DE69231907T2

DE69231907T2 - Stabile pura-Vektoren und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE69231907T2
Application number: DE69231907T
Authority: DE
Inventors: Algis Anilionis; Robert Newton Brey Iii; James Peter Fulginiti
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1991-05-03
Filing date: 1992-04-06
Publication date: 2001-10-18
Anticipated expiration: 2012-04-07
Also published as: NO921729L; EP0512260B1; NO314043B1; FI921940A0; KR920021701A; FI921940A; KR100242798B1; EP0512260A2; GR3036487T3; DK0512260T3; IL101751A0; PT512260E; AU1595992A; US5919663A; NO921729D0; AU654347B2; CA2067862A1; JP3320095B2; ATE202800T1; FI111013B

Description

STABILE purA-VEKTOREN UND IHRE VERWENDUNG

Hintergrund der Erfindung

In der Natur gefundene Plasmide sind auf sich teilende Zellen verteilt, so dass Tochterzellen mindestens eine Kopie erhalten. Bakterielle Plasmidsysteme benutzen variierende Strategien, um die korrekte Verteilung von Plasmiden an nachkommende Zellen sicherzustellen. Das Aufrechterhalten von Plasmiden in hoher Kopiezahl erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Tochterzellen durch statistische Verteilung mindestens ein Plasmid erben, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass nachkommende Zellen keine Plasmide erben, außerordentlich gering ist. Obwohl die statistischen Verteilungssysteme theoretisch derart funktionieren können, dass sie Plasmide auf sich teilende Zellen verteilen, müssen Plasmide, die Einzelkopie-Plasmide oder low-copy-number-Plasmide pro Zelle sind, aktive Verteilungs-Mechanismen benutzen müssen. So müssen, z. B., Plasmide, die in geringer Kopienzahl oder als Einzelkopie pro Zelle aufrechterhalten werden, wie der E coli-F-Faktor (incF1), Plasmid Prophage P1 (incY) und R1 und NR1 (incF2) aktive Verteilungssysteme benutzen, um Plasmide in der Population sich teilender Zellen aufrechtzuerhalten, da die statistische Verteilung von Plasmiden eine Verlustrate von 25% pro Generation vorhersagen würde. Weiter benutzen einige Plasmide höherer Kopienzahl stellen-spezifische Rekombinasen, um die Mehrfachbildung zu lösen, die funktionell die Kopienzahl von Plasmiden in Zellen und ihre Fähigkeit, sich durch freie Diffusion statistisch zu verteilen, verringern.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen spezifischen Plasmid- oder Phagen-Vektor, einen Wirt oder ein solchen Plasmid- oder Phagen-Vektor beherbergendes abgeschwächtes Bakterium, eine das Bakterium umfassende Zusammensetzung, die Verwendung eines solchen Plasmids für die Herstellung eines Medikaments und ein Verfahren zum Selektieren und Aufrechterhalten bakterieller Transformanden.
Für verschiedene Familien bakterieller Plasmide wurden verschiedene aktive Verteilungssysteme beschrieben. Diese Systeme haben einige gemeinsame Merkmale. Plasmid-Replikationsfunktionen können gewöhnlich bestimmten Regionen von Plasmiden zugeschrieben werden. Plasmid-Replikationsregionen (rep) von, z. B., P1 oder F können unabhängig in Zellen aufrechterhalten werden. Die miniF- oder miniPl-Plasmide, denen Verteilungs-Regionen fehlen, sind jedoch instabil und gehen in Frequenzen, die durch die statistische Verteilung vorhergesagt werden, aus der Population verloren.
Die Entwicklung von Plasmid-Vektoren für die bakterielle Expression heterologer Gene für kommerzielle Zwecke wurde in weitem Maße dokumentiert. Es wurden zahlreiche Klonierungsvehikel auf der Grundlage verschiedener Plasmid-Replikonen beschrieben und für die Produktion von Proteinen in E, coli und anderen Bakterien benutzt. Bei der Entwicklung von Klonierungsvehikeln, die für die Expression von Fremdproteinen geeignet sind, war die übliche Strategie der Entwurf von Plasmiden geringen Molekulargewichtes mit hoher oder regulierter Kopienzahl. Diese Strategien haben manchmal zur Beseitigung von Verteilungs-Funktionen geführt, die ansonsten zu einem stabilen Plasmiderbe geführt haben würden. Klonierungsvektoren hoher Kopienzahl für die Konstruktion von Produktions-Organismen zeigen häufig eine segregationelle Instabilität.
Die üblichste Strategie zum Erhalt stabiler Plasmidreplikation und stabilen Plasmiderbes in der Wirtspopulation bei der Fermentation war der Einschluss arzneimittel-resistenter Determinanten auf dem Klonierungsvehikel. Obwohl die Zugabe von Arzneimitteln zum Wachstumsmedium die Selektion von plasmidhaltigen Zellen gestattet, ist die Hinzufügung von Antibiotika in vielen Fällen wegen der Kosten und der möglichen Verunreinigung des Endproduktes unakzeptabel.
Es wurden verschiedene andere Strategien entwickelt, um eine stabile Plasmid-Beibehaltung während der Fermentation zu erzielen. So wurde, z. B., die parB-Stelle von R1 in eine Vielfalt von üblichen Plasmid-Klonvektoren untergeklont. Resultierende Plaside, die die parB-Region von R1 enthalten, zeigten eine verbesserte Stabilität, wenn sie in Abwesenheit selektiven Druckes gezüchtet wurden. Gleicherweise kann die bog-Region von F instabile oriC-Plasmide stabilisieren und P1-par kann ein mini-F-Plasmid stabilisieren, dem seine eigenen Verteilungs-Funktionen fehlen. Die Stabilität von Klonierungs-Vektoren, die Tryptophan-Operon-Gene enthalten, wurde durch die Hinzufügung der par-Stelle von pSC101 erhöht, und der von p15a (pACYC184) abgeleitete instabile Vielkopien-Vektor wurde durch die par-Stelle von pSC101 stabilisiert. Andere Verteilungs-Regionen, wie eine Verteilungs-Region von einem Virulenz-Plasmid von Salmonella thyphimurium, wurden auch erfolgreich zum Stabilisieren von Klonierungsvehikeln benutzt.
Obwohl Klonierungsvehikel im Wesentlichen durch die Hinzufügung von Verteilungs- Regionen von stabilen Plasmiden stabilisiert werden können, werden während der Fermentation noch immer üblicherweise arzneimittel-resistente Determinanten benutzt. Arzneirnittelresistenz- Marker sind geeignet für die Einführung von Plasmiden in bakterielle Wirtszellen. Alternativ können Plasmide durch Komplementation chromosomaler Wirtsmutationen durch von Plasmiden getragenen Genen in bakterielle Aufnahmezellen eingeführt werden. Komplementations-Systeme beruhen auf der Konstruktion spezieller chromosomaler Wirtsmutationen, doch können sie zuverlässig eingesetzt werden, um den Einschluss von Antibiotika in das Kulturmedium zu umgehen. So kann, z. B., die Komplementation von Nahrungsdefekten zur Plasmidstabilisierung führen. Die Komplementation einer chromosomalen Mutation für Aspartinsemialdehyd-Dehydrogenase (asd) in Salmonella typhimurigm oder die D-Alaninracemase-Mutation (dal) in Bacillus subtili, die zur fehlerhaften Zellwand-Biosynthese und zur Zellauflösung führen kann, ergibt ein stabiles Plasmiderbe bei Abwesenheit der Selektion in allen lebensfähigen Zellen der Kultur. Sowohl die asd- als auch dal-Mutationen können phenotypisch durch Ergänzung mit Ernährungszusätzen repariert werden. Andererseits kann die Komplementation eines wesentlichen Gens des Wirtes, dessen Defekt durch Ernährungsergänzung nicht überwunden werden kann, Plasmide ebenfalls stabilisieren. So ist, z. B., ein E, coli-Gen ssb, für die DNA-Replikation und die Zelllebensfähigkeit erforderlich und verhindert die Ansammlung plasmidloser Zellen während der Fermentation in einem Bioreaktor, wenn es in ein Plasmid eingeführt ist, und es kann zum Komplementieren eines chromosomalen ssb-Defektes eingesetzt werden. Analog stabilüert eine Plasmidkopie von Valyl-tRNA-Synthetase Plasmide in E, coli, die eine temperatur-empfindliche chromosomale Valyl-tRNA-Synthetase enthalten. Plasmide können auch durch den Einschluss eines Bakteriophagen-Repressorgens stabilisiert werden, dessen Verlust zur Einführung von Wirtsprophage und Zelltod führt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft einen Plasmid- oder Phagen-Vektor gemäß Anspruch 1. Es wurde ein stabiles Plasmid- oder Bakteriophagen-Vektorsystem für die Selektion und Aufrechterhaltung für Bakterien entwickelt, die heterologe Genprodukte während der Fermentation produzieren können, oder zur Verwendung bei der segregationalen Stabilisierung von Antigen- Produktion in lebenden geschwächten Bakterien-Vakzinen. Dieses System beruht auf der Komplementation einer chromosomalen Deletionsmutation durch Expression eines funktionellen Gens für Adenylosuccinat-Synthetase (pwrA-Genprodukt).
