Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft die Verwendung einer
Zusammensetzung, welche eine aus der aus Hypericin,
Pseudohypericin, einem isomeren Homologen, einem Homologen oder
einem Derivat von Hypericin und Pseudohypericin
bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindung und einen
pharmakologisch verträglichen Träger oder Verdünner enthält,
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder
Abwendung einer von T-Zellen vermittelten Erkrankung
bei einemmenschen oder Säugetier sowie eine
pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung oder Abwendung einer
durch T-Zellen vermittelten Erkrankung.
Hintergrund der Erfindung
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Durch T-Zellen vermittelte Erkrankungen sind durch die
Induktion cytotoxischer T-Lymphozyten, welche das CD8-
Antigen auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, und/oder
T-Zellen, welche das CD4-Antigen auf ihrer
Zelloberfläche exprimieren, gekennzeichnet. Diese Erkrankungen,
für die die Krankheit "Graft versus Host", bei der ein
Transplantat den Empfänger angreift, die Abstoßung von
Transplantaten und zahlreiche Autoimmunstörungen wie
Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis, die Basedow-
Krankheit, die Addison-Krankheit und die Sklerodermie
beispielhaft sind, stellen eine große Anzahl von
Immunsystemstörungen des Wirts dar.
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Zur Reaktion "Graft versus Host" kommt es dann, wenn
Immunsystemzellen wie Stammzellen oder Lymphozyten
eines Spenders in einen allogenen Wirt transplantiert
werden, d.h. einen Wirt mit anderen Antigenen für
Haupthistokompatibilität (Gewebekompatibilität).
Immunsystemzellen
werden in Patienten transplantiert, um
bestimmte Formen von Leukämie zu behandeln. Man kann auch
Patienten damit behandeln, die Strahlenschäden erlitten
haben. Typischerweise wird der Wirt durch Bestrahlung
und die Gabe immunsuppressiver Medikamente
immunologisch "zum Schweigen gebracht", d.h. man hindert ihn
daran, eine Immunantwort gegen die transplantierten
Zellen zu geben. Dadurch soll der Wirt tolerant gegen
das "fremde" Gewebe werden. Bei diesen Erkrankungen
erkennen die transplantierten Immunsystemzellen den Wirt
als fremden Organismus und geben eine gegen den Wirt
gerichtete Immunantwort. Die klinischen Manifestationen
der Erkrankung "Graft versus Host" sind unter anderem
Fieber, Ausschlag, Anorexie, Übelkeit, Erbrechen und
wäßriger oder blutiger Durchfall.
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Außerdem ist kürzlich berichtet worden, daß auch bei
immunkompetenten Empfängern von Transfusionen die
Bluttransfusion die Reaktion "Graft versus Host" auslösen
kann (Anderson, K.C., et al., New. Engl. J. Med. 323:
315 - 321, 1990).
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Allogene Empfänger von Transplantaten, d.h. Empfänger
von Gewebetransplantaten von Mitgliedern der gleichen
Spezies, werden normalerweise mit cytotoxischen
Medikamenten wie Cyclosporin A (CsA), FK-506 (einem von
Metcalfe, S., et al. in Transplantation (Baltimore) 49:
798 - 802, 1990, offenbarten CsA-Derivat), Cytoxan
(Cyclophosphamid) und in jüngerer Zeit einem neuen
Medikament, 15-Desoxyspergualin (von Amemiya, H., et al.
in Transplantion 49: 337 - 343, 1990 offenbart)
behandelt. Diese Medikamente unterdrücken die Immunantwort
des Wirts gegen das transplantierte Gewebe und tragen
dadurch dazu bei, die Abstoßung des Transplantats zu
verhindern. Wie sich gezeigt hat, hemmt CsA die
Aktivierung von T-Zellen, indem es die Produktion und/oder
Sekretion von Lymphokinen und Monokinen wie
Interleukin-1, Interleukin-2, Tumornekrosefactor (TNF) und
γ-Interferon hemmt, Substanzen, die an der Aktivierung
der cytotoxischen T-Zellen beteiligt sind. Die
Verwendung von CsA, Cyclophosphamid, 15-Desoxyspergualin und
FK-506 ist wegen der cytotoxischen Wirkung dieser
Medikamente eingeschränkt. Auch bewirken sie eine "globale"
Unterdrückung der Immunantwort, d.h. eine längere
immunsuppressive Behandlung mit diesen Medikamenten kann
zu Infektionen und bösartigen Tumoren führen.
Tatsächlich hat sich gezeigt, daß eine Therapie mit CsA beim
Wirt Tumore, vor allem Lymphome, hervorrufen kann und
deshalb abgebrochen werden muß. Man nimmt auch an, daß
CsA diabetagene Veränderungen bei damit behandelten
Patienten verursacht (Wahlstrom, M.E., et al.,
Transplantation 49: 600 - 604, 1990).
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Andere Therapien zur Behandlung der Abstoßung fremder
Transplantate beinhalten die Verabreichung monoklonaler
OKT-3-Antikörper, die sich gegen den T&sub3;-Rezeptor im auf
der Zelloberfläche cytotoxischer T-Zellen befindlichen
T&sub3;T&sub2;-Komplex richtet (New Eng. J. Med. 313: 338, 1986).
Die Behandlung mit OKT-3 eliminiert die
T-Effektorzellen, die diese Reaktion hervorrufen.
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Eine Autoimmunkrankheit ist eine Fehlfunktion des
Immunsystems von Menschen und Säugetieren. Bei einem
Menschen oder Säuger, der unter einer Autoimmunkrankheit
leidet, kann das Immunsystem nicht zwischen exogenen
(fremden) Antigenen und normalem (eigenem) Gewebe
unterscheiden. Im Ergebnis klassifiziert das Immunsystem
autologes Gewebe (Eigenantigene) und Substanzen als
fremd und gibt die proliferative Immunantwort, die
normalerweise für exogene (fremde) Gewebe oder
eindringende Organismen reserviert ist.
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Derzeit werden Autoimmunerkrankungen auch mit
Medikamenten behandelt, die die Immunantwort nicht spezifisch
unterdrücken. Beispiele solcher Medikamente sind unter
anderem Methotrexat, Cytoxan (Cyclophosphamid), Imuran
(Azathioprin), FK-506 und Cyclosporin A.
Steroidverbindungen wie Prednison und Methylprednisilon werden
ebenfalls häufig verwendet. Diese Medikamente haben
allerdings nur eine eingeschränkte Wirkung gegen
Autoimmunkrankheiten, entwickeln, wie vorstehend bereits
erwähnt, toxische Nebenwirkungen und neigen dazu, eine
"globale" Immunsuppression bei Patienten hervorzurufen.
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Eine andere Therapie, die zur Behandlung von
Autoimmunkrankheiten vorgeschlagen wurde, beeinhaltet die orale
Verabreichung des an der jeweiligen Autoimmunstörung
beteiligten Antigens, z.B. die orale Verabreichung von
Kollagen zur Behandlung von durch Kollagen induzierter
Arthritis, wie in Nagler-Anderson et al. (Proc. Nat.
