DE69016432T2

DE69016432T2 - Verfahren zur herstellung menschlicher adhärenter lymphokin-aktivierter killerzellen (alak).

Info

Publication number: DE69016432T2
Application number: DE69016432T
Authority: DE
Inventors: Kam Leung
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1989-07-21
Filing date: 1990-07-17
Publication date: 1995-07-06
Anticipated expiration: 2010-07-18
Also published as: EP0483216B1; DE69016432D1; WO1991001369A1; ATE117721T1; CA2064072A1; JPH05504883A; EP0483216A1; AU6044090A

Description

Hintergrund der Erfindung

Natürliche Killerzellen (NK) und lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK) wurden mit der Immunüberwachung gegen Tumorzellen in Verbindung gebracht (Barlozzari et al. (1983) J. Immunol. 131:1024; Rayner et al. (1985) Cancer 55:1327). Es wurde berichtet, daß die systemische Verabreichung von autologen LAK-Zellen und IL-2 an Patienten mit bestimmten fortgeschrittenen Krebsen günstig ist (Rosenberg (1988) Immunology Today 9:58). LAK-Zellen wurden in Konzentrationen von bis zu 1 x 106 Zellen/ml, jedoch nicht darüber hinaus, hergestellt. Das Verfahren der Herstellung von LAK- Zellen für die Krebstherapie ist sehr aufwendig und mühsam, da für die Behandlung jedes Patienten eine große Zahl von Zellen benötigt wird. Außerdem ist die Eehandlung von Krebspatienten durch LAK/IL2-Therapie mit erheblichen Toxizitäten verbunden (Rosenberg et al. (1987) N. Engl. J. Med. 316:889).
Es wurde bereits gezeigt, daß Monocyten die Erzeugung von LAK- Aktivität durch IL-2 stören (Hoyer et al. (1986) Cancer Res. 46:2834). Es wurde gezeigt, daß L-Leucinmethylester (LeuOMe) und L-Phenylalaninmethylester (PME) Monocyten aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen (PBMC) entfernen (Thiele und Lipsky (1985) J. Immunol. 134:786; Hoyer et al. (1986) Cancer Res. 46:2834). Weiterhin dünnte LeuOMe auch die NK-Aktivität und NK-Zellen aus (Thiele und Lipsky (1985) J. Immunol. 134:786; Hoyer et al. (1986) Cancer Res. 46:2834). Wir haben gezeigt, daß die Ausdünnung von Monocyten durch PME die Erzeugung von LAK- Zellen durch rIL-2 mit Zelldichten von 5 x 106 Zellen/ml oder höher erlaubt (EP-A-0 247 613, veröffentlicht am 2. Dezember 1987, und die zur Erteilung vorgesehene U.S.-Anmeldung 07/038361, eingereicht am 20. April 1987)
Kürzlich wurde berichtet, daß eine hoch angereicherte Population von LAK-Zellen erhalten werden kann, indem man "haftende" LAK- Zellen (A-LAK) ausselektiert, die durch Anhaften von 24-h-IL-2- aktivierten und Monocyten-ausgedünnten PBMC an Kunststoff isoliert werden (Melder et al. (1988) Cancer Res. 48:346). Diese Zellen sind hochgradig proliferierend und cytotoxisch und sind an Leu-19-positiven Zellen angereichert; die Leu-19-Expression korreliert mit der NK- und LAK-Aktivität. Die potentiellen Vorteile für und die Bedeutung von A-LAK-Zellen bei der passiven Immuntherapie bei Menschen sind: A-LAK-Zellpräparate sind relativ an LAK-Zellen angereichert, mit höherem Grad von Antitumoraktivität; A-LAK-Zellen können in Dosen wirksam sein, die geringere Zahlen von Zellen enthalten als bei der konventionellen LAK- Therapie; es kann weniger IL-2 für die gleichzeitige Verabreichung mit A-LAK-Zellen an Patienten erforderlich sein, wodurch die Toxizität der Therapie reduziert wird.
