DE69026715T2

DE69026715T2 - Neue thrombininhibitoren

Info

Publication number: DE69026715T2
Application number: DE69026715T
Authority: DE
Inventors: John W. Ii Maiden Bridge Ny 12115 Fenton; Toni Cambridge Ma 02139 Kline; John M. Tewksbury Ma 01876 Maraganore
Original assignee: Health Research Inc; Biogen Inc
Current assignee: Health Research Inc; Biogen Inc
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-17
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2010-08-18
Also published as: US5691311A; NO920616L; AU6284190A; NL300162I2; HU9200473D0; FI102183B1; FI102183B; HK1001562A1; LU91119I2; ATE137246T1; NO920616D0; HUT60285A; DK0489070T3; EP0489070A1; NL300162I1; NO310294B1; CA2065150C; DE69026715D1; DE122004000042I1; FI920672A0

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue biologisch aktive Moleküle, die an Thrombin binden und es hemmen. Diese Moleküle sind insbesondere durch eine mit einer außenliegenden Anionenbindungsstelle von Thrombin assoziierende Einheit (ABEAM), einen Linkerteil mit einer Länge von mindestens 18 Å und eine gegen die katalytische Stelle von Thrombin gerichtete Einheit (CSDM) charakterisiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Zusammensetzungen, Kombinationen und Verfahren, bei denen diese Moleküle für therapeutische, prophylaktische und diagnostische Zwecke eingesetzt werden.