Acad. Sci USA 83: 7443 - 7446, 1986) offenbart, die
orale Verabreichung von Myelinbasisprotein zur
Behandlung experimenteller allergischer Encephalomyelitis,
wie von Higgins, P., et al., J. Immunol. 140:
1440 - 1445, 1988, offenbart. Jedoch ist die
Einsatzmöglichkeit dieser Therapieform beschränkt, weil es sehr
schwierig ist, das oder die Antigene, welche für die
Autoimmunkrankheit verantwortlich sind, unter der der
Patient leidet, zu identifizieren und zu reinigen.
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Hypericin und verwandte polycyclische aromatische
Verbindungen sind dazu verwendet worden, ein breites
Spektrum von Krankheiten zu behandeln, die durch Viren und
Retroviren verursacht werden.
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Das am 6. Februar 1990 erteilte Patent US-A-4,898,891
offenbart die antivirale Wirkung von zwei aromatischen
polycyclischen Dionverbindungen: Hypericin (Hy) und
Pseudohypericin (Ps).
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Die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung Nr. 328,767 der
Rechtsnachfolgerin, die am 20. März 1989 als
Teilfortführung der am 10. August 1987 eingereichten (und nicht
weiterverfolgten) US-Anmeldung 084,008 eingereicht
wurde, erweitert die Offenbarung von US-A-4,898,891 und
konzentriert sich besonders auf die Verwendung von Hy
und Ps als effektive Mittel gegen Retroviren.
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Die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung Nr. 326,392 der
Rechtsnachfolgerin, die am 28. März 1989 als
Teilfortführung der am 23. März 1988 eingereichten (und nicht
weiterverfolgten) US-Anmeldung Nr. 172,065 eingereicht
wurde, offenbart gegen Retroviren wirksame
Zubereitungen, die effektive Mengen von Hy und Ps in Kombination
mit Nucleosidanalogen wie Azidothymidin enthalten,
sowie Verfahren zur Behandlung von Retrovireninfektionen
mit solchen Zubereitungen.
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Die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung Nr. 299,971 der
Rechtsnachfolgerin, die am 19. Januar 1989 eingereicht
wurde, und die am 21. Juli 1990 veröffentlichte PCT-
Anmeldung Nr. PCT/US90/00398 offenbaren Zubereitungen
und Verfahren, um in Blut, Blutprodukten und anderen
Körperflüssigkeiten sowie ganz allgemein biologischen
Flüssigkeiten vorhandene Viren und Retroviren zu
inaktivieren, sowie Gegenstände, die für die Durchführung
eines solchen Verfahrens nützlich sind. Die als
nützlich offenbarten Zubereitungen umfassen Hypericin,
Pseudohypericin, Isomere, Analoge, Homologe und
Derivate aromatischer polycyclischer Dione und Mischungen
dieser Verbindungen, die alle auch in dieser Erfindung
verwendet werden.
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Die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung Nr. 417,163 der
Rechtsnachfolgerin, die am 4. Oktober 1989 als
Teilfortführung der am 19. März 1989 eingereichten (und
nicht weiterverfolgten) US-Anmeldung 324,177
eingereicht
wurde, sowie die am 19. März 1990 eingereichte
PCT-Anmeldung Nr. PCT/US90/04163 offenbaren
Zubereitungen, die aromatische polycyclische antivirale
Verbindungen enthalten, sowie Verfahren zur Behandlung von
Virusinfektionen. Die offenbarten polycyclischen
aromatischen Verbindungen umfassen Hypericin und verwandte
polycyclische Dione sowie Homologe, Isomere, Derivate,
Salze und Analoge solcher polycyclischer
Dionzusammensetzungen sowie deren Mischungen zur Behandlung von
Virus- und Retrovirusinfektionen.
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Die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung Nr. 552,889 der
Rechtsnachfolgerin, die am 14. Mai 1990 eingereicht
wurde, offenbart wäßrige pharmazeutische Formulierungen
und Zubereitungen, die in Wasser dispergierte
polycyclische aromatische Verbindungen mit verbesserten
biologischen und/oder physikalischen Eigenschaften
enthalten, sowie Verfahren zu ihrer Nutzung bei der
Behandlung von Virus- und Retroviruserkrankungen.
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Bisher wurde die Wirkung der polycyclischen
aromatischen Verbindungen auf T-Zellen oder das Immunsystem
weder offenbart noch nahegelegt.
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Somit gibt es derzeit keine wirksamen Mittel und
Verfahren zur Behandlung von durch T-Zellen vermittelten
Erkrankungen, die eine geringe toxische Wirkung auf die
behandelten Tiere haben, jedoch wirksam bei der
Behandlung eines breiten Spektrums von durch T-Zellen
vermittelten Krankheiten sind.
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Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren und
pharmazeutische Formulierungen zur Verfügung zu stellen,
die wirksam bei der Behandlung von durch T-Zellen
vermittelten Krankheiten sind.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin,
Verfahren und pharmazeutische Formulierungen zur Verfügung
zu stellen, die eine geringe Toxizität auf den diese
Behandlung erhaltenden Wirt haben und wirksam bei der
Behandlung von durch T-Zellen vermittelten Krankheiten
sind.
Zusammenfassung der Erfindung
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Wir haben jetzt herausgefunden, daß Hypericin und
verwandte polycyclische aromatische Verbindunden dazu
verwendet werden können, zahlreiche durch T-Zellen
vermittelte Krankheiten zu behandeln. Dabei nehmen wir an,
daß die Wirksamkeit dieser Verbindungen bei der
Behandlung von durch T-Zellen vermittelten Krankheiten auf
die Fähigkeit der Verbindungen zurückzuführen ist, in
einige Aspekte der T-Zellenfunktion einzugreifen.
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In einem Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung
einer Zubereitung, die eine aus der aus Hypericin,
Pseudohypericin, einem isomeren Homologen, einem Homologen
oder einem Derivat von Hypericin und Pseudohypericin
bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindung und einen
pharmakologisch verträglichen Träger oder Verdünner
enthält, zur Herstellung eines Medikaments zur
Behandlung oder Abwendung einer von T-Zellen vermittelten
Erkrankung beim Menschen oder einem Säugetier zur
Verfügung.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet eine
pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung oder Abwendung
einer durch T-Zellen vermittelten Erkrankung, welche
eine therapeutisch wirksame Menge (a) mindestens einer
aus der aus Hypericin, Pseudohypericin, einem isomeren
Homologen, einem Homologen oder einem Derivat von
Hypericin und Pseudohypericin bestehenden Gruppe
ausgewählte Verbindung und (b) eine Menge an einem
Immunsuppressivum
enthält, wobei die vereinten Mengen an (a) und
(b) wirksam bei der Behandlung oder Abwendung der durch
T-Zellen vermittelten Erkrankung sind.
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Diese und andere Aspekte der Erfindung sind für
Fachleute aus der vorliegenden Beschreibung, den Ansprüchen
und Zeichnungen ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die Kurve in Fig. 1 zeigt die Wirkung von Hypericin,
das dreimal die Woche gegen die Erkrankung "Graft
versus Host" verabreicht wurde.
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Die Kurve in Fig. 2 zeigt die Wirkung von Hypericin
gegen die Erkrankung "Graft versus Host" bei Mäusen, die
dreimal pro Woche mit Hypericin behandelt wurden.
