-Proben waren das normale
(Placenta) Ha-ras-Gen und das mutierte (NIH3T3-T24) Ha-ras-Gen.
Die Hybridisierung der an die Kügelchen
gebundenen DNS mit Ru(bpy)3 2+-Marker-1T24
(1T24), Ru(bpy)3 2+-Marker-2T24
(2T24), Ru(bpy)3 2+-Marker-1CHR (1CHR)
und Ru(bpy)3 2+Marker-2CHR
(2CHR) folgten Waschungen mit TEMAC. Der erhaltene, an Kügelchen
gebundene Marker Ru(bpy)3 2+ wurde,
wie in Beispiel 1 beschrieben; auf ECL analysiert. Die Ergebnisse
wurden als ECL-Zählrate
für jede
Kombination aus Probe und Sonde aufgetragen. Die Ergebnisse (8)
waren wie erwartet, wobei die normalen Sonden gut mit der normalen
DNS (siehe die CHR-Sonden)
hybridisierten und die mutierten Sonden mit dem mutierten Gen (siehe
die T24-Sonden) hybridisierten. Interessant war, daß diese
Sonden sich in keinster Weise äquivalent
verhielten. Um diese offensichtliche Anomalie zu erkunden, haben
wir diese Sonden weiter untersucht, unter Verwendung von P32-markierten Sonden mit und ohne Ru(bpy)3 2+-Marker. Diese
Bestimmung der Spezifität
der mit Ru(bpy)3 2+-markierten
Sonden unter Verwendung von P32-markierten
Sonden für
das Ha-ras-Onkogen erfolgte wie folgt. Die PCR wurde, wie in 8 beschrieben,
unter alleiniger Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nichtmarkiertem
HRP1 (für
die Sonden 1T24 und 1CHR). Die verwendeten Sonden waren: 1T24 und
1CHR, enthaltend P32 (1T24-P, 1CHR-P) als
Kontrollen; mit 1T24 und 1CHR, enthaltend sowohl P32-
und Ru(bpy)3 2+-Marker
zur Ermittlung des Effekts des Ru(bpy)3 2+-Markers. Die Proben wurden wie zuvor mit
TEMAC gewaschen. Das erhaltene, an Kügelchen gebundene P32 wurde nach Zugabe von Szintillisations-Cocktail
in einem Szinillations-Zählgerät analysiert.
Die Ergebnisse wurden als P32-Zählrate pro
Sekunde für
jede Kombination aus Probe und Sonde aufgetragen (siehe 9).
Diese Ergebnisse belegen, daß die
P32-Sonden und die Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden äquivalent fungieren und daß die Probleme
mit der Sondenspezifität
auf den verwendeten spezifischen Sondensequenzen beruhen. Um die Äquivalenz
unseres Ru(bpy)3 2+-Markers und
P32 weiter zu belegen, haben wir einen Vergleich
zwischen diesen markierten Sonden durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte,
wie zuvor beschrieben, unter Verwendung placentaler DNS und von
biotinyliertem HRP2 mit unmarkiertem HRP1 (für die Sonden 1T24 und 1CHR).
Das erhaltene PCR-Produkt
wurde anschließend auf
Proben aufgeteilt zum Erhalt eines Sets aus Proben, die verschiedene
Mengen an Produkt enthielten. Diese Sets von Proben wurden anschließend entweder
mit Sonden, markiert mit P32 (1T24-P32 und
1CHR-P32) oder mit dem Ru(bpy)3 2+-Marker
(1T24-Ru(bpy)3 2+ und
1CHR-Ru(bpy)3 2+)
hybridisiert. Die Ergebnisse aus jeder Untersuchung wurden anschließend unter
Verwendung des Mittelwerts eines jeden Markers für die 90 μl-Probe normalisiert. Diese
normalisierten Zahlen gestatten einen effektiveren Vergleich des
Signals zum Hintergrund bzw. Rauschen und die vergleichbare Antwort
der beiden Verfahren. Der Einsatz in 10 veranschaulicht
die Antwort im unteren Bereich der Verdünnungskurve. Die Proben wurden,
wie zuvor beschrieben, behandelt (8 und 9).
Die Ergebnisse in 10 belegten die Äquivalenz
der beiden Marker mit Hinweisen für ein besseres Ansprechen unserer
Ru(bpy)3 2+-markierten
Sonde. Diese Untersuchungen haben die Fähigkeit der mit Ru(bpy)3 2+-markieren Sonden
belegt, genauso gut wie P32-markierte Sonden
hinsichtlich ihrer Fähigkeit
zu funktionieren, einzelne Basenaustausche in einer Proben-DNS zu unterscheiden.
Dieser Beleg zeigt an, daß der
Ru(bpy)3 2+-Marker
wenig tut, um die Eigenschaften der markierten Sonde in Hybridisierungsreaktionen
zu beeinflussen.
-
BEISPIEL 30
-
DNS-SONDENTESTFORMAT III.
