DE69232065T2

DE69232065T2 - Verfahren zum präparieren von gewebe für die transplantation

Info

Publication number: DE69232065T2
Application number: DE69232065T
Authority: DE
Inventors: G. Brockbank; F. Carpenter
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1991-05-14
Filing date: 1992-05-14
Publication date: 2002-01-31
Anticipated expiration: 2012-05-15
Also published as: DK0584195T3; ES2164051T3; CA2103025A1; EP0584195B1; WO1992020300A1; AU1891892A; EP0584195A1; US5160313A; DE69232065D1; EP0584195A4; CA2103025C; ATE205669T1

Description

Die hierin beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines transplantierbaren Gewebes, welches cryokonserviert und bei Cryokonservierungstemperaturen gelagert wurde. Der Erfolg bestimmter Gewebetransplantate hängt zu einem großen Teil vom Grad der Lebensfähigkeit der Zellen und des Gewebes ab, die als die Fähigkeit einer Zelle oder eines Gewebes, sich selbst zu erhalten und auf normale Weise mit seiner Umgebung zu wechselwirken, definiert ist. Mit dem ständigen Anstieg der Häufigkeit von transplantationschirurgischen Eingriffen sind die Techniken zur Gewebekonservierung, -lagerung, -auftauen und Eluierung des Cryoschutzmittels für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Gewebe immer wichtiger geworden.
Die hier beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines transplantierbaren Gewebes nach Cryokonservierung und Auftauen zwecks Eluierung (oder Verdünnung) des häufig verwendeten intrazellulären Cryoschutzmittels. Aufgrund ihrer temperaturabhängigen chemischen Zytotoxizität bergen intrazelluläre Cryoschutzmittel besondere Schwierigkeiten während der Herstellung von Transplantaten. Zusätzlich kann aufgrund der hyperosmotischen Mengen an gelösten Stoffen in den aufgetauten Zellen ein osmotischer Stress entstehen.
Die zum Eluieren des Cryoschutzmittels aus aufgetauten cryokonservierten Geweben verwendeten Verdünnungstechniken bestanden üblicherweise in einem vielschrittigen Verfahren, wodurch sowohl die chemische Zytotoxizität als auch der zelluläre osmotische Schock, die in Kombination zu einer Belastung der Zellen und potenziell zum Zelltod führen können, minimiert werden sollten. Die schrittweise Eluierung des intrazellulären Cryoschutzmittels minimiert die Nettodiffusion von Wasser in die Zellen und erlaubt das Ausdiffundieren des intrazellulären Cryoschutzmittels. Der vielschrittige Ansatz ist meist zeitaufwendig und erfordert besondere Aufmerksamkeit auf Details, wie etwa Elutionszeiten, Temperaturen etc. Da dieser relativ komplexe Elutionsprozess üblicherweise im Operationssaal während des chirurgischen Eingriffs durchgeführt wird, ist es vorteilhaft, das einfachste, sicherste Auftau- und Elutionsverfahren mit der geringsten Anzahl von Schritten zu verwenden, damit sich das OP-Personal auf das jeweilige chirurgische Verfahren konzentrieren kann.
May und Baust schlagen in Cryobiology of Tissue, Seiten 27-34 (Cardiac Valve Allografts: 1962-1987 (Hrsg. Yankch et al.) Springer-Verlag 1988) vor, dass es wünschenswert sein könnte, Cryoschutzmittel in einer einschrittigen oder zweischrittigen Verdünnung zu entfernen, um den osmotischen Stress in den Zellen zu minimieren.