Es können drei Verfahren zur Schaffung funktionalen purA-Genproduktes (Adenylosuccinat-Synthetase) für Selektion und Aufrechterhalten benutzt werden. Erstens kann ein Plasmid geringer Kopienzahl als Vektor benutzt werden, von dem die Expression des purA-Gens genügt, um den chromosomalen purA-Defekt ohne Überbürden der Zelle mit einem Übermaß an purA-Proteinprodukt zu komplementieren. Ein zweites Verfahren besteht in der Schaffung des purA-Gens auf einem Plasmid hoher Kopienzahl, von dem es unwirksam exprimiert wird. Dies kann erzielt werden durch irgendeines einer Vielfalt von Verfahren, die im Stande der Technik zum nach unten Regulieren der Genexpression bekannt sind, einschließlich der stellen-dirigierten Mutagenese der Promotor- oder Ribosom-Bindesequenzen zur Verringerung der Wirksamkeit der Transcription und folglich Expression des purA-Gens. Ein drittes Verfahren besteht in der Schaffung eines funktionalen purA-Gens auf einem integrierenden Vektor, wie einem Plasmid oder einer Bakteriophage, unfähig ist zur Replikation innerhalb des empfangenden purA-Wirtes, und so Selektieren für die Integration des purA-Vektors.
Dieses System vermeidet die Notwendigkeit, bakterielle Transformanden durch antibiotische Resistenz zu selektieren und verhindert für die Anwendung auf lebende Bakterienvakzin-Vektoren die Abgabe arzneimittel-resistenter Gene in die Umwelt und die Verteilung auf andere Darmflora durch bekannte genetische Mechanismen. Diese Erfindung ist besonders brauchbar bei der Selektion und Beibehaltung von Plasmiden oder integrierenden Vektoren in lebenden geschwächten Bakterienvakzin-Stämmen, sowohl beim Züchten als auch der Vakzinproduktion, und bei den Antigen-Lieferungsphasen in den vakzinierten Wirt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Konstruktion von Plasmid pPX3001, enthaltend das E coli-purA-Gen, unter der Kontrolle des lacZ-Promotors.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von Plasmid pPX3003, enthaltend das L coli-purA-Gen und das Gen, das für die bindende Untereinheit des wärmelabilen Enterotoxins (LT-B) von E coli codiert, unter der Kontrolle des lacZ-Promotors.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Prozent von, du lin SL5653-Zellen, die die purA-Plasmide unter selektiven (ohne hinzugegebenes Adenin) und nicht selektiven Bedingungen (mit hinzugegebenen Adenin) tragen.
Fig. 4A zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel des gesamten zellularen Proteins von Kulturen von SL5653/pPX3003, die in Medien mit Adenin (+ad) oder ohne Adenin (-ad) gezüchtet wurden. Fig. 4B zeigt ein Westernblot der gesamten Zellproteine von SL5653/pPX3003, sondiert mit Ziegen-anti- LT-B-Antiserum und sichtbar gemacht mit HRP-markiertem Protein A.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion von zwei Plasmid-Vektoren geringer Kopienzahl. Plasmid pPX3005 enthält die gesamte für LT-B codierende Sequenz und eine Kanamycin-Resistenz-Determinante. Plasmid pPX3006 enthält das DurA-Gen unter der Kontrolle des lacZ-Promotors.
Fig. 6 zeigt die Konstruktion von drei purA-Plasmid-Vektoren, enthaltend die codierende Sequenz von LT-B (pPX3010), Malaria-Circumsporozoit (CS)-Proteingen (pPX3009) und die Nucleotidsequenz, die für ein LT-B/CS-Fusionsprotein codiert (pPX3007).
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse von in vivo-Stabilisierungs-Untersuchungen von Salmonella thvphimurium-Stämmen durch ourA-Komplementation. S, thyohimurium, gewonnen aus A: Milzen, B: Lebern und C: Peyerschen Drüsen.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse von in vivo-Stabilisierungs-Untersuchungen von S. thypit- Stämmen durch purA-Komplementation. S, thyphi, gewonnen aus A: Lebern und B: Milzen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Stabile Plasmidvektoren für die Komplementation chromosomaler Deletions-Mutationen an der purA-Stelle werden beschrieben. Diese Vektoren können als ein Mittel zum Selektieren von Klonen benutzt werden, die nicht selektierbare Marker oder andere Passagier-Gene während der Klonkonstruktion tragen. Die Vektoren dieser Erfindung können auch dazu benutzt werden, diese Klone während des Wachstums zur Kulturamplifikation, der Vakzinstamm-Produktion und der Genprodukt-Isolation aufrechtzuerhalten.
Stabile purA-Vektoren nach der Erfindung schaffen ein purA-Gen, das zur Exprimierung von Adenylosuccinat-Synthetase, Reparieren irgendeines Fehlers bei der Purin-Biosynthese und Gestatten des Wachstums in der Lage ist. Im Gegensatz dazu können in Stämmen mit fehlerhaftem purA-Gen Purin-Anforderungen nur durch Ernährungs-Ergänzung mit extrazellularem Adenin oder Adenosin erfüllt werden. Das Wachstum von den purA-Vektor tragenden Zellen in einem Medium mit Adeninmangel stellt daher die fortgesetzte Selektion und Aufrecherhaltung des Plasmidvektors sicher. Deletionen des Wirts-purA-Gens sind bevorzugt, da sich diese Mutationen nicht umkehren. Extensive Deletionen sind bevorzugter, weil diese eine extensive Homologie zwischen Plasmid-purA und Chromosom beseitigen, die zu einer chromosomalen Integration des Plasmids und zur Marker-Rettung des purA-Gens in einem doppelten Überkreuzvorfall mit einhergehendem Verlust des exprimierten Passagiergens führen könnte. Der Einsatz eines komplementären purA- Gens aus einer heterologen Bakterienquelle verringert die Häufigkeit dieser möglichen unerwünschten homologen Rekombinationsvorfälle.
Dieses System beruht auf der Komplementation einer chromosomalen Deletions-Mutation durch Expression eines funktionalen Gens für Adenylosuccinat-Synthetase (purA-Genprodukt). Die purA-Stelle ist besonders wichtig beim Design von lebendem abgeschwächten Salmonella und verwandten enterischen Vakzinvektoren, da die Anwesenheit von purA-Mutationen auf dem Chromosom zur Abschwächung der Virulenz führt. In vivo verhindert die Anwesenheit von purA auf einem Plasmid- oder Bakteriophagen-Vektor, der auch für die Expression mindestens eines Polypeptid-Immunogens codiert, das Auftreten von Organismen, denen die Immunogen-Expression fehlt, innerhalb des vakzinierten Wirtes. Kombiniert mit anderen abschwächenden Stellen, wie solchen, die auxotrophe Anforderungen für aromatische Verbindungen bestimmen, führt purA zur weiteren Abschwächung der Virulenz. Die chromosomale Deletion dieser Gene führt wegen des Mangels freier Purine (wie Adenin oder Adenosin) oder von Vitamin-Vorstufen (wie Folsäure), die von der Biosynthese aromatischer Verbindungen abhängen, zur beeinträchtigten Fähigkeit, innerhalb des Wirtes zu replizieren. Salmonella thyphimurium, die Deletions-Mutationen sowohl in aroA als auch in purA aufweisen, sind daher unwirksam bei der Einleitung einer signifikanten Immunantwort, die gegen das Bakterium gerichtet ist, während Bakterien, die nur Defekte in Genen für die aromatische Biosynthese (wie aroA) aufweisen, wirksam Immunantworten induzieren. Obwohl Salmonella, die aro-A-Mutationen aufweisen, zur Replikation in einem begrenzten Ausmaß intrazellulär in der Lage sind, sind solche, die zusätzlich die purA-Mutation enthalten, vollständig unfähig, innerhalb des Wirtes zu replizieren. Durch Abgabe des purA-Produktes von E, coli, das auf einem Plasmid angeordnet ist, an ein aro purA-Wirtsbakterium hat das komplementierte Vakzin in vivo Wachstumseigenschaften, die identisch denen des Aro-Mutanten sind.
Mehrere allgemeine Verfahren zur Selektion und Stabilisierung der Expression unter Einsatz von Plasmid-Vehikeln geringer Kopienzahl, Plasmid-Vehikeln hoher Kopienzahl und Vektoren, die die Gewinnung chromosomaler Integrationsvorfälle in Einzelkopien gestatten, werden hier beschrieben. Im Falle von Vektoren geringer Kopienzahl, kann die Komplementation chromosomaler purA-Defekte den Plasmiden zusätzliche Stabilität verschaffen, die auch funktionale Verteilungs-Stellen enthalten.
Im Falle von Vektoren hoher Kopienzahl nach dieser Erfindung ist das purA-Gen vorzugsweise mutiert, um die Effizienz der Expression des Genproduktes zu verringern und somit die Wachstumshemmung durch nachteilige Wirkungen von zu viel des Adenylosuccinate-Synthetase (purA)-Enzyms zu verhindern.