Gleichzeitig wird die Morbidität der Tiere gemessen.
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Fig. 3A und B zeigen eine Reihe von Kurven mit einem
Vergleich der Wirksamkeit bei der Behandlung der
Erkrankung "Graft versus Host" bei Mäusen durch
Verabreichung von Hypericin ein-, zwei,- drei-, vier- und
fünfmal pro Woche.
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Die Kurven in Fig. 4 (A und B) zeigen die Wirkung auf
die Erkrankung "Graft versus Host" bei Mäusen, wenn man
Cyclosporin A, Hypericin und die Hypericinanaloge WIS-
3, WIS-6 und WIS-7 verabreicht. Gleichzeitig wird die
Morbidität der Tiere gemessen.
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Die Kurven in Fig. 5 (A und B) zeigen die Wirkung auf
die Erkrankung "Graft versus Host" bei Mäusen, wenn man
Cyclosporin A, Hypericin und die Hypericinanaloge WIS-
3, WIS-6 und WIS-7 verabreicht. Gleichzeitig wird die
Überlebensrate der Tiere gemessen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Sämtliche in dieser Beschreibung erwähnten Patente,
Patentanmeldungen und Literaturangaben werden hiermit in
ihrer Gesamtheit einbezogen.
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Der hier verwendete Begriff "behandeln" bzw.
"Behandlung" bedeutet die prophylaktische Verabreichung zur
Abwendung einer Erkrankung oder die therapeutische
Verabreichung zur Behandlung einer durch aktive T-Zellen
vermittelten Erkrankung bei einem betroffenen
Patienten.
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Der hier verwendete Begriff "Säuger" bezieht sich auf
alle Lebensformen, die ein Immunsystem aufweisen und
deshalb für durch T-Zellen vermittelte Erkrankungen
anfällig sind.
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Der hier verwendete Begriff "polycyclische aromatische
Verbindung" bezieht sich auf Hypericin,
Pseudohypericin, Isomere, Analoge, Homologe und Derivate
polycyclischer Dione wie in der gleichzeitig anhängigen am 4.
Oktober 1989 eingereichten US-Anmeldung Nr. 413,163 als
Teilfortführung der am 19. März 1989 eingereichten (und
nicht weiterverfolgten) US-Anmeldung Nr. 324,177 und
der am 19. März 1990 eingereichten PCT-Anmeldung
PCT/US90/ 01463 offenbart.
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Der hier verwendete Begriff "großer
Histokompatibilitätskomplex" (major histocompatibility complex = MHC)
bezieht sich auf eine Vielzahl von Proteinen und
Glykoproteinen der Zelloberfläche, die auf der Oberfläche
aller Zellen von Menschen und Säugetieren vorhanden
sind und die Wechselwirkung zwischen Zellen (z.B. die
Gewebekompatibilität bei Organ- und
Gewebetransplantationen) und die Immunantwort bei Menschen auslösen. Der
MHC wird beim Menschen durch den HLA-Komplex und bei
Mäusen durch den H-2-Komplex codiert.
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Wir haben jetzt herausgefunden, daß Hypericin und
verwandte polycyclische aromatische Verbindungen dazu
verwendet werden können, zahlreiche durch T-Zellen
vermittelte Erkrankungen zu behandeln. Dies ist eine
überraschende Erkenntnis, weil bisher keine Berichte
darüber veröffentlicht worden sind, daß Hypericin und
verwandte polycyclische aromatische Verbindungen
irgendeine Auswirkung auf das Immunsystem und vor allem
T-Zellen haben.
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Die Erfindung kann dazu verwendet werden, zahlreiche
durch T-Zellen vermittelte Erkrankungen zu behandeln.
Nicht einschränkende Beispiele für die Erkrankungen,
die durch die Erfindung behandelt werden können, sind
unter anderem die Krankheit "Graft versus Host", die
Abstoßung von Transplantaten und durch T-Zellen
vermittelte Autoimmunkrankheiten. Solche Krankheiten sind
unter anderem Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis,
die Addison Krankheit, die Basedow-Krankheit,
Sklerodermie, Polymyositis, bestimmte Formen von Diabetes
mellitus (z.B. der im Jugendalter einsetzende
Diabetes), autoimmune Uveoretinitis, systemischer Lupus
erythromatosis, eitrige Colitis, Pemphigus vulgaris und
autoimmune Schilddrüsenentzündung.
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Eine Autoimmunerkrankung ist eine Störung des
Immunsystems von Menschen und Säugetieren. Das Immunsystem
eines Menschen oder Tiers, der bzw. das an einer
solchen Erkrankung leidet, kann nicht zwischen exogenen
(fremden) Antigenen und normalem (eigenem) Gewebe
unterscheiden. Im Ergebnis klassifiziert das Immunsystem
autologe Gewebe (Eigenantigene) und Substanzen als
fremd und ruft eine proliferative Immunantwort hervor,
die üblicherweise für exogene (fremde) Gewebe und
eindringende Mikroorganismen reserviert ist.
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Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird einem Menschen
oder Säugetier, der bzw. das einer entsprechenden
Behandlung bedarf, eine wirksame Menge einer
polycyclischen aromatischen Verbindung [nachstehend auch als
"PAC" (polycyclic aromatic compound) bezeichnet]
verabreicht, um eine durch T-Zellen vermittelte Erkrankung
zu behandeln oder abzuwenden.
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Zur Verwendung in der Erfindung bevorzugte PACs sind
unter anderem Hypericin, Pseudohypericin,
Hypericindiacetat (WIS-6), Desmethylhypericin (WIS-3),
Hypericinhexaacetat und Dihydroxydesmethylhypericin (WIS-7)
Am meisten bevorzugt werden Hypericin und
Pseudohypericin. Alle diese PACs eignen sich zur Behandlung von
durch T-Zellen vermittelten Erkrankungen bei Menschen
und Säugetieren, doch kann bei bestimmten Personen oder
Erkrankungen eine bestimmte Verbindung effektiver sein
als andere. Die Identifikation und Wahl des wirksamsten
PAC zur Behandlung einer bestimmten durch T-Zellen
vermittelten Erkrankung kann durch Routineexperimente und
Fachleuten allgemein bekannte Techniken erfolgen. Diese
Techniken umfassen auch den Einsatz geeigneter in vivo
Systeme wie in den folgenden Beispielen 1 bis 5
beschrieben.
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Zusätzlich können auch weitere experimentelle Systeme
verwendet werden, um das erfindungsgemäße Verfahren zu
optimieren. Beispielsweise kann die Wirkung der
erfindungsgemäßen PACs auf die Multiple Sklerose mit dem von
Higgins et al., in J. Immunol. 140: 1440 - 1445, 1988,
offenbarten experimentellen System für allergische
Enzephalomyelitis (EAE) untersucht werden. EAE ist eine
induzierte, durch T-Zellen vermittelte
Autoimmunerkrankung, die sich gegen das Myelinbasisprotein (MBP)
richtet.