Nachweis und Quantifizierung von Human-Papilloma-Virus (HPV)-PCR-Produkten
in einem Test ohne Trennung
-
Für den Test
auf HPV 18 ohne Trennung haben wir eine asymmetrische PCR-Reaktion
mit einem Überschuß an biotinyliertem
Primer durchgeführt.
Diese PCR-Reaktion erzeugt einen Überschuß an biotinylierter, einzelsträngiger DNS,
die nun für
die direkte Hybridisierung mit den mit Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden zur Verfügung steht.
Für die
Hybridisierung fügten
wir 1000 ECL-Zellraten an Oligonukleotid mit Ru(bpy)3 2+-Marker
(2 ng) zu, welches spezifisch für
das HPV-Gen ist, amplifizierten auf 15 μl der PCR nach Abschluß der Amplifikation,
gefolgt von Inkubation für
15 Minuten bei 50 °C.
Zu diesem Hybridisierungsgemisch gaben wir 60 μl ECL-Puffer, enthaltend 600 μg von an
magnetische Teilchen I gekoppeltem Streptavidin, und inkubierten
unter Schütteln
bei Raumtemperatur für
15 Minuten. Das Probenvolumen wurde durch Zugabe von ECL-Puffer
auf 530 μl
erhöht,
gefolgt vom Nachweis der Elektrochemolumineszenz, wie in Beispiel
1 beschrieben. 5 veranschaulicht dieses Testformt.
Um diesen Test ohne Trennung zu belegen, haben wir eine Standardkurve
für HPV18-DNS
durchgeführt.
Die PCR wurde unter Verwendung von biotinyliertem 2PV18 und unmarkiertem
1PV18 und von HeLa-DNS durchgeführt
(14). Die erhaltene PCR-Reaktion wurde anschließend mit der spezifischen Sonde
Ru(bpy)3 2+-Marker-3PV18
hybridisiert. Die Hybridisierungsmischung wurde anschließend zu
mit Streptavidin beschichteten Teilchen zugegeben und der erhaltene,
an Kügelchen
gebundene Ru(bpy)3 2+-Marker
wurde direkt auf die ECL, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert.
Die Ergebnisse wurden als ECL-Zählrate über zur
PCR zugefügten
HPV18-Kopien aufgetragen, mit einer Kontrolle der ras-Oligonukleotidsonde
(siehe 11). Diese Ergebnisse belegen
die Fähigkeit,
schnelle Tests auf Nukleinsäuresequenzen
ohne Trennung auf Basis der Eigenschaften des ECL-Testsystems zu
erzeugen.
-
BEISPIEL 31
-
Test auf spezifische
genomische DNS-Sequenzen
-
Das
hier beschriebene Testformat setzt zwei Oligonukleotide ein, die
beide mit demselben DNS-Strang in der Nähe zueinander hybridisieren,
wobei eine Sonde das Einfangen gestattet, die andere den Komplex
markiert (Sandwich-Hybridisierung). Dieser Test wurde unter Verwendung
von E.coli-DNS und für den
trp-E/D-Genbereich spezifischen Sonden gezeigt. Die E.coli-DNS wurde
Standardprotokollen folgend hergestellt (16). Die Lachssperma-DNS
als Kontrolle wurde von Sigma Ltd. bezogen. Zu den DNS-Proben wurden 14 μl Hybridisierungspuffer
(10X PBS, 10 mM EDTA und 0,7 % SDS), 2 ng mit Biotin markierter
TRP.C04 und 5 ng von mit Ru(bpy)3 2+-markiertem TRP.C-O3 zugegeben. Diese Proben wurden mit
Wasser auf 100 μl
ergänzt.
Die Proben wurden auf 97 °C
erwärmt
und bei 97 °C
10 Minuten lang inkubiert, auf 50 °C abgekühlt und 2 Stunden hybridisiert.
Zu diesen Proben wurden 20 μl
mit Streptavidin beschichtete Magnetteilchen II zugegeben und 2
Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Die Teilchen wurden anschließend viermal
in ECL-Puffer gewaschen, in 500 μl
ECL-Puffer resuspendiert
und, wie in Beispiel 3 beschrieben, analysiert. Die positive DNS
ist E.coli und die negative DNS ist Lachssperma. Die Ergebnisse
sind in Tabelle X gezeigt.
-
-
Diese
Ergebnisse belegen die Fähigkeit
des ECL-Testsystems, beim Nachweis eines genomischen Gens in E.coli
unter Verwendung eines Sandwich-Hybridisierungs-Testformats auf
nicht amplifizierter DNS zu funktionieren. Die mit Streptavidin
beschichteten Magnetteilchen I können
vergleichbar in der Weise genutzt werden, daß mit Streptavidin beschichtete
Magnetteilchen II in diesem Beispiel eingesetzt werden.
-
BEISPIEL 32
-
Teilchenkonzentration
auf Abklingwellen-Fluoreszenzdetektoren
-
Die
Konzentration eines markierten Komplexes auf einer Detektionsoberfläche kann
verwendet werden, um die Empfindlichkeit eines Tests, der Abklingwellendetektoren
anwendet, zu erhöhen.