In früheren Verfahren zur Herstellung von A-LAK-Zellen werden Monocyten durch ihre Haftung an Nylon-Wolle-Säulen (Melder et al. Cancer Immunol. Immunother. (1989) 29:67-73) oder durch zentrifugale Ausschlämmung entfernt, um A-LAK-Zellen zu erzeugen (Melder et al. (1988) Cancer Res. 48:34). Diese Verfahren zur Entfernung von Monocyten sind aufwendig und kompliziert. Außerdem können manche LAK-Zell-Vorstufen an den Nylon-Wolle-Säulen haften, was die Effizienz des Verfahrens zur Erzeugung von A-LAK reduziert.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung haftender (adherent) lymphokinaktivierter Killerzellen (A-LAK) bereit. Das Verfahren umfaßt:
a. Behandeln peripherer einkerniger Blutzellen (PBMC), um Monocyten auszudünnen;
b. Kultivieren der übrigen Zellen in IL-2-haltigem Kulturmedium, um lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK) zu erzeugen, in einem Kunststoffbehälter, an dem ein Teil der LAK-Zellen haftet;
c. Entfernen der nicht anhaftenden Zellen;
d. Kultivieren der anhaftenden LAK-Zellen in IL-2-haltigem Medium, um die anhaftenden LAK-Zellen zu vermehren. Die Verbesserung umfaßt in Schritt a das Ausdünnen der Monocyten auf 1-19% der gesamten Zellen durch Behandlung der PBMC mit einem L-Phenylalaninmethylester (PME) oder Phenylalaninamid.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Verwendung von PME oder anderer Niederalkylaminosäureester in einem Verfahren zur Herstellung von LAK-Zellen ist offenbart in EP-A-0 247 613, veröffentlicht am 2. Dezember 1987, und in der zur Erteilung vorgesehenen U.S.-Anmeldung 07/038361, eingereicht am 20. April 1987.
Wir setzten PME mit Konzentrationen von 1 bis 5 mM als einzelnen Schritt für die Ausdünnung der Monocyten ein. Wir entdeckten, daß es möglich ist, A-LAK aus PME-behandelten PBMC zu erzeugen.
Wir fanden, daß die Behandlung von PBMC mit PME vor der Kultivierung der A-LAK-Zellen in Kunststoffbehältern zu einer wesentlichen Erhöhung des Ausmaßes der Vermehrung der A-LAK-Zellen im Vergleich zur Erhöhung der Zellzahl, die man ohne PME-Behandlung erhält, führt. Während der Vermehrung der A-LAK-Zellen nach der Behandlung mit PME bleibt die LAK-Zellen-funktionelle cytolytische Aktivität hoch. Es wurde auch gefunden, daß die bei dem Verfahren verwendete optimale PME-Konzentration hinsichtlich der Maximierung der Vermehrung der A-LAK-Zellen von der Zelldichte abhängt, mit der die A-LAK-Zellen zuerst in den Kunststoffbehältern kultiviert wurden. Bei einer Zellkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml war die optimale PME-Konzentration 1 mM; bei einer Zelldichte von 1 x 10&sup7; Zellen/ml war die optimale PME-Konzentration 5 mM.
