DE69014030T2

DE69014030T2 - Mittel für die Verhütung und Behandlung von Diarrhöe.

Info

Publication number: DE69014030T2
Application number: DE69014030T
Authority: DE
Inventors: Norimasa Onishi; Akihiro Yamashiro
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1989-09-05
Filing date: 1990-09-05
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2010-09-06
Also published as: DE69014030T3; EP0416892B1; US5540924A; EP0416892A1; US5372810A; DE69014030D1; EP0416892B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Diarrhöe. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Mittel zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Diarrhöe in beispielsweise dem Viehbestand, Geflügel, Haustieren usw..
Weiße Diarrhöe oder Diarrhöe während der Stillzeit stellt gegenwärtig eines der bedrohlichsten Probleme für Schweinezüchter dar. Etwa 45 bis 70 % der 2 bis 9 Wochen alten Schweine, die gesäugt und entwöhnt werden, leiden an weißer Diarrhöe oder Diarrhöe. Dies stellt in jeder Schweinezucht-Einheit ein bedrohliches Problem dar und führt aufgrund von Verlusten an Ferkeln, Tierarztkosten usw. zu empfindlichen finanziellen Einbußen.
Das Problem ist nicht nur auf solche Länder beschränkt, die ein niedrig entwickeltes Landwirtschaftswesen aufweisen, da es auch in höher entwickelten Ländern zu finden ist. Zur Vorbeugung gegen und zur Behandlung dieser Krankheit werden im allgemeinen Antibiotika, wie Sulfonamidpräparate oder dergleichen verwendet. In den letzten Jahren wurde jedoch der Einsatz von Antibiotika wegen des Auftretens von resistenten Bakterien und des Verbleibs der Chemikalien im Körper eingeschränkt.
Zur Vorbeugung gegen und Behandlung von weißer Diarrhöe/Diarrhöe im Viehbestand oder im Geflügel wurden als alternative Mittel zu Antibiotika Lebendbakterien-Zusammensetzungen entwickelt. Bei dieser Behandlungsart werden dem Vieh oder dem Geflügel geeignete Lebendbakterien, beispielsweise Escherichia coli, direkt verabreicht, wobei die verabreichten Bakterien im Darm der Tiere verbleiben und mit den schädlichen, enterotoxischen Bakterien in Wettstreit treten und diesen so entgegenwirken, wobei die enterotoxischen Bakterien während des Durchgangs der verabreichten Bakterien durch den Darm eliminiert werden. Auf diese Weise wird die bakterielle Mikroflora im Darm verbessert, so daß der Diarrhöe vorgebeugt und diese behandelt wird. Um wirksam zu sein ist es daher erforderlich, daß die Bakterien leben. Zur Verbesserung der physikochemischen Stabilität der Lebendbakterien-Zusammensetzung im Tierfutter und im Verdauungstrakt, wurden daher Beispiele über die Verwendung Sporen bildender Bakterien [Veterinarian and Stockbreeders, News, Nr. 695 (1979), 343; Journal of Japanese Veterinary Assoziation 30 (1977), 645] und über die Verwendung von Bakterien, die gegen eine Vielzahl von Arzneimitteln resistent sind, in Kombination mit Antibiotika als Futterzusatz gegeben [Bifidobakteria Microflora 4 (1985), 15].
Jedoch sind nur wenige der bekannten Lebendbakterien- Mittel sehr stabil. Ferner zeigt sich die Auswirkung, die durch diese bekannten Lebendbakterien-Mittel vermittelt wird, sehr spät, weil deren Effekt kraft ihrer Durchsetzung im Wettstreit mit der schädlichen Bakterienkolonie bewirkt wird.
EP-A-0 279 618 (Porter) offenbart ein Produkt vom probiotischen Typ zur Verbesserung der Wachstumsrate und der Wirksamkeit der Nahrungsumwandlung in jungen Tieren, das abgetötete Lactobazillen-, Streptokokken- oder B. subtilis-Zellen enthält.
Eine andere Zusammensetzung zur Vorbeugung gegen und Behandlung von weißer Diarrhöe/Diarrhöe im Viehbestand oder im Geflügel wurde vorgeschlagen, die als Wirkstoff das enzymatisch abgebaute Produkt der Zellwand von Bifidobakterium thermophilum umfaßt. Diese Spezies wird als Darmbakterium mit nützlichen Auswirkungen auf Tiere angesehen (siehe JP-A-56-108717 (offengelegt)). Es wird darüber hinaus berichtet, daß unter den Zellwand-Abbauprodukten von Bakterien, die der Gattung Bifidobakterium angehören, das Peptidoglycan der Wirkstoff ist (siehe JP- A-62-265231 (offengelegt)) . Glycan ist eine Komponente aller Bakterienzellwände und die allgemeine Struktur ist bei allen Spezien gleich. Die genaue Glycanstruktur der verschiedenen Mikrobenarten unterscheidet sich jedoch erheblich.