EAE ist ein anerkanntes und häufig verwendetes
Tiermodell der menschlichen Erkrankung Multiple
Sklerose. Die Krankheit wird durch die parenterale
Verabreichung von MBP und einem Hilfsstoff (z.B. "Freund's
Complete Adjuvant") induziert. Durch diese Maßnahme wird
(je nach der Tierart und den Einzelheiten der
Verabreichung) entweder eine monophasische oder sich
verschlimmernde/remittierende Form der Entmyelinisierung mit den
Eigenschaften der menschlichen Krankheit Multiple
Sklerose induziert. Auf ähnliche Weise kann die Auswirkung
der Verabreichung der erfindungsgemäßen PACs bzw. PAC-
haltigen Zubereitungen an Säugetieren mit Diabetes im
BB-Stamm oder NOD-Stamm von Mäusen untersucht werden,
die Diabetes spontan entwickeln.
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Die Auswirkungen von PAC und den erfindungsgemäßen
Zubereitungen auf die rheumatische Arthritis können unter
Verwendung des Mausmodells für die durch die
parenterale Verabreichung von Kollagen induzierte Erkrankung
wie von Nagler-Anderson et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 86: 680 - 684, 1986, offenbart untersucht werden.
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Die Herstellung von Hypericin und verwandten
polycyclischen aromatischen Verbindungen erfolgt z.B. wie in der
gleichfalls anhängigen am 4. Oktober 1989 eingereichten
US-Anmeldung Nr. 413,163 als Teilfortführung der am 19.
März 1989 eingereichten (und nicht weiterverfolgten)
US-Anmeldung Nr. 324,177, der am 19. März 1990
eingereichten PCT-Anmeldung PCT/US90/04163, der US-Anmeldung
Nr. 299,971 und der PCT-Anmeldung PCT/US90/00398
beschrieben.
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Das erfindungsgemäße PAC kann auch vorteilhaft mit
einem oder mehreren der immunsuppressiven Mittel
kombiniert werden, die man normalerweise zur Behandlung von
Menschen und Säugetieren verwendet, die unter durch T-
Zellen vermittelten Erkrankungen leiden. Aufgrund der
Wirksamkeit des erfindungsgemäßen PAC auf diese
Erkrankungen wird in Erwägung gezogen, verringerte Mengen des
oder der betreffenden immunsuppressiven Mittel zu
verwenden als in Fällen, wo man diese(s) Mittel allein
verwendet. Außerdem können auch die Behandlungsschemata
mit anderen Medikamenten verändert werden, wenn man
diese Mittel mit den erfindungsgemäßen PACs kombiniert,
so daß sie nicht nur seltener verabreicht werden müssen
sondern auch weniger toxische Nebenwirkungen haben.
Beispiele für die erfindungsgemäß verwendbaren
immunsuppressiven Mittel sind unter anderem Cyclosporin A
(Sandoz Pharmaceuticals, East Hanover, NJ), Imuran
(Azathioprin, Burroughs Welcome, Research Triangle
Park, NC), Cytoxan (Cyclophosphamid, Bristol Meyers
Oncology, Evansville, IN), Prednison (Lederle
Laboratories, Wayne, NJ), Methylprednisilon (Duramed
Pharmaceuticals, Cincinnati, OH) und monoklonale
OKT-3-Antikörper (Ortho Diagnostics, Raritan, NJ).
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Zusätzlich kann man FK-506 aus der Fermentierbrühe von
Streptomyces tsukubaensis (im Handel erhältlich von
Fujisawa Pharmaceutical Co., Osaka, Japan) gewinnen wie
von Thomas, J. et al. in Transplantation 49: 390 - 396,
1990 beschrieben.
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Die effektive Behandlung einer bestimmten durch T-
Zellen hervorgerufenen Erkrankung kann durch eine
einzige dieser PACs oder eine Kombination aus zwei oder
mehreren dieser Verbindungen erfolgen. Natürlich ist es
wünschenswert, die kleinstmögliche Menge der
erfindungsgemäßen PAC-Verbindungen und/oder Immunsuppressiva
zu verwenden, mit der eine signifikante Behandlung des
Patienten erzielt werden kann. Was unter "signifikanter
Behandlung" zu verstehen ist, schwankt von Patient zu
Patient und auch von Krankheit zu Krankheit. Außerdem
kann man auch zwei oder mehrere PAC-Verbindungen
zusammen verwenden. Das heißt, man kann dem Patienten zwei
oder mehr PACs gleichzeitig oder nacheinander
verabreichen. Darüber hinaus kann das PAC bzw. die PAC-
Mischung auch den einzigen Wirkstoff der
erfindungsgemäßen Zubereitung darstellen. Man kann das PAC auch
zusammen mit anderen Mitteln oder Inhaltsstoffen (wie den
nachstehend offenbarten Immunsuppressiva) verwenden,
von denen bekannt ist, daß sie die Erkrankung wirksam
behandeln oder die durch T-Zellen vermittelte
Erkrankung bzw. das Symptom einer solchen Erkrankung bessern
oder heilen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die
Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Abwendung
einer durch T-Zellen vermittelten Erkrankung zur
Verfügung, bei dem man einem behandlungsbedürftigen Menschen
oder Säugetier eine Menge an (a) eines PAC und (b)
eines Immunsuppressivums verabreicht, wobei die
kombinierte Menge an (a) und (b) die durch T-Zellen
vermittelte Erkrankung wirksam behandelt oder abwendet.
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Die Bestimmung der wirksamsten Verbindung oder Mischung
von Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung
eines Menschen oder Säugetiers, der unter einer
bestimmten durch T-Zellen vermittelten Krankheit leidet oder
das Risiko dafür trägt, erfolgt durch
Routineexperimente unter Einsatz der vorstehend beschriebenen
geeigneten und allgemein bekannten experimentellen Modelle.
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Wenn man die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Formulierungen dazu einsetzt, eine durch T-Zellen
vermittelte Erkrankung zu behandeln, können sie oral, topisch,
bevorzugt parenteral und am meisten bevorzugt
intravenös in Dosen verabreicht werden, die wie folgt auf
der Grundlage von Hypericin definiert werden.
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Die Erfindung stellt auch Zubereitungen,
pharmazeutische Formulierungen oder Dosierungsformen zur
Behandlung
oder Abwendung von durch T-Zellen vermittelten
Erkrankungen zur Verfügung. Zubereitungen oder
pharmazeutische Formulierungen, die das erfindungsgemäße PAC als
einzigen Wirkstoff enthalten, können pro Behandlung in
Dosierungen (auf Hypericinbasis) von 0,001 bis etwa
200.000 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht,
vorzugsweise etwa 2 bis etwa 10&sup5; Mikrogramm pro Kilogramm
Körpergewicht und am meisten bevorzugt etwa 200 bis 5 x
10&sup4; Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht pro
Behandlung eingesetzt werden. Die Häufigkeit der
Verabreichung kann je nach Zustand des Patienten, der Ansprache
auf die Behandlung und der Schwere seiner Erkrankung
zwischen täglich, zweimal täglich, zwei-, drei-,
vier- oder fünfmal pro Woche schwanken.