US 4,380,997 beschreibt ein Verfahren zum Lagern, Auftauen und Überführen von gefrorenen Embryos in Empfängertiere in einem einschrittigen Verdünnungsschritt. Trotz gegenteiliger Aussagen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von transplantierbarem Gewebe, welches mit einem intrazellulären Cryoschutzmittel cryokonserviert wurde und vor der Transplantation aufgetaut wurde, wobei das intrazelluläre Cryoschutzmittel in einem einschrittigen Elutionsverfahren für eine ausreichende Zeitdauer mit einer Elutionslösung eluiert wird, um eine im Wesentlichen nicht toxische Konzentration des intrazellulären Cryoschutzmittels in dem Gewebe zu erhalten, wobei die Elutionslösung eine ausgewogene Salzlösung mit einer Osmolarität von etwa 400 bis etwa 800 mOsm umfasst.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein einschrittiges Elutionsverfahren für intrazelluläre Cryoschutzmittel bereitzustellen, welches die Cryoschutzmittelkonzentration innerhalb des Gewebes auf im Wesentlichen nicht toxische Konzentrationen (bezogen auf die das Gewebe bildenden Zellen) reduziert, bei der das Gewebe sicher transplantiert werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verdünnungsverfahrens, welches eine minimale Anzahl von Schritten erfordert. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches keine Endpunkttitration oder -bestimmung erfordert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Beschleunigung und die Vereinfachung des Verdünnungsverfahrens zur Herstellung von cryokonserviertem Gewebe, um die Transplantationschirurgie zu erleichtern. Diese und weitere Gegenstände werden dem Fachmann aus den hier beschriebenen Lehren deutlich werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von transplantierbarem Gewebe bereitgestellt, welches mit einem intrazellulären Cryoschutzmittel cryokonserviert und vor dem Transplantieren aufgetaut wurde, wobei das intrazelluläre Cryoschutzmittel in einem einschrittigen Elutionsverfahren mit einer Elutionslösung für einen ausreichende Zeitdauer eluiert wird, um eine im Wesentlichen nicht toxische Konzentration des intrazellulären Cryoschutzmittels in dem Gewebe zu erhalten, wobei die Elutionslösung eine ausgewogene Salzlösung mit einer Osmolarität von etwa 400 bis etwa 800 mOsm umfasst.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Der Ausdruck "transplantierbares Gewebe", wie hierin verwendet, bezeichnet Zellgewebe, in dem die Zellen von einer extrazellulären Matrix begleitet oder darin gehalten werden. Beispiele "transplantierbaren Gewebes" umfassen carcliovaskuläres Gewebe, wie etwa Herzklappen, Venen, Aortatransplantate u. dgl. Zusätzlich bezeichnet der Ausdruck muskuloskeletale Gewebe, bei denen intrazelluläre Cryoschutzmittel üblicherweise verwendet werden, wie etwa Sehnen, Ligamente, Knorpel u. dgl. Daher ist Allotransplantatgewebe kardiovaskuläres oder muskuloskeletales Gewebe, das einem Spender derselben Spezies wie der Empfänger entnommen wurde. Die zur Verwendung hierin bevorzugten Gewebe umfassen Venen, Herzklappen und muskuloskeletales Gewebe, und die am meisten bevorzugten Gewebe sind Herzklappen und insbesondere Allotransplantat-Herzklappen.
"Elution" und "Verdünnung" bezeichnen die hierin verwendete Lösung und das hierin verwendete Verfahren, welches das Ausdiffundieren des Cryoschutzmittels aus den Zellen verursacht.