Der Mechanismus der Aktivität dieser Zusammensetzung unterscheidet sich von dem vorstehend beschriebener, herkömmlicher Lebendbakterien-Mittel, da die Wirkung anscheinend durch die Aktivierung des Immunsystems verursacht wird. Daher wird die Fähigkeit von Tieren einer Infektion zu widerstehen erhöht.
Die geschilderten Verfahren umfassen das Züchten geeigneter Bakterien, die im Darm von Tieren vorkommen, Isolieren des Wirkstoffs und das Verabreichen des Wirkstoffs an den Wirt. Bifidobakterium, das bei diesem Verfahren verwendet wird, ist ein strikt anaerobes Bakterium, das zur Unterstützung des bakterieIlen Zellwachstums eine von Sauerstoff freie Inkubationsumgebung benötigt. Diese Notwendigkeit macht die Inkubation schwierig und kompliziert. Zusätzlich werden für das Wachstum von Bifidobakterium teure Rohmaterialien, wie Vitamine usw. benötigt. Die Zell-Ausbeute ist trotzdem gering, was hohe Produktionskosten nach sich zieht.
Die vorliegende Erfindung bezweckt die vorstehend genannten oder andere Probleme zu lösen. Beispielsweise bezweckt die vorliegende Erfindung Mittel zur Vorbeugung gegen und Behandlung von weißer Diarrhöe/Diarrhöe zur Verfügung zu stellen, durch die das Immunsystem in beispielsweise Nutztieren aktiviert wird, und die im Gegensatz zu Antibiotika nicht die Probleme im Zusammenhang mit Bakterien, die gegen Arzneimittel resistent sind oder mit dem Verbleib von Arzneimittel im Körper aufweisen und die effizienter sind als Lebenbakterien-Mittel. Bekannte Mittel, die durch Aktivierung des Immunsystems wirken, basieren auf Bakterien, die in der Handhabung schwierig und schwer zu züchten sind und damit schlechte Ausbeuten liefern.
Daher bezweckt die vorliegende Erfindung Mittel zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Diarrhöe in beispielsweise Nutztieren, Geflügel, Haustieren usw., zu entwickeln, die im industriellem Maßstab einfach hergestellt werden können, einfach in der Handhabung sind, und die das Immunsystem wirksam aktivieren.
Im Hinblick auf die vorstehende Situation haben die hier genannten Erfinder umfangreiche Untersuchungen durchgeführt und als Ergebnis gefunden, daß Substanzen, die Zellwandkomponenten von Bakterien enthalten, die den Gattungen Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Lactobacillus, Streptococcus oder Streptomyces angehören, welche keine von beispielsweise Nutztieren stammenden Darmbakterien darstellen, die jedoch unter aeroben Bedingungen wachsen können, bei der Vorbeugung gegen und Behandlung von weißer Diarrhöe oder Diarrhöe beispielsweise von Nutztieren, Geflügel, Haustieren usw. wirksam sind. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zu Verfügung, das in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder als Futterzusatz zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Diarrhöe vorliegen kann und das entweder allein oder in Kombination enthält:
abgetötete Bakterienzellen, die einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, und Escherichia,
ein mechanisches Homogenisat von Bakterienzellen, die einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, und Escherichia,
ein Enzym-Homogenisat, das durch enzymatischen Abbau von Bakterienzellen oder einem mechanischen Homogenisat davon mit einem Enzym, das zum Abbau der Bakterienzellwand befähigt ist, erhältlich ist, wobei die Zellen einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus und Streptomyces und/oder
eine Fraktion, die eine Komponente der bakteriellen Zellwand von Bakterienzellen enthält, die einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, und Streptomyces.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von einem oder mehreren von:
abgetöteten Bakterienzellen, die einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, und Escherichia,
einem mechanischen Homogenisat von Bakterienzellen, die einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, und Escherichia,