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Wenn man ein oder mehrere PACs als Wirkstoff verwendet,
ist die Dosierung im allgemeinen die gleiche wie bei
Hypericin. Selbstverständlich gilt jedoch, daß in
Fällen, wo ein bestimmtes PAC z.B. die doppelte
Wirksamkeit von Hypericin bei der Behandlung einer bestimmten
durch T-Zellen vermittelten Erkrankung hat, die
wirksame Mindestdosis die Hälfte der Hypericindosis beträgt.
Wenn darüber hinaus mehr als ein Wirkstoff in einem
erfindungsgemäßen Behandlungs- oder Prophylaxeschema
verwendet wird (d.h. wenn mindestens ein Mittel verwendet
wird, bei dem es sich nicht um ein PAC handelt), kann
die Mindestdosis der PAC-Komponente (d.h. der PAC-
Verbindung(en)) bei diesem Schema verringert werden.
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Wenn man schließlich mehr als einen Wirkstoff einsetzt
und es zwischen der PAC-Komponente und dem bzw. den
anderen Wirkstoffen (oder zwischen zwei oder mehreren
PAC-Komponenten, sogar in Schemata mit einem einzigen
Wirkstoff, d.h. in Schemata, wo das bzw. die einzigen
verwendeten Mittel PACs sind) zu einer Synergie kommt,
sind die wirksamen Mindest-PAC-Dosierungen noch
geringer. Selbstverständlich gelten analoge Modifizierungen
der Mindestdosis, wenn man zusammen mit einem PAC ein
Stabilisierungs- oder Potenzierungsmittel verwendet.
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Wenn man ein oder mehrere Immunsuppressiva in
Kombination mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet,
können diese zusammen mit dem PAC in Dosen gegeben
werden, die von dem jeweils eingesetzten Mittel abhängen.
"Zusammen" bedeutet hier sowohl die gleichzeitige als
auch aufeinanderfolgende Verabreichung, d.h. das PAC
kann zuerst und das Immunsuppressivum später
verabreicht werden oder umgekehrt.
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Wenn man beispielsweise Cyclosporin A zusammen mit dem
erfindungsgemäßen PAC verwendet, kann das Cyclosporin
Menschen und Säugetieren in Dosen verabreicht werden,
die zwischen 0,01 mg und 100 mg pro Kilogramm
Körpergewicht pro Tag schwanken. Dies kann (in bestimmten
Fällen) weniger sein als die normale Cyclosporindosis, die
zwischen etwa 1 mg und etwa 20 mg pro Kilogramm
Körpergewicht pro Tag zur Behandlung der Abstoßung eines
Nierentransplantats beim Menschen oder einem Säugetier
liegt. Ähnlich kann Azathioprin (Imaran) in Dosen
verwendet werden, die zwischen etwa 0,1 und 20 mg pro
Kilogramm Körpergewicht pro Tag des Patienten liegen,
während Prednison in Dosierungen verabreicht werden
kann, die zwischen etwa 0,1 und 200 mg pro Kilogramm
Körpergewicht des Patienten pro Tag liegen. Die Mengen
dieser Mittel können mit in der Technik allgemein
bekannten Experimenten bestimmt und optimiert werden.
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Die Dauer und Anzahl der Dosen bzw. Behandlungen, die
dazu erforderlich sind, die Erkrankung unter Kontrolle
zu bekommen, schwanken von Person zu Person und hängen
von der Schwere und dem Stadium der Erkrankung, dem
Allgemeinzustand des Patienten sowie der spezifischen
Wirkung jedes PAC und/oder Immunsuppressivums sowie
ihrer (etwaigen) Toxizität ab. Die für jede Behandlung
erforderliche Gesamtdosis kann in einzelnen Teilen oder
auf einmal verabreicht werden. Die Behandlung kann je
nach dem Zustand des Patienten und dem Stadium der
Erkrankung täglich, mehrmals täglich oder zwei bis
fünfmal pro Woche erfolgen. Die Behandlung kann vor, im
wesentlichen gleichzeitig oder nach dem Ausbruch einer
durch T-Zellen vermittelten Erkrankung wie nachstehend
definiert beginnen. Wenn man beispielsweise einen
Menschen oder ein Säugetier behandelt, dem eine
Gewebetransplantation bevorsteht, können die
erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen 1 bis 15 Tage vor
der Transplantation sowie 1 bis 360 Tage nach der
Transplantation verabreicht werden.
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Das erfindungsgemäße PAC kann in herkömmliche feste
oder flüssige pharmazeutische Formulierungen (z.B.
Tabletten, Kapseln, injizierbare und oral verabreichbare
Lösungen) inkorporiert oder lokal durch Zäpfchen
verabreicht werden, um Patienten zu behandeln, die unter
einer durch T-Zellen vermittelten Erkrankung leiden. Die
erfindungsgemäßen Formulierungen enthalten eine
wirksame Menge des erfindungsgemäßen PAC als einen aktiven
Wirkstoff in Kombination mit einem Immunsuppressivum
wie vorstehend erörtert. Beispielsweise kann eine
parenterale therapeutische pharmazeutische Formulierung
eine sterile isotonische Salzlösung enthalten, die
zwischen etwa 0,001 und etwa 100.000 Mikrogramm der
erfindungsgemäßen polycyclischen aromatischen
Verbindungen und zwischen etwa 0,01 und 100 mg des vorstehend
beschriebenen Immunsuppresivums pro Kilogramm enthält.
Selbstverständlich braucht der Einheitsgehalt des in
einer Einzeldosis jeder Dosierungsform enthaltenen
Wirkstoffs selbst keine effektive Menge auszumachen, da
die notwendige wirksame Menge erreicht werden kann,
indem man mehrere Kapseln, Tabletten, Injektionen oder
Kombinationen davon verabreicht.
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Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen
können auch allgemein bekannte inerte Bestandteile
enthalten, darunter pharmazeutisch verträgliche
Trägerstoffe, Verdünner, Füllstoffe, Salze und andere in der
Technik bekannte Substanzen, deren Wahl von der
eingesetzten Dosierungsform und dem jeweils vom Fachmann
angestrebten Zweck abhängt. Beispielsweise können
Tabletten nach herkömmlichen Verfahren formuliert werden,
bei denen feste in der Technik allgemein bekannte
Trägerstoffe verwendet werden. Zu den Beispielen für feste
Trägerstoffe gehören Carboxymethylcellulose, Stärke,
Zucker, Bentonit, Siliciumdioxid und andere häufig
verwendete Trägerstoffe und enterische Schutzhüllen.
Propylenglykol, Polyethylenglykol, Benzylalkohol,
Isopropanol, Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO),
Dimethylacetamid und andere biologisch verträgliche organische
Lösungsmittel und wäßrige Detergenzlösungen wie 1 bis
5%iges Tween 80 oder wäßrige Lösungen können verwendet
werden. Mischungen wäßriger Lösungen (z.B. Wasser mit
einem pH von mehr als 7 und vorzugsweise etwa 8 oder
5%ige Dextrose) mit basischen Aminosäuren wie Lysin
oder wäßrigen Lösungen mit Tris-Puffer und/oder 2 bis
2,5 % Benzylalkohol können als Verdünner, Träger oder
Lösungsmittel bei der Herstellung fester und flüssiger
pharmazeutischer Formulierungen, die die
erfindungsgemäßen Zubereitungen enthalten, verwendet werden.