STAND DER TECHNIK

Akute Gefäßleiden, wie z.B. Herzinfarkt, Schlaganfall, Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, peripherer Arterienverschluß und andere Thrombosen des Blutsystems stellen große gesundheitliche Risiken dar. Solche Krankheiten werden entweder durch teilweisen oder vollständigen Verschluß eines Blutgefäßes durch ein Fibrin und Blutplättchen enthaltendes Blutgerinnsel verursacht.
Derzeitige Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Thrombosekrankheiten umfassen therapeutische Mittel, die auf eine von zwei verschiedenen Arten wirken. Der erste Typ therapeutischer Mittel hemmt die Aktivität oder Bildung von Thrombin und verhindert so die Blutgerinnselbildung. Diese Arzneimittel hemmen auch die Aktivierung und Aggregation von Blutplättchen Die zweite Klasse therapeutischer Mittel beschleunigt die Thrombolyse und löst das Blutgerinnsel auf, wobei das Gerinnsel aus dem Blutgefäß entfernt wird und die Blockierung der Durchblutung aufgehoben wird [J. P. Cazenave et al., Agents Action, Ergänzungsband 15 (1984), S. 24-49].
Zur Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. venöser Thromboembolie, bei der die Thrombinaktivität für die Entwicklung oder Ausdehnung eines Blutgerinnsels verantwortlich ist, hat man allgemein Heparin verwendet, eine Verbindung der erstgenannten Klasse. Trotz seiner Wirksamkeit verursacht Heparin viele unerwünschte Nebenwirkungen, die Blutungen und Thrombozytopenie umfassen. Das hat zur Suche nach einem spezifischeren und weniger toxischen Antikoagulans geführt.
Hirudin ist ein natürlich vorkommendes Polypeptid, das von dem blutsaugenden Blutegel Hirudo medicinalis produziert wird. Diese in der Speicheldrüse des Blutegels produzierte Verbindung ist der stärkste bekannte natürliche Inhibitor der Gerinnung. Hirudin verhindert die Blutgerinnung durch enge Bindung an Thrombin (Kd = 2 x 10&supmin;¹¹ M) in einem Komplex mit einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 [S. R. Stone und J. Hofsteenge, "Kinetics of the Inhibition of Thrombin by Hirudin, Biochemistry 25 (1986), S. 4622-4628]. Das wiederum führt zur Hemmung sowohl der Thrombin-Katalyse der Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin (Blutgerinnsel) als auch aller anderen Thrombin-vermittelten Prozesse [J. W. Fenton II, "Regulation of Thrombin Generation and Functions", Semin. Throm. Hemost. 14 (1988), S.234- 240].
Die tatsächliche Bindung zwischen Hirudin und Thrombin ist ein in zwei Schritten verlaufender Prozeß. Am Anfang bindet Hirudin an eine im Thrombin-Molekül befindliche Stelle "geringer" Affinität (Kd 1 x 10&supmin;&sup8; M), die von der katalytischen Stelle getrennt ist. Bei dieser Bindung erfolgt eine Struktur-Wechselwirkung zwischen dem C-Terminus von Hirudin und einer "außenliegenden Anionenbindungsstelle" (ABE) im Thrombin [J. W. Fenton II, et al., "Thrombin Anion Binding Exosite Interactions with Heparin and Various Polyanions", Ann. New York Acad. Sci. 556 (1989), 8.158-165]. Nach der Bindung mit geringer Affinität erfährt der Hirudin-Thrombin-Komplex eine Konformationsänderung und Hirudin bindet danach an eine Stelle "hoher" Affinität des Thrombins [S. Kono et al., "Analysis of Secondary Structure of Hirudin and the Conformational Change Upon Interaction with Thrombin", Arch. Biochem. Biophys. 267 (1988), S. 158-166]. Die letztere Stelle entspricht der aktiven Stelle von Thrombin.
Isolierung, Aufreinigung und chemische Zusammensetzung von Hirudin sind auf dem Fachgebiet bekannt [P. Walsmann und F. Markwardt, "Biochemical and Pharmacological Aspects of the Thrombin Inhibitor Hirudin", Pharmazie 36 (1981), S. 653-660]. Kürzlich ist die vollständige Aminosäuresequenz des Polypeptids aufgeklärt worden [J. Dodt et al., "The Complete Covalent Structure of Hirudin: Localization of the Disulfide Bonds", Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985), S. 379-385; S. J. T. Mao et al., "Rapid Purification and Revised Amino Terminal Sequence of Hirudin: A Specific Thrombin Inhibitor of the Blood- Sucking Leech", Anal. Biochem. 161 (1987), 8.514-518; und R. P. Harvey et al., "Cloning and Expression of a cDNA Coding for the Anti-Coagulant Hirudin from the Bloodsucking Leech, Hirudo medicinalis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), S. 1084-1088].
Mindestens zehn verschiedene isomorphe Formen von Hirudin sind sequenziert worden und es zeigte sich, daß sie sich in der Aminosäuresequenz etwas unterscheiden [D. Tripier, "Hirudin: A Family of Iso-Proteins. Isolation and Sequence Determination of New Hirudins", Folia Haematol. 115 (1988), S. 30- 35). Alle Hirudin-Formen umfassen ein 65 oder 66 Aminosäuren enthaltendes Protein mit einer einzigen Polypeptid-Kette, bei dem der Amino-Terminus hauptsächlich hydrophobe Aminosäuren und der Carboxyl-Terminus typischerweise polare Aminosäuren umfaßt. Insbesondere sind alle Hirudin- Formen durch eine N-terminale Domäne (Reste 1-39), die durch drei Disulfid- Brücken in einem 1-2-, 3-5- und 4-6-Halb-Cysteinyl-Muster stabilisiert ist, und einen stark sauren C-terminalen Abschnitt (Reste 40-65) charakterisiert. Der C- terminale Hirudin-Abschnitt ist außerdem durch das Vorliegen eines sulfatierten Tyrosin-Restes an der Aminosäure-Position 63 charakterisiert.
Bei Untersuchungen an Tieren hat aus Blutegeln isoliertes Hirudin seine Wirksamkeit bei der Vorbeugung von venöser Thrombose, Gefäßshunt- Verschluß und Thrombin-induzierter disseminierter intravaskulärer Gerinnung bewiesen. Außerdem ist Hirudin nur mäßig toxisch und zeigt geringe Antigenität sowie eine sehr kurze Clearance-Zeit aus dem Blutkreislauf [F. Markwardt et al., "Pharmacological Studies on the Antithrombotic Action of Hirudin in Experimental Animals", Thromb. Haemost. 47 (1982), S. 226-229].
Zur Vergrößerung des Hirudin-Angebots wurden Versuche zur Herstellung des Polypeptids mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken unternommen. Da im nativen Hirudin ein O-sulfatierter Tyrosin-Rest vorliegt und Mikroorganismen eine ähnliche Proteinmodifikation nicht bewirken können, waren die Chancen der rekombinanten Herstellung von biologisch aktivem Hirudin höchst unsicher. Die Beobachtung, daß Hirudin-Formen nach Entfernung der Sulfat-Gruppe fast genauso aktiv waren wie sulfatierte Proteine [US-Patent 4,654,302], führte zur Clonierung und Expression von Hirudin in E. coli [EP-Anmeldungen 158,564, 168,342 und 171,024] und Hefe [EP- Anmeldung 200,655]. Trotz dieser Fortschritte ist die Herstellung von Hirudin noch immer etwas teuer und es ist nicht überall im Handel verfügbar.
Vor kurzem sind Versuche unternommen worden, Peptidfragmente von nativem Hirudin zu identifizieren, die sich auch bei der Verlängerung von Gerinnungszeiten einsetzen lassen. Ein nichtsulfatiertes, 21 Aminosäuren umfassendes C-terminales Hirudin- Fragment, N-Acetylhirudin&sub4;&sub5;&submin;&sub6;&sub5;, verhindert in vitro die Blutgerinnsel-Bildung. Mehrere andere kleinere, nichtsulfatierte Peptide, die den 11 oder 12 C-terminalen Aminosäuren von Hirudin (Reste 55-65 und 54-65) entsprechen, haben ebenfalls ihre Wirksamkeit bei der Hemmung der Blutgerinnsel-Bildung in vitro bewiesen [J. L Krstenansky et al., "Antithrombin Properties of C-terminus of Hirudin Using Synthetic Unsulfated N-acetyl-hirudin&sub4;&sub5;&submin;&sub6;&sub5;", FEBS-Lett. 211(1987), S. 10-16]. Möglicherweise reichen solche Peptidfragmente jedoch wegen ihrer geringen Aktivität bei begonnenen therapeutischen Maßnahmen nicht aus, um Blutgerinnsel aufzulösen. N-Acetylhirudin&sub4;&sub5;&submin;&sub6;&sub5; besitzt beispielsweise eine spezifische Aktivität, die vier Größenordnungen niedriger ist als die spezifische Aktivität von nativem Hirudin
Thrombin katalysiert die Bildung eines Fibrin-Blutgerinnsels und besitzt außerdem mehrere andere biologische Regulationsfunktionen [J. W. Fenton II, "Thrombin Bioregulatory Functions", Adv. Clin. Enzymol. 6 (1988), S. 186-193]. Beispielsweise aktiviert Thrombin direkt die Aggregation und Freisetzungsreaktionen von Blutplättchen. Das bedeutet, daß Thrombin bei akuter Blutplättchen-abhängiger Thrombose eine zentrale Rolle spielt [S. R. Hanson und L. A. Harker, "Interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenylalanyl-L-Prolyl-L- Arginylchloromethylketone", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), S. 3184-3188]. Thrombin kann auch durch Stimulierung der Synthese des Thrombozyten- Aktivierungsfaktors (PAF) in Endothelzellen eine Entzündungsreaktion direkt aktivieren [S. Prescott et al., "Human Endothelial Cells in Culture Produce Platelet-Activating Factor (1-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3 -phosphocholine) When Stimulated With Thrombin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984), S. 3534- 3538]. PAF liegt frei an der Oberfläche von Endothelzellen und dient als Ligand zur Adhäsion neutrophiler Zellen und zur anschließenden Degranulation [G. M. Vercolletti et al., "Platelet-Activating Factor Primes Neutrophil Responses to Agonists: Role in Promoting Neutrophil-Mediated Endothelial Damage", Blood 71 (1988), S. 1100-1107]. Andererseits kann Thrombin eine Entzündung durch Erhöhung der Gefäßpermeabilität fördern, die zu einem Ödem führen kann [P. J. Del Vecchio et al., "Endothelial Monolayer Permeability To Macromolecules", Fed. Proc. 46 (1987), S. 2511-2515]. Reagenzien, die die aktive Stelle von Thrombin blockieren, wie z.B. Hirudin, unterbrechen die Aktivierung von Blutplättchen und Endothelzellen [C. L Knupp, "Effect of Thrombin Inhibitors on Thrombin-Induced Release and Aggregation", Thrombosis Res. 49 (1988), S. 23-36].
Thrombin spielt auch bei der Förderung von Krebs eine Rolle, da sein natives Spaltprodukt Fibrin als Substrat für das Tumorwachstum dienen kann [A. Falanga et al., "Isolation and Characterization of Cancer Procoagulant: A Cysteine Proteinase from Malignant Tissue", Biochemistry 24 (1985), S. 5558- 5567; S. G. Gordon et al., "Cysteine Proteinase Procoagulant From Amnion- Chorion", Blood 66 (1985), S. 1261-1265; und A. Falanga et al., "A New Procoagulant In Acute Leukemia", Blood 71(1988), S. 870-875]. Außerdem spielt Thrombin bei neurodegenerativen Krankheiten eine Rolle, da es eine Retraktion von Neunten verursachen kann [D. Gurwitz et al., "Thrombin Modulates and Reverses Neuroblastoma Neunte Outgrowth", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), S. 3440-3444]. Deshalb ist die Regulierbarkeit der in vivo- Aktivität von Thrombin in vieler Hinsicht von großer klinischer Bedeutung.
Ungeachtet der Entwicklungen bis heute besteht noch immer ein Bedarf an einem Molekül, das die Thrombin-Funktionen bei der Blutgerinnselbildung, der Blutplättchen-Aktivierung sowie verschiedenen anderen Thrombinvermittelten Prozessen wirksam hemmt und das billig in für den Handel geeigneten Mengen hergestellt werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung löst die vorstehend aufgeführten Probleme durch Bereitstellung von Molekülen, die die Hirudin-Wirkung durch Bindung sowohl an die außenliegende Anionbindungsstelle geringer Affinität (ABE) als auch an die katalytische Stelle eines α-Thrombin-Moleküls nachahmen. Diese Moleküle sind wirksamer als Hirudin und können deshalb Patienten in Dosen verabreicht werden, die im Vergleich zu den Dosen, die bei therapeutischen Maßnahmen auf der Basis von Hirudin erforderlich sind, geringer sind. Die erfindungsgemäßen Moleküle können in Zusammensetzungen und Verfahren zur Hemmung aller Thrombin-vermittelten oder im Zusammenhang mit Thrombin stehenden Funktionen oder Prozessen verwendet werden. Sowohl Arzneimittel, die diese Moleküle enthalten, als auch Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Gefäßleiden, Entzündungsreaktionen, Carcinomen und neurodegenerativen Krankheiten, die diese Moleküle verwenden, sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Diese Moleküle können auch in Zusammensetzungen und Verfahren zur bildlichen Darstellung ex vivo, zur Aufbewahrung und Behandlung von Blut außerhalb des Körpers sowie zur Beschichtung invasiver Vorrichtungen eingesetzt werden. Außerdem können die erfindungsgemäßen Moleküle dem Patienten in Kombination mit einem fibrinolytischen Mittel zur Erhöhung der Wirksamkeit einer bestimmten Dosis dieses Mittels oder zur Herabsetzung der Dosis dieses Mittels, die für eine bestimmte Wirkung erforderlich ist, z.B. zur Auflösung eines Blutgerinnsels, verabreicht werden.
Aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit und der Möglichkeit ihrer Herstellung mit Hilfe chemischer Syntheseverfahren können die erfindungsgemäßen Moleküle billig und in Mengen hergestellt werden, die für den Handel geeignet sind. Da die erfindungsgemäßen Moleküle deutlich kleiner als Hirudin sind, ist außerdem die Wahrscheinlichkeit geringer, daß sie in damit behandelten Patienten eine unerwünschte Immunreaktion stimulieren. Dementsprechend ist die Verwendung dieser Thrombininhibitoren nicht auf die Behandlung akuter Erkrankungen beschränkt. Die Moleküle können auch bei der Therapie chronischer thromboembolischer Krankheiten, wie Arteriosklerose und Restenose nach Blutgefäßrekonstruktion, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Moleküle können auch bei verschiedenen anderen Anwendungen anstelle von natürlichem oder rekombinantem Hirudin verwendet werden.
Wie in der folgenden Offenbarung zu erkennen ist, lassen sich die erfindungsgemäßen Moleküle, Zusammensetzungen und Verfahren sowohl zur Behandlung und Vorbeugung verschiedener, auf unerwünschte Wirkungen von Thrombin zurückzuführende Krankheiten als auch für diagnostische Zwecke verwenden.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1 ist ein Autoradiogramm eines SDS-Polyacrylamid-Gels, das die Bindung von DNFB-[³&sup5;S]-Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; an menschliches α- Thrombin in Gegenwart oder Abwesenheit von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-N-acetylhirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; zeigt.
Figur 2 stellt ein dreidimensionales Modell von menschlichem α-Thrombin dar.
Figur 3, Bild A, zeigt die Wirkungen von Hirulog-8 und Sulfo- Tyr&sub6;&sub3;hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; auf die Spaltung von Spectrozym TH durch menschliches α- Thrombin.
Figur 3, Bild B, stellt eine graphische Lineweaver-Burke-Auswertung der Spaltung von Spectrozym TH durch menschliches α-Thrombin in Gegenwart oder Abwesenheit von entweder Hirulog-8 oder Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; dar.
Figur 4 zeigt die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von Hirulog- 8, Hirudin oder Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-N-acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit von normalem menschlichen Serum.
Figur 5, Bild A, stellt den Zeitverlauf der Spaltung von unterschiedlichen Hirulog-8-Konzentrationen durch menschliches α-Thrombin dar.
Figur 5, Bild B, stellt die Beziehung zwischen der Konzentration von Hirulog-8 und der Dauer der Hemmung der durch menschliches α-Thrombin katalysierten Spectrozym-TH-Hydrolyse dar.
Figur 6 zeigt die Wirkung der Linker-Länge der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren auf die Hemmung der Thrombin-katalysierten Hydrolyse von Spectrozym TH.
Figur 7 stellt die Hemmwirkungen verschiedener Konzentrationen von Hirulog-8 oder Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-N-acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; auf die Modifikation von Thrombin durch ¹&sup4;C-DFP dar.
Figur 8 stellt die Wirkung verschiedener Hirulog-8-Dosen auf APTT-Werte bei Pavianen in vivo dar.
Figur 9 zeigt einen Vergleich der Hemmwirkungen von Hirulog-8 und Heparin auf die Hydrolyse von Fibrinogen durch lösliches oder im Gerinnsel gebundenes Thrombin.
Figur 10 zeigt die Wirkungen verschiedener Hirulog-8-Dosen in vivo auf die Blutplättchen-Ablagerung an einem operativ entfernten Gefäßinnenhaut- Segment der Pavian-Aorta.
Figur 11 zeigt die Wirkungen verschiedener Hirulog-8-Dosen in vivo auf die Blutplättchen-Ablagerung an einem Kollagen-beschichteten Schlauchstück, das einem Pavian eingeführt wurde.
Figur 12 zeigt einen Vergleich der in vivo-Wirkungen von Heparin, Hirudin und Hirulog-8 auf die Blutplättchen-Ablagerung an einem Kollagenbeschichteten Schlauchstück, das einem Pavian in einen arteriovenösen Shunt eingeführt wurde.
Figur 13 zeigt die in vivo-Wirkungen verschiedener Hirulog-8-Dosen auf die Fibrin-Ablagerung an einem Kollagen-beschichteten Schlauchstück, das bei einem Pavian in einen AV-Shunt eingeführt wurde.
Figur 14 zeigt die APTT-Veränderung bei Pavianen während der Zeitspanne nach intravenöser Injektion von Hirulog-8.
Figur 15 zeigt die ATPP-Veränderung bei Pavianen während der Zeitspanne nach subcutaner Injektion von Hirulog-8.
Figur 16 zeigt einen Vergleich der Wirkungen des entweder zusammen mit physiologischer Kochsalzlösung, Heparin, Hirudin oder Hirulog-8 verabreichten Gewebe-Plasminogenaktivators in vivo auf den Zeitpunkt einer erneuten Durchblutung am Modellsystem einer Ratte.
Figur 17 zeigt einen Vergleich der Wirkungen des entweder zusammen mit physiologischer Kochsalzlösung, Heparin, Hirudin oder Hirulog-8 verabreichten Gewebe-Plasminogenaktivators in vivo auf den Zeitpunkt eines erneuten Gefäßverschlusses am Modellsystem einer Ratte.
Figur 18 zeigt einen Vergleich der Wirkungen des entweder zusammen mit physiologischer Kochsalzlösung, Heparin, Hirudin oder Hirulog-8 verabreichten Gewebe-Plasminogenaktivators in vivo auf die APTT-Werte am Modellsystem einer Ratte.
Figur 19 zeigt einen Vergleich der Wirkungen des entweder zusammen mit physiologischer Kochsalzlösung, Heparin, Hirudin oder Hirulog-8 verabreichten Gewebe-Plasminogenaktivators in vivo auf die Gefäßdurchgängigkeit am Modellsystem einer Ratte.
Figur 20 zeigt die Wirkung verschiedener Hirulog-8-Dosen auf die Blutungszeiten am Modellsystem eines Pavians.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der Beschreibung und den Patentansprüchen werden durchgehend die folgenden allgemeinen Abkürzungen für Aminosäuren verwendet:
Orn - Ornithin
Ala - Alanin
Leu - Leucin
Pro - Prolin
Trp - Tryptophan
Ser - Serin
Cys - Cystein
Gly - Glycin
Val - Valin
Ile - Isoleucin
Phe - Phenylalanin
Met - Methionin
Thr - Threonin
Tyr - Tyrosin
Asn - Asparagin
Asp - Asparaginsäure
Lys - Lysin
His - Histidin
Hyp - Hydroxyprolin
Ac - Acetyl-Gruppe
BOC - tert-Butoxycarbonyl-Gruppe
Cbz - Carbobenzyloxy-Gruppe 3,4-dehydropro - 3,4-Dehydroprolin
Tyr(OSO&sub3;H) - Tyrosinsulfat
3-,5-dijodTyr - 3-,5-Dijodtyrosin
Gln - Glutamin
Glu - Glutaminsäure
Arg - Arginin
Nle - Norleucin
Pgl - Phenylglycin
Suc - Succinyl-Gruppe
Tos - para-Toluolsulfonyl- Gruppe
D-Ala - D-Alanin
Sar - Sarcosin (N-Methylglycin)
Tyr(SO&sub3;H) - Tyrosinsulfonat
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "eine beliebige Aminosäure" umfaßt sowohl L-Isomere natürlich vorkommender Aminosäuren als auch andere "Nichtprotein"-α-Aminosäuren, die vom Peptidchemiker bei der Herstellung synthetischer Analoge natürlich vorkommender Aminopeptide gewöhnlich verwendet werden. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Prolin, Histidin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, γ-Carboxyglutaminsäure, Arginin, Ornithin und Lysin. Beispiele für "Nichtprotein"-α-Aminosäuren umfassen Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Homoarginin, Thiaprolin, Dehydroprolin, Hydroxyprolin (Hyp), Homoserin, Cyclohexylglycin (Chg), α-Amino-n- Buttersäure (Aba), Cyclohexylalanin (Cha), Aminophenylbuttersäure (Pba), und Phenylalanin, die an der ortho-, meta- oder para-Position der Phenyl- Einheit mit einem oder zwei der folgenden Reste substituiert sind: einem (C&sub1;- C&sub4;)-Alkylrest, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxyrest, Halogenatom, Nitro-Resten oder substituiert mit einer Methylendioxy-Gruppe; β-2- und 3-Thienylal-alanin, β-2- und 3- Furanylalanin, β-2, 3- und 4-Pyridylalanin, β-(Benzothienyl-2- und 3-yl)alanin, β-( 1- und 2-Naphthyl)alanin, O-alkylierte Derivate von Serin, Threonin oder Tyrosin, S-alkyliertes Cystein, S-alkyliertes Homocystein, O-Sulfat, O-Phosphat und O-Carboxylat-Ester von Tyrosin, 3- und 5-Sulfonyltyrosin, 3- und 5- Carbonyltyrosin, 3- und 5 -Phosphonyltyrosin, 4-Methylsulfonyltyrosin, 4- Methylphosphonyltyrosin, 4-Phenylessigsäure, 3,5-Dijodtyrosin, 3- und 5- Nitrotyrosin, &epsi;-Alkyllysin, delta-Alkylornithin und D-Isomere natürlich vorkommender Aminosäuren.
Die in der vorliegenden Erfindung als Tyrosinsulfat, Tyr(OSO&sub3;H) und O- Sulfatester von Tyrosin bezeichneten Verbindungen sind identisch und haben die Strukturformel:
Die in der vorliegenden Erfindung als Tyrosinsulfonat, Tyr(SO&sub3;H), 3- Sulfonyltyrosin und 5-Sulfonyltyrosin bezeichneten Verbindungen sind identisch und haben die Strukturformel:
Der in der vorliegenden Anmeldung verwendete Begriff "Patient" bedeutet beliebige Säugetiere, insbesondere Menschen.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "anionische Aminosäure" bedeutet sowohl ein meta-, para- oder ortho-, mono- oder disubstituiertes Phenylalanin, Cyclohexylalanin oder Tyrosin, das eine Carboxyl-, Phosphoryl- oder Sulfonyl-Einheit enthält, als auch S-alkyliertes Cystein, S-alkyliertes Homocystein, γ-Carboxyglutaminsäure, &epsi;-Alkyllysin, delta-Alkylornithin, Glutaminsäure und Asparaginsäure. Beispiele für anionische Aminosäuren sind Phosphothreonin, Phosphoserin, Phosphotyrosin, 3-, 4- oder 5-Sulfotyrosin, 3-Methylphosphonyltyrosin und 3- Methylsulfonyltyrosin.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "katalytische Stelle", "aktive Stelle" und "aktive Stelle enthaltende Tasche" bedeuten eine beliebige oder jede der folgenden Stellen in Thrombin: die Substratbindungsoder "S&sub1;"-Stelle, die hydrophobe Bindungs- oder " ölartige" Stelle sowie die Stelle, an der die Spaltung eines Substrates tatsächlich erfolgt ("Ladungsübertragungsstelle").
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Norn" bedeutet das in der Seitenkette von Ornithin enthaltene Stickstoffatom. Der Ausdruck "Ng" bedeutet ein beliebiges der in der Seitenkette von Arginin enthaltenen Stickstoffatome. Der Ausdruck "Nα" bedeutet die α-Aminogruppe einer Aminosäure. Der in der Patentbeschreibung und den Patentansprüchen verwendete Ausdruck "psi" bedeutet gemäß der von J. Rudinger in Drug Design, Bd. II (1971), Herausg. E. J. Ariens, S. 319, Academic Press, New York, beschriebenen Nomenklatur den Austausch einer Amidbindung gegen die in Klammern angegebenen Atome.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Grundgerüstkette" bedeutet den Teil einer chemischen Struktur, der die kleinste Anzahl aufeinanderfolgender Bindungen definiert, die von einem Ende dieser chemischen Struktur bis zum anderen Ende zu finden sind. Die eine Grundgerüstkette bildenden Atombestandteile können beliebige Atome umfassen, die Bindungen mit mindestens zwei anderen Atomen eingehen können.
Beispielsweise ist jede der folgenden chemischen Strukturen durch eine Grundgerüstkette mit 7 Atomen charakterisiert (die Atome, die die Grundgerüstkette bilden, sind fett gedruckt):
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "berechnte Länge" bedeutet ein prognostiziertes Maß, das durch Summieren der Bindungslängen zwischen den die Grundgerüstkette bildenden Atomen erhalten wird. Bindungslängen zwischen zwei bestimmten Atomen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt [vgl. beispielsweise CRC Handbook of Chemistry and Physics, Herausgeber R. C. Weist, 65. Ausgabe (1984), S. F-166-170, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL].
Die vorliegende Erfindung betrifft Moleküle, die an Thrombin binden und es hemmen. Diese Moleküle sind durch drei Domänen charakterisiert: eine gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit ("CSDM"), einen Linker- Bereich und eine mit einer außenliegenden Anionenbindungsstelle assoziierende Einheit ("ABEAM").
Erfindungsgemäß bindet die erste Domäne, CSDM, an die katalytische Stelle von Thrombin, die sich bei oder in der Nähe von Ser-195 befindet, und hemmt oder verzögert die amidolytische oder esterolytische Aktivität von Thrombin Die erfindungsgemäßen CSDM-Domänen sind vorzugsweise aus einer der drei allgemeinen Gruppen ausgewählt: Gruppen, die reversibel an Thrombin binden und langsam gespalten werden, Gruppen, die reversibel an Thrombin binden und nicht gespalten werden können, und Gruppen, die irreversibel an Thrombin binden. Reversible Inhibitoren binden an die aktive Stelle von Thrombin durch nichtkovalente Wechselwirkungen, wie Ionenbindung, hydrophobe Wechselwirkungen oder Wasserstoff-Brückenbindung. Irreversible CSDM-Domänen gehen mit Thrombin kovalente Bindungen ein.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die CSDM- Domäne, die reversibel an Thrombin bindet und langsam gespalten wird, die Formel:
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Y,
wobei X ein Wasserstoffatom bedeutet oder durch eine aus 1 bis 35 Atomen bestehende Grundgerüstkette gekennzeichnet ist, A&sub1; ein Arg, Lys oder Orn ist, A&sub2; eine Nicht-Amidbindung bedeutet, A&sub3; durch eine aus 1 bis 9 Atomen bestehende Grundgerüstkette gekennzeichnet ist und Y eine Bindung darstellt.
Entsprechend dieser Ausführungsform kann der die Nicht-Amidbindung darstellende Bestandteil durch chemische Modifikation einer Amidbindung gebildet werden. Das kann durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Verfahren erreicht werden [M. Szelke et al., "Potent New Inhibitors of Human Renin", Nature 299 (1982), S. 555-557; D. H. Coy et al., "Facile Solid Phase Preparation of Proteins Containing the CH&sub2;-NH Peptide Bond Isostere and Application to the Synthesis of Somatostatin (SRIF) Octapeptide Analogues", Peptides 1986, Herausgeber D. Theodoropoulos, (1987), S. 143-146, Walter Degruyter & Co., Berlin]. Wenn eine Nicht-Amidbindung auf diese Weise gebildet wird, ist es bevorzugt, die chemische Modifikation vor Anlagerung des diese Bindung enthaltenen Dipeptids an die anderen CSDM-Bestandteile oder den Rest des Thrombininhibitor-Moleküls durchzuführen. Auf diese Weise wird das Dipeptid A&sub1;-A&sub2;-A&sub3; in einem einzigen Syntheseschritt im ganzen an den Rest des Moleküls angelagert.
Entsprechend einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist A&sub1; Arg und A&sub3; bedeutet Pro, D-Pro oder Sar. Bei dieser Ausführungsform stellt A&sub2; eine natürlich vorkommende Imidbindung dar, die durch Thrombin langsam gespalten wird. Dadurch ist es nicht erforderlich, die Nicht-Amidbindung vorher zu bilden, und A&sub1; sowie A&sub2; müssen nicht im ganzen, sondern können schrittweise an den Molekülrest angelagert werden.
Wie vorstehend dargelegt, können erfindungsgemäße CSDM-Domänen irreversibel an Thrombin binden. Beispiele für irreversibel bindende CSDM- Domänen umfassen allgemeine Serinproteinase-Inhibitoren, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Diisopropylfluorphosphat (DFP), Tosylprolylchlormethylketon (TPCK) und Tosyllysylchlormethylketon (TLCK), heterocyclische Protease-Inhibitoren, wie Isokumarine, Thrombin-spezifische Inhibitoren wie D-Phe-Pro-Arg-CHCl&sub2; (PPACK), sowie Übergangszustand- Analoge, wie Difluorketomethylen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Entsprechend einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzen nichtspaltbare, reversibel bindende CSDM- Domänen die Formel:
X-C&sub1;-C&sub2;-A&sub3;-Y,
wobei C&sub1; ein Derivat von Arg, Lys oder Orn darstellt, das durch eine reduzierte Carboxylat-Einheit oder eine Carboxylat-Einheit gekennzeichnet ist, die vom α- Kohlenstoffatom durch eine chemische Struktur verdrängt ist, die durch eine Grundgerüstkette mit 1 bis 10 Atomen charakterisiert ist, C&sub2; eine nichtspaltbare Bindung bedeutet und X, Y sowie A&sub3; wie vorstehend definiert sind. Beispiele für C&sub1;-Bestandteile sind β-Homoarginin, Arginin, das eine reduzierte Carboxylat- Einheit, wie Arg[psiCH&sub2;NH] enthält, β-Homolysin und β-Homoornithin.
Andere nichtspaltbare, reversibel bindende CSDM-Domänen, die bei den erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren eingesetzt werden können, sind Benzamidin, DAPA, NAPAP und Argatroban (Argipidin).
Bei den erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren, die durch eine A&sub2;- oder C&sub2;-Bindung gekennzeichnete CSDM-Bereiche besitzen, bedeutet der im vorliegenden Text verwendete Ausdruck "P&sub1;-P&sub1;' " zwei chemische Strukturen, die durch diese Bindung miteinander verbunden sind.
Der Bestandteil X einer CSDM-Domäne, der nicht an der eigentlichen Bindung an die katalytische Stelle beteiligt ist, kann eine unbegrenzte Länge und eine unterschiedliche Zusammensetzung aufweisen. Für praktische Zwecke und um die Synthesekosten niedrig zu halten, ist X jedoch vorzugsweise durch eine Grundgerüstkette gekennzeichnet, die aus 1 bis 35 Atomen besteht und eine berechnete Länge von 36 Å nicht überschreitet. X ist vorzugsweise ein Peptid, besonders bevorzugt ist es D-Phe-Pro. Diese am meisten bevorzugte Ausführungsform ermöglicht es, daß der Bestandteil X in eine neben der aktiven Stelle von Thrombin liegende Furche hineinpaßt [S. Bajusz et al., "Inhibition of Thrombin and Trypsin by Tripeptide Aldehydes", Int. J. Peptide Protein Res. 12 (1978), S. 217-221; C. Kettner et al., "D-Phe-Pro-Arg-CH&sub2;Cl - A Selective Affinity Label for Thrombin", Thromb. Res. 14 (1979), S. 969-973]. Das ermöglicht die Bindung des CSDM-Bestandteils und deshalb der erfindungsgemäßen Moleküle an Thrombin mit einem vorteilhafterweise hohen Grad an Mfinität und optimaler Spezifität
Erfindungsgemäß ist der zweite Bestandteil der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren ein Linker-Bereich. Da die Rolle dieses Molekülteils in der Bereitstellung einer Brücke zwischen der CSDM-Domäne und dem ABEAM- Bereich besteht, ist die Lange des Linkers von äußerster Wichtigkeit und nicht seine Struktur. Die den Linker kennzeichnende berechnete Länge der Grundgerüstkette muß mindestens etwa 18 Å - Abstand zwischen der katalytischen Stelle und der außenliegenden Anion-Bindungsstelle von Thrombin - aber weniger als etwa 42 Å betragen.
Die Grundgerüstkette des Linkers kann beliebige Atome umfassen, die mit mindestens zwei anderen Atomen eine Bindung eingehen können. Die Grundgerüstkette besteht vorzugsweise aus einer beliebigen, chemisch möglichen Kombination von Atomen, die aus Sauerstoff-, Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen ausgewählt sind. Aufgrund der bekannten Abstände zwischen verschiedenen Bindungen [vgl. beispielsweise R. T. Morrison und R. N. Boyd, Organic Chemistry, 3. Ausgabe (1977), Allyn and Bacon, Inc., Boston, Massachusetts] ist dem Fachmann klar, welche Kombination der vorstehend erwähnten, eine Grundgerüstkette bildenden Atome die erforderliche Länge aufweisen. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform ist der Linker ein Peptid, das die Aminosäuresequenz Gly- Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe umfaßt. Die an den ABEAM-Bestandteil gebundene Aminosäure ist vorzugsweise ein Phe.
Die dritte Domäne der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren ist der ABEAM-Bereich, der an die außenliegende Anionenbindungsstelle von Thrombin bindet. Der ABEAM-Bereich besitzt vorzugsweise die Formel:
W-B&sub1;-B&sub2;-B&sub3;-B&sub4;-B&sub5;-B&sub6;-B&sub7;-B&sub8;-Z,
wobei W eine Bindung bedeutet, B&sub1; eine anionische Aminosäure ist, B&sub2; eine beliebige Aminosäure ist, B&sub3; Ile, Val, Leu, Nle oder Phe bedeutet, B&sub4; Pro, Hyp, 3,4-dehydropro, Thiazolidin-4-carboxylat, Sar, eine beliebige N-Methyl- Aminosäure oder D-Ala darstellt, B&sub5; eine anionische Aminosäure ist, B&sub6; eine anionische Aminosäure ist, B&sub7; eine lipophile Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha oder Pro, oder ein Dipeptid, das aus einer dieser lipophilen Aminosäuren und einer beliebigen Aminosäure besteht, B&sub8; eine Bindung oder ein Peptid bedeutet, das ein bis fünf Reste einer beliebigen Aminosäure enthält, und Z ein Carboxyl-terminaler Rest ist, der ausgewählt ist aus der OH-Gruppe, einem C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy-Rest, Amino-, Monooder Di-(C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-substituierten Amino- oder Benzylamino-Gruppen.
Es hat sich gezeigt, daß zu dem Carboxyl-terminalen Hirudin-Teil homologe Peptide an die außenliegende Anionenbindungsstelle von Thrombin binden [gleichfalls anhängige US-Patentanmeldung 314,756 sowie J. M. Maraganore et al., "Anticoagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides", J. Biol. Chem. 264 (1989), 8.8692-8698; wobei beide Veröffentlichungen durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen sind].
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der ABEAM-Bereich zu den Aminosäuren 56-64 von Hirudin homolog, d.h. B&sub1; ist Glu, B&sub2; ist Glu, B&sub3; ist Ile, B&sub4; ist Pro, B&sub5; ist Glu, B&sub6; ist Glu, B&sub7; ist Tyr-Leu, Tyr(SO&sub3;H)-Leu bzw. Tyr(OSO&sub3;H)-Leu, oder (3-,5-DijodTyr)-Leu, B&sub8; ist eine Bindung und Z stellt die OH-Gruppe dar. Es ist erwähnenswert, daß natives Hirudin an der Position 63 Tyr(OSO&sub3;H) enthält. Carboxyl-terminale Hirudinpeptide, die Tyr(SO&sub3;H) enthalten, besitzen dieselbe gerinnungshemmende Aktivität wie Peptide, die natives Tyr(OSO&sub3;H) enthalten [vgl. die gleichfalls anhängige US-Patentanmeldung 314,756].
Andere ABEAM-Bestandteile, die zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung gehören, können Teile beliebiger Moleküle umfassen, von denen bekannt ist, daß sie an die Anionenbindungsstelle von Thrombin binden. Diese umfassen die Aminosäuren 1675-1686 von Faktor V, die Aminosäuren 272-285 des Blutplättchen-Glycoproteins Ib, die Aminosäuren 415-428 von Thrombomodulin, die Aminosäuren 245-259 des Prothrombin-Fragments 2 und die Aminosäuren 30 bis 44 der Fibrinogen-Aα-Kette. Der ABEAM-Bestandteil kann außerdem aus allen von J. L Krstenansky et al. in "Development of MDL- 28,050, A Small Stable Antithrombin Agent Based On A Functional Domain of the Leech Protein, Hirudin", Thromb. Haemostas. 63 (1990), S. 208-214 beschriebenen Hirudin-Peptidanalogen ausgewählt werden.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren werden als Hiruloge bezeichnet und sind in den folgenden Beispielen beschrieben. Die am meisten bevorzugten Hirulog-Formen sind Hirulog-8, Hirulog-12, Hirulog-18a, Hirulog-18b und Hirulog-33. Hirulog-8, Hirulog-12 und Hirulog-33 sind reversibel bindende Thrombininhibitoren, die langsam gespalten werden. Hirulog-18a und Hirulog-18b sind reversibel bindende Inhibitoren, die nicht gespalten werden.
Die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren können mittels verschiedener, auf dem Fachgebiet wohlbekannter Verfahren synthetisiert werden. Diese umfassen die enzymatische Spaltung von natürlichem oder rekombinantem Hirudin, DNA-Rekombinationstechniken, Peptidsynthese an Festphasen, Peptidsynthese in Lösung, Syntheseverfahren der organischen Chemie oder eine Kombination dieser Verfahren. Die Wahl des Syntheseverfahrens hängt natürlich von der Zusammensetzung eines bestimmten Inhibitors ab. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der gesamte Thrombininhibitor ein Peptid und wird mit Hilfe von Peptidsyntheseverfahren an Festphasen, Peptidsynthese- Verfahren in Lösung oder einer Kombination davon synthetisiert, wobei diese Verfahren zur Herstellung dieser Moleküle in für den Handel geeigneten Mengen am kostengünstigsten sind.
Wenn "Nichtprotein" -Aminosäuren im Thrombininhibitor-Molekül enthalten sind, können sie je nach der Art der gewünschten "Nichtprotein"- Aminosäure entweder während der Peptidsynthese an die länger werdende Kette angelagert oder mittels chemischer Modifikation des vollständig synthetisierten Peptids erzeugt werden. Der Fachmann weiß, welche "Nichtprotein"-Aminosäuren direkt angelagert werden können und welche nach der Peptidsynthese durch chemische Modifikation der vollständigen Peptidkette synthetisiert werden müssen.
Die Synthese der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren, die sowohl Teile, die keine Aminosäuren sind, als auch Peptidteile enthalten, wird vorzugsweise durch ein gemischtes heterologes/Festphasen-Verfahren erreicht. Dieses Verfahren umfaßt die Synthese des gesamten oder größten Teils des Peptidanteils des Moleküls an einer Festphase und anschließend die Anlagerung der Bestandteile, die keine Aminosäure sind und mit Hilfe von Verfahren in Lösung synthetisiert werden. Der Bestandteil, der keine Aminosäure ist, kann mit dem Peptidteil durch Verfahren an Festphasen oder in Lösung verknüpft werden. Ebenso können beliebige restliche Peptidanteile durch Verfahren an Festphasen oder in Lösung angelagert werden.
Die erfindungsgemäßen Moleküle zeigen eine starke gerinnungshemmende Aktivität. Diese Aktivität kann in vitro unter Verwendung eines beliebigen üblichen Verfahrens analysiert werden. Ein Test auf gerinnungshemmende Aktivität umfaßt vorzugsweise die direkte Bestimmung der Thrombin- hemmenden Aktivität des Moleküls Diese Verfahren ermitteln die Hemmung der Thrombin-katalysierten Spaltung von Farbsubstraten oder besonders bevorzugt die Zunahme der Thrombinzeiten bzw. der aktivierten partiellen Thromboplastinzeiten von menschlichem Plasma. Mit letzterem Test lassen sich Faktoren im Gerinnungs-"eigenen" Stoffwechselweg bestimmen. In einer anderen Ausführungsform können bei dem angewendeten Test gereinigtes Thrombin und Fibrinogen verwendet werden, um mittels eines Radioimmuntests oder des ELISA-Verfahrens die Hemmung der Freisetzung der Fibrinopeptide A und B zu bestimmen.
Die gegen Blutplättchen gerichtete Aktivität der erfindungsgemäßen Moleküle kann mit Hilfe einer der zahlreichen üblichen Blutplättchen-Tests bestimmt werden. Mit dem Test wird vorzugsweise eine Veränderung des Ausmaßes der Blutplättchen-Aggregation ermittelt oder eine Veränderung in der Freisetzung eines Blutplättchen-Sekretionsbestandteils in Gegenwart von Thrombin. Ersteres kann mit einem Gerät zur Aggregationsmessung ermittelt werden. Letzteres kann unter Verwendung von RIA- oder EUSA-Verfahren, die für den sezernierten Bestandteil spezifisch sind, bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Moleküle lassen sich in Zusammensetzungen, Kombinationen und Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe verschiedener Krankheiten verwenden, die auf Thrombin-vermittelte und im Zusammenhang mit Thrombin stehende Funktionen und Prozesse zurückzuführen sind. Diese umfassen Herzinfarkt, Schlaganfall, Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, peripheren Arterienverschluß, Restenose nach Arterienverletzung oder invasiven kardiologischen Verfahren, akute oder chronische Arteriosklerose, Ödeme und Entzündungen, verschiedene Zellregulationsprozesse (z.B. Sekretion, Form-Veränderungen, Proliferation), Krebs und Metastasen-Bildung sowie neurodegenerative Krankheiten.
Die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren können unter Verwendung üblicher Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen formuliert werden, z.B. durch Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen Trägers. Zusammensetzungen und Verfahren, bei denen Thrombininhibitoren eingesetzt werden, können bei dem Patienten zur Behandlung oder Verhinderung von Thrombosekrankheiten verwendet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Thrombininhibitoren in Kombinationen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Thrombosekrankheiten und zur Senkung der Dosis eines thrombolytischen Mittels angewendet werden, das vom Patienten zur erneuten Durchblutung und Verhinderung eines erneuten Gefäßverschlusses benötigt wird. Außerdem können die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren in Kombinationen, Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden, um bei dem mit einem thrombolytischen Mittel behandelten Patienten die Zeitspanne bis zur erneuten Durchblutung zu verringern oder die Zeitspanne bis zu einem erneuten Gefäßverschluß zu erhöhen. Diese Kombinationen und Zusammensetzungen umfassen eine pharmazeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Thrombininhibitors und eine pharmazeutisch wirksame Menge eines thrombolytischen Mittels.
In diesen Kombinationen und Zusammensetzungen ergänzen sich der Thrombininhibitor und das thrombolytische Mittel in der Auflösung von Blutgerinnseln, was bei dem damit behandelten Patienten zur Verkürzung der Zeitspanne bis zur erneuten Durchblutung und zur Erhöhung der Zeitspanne bis zu einem erneuten Gefäßverschluß führt. Insbesondere löst das thrombolytische Mittel das Gerinnsel auf, während der Thrombininhibitor die Wiederherstellung des Gerinnsels durch neu freigesetztes, im Gerinnsel verbliebenes oder im Gerinnsel gebundenes Thrombin verhindert. Die Verwendung eines Thrombininhibitors in erfindungsgemäßen Kombinationen und Zusammensetzungen ermöglicht vorteilhafterweise die Verabreichung eines thrombolytischen Mittels in Dosen, von denen man bisher annahm, daß sie zur Erzielung thrombolytischer Wirkungen bei alleiniger Verabreichung zu niedrig sind. Dadurch werden einige der unerwünschten Nebenwirkungen, die mit der Verwendung thrombolytischer Mittel einhergehen, wie Blutungskomplikationen, vermieden.
Thrombolytische Mittel, die bei den erfindungsgemäßen Kombinationen und Zusammensetzungen eingesetzt werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Mittel umfassen aus natürlichen Ausgangsmaterialien aufgereinigten Gewebe-Plasminogenaktivator, rekombinanten Gewebe- Plasminogenaktivator, Streptokinase, Urokinase, Prourokinase, einen isolierten Streptokinase-Plasminogenaktivator-Komplex (ASPAC), Plasminogenaktivatoren aus tierischen Speicheldrüsen und bekannte, biologisch aktive Derivate der vorstehend erwähnten Stoffe, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Kombination" umfaßt eine Dosiseinheit, die mindestens einen erfindungsgemäßen Thrombininhibitor und mindestens ein thrombolytisches Mittel enthält, mehrere Dosiseinheiten, wobei der Thrombininhibitor und das thrombolytische Mittel getrennt, aber gleichzeitig verabreicht werden, und mehrere Dosiseinheiten, wobei die beiden Bestandteile getrennt, aber nacheinander verabreicht werden. Bei der nacheinander erfolgenden Verabreichung kann der Thrombininhibitor dem Patienten während einer Zeitspanne verabreicht werden, die von etwa 5 Stunden vor Verabreichung des thrombolytischen Mittels bis etwa 5 Stunden nach dessen Verabreichung reicht. Der Thrombininhibitor wird dem Patienten vorzugsweise in einer Zeitspanne verabreicht, die von etwa 2 Stunden vor Verabreichung des thrombolytischen Mittels bis etwa 2 Stunden nach dessen Verabreichung reicht.
In einer anderen Ausführungsform können der Thrombininhibitor und das thrombolytische Mittel in Form eines konjugierten Einzelmoleküls vorliegen. Eine Konjugation beider Bestandteile kann mit Hilfe von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Standard-Vernetzungsverfahren erreicht werden. Das Einzelmolekül kann auch in Form eines rekombinanten Fusionsproteins vorliegen, wenn sowohl der Thrombininhibitor als auch das thrombolytische Mittel Peptide sind.
Zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Kombinationen können verschiedene Dosierungsformen angewendet werden. Diese umfassen die parenterale und orale Verabreichung sowie lokale Anwendung, sind aber nicht darauf beschränkt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Kombinationen können dem Patienten in beliebigen pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen verabreicht werden, zu denen solche gehören, bei denen die Dosis dem Patienten auf einmal oder durch kontinuierliche Infusion intravenös, intramuskulär einschließlich paravertebral und periartikulär, subcutan, intracutan, intraartikulär, intrasynovial, intrathecal, in die Wunde oder periostal injiziert oder oral, nasal bzw. lokal verabreicht wird. Diese Zusammensetzungen und Kombinationen werden vorzugsweise zur lokalen, nasalen, oralen bzw. parenteralen Verabreichung angepaßt, werden jedoch am meisten bevorzugt zur parenteralen Verabreichung formuliert.
Parenterale Zusammensetzungen werden am meisten bevorzugt entweder in einer Gabe oder als kontinuierliche Infusion intravenös injiziert. Bei Verwendung des Thrombininhibitors als Antithrombozytenmittel ist die kontinuierliche Infusion bevorzugt. Bei Verwendung des Thrombininhibitors als gerinnungshemmendes Mittel ist die subcutane oder intravenöse Injektion in einer Gabe bevorzugt. Zur parenteralen Verabreichung werden Flüssigeinheits-Dosisformen hergestellt, die einen erfindungsgemäßen Thrombininhibitor und einen sterilen Trägerstoff enthalten. Je nach Art des Trägerstoffes und Art des einzelnen Thrombininhibitors kann der Thrombininhibitor entweder suspendiert oder gelöst werden. Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden normalerweise hergestellt, indem man den Thrombininhibitor gegebenenfalls zusammen mit anderen Bestandteilen in einem Trägerstoff löst, die Lösung filtersterilisiert, anschließend in ein geeignetes Fläschchen oder eine Ampulle abfüllt und diese danach verschließt. Im Trägerstoff werden auch Hilfsstoffe gelöst, wie ein Lokalanaesthetikum, Konservierungsmittel und Puffermittel. Zur Erhöhung der Stabilität kann die Zusammensetzung dann eingefroren und lyophilisiert werden.
Suspensionen zur parenteralen Verabreichung werden im wesentlichen in gleicher Weise hergestellt, wobei allerdings der wirksame Bestandteil im Trägerstoff suspendiert und nicht gelöst wird. Eine Sterilisierung der Zusammensetzungen wird vorzugsweise vor Suspension im sterilen Trägerstoff durch Behandlung mit Ethylenoxid erreicht. Der Zusammensetzung wird zur Erleichterung einer gleichmäßigen Verteilung seiner Bestandteile vorteilhafterweise ein oberflächenaktives Mittel oder Benetzungsmittel zugegeben.
Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können übliche Excipienten, wie z.B. Bindemittel, Füllstoffe, Verdünnungsmittel, Tablettierungsmittel, Gleitmittel, Sprengmittel oder Benetzungsmittel enthalten. Die Tabletten können nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, beschichtet werden. Geeignete Füllstoffe, die eingesetzt werden können, umfassen Cellulose, Mannit, Lactose und andere ähnliche Mittel. Geeignete Sprengmittel umfassen Stärke, Polyvinylpyrrolidon und Stärke-Derivate, wie Natrium-Stärkeglycolat, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Gleitmittel umfassen beispielsweise Magnesiumstearat. Geeignete Benetzungsmittel umfassen Natriumlaurylsulfat.
Flüssigpräparate zur oralen Verabreichung können wäßrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe bzw. Elexiere sein oder können als Trockenprodukte vor ihrer Verwendung vorliegen, die dann mit Wasser oder einem anderen geeigneten Trägerstoff zubereitet werden. Solche Flüssigpräparate können übliche Zusätze enthalten. Diese umfassen Suspendiermittel, wie Sorbit, Sirup, Methylcellulose, Gelatine, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethyl-cellulose, Aluminiumstearatgel oder gehärtete Speisefette, Emulgatoren einschließlich Lecithin, Sorbitanmonooleat, Polyethylenglykole oder Akazien gummi, nichtwäßrige Trägerstoffe, wie Mandelöl, fraktioniertes Kokosöl oder Ölester, und Konservierungsmittel, wie Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure Zur lokalen Anwendung zubereitete Zusammensetzungen können beispielsweise in Form eines wäßrigen Gelees, einer öligen Suspension oder emulgierten Salbe vorliegen.
Die Dosierung und Dosisrate eines Thrombininhibitors hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z.B. der Größe des Patienten, dem spezifischen verwendeten Arzneimittel, dem Ziel der Behandlung, d.h. Therapie oder Prophylaxe, der Art der zu behandelnden Thrombosekrankheit und dem Urteil des behandelnden Arztes.
Erfindungsgemäß liegt eine bevorzugte pharmazeutisch wirksame Tagesdosis eines erfindungsgemäßen Thrombininhibitors zwischen etwa 1 µg/kg Körpergewicht des zu behandelnden Patienten ("Körpergewicht") und etwa 5 mg/kg Körpergewicht. Bei Kombinationen, die ein thrombolytisches Mittel enthalten, liegt eine pharmazeutisch wirksame Tagesdosis des thrombolytischen Mittels bei etwa 10% bis 80% des üblichen Dosierungsbereiches. Der "übliche Dosierungsbereich" eines thrombolytischen Mittels ist die verwendete Tages-Dosis, wenn dieses Mittel bei einer Therapie mit einem einzigen Wirkstoff eingesetzt wird [Physician's Desk Reference 1989, 43. Ausgabe, Herausgeber Edward R. Barnhart]. Dieser übliche Dosierungsbereich ist natürlich in Abhängigkeit von dem eingesetzten thrombolytischen Mittel unterschiedlich. Beispiele für übliche Dosierungsbereiche sind wie folgt: Urokinase - 500 000 bis 6 250 000 Einheiten/Patient, Streptokinase - 140 000 bis 2 500 000 Einheiten/Patient, TPA - 0,5 bis 5,0 mg/kg Körpergewicht, ASPAC - 0,1 bis 10 Einheiten/kg Körpergewicht.
Am bevorzugtesten umfassen die erfindungsgemäßen therapeutischen und prophylaktischen Zusammensetzungen eine Thrombininhibitor-Dosis von etwa 10 µg/kg Körpergewicht bis etwa 500 µg/kg Körpergewicht. Die am meisten bevorzugten Kombinationen umfassen einen Thrombininhibitor in gleicher Menge und etwa 10% bis etwa 70% des üblichen Dosierungsbereiches eines thrombolytischen Mittels. Eine pharmazeutisch wirksame Tages-Dosis sowohl eines erfindungsgemäßen Thrombininhibitors als auch eines in den erfindungsgemäßen Kombinationen vorhandenen thrombolytischen Mittels kann natürlich unter oder über den vorstehend angebenen spezifischen Dosierungsbereichen liegen.
Wenn einmal eine Verbesserung im Zustand des Patienten eingetreten ist, wird gegebenenfalls eine Erhaltungsdosis einer erfindungsgemäßen Kombination oder Zusammensetzung verabreicht. Anschließend können die Dosierung, die Häufigkeit der Verabreichung oder beides parallel zu den Symptomen bis zu einem Niveau herabgesetzt werden, auf dem der verbesserte Zustand trotzdem erhalten bleibt. Wenn eine gewünschte, ausreichende Linderung der Symptome erreicht worden ist, sollte die Behandlung beendet werden. Nach Wiederauftreten von Krankheitssymptomen benötigen die Patienten jedoch möglicherweise eine intermittierende Therapie.
Nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Thrombininhibitoren in Zusammensetzungen und Verfahren zur Beschichtung der Oberflächen invasiver Vorrichtungen verwendet werden, die bei Patienten, bei denen diese Vorrichtungen eingeführt werden, zu einem geringeren Risiko der Gerinnselbildung oder Blutplättchenaktivierung führen. Oberflächen, die mit erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beschichtet werden können, umfassen beispielsweise Prothesen, künstliche Herzklappen, Gefäßtransplantate, chirurgische Spannbügel und Katheder. Verfahren und Zusammensetzungen zur Beschichtung dieser Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Diese Verfahren umfassen die chemische Vernetzung oder physikalische Adsorption der Thrombininhibitoren enthaltenden Zusammensetzungen an den Oberflächen der Vorrichtungen.
Nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Thrombininhibitoren zur bildlichen ex vivo-Darstellung eines im Patienten befindlichen Thrombus verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform wird ein Thrombininhibitor mit einem radioaktiven Isotop markiert. Die Auswahl eines radioaktiven Isotops basiert auf einer Reihe wohlbekannter Faktoren, beispielsweise Toxizität, biologischer Halbwertszeit und der Möglichkeit eines Nachweises. Bevorzugte radioaktive Isotope umfassen ¹²&sup5;I, ¹²³I, und ¹¹¹In, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Verfahren zur Markierung eines Thrombininhibitors sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Das radio aktive Isotop ¹²³I und eine Markierung unter Verwendung des ¹²³I-Bolton-Hunter-Reagenz sind am meisten bevorzugt. Man verabreicht dem Patienten den markierten Thrombininhibitor und läßt diesen an das in einem Gerinnsel enthaltene Thrombin binden. Das Gerinnsel wird danach unter Verwendung wohlbekannter Nachweismittel kontrolliert, wie z.B. einer Kamera, die Radioaktivität nachweisen kann und mit einem Computer mit Bildverarbeitung verbunden ist. Dieses Verfahren liefert auch Bilder von Thrombin, das an Blutplättchen gebunden ist, und Meizothrombin.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch erfindungsgemäße Thrombininhibitoren enthaltende Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der Behandlung von Tumormetastasen. Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren zur Behandlung von Tumormetastasen zeigt sich in der Hemmung des Metastasenwachstums. Dies beruht darauf, daß in bestimmten Krebszellen ein Prokoagulanz-Enzym vorhanden ist. In dem kaskadenartig verlaufenden Mechanismus der Blutgerinnung aktiviert dieses Enzym die Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa, was zur Ablagerung von Fibrin führt, das seinerseits als Substrat zum Tumorwachstum dient. Indem die Fibrinablagerung durch die Hemmung von Thrombin verhindert wird, dienen die erfindungsgemäßen Moleküle als wirksame, gegen Metastasen gerichtete Tumormittel. Beispiele für Metastasen, die mit den erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren behandelt werden können, sind u.a. Gehirnkarzinome, Leberkarzinome, Lungenkarzinome, Knochenkarzinome und neoplastische Plasmazellenkarzinome, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren und Zusammensetzungen, bei denen die vorstehend beschriebenen Thrombininhibitoren zur Hemmung der Thrombin-induzierten Endothelzellen-Aktivierung eingesetzt werden. Diese Hemmung umfaßt die Repression der Synthese des Blutplättchen- Aktivierungsfaktors (PAF) durch Endothelzellen. Diese Zusammensetzungen und Verfahren besitzen wichtige Anwendungen bei der Behandlung von Krankheiten, die durch Thrombin-induzierte Entzündungen und Ödeme gekennzeichnet sind, wobei man glaubt, daß diese durch PAF vermittelt werden. Diese Krankheiten umfassen Atemnot bei Erwachsenen, septischen Schock, Septikämie und Schädigung durch erneute Durchblutung, sind aber nicht darauf beschränkt.
Frühe Stufen des septischen Schocks umfassen deutlich ausgeprägte, akute entzündliche und koagulopathische Reaktionen. Vor kurzem zeigte sich, daß die Injektion einer letalen Dosis lebender E.coli-Zellen bei Pavianen zu einem deutlichen Rückgang der Anzahl neutrophiler Zellen, des Blutdrucks und des Hämatokritwertes führt. Veränderungen im Blutdruck und des Hämatokritwertes sind teilweise auf die Entwicklung einer disseminierten intravaskulären Koagulopathie (DIC) zurückzuführen und es zeigte sich, daß diese Veränderungen parallel zum Abbau von Fibrinogen verlaufen [F. B. Taylor et al., "Protein C Prevents the Coagulopathic and Lethal Effects of Escherichia coli infusion in the Baboon", J. Clin. Invest. 79 (1987), S. 918-925]. Eine Neutropenie im Blut ist auf die schweren Entzündungsreaktionen zurückzuführen, die durch den septischen Schock verursacht werden, der zu deutlichen Erhöhungen der Tumornekrosefaktor-Menge führt. Die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren können in Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von DIC bei Septikämie und anderen Krankheiten verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Thrombininhibitoren oder Zusammensetzungen, die diese umfassen, als gerinnungshemmende Mittel für Blut, das sich außerhalb des Körpers befindet. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Blut außerhalb des Körpers" umfaßt im Kreis geführtes Blut, das dem Patienten entnommen, außerhalb des Körpers einer Behandlung unterworfen und anschließend in Verfahren wie Dialyse, Blutfiltration oder Blut-Bypass während chirurgischer Eingriffe dem Patienten zurückgegeben wird. Der Begriff umfaßt auch Blutprodukte, die zur späteren Verabreichung an den Patienten außerhalb des Körpers aufbewahrt werden, und Blut, das dem Patienten zur Verwendung bei verschiedenen Tests entnommen wird. Diese Produkte umfassen Vollblut, Plasma, oder eine beliebige Blutfraktion, bei der eine Gerinnungshemmung erwünscht ist.
Die Menge oder Konzentration eines Thrombininhibitors in diesen Zusammensetzungs-Arten basiert auf dem Volumen des zu behandelnden Blutes oder besonders bevorzugt auf seinem Thrombin-Gehalt. Die Menge eines erfindungsgemäßen Thrombininhibitors, die zur Verhinderung der Gerinnung von außerhalb des Körpers befindlichem Blut ausreicht, liegt bei etwa 1 µg/60 ml Blut außerhalb des Körpers und etwa 5 mg/60 ml Blut außerhalb des Körpers.
Die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren können auch zur Hemmung von Thrombin verwendet werden, das im Gerinnsel gebunden ist und von dem man annimmt, daß es zur Gerinnsel-Ablagerung beiträgt. Das ist besonders wichtig, da allgemein verwendete, gegen Thrombin gerichtete Mittel, wie Heparin und Heparin niederen Molekulargewichts, gegen Gerinnselgebundenes Thrombin nicht wirken.
Schließlich können die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren auch in Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten angewendet werden. Bekanntlich verursacht Thrombin eine Neuritenschrumpfung, einen Prozeß, der auf Veränderungen von Gehimzellen hindeutet, wobei deren Form abgerundet wird, und der an neurodegenerativen Krankheiten, wie der Alzheimer-Krankheit und der Parkinson-Krankheit, beteiligt ist.
Zum besseren Verständnis der im vorliegenden Text beschriebenen Erfindung dienen die folgenden Beispiele. Diese Beispiele dienen natürlich nur zur Veranschaulichung und sollen die vorliegende Erfindung in keinster Weise beschränken.