Der Ausdruck "intrazelluläres Cryoschutzmittel" bezeichnet Verbindungen, welche die Zellen von Gewebe durchdringen und das Überleben der Zellen verbessern, wenn sie einer Cryokonservierung und einem Auftauverfahren ausgesetzt werden, was zu minimierter intrazellulärer oder Zeilmembranschädigung führt. Beispiele umfassen Dimethylsulfoxid ("DMSO"), verschiedene Diole und Triole, wie etwa Ethylenglykol, Propylenglykol, Butandiol und -triol und Glycerin, sowie verschiedene Amide, wie etwa Formamid und Acetatamid. Diese Verbindungen dringen typischerweise in die Zelle ein, indem sie durch die Zellmembran diffundieren, und erreichen ein Gleichgewicht in einer relativ kurzen Zeit. Diese Diffusion in die Zellen kann von etwa 10 Minuten bis etwa 2 Stunden benötigen, wonach das Transplantatgewebe einem geeigneten Gefrierverfahren unterzogen wird.
Das Transplantatgewebe ist während des Erntens, der Cryokonservierung, des Auftauens und der Transplantatherstellung sowohl physischen als auch biochemischen Belastungen ausgesetzt. So wird beispielsweise Gewebe, welches gelagert und später zur Transplantation verwendet werden soll, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach dem Tod dem Spender entnommen. Das geerntete Gewebe wird für eine relativ kurze Zeitdauer auf Eis gelagert, beispielsweise etwa 24 Stunden. Es kann bestimmten Behandlungen und physikalischen Bestimmungen ausgesetzt werden, beispielsweise der Behandlung mit Antibiotika, Größenbestimmung etc. und anschließend unter Verwendung eines oder mehrerer intrazellulärer Cryoschutzmittel cyokonserviert werden, wobei ein extrazelluläres Cryoschutzmittel im flüssigen Cryokonservierungsmedium vorhanden sein kann oder nicht. Somit treten physiologische und biochemische Belastungen während der Verarbeitung auf, die jede für sich die Lebensfähigkeit der Zellen bei der Transplantation reduzieren können.
Der Ausdruck "nicht-toxisch" wird hierin in einem relativen Sinne verwendet und soll die Konzentrationen an Cryoschutzmittel angeben, die gering genug sind, um eine chemische Toxizität bei physiologischen Temperaturen im Wesentlichen zu vermeiden und um die osmotische Zelllyse beim lnkontaktbringen des Gewebes mit physiologischen Konzentrationen gelöster Stoffe zu vermeiden, wie etwa bei dem lnkontaktbringen mit Blut.
Das einschrittige Verfahren kann unter Verwendung einer ausgewogenen Salzlösung durchgeführt werden, wie etwa Ringerlösung oder einer anderen Salzlösung, die im Wesentlichen isoosmotisch oder hyperosmotisch zu normalen Gewebe bzw. normalen Zellen ist.
Nachdem die Cryokonservierung und das Auftauen abgeschlossen sind, ist das intrazelluläre Cryoschutzmittel typischerweise in einer Konzentration von etwa 1 bis 2 Molar vorhanden. Diese Konzentration kann je nach der Anfangskonzentration und der Behandlungszeit variieren.
Die Ausdrücke "schrittweise" und "vielschrittig" beziehen sich auf die Technik der Konzentrationsänderung des intrazellulären Cryoschutzmittel unter Verwendung von allmählich abnehmenden Konzentrationen an gelösten Stoffen in dem Verdünnungsmittel, um die potentiellen letalen osmotischen Veränderungen der Wasserdiffusion durch die Zellmembran zu minimieren. Während der Prozesse des Einfrierens und Auftauens machen cryokonservierte Zellen in intra- und extrazellulären Konzentrationen gelöster Stoffe Veränderungen durch, die das Ergebnis von Änderungen der Menge an vorhandenem flüssigen Wasser sind. Zusätzlich diffundiert Wasser schneller durch die Zellmembran als Cryoschutzmittel. Da aufgetautes Gewebe üblicherweise Cryoschutzmittel in