Die Ergebnisse legen nahe, daß PME eine Teilgruppe von PBMC ausdünnt, die die Vermehrung von A-LAK-Zellen hemmt und daß bei höheren PME-Konzentrationen eine andere PBMC-Teilgruppe, die die Vermehrung der A-LAK-Zellen verstärkt, ausgedünnt wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein verbessertes Verfahren zur Vermehrung und Anreicherung Leu-19-positiver Lymphocyten mit hoher lytischer Aktivität. PBMC werden zuerst mit PME behandelt, um Monocyten und andere PME-empfindliche Zellen zu entfernen. Die resultierenden Lymphocyten werden 1 bis 2 Tage in Kunststoffflaschen mit rIL-2 inkubiert. Die anhaftenden Zellen werden dann 8 bis 21 Tage lang kultiviert, um eine Erhöhung der Zellenzahl und der LAK-Aktivität zu erhalten. Die während des A-LAK-Herstellungsverfahrens einschließlich des Monocytenausdünnungsschrittes verwendeten Zelldichten betragen vorzugsweise 5 x 106 bis 2 x 10&sup7; Zellen/ml, noch bevorzugter 1 x 10&sup7; bis 2 x 10&sup7; Zellen/ml.
Wir fanden auch, daß A-LAK-Zellen aus mit Phenylalaninamid (PheNH&sub2;) behandelten PBMC erzeugt werden können. Unser Verfahren unter Verwendung von PME besitzt mehrere wesentliche Unterschiede und wichtige Vorteile gegenüber den früher verwendeten Verfahren zur Herstellung von A-LAK-Zellen (Melder et al. (1988) Cancer Res. 48:3461-3469). Erstens verwendeten wir PME als chemisches Mittel, um Monocyten aus PBMC auszudünnen. Dieses Verfahren kann über PME-Konzentration und Zeit der Inkubation mit PME besser gesteuert werden, als man es mit Hilfe des Nylon-Wolle-Verfahrens erreichen kann. Die PME-Behandlung von PBMC ist auch viel bequemer und weniger zeitraubend als die zentrifugale Ausschlämmung, die einen umständlichen Aufbau, einen Sterilisierungsvorgang und die Durchführung der Ausschlämmung erfordert. Zweitens werden die Lymphocyten im Verfahren der Erfindung in Kunststoffbehältern mit einer Zelldichte von 1 bis 2 x 10&sup7;/ml kultiviert im Vergleich zu 2 x 10&sup6;/ml, die bisher verwendet wurde. Das vorliegende Verfahren reduziert also das Gesamtvolumen des verwendeten Mediums im Vergleich zu früheren Verfahren zur Herstellung von A-LAK-Zellen um den Faktor 5 bis 10. Drittens ergab die hohe Zelldichte (1 x 10&sup7;/ml) im allgemeinen eine zuverlässigere Vermehrung als eine geringe Zelldichte (1 x 10&sup6;/ml). Viertens können angereicherte A-LAK-Zellen aus PBMC erzeugt werden, die völlig von Monocyten befreit sind, sie sind jedoch nicht so proliferierend. Das Ausmaß der Monocytenausdünnung kann über die zur Behandlung der PBMC verwendete PME-Konzentration präzise gesteuert werden. Wie oben beschrieben, kann das Ausmaß der Monocytenausdünnung bei Verwendung des Ausschlämmungs- und/oder Nylon-Wolle-Säulenverfahrens zur Ausdünnung von Monocyten nicht leicht gesteuert werden.
A-LAK-Zellen können von Kunststoffflaschen losgelöst und zur Kultur in DuPont SteriCell -Beutel (Dupont) übertragen werden. A-LAK-Zellen können in serumfreiem Medium, wie AIM-V, erzeugt und kultiviert werden. Das Verfahren unter Verwendung PME-behandelter PBMC bietet sich gut für ein Verfahren an, bei dem relativ große Blutvolumina und Zellenzahlen erforderlich sind, wie es bei der passiven Immuntherapie der Fall ist. Weiterhin sind die A-LAK- Zellen an den cytotoxischen und proliferierenden Zellen hoch angereichert. Die Verwendung von A-LAK-Zellen bei der passiven Immuntherapie sollte zu einem besseren Verständnis der Bedeutung von LAK-Zellen bei der Immunüberwachung von Tumorzellen und bei der menschlichen Krebstherapie führen.