einem Enzym-Homogenisat, das durch enzymatischen Abbau von Bakterienzellen oder einem mechanischen Homogenisat davon mit einem Enzym, das zum Abbau der Zellwand befähigt ist, erhältlich ist, wobei die Zellen einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus und Streptomyces und/oder
einer Fraktion, die eine Komponente der Bakterienzellwand von Bakterienzellen enthält, die einer oder mehreren der folgenden Gattungen angehören: Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, und Streptomyces,
zur Herstellung eines Mittels, das in Form eines Arzneimittels oder eines Futterzusatzes zur Vorbeugung gegen oder zur Behandlung von Diarrhöe vorliegen kann. Die Zusammensetzung oder der Zusatz kann als Wirkstoff irgendeine der vorstehend genannten Bestandteile enthalten, insbesondere abgetötete Bakterienzellen, ein Homogenisat aus Bakterienzellen oder eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält, oder als Wirkstoff irgendeine der folgenden Kombinationen enthält: abgetötete Bakterienzellen und ein Homogenisat aus Bakterienzellen, abgetötete Bakterienzellen und eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält, ein Homogenisat aus Bakterienzellen und eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält, oder abgetötete Bakterienzellen, ein Homogenisat aus Bakterienzellen und eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält. Insbesondere kann die Zusammensetzung oder der Zusatz als Wirkstoff irgendeine der vorstehend beschriebenen Kombinationen enthalten. Die Bakterienzellen müssen nicht aus dem Darm stammen. Die Bakterienzellen können aerob sein. Abgetötete Zellen können durch Sterilisieren erhalten worden sein. Das Zell-Homogenisat kann durch mechanisches Homogenisieren und/oder durch enzymatische Zersetzung erhalten worden sein. Die Fraktion kann durch Fraktionieren des Zell-Homogenisats oder eines Homogenisats von Bakterienzellwänden erhalten worden sein. Das Mittel kann auch ein oder mehrere Exzipienten enthalten.
Beispiele von Bakterien, die in dem erfindungsgemäßen Mittel zur Vorbeugung gegen und zur Behandlung von weißer Diarrhöe/ Diarrhöe verwendet werden können, umfassen Bakterien, die der Gattung Bacillus angehören, wie Bacillus subtilis ATCC 13952, Bakterien, die der Gattung Brevibacterium angehören, wie Brevibacterium lactoferiaentum ATCC 13869, Bakterien, die der Gattung Corynebacterium angehören, wie Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Bakterien, die der Gattung Escherichia angehören, wie Escherichia coli ATCC 8739, Bakterien, die der Gattung Lactobacillus angehören, wie Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Bakterien, die der Gattung Streptococcus gehören, wie Streptococcus thermophilus ATCC 19987, Bakterien, die der Gattung Streptomyces angehören, wie Streptomyces tanashiensis ATCC 15238.
Zur Inkubation dieser Bakterien kann jegliche Nährstoffquelle, die die Bakterien nutzen können, verwendet werden, beispielsweise herkömmliche Medien, die zweckmäßig ergänzt wurden mit Kohlenhydraten, wie Glucose oder Saccharose, Alkoholen, wie Ethanol oder Glycerin, organischen Säuren, wie Essigsäure oder Propionsäure, Kohlenstoffquellen, wie Sojabohnenöl, oder einem Gemisch verschiedener Kohlenstoffquellen, stickstoffhaltigen anorganischen oder organischen Nährstoffquellen, wie Hefeextrakt, Pepton-Fleischextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat oder Ammoniak, anorganische Nährstoffquellen, wie Phosphate, Magnesium, Eisen, Mangan oder Kalium, Vitamine, wie Biotin oder Thiamin. Die Inkubation kann in einem Nährmedium in einem pH- Bereich von 4,0 bis 9,5 bei 200 bis 40ºC für 12 Stunden bis 5 Tage unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden.