BEISPIEL 1

Synthese von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4;

Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; besitzt die Aminosäureformel: H-Gly-Asp-Phe-Glu- Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(OSO&sub3;)-Leu-OH. Dieses Peptid wurde mit Hilfe eines Festphasen-Peptidsyntheseverfahrens unter Verwendung der Applied Biosystems-Peptidsynthesevorrichtung 430 A (Applied Biosystems, Foster City, CA) hergestellt.
Insbesondere wurden 0,259 meq BOC-O-Leu-Harz (1% DVB-Harz) schrittweise mit 2 mMolen geschützten Aminosäuren umgesetzt. Nach 10 Synthesezyklen wurde das Peptid von den Schutzgruppen befreit und durch Behandlung mit was serfreiem Fluorwasserstoff (HF) : p-Cresol : Ethylmethyl-sulfat (10:1:1, Vol./Vol./Vol.) vom DVB-Harz abgekoppelt. Das Peptid wurde weiter aufgereinigt auf einer Vydac C&sub1;&sub8;-HPLC-Säule vom Umkehrphasentyp (22 mm x 25 cm), die vorher äquilibriert worden war mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser. Vor dem Auftragen auf die Säule wurde das Peptid in 2,0 ml 0,1% TFA in Wasser gelöst. Zur Erhöhung der Löslichkeit wurde der Probe gegebenenfalls zusätzlich 1 ml 6 M Guanidiniumchlorid zugegeben. Nach Auftragen der Probe wurde die Säule mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in zunehmenden Konzentrationen (0 - 80%) in 0,1% TFA 45 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 4,0 ml/min entwickelt. Der Ausfluß wurde bei 229 nm kontrolliert und Fraktionen wurden manuell gesammelt.
Das erhaltene gereinigte Peptid wurde unter Verwendung von Standardmethoden [T. Nakahara et al., "Preparation of Tyrosine- -[³&sup5;S] Sulfated Cholecystoklnin Octapeptide From A Non-Sulfated Precursor Peptide", Anal. Biochem. 154 (1986), S. 194-199] an dem einzigen Tyrosin-Rest sulfatiert. Sulfo- Tyr&sub6;&sub3;hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; wurde dann durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub1;&sub8;-Säule (4,6 x 25 cm) und eines Applied Biosystems-Flüssig- Chromatographiesystems von den anderen Peptiden und Reaktionsbestandteilen abgetrennt und aufgereinigt. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittel aus 0,1% TFA/Wasser äquilibriert und mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in zunehmenden Konzentrationen von 0% bis 35% in einem 0,085% TFA enthaltenden Lösungsmittel 90 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,8 ml/Min. entwickelt. Die Extinktion der Fraktionen wurde bei 214 nm bestimmt.

BEISPIEL 2

Vernetzung von menschlichem Thrombin mit Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- dinitrofluorbenzyl-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4;

Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-dinitrofluorbenzyl-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; (Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4;) wurde durch eine 18-stündige Reaktion von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; (2,0 mg; wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt) mit einer stöchiometrischen Menge von Difluordinitrobenzol (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) in Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur hergestellt. Zur Bestimmung des Umfangs der Derivatbildung wurde die Probe danach unter Verwendung eines Applied Biosystems-150-A-Flüssig-Chromatographiesystems und einer Brownlee-RP-300-C&sub8;-Säule (0,46 x 10 cm) einer analytischen HPLC- Auftrennung unterworfen. Die Säule wurde äquilibriert mit 0,1% TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 45 Minuten mit einem linearen Gradienten von 0,085% TFA/70% Acetonitril (Lösungsmittel B) in Konzentrationen von 0% - 50% sowie 15 Minuten mit einem linearen Gradienten von Lösungsmittel B in Konzentrationen von 50% - 100% entwickelt. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug gleichbleibend 1,0 ml/Minute.
Die Extinktion des Ausflusses wurde bei 214 nm und 310 nm bestimmt. Die Extinktion des Peptids, das durch das Reagenz Difluordinitrobenzol in ein Derivat überführt worden war, lag bei 310 nm. Sulio-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; wurde in der vorstehend beschriebenen Reaktion in einer Ausbeute von 15% - 30% erhalten. Nach der Synthese wurde Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; im gleichen Dimethylformamid-Lösungsmittel bei -20ºC bis zu einem Monat aufbewahrt.
Ein 10facher molarer Überschuß an Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; wurde mit menschlichem α-Thrombin (12,5 mg) 18 Stunden bei Raumtemperatur in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung umgesetzt. Der Umfang der Vernetzung wurde durch Analyse des Reaktionsgemisches auf einem SDS-Polyacrylamidgel bestimmt. Die SDS-PAGE zeigte eine Abnahme der relativen Mobilität der α- Thrombin-Bande, die eine Zunahme des Molekulargewichts um 1000 - 2000 Dalton (Da) widerspiegelte. Diese Änderung entspricht einer Quervernetzung von Thrombin mit Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; an einer einzigen Stelle.
Unter Verwendung von [³&sup5;5]-Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; wurde bestätigt, daß die Bildung eines kovalenten Komplexes von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB- hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; und menschlichem α-Thrombin spezifisch ist. [³&sup5;S] -Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; wurde im wesentlichen wie vorstehend beschrieben hergestellt, wobei allerdings im Sulfatierungsverfahren nach Nakahara statt H&sub2;SO&sub4; H&sub2;[³&sup5;SO&sub4;] verwendet wurde [vgl. auch die gleichfalls anhängigen US- Patentanmeldungen 164,178, 251,150, 280,618 und 314,756 sowie J. M. Maraganore et al., "Anticoagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides", J. Biol. Chem. 264 (1989), S. 8692-8698, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichungen durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist].
[³&sup5;S]-Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; wurde mit menschlichem α-Thrombin entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit eines 5fachen bzw. 20fachen molaren Überschusses (im Vergleich zur Thrombin-Konzentration) an Sulfo- Tyr&sub6;&sub3;- -acetyl-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; (wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wobei im letzten Schritt der Peptidsynthese -Acetylasparagin angelagert wurde) umgesetzt. Nach 18-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Gemisch einer SDS-PAGE und Autoradiographie unterworfen. Die Ergebnisse (Figur 1) zeigen, daß das [³&sup5;S]-markierte Peptid in der Thrombin entsprechenden Bande enthalten war und daß die Gegenwart von kaltem, nichtmarkiertem Hirudinpeptid das Ausmaß der Bildung des kovalenten Komplexes bis auf < 10% abschwächt. Die Reaktion von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB- hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; mit Thrombin führt daher zur Bindung des Hirudinpeptids an eine spezifische Bindungsstelle in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1.
Zur Bestimmung der Bindungsstelle von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; in Thrombin wurde ein Thrombin/Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-dinitrobenzyl (DNB)-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4;-Komplex (1,0 mg) auf eine Sephadex-G-50-Säule (1,5 x 45 cm) aufgetragen, die mit 7 M Harnstoff und 20 mM Tris, pH-Wert 7,5, äquilibriert und entwickelt wurde. Durch Chromatographie wurde das nicht umgesetzte Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNB- hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; entfernt. Zwischenraumvolumen-Fraktionen, die einen Peak aufwiesen und damit den Thrombin/Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4;-Komplex enthielten, wurden gesammelt und vereinigt. Der isolierte Komplex wurde durch Zugabe von 10 µl β-Mercaptoethanol reduziert.
Nach Reduktion wurde der Komplex wie bereits beschrieben [J. M. Maraganore et al., "A New Class of Phospholipases A&sub2; with Lysine in Place of Aspartate-49", J. Biol. Chem. 259 (1984), S. 13839-13843] unter Verwendung von Jodessigsäure -carboxymethyliert. Das reduzierte, S-alkylierte Protein wurde danach bei Raumtemperatur ausgiebig gegen 3%-ige Essigsäure dialysiert. Nach Dialyse wurde der Komplex mit Pepsin (2% Gew./Vol.) 4 Stunden bei 37ºC gespalten. Die durch Pepsinspaltung erhaltenen Fragmente des reduzierten - carboxymethylierten Thrombin/Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4;-Komplexes wurden mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Aquapore-RP- 300-C&sub8;-Säule (0,46 x 10 cm) gereinigt. Die Säule wurde mit 0,1% TFA in Wasser äqulibriert und mit einem Gradienten von 0,085% TFA/70% Acetonitril in zunehmenden Konzentrationen (0% - 60%) 80 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. entwickelt. Die Extinktion des Ausflusses wurde sowohl bei 214 nm als auch 310 nm bestimmt. Fraktionen von 1 ml wurden automatisch gesammelt. Durch eine Trennung der peptidischen Fragmente mittels HPLC wurde ein einzelner großer Peak erhalten, der Material enthielt, das sowohl bei 214 nm als auch 310 nm absorbierte. Aufgrund seiner Extinktion im fernen UV-Bereich enthielt dieses Fragment das gebundene Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4;.
Das Fragment wurde danach einem automatisierten Edman-Abbau auf einer Applied Biosystems-470A-Gasphasen-Sequenziervorrichtung, die mit einem 900A-Datenverarbeitungssystem ausgestattet war, unterworfen. Phenylthiohydantoin (PTH) -Aminosäuren wurden unter Verwendung einer Applied Biosystems-120A-PTH-Analysevorrichtung und einer PTH-C&sub1;&sub8;-Säule (2,1 x 220 mm) rechnergestützt analysiert. Nachstehend ist eine Tabelle mit wiederholten Ergebnissen der Sequenzanalyse gezeigt: Zyklus Aminosäure pMole
Es zeigte sich, daß die Peptidsequenz den Resten 144-154 von menschlichem a Thrombin entsprach [J. W. Fenton II, "Thrombin Active Site Regions", Semin. Thromb. Hemostasis 12 (1986), S. 200-208]. Die Pepsinspaltungen erfolgten an einer Leu-Lys- und einer Val-Leu-Bindung, was mit der Spezifität dieses Enzyms übereinstimmte.
Im Verlauf der Sequenzanalyse konnte die Lys-149 entsprechende Aminosäure (Zyklus 10) weder identifiziert noch quantitativ bestimmt werden. Wahrscheinlich ist das auf die Derivatbildung der &epsi;-NH&sub2;-Gruppe dieser Aminosäure mit der Dinitrofluorbenzyl-Einheit von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-DNFB- hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; zurückzuführen. Lys-149 ist daher die Hauptstelle, an der Sulfo- Tyr&sub6;&sub3;-DNFB-hirudin&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub4; mit α-Thrombin reagiert.