Beispiel 1

Wir untersuchten die Erzeugung von A-LAK-Zellen aus mit PME behandelten PBMC. PBMC wurden mit 1 oder 5 mM PME behandelt und 1 Tag bei 2 x 10&sup6; Zellen/ml oder 1 x 10&sup7; Zellen/ml mit rIL-2 in Kunststoffflaschen kultiviert (Tabelle 1). Nicht anhaftende (NA) Zellen wurden entfernt und an den Flaschen anhaftende Zellen wurden 8 Tage mit den rIL-2-haltigen konditionierten Medien kultiviert. Die resultierenden A-LAK-Zellen waren gegenüber &sup5;¹Cr-markierten K562- und Raji-Zielzellen cytotoxisch. A-LAK-Zellen sind auch hochgradig proliferierend und haben einen hohen prozentualen Anteil des Leu-19-Phänotyps von NK- und LAK-Zellen. Bei der geringen Zelldichte (2 x 10&sup6; Zellen/ml) führte die partielle Ausdünnung von Monocyten durch 1 mM PME zu stärkerem Zellwachstum von A-LAK-Zellen, als mit Hilfe von 5 mM PME erhalten wurde. Bei der hohen Zelldichte (1 x 10&sup7; Zellen/ml) führten 5 mM PME zu stärkerem Zellwachstum als 1 mM PME. Sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Zelldichten wurde bei den mit 1 mM PME behandelten PBMC ein stärkeres Zellwachstum beobachtet als bei den unbehandelten PBMC. Unsere Ergebnisse zeigen, daß die PME-Behandlung von PBMC ein wirkungsvolles Mittel bereitstellt, um A-LAK-Zellen für die passive Immuntherapie zu erzeugen. Tabelle 1 Erzeugung von A-LAK-Zellen aus PBMC, die mit verschiedenen Konzentrationen von PME behandelt wurden Zelldichte % Monocyten vor der Kultur LAK-Aktivität (% Lyse) Vermehrungsfaktor
PBMC wurden bei einer Konzentration von 1 x 10&sup7; Zellen/ml 40 min mit 0, 1 oder 5 mM PME behandelt. Die verschiedenen Zellpräparate (30 ml) wurden dann bei Gesamtzelldichten von 2 x 106 Zellen/ml oder 1 x 10&sup7; Zellen/ml über Nacht in T75-Flaschen mit 400 E/ml rIL-2 inkubiert. Das Kulturmedium, das nicht anhaftende Zellen enthielt, wurde entfernt, die nicht anhaftenden Zellen wurden aus dem Medium abgetrennt, das Medium wurde in die Flaschen zurückgegeben, und die anhaftenden (A) Zellen wurden kultiviert. Die gezeigten Daten gelten für 8 Tage lang kultivierte Zellen. Das gezeigte E:T-Verhältnis beträgt 5:1 für die LAK-Aktivität gegen Raji-Zellen.

Beispiel 2

PBMC wurden bei einer Zelldichte von 2 x 10&sup6;/ml, 5 x 10&sup6;/ml oder 1 x 10&sup7;/ml 5 mM PME behandelt und über Nacht mit 400 E/ml rIL-2 inkubiert. IL-2-Einheiten E sind BRMP-Einheiten (Biological Response Modifier Program). Nicht anhaftende Zellen wurden aus den Flaschen dekantiert. Die anhaftenden Zellen in den Flaschen wurden gewaschen und gezählt. Konditioniertes Medium (100%) wurde zur Kultur zurück in die Flaschen gegeben. Die Anzahl der Zellen, die an den Flaschen haftete, nahm mit der anfänglichen Dichte der anhaf tenden Zellen zu. Nach 10 Tagen Kultur waren die LAK-Aktivität und der Prozentsatz an Leu-19-positiven Zellen bei den drei Dichten anhaftender Zellen im wesentlichen dieselben. Es wurde jedoch gefunden, daß der Vermehrungsfaktor mit steigender während des Verfahrens verwendeter Zelldichte zunahm. Tabelle 2 Erzeugung von A-LAK-Zellen aus PBMC, die mit PME behandelt wurden, bei verschiedenen Zelldichten Zelldichte insgesamt anhaftende Zellen LAK-Aktivität (% Lyse) Vermehrungsfaktor
PBMC wurden bei den verschiedenen Zelldichten mit 5 mM PME behandelt und über Nacht mit 400 E/ml rIL-2 inkubiert. NA-Zellen wurden bei 1 x 10&sup6;/ml mit 400 E/ml rIL-2 kultiviert. Das Kulturmedium, das nicht anhaftende Zellen enthielt, wurde entfernt, die nicht anhaftenden Zellen wurden aus dem Medium abgetrennt, das Medium wurde in die Flaschen zurückgegeben, und die anhaftenden (A) Zellen wurden kultiviert. Die gezeigten Daten gelten für 10 Tage lang kultivierte Zellen. Das gezeigte E:T-Verhältnis beträgt 5:1 für die LAK-Aktivität gegen Raji-Zellen.