Die Zellen, die durch die Inkubation erhalten werden, werden vom Medium abgetrennt und beispielsweise durch Hitzebehandlung abgetötet. Die abgetöteten Zellen können so wie sie sind verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, homogenisierte Zellen zu verwenden. Das Homogenisierungsverfahren kann auch zum Abtöten der Mikroben-Zellen verwendet werden. Die Zellen, die homogenisiert werden sollen, können lebende und/oder abgetötete Zellen sein. Das Verfahren zur Homogenisierung kann ein mechanisches Verfahren und/oder ein Verfahren unter Verwendung eines Enzyms sein. In einem geeigneten mechanischen Verfahren werden die Zellen unter Verwendung beispielsweise einer französischen Presse (french press) unter einem Druck von etwa 800 bis 2000 kg/cm² homogenisiert. Alternativ können die Zellen auch mit einem Ultraschall-Homogenisator homogenisiert werden. Wenn Bakterienzellen unter Verwendung eines Enzyms homogenisiert werden, werden die gezüchteten Zellen oder das mechanische Homogenisat der gezüchteten Zellen in beispielsweise physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und der Suspension wird ein die Zellwand lysierendes Enzym zugesetzt, um die Zellwand abzubauen. Das Enzym, das zu diesem Zweck verwendet wird, kann jegliches Enzym sein, das zum Zellwandabbau befähigt ist. Typische Beispiele für das Enzym sind Lysozym und Protease. Bedingungen für die Enzymbehandlung sind in den folgenden bekannten Verfahren dargelegt. Bei sowohl dem mechanischen als auch dem enzymatischen Verfahren ist ein Ausmaß der Zell-Homogenisierung von 20% oder mehr bevorzugt, bevorzugt etwa 60%. Das Ausmaß der Homogenisierung kann als Verminderung der Trübung einer Suspension von Mikroben-Zellen bei einer Wellenlänge von 660 nm bestimmt werden. Die vorstehend angegebenen Prozent-Werte beziehen sich auf die Abnahme der Trübung einer Suspension von Mikroben-Zellen bei einer Wellenlänge von 660 nm und nicht auf den Prozentsatz abgetöteter Zellen. Beträgt die Homogenisierung der Zellen beispielsweise 20 % sind im wesentlichen alle Mikroben-Zellen abgetötet. Um das Ausmaß der Homogenisierung zu erhöhen, wird bevorzugt das mechanische mit dem enzymatischen Verfahren kombiniert.
Das Zell-Homogenisat kann darüber hinaus fraktioniert werden und die isolierte Fraktion, die die Zellwandkomponenten enthält, kann verwendet werden. Das Fraktionieren kann durch einfaches Zentrifugieren des Zell-Homogenisats unter Entfernen unlöslicher Stoffe erfolgen. Des weiteren können auch bekannte Vefahren zum Fraktionieren von Proteinen verwendet werden, die beispielsweise auf dem Molekulargewicht basieren, wie Ultrafiltration oder Gelfiltration.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Diarrhöe wird nun beschrieben. Die Zusammensetzung in Form von vorbereiteten Zellen, Homogenisaten davon oder Fraktionen, die die Zellwandkomponenten enthalten (allein oder in Kombination) können dem Individuum (beispielsweise dem Vieh, Geflügel, Haustieren) oral, in Form einer Flüssigkeit verabreicht werden. Wenn erforderlich und erwünscht, kann die Zusammensetzung auch zu einer pulvrigen Form getrocknet werden, die beispielsweise dem Tierfutter zugesetzt wird. Die Zusammensetzung kann zur Behandlung verabreicht werden. Zur Vorbeugung gegen und Behandlung von weißer Diarrhöe/Diarrhöe in gesäugten Jungtieren kann die Zusammensetzung jedoch fortlaufend 1 bis 2 Wochen nach der Geburt gegeben werden, wodurch ihre vorteilhafte Wirkung verstärkt wird. Eine Tagesdosis beträgt etwa 10 mg bis etwa 50 g, vorzugsweise etwa 100 mg bis etwa 2 g, bezogen auf das Trockengewicht. Während der Entwöhnungszeit bei Schweinen oder bei Geflügel kann die Zusammensetzung dem Futter in einer Menge zugesetzt werden, so daß es bezogen auf das Trockengewicht 0,01 % bis 5 %, vorzugsweise 0,05 % bis 1 % davon enthält.
In der vorliegenden Erfindung umfassen die Nutztiere beispielsweise Schwein, Rind, Pferd, Ziege, Schaf, zu Geflügel gehört Federvieh, wie Hühner, und Haustiere umfassen beispielsweise Hunde und Katzen.
Die Erfindung wird nun unter Bezug auf die nachfolgenden Beispiele genauer beschrieben, die nur zur Erläuterung und nicht zur Begrenzung dienen, und unter Bezug auf Figur 1, die die Darstellung des Verhältnisses zwischen abgetöteten Zellen jeder Gattung und deren enzymatischen Abbauprodukten und der Maus-IgM-Antikörperproduktion zeigt.