Konstruktion von purA-Plasmidvektoren

Die rekombinante DNA-Technologie wurde bei der Konstruktion der purA-Plasmide benutzt. Rekombinante Techniken schließen die Einführung spezifischer DNA-Sequenzen in ein DNA- Vehikel (Vektor) ein, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu bilden, das zur Replikation in einer Wirtszelle in der Lage ist. Die eingeführte DNA-Sequenz kann für den empfangenden DNA-Träger fremd sein, d. h., die eingeführte DNA-Sequenz und der DNA-Vektor werden aus Organismen gewonnen, die in der Natur keine genetische Information austauschen, oder die eingeführte DNA- Sequenz kann vollständig oder teilweise synthetisch hergestellt sein. Mehrere allgemeine Verfahren wurden entwickelt, die die Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle gestatten.
Ungeachtet des für die Konstruktion benutzten Verfahrens, muss das rekombinante DNA- Molekül mit der Wirtszelle verträglich sein, d. h., es muss zu einer autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage sein oder stabil in eines oder mehrere der Chromosomen oder Plasmide der Wirtszelle integriert sein. Das rekombinante DNA-Molekül sollte vorzugsweise auch eine Marker- Funktion haben, die die Selektion der erwünschten rekombinaten DNA-Moleküle gestattet. Wenn all die richtigen Replikations-, Transcriptions- und Translations-Signale korrekt auf dem rekombinanten Vektor angeordnet sind, dann wird das Fremdgen, z. B. in den transformierten Bakterienzellen, richtig exprimiert, wie im Falle bakterieller Expressions-Plasmide oder in permissiven Zelllinien oder Wirten, die mit einem rekombinanten Virus infiziert sind oder ein rekombinantes Plasmid tragen, das den geeigneten Replikationsursprung aufweist.
Unterschiedliche genetische Signale und Verarbeitungsvorfälle regeln die Niveaus der Genexpression, wie DNA-Transcription und Messenger-RNA (mRNA)-Translation. Die Transcription von DNA hängt von der Anwesenheit eines Promotors ab, der eine DNA-Sequenz ist, die das Binden von RNA-Polymerase dirigiert und dadurch die mRNA-Synthese fördert. Die DNA-Sequenz eukaryontischer Promotoren unterscheidet sich von solchen prokaryontischer Promotoren. Weiter können eukaryontische Promotoren und diese begleitende genetische Signale in einem prokaryontischen System nicht erkannt werden oder funktionieren dort nicht, und weiter werden prokaryontische Promotoren in eukaryontischen Zellen nicht erkannt und funktionieren dort nicht.
In ähnlicher Weise hängt die Translation von mRNA in Prokaryonten von der Anwesenheit der richtigen prokaryontischen Signale ab, die sich von denen der Eukaryonten unterscheiden. Die wirksame Translation von mRNA in Prokaryonten erfordert eine Ribosom-Bindestelle, die Shine- Dalgarno (S/D)-Sequenz genannt wird (J. Shine und L. Dargano, Nature, 254, 34-38 (1975)), auf der mRNA. Diese Sequenz ist eine kurze Nucleotid-Sequenz von mRNA, die vor dem Startcodon, üblicherweise AUG, angeordnet ist, und die für das Methionin mit Amino(formyl)-Endgruppen des Proteins, codiert. Die S/D-Sequenzen sind komplementär zum 3'-Ende der 16S-rRNA (ribosomalen RNA) und fördern wahrscheinlich das Binden von mRNA an Ribosomen durch Doppelstrangbildung mit der rRNA, um die korrekte Anordnung des Ribosoms zu gestatten.
Die erfolgreiche Expression eines geklonten Gens erfordert genügend Transcription der DNA, Translation der mRNA und, in einigen Fällen, post-translationale Modifikation des Proteins. Es wurden Expressions-Vektoren zum Exprimieren von Genen unter der Kontrolle eines aktiven Promotors in einem geeigneten Wirt und zur Erhöhung der Protein-Produktion benutzt.
Verschiedene regulierende Expressions-Elemente können benutzt werden, die irgendwelche einer Anzahl geeigneter Transcriptions- und Translations-Elemente sind, die in Bakterien aktiv sind. So schließen, z. B., Promotoren, die zum Dirigieren der Expression der rekombinanten Gensequenz benutzt werden können, den Lactose-Operon-Promotor von E. coli, den Hybrid-trp-lac-UV-5- Promotor (tac) (H. Deßoer et al., In Promotor Structure and Function (1982); R. L. Rodriguez und M. J. Chamberlain, Herausgeber, Praeger Publishing, New York), die linken (PL) und die rechten (PR) Promotoren des Bakteriophagen Lambda, Bakteriophagen-T7-Promotoren, den trp-Operon- Promotor, den lpp-Promotor (E, coli-Lipoprotein-Genpromotor; K Nakamura und I. Inouye, Cell, 18, 1109-1117 (1979) usw. ein, doch sind sie darauf nicht beschränkt. Andere Promotoren, die durch rekombinante DNA- oder synthetische Techniken erzeugt werden, können ebenfalls benutzt werden, um für die Transcription der eingeführten Sequenzen zu sorgen.
Für die wirksame Translation eingeführter Sequenzen, die für Protein codieren, sind auch spezifische Initiations-Signale erforderlich. Diese Signale schließen das ATG-Initiationscodon und benachbarte Sequenzen ein. In Fällen, bei denen die natürlichen Gensequenzen, die für ihr eigenes Initiationscodon und benachbarte Sequenzen codieren, in die geeigneten Expressions-Vektoren eingeführt werden, mögen zusätzliche translationale Kontrollsignale nicht erforderlich sein. In Fällen, bei denen die natürlichen Translablons-Signale nicht vorhanden sind, müssen jedoch exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, geschaffen werden. Das Initiationscodon muss weiter in Phase mit dem Leserahmen der für Protein codierenden Sequenzen liegen, um die Translation des gesamten Einsatzes sicherzustellen. Diese exogenen Translations- Kontrollsignale und Initiationscodons können von einer Vielfalt von Ursprüngen sein, die sowohl natürlich als auch synthetisch sind.
Verfahren zum Konstruieren der geeigneten Expressions-Vektoren können rekombinante DNA- und synthetische Techniken in vitro und Rekombinationen (genetische Rekombinationen) in vivo einschließen.
Hinsichtlich Übersichten bezüglich der Maximierung der Genexpression siehe Roberts und Lauer, Meth. Enzymol., 68, 473 (1979) und W. Reznikoff und M. Gold, Maximizing Gene Expression, Plenum Press, New York (1986).
Die US-PS 4,237,224 von Cohen und Boyer beschreibt die Produktion rekombinanter Plasmide unter Anwendung von Verfahren zum Spalten mit Restriktionsenzymen und Verbinden mit DNA-Ligase nach bekannten Verfahren der Ligation. Die rekombinanten Plasmide werden dann mittels Transformation eingeführt und in einzellularen Kulturen, einschließlich prokaryontischen Organismen und eukaryontischen Zellen, die in Gewebekultur gezüchtet werden, repliziert. Ein anderes Verfahren zum Einführen rekombinanter DNA-Moleküle in einzellige Organismen ist von Collins und Hohn in der US-PS 4,304,863 beschrieben. Dieses Verfahren benutzt ein Packungs/Transduktions-System mit Bakteriophagen-Vektoren (Cosmiden).
Der die rekombinante Gensequenz umfassende Expressions-Vektor sollte dann in eine bakterielle Wirtszelle übertragen werden, wo er sich replizieren und er exprimiert werden kann oder einer bedingten Replikation unterliegt. Dies kann nach irgendeinem zahlreicher Verfahren erfolgen, die im Stande der Technik bekannt sind, einschließlich der Transformation (z. B. von isolierter Plasmid-DNA in den abgeschwächten Bakterienwirt), Phagen-Transduktion (Schmeiger, Mol. Gen. Genetics, 119, 75 (1972)), Konjugation zwischen bakteriellen Wirtsarten, Elektroporation usw., darauf jedoch nicht beschränkt.

Expression in abgeschwächten invasiven Bakterien

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der das purA-Gen umfassende Expressions-Vektor in ein abgeschwächtes invasives Bakterium übertragen, wo er exprimiert wird und so einen Bakterienstamm erzeugt, der zum Einsatz als ein lebender Impfstoff geeignet ist.
Es kann irgendeines verschiedener abgeschwächter invasiver Bakterien als ein Vehikel zum Exprimieren des (der) rekombinanten Gens (Gene) benutzt werden, so dass das heterologe Antigen in den Impfstoff-Formulierungen der vorliegenden Erfindung dem Wirts-Immunsystem wirksam präsentiert wird. Die Bakterien behalten ihre invasiven Eigenschaften, verlieren jedoch zum großen Teil ihre virulenten Eigenschaften, was ihre Vermehrung im Wirt zu einem beschränkten Ausmaß gestattet, nicht aber genug, um eine signifikante Erkrankung oder Störung zu verursachen. Beispiele invasiver Bakterien, die in abgeschwächten Formen in den Vakzin-Formulierungen der Erfindung benutzt werden können, schließen Salmonelle spp., invasive E coli (EIEC) und Shigella spp. ein, sind darauf jedoch nicht beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden invasive Bakterien benutzt, die in Lymphoidgeweben, wie der Milz (z. B. Salmonella spp.), residieren.
Solche Bakterien können in Darm-Epithelgewebe und/oder Peyersche Drüsen eindringen, sich durch das reticuloendotheliale System verteilen und Zugang zum mesenteren lymphoiden Gewebe, Leber und Milz, gewinnen, wo sie sich vermehren oder zumindest für eine Zeit überleben und humorale und zell-vermittelte Immunität induzieren.
Abgeschwächte invasive Bakterien können nach zahlreichen Verfahren erhalten werden, einschließlich chemischer Mutagenese, genetischer Insertion, Deletion (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) oder rekombinanten DNA-Methoden (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), Laboratoriums-Selektion natürlicher Mutationen usw., darauf jedoch nicht beschränkt. Verfahren zum Erhalten abgeschwächter Salmonella- Stämme, die nicht umkehrende, nicht virulente, auxotrophe Mutanten sind, geeignet zur Verwendung als lebende Vakzine, sind in den US-PSn 4,550,081 (herausgegeben 29. Oktober 1985), 4,735,801 (herausgegeben 5. April 1988) und 4,837,151 (herausgegeben 6. Juni 1989) beschrieben. Ein zuverlässiges Verfahren zum Abschwächen von Salmonella wurde auch beschrieben (S. K. Hoiseth und B. A. D. Stocker, Nature, 291, 238 (1981); B. A. D. Stocker et al., Develop. Biol. Standard, 53, 47 (1982)) und es kann in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung benutzt werden.
Abgeschwächte Salmonella, die in den lebenden Vakzin-Formulierungen der Erfindung eingesetzt werden können, schließen die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführten Arten ein, sind darauf jedoch nicht beschränkt.

Tabelle 1

SALMONELLA-ARTEN, DIE IN ABGESCHWÄCHTEN FORMEN IN DEN VAKZIN- FORMULIERUNGEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG* BENUTZT WERDEN KÖNNEN

S. thypi
S. thypimurium
S. paratyphi A
S. paratyphi B
S. enteritides
(z. B. Serotyp dublin)
* Für eine vollständige Beschreibung von Salmonella-Serotypen siehe Edward und Ewing, 1986, Classification of the Enterobacteriaceae, 4. Auflage, Elsevier, N. Y.
In spezifischen Ausführungsformen können Salmonella-Bakterien benutzt werden, die durch chromosomale Deletion von Gen(en) für die Biosynthese aromatischer Verbindungen (aro), oder Mutation im galE-Gen oder die Cya-, res- sind oder denen das Vir-Plasmid fehlt, abgeschwächt worden. Aro -Mutanten, die benutzt werden können, schließen S. typhi-Stämme 543Ty und 541Ty zum Einsatz in Vakzinen für Menschen und 3.. typhimurium SL3261 und SL1479 und 3.. enteriditis Serotyp dublin SL1438 (auch als S. dublin bezeichnet) zum Einsatz in Tieren ein, doch sind sie darauf nicht beschränkt (siehe US-PS 4,550,081 für eine Beschreibung von S. typhimurium- Stämmen, wie 543Ty und 541Ty, die aufgrund einer Abschwächung durch Deletion, die die Gene aroA und/oder purA (M. M. Levin et al., J. Clin. Invest., 79, 888 (1987)) in Menschen nicht virulent sind. Mutanten von S. dublin, wie SL1438, und von 3.. typhimurium, wie SL3261, können bei der Entwicklung von Tier-Modellsystemen eingesetzt werden, da diese Arten in der Lage sind, Tierkrankheiten zu verursachen, die Typhoidfieber äquivalent sind. galE-Mutanten, die benutzt werden können, schließem Salmonella thvphi-Stämme Ty21a (Germanier, Bacteria Vaccines, Academic Press, NY, Seiten 137-165), Salmoriella typhimurium G30D, usw. ein, doch sind sie darauf nicht beschränkt.