Beispiel 3

Wir fanden, daß auch L-Phenylalaninamid (PheNH&sub2;) Monocyten ausdünnt, ohne NK-Zellen zu beeinträchtigen. Die Erzeugung von A- LAK-Zellen aus PBMC, die mit PheNH&sub2; behandelt wurden, wurde mit derjenigen verglichen, die man mit Hilfe der PME-Behandlung erhielt. Wie in Tabelle 3 zusammengefaßt, waren der Prozentsatz an Leu-19-positiven Zellen und die LAK-Aktivität bei mit PheNH&sub2; behandelten PBMC nur geringfügig niedriger als bei mit PME behandelten PBMC. Die Anzahl der A-LAK-Zellen am achten Tag war jedoch im allgemeinen bei den mit PheNH&sub2; behandelten PBMC viel größer als bei den mit PME behandelten PBMC. Dieses Ergebnis kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß PheNH&sub2; bei 5 mM weniger wirksam in bezug auf das Ausdünnen der Monocyten ist als PME bei 5 mM. Vermutlich bleibt also eine größere Zahl von Monocyten in den mit PheNH&sub2; behandelten PBMC erhalten, und wie wir in Beispiel 1 gezeigt haben, scheint diese geringe Menge an Monocyten (1 bis 10% der Gesamtzellen) für eine maximale Vermehrung der A-LAK- Zellen optimal zu sein. Tabelle 3 Auswirkung von PheNH&sub2; auf die Erzeugung von A-LAK-Zellen Behandlung % Monocyten vor der Kultur Aktivität (% Lyse) Zellen/ml am 8. Tag Vermehrung
PBMC wurden mit 5 mM PME oder 5 mM PheNH&sub2; behandelt. Die A-LAK- Zellen wurden unter Verwendung einer Gesamtzelldichte der Kultur von 5 x 10&sup6; Zellen/ml erzeugt. Das gezeigte E:T-Verhältnis beträgt 5:1 für die LAK-Aktivität gegen Raji-Zellen.
Die gezeigten Daten beruhen auf vier verschiedenen Spendern.
NB = nicht behandelt.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen, mit PME und PheNH&sub2;, beschrieben wurde, lassen sich die beschriebenen Vorgehensweisen und Bedingungen auch auf die Verwendung beim A-LAK-Verfahren der anderen in der Kurzbeschreibung der Erfindung erwähnten Ester und Amide anwenden.

Claims

1. Verfahren zur Aktivierung und Vermehrung von Zellen zur Verwendung bei der passiven Immuntherapie, umfassend:

a. Behandeln peripherer einkerniger Blutzellen (PBMC), um Monocyten auszudünnen;

b. Kultivieren der übrigen Zellen in IL-2-haltigem Kulturmedium, um lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK) zu erzeugen, in einem Kunststoffbehälter, an dem ein Teil der LAK-Zellen haftet;

c. Entfernen der nicht anhaftenden Zellen;

d. Kultivieren der anhaftenden LAK-Zellen in IL-2- haltigem Medium, um die anhaftenden LAK-Zellen zu vermehren;

umfassend in Schritt a das Ausdünnen der Monocyten auf 1-19% der gesamten Zellen durch Behandlung der PBMC mit einem L-Phenylalaninmethylester oder Phenylalaninamid.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in Schritt a die PBMC bei einer Zellkonzentration im Bereich von 1 10&sup6; bis 2 10&sup7; Zellen pro ml mit dem Aminosäureester oder -amid einer Konzentration im Bereich von 1 bis 5 mM behandelt werden und in Schritt b die PBMC 1 bis 2 Tage bei einer Zellkonzentration im Bereich von 1 10&sup6; bis 2 10&sup7; Zellen pro ml kultiviert werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in Schritt b die PBMC in Kunststoffflaschen kultiviert werden und in Schritt d die anhaftenden LAK-Zellen 8 bis 21 Tage in derselben Kunststoffflasche oder in geschlossenen gasdurchlässigen Kunststoffbeuteln im Medium von Schritt b kultiviert werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei in Schritt a die PBMC- Konzentration 2 10&sup6; Zellen pro ml beträgt und die Zellen mit Phenylalaninmethylester oder Phenylalaninamid einer Konzentration von 1 mM behandelt werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei in Schritt a und b die PBMC-Konzentration im Bereich von 5 10&sup6; bis 2 10&sup7; Zellen pro ml liegt und in Schritt a die Zellen mit Phenylalaninmethylester oder Phenylalaninamid einer Konzentration von 5 mM behandelt werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei in Schritt a und b die PBMC-Konzentration im Bereich von 1 10&sup7; bis 2 10&sup7; Zellen pro ml liegt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei in Schritt a und b die PBMC-Konzentration 1 10&sup7; Zellen pro ml beträgt.