einer Konzentration enthält, die etwa dieselbe ist wie bei der Anfangsbehandlung, wurde ein schrittweises Verdünnungsprotokoll verwendet, um den potentiell letalen osmotischen Effekt der Wasserdififusion während und nach dem Auftauungsvorgang zu minimieren. Daher glaubte man bisher, dass ein teilweises Austauschen des Verdünnungsmediums während des Verdünnungsvorgangs die Zellen darin unterstützt, eine normale Tonizität zu erreichen. Beispielsweise hat man in 1 M DMSO-Lösung (100 ml) cryokonserviertes Gewebe verdünnt, indem ein Teil der DMSO enthaltenden Lösung entfernt und mit einer gleichen Menge Verdünnungsmittel ersetzt wurde. Dies VerFahren wurde nach einer Äquilibrationszeit, z. B. 1 Minute, wiederholt.
Das hierin beschriebene einschrittige Elutionsverfahren reduziert die Faktoren, die während des Elutionsprozesses kontrolliert werden müssen. Der Hauptfaktor, der kontrolliert wird, ist die Elutionszeit. Die minimale Elutionszeit beträgt ungefähr 5 min. Diese Zeitdauer scheint mehr als ausreichend zu sein, um eine ausreichende Menge an intrazellulärem Cryoschutzmittel aus dem Gewebe ausdiffundieren zu lassen, wobei vor der Transplantation eine im Wesentlichen nicht toxische intrazelluläre Konzentration erhalten wird.
Indem gemäß den hierin offenbarten Lehren ein geeigneter Eluent ausgewählt wird, kann die Elutionszeit verlängert werden, sodass keine Endpunkttitration erforderlich ist. Somit kann das transplantierbare Gewebe aufgetaut und vor oder während des chirurgischen Eingriffs in den Eluenten eingebracht werden, und einfach in dieser Lösung gelassen werden, bis die Operationsstelle zum Empfang des Transplantats vorbereitet ist. Das Transplantatgewebe muss nicht für eine genaue Zeitdauer über 5 Minuten in der Lösung verbleiben. Im Gegensatz dazu muss der Zeitablauf der zwischenzeitlichen Verdünnungsschritte bei dem vielschrittigen Verfahren genau kontrolliert werden.
Um den Verdünnungsprozess weiterhin zu verbessern, ohne zellschädigendes Netto- Einströmen von Wasser zu verursachen, kann ein im Wesentlichen impermeanter gelöster Stoff verwendet werden. Der Ausdruck "impermeanter gelöster Stoff", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Komponenten, die nicht passiv in oder aus Zellen diffundieren, und die innerhalb des Zeitrahmens des Verdünnungsvorgangs in keinem großen Ausmaß aktiv durch die Zellmembranen transportiert werden. Der Ausdruck "impermeant" wird im relativen Sinne gebraucht, da die verwendeten, die Zellen nicht durchdringenden Komponenten, die das Erreichen von Hyperosmolarität fördern können, immer noch in einem bestimmten Ausmaß in die Zellen eindringen. Beispiele von im Wesentlichen impermeanten gelösten Stoffen wie hierin verwendet umfassen Mannitol, Sorbit, Glucose (oder Dextrose) und Sucrose. Solche impermeanten gelösten Stoffe werden entsprechend der Art des behandelten Transplantatgewebes, des gewünschten osmotischen Drucks, der mit einer nicht-toxischen Konzentration des gelösten Stoffes erzeugt werden kann und der Gesamtkompatibilität des impermeanten gelösten Stoffes mit den anderen Komponenten im Verdünnungsmittel ausgewählt.
Die Gesamtkompatibilität des impermeanten gelösten Stoffes mit dem Verdünnungsmittel und weiteren Komponenten ist aus der Sicht der Formulierung wichtig, da jedwede Reaktion zwischen den Komponenten im Verdünnungsmittel den osmotischen Druck beeinflussen kann und daher die Wirksamkeit des Verdünnungsmittels bei der Bekämpfung des osmotischen toxischen Effekts des intrazellulären Cryoschutzmittels reduzieren kann.