Expression von Genprodukten und Verwendungen

Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum Einführen, Auswählen und Aufrechterhalten einzelner und mehrerer Kopien homologer und/oder heterologer Gene, entweder in Plasmiden geringer Kopienzahl, Plasmiden hoher Kopienzahl oder integriert in das bakterielle Wirtschromosom als einzelne oder mehrere Kopien.
Exprimierbare Gene können von eukaryontischen Quellen erhalten werden, und sie können für Antigen-Determinanten von pathogenen Parasiten, menschliche immunaktive Peptide und Proteine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Allergene, Tumor-Antigene und andere Proteine codieren. Solche Gene können von Virenquellen erhalten werden und sie können für antigene Proteine, Strukturkomponenten oder Enzyme codieren, die bei der viralen Replikation oder bei Anbinden involviert sind. Homologe Gene sowie heterologe Gene können von bakteriellen, viralen, parasitären, Pilz- oder Säugetier-Quellen erhalten werden, und sie können Gene einschließen, die für Virulenz-Faktoren pathogener Organismen, einschließlich Toxinen, immunogenen Schutzproteinen codieren oder Genen, die für Proteine codieren, die bei der Regulation oder Synthese antigenen Polysaccharidmaterials eine Rolle spielen, und sie können für das Wirtsbakterium Fremdenzyme sein.
Zu den bakteriellen Antigenen von Interesse gehören solche, die mit den menschlichen bakteriellen Pathogenen assoziiert sind, einschließlich Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningiditis, Streptococcus pneumoniae, Streotococcus pyrogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholera, Corvnebacterium diohtheriae, Chlamvdia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Bordetella pertusis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococus aureus, Klebstella pneumoniae und Clostridium tetani. Beispiele spezifischer bakterieller Antigene von Interesse schließen bakterielle Proteine ein, von denen besonders brauchbare Beispiele äußere Membranproteine (z. B. von Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis oder Neisseria meningiditis), bakterialle Toxine (z. B. Pertussis-Toxine, Diphtherie-Toxin, Tetanus-Toxin und Pseudomonas- Exotoxin A) und bakterille Oberflächenproteine (z. B. Flagelline, Hemagluttinine und das M-Protein von Streptococcus pyrogenes sind.
Virale Atigene pathogener Viren schließen den menschlichen Immundefizienz-Virus (Typen I und II), den menschlichen T-Zellen-Leukämievirus (Typen I, II und III), RS-Virus, Hepatitis A-, Hepatitis B-, Hepatitis C-, Non-A- und Non-B-Hepatitis-Viren, herpes simplex-Virus (Typen I und II), Zytomegalovirus, Influenzavirus, Parainfluenzavirus, Poliovirus, Rotavirus, Coronavirus, Rubellavirus, Masernvirus, Varicellavirus, Epstein Barr-Virus, Adenovirus, Papillomavirus und Gelbfiebervirus ein, doch sind sie darauf nicht beschränkt.
Verschiedene spezifische virale Antigene dieser pathogenen Viren schließen das F-Protein (spezielle Antige, enthaltend das F-Peptid 283-315, beschrieben in WO89/02935 mit dem Titel "Respiratory Syncytial Virus: Vaccines and Diagnostic Assays" von P. Paradiso et al.) und die N- und G-Proteine des RS-Virus, VP4-(früher als VP3 bekannt), VP6- und VP7-Polypeptide von Rotavirus, Hüllglykoproteine des menschlichen Immundefizienz-Virus und die Oberflächen- und Voroberflächen-Antigene von Hepatitis B und Herpesglykoproteine B und D ein.
Pilzantigen, das benutzt werden kann, ist solches von Pilzen, einschließlich Candidia spp. (speziell albicans, Cryetococcus spp. (speziell neoformans), Blastomyces spp. (z. B. dermatitidis), Histoplasma spp. (speziell capsulatum), Coccidioides spp. (speziell immi i, Paracoccidioidis spp. (speziell brasiliensis) und Asuergillus spp. ein, sind jedoch darauf nicht beschränkt. Beispiele von Parasiten-Antigenen schließen Plasmodium spp., Eimeria spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Babesia spp., Leishmania spp., Cryptosooridia spp., Toxo lasma spp. und Pneumocystisspp. ein, sind jedoch darauf nicht beschränkt.
Von Interesse sind auch verschiedene Antigene in Verbindung mit Autoimmun-Erkrankungen, wie rheumatoider Arthritis und Lupus erythematosus, Tumorantigene, Krebsantigeneund Einzel- und Mehrfachkopien von Genen, die für Hormone, bioaktive Peptide, Cytokine, Lymphokine und Wachstumsfaktoren codieren, sowie Enzyme und strukturelle Proteine von prokaryontischem oder eukaryontischem Ursprung, speziell zur Verwendung in Vakzinen oder Therapeutika.
Um neue Vakzin-Formulierungen zu schaffen, können Gene, die für Schutzantigene codieren, in die abgeschwächten Bakterien eingeführt werden, die als Liefervehikel zur Stimulierung von Immunantworten gegen das Pathogen wirken, von dem das exprimierte Gen abgeleitet wurde. Siehe Dougan und Tite, Seminars in Virology 1, 29 (1990). Für Antigene codierende Gene, die von pathogenen bakteriellen, viralen oder Parasiten-Quellen abgeleitet sind, können in abgeschwächte Salmonella tvphi zur Verwendung als lebende Vakzine in Menschen eingeführt werden, um, z. B., gegen typhoides Fieber, Diarrhoe-Erkrankungen und sexuell übertragene Erkrankungen, einschließlich AIDS, zu schützen. Alternativ können solche Gene in andere Salmonella eingeführt werden, die zum Infizieren von Tierarten in der Lage sind, z. B.S. duhiin, zur Verwendung als lebende abgeschwächte Rinder-Vakzine (z. B. gegen Transportfieber (shipping fever) oder Rinder- Rotavirus), S. choleraesuis zur Verwendung als lebende abgeschwächte Vakzine für Schweine und S. gallinarum oder S. pullorum zur Verwendung als lebende abgeschwächte Vakzine für Geflügel. In einer speziellen Ausführungsform können von Eimeria-Parasiten stammende Antigene in abgeschwächte S. gallinarum eingeführt werden, um ein orales Vakzin für die Coccidia-Erkrankung herzustellen.
Alternativ können für Antigene codierende Gene in andere Bakterien eingeführt werden, die als Träger zur Lieferung lebenden Vakzins verwendet werden sollen. Beispiele solcher können enteroinvasive Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, hinella flexneri, Shigella dysenteriae, Campylobacter jejuni und Vibrio cholerae einschließen.
Zusätzlich können solche Gene in bakterielle Wirte eingeführt werden, um für die wirksame Produktion antigenen Materials zur Vakzin-Produktion zu sorgen. Die Expression natürlicher oder mutierter Gene, die von bakteriellen Pathogenen stammen, kann zur verbesserten und wirksamen Antigen-Produktion führen. So können, z. B., für mutierte Toxine codierende Gene, für Virulenz- Faktoren oder andere natürliche Proteine oder mutierte Schutzimmunogene codierende Gene in homologe oder heterologe Bakterienstämme eingeführt werden. In vielen Fällen können Virulenz- Faktoren oder Schutzantigene wirksam nur in einem speziellen Wirtsbakterium produziert werden. Zusätzlich können Gene, die für Produkte codieren, die in komplexen Biosynthesewegen involviert sind, die zu bakteriellem Oberflächen-Polysaccharid oder zur Kapselproduktion führen, nicht leicht in anderen Bakterien für den Zweck der Produktion antigenen Materials für Vakzin-Verwendungen geklont und exprimiert werden. Beispiele solcher Verwendungen schließen die Einführung von Genen, die für Mutanten-Kreuzreaktions-Toxine von Bordetella pertussis codieren, in Organismen mit Toxinmangel für die Produktion eines Pertussis-Vakzins ein.
Bakterien, die die stabilen purA-Plasmide dieser Erfindung beherbergen, können als lebende Vakzine für eine Immunantwort auf ein Immunogen in einem warmblütigen Tier eingesetzt werden. Das Verfahren umfasst das Verabreichen des lebenden Vakzins an das Tier derart, dass das in der Vakzin-Zusammensetzung enthaltende Bakterium das Immunogen in einer immunologisch wirksamen Dosis exprimieren kann, die zu einer Immunantwort in der Lage ist. Die Vakzine sind brauchbar zur Verhinderung mikrobieller Infektionen. Die Vakzine können in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht werden, wie physiologischer Salzlösung oder Ethanolpolyolen (wie Glycerin oder Propylenglykol).
Die Vakzine können an einen Menschen oder ein Tier auf verschiedene Weise verabreicht werden. Diese schließen intradermale, transdermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, orale oder intranasale Routen der Verabreichung ein. Die in einem solchen Vakzin benutzte Menge lebender abgeschwächter Bakterien variiert in Abhängigkeit von der Identität des exprimierten Antigens. Die Einstellung und Manipulation festgelegter Dosierungsbereiche liegt im Rahmen fachmännischen Handelns. Die lebenden Vakzine der vorliegenden Erfindung sind vorgesehen für den Einsatz zur Behandlung sowohl junger als auch erwachsener warmblütiger Tiere und insbesondere Menschen.
Typischerweise erfordert die Vakzinierung die Verabreichung von Antigen über eine Dauer von Wochen oder Monaten zur Stimulierung einer "schützenden" Immunantwort. Eine schützende Immunantwort ist eine Immunantwort, die zum Schützen des immunisierten Organismus vor produktiver Infektion durch ein spezielles Pathogen oder Pathogene ausreicht, gegen das (die) das Vakzin gerichtet ist. Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend zu verstehen sind.

Erläuterung durch Beispiele

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Bakterienstämme und Plasmide

Die Bakterienstämme und Plasmide werden in der folgenden Tabelle 2 beschrieben.

Tabelle 2

Bei der Entwicklung stabiler Expressions-Plasmide für Salmonella-Vakzinstämme eingesetzte Stämme

Art/Stamm Bezeichnung Genotyp

Escherichia coli

JM103 supE thi Δ(lac-proAB)hsdR4/F'[traDproAB&spplus;laci9 lacZm15
TX595 purA::mudlacTT(ampr)
TX595.λPB100 purA::mudlacTT(ampr) λPB100(cmr)

Salmonella.-Arten

S. typhimurium
SL5495 zbj-908::Tn10purAΔ155
SL3261 hisG46aroADEL407
SL3261pur hisG46aroADEL407 CRR[zbj-908::Tn10]TcspurAΔ155
S. dublin
SL5653 SVA47aroAA148 CRR[zbj-908::Tn10]TcspurAΔ155
S. tvpohi
CDC10-80 Wildtyp
679Ty aroADEL148
BB1333 aroADEL14BaroDä9
BB1354 aroADEL14BaroDΔ9 CRR[zbj-908::Tn10]TcspurAΔ155

Medien und Züchtung von Bakterien

Bakterien wurden in M9-Medium gezüchtet, das mit 0,5% Casaminosäuren, 0,2% Glucose, 0,02% MGSO&sub4; · 7H&sub2;O, 5 ug/ml Thiamin, 1 mM Natriumcitrat, 5 ug/rwe Nikotinsäure, 30 ug/mlt jeweils von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, 10 gg/ml 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 10 ug/ml p- Aminobenzoesäure und 1 ug/ml Adenin ergänzt worden war. Platten enthielten 15 g Agar/l. Es wurden 100 pg/ml Ampicillin hinzugegeben.