BEISPIEL 3

Konstruktion eines Thrombininhibitors. der die katalytische Stelle blockieren und an die außenliegende Anionenbindungsstelle binden kann

Carboxyl-terminale Hirudinpeptide blockieren wirksam die Thrombin- katalysierte Fibrinogen-Hydrolyse, jedoch nicht die Hydrolyse chromogener Substrate [J. M. Maraganore et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), S. 8692-8698]. Außerdem neutralisieren Hirudinpeptide nicht die Thrombin-katalysierte Aktivierung der Faktoren V und VIII [J. W. Fenton II et al., "Hirudin Inhibition by Thrombin", Angio. Archiv. Biol. 18 (1989), S.27].
Hirudinpeptide, wie Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-N-acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; zeigen in vitro gegenüber der Thrombin-induzierten Blutplättchen-Aktivierung starke Hemmwirkungen [J. A. Jakubowsky und J. M. Maraganore, "Inhibition of Thrombin-Induced Platelet Activities By A Synthetic 12 Amino Acid Residue Sulfated Peptide (Hirugen)", Blood (1989), S. 1213]. Falls die Aktivierung der Faktoren V und VIII Schritte sind, die die Reaktionsgeschwindigkeit beschränken, wird zur Hemmung der Blutplättchen-Thrombose in vivo möglicherweise dennoch ein Thrombininhibitor benötigt, der die aktive Stelle blockieren kann. Diese Schlußfolgerung ergibt sich aus Ergebnissen, die mit dem irreversiblen Thrombininhibitor ( -Phe)-Pro-Arg-CH&sub2;CL [S. R. Hanson und L. A. Harker, "Interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin -Phenylalanyl- -prolyl- -Arginyl Chloromethyl Ketone", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), S. 3184-3188] und anderen reversiblen Thrombininhibitoren [J. F. Eidt et al., "Thrombin is an Important Mediator of Platelet Aggregation in Stenosed Canine Coronary Arteries with Endothelial Injury", J. Clin. Invest. 84 (1989), S. 18-27] erzielt wurden.
Zur Schaffung eines Mittels, das 1) an die außenliegende Anionenbindungsstelle eines Thrombin-Moleküls bindet und 2) die die aktive Stelle enthaltende Tasche des gleichen Thrombin-Moleküls blockieren und die Funktion der darin enthaltenen katalytischen Reste hemmen kann, wurde ein dreidimensionales Thrombin-Modell (Figur 2) angewandt [B. Furie et al., "Computer-Generated Models of Blood Coagulation Factor Xa, Factor IXa, und Thrombin Based Upon Structural Homology with Other Serine Proteases", J. Biol. Chem. 257 (1982), S 3875-3882], wobei die vorstehend erwähnte Erkenntnis genutzt wurde, daß der NH&sub2;-Terminus von Hirudinpeptiden proximal zu Lys-149 liegt.
Es wurde bestimmt, daß der kleinste Abstand zwischen der &epsi;-NH&sub2;-Gruppe von Lys-149 und dem β-Hydroxylat von Ser-195 18 Å - 20 Å beträgt. Auf der Basis einer Länge von 3 Å/Aminosäurerest wurde berechnet, daß mindestens 4 - 7 Aminosäuren erforderlich sind, um ein Hirudinpeptid, wie Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4;, mit einer Domäne zu verbinden, die die Struktur eines Inhibitors der aktiven Stelle umfaßt. Der Linker wurde so entworfen, daß er aus Glycin besteht. Glycin wurde gewählt, damit bei diesen Voruntersuchungen die größte Flexibilität für einen Linker erreicht wird. Andere Biopolymerlinker, die weniger flexibel sind, können natürlich auch eingesetzt werden.
Als Inhibitor der aktiven Stelle wurde die Sequenz ( -Phe)-Pro-Arg-Pro ausgewählt, da Thrombin bei der Substratspaltung für den Arg-Rest als P&sub1;- Aminosäure spezifisch ist. Ein Pro-Rest, der sich dem Arg-Rest anschließt, ergibt eine Bindung, die durch Thrombin sehr langsam gespalten wird. Andere Peptide wurden durch den Austausch des Pro-Restes (im Anschluß an die P&sub1;- Aminosäure Arg) gegen die Aminosäuren Sarcosyl- oder -Methyl-Alanin bzw. durch chemische Reduktion einer leicht spaltbaren Arg-Gly-Bindung konstruiert.

BEISPIEL 4

Synthese von Hirulog 8

Hirulog 8 besitzt die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-8 wurde mittels eines üblichen Peptidsyntheseverfahrens an Festphasen unter Verwendung einer Applied Biosystems-430 A-Peptidsynthesevorrichtung synthetisiert. Das Peptid wurde unter Verwendung von BOC- -leucin- -divinylbenzol-Harz synthetisiert. Zusätzlich verwendete t-BOC-Aminosäuren (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) umfaßten BOC- -2,6-dichlorbenzyl-tyrosin, BOC- - glutaminsäure (γ-Benzylester), BOC- -prolin, BOC- -isoleucin, BOC- - phenylalanin, BOC- -asparaginsäure (β-Benzylester), BOC-glycin, BOC- - asparagin, BOC- -phenylalanin und BOC- -arginin. Zur Erzielung hoher Syntheseausbeuten wurde das (Gly)&sub4;-Linkersegment in zwei Zyklen durch manuelle Anlagerung von BOC-glycylglycin (Beckman Biosciences, Inc., Philadelphia, PA) angefügt. Nach Beendigung der Synthese wurde das Peptid vollständig von Schutzgruppen befreit und durch Behandlung mit wasserfreiem HF : -Cresol : Ethylmethylsulfat (10:1:1, Vol./Vol./Vol.) vom Divinylbenzol-Harz abgekoppelt. Nach Entfernung vom Harz wurde das Peptid zur Trockne lyophillisiert.
Roh-Hirulog-8 wurde mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Applied Biosystems-151A-Flüssig-Chromatographiesystems und einer Vydag-C&sub1;&sub8;-Säule (2,2 x 25 cm) aufgereinigt. Die Säule war mit 0,1% TFA/Wasser äquilibriert worden und wurde mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in zunehmenden Konzentrationen von 0% bis 80% in 0,1% TFA 45 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 4,0 ml/Min. entwickelt. Die Extinktion des Ausflusses wurde bei 229 nm bestimmt. Fraktionen wurden manuell gesammelt. 25 mg - 30 mg Roh-Hirulog-8 wurden mittels HPLC aufgereinigt, wobei 15 mg - 20 mg reines Peptid gewonnen wurden.
Die Struktur von gereinigtem Hirulog-8 wurde durch Analyse der Aminosäuren und der Sequenz bestätigt. Aminosäurehydrolysate wurden durch eine 24-stündige Behandlung des Peptids mit 6 N HCL im Vakuum bei 110ºC hergestellt. Dann wurden die Hydrolysate mittels Ionenaustausch- Chromatographie und anschließender Derivatbildung mit Ninhydrin sowie dessen Nachweis unter Verwendung eines automatischen Beckman-6300- Analysegerätes untersucht. Die Sequenzanalyse wurde durch automatischen Edman-Abbau auf einer Applied Biosystems-470A-Gasphasen- Sequenziervorrichtung, die mit einem Datenverarbeitungssystem Modell 900A ausgestattet war, durchgeführt. Phenylthiohydantoin (PTH)-Aminosäuren wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems-120A-PTH-Analysegerätes und einer PTH-C&sub1;&sub8;-Säule (2,1 x 220 mm) rechhergestützt untersucht.

BEISPIEL 5

Synthese von Hirulog-9

Hirulog-9 besitzt die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg- -Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Peptid wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 beschrieben synthetisiert, wobei allerdings im Zyklus 15 BOC- D-prolin (Peninsula Laboratories) anstelle von BOC- -prolin verwendet wurde. Reinigung und Charakterisierung des Peptids wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 6

Synthese von Hirulog-10

Hirulog-10 besitzt die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-Sar-(Gly)&sub5;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Peptid wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wobei im Zyklus 16 BOC-sarcosin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) verwendet wurde. Reinigung und Charakterisierung des Peptids wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 7

Synthese von Hirulog-11

Hirulog-11 besitzt die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-(3,5-dijodTyr)-Leu-OH. Das Peptid wurde wie in Beispiel 4 synthetisiert, wobei in Zyklus 2 BOC-3,5-dijod- -Tyrosin (Sigma) verwendet wurde. Reinigung und Charakterisierung des Peptids wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 8

Synthese von Hirulog-12

Hirulog-12 besitzt die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(OSO&sub3;)-Leu-OH. Die Synthese des Peptids erfolgte durch eine 10-minütige Reaktion von 1,0 mg Hirulog-8 in Dimethylformamid (80 µl) mit einer Dicyclohexylcarbodiimid-Lösung (1,25 g/ml, 0,007 ml) und konzentrierter Schwefelsäure (0,5 µl) bei 0ºC. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasser (1,0 ml) beendet.
Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Applied-Biosystems-150A-Flüssig-Chromatographiesystems und einer Aquapore-RP-300-C&sub8;-Säule (0,46 x 10 cm) unterworfen. Die Säule wurde mit Lösungsmittel A (0,1% TFA/Wasser) äquilibriert und mit Lösungsmittel B (0,085% TFA/70% Acetonitril) in zunehmenden Konzentrationen von 0% bis 50% 45 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. entwickelt. Die Extinktion des Ausflusses wurde bei 214 nm bestimmt.
Gereinigtes Hirulog-12 wurde dann durch Zugabe von 0,1 N NaOH auf einen neutralen pH-Wert von 7 eingestellt. Danach wurde es lyophilisiert und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zubereitet.

BEISPIEL 9

Hemmung der Thrombin-katalysierten Hydrolyse eines synthetischen p-Nitroanilid-Substrates durch Hirulog-8

Danach wurden die Wirkungen von Hirulog-8 auf die von menschlichem α- Thrombin katalysierte Hydrolyse von Spectrozym TH (Tosyl-Gly-Pro-Arg-p- nitroanilid; American Diagnostica, New York, NY) untersucht. Die Anfangs- Reaktionsgeschwindigkeiten wurden insbesondere bei Substratkonzentrationen von 2,2 µM bis 22 µM in Gegenwart oder Abwesenheit von Hirulog-8 bestimmt. Die Thrombin-katalysierte Reaktionsgeschwindigkeit wurde in einem Cary 19-Spektrophotometer bei 405 nm beobachtet und als Funktion der Zeit kontinuierlich aufgezeichnet. Untersuchungen zur Kinetik wurden bei Raumtemperatur (25 ± 1ºC) in einem Puffer aus 0,05 M Tris, pH- Wert 7,5, und 0,1 M NaCl durchgeführt.
Zur Durchführung einer typischen Enzymreaktion wurden sowohl der Probenküvette als auch der Küvette mit dem Referenzmittel 1,0 ml Puffer zugegeben. Vor Zugabe von Spectrozym TH (2,2 µM - 22 µM) wurden Thrombin (Endkonzentration 3,2 x 10&supmin;&sup9; M) und Hirulog-8 (0 M - 4 x 10&supmin;&sup8; M) in die Probenküvette gegeben. Unmittelbar nach Zugabe des Substrats wurden die in der Probenküvette enthaltenen Stoffe unter Verwendung einer Plastikpippette gemischt. Die Reaktion wurde 5 - 15 Minuten spektrophotometrisch beobachtet.
Für jede Substratkonzentration wurden die Anfangs- Reaktionsgeschwindigkeiten als hydrolysierte Mole Spektrozym-TH/sek/Mol Thrombin angegeben. Die Bestimmung erfolgte während der linearen Anfangsphase der Reaktion (≤ 15% vollständige Hydrolyse des Substrats) durch Ermittlung des Kurvenverlaufs der Hydrolyse-Reaktion. Dementsprechend wurden graphische Lineweaver-Burke-Auswertungen erstellt, indem der umgekehrte Wert der Anfangs-Reaktionsgeschwindigkeit gegen den umgekehrten Wert der Substratkonzentration aufgetragen wurde. Die Ergebnisse zeigten, daß die von menschlichem α-Thrombin katalysierte Hydrolyse von Spectrozym TH einen Vmax-Wert = 17 hydrolysierte Mole/sek/Mol Thrombin und eine KM-Konstante bei 1,19 x 10&supmin;&sup6; M aufwies. Die Bilder A und B in Figur 3 zeigen, daß zunehmende Konzentrationen von Hirulog-8 zu signifikanten, dosisabhängigen Erhöhungen der KM-Werte führen, wobei die Vmax-Werte für die Spektrozym-TH-Hydrolyse leicht ansteigen. Die Hemmung der Thrombin-katalysierten Reaktion durch Hirulog-8 wurde deshalb mit einem Gemisch aus Bestandteilen durchgeführt, die sich in bezug auf die Spektrozym-TH-Hydrolyse kompetitiv oder nichtkompetitiv verhalten. Die Ki-Konstante von Hirulog-8 für α-Thrombin wurde unter Verwendung der Gleichung:
bestimmt, wobei
den Kurvenverlauf der Thrombin-katalysierten Reaktion in Gegenwart von Hirulog-8 bedeutet, [Hirulog-8] die molare
Konzentration des Peptids ist,
den Verlauf der Thrombin katalysierten Reaktion in Abwesenheit des Inhibitors bedeutet, und Ki die molare Hemmkonstante für Hirulog-8 bei menschlichem α-Thrombin ist. Es wurde berechnet, daß die Ki-Konstante für Hirulog-8 1,95 ± 0,11 x 10&supmin;&sup9; M beträgt.

BEISPIEL 10

Spezifität von Hirulog-8 für die Hirudinpeptid-Bindungsstelle und die aktive Stelle von menschlichem α-Thrombin

Hirulog-8 wurde als Analog konstruiert, das über seine Hirudinpeptid- Bindungsstelle an das menschliche α-Thrombinmolekül bindet, während es die katalytische Stelle desselben Thrombinmoleküls blockiert. Durch verschiedene, nachstehend beschriebene Untersuchungen wurde die Fähigkeit von Hirulog-8 zur Ausübung dieser Funktionen getestet.
Die Kinetik der Hemmung von menschlichem γ-Thrombin durch Hirulog-8 wurde im wesentlichen wie vorstehend in Beispiel 9 für α-Thrombin beschrieben untersucht. Die γ-Thrombin-katalysierte Reaktion gegenüber Spectrozym TH zeigte einen Vmax-Wert = 7,14 hydrolysierte Mole/sek/Mol Thrombin und eine KM-Konstante = 1,1 x 10&supmin;&sup6; M. Diese Ergebnisse bestätigen, daß γ-Thrombin, eine proteolytische Thrombinform, fast alle katalytischen Fähigkeiten besitzt, obwohl dieser Form im wesentlichen die Gerinnungsaktivität fehlt [S. D. Lewis et al., "Catalytic Competence of Human α- and γ-Thrombins in the Activation of Fibrinogen and Factor XIII", Biochemistry 26 (1987), S. 7597-76031. Die Hemmung von γ-Thrombin durch Hirulog-8 wurde bei Peptidkonzentrationen im Bereich von 2,7 x 10&supmin;&sup8; M bis 6,8 x 10&supmin;&sup6; M untersucht. Wie nachstehend gezeigt, wies Hirulog-8 eine im Vergleich zur Ki- Konstante bei α-Thrombin um 3 Größenordnungen erhöhte Ki-Konstante auf. Die hohe Ki-Konstante gegenüber γ-Thrombin ist auf das Fehlen einer intakten außenliegenden Anionenbindungsstelle (ABE) bei γ-Thrombin zurückzuführen [J. W. Fenton II et al., "Anion-Binding Exosite of Human α-Thrombin and Fibrin(ogen) Recognition", Biochemistry 27 (1988), S.7106-7112]. γ-Thrombin wird durch Proteolyse der B-Kette von α-Thrombin an den Resten Lys- 149 und Arg-78 gebildet.
Die Hemmung von menschlichem α-Thrombin durch Hirulog-8 wurde in Gegenwart von Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- -acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; in Konzentrationen von 2,6 x 10&supmin;&sup6; M bis 1,29 x 10&supmin;&sup5; M signifikant verringert. Das ist darauf zurückzuführen, daß Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- -acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; mit Hirulog-8 um die Bindung an den ABE-Bereich von Thrombin konkurriert.
Das wurde auch durch Zugabe von Phenylmethylsulfonyl-α-thrombin ("PMS-α-thrombin", Endkonzentration 18 nM) zu Reaktionsgemischen von Hirulog-8 und menschlichem α-Thrombin gezeigt. Die Zugabe dieses modifizierten Thrombins führte zu einer wesentlichen Verringerung der Fähigkeit von Hirulog-8 zur Hemmung von α-Thrombin. PMS-α-thrombin besitzt einen intakten ABE-Bereich, ist jedoch an seiner aktiven Stelle kovalent derivatisiert. Das modifizierte Thrombin bindet das im Reaktionsgemisch enthaltene Hirulog-8 und verringert daher die Peptidmenge, die zur Hemmung von intaktem, katalytisch aktivem α-Thrombin verfügbar ist.
Wie vorstehend in Beispiel 9 beschrieben, wurden auch Untersuchungen zur Wirkung von Salzkonzentrationen auf die Ki-Konstante von Hirulog-8 für Thrombin durchgeführt. Die Ki-Konstante wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von Hirulog-8 (11,5 x 10&supmin;&sup9; M) in Puffersystemen bestimmt, die 0,1 M, 0,25 M oder 0,5 M NaCl enthielten. Wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt, erhöhte sich die Hemmung von α-Thrombin durch Hirulog-8 bei niedrigeren Salzkonzentrationen. Dieses Ergebnis bestätigte, daß für die Hemmung der Thrombin-katalysierten Spectrozym-TH-Hydrolyse durch Hirulog-8 eine Wechselwirkung zwischen der stark anionischen Hirudinpeptid-Einheit von Hirulog-8 und der positiv geladenen Stelle, die Lys- 149 in Thrombin umgibt, unbedingt erforderlich ist. Enzym Bedingungen Hirulog-8, Ki, nM Menschliches α-Thrombin Menschliches γ-Thrombin Puffer

BEISPIEL 11

Gerinnungshemmende Aktivität von Hirulog-8: Vergleich mit Hirudin und Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;-N-acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4;

Die gerinnungshemmende Aktivität von Hirulog-8 wurde unter Verwendung von vereinigtem, normalem menschlichem Plasma (George King Biomedical, Overland Park, KA) und einem Coag-A-Mate-XC-Gerät (General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK) untersucht. Die Aktivität wurde mit Hilfe eines Testes zur Ermittlung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) unter Verwendung von CaCl&sub2; und Phospholipid- Lösungen bestimmt, die vom Hersteller erhalten worden waren. Zur Bestimmung wurden Hirulog-8, Hirudin oder Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- -acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; in einem Gesamtvolumen von jeweils 25 µl bis zu Endkonzentrationen von 10 ng/ml bis 32 300 ng/ml in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben. Danach erfolgte die Zugabe von 100 µl Plasma.
Der APTT-Kontrollwert (Abwesenheit eines Inhibitors) betrug 29,6 Sekunden (Durchschnittswert, n = 8, SEM < 0,5%). Figur 4 zeigt die Ergebnisse dieser Dosisabhängigkeits-Untersuchungen. Hirulog-8 war 2- bis 3-mal wirksamer als Hirudin und 100- bis 150-mal wirksamer als Sulfo-Tyr63-N- acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4;. Sowohl Hirulog-8 als auch Hirudin erhöhten die APTT von Plasma auf so hohe Werte, daß sie nicht gemessen werden konnten. Das steht im Gegensatz zu Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- -acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4;, das ATPP-Werte zeigte, die in der Dosis-Wirkungs-Kurve eine Sättigung bei 200% - 250% der Kontroliwerte erreichten [J. M. Maraganore et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), S. 8692-8698]. Das Ergebnis zeigte, daß Hirulog-8 sowohl im Plasma als auch bei in vitro-Tests in chromogenen Nachweisverfahren die aktive Stelle von Thrombin in ähnlicher Weise wie Hirudin blockieren kann.

BEISPIEL 12

Hemmung der Thrombin-induzierten Blutplättchen-Aktivierung durch Hirulog-8

Untersuchungen zur Thrombin-induzierten Blutplättchen-Aktivierung wurden bei 37ºC unter Verwendung eines Biodata-PAP&sub4;-Gerätes zur Bestimmung der Blutplättchenaggregation durchgeführt. Plasma mit angereicherten Blutplättchen (PRP) wurde aus normalen, gesunden Spendern gewonnen, die mindestens eine Woche vor der Untersuchung keine Medikamente mit Blutplättchen-verändernden Eigenschaften eingenommen hatten. PRP wurde wie von J. A. Jakubowski et al. in "Modification of Human Platelet by a Diet Enriched in Saturated or Polyunsaturated Fat", Atherosclerosis 31(1978), S. 335-344, beschrieben hergestellt. 0,4 ml vorgewärmtem (37ºC) PRP wurde Hirulog-8 in unterschiedlichen Konzentrationen (0 ng/ml - 500 ng/ml in 50 µl Wasser) zugegeben. Eine Minute später wurde der Blutplättchen- Suspension menschliches α-Thrombin bis zu Endkonzentrationen von 0,2 , 0,25 oder 0,5 Einheiten/ml Gesamttest-Volumen zugesetzt.
Die Aggregation wurde als Zunahme der Lichtdurchlässigkeit über einen Zeitraum von 5 Minuten nach Thrombin-Zugabe bestimmt. Die prozentuale Hemmung wurde als (% Aggregationprobe)/(% AggregationKontrolle) x 100 berechnet. Die Untersuchung zeigte, daß Hirulog-8 die Thrombin-induzierte Blutplättchen-Aktivierung in vitro blockierte.