Man fand heraus, dass das hierin beschriebene einschrittige Verfahren mit einem isoosmotischen oder im Wesentlichen hyperosmotischen Verdünnungsmittel mit oder ohne einem im Wesentlichen impermeanten gelösten Stoff über eine Zeitdauer von mehr als 5 Minuten durchgeführt werden kann, wobei dies eine wirksame Zeitdauer zur Reduzierung der intrazellulären Cryoschutzmittelkonzentration auf einen im Wesentlichen nicht-toxischen Grad ist. Die intrazelluläre Konzentration an Cryoschutzmitteln wird auf annehmbare Mengen reduziert, ohne dass ein wesentlicher Grad der Toxizität verursacht wird und ohne dass die Zelllebensfähigkeit auf ein nicht akzeptables Maß verringert wird.
Das Einschritt-Verdünnungsmittel hat in dieser Hinsicht eine Konzentration an gelöstem Stoff, die zu einem osmotischen Druck von etwa 400 bis etwa 800 mOsm führt. Das Einschrittverfahren ergibt überraschenderweise eine annehmbare Gewebelebensfähigkeit nach der Transplantation im Vergleich mit der Gewebelebensfähigkeit, die man bei schrittweisen Verdünnungsverfahren beobachtet.
Der am meisten bevorzugte hierin verwendete Einschritteluent erzeugt einen osmotischen Druck von etwa 525 mOsm. In dieser Hinsicht ist der bevorzugte Eluent eine 5% Dextrose (Gew./Vol.) enthaltende laktierte Ringerlösung.
Wenn Hyperosmotizität gewünscht wird, ist es bevorzugt, einen im Wesentlichen impermeanten gelösten Stoff in dem Eluenten zu verwenden, um den osmotischen Druck zu erhöhen, ohne die intrazellulären Elektrolytkonzentrationen negativ zu beeinflussen, die sonst beeinträchtigt werden könnten.
In dieser Hinsicht ist der bevorzugte Eluent laktierte Ringerlösung mit 5% Dextrose. Diese Formulierung kann über einen Zeitraum von mindestens etwa 5 bis 10 Minuten in einem Einschrittverdünnungsverfahren verwendet werden, um eine DMSO-Gewebekonzentration vor der Verdünnung von etwa 10% (Vol./Vol.) auf eine DMSO-Gewebekonzentration vor der Transplantation von etwa 5% (Vol./Vol.) oder niedriger zu reduzieren.
Wenn Glycerin als intrazelluläres Cryoschutzmittel verwendet wurde, ist wiederum laktiert Ringerlösung mit 5% Dextrose das bevorzugte Verdünnungsmittel. Aufgetautes Gewebe, das mit einer intrazellulären 2M Glycerinkonzentration cryokonserviert wurde, wird über einen Zeitraum von etwa 5 bis 10 Minuten mit laktierter Ringerlösung plus 5% Dextrose eluiert, was die intrazelluläre Glycerinkonzentration auf etwa 0,5 bis 1 M oder weniger reduziert.
Ein alternatives bevorzugtes Verdünnungsmittel, das hier geeignet ist, enthält Dulbecco's Modified Eagles Medium ("DMEM") mit oder ohne im Wesentlichen impermeanten gelösten Stoffen.
Der bevorzugte im Wesentlichen impermeante gelöste Stoff, der mit DMEM geeignet ist, ist 0,5 M Mannitol.
Die Wirksamkeit des Einschrittverfahrens im Vergleich mit dem vielschrittigen Verfahren bei der Erhaltung der Lebensfähigkeit von Zellen und der funktionellen Integrität kann durch Untersuchen des Gewebes demonstriert werden, bevor und nachdem ein Zyklus der Cryokonservierung-Auftauen-Verdünnung durchgeführt wurde. Das einschrittig eluierte Gewebe kann mit dem Gewebe verglichen werden, welches cryokonserviert, aufgetaut und anschließend mit einem vielschrittigen Verfahren verdünnt wurde.