Genetische Transformation und Transduktion

Plasmide wurden direkt durch Elektroporation mit einem BTX Transfector 100 mit der 0,5 mm-Elektrode und einer Feldstärke von 15 kV/cm in Salmonella eingeführt.
Plasmid-Konstruktionen, die von der Ligation synthetischer Oligonucleotide in Plasmide resultierten, wurden in gewöhnliche Laboratoriumsstämme von Escherichia coli durch Transformation eingeführt (hinsichtlich Einzelheiten siehe Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York (1982)). Plasmid-Konstruktionen wurden isoliert und, wegen der hohen Transformations-Frequenzen von E. coli K-12 mit Bezug auf solche von S. typhimurium. zuerst in E. coli charakterisiert, bevor sie zu Salmonella spp. transferiert wurden,. Plasmide wurden in S. typhimurium LT-2 LB5010, einen Stamm, der restriktionsnegativ (aber modifikationsfähig) für die drei Restriktions-Systeme von Salmonella typhimurium ist, transferiert und der auch eine Mutation in galE enthält, die in höheren Transformations- Frequenzen resultiert (eine Beschreibung der Restriktions-Systeme von Salmonella typhimurium, siehe Bullas et al., J. Bacteriol" 141, 275 (1980)).
Plasmide wurden dann durch Transduktions-Techniken in abgeschwächte Salmonella eingeführt. LB5010, enthaltend das erwünschte Plasmid, wurde in Luriabrühe (LB) bis zu einer Dichte von 3 · 10&sup8; Zellen/ml gezüchtet, woraufhin D-Gallactose (bis zu einer Endkonzentration von 1%) zum Züchtungsmedium hinzugegeben wurde, um die Synthese von "glattem" Lipopolysaccharid (LPS) zu induzieren. Nach 1,5 Stunden des Züchtens in Gegenwart von D-Gallactose wurde Bakteriophage P22 HT 105/1 int zu der Kultur hinzugegeben bis zu einer Infektionsmultiplizität von eins. Nach der Absorption der Phage wurden Zellen in LB, die 0,7% Agar enthielt, immobilisiert. Phagen wurden geerntet und zum Transduzieren von Plasmiden in abgeschwächte P22-empfindliche Salmonella benutzt.

Elektrotransfer-Verfahren für den Antigen-Nachweis

Heterologe rekombinante Proteinsynthese wurde in E coli- und Salmonella-Vakzinstamm- Witrszellen durch Transblotten von Proteinproben, getrennt durch Polyacrylamid-Elektrophorese auf Nitrocellulose-Membranen, Blockieren mit 1,5% Tween-20 PBS, gefolgt vom Antikörperbinden in 0,1% Tween-20, nachgewiesen. Gebundene Antikörper wurden mit mit Meerettich-Peroxidase markiertem Protein A (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Für den Nachweis von LT-B-Antigen war der primäre Antikörper polyklonales Ziegen-α-LT-B-Reagenz, teilweise gereinigt durch Eluieren gebundenen Materials aus einer Sepharose 4B-Protein A-Affinitätssäule.

Restriktionsenzym-Analyse

Die horizontale Gel-Elektrophorese von DNA wurde unter Anwendung von Standardverfahren (Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Habor, NY) ausgeführt. Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) und New England Biolabs Inc. (Berverly, MA) gekauft.

In Vitro-Stabilitätstests

Stabilitätstests für plasmidhaltige Stämme wurden unter Benutzung von Verdünnungen von 1 : 1.000 von über Nacht-Kulturen in M9-Medium, das, wie oben beschrieben, ergänzt war, ausgeführt. Verdünnungen wurden doppelt auf selektive und nicht selektive Medien plattiert, um die Plasmid-Beibehaltung zu bestimmen. Zusätzlich wurden Kolonien von nicht selektiven Platten unter Benutzung einer FMC-RepliPlate (Rockland, ME) auf selektive Platten repliziert, um die Plasmid-Beibehaltung zu verifizieren.

Immunisierung von Mäusen

Inocula wurden in M9-Medium, das, wie oben beschrieben, ergänzt worden war, bis zu einer Dichte von 3 · 10&sup8; Organismen/me gezüchtet, wie mittels eines Klett-Sommerson Kolorimeters bestimmt. Zellen wurden bei 5.000 U/min 15 Minuten lang bei 4ºC pelletisiert und dann in 1,5% (Gew/Vol) Natriumbicarbonat zu zweimal 1010 Organismen/ml (Klett 100) für intragastrale (i.g.) Inoculation und in phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2, zu 1 · 10&sup7; Organismen/me für intravenöse (i.v.) und intraperitoneale (i.p.) Inoculation resuspendiert. Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden routinemäßig benutzt (Jackson Laboratorys). Nahrungsmittel und Wasser wurden vor der i.g.-Inoculation 4 Stunden lang vorenthalten und 30 Minuten nach der Inoculation wieder gegeben. Es wurden 1 · 10¹&sup0; Organisme/ml (0,5 ml Inoculum) i.g. unter Benutzung einer Perfektum-Intubationsnadel (18 G · 2") verabreicht. Es wurden 1 · 10&sup6; Organismen/m² (0,1 nie) für i.v.- und i.p.-Inoculationen benutzt.

Probensammlung

Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inoculation getötet. Die Leber, Milz und drei Payersche Drüsen wurden aus jedem Tier entfernt, in einzelenen sterilen Beuteln angeordnet und mit einem Stomacher Modell 80-Mischer 30 Sekunden lang homogenisiert (A. J. Seward, London) unter Einsatz von 5 mf von PBS (pH 7,2) für jede Leberprobe und 2 me für jede Milz- und Payersche Drüsen-Probe.

Bakterielle Kolonisierung und Plasmid-Stabilität

Organ-Homogenisate wurden auf selektivem und nicht selektivem M9-Medium plattiert, das, wie oben beschrieben, ergänzt worden war, um die Plasmid-Beibehaltung zu bestimmen. Auf nicht selektiven Platten gezüchtete Kolonien wurden auf SS-Agar (Difco, Detroit, Michigan) und auf selektiven Platten repliziert, um die Prozent plasmidhaltiger Kolonien zu verifizieren.

RESULTATE

Komnlementation von purA-Auxotroohie in E. coli und Salmonella

Das Produkt des purA-Gens, Adenylosuccinat-Synthetase (EC 6.3.4.4), katalysiert die Synthese von Adenylosuccinat aus Inosinmonophosphat (IMP). Dieses Enzym katalysiert die erste ausgeführte Stufe beider Synthese von Adeninmonophosphat (AMP) und es ist auch bei Rettungswegen und der Interkonversion von Nucleotiden beteiligt. Mutanten von E. coli und anderen eng verwandten enterischen Bakterien, die einen Mangel im Strukturgen für Adenylosuccinat-Synthetase (g zLrA) haben, hängen für ihr Wachsturn von Adenin- oder Adenosin-Nahrungszugaben ab.
Das Gen für E coli- urA ist in einem KpnI-Restriktionsenzym-Fragment von 3,2 Kilobasenpaaren in Plasmid pJS76 (S. A. Wölfe und J. M. Smith, "Nucleotide sequence and analysis of the uurA gene encoding adenylosuccinate synthetase of Escherichia oli K12", J. Biol. Chem., 263, 19147- 19153 (1988)) enthalten. Zur Konstruktion von Plasmiden, die entweder E coli- oder Salmonella- DurA-Auxotrophien komplementieren, wurde Plasmid pJS76 (erhalten von John M. Smith, Seattle Biomedical Research Institute) als eine Quelle des E. coli-uurA-Genproduktes benutzt. Anfänglich wurde das purA-Gen in pUC19 durch Verknüpfen eines AccI-Fragmentes mit glatten Enden von 1,75 Kilobasenpaaren mit dem DraI-MmaI-Fragment von pUC19 in pUC19 eingeführt, wie diagrammartig in Fig. 1 gezeigt. Plasmid pPX3001 wurde in E coli TX595 durch Selektion auf adenin-unabhängige Kolonien gewonnen. Dieses anfängliche Konstrukt, pPX3001, behielt im Wesentlichen den Ursprung der Replikation des pUC-Ausgangsvektors und ersetzte das β-Lactamasegen durch p irA, während gleichzeitig verschiedene brauchbare Klonierungsstellen für die weitere Modifikation des Plasmids beibehalten wurden. Dieses Plasmid komplementierte wirksam den piarA-Gendefekt in E coli TX595 und führte zu einer Plasmid-Phenotypcharakteristik hoher Kopienzahl von pUC-Plasmiden.
Plasmid pPX3001 wurde weiter dahingehend modifiziert, dass es ein zusätzliches exprimiertes Genprodukt enthielt. Das Gen für die atoxische Untereinheit von enterotoxigenem labilen E coli-Toxin (LT-B) auf einem EcoRI-HindIII mit glatten Enden von 600 Basenpaaren wurde unter Benutzung einer BamHI-Stelle mit glatten Ende in pPX3001 kloniert, wie in Fig. 2 gezeigt. Dieses Plasmid-Konstrukt, pPX3003, wurde durch Transformieren von E. coli DX595 und Selektieren adenin-unabhängiger Klone gewonnen, die Protein exprimierten, das auf Kolonieblots mittels polyklonalen Anti-LT-B-Antikörpern erkannt wurde.
Um die Stabilität des purA-Vektors zu untersuchen, wurden Plasmid pPX3001 und das derivative LT-B-Expressionsplasmid pPX3003 in S. dublin SL5653 oder in S. typhimurium BB1231, Derivativen von Salmonellg-Vakzinstämmen transformiert, die Deletions-Mutationen im pnrA-Gen aufweisen. Salmonella-Transformanden wurden dann auf die Anwesenheit der antizipierten Plasmide durch DNA-Analyse und im Falle von pPX3003 hinsichtlich der Expression von LT-B untersucht. Geeignete Isolate jedes Stammes wurden dann auf die Beibehaltung von Plasmiden nach dem Durchgang ja xjten, vitro unter selektiven und nicht selektiven Bedingungen untersucht. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurden die plasmidhaltigen Kolonien anfänglich unter selektiven Bedingungen gezüchtet, z. B. in definiertem Medium ohne Adenin in Übernachtkulturen. Proben in Übernachtkulturen wurden gewaschen und in frischem Medium verdünnt, entweder mit oder ohne Adenin-Zusatz. Nach 10 Wachstumsgenerationen wurden Kulturen in ähnliches frisches Medium übertragen. Nach jeweils 10 Generationen wurden Proben von den Kulturen genommen, verdünnt und auf entweder selektives oder nicht selektives Agarmedium plattiert. Der Anteil der Kolonien, der auf nicht ergänzten Medien zum Wachstum in der Lage war, repräsentiert den Anteil der Kulturpopulation, der ein komplementierendes purA-Plasmid enthielt. In nicht ergänzten Medien enthalten 100% der Kolonien komplementierende purA-Plasmide, während nur ein kleiner Prozentsatz resultierender Kolonien vom Durchgang unter Adenin-Zusatz (nicht selektiven Bedingungen) nach 40 Wachstumsgenerationen Plasmide enthalten. Weiter wird in den Kulturen von SL5653, die das LT- B-Expressionsplasmid pPX3003 enthalten, die LT-B-Expression und die Antigenizität in der unter selektiven Bedingungen gezüchteten Kultur aufrechterhalten, unter nicht selektiven Bedingungen jedoch verloren. Nach 40 Generationen exprimiert jede der Kolonien von pPX3003/SL5653, die unter selektiven Bedingungen auf selektivem Agar gezüchtet wurden, LT-B und zeigt keine Segregation von purA- und der LT-B-Expression (siehe Tabelle 3 und Fig. 4). Tabelle 3 Beibehalten von Expressionsplasmiden mittlerer und hoher Kopienzahl während der Züchtung von Salmonella unter selektiven und nicht selektiven Kulturbedingungen
¹ Plasmidgehalt wurde durch Nummerieren von Kolonien aus Kulturverdünnungen auf Medium mit und ohne Selektion bestimmt, n.d. = nicht bestimmt.
Diese Resultate zeigen, dass das exprimierte purA-Gen, das auf einem pUC-Plasmid hoher Kopienzahl getragen wurde, Plasmide bei Abwesenheit exogener Adenin-Zufuhr stabilisiert. Obwohl die purA-Komplementation ein LT-B-Expressionsplasmid in vitro stabilisierte, sind die speziellen Plasmide pPX3001 und pPX3003 wahrscheinlich nicht optimal brauchbar in einem lebenden Salmonella-Vakzin, da eine Kombination der purA- und/oder der LT-B-Expression an sich in der obigen Konfiguration die Wachstumsrate des Wirtes Salmonella beeinträchtigt. In dem definierten Salzmedium (M9), enthaltend Kasaminosäuren, hatten pPX3001/SL5653 und pPX3003/SL5653 eine Verdoppelungszeit von 1 Stunde, während in dem gleichen Medium, ergänzt mit Adenin, gezüchtetes SL5653 eine Verdoppelungszeit von etwa 30 Minuten aufwies. Obwohl die Beeinträchtigung der Wachstumsrate zu einer weiteren Abschwächung der Bakterien nach dem oralen Zuführen resultieren würde, ist es auch wahrscheinlich, dass die verminderte Fähigkeit zur Schaffung einer transienten Infektion im Wirtstier zu einer verminderten Immunogenität führen würde. Obwohl Plasmide durch Komplementation chromosomaler purA-Deletion stabilisiert werden, schwächt die Überexpression des Antigens den Vakzinstamm zu stark.
Es ist bekannt, dass die pUC-Vektorplasmide hoher Kopienzahl in E. coli- und Salmonella- Stämmen stabil sind. Die beobachtete Instabilität der purA-Derivate der pUC-Plasmide ist wahrscheinlich der Expression des purA-Genproduktes in großer Menge zuzuschreiben (auf SDS-PAGE als ein 40 Kdalton-Protein zu sehen). Die Vektoren der vorliegenden Erfindung überwinden diese nachteilige Überexpression des purA-Gens durch eines von zwei Verfahren. Erstens durch Verwendung von Plasmiden geringer Kopienzahl zur Verringerung der Kopienzahl des pur-A-Gens und somit seiner Expression und zweitens durch Verwendung von Plasmiden hoher Kopienzahl, die ein purA-Gen tragen, das ineffizient exprimiert wird.