BEISPIEL 13

Verwendung von Hirulog-8 zur bildlichen Darstellung eines Thrombus

Hirulog-8 wurde durch kovalente Verknüpfung einer ¹²³I-enthaltenden chemischen Gruppe modifiziert. Insbesondere wurde Hirulog-8 (wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt) mit ¹²³I-Bolton-Hunter-Reagenz (New England Nudear, Boston, Massachusetts) in 0,1 M Natriumborat, pH-Wert 9,0, umgesetzt. Das ¹²³I-markierte Molekül (spezifische Aktivität > 5 µCi/µg) wurde dann auf einer mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung äquilibrierten Biogel-P2-Säule entsalzt.
Die bildliche Darstellung experimentell erzeugter Thromben ex vivo wurde im wesentlichen wie von T. M. Palabrica et al. in "Thrombus Imaging in a Primate Model with Antibodies Specific for an External Membrane Protein of Activated Platelets", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), S. 1036-1040, beschrieben durchgeführt. Die bildliche Darstellung wurde insbesondere in Pavianen unter Verwendung eines externen Ticoflex-Prothesenshunts zwischen Femoralartene und Femoralvene durchgeführt. Durch Einsetzen eines Dacron-Transplantat-Segments, in dem zuvor eine Gerinnung hervorgerufen worden war, in den Shunt wurde ein Thrombus experimentell erzeugt. ¹²³I-markierter Thrombininhibitor wurde in den Venenteil des Ticoflex-Shunts injiziert. Unter Verwendung einer Ohio-Nuclear-Series-100- Gamma-Kamera mit einem angeschlossenen PDP-11/34-Computer wurden dann Serien von Vorderansichten über eine Zeitspanne von 0,5 bis 1 Stunde gewonnen. Aus den so erhaltenen bildlichen Radionuclid-Darstellungen wurde die Kinetik der ¹²³I-Thrombin-Aufnahme durch das Transplantat und den Blutpool abgeleitet.
Dasselbe Verfahren kann verwendet werden, um bildliche ex vivo- Darstellungen einer durch Stauung in der Femoralvene von Pavianen verursachten tiefen Venenthrombose zu gewinnen. Da ¹²³I-Hirulog-8 mit hoher Spezifität an Thrombin bindet, ermöglicht die Verwendung dieses Moleküls präzise bildliche Thrombus-Darstellungen ex vivo. Die im Gegensatz zu nativem Hirudin oder Thrombin-Antikörpern geringe Größe von Hirulog-8 bietet die Möglichkeit, daß der radioaktiv markierte Thrombininhibitor sowohl von Blutplättchen-gebundenem Thrombin und Meizothrombin als auch von im Fibringerinnsel enthaltenem Thrombin bildliche Darstellungen liefert.

BEISPIEL 14

Gegen Metastasen gerichtete Aktivität von Thrombininhibitoren

Die gegen Metastasen gerichtete Aktivität der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren, vorzugsweise von Hirulog-8, wurde unter Verwendung von T241-Sarkomzellen [L A. Liotta et al., Nature 284 (1980), S. 67-68] und syngenen C57BL/6-Mäusen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) untersucht. Den Mäusen wurde Hirulog-8, das wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt worden war, in einer Menge von 0 g/kg - 250g/kg entweder intravenös oder subcutan injiziert. Anschließend erfolgte eine Injektion von 10&sup4; - 10&sup6; T241- Tumorz eilen. Nach 15 Tagen wurden die Tiere getötet und Lungentumor- Kolonien wurden quantitativ ausgewertet. Die gegen Metastasen gerichtete Aktivität von Hirulog-8 wurde als prozentuale Verminderung der Tumorkolonien im Vergleich zu mit einem Placebo behandelten Kontroll- Mäusen bestimmt. Hirulog-8 zeigte in diesem Test eine gegen Metastasen gerichtete Aktivität.

BEISPIEL 15

Hemmung von Endothelzellen durch einen Thrombininhibitor

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren zur Verhinderung der Thrombin-induzierten Synthese des Blutplättchen Aktivierungsfaktors (PAF) wurde unter Verwendung gezüchteter menschlicher Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) untersucht. HUVEC-Zellen wurden nach etablierten Verfahren [M. A. Gimborne, Jr., "Culture of Vascular Endothehum", Prog. Hemost. Thromb. 3 (1976), S. 1-28] aus menschlichen Nabeischnüren durch Kollagenase-Spaltung gewonnen. HUVEC-Zellen wurden in einer Mikrotiterpiatte mit 96 Vertiefungen in Gegenwart von [³H]-Acetat soweit gezüchtet, bis sie zusammengewachsen waren (Konfluenz). Auf diese Weise gezüchtete Zellen produzieren [³H]-Acetyl-PAF, das durch Extraktion von HUVEC-Membran-Phospholipiden quantitativ bestimmt werden kann.
Den [³H]-Acetat-enthaltenden HUVEC-Zellen wurde 1 Minute vor Zugabe von Thrombin (Endkonzentration 1 E/ml) Hirulog-8 (0 µg/ml - 1 µg/ml) zugegeben. Die Zellen wurden 5 Minuten inkubiert und dann wurde der Überstand entfernt. Den HUVEC-Zellen wurde Medium zugegeben, das 0,1% Gelatine und 50 mM Essigsäure in Methanol (2:1, Vol./Vol.) enthielt. Dann wurde der PAF-Faktor extrahiert und unter Verwendung üblicher Verfahren [T. M. Mclntyre et al., "Cultured Endothelial Cells Synthesize Both Platelet- Activating Factor and Prostacyclin in Response to Histamine, Bradykinin and Adenosine Triphosphate", J. Clin. Invest. 76 (1985), S. 271-280] quantitativ bestimmt. Danach wurden die IC&sub5;&sub0;-Werte berechnet. Hirulog-8 hemmte bei diesem Test die PAF-Synthese in HUVEC-Zellen.
Die Wirkung von Hirulog-8 auf die thrombin-induzierte Adhäsion polymorphkerniger Leukozyten (PMN) an HUVEC-Zellen konnte wie folgt gezeigt werden. HUVEC-Zellen wurden bis zur Konfluenz in 1% foetales Kälberserum enthaltendem MEM-Medium auf Platten mit 24 gruppenweise angeordneten Vertiefungen gezüchtet. Danach wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden zweimal mit frischem serumfreiem Medium gewaschen und zur Entfernung von Serumprodukten im gleichen Medium 10 - 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Bei 37ºC voräquilibrierte polymorphkernige Leukozyten (2,5 x 10&sup6; in 1 ml) wurden dann in jede Vertiefung gegeben. Die polymorphkernigen Leukozyten wurden 2 Minuten auf der einzelligen HUVEC-Schicht belassen. In jede Vertiefung wurde Hirulog-8 (5 µg/ml) oder physiologische Kochsalzlösung und unmittelbar danach α-Thrombin (0,1 E/ml oder 1 E/ml) gegeben. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, zweimal gewaschen und danach mittels Phasenkontrast-Mikroskopie untersucht. Anhaftende polymorphkernige Leukozyten wurden direkt gezählt. Proben, die mit Hirulog- 8 inkubiert worden waren, besaßen signifikant weniger anhaftende polymorphkernige Leukozyten als mit Kochsalzlösung behandelte Proben.

BEISPIEL 16

Synthese von Hirulog-13

Hirulog-13 hat die Formel: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub2;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Peptid wurde im wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben synthetisiert, aufgereinigt und charakterisiert, wobei zur Herstellung des Diglycin-Teilstücks allerdings nur ein BOC- glycylglycin-Anlagerungszyklus durchgeführt wurde.

BEISPIEL 17

Synthese von Hirulog-14

Hirulog-14 hat die Formel: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub5;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-14 wurde unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren synthetisiert, aufgereinigt und charakterisiert, wobei zur Herstellung des Pentaglycin-Teilstücks ein BOC- glycin-Anlagerungszyklus nach zwei BOC-glycylglycin-Anlagerungszyklen durchgeführt wurde.

BEISPIEL 18

Synthese von Hirulog-15

Hirulog-15 hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub6;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-1 5 wurde unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren synthetisiert, aufgereinigt und charakterisiert, wobei zur Herstellung des Hexaglycin-Teilstücks drei BOC- glycylglycin-Anlagerungszyklen durchgeführt wurden.

BEISPIEL 19

Synthese von Hirulog-16

Hirulog-16 hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub8;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-16 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben synthetisiert, aufgereinigt und charakterisiert, wobei zur Herstellung des Octaglycin-Teilstücks vier BOC-glycylglycin- Anlagerungszyklen durchgeführt wurden.

BEISPIEL 20

Synthese von Hirulog-17

Hirulog-17 hat die Formel: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Glu-Gly-His- Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-17 wurde im wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben synthetisiert, wobei allerdings das in Hirulog-8 vorhandene Gly&sub4;-Teilstück gegen Gly-Gly-Glu-Gly-His-Gly ausgetauscht wurde. Diese Sequenz wurde in den Synthesezyklen 13-17 durch aufeinanderfolgende Anlagerung von BOC-glycin, BOC- -histidin, BOC-glycin, BOC-L-glutaminsäure und BOC-glycylglycin an die länger werdende Peptidkette angelagert. Aufreinigung und Charakterisierung wurden wie im Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 21

Synthese von Hirulog-18a, -18b und -18c

Hirulog-18a hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-(β-homoarginin)-(Gly)&sub5;-Asn- Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-18b besitzt die Formel: H-( -Phe)-Pro-(β-homoarginin)-Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu- Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-18c hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-(β- homoarginin)-Val-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu- OH. Hirulog-18a wurde unter Verwendung eines gemischten homogenen/Festphasen-Verfahrens synthetisiert. Die Reste 5-20 wurden wie in den Beispielen 4 und 17 beschrieben mittels eines Festphasen- Syntheseverfahrens hergestellt. Das erhaltene, harz gebundene Zwischenprodukt wurde mit einem BOC-β-homoarginin-Gly-geschützten Zwischenprodukt umgesetzt, das durch das nachstehend dargestellte und unmittelbar danach beschriebene, mehrere Schritte umfassende Reaktionsschema synthetisiert worden war.

Nα-BOC-Ng-Tos-arginin-diazomethylketon

10 g (13,4 mMole) Nα-BOC-Ng-Tos-arginin (Bachem, Torrance, CA) und 2,1 ml (19,1 mMole) N-Methylmorpholin (Aldrich, Milwaukee, Wis.) wurden in 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) 5 Minuten bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Die Lösung wurde dann auf -15 ºC abgekühlt und 2,8 ml (21,6 mMole) Isobutylchlorformiat (Aldrich) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 5 Minuten bei -15ºC gerührt und dann durch eine Celite/MgSO&sub4;-Unterlage gefiltert. Das Filtrat wurde dann in eine eiskalte Lösung von Diazomethan in Ether (150 mM, aus 32,4 g Diazald erzeugt; Aldrich) gegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt und man ließ sie allmählich Raumtemperatur erreichen. Danach wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 200 ml Chloroform gelöst. Dann wurde die organische Lösung nacheinander mit 200 ml einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung und anschließend 200 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, danach über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und wieder zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde danach mittels Flash-Chromatographie auf einer 4 x 17 cm großen Kieselgel-Säule unter Verwendung eines Stufengradienten von Aceton in Chloroform (10% Aceton in 2 l Chloroform, anschließend 20% Aceton in 3 l Chloroform) gereinigt. Es wurden 25 ml- Fraktionen gesammelt. Aliquots jeder Fraktion wurden mittels Dünnschicht- Chromatographie (TLC) untersucht. Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Das Produkt, Diazomethylketon, wurde nach Reinigung in Form eines blaßgelben Schaums erhalten (6,54 g).

NαBOC-Ng-Tos-β-homoarginin-methylester

Das vorstehend hergestellte Diazomethylketon wurde in 100 ml wasserfreiem Methanol gelöst und die erhaltene Lösung wurde unter Argon zum Sieden unter Rückfluß gebracht, wobei eine Lösung des Katalysators Silberbenzoat (165 mg in 400 µl Triethylamin) tropfenweise zugegeben wurde. Nach 30 Minuten wurde die unter Rückfluß erhitzte Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Norit aufgeschlämmt und durch Celite gefiltert. Danach wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand mittels Flash-Chromatographie über Kieselgel gereinigt. Das Produkt wurde mit 4 l 10%-igem Aceton in Chloroform eluiert. Das gewünschte Produkt, β-Homoarginin-methylester, wurde nach dieser Reinigung als hellbrauner Schaum erhalten (6,43 g).

Nα-BOC-Ng-Tos-β-homoarginin

Die gesamte Menge des vorstehend erhaltenen Methylesters wurde in 100 ml Methanol gelöst und dann mit einer LiOH-Lösung (1,48 g in 50 ml Wasser) über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon und kontinuierlichem Rühren umgesetzt. Methanol wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand in Wasser gelöst und mit Ethylacetat gewaschen. Anschließend wurde eine gesättigte Citronensäure-Lösung zugegeben, bis die Lösung einen pH-Wert von 4 erreichte. Die erhaltene Carbonsäure wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Extraktion wurde bei einem pH-Wert von 3 wiederholt, die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die erhaltene Roh-Säure wurde als weißer Schaum gewonnen (4,9 g). Die Säure wurde wie in Beispiel 4 beschrieben auf einer Vydac-C&sub1;&sub8;- Umkehrphasen-HPLC-Säule weiter aufgereinigt, wobei allerdings die Extinktion des Ausflusses bei 214 nm bestimmt wurde. Nach Lyophilisierung der gewünschten Fraktionen wurde das Produkt, Nα-BOC-Ng-Tos-β-homoarginin als weißer amorpher Feststoff gewonnen.
Eine Probe von Nα-BOC-Ng-Tos-β-homoarginin wurde in Fluorwasserstoffsäure (HF) hydrolysiert und dann als Standard zur Aminosäure-Analyse verwendet. Die Durchlaufzeit von β-Homoarginin war mit der von Arginin identisch, jedoch war die Intensität des Peaks erheblich geringer als erwartet.

Nα-BOC-Ng-Tos-β-homoargininylglycin-benzylester

4,06 (9,2 mMole) der vorstehend erhaltenen Carbonsäure wurden mit 2.04 ml N-Methylmorpholin in 25 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran vereinigt. Das Gemisch wurde bei -5ºC unter Argon gerührt. Der Lösung wurde dann eine gekühlte Lösung von Isobutylchlorformiat (2,4 ml in 25 ml Tetrahydrofuran) über eine Zeitspanne von 10 Minuten tropfenweise zugegeben. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 12 Minuten bei -5ºC gerührt. Im Fall von Hirulog-18a wurde eine Lösung von Glycinbenzylester (4,9 g in 40 ml Tetrahydrofuran; 27,6 mMole) zugegeben und dann ließ man das Reaktionsgemisch Raumtemperatur erreichen. Das Lösungsmittel wurde danach im Vakuum entfernt und der erhaltene Rückstand in 100 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit jeweils 100 ml einer gesättigten NaHCO3 -Lösung und einer gesättigten NaCl-Lösung extrahiert, über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der erhaltene Roh-Dipeptidester wurde gereinigt auf einer 4 x 20 cm großen Kieselgel-Säule mit einem Stufengradienten von Methanol in Chloroform (2 l 1%-iges Methanol in Chloroform, anschließend 3 l 2%-iges Methanol in Chloroform), enthaltend 10 Tropfen NH&sub4;OH pro 100 ml. Es wurden Fraktionen (25 ml) gesammelt und mittels Dünnschicht-chromatographie untersucht. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das erhaltene Produkt, Nα-BOC-Ng-Tos-β-homoargininylglycin- benzylester wurde als weißer Schaum isoliert (3,9 g).
Zum Erhalt von Hirulog-18b und Hirulog-18c wurde die vorstehend beschriebene Reaktion in identischer Weise mit Ausnahme der folgenden Modifikationen durchgeführt: Für Hirulog-18b wurde Glycinbenzylester gegen Prolinbenzylester ausgetauscht und die Reaktion wurde mit einer Menge von 1,8 mMolen durchgeführt. Für Hirulog-18c wurde Glycinbenzylester gegen Valinbenzylester ausgetauscht und die Reaktion wurde mit einer Menge von 3,0 mMolen durchgeführt.

Nα-BOC-Ng-Tos-β-homoargininylglycin

Der vorstehend erhaltene Benzylester wurde in 50 ml Methanol gelöst und 17 Stunden bei Atmosphärendruck über 1,0 g 10% Palladium/Kohlenstoff hydriert. Die erhaltene Lösung wurde durch Celite gefiltert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Reaktion ergab 2,9 g Roh-Nα-BOC-Ng- Tos-β-homoargininylglycin, das auf einer Vydac-C&sub1;&sub8;-HPLC-Säule wie vorstehend beschrieben gereinigt wurde.
Das vorstehend erhaltene Na-BOC-Ng-Tos-β-homoargininylglycin (1,02 g) wurde in 1 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Der Lösung wurden nacheinander 5,5 ml 0,5 M Hydroxybenztriazol in DMF (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) und 5,5 ml 0,5 M Dicyclohexylcarbodiimid in CH&sub2;Cl&sub2; (Applied Biosystems) zugegeben. Zur Entfernung von Dicyclohexylharnstoff wurde die kalte Suspension des symmetrischen Anhydrids der Dipeptid-Einheit nach 1 Stunde schnell durch einen Glaswollebausch gefiltert.
Inzwischen wurde eine Suspension von N-BOC-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe- Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM (0,2 mMole in CH&sub2;Cl&sub2;) mittels Standard-Peptidsyntheseverfahren aktiviert. Ein am erhaltenen Produkt durchgeführter Kaiser-Test deutete auf eine freie endständige Aminogruppe hin.
Das aktivierte β-Homoarginylglycin-Dipeptid wurde dann an das harzgebundene Hexadekapeptid gekoppelt. Das erhaltene Octadekapeptid wurde dann unter Verwendung von Standard-Verknüpfungsverfahren schrittweise mit N-BOC-Pro und N-BOC-( -Phe) verknüpft. Das erhaltene Peptid, Hirulog-18a, wurde wie in Beispiel 4 beschrieben gereinigt und charakterisiert.
Die Synthese von Hirulog-18b und Hirulog-18c wurde nach ähnlichen Vorschriften durchgeführt.

BEISPIEL 22

Synthese von Hirulog-19

Hirulog- 19 besitzt die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-[ CH&sub2;NH]-(Gly)&sub5;-Asn- Gly-ASp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Die Reste 4-20 des Peptids wurden wie in Beispiel 4 beschrieben mit Hilfe von Peptidsyntheseverfahren an Festphasen zusammengesetzt. Der als nächstes angelagerte Rest Nα-BOC-Ng- tosyl-argininal wurde wie nachstehend dargestellt und beschrieben hergestellt.

Nα-BOC-Ng-tosyl-argininal

Nα-BOC-Ng-tosyl-argininal (Bachem Inc.; 10 g) wurde in 80 ml wasserfreies Tetrahydrofuran gegeben und die Suspension auf 0ºC -5ºC abgekühlt. Dann wurde 1,1'-Carbonyldlimidazol (Aldrich; 3,61 g) auf einmal zugegeben und die Suspension wurde weitere 20 Minuten gerührt. Die erhaltene klare Lösung wurde teilweise in ein Trockeneis/Aceton-Bad getaucht, um während der 45- minütigen tropfenweisen Zugabe einer Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (Aldrich; 1,8 g in 80 ml THF) unter konstantem Rühren die Temperatur bei -20ºC bis -30ºC zu halten. Die Reaktion wurde weitere 30 Minuten bei -20ºC gerührt und dann bei -10ºC durch tropfenweise Zugabe von 63 ml 2 N HCl beendet. Die erhaltene Lösung wurde durch einen mittelporigen Sinterglastrichter gefiltert und das erhaltene Filtrat im Vakuum konzentriert.
Das als weißer Schaum erhaltene Roh-Aldehyd (11,5 g) wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und mit Wasser gewaschen (2 x 50 ml). Danach wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Roh-Aldehyd (7,7 g) wurde in 100 ml Chloroform gelöst und mittels Flash-Chromatographie über einer 5 x 20 cm großen Flash-Säule, die 350 ml Kieselgel enthielt (Merck-Korngröße 60, Maschenzahl 230 - 400, 60 Å) gereinigt. Eine Hution wurde unter Verwendung eines Stufengradienten von 0,5% Methanol in 500 ml Chloroform, 1% Methanol in 1 l Chloroform und 1,5% Methanol in 1 l Chloroform durchgeführt. Durch dieses Verfahren wurden 8,9 g Nα-BOC-Ng-Tos-argininal erhalten.
Unter Verwendung des von D. H. Coy et al., in "Solid-Phase Synthesis of Peptides", in: Peptides Bd.8 (1978), S. 119-121, beschriebenen Verfahrens wurde Nα-BOC-Ng-Tos-argininal (258 mg) danach an das harzgebundene (GLy)&sub5;-Asn- Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM unter für Festphasen reduzierenden Alkylierungsbedingungen (40 mg Natriumcyanoborhydrid über eine Zeitspanne von 24 Stunden) angelagert. Nach der Reaktion des harzgebundenen Peptides mit dem geschützten Argininal wurde die Peptidsynthese mit einem Zyklus, in dem der Einbau von BOC-prolin erfolgte, und einem Zyklus, in dem der Einbau von BOC-( -phenylalanin) erfolgte, beendet. Nach Synthese-Beendigung wurde Hirulog-19 wie in Beispiel 4 beschrieben von Schutzgruppen befreit und vom Harz abgekoppelt.
Hirulog-19 wurde mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Applied Biosystems-151A-Flüssig-Chromatographiesystems und einer Aquapore-C&sub8;-Säule (10 x 22 cm) aufgereinigt. Die Säule wurde mit 1 Teil 0,85% TFA enthaltenden 70% Acetonitril/30% Wasser (Puffer B) und 4 Teilen 1% TFA enthaltendem Wasser (Puffer A) äquilibriert. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von zunehmenden Puffer-B-Konzentrationen (20% - 50%) 120 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 4,0 ml/Minute entwickelt. Die Extinktion des Ausflusses wurde bei 214 nm bestimmt und Fraktionen wurden manuell gesammelt. Eine weitere Aufreinigung erfolgte unter isokratischen Bedingungen unter Verwendung von 20% PufferB/80% PufferA.

BEISPIEL 23

Synthese von Hirulog-21

Hirulog-21 hat die Formel: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-(Gly)&sub2;-Lys-OH. Hirulog-21 wurde mittels der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren unter Verwendung geeigneter BOC- Aminosäuren synthetisiert. Aufreinigung und Charakterisierung von Hirulog-21 erfolgten mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren.

BEISPIEL 24

Synthese von Hirulog-25

Hirulog-25 hat die Formel: H-(D-Phe)-Pro-(4-argininyl-2,2- difluor)malonylglycyl-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr- Leu-OH. Das Hexadekapeptid (Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu- Tyr-Leu wurde wie vorstehend beschrieben synthetisiert und blieb an das Harz gebunden. Der nächste Rest, (3-Argininyl-2,2-difluor)malonylglycin, wurde mittels des nachstehend dargestellten und genauer beschriebenen Reaktionsschemas synthetisiert.

1-[(2'-Carboethoxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC-Norn-benzyl-Norn- Cbzornithinol

Eine Lösung von 3,1 g (7,1 mMole) Nα-BOC-Norn-benzyl-Norn-Cbzornithinal [F. Salituro et al., "Inhibition of Aspartic Proteinases By Peptides Containing Lysine and Ornithine Side Chain Analogues of Statine", J. Med. Chem. 30 (1987), S. 286-295] und 1,56 ml (9,23 mMole) Ethylbromdifluoracetat in 15 ml wasserfreiem THF wurde über eine Zeitspanne von 90 Minuten einer unter Rückfluß erhitzten Suspension von 786 mg Zn-Staub (Fluka) in 15 ml THF unter Argon zugegeben. Nach 4 Stunden Erhitzen unter Rückfluß sowie 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gemisch abgekühlt und mit jeweils 200 ml Ethylacetat und einer gesättigten NaCl-/KHSO&sub4;-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde isoliert, über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der erhaltene ölige Rückstand wurde auf einer Kieselgel-Säule unter Verwendung von CHCl&sub3; : Methanol (90:10) plus 100 Tropfen/l NH&sub4;OH als Elutionsmittel gereinigt.

1-[(2'-Carboethoxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC-ornithinol-tert-butyldimethylsilyl-ether

Die erhaltene Verbindung 1-[(2'-Carboethoxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC- Norn-benzyl-Norn-Cbzornithinol wurde dann mit 5 Äquivalenten tert-Butyldimethylsilylchlorid und 10 Äquivalenten Imidazol in wasserfreiem DMF bei 35ºC umgesetzt, wobei nach dem Verfahren von E J. Corey et al., "Protection of Hydroxyl Groups as tertbutyldimethylsilyl Derivatives", J. Amer. Chem. Soc. 94 (1972), S. 6190-6191, gearbeitet wurde. Das orthogonal geschützte Amin wurde dann in Methanol gelöst und 18 Stunden über Pd(OH)&sub2; bei 30 PSI hydriert. Durch Futration wurde dann der Katalysator entfernt und das Filtrat im Vakuum konzentriert, wobei 1-[(2'-Carboethoxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC- ornithinol-tert-butyldimethylsilyl-ether erhalten wurde.