Weitere nicht einschränkende Beispiele für Trägerstoffe und
Verdünner sind Kohlehydrate, Cyclodextrane, Albumin
und/oder andere Plasmaproteinkomponenten wie
Lipoproteine von niedriger Dichte, Lipoproteine von hoher
Dichte und die Lipide, mit denen diese Serumproteine
assoziiert sind. Solche Lipide umfassen
Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin und
neutrale Lipide wie Triglyceride. Flüssige Trägerstoffe
umfassen auch ohne Einschränkung Tocopherol und
Retinolsäure. Herkömmliche, in der Technik allgemein
bekannte Liposome, die die erfindungsgemäßen
Formulierungen
enthalten, können ebenso als Systeme zur Abgabe
des Medikaments verwendet werden. Halbfeste geformte
Formulierungen wie solche, die in der Technik allgemein
bekannt sind (z.B. Zäpfchen) werden ebenfalls zur
Verwendung bei der Verabreichung des erfindungsgemäßen
Wirkstoffs in Erwägung gezogen.
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Bevorzugte parenterale Dosierungsformen können eine
wäßrige Lösung mit 2 % Benzylalkohol aufweisen, die in
5%iger Dextrose weiter auf ein Volumen von 50 bis 500
ml verdünnt wurde und zwischen etwa 0,001 und etwa
100.000 Mikrogramm der erfindungsgemäßen polycyclischen
aromatischen Verbindungen und etwa 0,01 bis 100 mg
eines Immunsuppressivums enthält.
-
In der Erfindung verwendete Kapseln können aus jedem
pharmazeutisch verträglichen Material wie
Gelatine- oder Cellulosederivaten hergestellt sein. Auch orale
und transdermale Darreichungssysteme mit verlängerter
Freisetzung können dazu verwendet werden, die
erfindungsgemäßen Wirkstoffe zu verabreichen.
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In den nachstehend aufgeführten spezifischen Beispielen
werden die Auswirkungen von PAC auf die Erkrankung
"Graft versus Host" (GVHD), die Abstoßung von
Transplantaten und die Autoimmunerkrankung EAE offenbart.
GVHD ist ein allgemein anerkanntes Modellsystem für
durch T-Zellen vermittelte Erkrankungen.
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Im GVHD-System werden C3H-Mäuse, die den
Histokompatibilitätsgenotyp H-2k aufweisen, mit BALB/c-Mäusen vom
Genotyp H-2d gekreuzt. Die bei dieser Kreuzung
entstandenen F&sub1;-Nachkommen wiesen den Genotyp H-2d/k auf. Die
F&sub1;-Nachkommen wurden dann einer subletalen Dosis (450
rad) γ-Strahlen ausgesetzt, um ihr Immunsystem weiter
zu schwächen, und dann mit Immunsystemzellen injiziert,
die man aus den Milz und den Lymphknoten von C3H-Mäusen
isoliert hatte. Die injizierten Zellen siedeln sich
wieder in den blutbildenden Geweben, d.h. Milz,
Lymphknoten und Thymus, an. Die injizierten Zellen erkennen
den auf den Zellen der F&sub1;-Nachkommen vorhandenen H2d-
Anteil, der den H2d/k-Genotyp trägt, als fremd und
geben eine durch cytotoxische T-Lymphozyten (CTL)
vermittelte Immunantwort gegen den Wirt. Die CTL greifen den
Wirt an und verursachen Kachexie sowie das Aussickern
aus Gefäßen. Dadurch wird das Fell der Tiere struppig,
und die Erkrankungshäufigkeit steigt. Die Tiere
verlieren an Gewicht und sterben innerhalb von 20 bis 40
Tagen nach der Transplantation. Die Injektion von
Hypericin mit einer Dosis von 150 Mikrogramm pro Maus führte
dazu, daß in einigen Experimenten alle und in anderen
der Großteil der Mäuse in den behandelten Gruppen
überlebten, während fast alle unbehandelten Mäuse GVHD
bekamen und innerhalb von 20 bis 40 Tagen starben.
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Die Erfindung wird nachstehend anhand von spezifischen
Arbeitsbeispielen näher beschrieben, die sie
veranschaulichen, aber nicht einschränken sollen.
Beispiel 1
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In den nachstehend beschriebenen Experimenten wurde die
Wirkung von Hypericin auf die Erkrankung "Graft versus
Host" (GVHD) untersucht.
-
Das zur Messung der GVHD und zur Bestimmung der Wirkung
von Hypericin auf diese Reaktion verwendete
experimentelle System beeinhaltete die Kreuzung von C3H/DiSN
Mäusen, die den Haupthistokompatibilitätslocus (H-2)
des Typs H-2 tragen, mit BALB/c-Mäusen, die H-2d sind
(beide Jackson Labs, Bar Harbor, ME), um heterozygote
F&sub1;-Nachkommen zu erhalten, die H-2k/d sind. Die
heterozygoten F&sub1;-Nachkommen wurden als Empfänger von
parenteralen
Zelltransplantaten aus der Milz und dem
Knochenmark der immunkompetenten Eltern verwendet.
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Die F&sub1;-Nachkommen wurden 1,2 Minuten mit 450 rad
Caesium 137 bestrahlt, so daß sie eine Strahlendosis von 390
rad/min erhielten. Die beschädigten Lymphoidorgane der
bestrahlten Mäuse wurden durch intravenöse Injektion
von 5 x 10&sup6; Zellen oder 2 x 10&sup7; immunkompetenten C3H-
Zellen aus der Milz und dem Knochenmark der C3H-Maus
durch die Schwanzvene wieder aufgebaut, wie von
Rappaport, H., et al., Amer. J. Pathol. 96: 121 - 142, 1979,
beschrieben. Bei diesem System erkennt die
Empfängermaus (die den Genotyp C3H/BALB/c trägt) die
übertragenen C3H-Zellen als eigen oder zumindest nicht fremd an
und kann sie deshalb nicht abstoßen. Die
transplantierten immunkompetenten Zellen erkennen die von BALB/c
abgeleiteten Klasse I und Klasse II Antigene der H-2d-
Zellen als fremde Antigene und geben eine durch Zellen
vermittelte Immunantwort über diese hohe
Histokompatibilitätsschranke der Klasse I und II hinweg. Diese
Reaktion beinhaltet anfänglich eine starke Ausbreitung
(durch Zellproliferation) in der Zellanzahl in diesen
an der Reaktion beteiligten Klonen. Darauffolgt die
Reifung spezifischer cytotoxischer Lymphozyten, die
Zellen mit dem genetischen H-2d-Allotyp in
verschiedenen Organen des transplantierten Tieres angreifen und
zerstören können. Dieses hyperstimulative Verfahren des
Immunsystems wird auch durch die erhöhte Produktion und
Absonderung löslicher Lymphokine und Monokine
ausgelöst. Dazu gehören das Monokin Interleukin-1 (IL-1),
das Fieber und Übelkeit hervorruft und zur Produktion
anderer Lymphokine wie Tumornekrosefaktor (TNF) β und α
sowie IL-2 beiträgt, wobei letzteres die
Lymphozytenproliferation beschleunigt. Diese Substanzen
verursachen Gewichtsverlust und als Kachexie bezeichnete
Verkümmerungen, die zu Absonderungen aus Gefäßen und zur
Erkrankung der Tiere führen. Ihr Fell wird struppig,
und innerhalb 20 bis 40 Tagen sind alle tot.