Expressionsplasmide-geringer Kopienzahl und integrierte exprimierte Gene

Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass Genexpression, die neutral für die in vivo -Wachstumseigenschaften eines lebenden Salmonella-Vakzinstammes sind, kombiniert mit genetischer Stabilität, eine maximal immunogene Vakzin-Konfiguration ergeben sollten. Geeignete Niveaus der Genexpression können inhärent in Beziehung stehen zu den Eigenschaften des exprimierten Gens sowie dem Niveau, bis zu dem es im Salmonella-Vakzinstamm exprimiert wird. Mehrere Faktoren, die die Toleranz des bakteriellen Wirtsstammes für die Antigen-Expression beeinflussen können, schließen die intrazellulare Lokalisation des Antigens, das Niveau der Expression und die Stabilität des Antigens gegenüber proteolytischer Bearbeitung ein. Einige dieser Faktoren können ihrerseits durch Transcriptions- und Translations-Signale, wie Promotor-Festigkeit, Wirksamkeit der Ribosom-Rekrutierung und Kopienzahl des Gens, beeinflusst werden.
Um eine Situation zu schaffen, bei der die LT-B-Expression durch purA-Komplementation stabilisiert und für das Wachstum eines Salmonella-Vakzinstammes neutral gemacht worden war, wurde die Auswirkung der Kopienzahl des Gens auf die LT-B-Expression und die Toleranz durch den Salmonella-Wirt untersucht. Dies wurde unter verschiedenen Bedingungen untersucht, einer, bei der lac-Promotor kontrolliertes LT-B auf einem Plasmidvektor geringer Kopienzahl exprimiert wurde, und einer, bei der LT-B als eine einzelne Chromosomenkopie exprimiert wurde.
Um ein LT-B-Expressionsplasmid geringer Kopienzahl zu konstruieren, wurde Plasmid pGD103 (R. A. Deich et al., J. Bacteriol., 172, 489-498 (1988)) mit EcoRI und HincII verdaut und ein EcoRI-SsaI-DNA-Fragment, enthaltend die gesamte LT-B-Codierungssequenz, wurde in den Vektor geklont, um pPX3005 zu ergeben, ein LT-B exprimierendes Plasmid, das auch eine Kanamycin-Resistenz-Determinante enthielt (siehe Fig. 5). Plasmid pPX3005 wurde durch Elektroporation in S. typhimurium 5L3261 transformiert. Das Wachstum des pPX3005 beherbergenden SL3261 wurde mit SL3261, enthaltend das Eltern-Plasmid und mit richtigem SL3261 verglichen. In M9-Medium, enthaltend 0,5% Kasaminosäuren, wurde kein Unterschied in der Wachstumsrate zwischen den drei Stämmen gesehen, wobei jeder Verdoppelungzeiten von etwa 45 Minuten aufwies. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das Expressionsniveau von LT-B in dieser Konfiguration für die Wachstumseigenschaften des Wirtes SL3261 neutral war.
Ein chromosomaler Integrant von LT-B wurde in der folgenden Weise erhalten: Ein Plasmid, enthaltend eine umgekehrte 31-Basen-Wiederholung, abgeleitet von den extremen Enden von TnlO und dem exprimierten Transposongen von TnlO unter der Kontrolle des tac-Promotors, der außerhalb der invertierten Wiederholungssequenzen angeordnet war, wurde zur Schaffung eines Transposons benutzt, das LT-B exprimierte. Ein HaeII-Restriktionsenzymfragment mit 800 Basenpaaren, das die lac-Promotorregion und das strukturelle Gen für LT-B trug, wurde in den Transposonvektor geklont, der auch eine Kanamycin-Resistenz-Determinante enthielt. In dieser Konfiguration wurde das Gen für LT-B und Kanamycin-Resistenz durch die invertierten Wiederholungssequenzen flankiert. Um einen Suizidvektor zum Einsatz in Salmonella-Stämmen zu erzeugen, wurde das LT-B und Kanamycin tragende Transposon in ein Derivat von λgtl1 gekreuzt, so dass ein Hybridphagen- Teilchen, das das LT-B-Transposon und die TnlO-Transposase trug, konstruiert wurde. Diese Techniken sind ähnlich Modifikationen von Transposonen, die durch Herrero et al. in J. Bacteriol., 172, 6537-67 (1990) beschrieben sind. Die modifizierte X-Phage, die das LT-B-Transposon trug, wurde zum Infizieren von Salmonella LB5010/F112, die einen exprimierten X-Phagenrezeptor trug, benutzt. Da DNA der Phage λ nicht in Salmonella repliziert wird, resultieren für Kanamycin-Resistenz ausgewählte Klone aus der Transposition des modifizierten Transposons auf das Chromosom. Mehrere unabhängige Isolate wurden erhalten, alle exprimierten das LT-B-Antigen. Mehrere der S. typhimurium LB5010-Isolate wurden beibehalten und auf diesen fortgepflanzte P22-Phagenlysate wurden zum Transduzieren der chromosomal angeordneten Expressionskassette in den Salmonella- Vakzinstamrn SL3261 benutzt. Zwei unabhängige chromosomale SL3261-LT-B-Integranten, resultierend von der Transduktion zweier separater Alele, die an verschiedenen Stellen im Salmonella- Chromosom angeordnet waren, wurden als stabil in vi r und in VIV0 gefunden.

Konstruktion eines purA-Vektors geringer Konienzahl

Plasmid pGD103 wurde dahingehend modifiziert, dass es das purA-Gen von E. coli und verschiedene einzigartige Klonierungsstellen enthielt. Das Accl-Fragment mit 1,7 Kilobasenpaaren von pJS76 wurde in die XnmI-XhoI-Stellen von pGD103 eingeführt, um pPX3006 zu ergeben (siehe Fig. 5). In diesem Plasmid war die Kanamycin-Resistenz-Determinante vollständig durch purA ersetzt, was einen Vektor mit einzigartigen BamHI-, SmaI-, PstI- und Sah-Stellen schuf.