1-[(2'-Carboethoxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC-Ng-Tos-argininol-tert-butyldimethylsilyl-ether

Die vorstehend hergestellte Verbindung wurde dann mit jeweils 6,8 Äquivalenten 1-Guanyl-3,5-dimethylpyrazol und Triethylamin in Wasser 24 Stunden bei 105ºC umgesetzt. Das Gemisch wurde danach lyophilisiert und der Rückstand wie in Beispiel 4 beschrieben einer präparativen HPLC unterworfen. Fraktionen, die die gewünschte Guanidiniumverbindung enthielten (mittels Dünnschicht-Chromatographie untersucht), wurden vereinigt und im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in H&sub2;O : Aceton (1:4) gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Der pH-Wert wurde mit 50% (Gew./Vol.) NAOH auf 12 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 3 Äquivalenten para-Toluolsulfonylchlorid in Aceton über eine Zeitspanne von 60 Minuten gegeben, wobei der pH-Wert mit NaOH bei 11 - 12 gehalten wurde. Man ließ die Lösung Raumtemperatur erreichen und rührte sie über Nacht. Danach wurde Aceton im Vakuum entfernt und die übriggebliebene wäßrige Lösung mit Ether gewaschen. Die Ether-Phase wurde entfernt und mit einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung nachextrahiert. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt und mit 2 N HCL bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Die erhaltene saure Lösung wurde dann zweimal mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.

1-[(2'-Carboxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC-Ng-Tos-argininol

Durch Behandlung mit 3 Äquivalenten tetra-n-Butylammoniumfluorid in THF bei Raumtemperatur wurde wie in E. J. Corey et al., vorstehend beschrieben die Silyl-Gruppe der erhaltenen Verbindung 1-[(2'-Carbo-ethoxy-1', 1'- difluor)ethyl]Nα-BOC-Ng-Tos-argininol-tert-butyldimethylsilyl-ether entfernt. Die mittels dieses Verfahrens hergestellte Verbindung wurde dann durch Behandlung mit 2,5 Äquivalenten LiOH in Methanol/Wasser bei Raumtemperatur über Nacht unter Argon verseift. Das Reaktionsgemisch wurde danach mit Ethylacetat gewaschen und mit Citronensäure bis auf einen pH-Wert von 4 angesäuert. Die erhaltene Säure wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Roh-Säure wurde dann auf einer Vydac-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen- HPLC-Säule unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen gereinigt.

1-[(2'-Carboxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC-Ng-Tos-argininon

Die funktionelle Alkohol-Gruppe der vorstehend erhaltenen Verbindung wurde durch Zugabe eines 0,5% Eisessig enthaltenden Äquivalents Pyridiniumchromat in CH&sub2;Cl&sub2; in Gegenwart von Molekularsieben in die Keton- Form überführt [N. Peet et al., "Synthesis of Peptidyl and Fluoromethyl Ketones and Peptidyl α-Keto Esters as Inhibitors of Porcine Pancreatic Elastase, Human Neurophil Elastase, and Rat and Human Neutrophil Cathepsin G", J. Med. Chem. 33 (1990), S. 394-407]. Nach 15-stündigem Rühren unter Argon wurde das Reaktionsgemisch gefiltert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das erhaltene 1-[(2'-Carboxy-1', 1'-difluor)ethyl] Nα-BOC-Ng-Tos-argininon wurde in Form eines öligen Rückstandes gewonnen und dann entsprechend den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen mittels HPLC gereinigt.
Die freie Carbonsäure wurde in das symmetrische Anhydrid überführt und mit dem in Beispiel 21 beschriebenen harzgebundenen Hexadekapeptid umgesetzt. Die zwei N-terminalen Reste von Hirulog-25, BOC-Pro und BOC-(D- Phe), wurden unter Standard-Peptidsynthese-Bedingungen angelagert und das erhaltene Peptid mit HF gespalten.

BEISPIEL 25

Synthese von Hirulog-26

Hirulog-26 hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-argoxopropionylglycyl-(Gly)&sub4;- Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Hexadekapeptid (Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu wurde wie vorstehend beschrieben synthetisiert und blieb an das Harz gebunden. Der nächste Rest, Nα-BOC-argoxopropionylglycin, wurde mittels des nachstehend dargestellten und genauer beschriebenen Reaktionsschemas synthetisiert.

3-(Cbz-amino)-2-oxo-3-{3-[(Ng-Tos)guanidinyl]propyl}-di-tert-butylmalonat

Eine Charge Nα-Cbz-Ng-Tos-arginin-diazomethylketon wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 21 für die Herstellung von Nα-BoC-Ng-Tos-arginindiazomethylketon beschrieben hergestellt, wobei allerdings Nα-BOC-Ng-Tos- arginin durch Nα-Cbz-Ng-Tos-arginin ersetzt wurde. 4,5 mg Nα-Cbz-Ng-Tos- arginin-diazomethylketon wurden in 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; in einer Hasche gelöst und die Lösung wurde in einem Trockeneis/Aceton-Bad unter Rühren auf -70ºC abgekühlt. Bei einer mäßigen Durchlaufgeschwindigkeit ließ man dann 15 Minuten wasserfreies HBr-Gas durch die Lösung hindurchperlen. Die Lösung wurde weitere 15 Minuten bei -70º C gerührt und danach im Vakuum konzentriert. 5,0 g des resultierenden Produkts Nα-Cbz-Ng-Tos-Arg-COCH&sub2;Br wurden als gelbe Kristalle gewonnen.
Inzwischen wurde eine Suspension von Natriumhydrid (36 mg; 80% Dispersion in Öl) in 1 ml DMF und 1,2 ml Hexamethylphosphoramid ("HMPA") einer Lösung von 259 mg Di-tert-Butoxymalonat in 4 ml DMF zugegeben. Das Gemisch wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann einer Lösung von 1 mmol Nα-Cbz-Ng-Tos-Arg-CoCH&sub2;Br in 1 ml DMF/0,13 ml HMPA über eine Zeitspanne von 20 Minuten tropfenweise zugegeben. Man ließ die Reaktion 3 Stunden ablaufen, danach wurde die Lösung in 50 ml Wasser gegossen und mit 2 x 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde isoliert, getrocknet und im Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert Der Rückstand wurde anschließend auf einer 3 x 10 cm großen Kieselgel-Säule, die nacheinander mit 400 ml 5%-igem Aceton in Chloroform, 400 ml 10%-igem Aceton in Chloroform und 200 ml 20%-igem Aceton in Chloroform eluiert wurde, aufgereinigt. Es wurden Fraktionen (25 ml) gesammelt und mittels Dünnschicht-Chromatographie untersucht. Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt und konzentriert, wobei 3-(Cbz-amino)- 2-oxo-3-{3-[(Ng-Tos)guanidinyl]propyl}-di-tert-butylmalonat erhalten wurde.

5-(Nα-Cbz-amino)-4-oxo-5-{3-[(Ng-Tos)guanidinyl]-propyl}pentanoylglycinbenzylester

Der vorstehend erhaltene Di- -Butylester wurde in 1,2 Äquivalenten 1 N HCl 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde er in Pyridin, das im Überschuß vorlag, 15 Minuten bei 100ºC decarboxyliert. Dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wie vorstehend beschrieben mittels Kieselgel-Chromatographie gereinigt. Die erhaltene Carbonsäure wurde mit Glycinbenzylester nach dem in Beispiel 21 beschriebenen Verfahren acyliert.

5-(Amino)-4-oxo-5-{3-[(Ng-Tos)guanidinyl-propyl}pentanoylglycin

Der erhaltene Ester wurde in 500 ml Methanol gelöst und über Nacht unter Wasserstoffgas bei einem Druck von 1 Atmosphäre über 600 mg 10% Palladium- Kohlenstoff als Katalysator hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch Celite gefiltert und im Vakuum zu einem festen Rückstand (155 mg) konzentriert. Die erhaltene Aminosäure wurde danach mittels HPLC unter Anwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen aufgereinigt.

5-(Nα-BOC-amino)-4-oxo-5-{3-[(Ng-Tos)guanidinyl]-propyl}pentanoylglycin

Die vorstehend erhaltene Aminosäure wurde durch Lösen in Dioxan/Wasser (2:1, Vol./Vol.) und Kühlen auf 0ºC unter Rühren in ihr entsprechendes BOC- Derivat überführt. Der pH-Wert wurde mit 0,1 N NaOH auf einen Wert von 10 eingestellt und dann wurden 1,1 Äquivalente Di-tert-Butylhydrogencarbonat (in Dioxan) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden gerührt, wobei die Temperatur von 0ºC bis 20ºC anstieg, und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat/1% Citronensäure (2:1) ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde isoliert und einmal mit 1%-iger Citronensäure sowie dreimal mit einer gesättigten NaCl-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet, gefiltert und im Vakuum konzentriert; wobei das BOC-geschützte Produkt erhalten wurde.
Das erhaltene freie Carboxylat des geschützten Pseudopeptids wurde danach unter Verwendung von Standard-Peptidsyntheseverfahren an das harzgebundene Hexadekapeptid gekoppelt. Danach erfolgte die schrittweise Anlagerung von BOC- -Phe und BOC-Pro an das harzgebundene Peptid. Das vollständige Hirulog-26 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben vom Harz abgespalten, von Schutzgruppen befreit und aufgereinigt.

BEISPIEL 26

Synthese von Hirulog-27

Hirulog-27 hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-(CO-CH&sub2;)-Pro-(Gly)&sub4;-Asn- Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Hexadekapeptid (Gly)&sub4;- Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu wurde wie vorstehend beschrieben synthetisiert und blieb an das Harz gebunden. Der restliche Teil des Moleküls wurde mittels des nachstehend dargestellten und beschriebenen Reaktionsschemas synthetisiert.

Na-Cbz-Ng-Tos-arginin (COCH&sub2;)prolin-benzylester

720 mg Prolinbenzylester (HCL-Salz) wurden in 25 ml THF gelöst. Unter Rühren wurde diese Lösung dann in einem Aceton/Trockeneis-Bad unter Argon auf -78ºC gekühlt. Danach wurde Lithiumdlisopropylamid (8,0 ml einer 0,75 M Hexan enthaltenden Suspension) zugegeben und es wurde weitere 5 Minuten gerührt. Dazu wurden 1,08 g Nα-Cbz-Ng-Tos-arginin-brommethylketon, das wie in Beispiel 25 beschrieben hergestellt worden war, in 10 ml THF über eine Zeitspanne von 20 Minuten tropfenweise zugegeben. Die Reaktion wurde weitere 5 Minuten gerührt und dann ließ man die Lösung unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmen. Man beendete die Reaktion durch Zugabe von 10 ml einer gesättigten NaCl-Lösung, ließ sich die Phasen trennen und isolierte die organische Phase. Diese Phase wurde dann über MgSO&sub4; getrocknet, gefiltert und im Vakuum eingedampft.

Nα-BOC-Ng-Tos-arginin (COCH&sub2;)prolin

Der vorstehend erhaltene Benzylester (1,3 g) wurde unter Verwendung des in Beispiel 25 beschriebenen Palladium-Kohlenstoff-Verfahrens hydriert. Zur Herstellung des gewünschten Produkts wurde das erhaltene Pseudodipeptid mit Hilfe des in Beispiel 25 beschriebenen Verfahrens BOC-geschützt.
Das gereinigte, geschützte Pseudodipeptid wurde dann mit Hilfe von Standard-Peptidsyntheseverfahren an das harzgebundene Hexadekapeptid gekoppelt. Hirulog-27 wurde mittels der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren von Schutzgruppen befreit, vom Harz abgespalten und gereinigt.

BEISPIEL 27

Synthese von Hirulog-28

Hirulog-28 hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg(CH&sub2;N)-Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly- Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Hexadekapeptid (Gly)&sub4;-Asn- Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM wurde wie vorstehend beschrieben synthetisiert und blieb an das Harz gebunden. Der restliche Teil des Moleküls wurde mittels des nachstehend dargestellten und beschriebenen Reaktionsschemas synthetisiert.

Nα-BOC-Ng-Tos-arginin [psiCH&sub2;N]prolin-benzylester

Ein Gramm zerkleinerte Molekularsiebe mit einer Größe von 3 Å (Aldrich) wurden einer gerührten Lösung aus 5,25 g freier Prolinbenzylester-Base (Schweizerhall, Inc.) in 10 ml wasserfreiem THF und 2 ml wasserfreiem Ethanol unter Argon bei Raumtemperatur zugegeben. Dem Gemisch wurden 1,45 ml 5 N methanolische HCL und 1,5 g Nα-BOC-Ng-Tos-argininal (wie in Beispiel 22 beschrieben hergestellt) zugegeben und dann wurde 1 Stunde gerührt. Dem Gemisch wurde eine Portion Natriumcyanoborhydrid von 85 mg zugegeben. Eine Stunde später erfolgte die Zugabe einer zweiten Portion Natriumcyanoborhydrid von 85 mg. Danach wurde das Reaktionsgemisch 20 Stunden gerührt und anschließend gefiltert. Dern Filtrat wurden unter Rühren 1 ml Wasser und 0,9 ml 1 N HCl zugegeben. Dann wurde die Lösung im Vakuum konzentriert, wobei 6,2 g Nα-BOC-Ng-Arg[psiCH&sub2;N]Pro-benzylester als klares Öl erhalten wurden.
Das Öl wurde mittels Flash-Chromatographie über einer 5 cm-Flash-Säule, die 350 ml Kieselgel (Merck-Körnung 60, Maschenzahl 230-400, 60 Å) enthielt, weiter aufgereinigt. Das Produkt wurde durch Elution mit nacheinander 0,25%, 0,75% und 1,5% Methanol in Chloroform gewonnen.

Nα-BOC-Ng-Tos-arginin [psiCH&sub2;N]prolin

Der erhaltene Benzylester wurde wie in Beispiel 25 beschrieben über Palladium-Kohlenstoff hydriert und geremigt. Durch dieses Verfahren wurden 160 mg der freien Säure von Nα-BOC-Ng-Tos-Arg[psiCH&sub2;N]prolin erhalten, die unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen HPLC-Chromatographiesystems weiter aufgereinigt wurde, wobei allerdings die Elution mit dem vorstehend in Beispiel 22 beschriebenen isokratischen Puffersystem von 26% Puffer B/74% Puffer A durchgeführt wurde. Die Endausbeute des Dipeptids betrug 86 mg.
Das Dipeptid wurde dann an das harzgebundene Hexadekapeptid gekoppelt. Anschließend wurden in einem Zyklus BOC-Pro und in einem Zyklus BOC-( - Phe) eingebaut. Die Entfernung der Schutzgruppen, Spaltung und Aufreinigung von vollständig synthetisiertem Hirulog-28 wurden mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

BEISPIEL 28

Synthese von Hirulog-29

Hirulog-29 hat die Formel: 4-Chlor-isocumarino-3-carboxyethoxy-(Gly)&sub5;- Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Heptadekapeptid (Gly)&sub5;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu wurde wie vorstehend beschrieben synthetisiert und blieb an das Harz gebunden. Die 4- Chlor-isocumarino-3-carboxyalkoxy-Einheit wurde mittels des nachstehend beschriebenen Reaktionsschemas und der darin gezeigten Verfahren synthetisiert.

Ethyl-2-brom-homopthalat

Homopthalsäure (10,0 g), 2-Bromethanol (21,0 g) und Benzol (200 ml) wurden gemischt. Danach wurden 12 - 15 Tropfen Schwefelsäure zugegeben und das Gemisch wurde 2,5 Stunden bis zum Sieden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde dann gefiltert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit 250 ml Ether/Hexan (1:1) gewaschen und über einen Sinterglastrichter gefiltert. Der erhaltene hellbraune Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, wobei etwa 15,0 g Produkt erhalten wurden.

4-Chlor-3-[2-bromethyloxy]-isocumarin

Das vorstehend hergestellte Ethyl-2-brom-homopthalat (4 g) wurde zusammen mit Phosphorpentachlorid (8,2 g) und Benzol (100 ml) gemischt. Das Gemisch wurde 4,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt, heiß gefiltert und im Vakuum eingedampft. Der rötlich-braune ölige Rückstand wurde sofort auf einer 24 mm x 175 mm großen Kieselgel-Säule unter Verwendung von Dichlormethan als Elutionsmittel einer Chromatographie unterworfen. Es wurden 20 ml-Fraktionen gesammelt und mittels Dünnschicht- Chromatographie untersucht. 4-Chlor-3-[2-bromethyloxy]-isocumarin wurde mit den Fraktionen 2-6 eluiert. Die Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde als klares, hellgelbes Öl gewonnen (2,2 g).

4-Chlor-3-[3-oxypropansäure]-isocumarin

Das vorstehend hergestellte 4-Chlor-3-[2-bromethyl]-isocumarin (1,4 g) wurde in wasserfreiem THF gelöst und dann direkt einer unter Rückfluß erhitzten Lösung aus Magnesiumdrehspänen (170 mg) und einigen Jodkristallen in 15 ml wasserfreiem THF, die unter Argon gerührt wurde, zugegeben. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Danach wurde es über Trockeneis im Überschuß in einem 400 ml-Becher ausgegossen. Man ließ das Gemisch bei 20ºC so lange stehen, bis das gesamte überschüssige CO&sub2; sublimiert war, und dann wurden dem Gemisch jeweils etwa 100 ml Diethylether und THF zugesetzt, wodurch eine gelbe Lösung erhalten wurde, die eme große Menge eines weißen, grobkörnigen Präzipitats enthielt.
Bei 20ºC wurde wasserfreie HCl durch das Gemisch hindurchgeperlt, wodurch der größte Teil des Präzipitats gelöst wurde. Zum Erhalt des Roh- Produkts wurde die Lösung danach gefiltert und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wurde dann über Nacht in Dichlormethan (DCM) umkristallisiert.
Das erhaltene 4-Chlor-3-[3-oxypropansäure]-isocumarin wurde an ein Glycinbenzylester angekoppelt und das erhaltene Produkt wie in Beispiel 25 beschrieben über Palladium-Kohlenstoff katalytisch hydriert. Dieses Pseudodipeptid wurde dann mit Hilfe von Standard-Peptidsyntheseverfahren an das harzgebundene Hexadekapeptid (Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile- Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu gekoppelt.

BEISPIEL 29

Synthese von Hirulog-30

Hirulog-30 hat die Formel: 4-Chlor-3-[2-aminoethanol]-isocumarino-(Gly)&sub5;- Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu. Das Hexadekapeptid (Gly)&sub4;- Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu wurde wie vorstehend beschrieben synthetisiert und blieb an das Harz gebunden.
Die 4-Chlor-3-[2-aminoethanol]-isocumarin-Einheit wurde mittels eines Verfahrens hergestellt, das zu dem in Beispiel 28 beschriebenen Verfahren zur Synthese von 4-Chlor-3-[2-bromethanol]-isocumarin analog ist, wobei allerdings 2-Aminoethanol anstelle des im Anfangsschritt der Veresterung der Homopthalsäure eingesetzten 2-Bromethanol verwendet wurde.
Die Harnstoff-Bindung wurde durch Reaktion der Aminogruppe von 4- Chlor-3-[2-aminoethanol]-isocumarin mit dem aktivierenden Mittel Carbonyldiimidazol ("CDI") gebildet. Das als Zwischenprodukt erhaltene Imidazolid wurde nicht isoliert, jedoch zur Herstellung von Hirulog-30 mit dem harzgebundenen Hexadekapeptid umgesetzt. Hirulog-30 wurde dann mittels der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren von Schutzgruppen befreit, vom Harz abgespalten und aufgereinigt.

BEISPIEL 30

Synthese von Hirulog-31

Hirulog-31 hat die Formel: Argipidyl-(Gly)&sub5;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile- Prc-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Hexadekapeptid (Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu- Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu wurde mittels der vorstehend beschriebenen Standard-Peptidsyntheseverfahren synthetisiert und blieb an das Harz gebunden. Der Argipidylglycin-Teil dieses Hirulog-Moleküls wurde mittels des nachstehend dargestellten und beschriebenen Reaktionsschemas synthetisiert.
Ein Dehydro-Ng-nitro-argipidin wurde im wesentlichen mit Hilfe des im US-Patent 4,258,192 beschriebenen Verfahrens zur Synthese von Argipidin synthetisiert, wobei der Inhalt des Patents durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist. Die einzigen Unterschiede bestanden darin, daß die Guanidinium-Gruppe durch eine funktionelle Nitro-Gruppe geschützt wurde und der heterocyclische Ring von Chinolin ungesättigt blieb. Dieses Zwischenprodukt wurde zur Acylierung von -Butylglycin mit Hilfe des in Beispiel 21 beschriebenen Verfahrens verwendet. Der -Butylester wurde mittels Standard-Säurehydrolyseverfahren entfernt. Die erhaltene freie Säure wurde mit dem Hexadekapeptid unter Verwendung von Standard- Kupplungsverfahren umgesetzt. Das erhaltene Peptid wurde mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren von Schutzgruppen befreit, vom Harz abgespalten und aufgereinigt.
Das Peptid wurde dann dem in dem US-Patent 4,258,192 beschriebenen Hydrierungsverfahren unterworfen und mit Hilfe des in Beispiel 4 beschriebenen HPLC-Verfahrens aufgereinigt.

BEISPIEL 31

Synthese von Hirulog-32

Hirulog-32 hat die Formel: H-( -Phe)-Pro-Arg-(Gly)&sub5;-Asn-Gly-Asp-Phe- Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-32 wurde unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren synthetisiert, aufgereinigt und charakterisiert, wobei allerdings im Zyklus, der sich den beiden Zyklen zur Anlagerung von BOC-glycylglycin anschließt, BOC-glycin anstelle von BOC- prolin verwendet wurde.

BEISPIEL 32

Synthese von Hirulog-33

Hirulog-33 hat die Formel: N-Acetyl-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-(Gly)&sub3;-Val- Arg-Pro-(Gly)&sub4;-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-33 wurde mit Hilfe der in Beispiel 4 angewendeten Standard- Peptidsyntheseverfahren unter Verwendung geeigneter BOC-Aminosäure- Substitutionen synthetisiert, aufgereinigt und charakterisiert. Der CSDM-Teil von Hirulog-33 besitzt eine Aminosäuresequenz, die zu einem Abschnitt der Fibrinopeptid A-Sequenz der Aα-Kette in menschlichem Fibrinogen identisch ist.