BEISPIEL 1

Herzklappenblättchen werden seziert, um ein Kontrollgewebe und eine Vergleichsprobe zu erhalten. Die Segmente werden in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10% DMSO cryokonserviert. Anschließend werden die Segmente aufgetaut und mit der unten beschriebenen Elutionslösung eluiert.
Das dreischrittige Verdünnungsverfahren (Kontrolle) wird wie folgt durchgeführt. Vor der Elution werden die Segmente bei 37ºC bis 42ºC in 1 ml des oben beschriebenen Cryokonservierungsfluids aufgetaut. Der Inhalt, einschließlich der Segmente und des Fluids, wird in Schnappkappenröhrchen überführt. Die Elutionslösung ist DMEM, wenig Glucose mit Glutamin und Hepes. Zu dem Segment und seiner DMSO enthaltenden Lösung wird Elutionslösung (0,35 ml) hinzugegeben. Das Röhrchen wird für eine Minute sanft geschüttelt.
Weitere 0,65 ml Elutionslösung werden hinzugegeben, und der Inhalt für eine weitere Minute sanft geschüttelt.
Anschließend wird 1 ml der Lösung aus dem Röhrchen entfernt und verworfen, und 1 ml der Elutionslösung wird zu dem Röhrchen unter sanftem Schütteln für eine weitere Minute hinzugegeben.
Nach der einen Minute wird das Blättchensegment aus dem Röhrchen entfernt und in 1 ml der Elutionslösung gegeben.
Nach einer Minute in der Elutionslösung ist das Blättchensegment für den Lebensfähigkeitstest bereit.
Das Einschrittelutionsverfahren wird unter Verwendung von DMEM als Eluent über einen Zeitraum von 5 Minuten durchgeführt. Gryokonservierte und aufgetaute Blättchensegmente werden aus der Cryoschutzmittellösung entfernt und direkt in DMEM gegeben. Nach 5 Minute sind die Segmente für den Lebensfähigkeitstest bereit.
Um den Lebensfähigkeitstest durchzuführen, werden die Gewebesegmente in Schnappkappenröhrchen (FALCON), die 12 Mikrocurie (uCl) tritiummarkiertes Glycin in 750 ml DMEM mit Zusatz von 15 pl/ml Ascorbinsäure enthalten, gegeben. Der Einbau radiomarkierten Glycins wird nach 48 Stunden Inkubationszeit bei 37ºC in einer 5% CO&sub2; in Luft enthaltenden Atmosphäre bestimmt.
Die Blättchen werden anschließend viermal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen, mit Ethanol und Ether entwässert, luftgetrocknet und gewogen. Die Blättchen werden mit 200 ul Wasser rehydriert und durch Zusatz von 1 M NaOH solubilisiert. Die Blättchen werden anschließend bei 60ºC für 1 Stunde inkubiert und 2 zwanzig Sekunden dauernden Ultraschallbehandlungen ausgesetzt.
Die resultierenden Homogenate werden bei 12.000 · g zentrifugiert, und es werden 100 ul Aliquots der Überstände auf Glasfaserfilterscheiben (WHATMAN No. 1822024, WHATMAN Chemical Separation, Inc. Clifton, N. J.) gegeben. Die Filterscheiben werden getrocknet und die Proteine durch Zusatz von eiskalter 10%-iger Trichloressigsäure für 30 Minuten ausgefällt, gefolgt von fünf Ethanolspülungen, zwei Etherspülungen und Trocknen. Die Scheiben werden dann in 1 ml PROTOSOL (DuPont), einem proteinsolubilisierenden Mittel, gegeben, gefolgt von 10 ml Szintillationsfluid (ECOSCINT A; National Diagnostics, Inc., Sommerville, New Jersey). Der Einbau von Tritium wird dann gemessen (Backmann Instruments, Inc., Palo Alto, Cal). Die Ergebnisse, die in Zerfall pro Minute (DPM, disintegtrations per minute) pro mg Gewebetrockengewicht ausgedrückt werden, sind in Tabelle I unten dargestellt. Tabelle I DPM/mg Trockengewicht