purA-Vektor geringer Kopienzahl enthaltend PL-Promotor-Exnressionskassetten

Plasmid pPX3006 wurde als ein Vektor zur Konstruktion mehrerer Plasmide geringer Kopienzahl benutzt, die Genprodukte unter der Kontrolle des starken X-PL-Promotors exprimierten. Es wird erwartet, dass gewisse Genprodukte, deren Transcription durch den P1-Promotor geregelt wird, in der bakteriellen Wirtszelle in hohen Niveaus produziert wird, verglichen mit Genen unter der Kontrolle schwächerer Promotoren, wie dem lac-Prornotor. Weil Salmonella-Stämme für die Bakteriophage X bekanntermaßen nicht lysogen sind, wird die Expression von PL-geförderten Proteinen aus Plasmiden konstitutiv. Kombiniert mit der Stabilisierung durch Komplementation von purA werden solche Konfigurationen möglicherweise geringe Niveaus der Genexpression überwinden, die mit einer geringen Kopienzahl des Vektorplasmids, pPX3006, verbunden sind und die Immogenität der lebenden abgeschwächten rekombinanten Salmonella-Stämme fördern.
Mehrere Versionen des Circumsporozoidprotein (CS)-Gens von Plasmodium berghei wurden in pPX3006 stabilisiert. Das CS-Gen wurde als eines der hauptsächlichen Immunogene des Malaria- Sprozoidüberzuges einbezogen, und als solches ist es ein Kandidat für das Untereinheits-Herangehen für ein Malariavakzin. Die Strukturen mehrerer CS-Gene wurden ermittelt, wobei festgestellt wurde, dass alle eine ähnliche Gesamtstruktur aufweisen. Das einzelne hervorragende Merkmal jeder ist, dass sie ein zentrales wiederkehrendes Peptid enthalten, das bis zu einem Drittel des Proteins umfasst. Die Wiederholungsregionen sind immundominant, da die Masse der Antisporozoid-Antikörper gegen diese Regionen gerichtet ist. Obwohl Antikörper der Wiederholungsregionen in dem Schutz gegen das Sporozoid-Stadium der Malaria einbezogen wurden, sind Antikörper allein ungenügend, um Schutz gegen Sporozoid-Infektion zu erzielen. Es ist wahrscheinlich, dass der Schutz gegen das Sporozoid-Stadium von Malaria-Parasiten nicht nur eine humorale Antwort, sondern auch eine starke T-Zellen-Antwort einschließt. Die wahrscheinlichste Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten, die Abschnitte des CS-Proteins und anderer Proteine des sich entwickelnden Sporozoids auf der Oberfläche sporozoid-infizierter Hepatozyten erkennen, ist für den Schutz erforderlich. Vakzine, die solche Antworten spezifisch oder in Verbindung mit humoralen Antworten stimulieren sollen, sind in wirksamen Malariavakzinen erforderlich. Die Stimulierung zellularer Immunität auf dem Niveau cytotoxischer T-Zellen kann durch Abgabe von Antigen an antigen-präsentierende Zellen in einer Weise erzielt werden, dass sie wahrscheinlich durch einen inneren Weg der Verarbeitung behandelt werden. Die Präsentation von Antigenen über interne Wege kann vorzugsweise zu einer Oberflächen-Expression von Antigen in Verbindung mit beschränktem Klasse I MHC resultieren, üblicherweies verbunden mit der Stimulierung cytotoxischer CD8±-T-Zellen. Die Expression des CS-Proteins von P. berghei und P. falciparum in abgeschwächten Salmonella und nachfolgende orale Immunisierung führte zu einer Induktion spezifischer cytotoxischer CD+-T-Zellen, die Peptide dieser CS-Proteine erkennen. Die orale Immunisierung von Mäusen mit CS-Protein-Konstrukten von P. berghei führte zu einem signifikanten Schutz gegen Sporozoid-Angriff, der üblicherweise nur durch Vakzinierung von Tieren mit Sporozoiden erzielt wird, die mit γ-Strahlen inaktiviert wurden.
Obwohl der Schutz gegen Sporozoiden-Angriff durch Vakzinierung mit CS-Protein exprimierender Salmonella dokumentiert wurde, war der Schutz unvollständig, was nahelegt, dass die angemessene Induktion von Immunität nicht aufgetreten war. Dies legt nahe, dass Faktoren mit Bezug auf die CS-Proteinexpression im abgeschwächten Salmonella-Vakzinstamm hinsichtlich verbesserter Immugenität manipuliert werden könnten. Solche Faktoren schließen, wie oben erwähnt wurde, genregulierende Signale ein, die vermutlich das Niveau der Proteinexpression, die Stabilität des exprimierten Proteins und die genetische Stabilität des exprimierten Proteins beeinflussen. Wenn während der vorübergehenden Infektion durch abgeschwächte Salmonella ein signifikanter Anteil der immunisierenden Bakterien aufgrund von Segregation Plasmid verlieren, dann tritt eine wirksame Immunisierung nicht auf.
Um die Stabilisierung von CS-Proteinkonstrukten durch Komplementation von purA zu bewerten, wurde ein CS-Proteinkonstrukt voller Länge in die BamHI-Stelle von pPX3006 eingeführt. Dieses Konstrukt enthält die gesamte Codierungssequenz des P. berghei (ANKA)-CS-Proteingens, exprimiert vom PL-Promotor, und wurde pPX3009 (Fig. 6) bezeichnet. Ein zweites Konstrukt, enthaltend ein verkürztes CS-Protein (pPX1601), exprimiert vom P1-Promotor als ein Fusionsprotein mit den ersten 30 Aminosäuren von LT-B, wurde in die BamHI-Stelle von pPX3006 eingeführt. Dieses Konstrukt enthält ein LT-B-Fusionsprotein mit einem exprimierten Abschnitt des CS-Proteins, dem 60 Aminosäuren des Aminoendes und 30 Aminosäuren des Carboxyendes fehlen. Dieses Konstrukt wurde als pPX3007 (Fig. 6) bezeichnet. Beide Konstrukte wurden durch Auswahl hinsichtlich Purin-Unabhängigkeit S., typhimurium-BB1231 (ΔpurA) transformiert. Wurde die Expression mit ihren verwandten Elternplasmiden hoher Kopienzahl (abgeleitet von pBR322) verglichen, dann war kein Unterschied im Expressionsniveau in 5L3261 ersichtlich, was nahelegt, dass die Genexpression von der Kopienzahl des Gens abgekoppelt war.
Es wurde eine dritte promotor-kontrollierte Expressionskassette hinsichtlich Stabilisierung durch purA-Komplementation untersucht. Die Codierungssequenz für LT-B (auf einem CoRI- HindIII-Fragment mit 590 Basenpaaren, geblunted durch die Wirkung von Klenow-Enzym) wurde in die HpaI-Stelle von pFD. (Pharmacia Molecular Biologicals, Piscataway, NJ) eingeführt, um pPX1602 zu ergeben. Die Codierungssequenz von LT-B, nun auf einem BhmHI-Fragment von 1,7 Kilobasenpaaren lokalisiert, wurde in die BamHI-Stelle von pPX3006 eingeführt, um pPX3010 (Fig. 6) zu ergeben. Dieses Plasmid wurde in BB1231 transformiert. Die Expression von LT-B- Antigen wurde an verschiedenen Punkten im Wachstumszyklus von Salmonella verglichen und wurde zwischen integrierten Genformen, Plasmidformen hoher Kopienzahl und Plasmidformen geringer Kopienzahl verglichen. Die maximale Genexpression wurde in Übernachtkulturen der Bakterien gefunden. Das Expressionsniveau stand in Beziehung zur Kopienzahl des Gens, wenn die Expression von LT-B durch den lac-Promotor kontrolliert wurde. Die Expression war am größten in den pPX100 enthaltenden Kulturen, gefolgt von pPX3005; die geringste Expression ergab sich in Kulturen von SL3261λ3. Die Expression von LT-B von pPX3010 überstieg jedoch die in Kulturen von pPX100 beobachtete, was zeigte, dass der starke PL-Promotor die Wirkungen der Gen- Kopienzahl für die Expression von LT-B-Antigen überwunden hatte.

In Vitro Stabilität von integranten Expressionskassetten geringer Kopienzahl und von Chromosomen

S. typhimurium SL3261-Stämme, die Expressionskassetten auf pPR322-, pUC- oder pSC101- Derivaten tragen, wurden hinsichtlich der Stabilität beider Züchtung bei Abwesenheit von Selektion verglichen. Wie in Tabelle 3 ersichtlich, waren pUC-Vektorplasmide oder Expressionsplasmide auf der Grundlage von pUC-Plasmiden sehr instabil beim Züchten in vitro ohne Ampicillin-Selektion. Ein von pBR322 abgeleitetes Plasmid (pPX1601), das ein verkürztes (oben beschriebenes) P. berghei CS/LT-B-Fusionsprotein exprimiert, zeigte einen signifikanten Verlust von passierten Kulturen bei Abwesenheit von Ampicillin.
Wurde irgendeine dieser Expressionskassetten in entweder pGD103 oder sein purA-Derivat (pPX3006) geklont, dann wurde die 100%-ige Beibehaltung von Expressionsplasmiden für bis zu 80 Generationen beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass Plasmide auf der Grundlage von pSC101- Replicon inhärent stabil in S. typhpimurium sind. Weiter, daß pur,A-Gen von E .coli wirksam beim Ersatz von Arzneimittel-Resistenz-Determinanten ist, die üblicherweise mit Klonierungsplasmiden verbunden sind (siehe Tabelle 4). Tabelle 4 Aufrechterhaltung von parB-haltigen Expressionsplasmiden geringer Kopienzahl während der Züchtung von Salmonella typhimurium unter selektiven und nicht selektiven Kulturbedingungen
¹ Plasmidgehalt wurde durch Nummerieren von Kolonien aus Kulturverdünnungen auf Medium mit und ohne Selektion bestimmt, n.d. = nicht bestimmt.
Plasmidvektoren, die die mit pSC101 verbundenen Partitions-Regionen und -Funktionen enthalten, sind unter Bedingungen von Ansatzkulturen in E coli und Salmonella stabil. Obwohl die par-Region von pSC101 in pGD103 und den hier beschriebenen purA-Derivaten beibehalten wird, können die Partitions-Funktionen allein nicht genügen, um die wirksame Plasmid-Stabilisierung während der Fermentation der rekombinanten Vakzinstämme während der Produktion zu gestatten (Nilsson und Skogman, Biotechnolopv 4, 901-903 (1986)). Die Plasmid-Komplementation einer purA- Deletionsmutation auf dem Chromosom, kombiniert mit der Beibehaltung von Partitions-Funktionen, gestattet eine wirksame Stabilität während der Ansatzzüchtung, Züchtung unter nahrungsbegrenzenden Bedingungen und während der Fermentation.

In vivo-Stabilisierunp von Salmonella typhimurium-Vakzinstämmen durch nurA-Komplementation