Solche Detektoren können
entweder (eine) optische Faser(n) oder (einen) planare(n) optische(n)
Wellenleiter 300 einsetzen, um Licht 310 von einer
Lichtquelle zur fluiden Umgebung zu führen. Das Licht wird durch
den Wellenleiter oder die optische Faser über innere Totalreflektion
(Total Internal Reflection; TIR) 310' reflektiert, die dann auftritt, wenn
ein einfallender Lichtstrahl eine Grenzfläche zwischen einem dielektrischen
Medium mit hohem Brechungsindex (n1) und
einem mit niedrigerem Brechungsindex (n2)
berührt.
Ist der Einfallswinkel des Lichtstrahls größer als der kritische Winkel 315,
der θ0 ist (der zwischen der senkrechten Linie 300' und dem Lichtpfad 310' gezeigte Winkel), θ0 = sin–1(n2/n1), wird das Licht an der Grenzfläche zu 100
% intern reflektiert. In optischen Wellenleitern und optischen Fasern
bewegt sich das Licht mit einem Einfallswinkel, der größer als der
kritische Winkel ist und propagiert durch das Medium mittels interner
Totalreflektion. 22 zeigt die TIR-Propagation
in einem Wellenleiter oder einer optischen Faser.
-
Obwohl
der Lichtstrahl bei jeder Wechselwirkung mit der Grenzfläche total
reflektiert wird, ist das elektromagnetische Feld außerhalb
des Mediums nicht gleich null. Physikalische Bedingungen der Kontinuität über eine
Grenzfläche
hinweg erfordern, daß das
elektromagnetische Feld exponentiell abfällt, wenn es aus der Faser
oder dem Wellenleiter in die äußere Umgebung
austritt. Dieses Feld wird austretendes oder abklingendes Feld 320 genannt
und kann Fluorophore zur Fluoreszenz anregen. Die Abklingrate des
austretenden Feldes hängt
von der einfallenden Wellenlänge,
den Brechungsindizes n1 und n2 sowie
dem Einfallswinkel ab. Unter Verwendung eines Quarz-Wellenleiters
und sichtbaren Lichtes in einer Wasserumgebung, fällt das
austretende Feld 320 innerhalb eines Abstandes von 100
nm von der Grenzfläche
zwischen Wellenleiter und Lösung um
etwa 90 % ab. In 22 weist das umgebende Medium 330 einen
Brechungsindex n2 und die optische(n) Faser(n)
oder der bzw. die Wellenleiter 300 einen Brechungsindex
n1 auf.
-
Dieselben
Prinzipien, die das abklingende Feld für im Wellenleiter oder der
optischen Faser propagierendes Licht erzeugen, gestatten, daß das Licht,
das bei der Lumineszenz der Fluorophore erzeugt wird, effektiv zurück in das
optische Element eingefangen wird. Zusätzlich wird alles Licht, das
außerhalb
der Abklingzone (320) erzeugt wird, effektiv am Eintritt
in das optische Element gehindert. Die Kombination dieser Effekte gestattet
den Einsatz von optischen Fasern oder Wellenleitern als effiziente
optische Elemente zum Messen der Anwesenheit und Konzentration von
Fluorophoren als Markern auf oder in der Nähe ihrer Oberflächen in einer
wäßrigen Umgebung.
Die hierin durch Bezugnahme aufgenommene US-A-4,447,546 beschreibt
ein geeignetes Verfahren und eine Vorrichtung zur Ausführung von
Fluoreszenz-Immunoassays, die eine optische Faser zur Anregung und
Messung der Fluoreszenz von einem markierten Immunoreagenz in der
Abklingzone einsetzen.
-
Die
Erfindung kann angewandt werden, um die Empfindlichkeit von Fluoreszenz-Bindungstests unter Verwendung
von optischen Fasern oder Wellenleitern zu verbessern. Der Test
wird unter Verwendung von mit Fluoreszenz-Gruppen markierten Reagenzien
durchgeführt.
Nach Inkubation der Teilchen, der Probe und des Reagenz' werden die Teilchen
auf der Oberfläche
des Wellenleiters oder der optischen Faser konzentriert. Da die
Oberfläche
der Teilchen größer als
die geometrische Fläche
des Wellenleiters oder der optischen Faser ist, können mehr
Fluorophore in der das optische Element umgebenen Abklingzone gesammelt
werden. Somit wird das Lumineszenzsignal von den Teilchen größer sein
und kann die Quantifizierung des Analyten empfindlicher sein, was
zu verbesserten Nachweisgrenzen führt. DYNAL, DYNABEADS, TEFLON,
TRITON und TWEEN sind allesamt eingetragene Handelsmarken.
-
LITERATUR
-
- 1. Beaucage SL, Caruthers MH. Deoxynucleoside phosphoramidites,
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