BEISPIEL 2

Das oben beschriebene Verfahren wurde in Bezug auf das Einschrittelutionsverfahren in Beispiel 1 wiederholt, außer dass anstelle von DMEM im Elutionsschritt laktierte Ringerlösung verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt. Tabelle II DPM mq Trockenpewicht

BEISPIEL 3

Das oben beschriebene Verfahren wurde in Bezug auf das Einschrittelutionsverfahren in Beispiel 1 wiederholt, außer dass der Eluent durch DMEM mit 0,5 M Mannitol ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle III DPM/mg Trockengewicht

BEISPIEL 4

Das Einschrittelutionsverfahren wurde mit dem dreischrittigen Protokoll unter Verwendung von laktierter Ringerlösung mit 5% Dextrose verglichen. Das Einschrittverfahren wurde verwendet, um Cryoschutzmittel (10% DMSO) aus cryokonservierten und aufgetauten Herzklappeblättchen mit laktierter Ringerlösung enthaltend 5% Dextrose zu eluieren. (Behandlung B). Das DPM/mg Trockengewicht wird mit dem verglichen, dass aus dem dreischrittigen Elutionsverfahren unter Verwendung von DMEM als Eluent erhalten wurde (Behandlung A). Für die Klappen 1 bis 3 wurde jedes Blättchen aus der Klappe seziert und in zwei Hälften geschnitten. Jede Hälfte wurde in ein separates Cryoröhrchen gegeben und in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10% DMSO cryokonserviert. Alle drei Proben wurden cryokonserviert und anschließend in einem 45ºC warmen Wasserbad aufgetaut.
Die Klappen 4 bis 6 wurden als Ganzes cryokonserviert, aufgetaut wie oben beschrieben und anschließend seziert. Jede Blättchenhälfte wurde anschließend separat eluiert. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV DPM/mg Trockengewicht

Claims

1. Verfahren zur Behandlung eines transplantierbaren Gewebes, welches mit einem intrazellulären Cryoschutzmittel cryokonserviert und vor dem Transplantieren aufgetaut wurde, wobei das intrazelluläre Cryoschutzmittel vor dem Transplantieren in einem einzigen Schritt für eine ausreichende Zeitdauer mit einer Elutionslösung eluiert wird, um eine im wesentlichen nicht toxische Konzentration des Cryoschutzmittels in dem Gewebe zu erhalten, wobei die Elutionslösung eine ausgewogene Salzlösung mit einer Osmolarität von etwa 400 bis etwa 800 mOsm umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung eine laktierte Ringer-Lösung und einen im wesentlichen impermeanten gelösten Stoff umfaßt, wobei der impermeante gelöste Stoff Dextrose ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Lösung hyperosmotisch ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das cryogeschützte transplantierbare Gewebe eine endgültige Cryoschutzmittelkonzentration von etwa 0,25 M bis etwa 1 M aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das intrazelluläre Cryoschutzmittel Dimethylsulfoxid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das transplantierbare Gewebe bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 38ºC in die Lösung eingetaucht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das transplantierbare Gewebe kardiovaskuläres Gewebe oder muskuloskeletales Gewebe ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das transplantierbare Gewebe eine Vene, Arterie, Herzklappe, ein Ligament oder eine Sehne ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das transplantierbare Gewebe eine Herzklappe ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Herzklappe eine Allograft-Herzklappe ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das intrazelluläre Cryoschutzmittel vor dem Transplantieren in einem einzigen Elutionsschritt mit einer eine laktierte Ringerlösung und 5% Dextrose umfassenden Lösung verdünnt wird, ohne daß die Lebensfähigkeit des transplantierbaren Gewebes nach dem Transplantieren in einen Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, wesentlich reduziert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das transplantierbare Gewebe ein wie in einem der Ansprüche 7, 8 oder 9 definiertes Gewebe ist.