Um die Stabilisierung von pSC101-Plasmiden durch urA-Komplementation unter Vakzinierungs-Bedingungen zu untersuchen, wurden Mäuse oral mit SL3261, BB1231 (SL3261ΔpurA) und pPX3006/BB1231 immunisiert. Es wurden Organproben entnommen und auf die Anwesenheit der immunisierenden Organismen bis zu 30 Tagen nach der oralen Einnahme der Bakterien untersucht. In Fig. 7 ist ersichtlich, dass BB1231 aus Proben von Milz, Leber und Payerschen Drüsen in sehr geringen Niveaus nur 2 Tage nach der Inokulation gezüchtet werden konnten, während SL3261 und komplementiertes BB1231 in Gewebeproben für mehrere Wochen gewonnen werden konnten. Der komplementierte Vakzinstamm ergab in vivo-Wachstumscharakteristika ähnlich, wenn nicht identisch, innerhalb statistischer Variation mit SL3261. Dies zeigt, dass die purA- Komplementation wirksam die chromosomale purA-Deletion zum pur+-Verhalten restauriert und effektiv neutral ist gegenüber Invasion und bakteriellen Replikations-Eigenschaften des Vakzinstammes.
Auf pSC101 beruhende Plasmide werden auch in vivo stabilisiert. Wie in Tabelle 5 zur Stützung von in vitro-Stabilitätsdaten gezeigt, sind Plasmide auf der Grundlage von pSC101, seien sie zusätzlich durch pjuA-Komplementation stabilisiert oder nicht, vollständig stabil in Organproben, die bis zu 29 Tagen nach der Inokulation entnommen wurden. Bei mit LT-B-Expressionsplasmiden immunisierten Tiere exprimierten auch alle Isolate, die als plasmidhaltig charakterisiert wurden, das Antigen. Im Gegensatz dazu enthielt eine Minorität von Organismen, die aus mit entweder pUC-Vektor oder pPX100 immunisierten Tieren gewonnen wurden, Plasmid, so dass keine plasmidhaltigen Organismen von Organproben 15 Tage nach der Inokulation gezüchtet werden konnten. Tiere, die eine integrierte Genform von LT-B erhielten, zeigten auch eine 100%-ige Beibehaltung der Expression (von Kanamycin-Resistenz und LT-B). Tabelle 5 Beständigkeit von plasmidhaltigem S. typhimurium aroA in Payerschen Drüsen
Stabilisierung der Genexuression in S. typhi-Vakzinstämmen
Obwohl abgeschwächte S. typhimurium- und S. dublin-Stämme zum Erreichen von Immunogenität in Tiermodellen eingesetzt werden können oder zu rekombinanten Vakzinen für Veterinärgebrauch entwickelt werden können, sind sie bei der menschlichen Anwendung für entweder Typhoidfieber-Vakzinierungsprogramme oder als Vektoren zur Lieferung heterologer Antigene an das menschliche Immunsystem nicht ideal brauchbar. Um die Brauchbarkeit der nurA-Komplementation in abgeschwächten S. typhi zu zeigen, wurden pPX3006 und pPX3010 durch Elektroporation in einen aroA-S, typhi-Kandidaten BB1354 (679Ty ΔpurA) transformiert. Die Anwesenheit von Plasmid wurde verfiziert und die Expression von LT-B in pPX3010-Transformanden durch Westernblot-Analyse bestätigt. Zwei Stämme wurden auf Wachstumseigenschaften untersucht: die Verdoppelungszeiten für plasmidhaltige Transformanden waren ähnlich denen nicht transformierter Eltern. Die beiden plasmidhaltigen Stämme wurden hinsichtlich Plasmid-Stabilität in vitro durch Passage in Abwesenheit und Anwesenheit von Adenin untersucht. Beide Plasmide waren bis zu 80 Generationen mit und ohne Selektion 100% stabil.
S. typhi-Stämme 679Ty, BB1354 und pPX3006/BB1354 wurden hinsichtlich der Fähigkeit verglichen, nach parenteraler Inokulation innerhalb tiefer Gewebe zu überstehen. S. typhi in seinem natürlichen Zustand ist kein Pathogen für Mäuse und infiziert Mäuse nicht oral. Wurden pPX3006/BB1354 oder 679Ty (10&sup7; Bakterien pro Tier) zum Inokulieren von Mäusen benutzt, dann wurden Organismen aus Lebern und Milzen bis zu 10 Tagen nach der Inokulation gewonnen. Andererseits war BB1354 (10&sup7; Organismen pro Tier) nur in sehr geringen Niveaus für mehrere Tage gewinnbar, was die begrenzte Fähigkeit dieser Stämme zeigt, in Tiergeweben zu wachsen. Die Komplementation der chromosomalen, purA-Deletion mit ourA-Gen auf Plasmid pPX3006 komplementiert auch die Fähigkeit der Deletion, in Geweben bestehen zu bleiben (siehe Fig. 8).
Die in vivo- und in, vitro-Resultate in S. typhimurium- und S. typhi-aroA-nurA-Stämmen zeigt klar die Fähigkeit des von Plasmiden stammenden purA-Gens von E coli, chromosomale Defekte in diesen Stämmen zu komplementieren. Wichtiger ist, dass die Koplementation des purA- Defektes auf dem Plasmidvektor geringer Kopienzahl neutral für das in vivo-Wachstumsverhalten der Vakzin-Bakterien ist. Dies legt stark nahe, dass rekombinante Bakterien, die die purA-Komplementation nutzen, eine stabile Expression heterologer Antigene, die bei der oralen Inokulation brauchbar sind, gestatten sollten.

purA-Gen als ein Marker für chromosomale Intearation

Um vielseitigere Mittel zum Manipulieren des E. coli-purA-Gens zuschaffen, wurde das purA enthaltende AccI-Fragment von 1,74 Kilobasenpaaren mit verschiedenen Linkem zur Aufnahme einzigartiger symmetrischer Restriktionsstellen angepasst. Ein Linker enthielt eine einzelne Restriktionsstelle für SalI; das purA-Gen mit SalI-Linker wurde in die SalI-Stelle von pUC18 geklont. Dieses Plasmid wurde danach als eine Quelle für das purA-Gen, flankiert von einzigartigen SalI- Stellen, benutzt.
Ein modifiziertes Transposon wurde konstruiert, das sowohl das PILA-Gen als auch LT-B (PL-kontrolliert) enthielt, und zwar in der folgenden Weise. Phage λ112 wurde erst durch Unterklonen des BamHI-Fragmentes, enthaltend den PL-Promotor und strukturelles LT-B-Gen von pPX1602, in ein Transpositions-Plasmid konstruiert, bei dem die umgekehrten 31 Wiederholungen von TnlO eine Kanamycin-Resistenzdeterminante flankierten. Das resultierende Plasmid, pPX1584 genannt, enthielt LT-B und Kanamycin-Resistenz, flankiert von umgekehrten Wiederholungen. Die transposierbare Kassette wurde in ein Derivat von λgtl1 durch homologe Rekombination zwischen den Enden von Tn10 gekreuzt. Die Fähigkeit des Transposons Transpositionsvorfälle zu ergeben, wurde durch Transduzieren von LB5010/F112 festgestellt. Die Expression von LT-B wurde in einem unabhängigen Isolat verzifiziert. E L coli-Gen mit SaII-Linkem wurde zum Ersatz der Kanamycin-Resistenzdeterminanten von λ112 durch direktes Unterklonen des Stückes in die XhoI-Stelle von λ112 und Selektieren von purA+-Lysogenen in E. coli TX595 eingesetzt. Die modifizierte Phage enthielt purA-Gen und LT-B und wurde zum Transduzieren von S. typhimurium LB5010 Δ purA/F112 oder S. typhi-aroA ΔpurA/F112 zur Purin-Unabhängigkeit benutzt. Solche Transduktanten ergeben sich invariabel aus der Transposition von purA und LT-B zu statistischen Stellen auf dem Salmonelle-Chromosom.

Hinterlegung von Stämmen

Die folgenden Stämme wurden bei der ATTC, Rockville, Maryland unter den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt:

Claims

1. Plasmid- oder Phagenvektor, der keine antibiotische Resistenz-Determinante enthält, der durch die Einführung von DNA stabilisiert ist, die das purA-Gen enthält, das für Adenosylsuccinat- Synthetase codiert, wobei der Vektor ein low-copy-number Plasmidvektor oder ein high-copynumber Plasmid ist, in dem das purA-Gen nach unten reguliert (down regulated) ist.

2. Vektor nach Anspruch 1, weiter umfassend eine Nucleotid-Sequenz, die für mindestens ein anderes Antigen oder deren Fragment codiert.

3. Vektor nach Anspruch 2, bei dem das Antigen ein virales Antigen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Immundefizienzvirus (Typen I und II), menschlichem T-Lyrnphozytenvirus (Typen I, II und III), RS-Virus, Hepatitis A-, Hepatitis B-, Hepatitis C-, Non-A- und Non-B-Hepatitisviren, Herpes simplex Virus (Typen I und II), Cytomegalovirus, Influenzavirus, Parainfluenzavirus, Poliovirus, Rotavirus, Coronavirus, Rubellavirus, Masernvirus, Windpockenvirus, Epstein Barr-Virus, Adenovirus, Papillomavirus und Gelbfiebervirus, ein bakterielles Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria mening itidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Bordetellapertussis, Pseudomonas aeroginosa, Staphylococcus aureus, Klebstella pneumoniae und Clostridium tetani, Pilz- oder parasitärem Antigen eines warmblütigen Tieres oder menschlichem Pathogen.

4. Vektor nach Anspruch 1, der ein stabiler low-cpoy-number Plasmidvektor ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pPX3005 (ATCC 68451), pPX3006 (ATCC 68452), pPX3009 (ATCC 68612) und pPX3010 (ATCC 68453).

5. Bakterieller Wirt, der das Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 beherbergt.

6. Geschwächtes Bakterium, das einen stabilen Plasmidvektor beherbergt, der keine antibiotische Resistenzstelle enthält, wobei das Plasmid ein heterologes purA-Gen, das für Adenosylsuccinat-Synthetase codiert, und mindestens ein anderes Gen enthält, das für ein heterologes Genprodukt codiert, worin der Vektor ein low-copy-number Plasmidvektor oder ein high-copynumber Plasmid ist, in dem das purA-Gen nach unten reguliert (down regulated) ist.

7. Bakterium nach Anspruch 6, das eine chromosomale purA-Genmutation und gegebenenfalls eine chromosomale Mutation in einem oder mehreren Genen aufweist, die funktional bei der Biosynthese aromatischer Verbindungen oder dem Galactose-Metabolismus sind.

8. Bakterium nach einem der Ansprüche 6 bis 7, worin das Genprodukt von viralem, bakteriellem, fungalem oder parasitärem Ursprung eines warmblütigen Tieres oder menschlichen Pathogens ist.

9. Bakterium nach einem der Ansprüche 6 bis 8, das ein entero-invasives Bakterium der Gattung Salmonella, Shigella, Yersinia, Escherichia, Vibrio und Campylobacter ist.

10. Zusammensetzung, umfassend das Bakterium nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und einen physiologisch akzeptablen Träger und ein wahlweises Adjuvans.

11. Plasmid, Bakterium oder Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Plasmid, das ein Gen umfasst, das für ein Antigen codiert, ein Epitop eines Malaria-Circumsporozoidproieins ist, das als Teil des Fusionsproteins exprimiert ist, das das Circumsporozoid-Epitop und eine B-Untereinheit von wärmelabilem Enterotoxin von E. coli oder ein Abschnittsprotein davon umfasst, das, kombiniert mit dem Circumsporozoid-Epitop, ein immunaktives Fusionsprotein produziert.

12. Verwendung einer immunologisch wirksamen Dosis eines Plasmids, Bakteriums oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung eines Medikamentes zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Antigen in einem warmblütigen Wirt.

13. Verfahren zum Auswählen und Aufrechterhalten interessierender bakterieller Transformanden unter Verwendung nicht-antibiotischer Auswahlmittel, umfassend das Einführen eines stabilen purA-Vektors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in Wirtsbakterien, die einen Mangel an dem purA-Gen aufweisen, selektives Züchten der Bakterien in einem Medium mit Adeninmangel und Auswählen darauf gezüchteter, purA-Plasmid enthaltender Bakterienkolonien.

14. Plasmid- oder Phagenvektor nach Anspruch 1, das keine antibiotische Resistenzstelle enthält, wobei das Plasmid oder die Phage ein purA-Gen trägt, dessen Einführung durch purinunabhängiges Wachstum ausgewählt werden kann.

15. Vektor, Bakterium oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 6 bis 9 und 13, worin das Plasmid ein low-copy-number Plasmid ist, das weiter einen funktionellen Partitionsort (z. B. parB) umfasst.