Beispiel 1

Züchten von Bakterienzellen

Kolben mit einem Volumen von 500 ml wurden mit 50 ml Medium (pH 7) beschickt, das 1,0 g/dl Glucose, 1,0 g/dl Hefe- Extrakt, 1,0 g/dl Pepton, 0,5 g/dl (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,3 g/dl K&sub2;HPO&sub4;, 0,1 g/dl KH&sub2;PO&sub4; und 0,05 g/dl MgSO&sub4; 7H&sub2;O enhielt, und nachfolgend 15 Minuten bei 115ºC sterilisiert. Bacillus subtilis ATCC 13952, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutanicum ATCC 13060, Escherichia coli ATCC 8739, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Streptococcus thermophilus ATCC 19987, Streptomyces tanashiensis ATCC 15238 wurden (getrennt) einen Tag bei 30ºC in Bouillon-Agar-Medium vorinkubiert. Eine Impföse jeder Kultur wurde dann zum Animpfen einzelner Kolben mit sterilisiertem Medium verwendet, worauf die Kultur 24 Stunden bei 30ºC geschüttelt wurde. Nach Abschluß der Inkubation wurde das Medium zum Gewinnen der Zellen zentrifugiert. Die jeweiligen Zellen wurden in einem zum Volumen des Mediums äquivalenten Volumen physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und dann 10 Minuten bei 100ºC einer Hitze- Behandlung unterzogen. Jede Suspension wurde erneut zentrifugiert um die Zellen zu gewinnen.
Zur Kontrolle wurden Bifidobacterium thermophilum ATCC 25525 (erhalten aus Schweine-Darm) und Clostridium butylicum (erhalten aus menschlichem Darm) als strikt anaerobe Bakterien verwendet. In Kolben mit einem Volumen von 300 ml wurden 280 ml Medium (pH 7,0) vorgelegt, das 1,0 g/dl Glucose, 1,0 g/dl Hefe- Extrakt, 1,0 g/dl Pepton, 0,02 g/dl MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,05 g/dl Tween 80, 0,2 g/dl Ammoniumacetat, 10% Tomatensaft-Filtrat und 1,0 g/dl CaCO&sub3; enthielt und nachfolgend 15 Minuten bei 115ºC sterilisiert. Von den Kontroll-Bakterien wurden Stabkulturen in Bouillon-Agar angelegt, anschließend in separaten Kolben mit sterilisiertem Medium angeimpft, und nachfolgend unter anaeroben Bedingungen zwei Tage bei 37ºC kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurde jedes der Medien zentrifugiert um die Zellen zu gewinnen. Die jeweiligen Zellen wurden in einem dem Medium äquivalenten Volumen physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wurde 10 Minuten bei 100ºC hitzebehandelt und zum Gewinnen der Zellen nochmals zentrifugiert.
Das Gewicht des nassen Zentrifugats pro 100 ml Medium nach der Kultur ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Gewicht nasses Zentrifugat g/100 ml Bacillus subtilis ATCC 13952 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Corynebacterium glutamicum ATCC 13060 Escherichia coli ATCC 8739 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 Streptococcus thermophilus ATCC 19987 streptomyces tanashiensis ATCC 15238 Bifidobacteriurn thermophilum ATCC 25525 Clostridiuin butylicum

Beispiel 2

Homogenisierung

Die jeweiligen Zellen (nasses Zentrifugat) aus Beispiel 1 wurden jeweils in 25 mM Phosphatpufer (pH 7,0) zu 10 Gew.-% suspendiert. Jede Zellsuspension wurde in einen Behälter aus Edelstahl (je 50 ml Volumen) überführt und unter Verwendung eines Ultraschall-Homogenisators (Model UR-200 P, hergestellt von Tomy Seiko Co., LTD) 15 min. bei einer Oszillationsfrequenz von 20 kHz und einer Arbeitsleistung von 200 W behandelt. Nach der Behandlung wurde jedes Homogenisat weiter zentrifugiert, wobei eine Fraktion erhalten wurde, die die Zellwand-Bestandteile enthält.

Beispiel 3

Produkt des enzymatischen Abbaus

Separate gleiche Anteile von 25 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), die jeweils als festen Bestandteil 10 Gew.-% eines unterschiedlichen mechanischen Zellhomogenisats, das wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, enthielten, wurden mit 0,01 Gew.-% Albumin-Lysozym (hergestellt von Sigma Co.) und 0,02 Gew.-% Actinase (hergestellt von Kaken Pharmaceutical Co., LTD., 7000 Einheiten) versetzt. Jedes Gemisch wurde 12 Stunden bei 37ºC behandelt und dann zur Inaktivierung des Enzyms 2 Min. bei 100ºC hitzebehandelt.