BEISPIEL 33

Spaltung verschiedenener Hirulog-Formen durch Thrombin

Es stellte sich heraus, daß die Thrombin-Hemmung durch Hirulog-8 aufgrund der langsamen Spaltung der Arg-Pro-Bindung durch Thrombin ein Übergangszustand ist. Es wurde festgestellt, daß Thrombin nach dieser Spaltung gegenüber einem chromogenen Substrat die volle hydrolytische Aktivität wiedergewinnt. Deshalb wurde Hirulog-8 als "langsam wirkender Substrat"- Inhibitor von Thrombin charakterisiert.
Die Spaltung sowohl von Hirulog-8 als auch anderer erfindungsgemäßer Hirulog-Formen durch menschliches α-Thrombin wurde in in-vitro-Tests gezeigt. In 0,1 M NaCl enthaltendem 20 mM Tris-HCL, pH-Wert 7,4, wurden Reaktionsgemische hergestellt, die menschliches α-Thrombin (1,6 nM) und entweder Hirulog-8, Hirulog-10, Hirulog-18a, Hirulog-18b, Hirulog-18c, Hirulog-19, Hirulog-32 oder Hirulog-33 in unterschiedlichen Konzentrationen (80 nM bis 160 nM) enthielten. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden den Reaktionsgemischen Aliquots (0,975 ml) entnommen und in einer Küvette mit 0,025 ml Spectrozym TH, einem chromogenen Substrat, gemischt (Endkonzentration 11 µM). Es wurde die Anfangs-Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt und auf der Basis von Kontrollgemischen, die Thrombin in Abwesenheit von Hirulog enthielten, die prozentuale Hemmung berechnet.
Bei einer anderen Ausführungsform des Verfahrens erfolgte eine Auftrennung von Aliquots aus Hirulog/Thrombin-Reaktionsgemischen mittels Umkehrphasen-HPLC. Bei diesem Test wurde menschliches α-Thrombin (Endkonzentration 0,25 µM) in ein Reaktionsgefäß gegeben, das eine der vorstehend erwähnten Hirulog-Formen (Endkonzentration 12,5 µM) enthielt. Sowohl vor als auch zu verschiedenen Zeitpunkten nach Thrombin-Zugabe wurden Aliquots (50 µl) entnommen. Die Aliquots wurden entweder kurz eingefroren oder direkt auf die HPLC-Säule injiziert. Bei der HPLC wurde ein Applied Biosystems-Flüssig-Chromatographiesystem angewendet, das mit einer Aquapore-C&sub8;-Säule (0,46 x 10 cm) ausgestattet war. Die Säule wurde mit 70%- igem Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und 30%-igem Lösungsmittel B (0,085% TFA/70% Acetonitril) äquilibriert und mit einem linearen Gradienten von Lösungsmittel B in Konzentrationen von 30% bis 50% 30 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute entwickelt. Die Extinktion des Ausflusses wurde bei 214 nm bestimmt. Peptidkonzentrationen wurden durch Messung der Peak-Höhen bestimmt.
Beide vorstehend beschriebenen Tests ermöglichen die Bestimmung der Geschwindigkeit der Hirulog-Hydrolyse durch Thrombin (angegeben in M/min) und der Stoffumsatzgeschwindigkeit (kcat; angegeben in min-¹). Durch beide Verfahren wurden vergleichbare kcat-Werte erhalten, die in der nachstehenden Tabelle gezeigt sind. INHIBITOR P&sub1;-P&sub1;'-SEOUENZ Hirulog
Wie vorstehend gezeigt, wurden Hirulog-8, Hirulog-10, Hirulog-32 und Hirulog- 33 von Thrombin bei kcat-Werten im Bereich von 0,056 min&supmin;¹ (langsame Spaltung) bis 535 min&supmin;¹ (schnelle Spaltung) gespalten. Im Gegensatz dazu schienen Hirulog-18a, Hirulog-18b, Hirulog-18c und Hirulog-19 gegen die Thrombin-Spaltung resistent zu sein.
Die Bilder A und B von Figur 5 zeigen eine genauere Analyse der Spaltung von Hirulog-8 durch Thrombin Wie in Figur 5, Bild A, dargestellt, zeigten im Vergleich zu Thrombin in geringem Überschuß vorliegende Hirulog-8- Konzentrationen eine vorübergehende Hemmaktivität (je nach Hirulog- Konzentration 10 Minuten oder mehr). Zunehmend höhere Konzentrationen von Hirulog-8 zeigten längere Hemmwirkungen. In Figur 5, Bild B, ist eine lineare Beziehung zwischen der Hemmdauer und der Hirulog-8-Konzentration gezeigt. Aus diesen Daten wurde eine Stoffumsatz-Zeit oder ein kcat-Wert von 0,37 min&supmin;¹ berechnet.
Durch Aufreinigung und Sequenzanalyse der in den vorstehend beschriebenen Reaktionen erhaltenen Hirulog-8-Spaltprodukte wurde ermittelt, daß Hirulog-8 durch Thrombin an der Arg-Pro-Bindung langsam gespalten wurde. Diese Spaltstelle ist für Serinproteasen höchst ungewöhnlich und man kann davon ausgehen, daß diese Stelle in Hirulog-8 aufgrund der hohen Affinität des Peptids für Thrombin für eine Spaltung zugänglich ist.

BEISPIEL 34

Wirkung der Linker-Länge auf die Hirulog-Aktivität

Hirulog-8, Hirulog-13, Hirulog-15 und Hirulog-16 unterscheiden sich nur durch die Länge des Polyglycin-Teils ihrer entsprechenden Linkersegmente. Zur Bestimmung der Wirkung der Linkerläge auf die Aktivität wurde das Ausmaß der Hemmung von menschlichem α-Thrombin durch jedes dieser Hirulog-Moleküle verglichen. Die folgende Tabelle listet die Linkerlängen jedes dieser Hirulog-Moleküle auf: Peptid Linkerlänge (Å) Hirulog
Die gegen Thrombin gerichteten Aktivitäten dieser Hirulog-Moleküle wurden im wesentlichen wie in Beispiel 9 beschrieben durch Hemmung der Thrombin-katalysierten Hydrolyse von Spectrozym TH bestimmt. Figur 6 stellt die Beziehung zwischen der Linkerlänge und dem Ki-Wert für die Hemmung dieser Thrombin-katalysierten Reaktion durch Hirulog dar. Diese Figur zeigt, daß Hirulog-8, Hirulog-15 und Hirulog-16 vergleichbare Hemmaktivitäten aufweisen, während die Aktivität von Hirulog-13 mit einer Linkerlänge von 18 Å um mehr als das 10fache verringert ist. Das bestätigt, daß Linkerlägen > 18 Å und < 42 Å keinen Einfluß auf die Hirulog-Aktivität haben. Ohne eine bestimmte Theorie zu vertreten, läßt sich vermuten, daß dies auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß der Hirulog-Linker bei freiem Vorliegen in Lösung genauso fehlgeordnet ist wie bei Bindung an Thrombin. Es wird außerdem vermutet, daß sich die CSDM- und ABEAM-Teile der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren bei Bindung an Thrombin nur in geringem Maße kooperativ verhalten.

BEISPIEL 35

Hemmung einer Thrombin-katalysierten Hydrolyse durch verschiedene Hirulog-Formen

Es wurden die Aktivitäten verschiedener erfindungsgemäßer Thrombininhibitoren bei der Hemmung der Thrombin-katalysierten Hydrolyse eines Tripeptidyl-p-nitroanilid-Substrates verglichen. Die gegen Thrombin gerichteten Aktivitäten von Hirulog-10, Hirulog-18a, Hirulog-18b, Hirulog-18c, Hirulog-19, Hirulog-32 und Hirulog-33 wurden mittels des in Beispiel 9 beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von Spectrozym TH als Substrat untersucht. Die nachstehende Tabelle listet sowohl die berechnten Ki-Werte als auch die P&sub1;-P&sub1;'-Sequenz jedes dieser Thrombininhibitoren auf. INHIBITOR P&sub1;-P&sub1;'-SEQUENZ Hirulog
Wie vorstehend gezeigt, erwiesen sich Hirulog-10 und Hirulog-32 als schwache Inhibitoren der Thrombin-katalysierten Hydrolyse von Spectrozym TH. Das stimmte mit der Tatsache überein, daß jeder dieser Inhibitoren schnell von Thrombin an der P&sub1;-P&sub1;'-Bindung gespalten wurde. Es wurde festgestellt, daß Hirulog-19, bei dem diese Bindung auf eine CH&sub2;-NH-Bindung reduziert wurde und damit von Thrombin nicht gespalten werden konnte, die Thrombin katalysierte Hydrolyse wirksam hemmen konnte.
Die Untersuchungen mit β-Homoarginin enthaltenden Inhibitoren (Hirulog-18a, Hirulog-18b und Hirulog-18c) zeigten, daß dieses Aminosäurederivat Arginin in den erfindungsgemäßen Inhibitoren ohne Beeinträchtigung der Aktivität ersetzen kann. Außerdem zeigte sich, daß der Austausch der Amidbindung gegen eine Methylengruppe die Thrombin- Hemmaktivität nicht wesentlich verringerte. Die im Vergleich zu Hirulog-18a bzw. Hirulog-18b 30fache - 50fache Erhöhung des Ki-Wertes bei Hirulog-18c legt nahe, daß die Struktur der P&sub1;'-Aminosäure wichtig für die Hemmaktivität ist. Ohne eine bestimmte Theorie zu vertreten, wird vermutet, daß sowohl die Gegenwart von phi-psi-Winkeln in der P&sub1;'-Aminosäure (bei Hirulog-18a Gly; bei Hirulog-18b Pro) als auch Einschränkungen der Konformation (beispielsweise bei Hirulog-18b durch Prolin verursacht) zur Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Inhibitoren beitragen. Eine andere Möglichkeit ist, daß die β-verzweigte Seitenkette der P&sub1;'-Aminosäure Val in Hirulog-18c die Bindung des CSDM-Teils dieses Moleküls an das aktive Zentrum von Thrombin aufgrund sterischer Probleme beeinträchtigen kann.

BEISPIEL 36

Bindung von Hirulog-8 an die aktive Stelle von Thrombin

Diisopropylfluorphosphat (DFP) ist ein wohlbekannter Inhibitor von Serinproteasen einschließlich Thrombin, dessen Wirkung in der kovalenten Modifikation der Hydroxyl-Gruppe von Ser-195 besteht. Ein 270facher Überschuß an ¹&sup4;C-DFP wurde Thrombin in 0,1 M Natriumborat, pH-Wert 8,0, zugegeben. Nach einer 10-minütigen Reaktion wurde die Bildung eines Thrombin-Komplexes mittels SDS-PAGE und fluorgraphischer Analysen gezeigt (Figur 7, Spur 1). Bei Durchführung der Reaktion in Gegenwart von Sulfo- Tyr&sub6;&sub3;-N-acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; (im Vergleich zu Thrombin in einem 300fachen bzw. 3000fachen molaren Überschuß) veränderte sich die Modifikation von Thrombin durch [¹&sup4;C]-DFB nicht signifikant (Figur 7, Spuren 4 und 5). Bei Durchführung der Reaktion in Gegenwart von Hirulog-8 (im Vergleich zu Thrombin in einem 3fachen oder 30fachen molaren Überschuß) wurde der Einbau von [¹&sup4;C]-DFB in die katalytische Stelle von Thrombin vollständig blockiert (Figur 7, Spuren 2 und 3). Diese Daten zeigen, daß die CSDM-Domänen der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren an die katalytische Stelle von Thrombin binden und die katalytische Aktivität hemmen können.

BEISPIEL 37

Vergleich der gegen Thrombin gerichteten Aktivitäten von Hirulog-8 und des gegen die katalytische Stelle gerichteten synthetischen Pentapeptids (D-Phe)- Pro-Arg-Pro-Gly

Wie in Figur 1 gezeigt, konnte Hirulog-8 im Gegensatz zu seiner mit einer außenliegenden Anionen-Bindungsstelle assozuerenden Einheit Sulfo-Tyr&sub6;&sub3;- N-acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4; die Thrombin-katalysierte Hydrolyse kleiner - Nitroanilid-Substrate hemmen. In ähnlicher Weise wurde die Fähigkeit des Pentapeptids ( -Phe)-Pro-Arg-Pro-Gly zur Hemmung des katalytischen Reaktionsvermögens von Thrombin getestet.
Unter Verwendung eines BOC-glycin-divinylbenzol-Harzes wurde das Pentapeptid wie in Beispiel 4 beschrieben synthetisiert. Das Pentapeptid wurde wie in Beispiel 4 beschrieben gereinigt und charakterisiert.
Die gegen die Thrombin-katalysierte Hydrolyse von Spektrozym TH gerichteten Wirkungen sowohl von Hirulog-8 als auch dieses Pentapeptids wurden wie in Beispiel 9 beschrieben untersucht, wobei festgesetzte Peptidkonzentrationen von 50 nM bzw. 10 µM verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß selbst Konzentrationen des Pentapeptides von 10 µM keine signifikante Wirkung auf die Thrombin-katalysierte Reaktionsgeschwindigkeit hatten, während Konzentrationen von Hirulog-8 im nanomolaren Bereich die Thrombin-katalysierte Reaktion hemmten. Diese Daten zeigten, daß die CSDM-Domäne der erfmdungsgemäßen Inhibitoren selbst nur ein schwacher Inhibitor der katalytischen Funktion von Thrombin ist.

BEISPIEL 38

Gerinnungshemmende Aktivität von Hirulog-8 in vivo

Die gerinnungshemmende Aktivität von Hirulog-8 wurde in vivo bestimmt, nachdem Pavianen dieses Peptid intravenös injiziert worden war. Dazu wurden verschiedene Dosen von Hirulog-8 im Bereich von 0,002 mg/kg/min bis 0,2 mg/kg/min verwendet. Paviane (männlich, 10-15 kg) wurden vor Hirulog-8- Verabreichung mit Ketaminhydrochlond sediert. Bei behandelten Tieren und Kontrolltieren wurde Vollblut aus einem in der Femoralvene befindlichen Katheter entnommen und in eine 3,8%-ige Natriumcitratlösung gegeben (9:1, Blut : Natriumcitrat). Mit Hilfe von Standardverfahren wurde Plasma gewonnen und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit mittels der in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren ermittelt. Wie in Figur 8 gezeigt, führte Hirulog-8 zu einer dosisabhängigen Erhöhung der APTT-Werte. Mit der niedrigsten Hirulog- Dosis (0,002 mg/kg/min Infusion) wurde eine 200%-ige Erhöhung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (als therapeutischer Bereich angesehen) erzielt.

BEISPIEL 39

Hemmung von Gerinnsel-gebundenem Thrombin durch Hirulog-8

Bekanntlich kann Thrombin an ein Fibrin-Gerinnsel binden und kann, sobald es absorbiert worden ist, weiteres Fibrinogen spalten, was zu einem Wachstum des Gerinnsels führt. Es zeigte sich, das an ein Gerinnsel gebundenes Thrombin gegen die Neutralisierung durch den Heparin-Antithrombin III- Komplex resistent ist [P. J. Hogg et al., "Fibrin Monomer Protects Thrombin From Inactivation By Heparin-Antithrombin III: Implications for Heparin Efficacy", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), S. 3619-3623], jedoch durch Antithrombin-III-unabhängige Inhibitoren, wie PPACK, Hirudin oder Sulfo- Tyr&sub6;&sub3;-N-acetyl-hirudin&sub5;&sub3;&submin;&sub6;&sub4;, gehemmt werden kann. Man vermutet, daß Gerinnsel-gebundenes Thrombin eine Rolle bei der Thrombus-Ablagerung und erneuter Thrombose nach einer thrombolytischen Therapie spielt.
Die Fähigkeiten von Hirulog-8 und Heparin zur Hemmung von Gerinnsel- gebundenem Thrombin wurden unter Verwendung des von J. I. Weitz et al. in "Clot-Bound Thrombin Is Protected from Heparin Inhibition - A Potential Mechanism for Rethrombosis After Lytic Therapy", Blood 74 (1989), S. 136a, beschriebenen Verfahrens verglichen.
Eine klinisch relevante Heparin-Dosis (0,1 E/ml) hemmte die durch lösliches Thrombin katalysierte Freisetzung von Fibrinopeptid A (FPA) etwa um 70%. Eine ähnliche Dosis hatte jedoch keine Wirkung auf die durch Gerinnsel-gebundenes Thrombin katalysierte FPA-Freisetzung. Im Gegensatz dazu war die Hemmwirkung von Hirulog-8 sowohl auf die durch lösliches als auch die durch Gerinnsel-gebundenes Thrombin katalysierte FPA-Freisetzung fast identisch (Figur 9).
Diese Untersuchung zeigte, daß sowohl Hirulog-8 als auch die anderen erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren die Thrombus-Ablagerung wirksamer blockieren und nach thrombolytischer Behandlung eine schnellere Durchblutung herbeiführen sowie eine erneute Thrombose wirksamer verhindern als andere derzeit verfügbare Medikamente.

BEISPIEL 40

Die Wirkung von Hirulog-8 auf die Blutplättchen-abhängige Thrombose in vivo

Da Paviane bekanntlich ähnliche Koagulations- und Hämostase-Reaktionen haben wie der Mensch, wurden Paviane als Modell verwendet, um die Fähigkeit von Hirulog-8 zur Unterbrechung der Blutplättchen-abhängigen Thrombose zu ermitteln. Insbesondere wurden bei den Tieren verschiedene thrombogene Oberflächen in einen ständig außerhalb des Körpers befindlichen AV-Shunt eingesetzt. Diese Oberflächen umfaßten operativ entfernte Gefäßinnenhaut- Teilstücke der Pavian-Aorta, mit Kollagen beschichtete Silastik-Schlauchstücke sowie mit Kollagen beschichtete Gortex- oder Dacron-Gefäßtransplantate. Nach Einsetzten in den Shunt wurden die Oberflächen zur Auslösung der Thrombenbildung nativer Blutströmung ausgesetzt. Die Thrombenbildung wurde durch Kontrolle der Blutplättchung-Ablagerung an den thrombogenen Oberflächen über eine Zeitspanne von 60 Minuten gemessen. Die Messungen wurden durch bildliche Darstellung mittel einer außen befindlichen Gamma- Kamera festgehalten, nachdem den getesteten Tieren vorher durch Infusion autologe ¹¹¹In-markierte Bluttplättchen verabreicht worden waren.
Der Einsatz eines 5 cm großen, operativ entfernten Gefäßinnenhaut- Teilstücks der Pavian-Aorta in den außen befindlichen arteriovenösen Shunt führte in Abwesenheit von Hirulog-8 zu einer zeitabhängigen Blutplättchen- Ablagerung. Die Akkumulation erreichte nach 60 Minuten ein Plateau, wobei festgestellt wurde, daß zu diesem Zeitpunkt insgesamt 14,0 ± 5,0 x 10&sup8; Blutplättchen/cm an dem operativ entfernten Gefäßinnenhaut-Teilstück abgelagert waren. Hirulog-8-Dosen von 0,002 mg/kg/min und 0,01 mg/kg/min hemmten die Blutplättchen-Ablagerung um 53,6% bzw. 75,5%. Diese Ergebnisse sind in Figur 10 dargestellt. In diesem Modellsystem betrug der ED&sub5;&sub0;-Wert (die Dosis, die erforderlich ist, um die Blutplättchen-Ablagerung um 50% zu verringern) für Hirulog-8 0,002 mg/kg/min.
Danach wurden 5 cm große, Kollagen-beschichtete Silastik-Schlauchstücke in den arteriovenösen Shunt eingesetzt. In Abwesenheit von Hirulog-8 waren nach 60 Minuten 12,6 ± 5,0 x 10&sup8; Blutplättchen/cm abgelagert. Die Verabreichung von Hirulog-8 führte zu einer dosisabhängigen Hemmung der Blutplättchen-Ablagerung. Eine Hirulog-8-Dosis von 0,04 mg/kg/min hemmte die Blutplättchen-Ablagerung vollständig. Die Ergebnisse dieses Teils des Experiments sind in Figur 11 dargestellt. Es wurde berechnet, daß in diesem System der ED&sub5;&sub0;-Wert für Hirulog-8 0,04 mg/kg/min betrug.
Bekanntlich besitzen sowohl Kollagen-beschichtete Gortex- als auch Dacron-Gefäßtransplantate stärkere thrombogene Eigenschaften als Silastik- Schlauche. Nach 60 Minuten Kontakt mit nativem Blut in Abwesenheit von Hirulog-8 wurden insgesamt 35,0 ± 6,0 x 10&sup8; Blutplättchen/cm auf Gortex abgelagert. Es stellte sich heraus, daß Hirulog-8 erneut eine dosisabhängige, antithrombotische Wirkung auf die Blutplättchen-Thrombusbildung zeigte. Eine Hirulog-8-Dosis von 0,2 mg/kg/min verursachte eine 62,9%-ige Hemmung der Blutplättchen-Ablagerung. Der ED&sub5;&sub0;-Wert für Hirulog-8 betrug im Gortex- System 0,135 mg/kg/min. Ein ähnliches Ergebnis wurde für Dacron- Transplantate erhalten. Daß zur Hemmung der Blutplättchen-Ablagerung auf diesen beiden Oberflächen eine höhere Dosis von Hirulog-8 erforderlich war, konnte aufgrund ihrer starken thrombogenen Wirkung erwartet werden.
Die Wirkung von Hirulog-8 auf die Blutplättchen-abhängige Thrombenbildung wurde auch unter Bedingungen mit schwachen und starken Scherkräften bestimmt, wobei eine aus zwei Kammern bestehende Vorrichtung verwendet wurde, die eine gleichzeitige Messung unter sowohl starken als auch schwachen Scherkräften ermöglichte. Die Vorrichtung bestand aus einem 2 cm großen, mit Kollagen beschichteten Gortex-Teilstück, dem sich 2 cm große Teilstücke anschlossen, deren Durchmesser gedehnt worden war. Unter Verwendung dieser Vorrichtung wurde die Thrombenbildung eingeleitet, indem unter starken Scherkräften ein Kollagen-beschichtetes Gortex-Teilstück nativer Blutströmung ausgesetzt wurde. In diesem Teil der experimentellen Verfahrensweise wurden arterienähnliche Bedingungen simuliert. Bei Eintritt des Blutes in die Teilstücke mit gedehntem Durchmesser traten Verwirbelungsbedingungen mit schwachen Scherkräften auf, wodurch venöse Thrombose simuliert wurde. Bei Kontrolltieren akkumulierten sich in den starken bzw. schwachen Scherkräften ausgesetzten Teilstücken nach 40 Minuten insgesamt 9,3 ± 2,3 x 10&sup8; bzw. 6,1 ± 0,5 x 10&sup8; Blutplättchen/cm. Die Hemmung der Blutplättchen-Ablagerung durch Hirulog-8 verlief in den starken Scherkräften ausgesetzten Teilstücken ebenso wie in den schwachen Scherkräften ausgesetzten Teilstücken dosisabhängig. Eine Dosis von 0.05 mg/kg/min hemmte die Blutplättchen-Akkumulation unter schwachen Scherkräften um 42,6% und unter starken Scherkräften um 29,0%.

BEISPIEL 41

Vergleich von Hirulog-8 und anderen antithrombotischen Mitteln bei der Hemmung akuter Bluttplättchen-abhängiger Thrombose

Die Wirkungen von Heparin, Heparin niedrigen Molekulargewichts und rekombinantem Hirudin auf die Blutplättchen-Ablagerung wurden in dem in Beispiel 40 beschriebenen Pavian-Modeilsystem mit einem außerhalb des Körpers befindlichen, Kollagen-beschichtete Silastic-Schläuche umfassenden AV-Shunt untersucht.
Schon früher hatte es sich gezeigt, daß die Hemmung der Blutplättchen- Ablagerung durch Heparin, das in einer Dosis von 160 E/kg in einer Gabe injiziert und anschließend in einer Dosis von 160 E/kg/Std. als Infusion verabreicht worden war, 80% der bei Kontrolltieren nach Behandlung mit Kochsalzlösung festgestellten Hemmung betrug. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Heparin niedrigen Molekulargewichts erzielt, das in einer Dosis von 53 Antifaktor-Xa-Einheiten/kg auf einmal injiziert und anschließend in einer Dosis von 53 Antifaktor-Xa-Einheiten/kg/Std. als Infusion verabreicht worden war [Y. Cadroy, "In Vivo Mechanism of Thrombus Formation. Studies Using a Primate Model" (1989), Doktorarbeit, L'universite Paul Sabatier de Toulouse (Sciences)]. Sowohl rekombinantes Hirudin [A. B. Kelly et al., "Recombinant Hirudin Interruption of Platelet-Dependent Thrombus Formation", Circulation 78 (1988), S. II-311] als auch Hirulog-8 hemmten in äquivalenten molaren Dosen (5 nmol/kg/min) die Blutplättchen-abhängige Thrombenbildung im Vergleich zur Kontrolle um 60% - 70%. Diese Ergebnisse sind in Figur 12 dargestellt. Bei Pavianen als Modellsystem sind früher andere Thrombininhibitoren getestet worden [A. B. Kelly et al., "Comparison of Antithrombotic and Antihemostatic Effects Produced by Antithrombins in Primate Models of Arterial Thrombosis", Thromb. and Hemostas. 62 (1989), S. 42]. In der nachstehenden Tabelle sind sowohl die in der Veröffentlichung beschriebenen ED&sub5;&sub0;-Werte für diese Mittel an Kollagen-beschichteten Oberflächen als auch die in der vorliegenden Erfindung ermittelten ED&sub5;&sub0;- Werte zusammengefaßt: Mittel Gyki 14,451 Benzamidin Argipidin (MD805) rekombinantes Hirudin Hirulog-8

BEISPIEL 42

Die Wirkung von Hirulog-8 auf die Fibrin-Ablagerung

Die Wirkung von Hirulog-8 auf die Ablagerung von Fibrin(ogen) wurde bei den Thromben bestimmt, die sich an den in Beispiel 40 beschriebenen, als Modeilsystemen dienenden, aus der Aorta operativ entfernten Gefäßinnenhaut- Bereichen und Kollagen-beschichteten Schlauchstücken gebildet hatten. Die Fibrin-Ablagerung wurde durch Messung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrin(ogen) 30 Tage nach Beendigung des vorstehend beschriebenen Tests mit ¹¹¹Inmarkierten Blutplättchen ermittelt. Die ¹¹¹In-Markierung konnte dadurch soweit zerfallen, daß die ¹²&sup5;I-Messung nicht beeinträchtigt wurde.
Figur 13 zeigt, daß in Abwesenheit von Hirulog-8 0,17 mg Fibrin/cm auf dern Kollagen-beschichteten Schlauch abgelagert wurden, nachdem dieser wie in Beispiel 40 beschrieben 60 Minuten nativer Blutströmung ausgesetzt worden war. Dosen von 0,01 mg/kg/min und 0,04 mg/kg/min hemmten die Ablagerung von Fibrin(ogen) vollständig. Ähnliche Ergebnisse wurden an den aus der Aorta operativ entfernten Gefäßinnenhaut-Segmenten erzielt. Diese Ergebnisse zeigen, daß sich die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren sowohl zur Verminderung der im Zusammenhang mit einem Thrombus stehenden Fibrin(ogen)-Ablagerung als auch zur Blockierung der akuten, Blutplättchenabhängigen Thrombenbildung einsetzen lassen.