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Den Mäusen, die das Transplantat erhielten, wurde
dreimal die Woche (jeden zweiten Tag) beginnend am 8. Tag
nach der Bestrahlung und Zellübertragung
intraperitoneal Hypericin in Dosen von 10, 50 und 150
Mikrogramm/Maus injiziert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind
in Fig. 1 gezeigt.
-
Aus Fig. 1 geht hervor, daß bei dem verwendeten
Zellinokulum zwei Mäuse aus der mit Hypericin behandelten
Gruppe (von denen eine 10 und die andere 150 Mikrogramm
Hypericin erhalten hatte) zwei am Leben blieben. Die
Hypericininjektionen wurden 50 Tage nach der
Zellübertragung abgesetzt; die überlebenden Mäuse lebten noch
21 Tage.
-
In einem zweiten Experiment wurden die Empfängermäuse
wie vorstehend behandelt und mit 2 x 10&sup7; oder 5 x 10&sup6;
Zellen geimpft. Anschließend beobachtete man sie nach
der Transplantation 40 Tage lang. Die Ergebnisse dieser
Impfung sind in Fig. 2 graphisch und in Tabelle 1
quantitativ gezeigt.
-
In den Daten in der nachstehenden Tabelle 1 wurde die
bei den geimpften Mäusen beobachtete Morbidität wie
folgt klassifiziert:
-
0 Die Maus ist gesund, hat ein glattes Fell und
weicht jedem physischen Kontakt aus.
-
+ Die Maus erscheint krank, hat ein struppiges Fell
und bewegt sich langsam.
-
2+ Die Maus ist lethargisch, sitzt herum und läßt
sich ohne weiteres hochnehmen. Sie bleibt reglos
und versucht nicht zu fliehen.
-
3+ Der Rücken der Maus verkrümmt sich, sie verliert
Gewicht. Ihr Fell ist struppig, und sie verharrt
bewegungslos in einer Käfigecke.
-
4+ Gewichtsverlust und Kachexie sind ausgeprägt. Das
Fell ist struppig; das Tier zittert sichtlich.
-
D Tod.
Tabelle 1
Morbidität (Tage nach der Transplantation)
-
Tabelle 1 und Fig. 2 zeigen die Ergebnisse in Bezug auf
Morbidität und Überleben dieser Mäuse. In Fig. 2 und
Tabelle 1 sieht man, daß bei einem Zellinokulum von 5 x
10&sup6; Zellen pro Maus sämtliche Mäuse in der
Kontrollgruppe schon 16 Tage nach der Transplantation Symptome
von GVHD zeigten. 35 Tage nach der Transplantation
waren sämtliche Tiere in der Kontrollgruppe befallen
(Tabelle 1). Eine Maus (von vier), die dreimal pro
Woche 50 Mikrogramm Hypericin erhielt, war bis zum 55.
Tag nach der Inokulation symptomfrei. Jedoch blieben
sämtliche Mäuse, die 150 Mikrogramm Hypericin
erhielten, während des ganzen Experiments symptomfrei.
-
Es wird darauf hingewiesen, daß Hypericin bei Dosen von
bis zu 150 Mikrogramm pro Maus in beiden Experimenten
ineffektiv war, wenn man 2 x 10&sup7; Zellen als Inokulum
verwendete. Dies liegt vielleicht daran, daß dieses
Inokulum zu belastend war. Weitere Experimente, in
denen höhere PAC-Konzentrationen mit diesem Zellinokulum
verwendet werden, sind im Gang.
-
Dieses Beispiel bewies, daß Hypericin wirksam darin
war, die GVHD-Symptome zu verringern und die
Überlebenszeit der behandelten Tiere zu verlängern.
Beispiel 2
-
In diesem Experiment wurde die Wirkung verschieden
häufiger Hypericingaben auf eine akute "Graft versus Host"
Erkrankung untersucht.
-
Dazu verwendete man das gleiche Mausstammsystem wie
vorstehend in Beispiel 1 beschrieben. Man injizierte
10&sup7; C3H Zellen in bestrahlte (C3H/BALB/c) F&sub1;-Mäuse. 8
Tage später spritzte man den Mäusen 150 Mikrogramm/Maus
Hypericin in 0,5 ml H&sub2;O intraperitoneal 0, 1 x, 2 x,
3 x, 4 x und 5 x pro Woche kontinuierlich bis zum 70.
Tag. Dann wurde die Überlebensrate der Mäuse 70 Tage
beobachtet (Fig. 3A und 3B).
-
Wie aus Fig. 3A und 3B hervorgeht, starb nur eine von
vier Mäusen, denen Hypericin viermal pro Woche
injiziert worden war, innerhalb des Beobachtungszeitraums
von 70 Tagen; in der Gruppe, die fünfmal pro Woche eine
Injektion erhielt, starben zwei von vier Mäusen. Bei
den Mäusen, die in dieser Gruppe starben, trat der Tod
15 bis 20 Tage später als in der unbehandelten
Kontrollgruppe ein. Alle Mäuse in der Kontrollgruppe und
in der dreimal die Woche mit Hypericin injizierten
Gruppe waren tot.
-
Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, daß eine
Hypericinbehandlung mit einer Häufigkeit von vier- und
fünfmal pro Woche effektiver bei der Behandlung von
GVHD war als ein Schema, bei dem das Medikament dreimal
pro Woche verabreicht wurde.
Beispiel 3
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Die Wirkung von drei Hypericinanalogen und Derivaten,
Hypericindiacetat (WIS-6), Desmethylhypericin (WIS-3) und
Dihydroxydesmethylhypericin (WIS-7) auf die
Überlebensrate von an GVH erkrankten Mäusen wurde im Vergleich zu
einer Behandlung mit Hypericin oder Cyclosporin A (von
Sandoz Pharmaceuticals, East Hanover, N.J. bezogen)
untersucht, wobei letzteres Medikament eine der derzeit
wirksamsten Behandlungen zur Unterdrückung von durch T-
Zellen vermittelten Erkrankungen ist. Die Experimente
wurden wie in den vorstehenden Beispielen 1 und 2
beschrieben durchgeführt, doch jedes der Medikamente wurde
intraperitoneal in Wasser mit 0,5 % Ethanol und bei einer
Dosierung von 150 Mikrogramm/ Maus dreimal pro Woche
injiziert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig.
4 (A und B) und Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Morbidität (Tage nach der Transplantation)
-
Wie Tabelle 2 zeigt, manifestierten sich bei Mäusen in
den Kontrollgruppen (die nur Bestrahlung und Zellgaben
erhalten hatten) schon 15 Tage nach der Transplantation
GVHD-Symptome. Drei von vier der Mäuse in dieser Gruppe
waren am 28. Tag nach der Gewebetransplantation tot.