Beispiel 4

Wirkung der immunologischen Aktivierung unter Verwendung von Maus-Milzzellen

RPMI 1640 Medium wurde mit 10% inaktiviertem fötalem Kälberserum und 5x10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol versetzt, und anschließend filtriert und sterilisiert. Milzzellen die aus der Milz einer weiblichen, 10 Wochen alten Maus vom DBA/2-Stamm erhalten wurden, wurden in dem sterilisierten Medium in einer Konzentration von 2,5x10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Die Zellen und das enzymatische Abbauprodukt, das in den Beispielen 1 und 3 hergestellt wurde, oder Zellen von Kluyvera citophilia IFO 8193 und Beijerinckia indica ATCC 9037 und das enzymatische Abbauprodukt, das in ähnlicher Weise wie in den Beispielen 1 und 3 beschrieben hergestellt wurde, wurden in den entsprechenden Konzentrationen den jeweiligen Suspensionen zugesetzt und anschließend 4 Tage bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;-Inkubator kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden die Überstände 1000-fach mit 0,01 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8,1), der 1% Rinderserumalbumin enthielt, verdünnt. Danach wurde die Gesamtmenge Maus-IgM, die in jedem der Medien produziert worden war, mittels ELISA gemessen, um die Wirkung auf die immunologische Aktivierung in jedem der Systeme zu bestimmen. Als Standardsubstanz zur Messung der Wirkung auf die immunologische Aktivierung wurde Lipopolysaccharid (LPS), das aus pathogenem Escherichia coli erhalten wurde, verwendet. Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt.
Figur 1 zeigt die Beziehung zwischen den abgetöteten Zellen jeder Gattung (unterbrochene Linie) und den enzymatischen Abbauproduten davon (durchgezogene Linie) und der Maus-IgM- Antikörperproduktion. In der Figur gibt die Abszisse die Konzentration (ug/ml) zugesetzter abgetöteter Bakterienzellen an und die Ordinate gibt die Konzentration (ug/ml) an Gesamt-Maus- IgM an, das in dem Nährmedium von den Milzzellen produziert wurde.
Wie aus Figur 1 hervorgeht, ist die Antikörperproduktivität für Bacillus subtilis ATCC 13952, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Escherichia coli ATCC 8739, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Streptococcus thermophilus ATCC 19987, Streptomyces tanashiensis ATCC 15238 erfindungsgemäß höher als die von Bifidobacterium thermophilum oder Clostridium butylicum, die als strikt anaerobe Bakterien aus dem Darm von Nutztieren verwendet wurden, und ist auch höher als die von Kluyvera citophilia und Beijerinckia indica, die als aerobe Bakterien in der Kontrollgruppe verwendet wurden.
Des weiteren wird eine Tendenz festgestellt, daß die Antikörperproduktivität der erfindungsgemäßen enzymatischen Abbauprodukte höher ist als die der abgetöteten Zellen. Die enzymatischen Abbauprodukte zeigen alle eine hohe Aktivität, die den Maximalwert (150 g/ml) der Antikörper-Produktion für LPS übersteigt. Dies zeigt, daß die enzymatischen Abbauprodukte bei der Aktivierung des Immunsystems sehr wirksam sind. Im Gegensatz dazu wurde in den Kontrollgruppen keine Aktivität festgestellt, die die für LPS übersteigt. Die Gradienten der Steigungen in Figur 1 zeigen, daß in den Kontrollgruppen eine verstärkte Antikörperproduktion unmöglich zu erwarten ist, auch wenn die Konzentration der zugesetzten Mittel erhöht wird.

Beispiel 5

Wirkung auf weiße Diarrhöe oder Diarrhöe in Ferkeln während der Still zeit

Dreiundsechzig (63) Ferkel, die gesäugt wurden, wurden in neun Gruppen mit je 7 Ferkeln aufgeteilt. Eine Gruppe war eine Kontrollgruppe (Gruppe ohne Verabreichung). In den anderen acht Gruppen wurde eine Suspension, die durch Suspendieren von 200 mg der enzymatischen Abbauprodukte der verschiedenen Bakterienzellen in Trockpulver-Form (hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben) in 3 ml Wasser täglich hergestellt wurde, in den ersten 7 Tagen nach der Geburt einmal täglich oral verabreicht.
Die Ferkel wurden für 20 Tage, von Tag 8 bis Tag 27 nach der Geburt, auf weiße Diarrhöe oder Diarrhöe untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war in allen Gruppen, denen die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten enzymatischen Abbauprodukte von Bakterien verabreicht wurden im Vergleich zu der Kontollgruppe und zu den Gruppen, denen enzymatische Abbauprodukte von Bifidobacterium thermophilum verabreicht wurden, das Auftreten von weißer Diarrhöe oder Diarrhöe gering und die durchschnittliche Gewichtszunahme hoch. Tabelle 2 verabreichte Bakterien Gesamtzahl von Beobachungstagen*1 Gesamtzahl von Tagen mit weißer Diarrhöe oder Diarrhöe*2 Gewichtszunahme an Tag 27 (Kg/Schwein) Kontrolle (Keine) Bacillus subtilis ATCC 13952 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Corynebacterium glutamicum ATCC 13060 Escherichia coli ATCC 8739 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 Streptococcus thermophilus ATCC 19987 Streptomyces tanashiensis ATCC 15238 Bifdobacterium thermophilum ATCC 25525 *1 Anzahl der untersuchten Tiere (7) x Anzahl der Beobachtungstage (20) *2 Gesamtzahl der Tage an denen weiße Diarrhoe oder Diarrhoe beobachtet wurde, während der gesamten Beobachtungstage. *3, 4 Ein Schwein in jeder Gruppe war tot.