BEISPIEL 43

Bestimmung der Clearance-Zeiten für Hirulog-8

Paviane wurden als Modeilsystem verwendet, um die Clearance-Zeiten von Hirulog-8, das als intravenöse Infusion verabreicht oder in einer Gabe intravenös oder subcutan injiziert worden war, zu ermitteln. Zur Kontrolle der Clearance-Zeiten wurden wie in Beispiel 11 beschrieben APTT-Tests durchgeführt.
Pavianen wurden verschiedene Hirulog-8-Dosen (0,002 mg/kg/min - 0,2 mg/kg/min) durch eine systemische intravenöse Infusion über eine Zeitspanne von 60 Minuten verabreicht. APTT-Werte wurden nach der 60- mmütigen Infusion und in verschiedenen Zeitabständen danach bestimmt. Es wurde ermittelt, daß die durchschnittliche Halbwertszeit für die Hirulog-8- Clearance 9,2 ± 3,3 Minuten beträgt.
Zur Bestimmung der Clearance-Zeit nach in einer Gabe erfolgter Injektion wurde Pavianen eine Dosis von 1 mg/kg Hirulog-8 intravenös oder subcutan injiziert. Die APTT-Werte wurden in verschiedenen Zeitabständen nach Injektion bestimmt. Figur 14 zeigt, daß der APTT-Wert 2 Minuten nach intravenöser Injektion bis zu einem Peak anstieg, der bei 570% des Kontrollwertes lag. Nach intravenöser Injektion betrug die Halbwertszeit von Hirulog-8 14 Minuten.
Figur 15 zeigt, daß sich zum frühesten Zeitpunkt nach subcutaner Hirulog-8-Injektion (d.h. nach 15 Minuten) der APTT-Wert im Vergleich zur Kontrolle um etwa 200% erhöhte. Bei subcutaner Darreichungsform verlängerte sich die Clearance auf eine Halbwertszeit von 340 Minuten. Es stellte sich heraus, daß subcutan injiziertes Hirulog-8 quantitativ adsorbiert wurde.

BEISPIEL 44

Wirkung von Hirulog-8 auf die disseminierte intravasculäre Gerinnung bei Pavianen als Modellsystem

Nach dem von F. B. Taylor et al. in J. Clin. Invest. 79 (1987), S. 918-925 beschriebenen Verfahren wurde in Pavianen Septikämie durch Injektion einer letalen Dosis lebender E. coli-Zellen induziert. Die Infusion von Hirulog-8 in einer Dosis von 0,08 mg/kg/Std. erfolgte in einem Zeitraum, der 15 Minuten vor Infektion mit E. coli begann und 6 Stunden nach Injektion endete. In Abwesenheit von Hirulog-8 führte der E. coli-induzierte septische Schock zu einer deutlichen Abnahme der Zahl neutrophiler Zellen, des Blutdruckes und des Hämatokrit-Wertes. Kontroll-Tiere zeigten nach 3 Stunden eine Abnahme des Hämatokrit-Wertes bis auf 70% der Grundlinie und einen Rückgang des Blutdruckes auf 20% der Grundlinie. Eine Verabreichung von Hirulog-8 hob den Rückgang des Hämatokritwertes vollständig auf und beschränkte die Abnahme des Blutdruckes auf 60% der Grundlinie.
Trotz der DIC-Abschwächung durch Hirulog-8 führte die Infusion einer letalen E. coli-Dosis zur Häufung von Erkrankungen. Eine sowohl a n Kontrolltieren als auch an mit Hirulog-8 behandelten Tieren durchgeführte Autopsie zeigte in beiden Gruppen massive Gewebsödeme. Jedoch zeigte nur die Kontrollgruppe intravasculäre Thrombose. Die Autopsie-Ergebnisse zeigen, daß es nicht ausreicht, zur Verhinderung der durch den septischen Schock hervorgerufenen Erkrankungshäufigkeit nur die coagulopathische Septikämie-Stufe zu unterbrechen.

BEISPIEL 45

Wirkung einer Kombination aus tPA und Hirulog-8 auf die Thrombusauflösung

Zur Bestimmung der Wirkung von Hirulog-8 auf die Verstärkung einer tPA- induzierten Thrombusauflösung wurden Ratten als Modellsystem für arterielle Thrombolyse verwendet. Bei diesem Modellsystem wurde in der Bauchaorta nach Freilegung mittels Ballonkatheter und hochgradiger Stenose (95%) experimentell ein Thrombus gebildet. Blutströmung und Blutdruck wurden distal zur Stelle der Verletzung und Stenose aufgezeichnet. Nach dem Zufallsprinzip erhielten die Ratten tPA (1,0 mg/kg auf einmal injiziert und anschließend eine Infusion in einer Dosis von 1,0 mg/kg/Std.) zusammen mit einem der folgenden Mittel: physiologische Kochsalzlösung, Heparin (10 E/kg auf einmal injiziert, anschließend eine Infusion in einer Dosis von 1,5 E/kg/min), rekombinantes Hirudin (1,0 mg/kg auf einmal injiziert, anschließend eine Infusion in einer Dosis von 0,02 mg/kg/Std.) oder Hirulog-8 (0,6 mg/kg auf einmal injiziert, anschließend eine Infusion in einer Dosis von 0,02 mg/kg/Std.). Das antithrombotische Mittel sowie die Kochsalzlösung wurden gleichzeitig mit tPA und weitere 50 Minuten nach Beendigung der tPA- Infusion verabreicht.
Figur 16 stellt die Ergebnisse dieser Experimente dar. Bei Tieren, die mit tPA und Kochsalzlösung behandelt worden waren, betrug die Zeit bis zur erneuten Durchblutung 16,2 Minuten. Durch Heparin wurde die Zeit bis zur erneuten Durchblutung auf 12,2 Minuten verringert, während rekombinantes Hirudin diese Zeit auf 13,0 Minuten reduzierte. Die Verkürzung der Zeit war in keinem Fall statistisch signifikant (p < 0,05). Die Kombination von Hirulog-8 mit TtPA verkürzte die Zeit bis zur erneuten Durchblutung signifikant auf 4,4 Minuten (p < 0,01), wobei die fibrinolytische Wirkung von tPA um den Faktor 4 erhöht wurde.
Im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen verhinderten sowohl Heparin, Hirudin als auch Hirulog-8 signifikant einen erneuten Gefäßverschluß (Figur 17). Jedes dieser Mittel verlängerte die APTT- Zeiten auf Werte, die im Vergleich zu den Kontrollwerten bei 600%, 500% bzw. 400% lagen (Figur 18). Schließlich erhöhten Heparin, Hirudin und Hirulog-8 die Gefäßdurchgängigkeits-Zeit auf Werte von 80,2%, 82% bzw. 93,1% (Kontrolle = 43,6%) (Figur 19). Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren anderen bekannten antithrombotischen Mitteln bei der Erhöhung der tPA-Wirksamkeit überlegen sind.

BEISPIEL 46

Wirkung von Hirulog-8 und anderen antithrombotischen Mitteln auf die Blutungszeiten bei Pavianen

Zur Bestimmung der Hirulog-8-Wirkung auf die Hämostase wurde die Schablonen-Blutungszeit-Messung angewendet.
Verschiedene Hirulog-8-Dosen (0,002 mg/kg/min bis 0,2 mg/kg/min) wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Blutungszeit untersucht. Dosen von 0,002 mg/kg/min bis 0,04 mg/kg/min verursachten keine signifikante Erhöhung der Blutungszeit. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 20 dargestellt. In einer Dosis von 0,1 mg/kg/min führte Hirulog-8 verglichen mit Kontrollwerten zu einer zweifachen Erhöhung der Blutungszeit. Bei 0,2 mg Hirulog-8/kg/min erhöhte sich die Blutungszeit um das Dreifache der Kontrollwerte. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß zur Hemmung der Blutplättchen-abhängigen Thrombose erforderliche Dosen (0,002 mg/kg/min; vgl. Beispiel 40) keine signifikante Wirkung auf die Bildung eines blutstillenden Propfes haben.
Die Wirkungen verschiedener anderer Mittel sowohl auf die Blutungszeiten bei Pavianen als auch auf systemische gerinnungshemmende Wirkungen wurden (durch Bestimmung der APTT-Werte) getestet. Diese Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt: Mittel APTT (% Kontrolle) Blutungszeit (min) Hirulog-8 rekombinantes Hirudin Gyki 14,451 Benzamidin Argipidin (MD805) Heparin

BEISPIEL 47

Synthese von Hirulog-34

Hirulog-34 hat die Formel: H(- -Phe)-Pro-Arg-(tetraethylenglykolylsuccinyl)-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Tyr-Leu-OH. Das Dekapeptid Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu wurde wie vorstehend beschrieben synthesiert und bleib an das Harz gebunden. Der restliche Teil des Moleküls wurde mittels des nachstehend dargestellten und beschriebenen Reaktionsschemas synthetisiert.

Nα-BOC-(D-Phe)-Pro-Ng, Ng-(Cbz)&sub2;-Arg

Nα-BOC-Ng-(Cbz)&sub2;-Arg (Bachem, Inc., Torrance, CA) wurde mit einem Überschuß an Diazomethan in Ether umgesetzt und danach zur Entfernung der Nα-BOC-Gruppe mit einer Säure behandelt. Das erhaltene Produkt Ng, Ng- (Cbz)&sub2;-Argininmethylester wurde dann in DMF gelöst, in einem Eisbad gekühlt und nacheinander mit 2 Äquivalenten Nα-BOC-prolin, 1 Äquivalent Butanol, 1 Äquivalent EDCI und 1 Äquivalent Diisopropylethylamin behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt, dann mit 5 Volumina kaltem Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde gewonnen und nacheinander mit gesättigter Citronensäure-, gesättigter NaHCO&sub3;- und gesättigter NaCl-Lösung in jeweils gleicher Menge gewaschen. Das Produkt wurde danach über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das erhaltene Dipeptid-Zwischenprodukt Nα-BOC-(D-Phe)-Pro-Ng,Ng-(Cbz)&sub2;- argininmethylester wurde 30 Minuten mit einem 10fachen molaren Überschuß an 4 HCl/Dioxan behandelt. Freie HCl wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in wasserfreiem DMF gelöst. Das Produkt wurde danach im Eisbad gekühlt und wie vorstehend beschrieben mit 2 Äquivalenten Nα-BOC-( -Phe) in Gegenwart von Butanol, EDCI und Diisopropylethylamin umgesetzt. Das orthogonal geschützte Roh-Tripeptid wurde wie vorstehend beschrieben isoliert und auf einer Kieselgel-Säule gereinigt, wobei die Elution mit 0,1% NH&sub4;OH enthaltendem Chloroform : Methanol (95:5) durchgeführt wurde. Der Nα-BOC-( )-phenylalanylpropyl-Ng,Ng-(Cbz)&sub2;-argininmethylester wurde danach mit 2 Äquivalenten LiOH in Methanol : Wasser (2:1) 3 Stunden bei Raumtemperatur verseift. Methanol wurde im Vakuum entfernt und die wäßrige Lösung mit 2 Volumina Diethylether gewaschen. Die Lösung wurde dann mit gesättigter Citronensäure bis auf einen pH-Wert von 3 angesäuert. Die erhaltene freie Säure des Roh-Tripeptids wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit 3 Volumina einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das erhaltene Nα-BOC-( )-phenylalanylprolyl-Ng,Ng-(Cbz)&sub2;-arginin wurde mittels Umkehrphasen-HPLC unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen aufgereinigt.

NαBOC-(D)-phenylalanyldrolyl-Ng,Ng(Cbz)&sub2;-arginin-tetraethylenglykolester

Eine Lösung des vorstehend erhaltenen Tripeptids wurde in THF gelöst und mit 1,5 Äquivalenten Tetraethylenglykol in Gegenwart von jeweils 1 Äquivalent Diethylazodicarboxylat und Triphenylphosphin verestert, wie von O. Mitsunobu in "The Use of Diethylazodicarboxylate and Triphenylphosphine in Synthesis and Transformation of Natural Products", Synthesis (1981), S. x1- 28, wobei die Offenbarung dieser Veröffentlichung durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist, beschrieben.

Nα-BOC-(D)-Dhenylalanyldrolyl-Ng,Ng(Cbz)&sub2;-arginin-tetraethylenglykolylhemisuccinat

Die erhaltene Verbindung wurde in DMF gelöst und mit 1 Äquivalent Bernsteinsäure-Anhydrid in Gegenwart von 1 Äquivalent Dusopropyl ethylamin verestert. Die flüchtigen Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und die freie Säure mittels Umkehrphasen-HPLC unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen aufgereinigt.

Nα-BOC-(D)-phenylalanylprolyl-Ng,Ng(Cbz)&sub2;-arginin-tetraethylenglykolylhemisuccinat-N-hydroxysuccinimid-ester

Eine Lösung der vorstehend erhaltenen Säure wurde mit 1 Äquivalent N- Hydroxysuccinimid in DMF gemischt, im Eisbad gekühlt und mit einem tropfenweise zugesetzten Äquivalent DCC in DMF gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, zur Entfernung von präzipitiertem Dicyclohexylharnstoff gefiltert und im Vakuum konzentriert. Die Lösung wurde mit kaltem Benzol/Hexan konzentriert, wobei das mit N-Hydroxysuccinimid-ester konjugierte Roh-Peptid-Glykol erhalten wurde.
Die vorstehend erhaltene Verbindung wurde wie in Beispiel 21 beschrieben mit dem harzgebundenen Dodekapeptid umgesetzt. Das daraus resultierende Hirulog-34 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben vom Harz abgespalten, gereinigt und charakterisiert.
Obwohl vorstehend eine Anzahl von Ausführungsformen der Erfindung vorgestellt worden sind, ist klar, daß die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung vorgenommene grundlegende Konstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen zu erhalten, bei denen erfindungsgemäße Moleküle, Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden. Deshalb wird der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung durch die angefügten Patentansprüche festgelegt und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen, die im vorliegenden Text nur als Beispiel dienen.

Claims

1. Thrombininhibitor, umfassend:

a) eine gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit, die an die aktive Stelle von Thrombin bindet und diese inhibiert, wobei die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit ausgewählt ist aus Serinproteinase-Inhibitoren, heterocyclischen Proteaseinhibitoren, Thrombin-spezifischen Inhibitoren, Übergangszustandanalogen, Benzamidin, DAPA, NAPAP, Argipidin oder Einheiten mit den Formeln X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Y oder X-C&sub1;-C&sub2;-A&sub3;-Y, wobei X ein Wasserstoffatom darstellt oder durch eine aus 1 bis 35 Atomen bestehende Grundgerüstkette gekennzeichnet ist, A&sub1; Arg, Lys oder Orn darstellt, A&sub2; eine Nicht- Amidbindung ist, A&sub3; durch eine aus 1 bis 9 Atomen bestehende Grundgerüstkette gekennzeichnet ist, Y eine Bindung ist, C&sub1; ein Derivat von Arg, Lys oder Orn darstellt, das eine Carboxylateinheit umfaßt, die reduziert ist oder vom α-Kohlenstoff durch eine Einheit verdrängt ist, die durch eine aus 1 bis 10 Atomen bestehende Grundgerüstkette gekennzeichnet ist, und C&sub2; eine nicht-spaltbare Bindung ist;

b) eine Linkereinheit, die durch eine Grundgerüstkette mit einer berechneten Länge zwischen etwa 18 Å und etwa 42 Å gekennzeichnet ist; und

c) eine mit einer außenliegenden Anionenbindungsstelle assoziierende Einheit, die an die außenliegende Anionenbindungsstelle von Thrombin bindet, wobei die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit an die Linkereinheit und die Linkereinheit an die mit der außenliegenden Anionenbindungsstelle assoziierende Einheit gebunden ist.

2. Thrombininhibitor nach Anspruch 1, wobei die mit der außenliegenden Anionenbindungsstelle assoziierende Einheit die Formel aufweist:

W-B&sub1;-B&sub2;-B&sub3;-B&sub4;-B&sub5;-B&sub6;-B&sub7;-B&sub8;-Z;

wobei W eine Bindung darstellt, B&sub1; eine anionische Aminosäure, B&sub2; eine beliebige Aminosäure, B&sub3; Ile, Val, Leu, Nle oder Phe, B&sub4; Pro, Hyp, 3,4-Dehydropro, Thiazolidin 4-carboxylat, Sar, eine beliebige N-Methylaminosäure oder D-Ala, B&sub5; eine anionische Aminosäure, B&sub6; eine anionische Aminosäure, B&sub7; eine lipophile Aminosäure, ausgewählt aus Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha, Pro oder einem Dipeptid, das aus einer dieser lipophilen Aminosäuren und einer beliebigen Aminosäure besteht, B&sub8; eine Bindung oder ein Peptid, das 1 bis 5 beliebige Aminosäurereste enthält, und Z einen carboxyterminalen Rest bedeutet, ausgewählt aus einer OH-Gruppe, einem C&sub1;-C&sub6;- Alkoxy-, Amino-, Mono- oder Di-(C&sub1;-C&sub4;)-alkylsubstituierten Amino- oder Benzylaminorest.

3. Thrombininhibitor nach Anspruch 2, wobei B&sub1; Glu, B&sub2; Glu, B&sub3; Ile, B&sub4; Pro, B&sub5; Glu, B&sub6; Glu, B&sub7; Tyr-Leu, Tyr(SO&sub3;H)- Leu, Tyr(OSO&sub3;H)-Leu oder (3,5-Diiod-Tyr)-Leu, B&sub8; eine Bindung und Z eine OH-Gruppe darstellt.

4. Thrombininhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wo bei die Grundgerüstkette der Linkereinheit aus einer beliebigen Kombination von Atomen besteht, ausgewählt aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Sauerstoffatomen.

5. Thrombininhibitor nach Anspruch 4, wobei der Linker die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe umfaßt.

6. Thrombininhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit reversibel an Thrombin bindet und von diesem langsam gespalten wird.

7. Thrombininhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit reversibel an Thrombin bindet und von diesem nicht gespalten werden kann.

8. Thrombininhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, woneo die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit irrebersibel an Thrombin bindet.

9. Thrombininhibitor nach Anspruch 6, wobei die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit die Formel

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Y

aufweist.

10. Thrombininhibitor nach Anspruch 9, wobei X D-Phe-Pro, A&sub1; Arg und A&sub3; D-Pro, Pro oder Sar darstellt.

11. Thrombininhibitor nach Anspruch 10, wobei der Thrombininhibitor ausgewählt ist aus Hirulog-8 oder Hirulog- 12.

12. Thrombininhibitor nach Anspruch 9, wobei X N-Acetyl-Gly- Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val, A&sub1; Arg und A&sub3; Pro darstellt, wobei der Thrombininhibitor Hirulog-33 ist.

13. Thrombininhibitor nach Anspruch 7, wobei die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit die Formel

X-C&sub1;-C&sub2;-A&sub3;-Y

aufweist.

14. Thrombininhibitor nach Anspruch 13, ausgewählt aus Hirulog-18a oder Hirulog-18b.

15. Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung zur Hemmung einer Thrombin-vermittelten Funktion in einem Patienten oder in Blut außerhalb des Körpers, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Thrombininhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

16. Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die pharmazeutisch wirksame Menge etwa 1 µg/kg Körpergewicht/Tag bis etwa 5 mg/kg Körpergewicht/Tag beträgt.

17. Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die pharmazeutisch wirksame Menge etwa 10 µg/kg Körpergewicht/Tag bis etwa 500 µg/kg Körpergewicht/Tag beträgt.

18. Thrombininhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Inhibitor mit einem Radioisotop markiert ist.

19. Thrombininhibitor nach Anspruch 18, wobei das Radioisotop ausgewählt ist aus ¹²³I, ¹²&sup5;I oder ¹¹¹In.

20. Zusammensetzung zur bildlichen Darstellung eines Fibrin- oder Blutplättchenthrombus in einem Patienten ex vivo, wobei die Zusammensetzung einen pharmazeutisch verträglichen Puffer und einen Thrombininhibitor nach Anspruch 18 oder 19 umfaßt.

21. Verfahren zur bildlichen Darstellung eines Fibrin- oder Blutplättchenthrombus in einem Patienten ex vivo, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Verabreichen einer Zusammensetzung nach Anspruch 20 an den Patienten; und

(b) Verwendung von Nachweismitteln, um den in der Zusammensetzung vorhandenen Thrombininhibitor nachzuweisen.

22. Zusammensetzung zur Beschichtung der Oberfläche einer invasiven Vorrichtung, die in einen Patienten eingeführt werden soll, wobei die Zusammensetzung einen geeigneten Puffer und mindestens einen Thrombininhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfaßt.

23. Verfahren zur Beschichtung der Oberfläche einer invasiven Vorrichtung, die in einen Patienten eingeführt werden soll, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens der Oberfläche mit einer Zusammensetzung nach Anspruch 22 umfaßt.

24. Pharmazeutisch wirksame Kombination zur Behandlung oder Verhütung thrombotischer Erkrankungen in einem Patienten, umfassend:

a) einen Thrombininhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 14;

b) ein thrombolytisches Mittel; und

c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

25. Pharmazeutisch wirksame Kombination nach Anspruch 24, wobei der Thrombininhibitor Hirulog-8 und das thrombolytische Mittel TPA ist.

26. Kombination nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Tagesdo sis des Thrombininhibitors etwa 1 µg/kg Körpergewicht bis etwa 5 mg/kg Körpergewicht und die Tagesdosis des thrombolytischen Mittels etwa 10 % bis etwa 80 % des üblichen Dosierungsbereichs des thrombolytischen Mittels beträgt.

27. Kombination nach Anspruch 26, wobei die Tagesdosis des Thrombininhibitors etwa 10 µg/kg Körpergewicht bis etwa 500 µg/kg Körpergewicht und die Tagesdosis des thrombolytischen Mittels etwa 10 % bis etwa 70 % des üblichen Dosierungsbereichs des thrombolytischen Mittels beträgt.

28. Verfahren nach Anspruch 21 oder 23, wobei der Patient ein Mensch ist.

29. Thrombininhibitor nach Anspruch 2, wobei die Linkereinheit durch eine Grundgerüstkette mit einer berechneten Länge zwischen etwa 18 Å und 36 Å gekennzeichnet ist und ausgewählt ist aus einem Acylrest mit etwa 17 bis 35 Kohlenstoffatomen, einem Carbobenzyloxy- oder t-Butyloxycarbonylrest, einem Alkylrest mit 17 bis 35 Grundgerüstbindungen, einem etwa 6 bis 12 beliebige Aminosäurereste enthaltenden Peptid oder Kombinationen davon.

30. Thrombininhibitor nach Anspruch 3, wobei B&sub7; Tyr(SO&sub3;H)-Leu oder Tyr(OSO&sub3;H)-Leu darstellt;

der Linker ein Peptid mit etwa 8 bis 10 Aminosäuren ist, wobei die der außenliegenden Anionenbindungsstelleneinheit am nächsten liegende Aminosäure des Linkers Phe ist; und

die gegen die katalytische Stelle gerichtete Einheit die Formel

X-Arg-R

aufweist, wobei X ausgewählt ist aus D-Phe-Pro oder Tosyl-Gly; und R ausgewählt ist aus Pro, Sar oder N-Methyl-Ala.