WIS-3 und WIS-6 können ein wenig dazu beigetragen
haben, die GVHD-Symptome zu mildern. Im Gegensatz dazu
waren 2 von 3 mit Hypericin behandelten Mäusen gesund
und zeigten auch während des gesamten
Nachbeobachtungszeitraums von 46 Tagen keinerlei Symptome von GVHD.
-
Die in Fig. 4A und 4B aufgeführten Ergebnisse zeigen,
daß die Behandlung mit WIS-3 (Desmethylhypericin) der
Behandlung mit Cyclosporin A möglicherweise überlegen
ist. Sowohl Hypericindiacetat (WIS-6) als auch
Dihydroxydesmethylhypericin (WIS-7) können im Vergleich
zu den Tieren, die nicht behandelt wurden, eine gewisse
Wirkung dabei gehabt haben, die GVHD abzuwenden oder zu
bessern.
-
In Fig. 4A waren 80 % der unbehandelten Mäuse am 46.
Tag erkrankt. Die Behandlung mit Hypericin senkte die
Anzahl erkrankter Mäuse auf 60 % und verzögerte das
Auftreten von Symptomen vom 8. Tag (in der
unbehandelten Gruppe) bis zum 22. Tag. Mit WIS-3 behandelte Mäuse
blieben bis zum 32. Tag gesund, erkrankten danach aber
rasch, was möglicherweise auf die Toxizität des WIS-3
in der verabreichten Dosis zurückzuführen ist.
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Fig. 4B zeigt, daß nur 60 % der mit WIS-7 behandelten
Mäuse am 46. Tag nach der Transplantation erkrankt
waren. Zum gleichen Zeitpunkt waren bereits 100 % der mit
WIS-6 oder Cyclosporin A behandelten Mäuse erkrankt.
-
Die Kurven in Fig. 5A und 5B zeigen die Überlebensrate
von Mäusen, die wie vorstehend beschrieben behandelt
worden waren. Wie aus Fig. 5A hervorgeht, waren 40 %
der unbehandelten Mäuse (die nur Bestrahlung und
Zelltransplantationen erhalten hatten) nach 46 Tagen tot,
während nur 33 % der mit Hypericin behandelten Gruppe
und 0 % der mit WIS-3 (Desmethylhypericin) behandelten
Gruppe tot waren. Außerdem begannen mit Hypericin
behandelte Mäuse erst ab dem 30. Tag zu sterben, während
die (unbehandelten) Tiere in der Kontrolle schon ab dem
17. Tag starben.
-
Fig. 5B zeigt, daß 0 % der mit Cyclosporin behandelten
Mäuse am 46. Tag tot waren. Zu diesem Zeitpunkt waren
100 % der mit WIS-8 und 33 % der mit WIS-7 behandelten
Mäuse tot.
-
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß Hypercin, WIS-7
(und möglicherweise WIS-3) effektiver bei der
Behandlung von GVHD waren als Cyclosporin A.
Beispiel 4
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Die Wirkung von Hypericin und verwandter PACs auf durch
T-Zellen vermittelte Abstoßung von Transplantaten
fremder Haut wird jetzt wie nachstehend beschrieben
untersucht.
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C57BL/6 Mäuse erhielten Transplantate der Schwanzhaut
von B10-A Mäusen (beide von Jackson Labs, Bar Harbor,
ME). Dazu verwendete man das von Billingham, R.E. et
al. in J. Exp. Biol. 28: 335, 1951, beschriebene
Verfahren. C57BL/6 Mäuse tragen einen
Haupthistokompatibilitätsgenotyp von H-2b und haben einen Klasse I Genotyp
H2Kb, während B10.A Mäuse sich insofern unterscheiden,
als sie einen H2Kd-Genotyp tragen.
-
Bei diesem System wird das Transplantat anfänglich von
den C57BL/6-Empfängermäusen aufgenommen; es bilden sich
Gefäßverbindungen zum transplantierten Gewebe. Jedoch
erkennt das Immunsystem der C57BL/6 Mäuse das genetisch
unterschiedliche Hauttransplantat als fremd und löst
eine durch T-Zellen vermittelte Abstoßungsreaktion aus.
Die Reaktion kappt die Gefäßversorgung des
Transplantats, und die cytotoxischen T-Zellen des Wirts greifen
die Zellkomponenten des transplantierten Gewebes an,
wodurch dieses stark geschädigt wird. Ungefähr 20 bis
22 Tage nach der Transplantation nekrotisiert das
Transplantat und fällt ab.
-
Hypericin, WIS-3, WIS-6 oder WIS-7 wird ab dem achten
Tag nach der Transplantation drei- bis fünfmal pro
Woche in Dosen von 50, 100, 150 und 300 Mikrogramm pro
Maus verabreicht.
-
Man nimmt an, daß die Verabreichung von Hypericin und
verwandter PACs die Überlebensrate des übertragenen
Gewebes auf über 70 Tage verlängert. Darüber hinaus
erwartet man, daß bei den fünfmal pro Woche behandelten
Tieren das Transplantat länger überlebt als bei Tieren,
die die erfindungsgemäßen PACs dreimal pro Woche
erhalten.
Beispiel 5
-
Die Auswirkungen der erfindungsgemäßen PACs auf eine
Autoimmunerkrankung - die experimentelle allergische
Encephalomyelitis (EAE, das Tiermodell für die
menschliche Krankheit Multiple Sklerose) - werden
auffolgende Weise studiert.
-
Das aus Hirngewebe erhaltene Myelinbasisprotein von
Meerschweinchen (GP-MBP) (Pel Freeze Rogers, Arkansas)
wird nach dem Verfahren von Diebler, G.E., et al.
(Anal. Biochem. 2: 139, 1972) gereinigt. Lewis-Ratten
im Alter von 6 bis 8 Wochen (Charles River, Wilmington,
MA) werden am Tag 0 10 Mikrogramm GP-MBP (wie
vorstehend
erhalten) in Freund's Complete Adjuvant (Difco,
Detroit, MI) wie von Higgins et al., J. Immunol. 140:
1440, 1988, offenbart in die Pfote injiziert. Die
Ratten werden dreimal und fünfmal pro Woche mit
verschiedenen Dosen von Hypericin, WIS-3, WIS-6 oder WIS-7
behandelt und auf Symptome von EAE überwacht. Die
Immunisierung der Ratten zur Auslösung von EAE am Tag 0 führt
zu einer akuten paralytischen Erkrankung mit Symptomen,
die sich 12 bis 14 Tage nach der Immunisierung zeigen.
Die Ratten werden nach folgendem System bewertet:
0 = normal, 1 = Schwanzmuskulatur wird schwächer,
2 = Hinterbeine werden schwach, 3 = Hinterbeine
gelähmt, 4 = Vorderbeine werden schwach, 5 = moribund.
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Eine weitere Gruppe von Tieren wird 7 bis 10 Tage vor
der Auslösung von EAE am Tag 0 mit verschiedenen Dosen
von Hypericin, WIS-3, WIS-6 oder WIS-7 behandelt, um
die Wirkung dieser PACs auf die Auslösung der
Erkrankung zu bestimmen.
-
Wir gehen davon aus, daß das erfindungsgemäße PAC
sowohl bei der Abwendung von EAE als auch der Besserung
ihrer Symptome wirksam ist.