Beispiel 6

Wirkung auf weiße Diarrhöe oder Diarrhöe in Ferkeln während der Still zeit
Achtundzwanzig (28) Ferkel, die gesäugt wurden, wurden in 4 Gruppen von je 7 Ferkeln aufgeteilt. Eine Gruppe war eine Kontrollgruppe (Gruppe ohne Verabeichung). In den anderen drei Gruppen (Verabreichungsgruppen) wurden Suspensionen, die durch Suspendieren von 200 mg Trockenpulver von: i) den hitzebehandelten Zellen von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, ii) dem mechanischen Homogenisat davon und iii) dem enzymatischen Abbauprodukt davon, und einer Fraktion davon, die wie in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben hergestellt wurden, in 3 ml Wasser täglich hergestellt, und wurden den entsprechenden Gruppen in den ersten 7 Tagen nach der Geburt einmal täglich verabreicht.
Zwanzig Tage lang, von Tag 8 bis Tag 27 wurden die Ferkel auf weiße Diarrhöe oder Diarrhöe hin untersucht. Wie in Tabelle 3 gezeigt, war in den Gruppen, die erfindungsgemäß behandelt wurden, verglichen mit der Kontrollgruppe, das Auftreten von weißer Diarrhöe oder Diarrhöe niedrig und die durchsschnittliche Gewichtszunahme hoch.
In den getesteten Gruppen war die vorbeugende Wirkung gegen das Auftreten von weißer Diarrhöe oder Diarrhöe in den Gruppen, denen das mechanische Homgenat und sein enzymatisches Abbauprodukt verabreicht worden war, stärker als in der Gruppe, der die hitzebehandelten Zellen verabreicht worden waren. Tabelle 3 verabreichte Bakterien Gesamtzahl von Beobachungstagen*1 Gesamtzahl von Tagen mit weißer Diarrhöe oder Diarrhöe*2 Gewichtszunahme an Tag 27 (Kg/Schwein) Kontrolle (Keine) hitzebehandelte Zellen mechanisches Zellhomogenisat enzymatisches Abbauprodukt von Zellen
*1 Anzahl der untersuchten Tiere (7) x Anzahl der Beobachtungstage (20)
*2 Gesamtzahl der Tage an denen weiße Diarrhoe oder Diarrhoe beobachtet wurde, während der gesamten Beobachtungstage.
*3 Ein Schwein in dieser Gruppe war tot.

Beispiel 7

Fütterungstest von Kälbern durch Zugabe zum Futter

Zwölf (12) männliche Kälber der Holstein-Art wurden eine Woche nach der Geburt in 3 Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe war die Kontrollgruppe (ohne Verabreichung). In den anderen beiden Gruppen wurde dem Futter, das während der Entwöhnung an die Kälber verfüttert wurde 0,1 % (für eine Gruppe) und 1 % (für die andere Gruppe) enzymatische Abbauprodukte von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 in Trockenpulver-Form, das entsprechend Beispiel 4 hergestellt wurde, zugesetzt (Verabreichungsgruppen). Die Kälber wurden 3 Wochen lang gesäugt. Während dieser Zeitspanne wurde das Auftreten von Diarrhöe und weichem Kot beobachtet und die Gewichtszunahme untersucht.
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, war in den Verabreichungsgruppen verglichen mit der Kontrollgruppe das Auftreten von Diarrhöe und weichem Kot selten und die Gewichtszunahme gut. Desweiteren zeigte in den Verabreichungsgruppen die Gruppe, der 1 % verabreicht wurde etwas bessere Ergebnisse als die Gruppe, der 0,1 % verabreicht wurde. Tabelle 4 Auftreten von Diarrhöe oder weichem Kot durchschnittliche Gewichtszunahme (Kg/Kalb) Kontrolle 1 % verabreichungsgruppe 0,1 % verabreichungsgruppe
* Auftreten von Diarrhäe oder weichem Kot =
Anzahl der Tage an denen während des Zeitrums der Beobachtung Diarrhöe oder welcher Kot festgestellt wurde/Gesamtzahl von Beobachtungstagen (4 Kälber x 21 Tage) x 100

Claims

1. Arzneimittel-Zusammensetzung oder Nahrungsinittelzusatz zur Vorbeugung und Behandlung von Diarrhoe, welche(r) entweder voneinander getrennt oder in Kombination enthält:

abgetötete Bakterienzellen, welche einer oder mehreren der Arten Brevibacterium, Corynebacterium und Escherichia angehören;

ein mechanisches Homogenat von Bakterienzellen, welche einer oder mehreren der Arten Brevibacterium, Corynebacterium und Escherichia angehören;

ein Enzymhomogenat, das durch enzymatischen Abbau von Bakterienzellen oder eines mechanischen Homogenats davon mit einem zum Zellwandabbau befähigten Enzym erhältlich ist, wobei die Zellen einer oder mehreren der Arten Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus und Streptomyces angehört; und/oder

eine Fraktion, die eine Komponente der Bakterienzellwand von Bakterienzellen, welche einer oder mehreren der Arten Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus und Streptomyces angehören, enthält.

2. Zusammensetzung oder Zusatz nach Anspruch 1, welche(r) als aktiven Inhaltsstoff eine der folgenden Komponenten enthält:

abgetötete Bakterienzellen,

ein Homogenat von Bakterienzellen, oder

eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält,

oder welche(r) als den aktiven Inhaltsstoff eine der folgenden Kombinationen enthält:

abgetötete Bakterienzellen und ein Homogenat von Bakterienzellen,

abgetötete Bakterienzellen und eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält,

ein Homogenat von Bakterienzellen und eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält, oder

abgetötete Bakterienzellen, ein Homogenat von Bakterienzellen und eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält.

3. Zusammensetzung oder Zusatz nach Anspruch 1 oder 2, worin die Bäkterienzellen die folgenden sind:

Bacillus subtilis ATCC 13952,

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869,

Corynebacterium glutamicum ATCC 13060,

Escherichia coli ATCC 8739,

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356,

Streptococcus thermophilus ATCC 19987, und

Streptomyces tanashiensis ATCC 15238.

4. Zusammensetzung oder Zusatz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Bakterienzellen nicht-intestinal sind.

5. Zusammensetzung oder Zusatz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Bakterienzellen aerob sind.

6. Zusammensetzung oder Zusatz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Fraktion durch Fraktionieren eines Bakterienzellwandhomogenats erhalten wird.

7. Zusammensetzung oder Zusatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche(r) die Form einer Flüssigkeit oder eines Trockenpulvers besitzt.

8. Verwendung von einer oder mehreren der folgenden Komponenten zur Herstellung einer Arzneimittel-Zusammensetzung oder eines Nahrungsmittelzusatzes zur Vorbeugung und Behandlung von Diarrhoe:

ein Enzymhomogenat, das durch enzymatischen Abbau von Bakterienzellen oder eines mechanischen Homogenats davon mit einem zum Abbau von Zellwänden befähigten Enzym erhältlich ist, wobei aie Zellen einer oder mehreren der Arten Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus und Streptomyces angehören, und/oder

eine Fraktion, welche eine Komponente der Bakterienzellwand von Bakterienzellen, die einer oder mehreren der Arten Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus und Streptomyces angehören, enthält.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung oder der Zusatz als aktiven Inhaltsstoff eine der folgenden Komponenten enthält:

abgetötete Bakterienzellen,

ein Homogenat von Bakterienzellen, oder

eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält,

abgetötete Bakterienzellen und ein Homogenat von Bakterienzellen,

ein Homogenat aus Bakterienzellen und eine Fraktion, die eine Komponente einer Bakterienzellwand enthält, oder

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei die Bakterienzellen die folgenden sind:

Bacillus subtilis ATCC 13952

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

Corynebacterium glutamicum ATCC 13060

Escherichia coli ATCC 8739

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356

Streptococcus thermophilus ATCC 19987; und

Streptomyces tanashiensis ATCC 15238.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9 oder 10, wobei die Bakterienzellen nicht-intestinal sind.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Bakterienzellen aerob sind.