DE3781652T2

DE3781652T2 - Zubereitung, geeignet fuer die behandlung von darmstoerungen.

Info

Publication number: DE3781652T2
Application number: DE8787310965T
Authority: DE
Inventors: Pieter Willem Nicol Groenewald
Original assignee: Biorem C C
Current assignee: Biorem C C
Priority date: 1986-12-12
Filing date: 1987-12-14
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2007-12-15
Also published as: EP0271364A3; EP0271364A2; EP0271364B1; AU8240687A; AU624067B2; DE3781652D1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Zubereitung für die Behandlung von Darmkrankheiten, und insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, zur Behandlung von Durchfall oder Ruhr bei Tieren.
Es ist allgemein anerkannt, daß Darmkrankheiten, die bei den befallenen Tieren, die an Durchfall oder Ruhr leiden, manifestiert werden, für wesentliche finanzielle Verluste verantwortlich sind, die durch den Tod oder den Konditionsverlust der Tiere hervorgerufen werden. Durchfall- oder ruhrbedingte Verluste herrschen insbesondere bei jungen Wiederkäuern vor und führen ohne Behandlung des Durchfalls oder der Ruhr im allgemeinen zum Tod des Tieres.
Durchfall oder Ruhr können bei Rindern und Schafen durch ein oder mehrere pathogene Infektionen hervorgerufen werden, z.B. durch eine pathogene E. coli-oder Corona-Virusinfektion. Es kann sich jedoch auch bei solchen normalen Aktivitäten ergeben, wie z.B. dem einfachen Bewegen der Tiere von einem Habitat zum anderen oder durch eine Veränderung der Diät. In einigen Fällen kann kein Grund für das Auftreten des Durchfalls oder der Ruhr in jungen Tieren identifiziert werden.
Verschiedenartige Anti-Durchfallzubereitungen sind auf dem Markt erhältlich, jedoch haben alle diese ihnen eigene Begrenzungen und sind häufig nicht indiziert als generell verwendbare Zubereitungen für die Prophylaxe und Behandlung von Durchfall im Hinblick auch auf ihre Kosten, Spezifizität und das Potential für einen erlangten Widerstand gegenüber den Produkten. Die Verwendung antibiotischer Zubereitungen, um infektiöse Organismen zu bekämpfen, die Darmkrankheiten hervorrufen, haben einige dieser Organismen widerstandsfähig gegenüber den häufiger verwendeten Antibiotika gemacht, und es ist dementsprechend im Stand der Technik vorgeschlagen worden, Probiotika anstelle der Antibiotika zu verwenden. Solche Probiotikabehandlung geht im allgemeinen davon aus, daß sie die orale Einführung einer großen Anzahl förderlicher Mikroorganismen in den Verdauungstrakt des befallenen Tieres umfaßt, wobei in der Praxis anscheinend nur die thermophilen, wie z.B. Lactobacillus acidophilus für diesem Zweck verwendet worden sind.
Die vorliegende Erfindung sieht eine probiotische Zubereitung vor, umfassend nicht-thermophile Milchsäurebaktierien, die zur Verwendung in der Prophylaxe und/oder Behandlung eines weiten Bereiches von Darmkrankheiten geeignet sind, und insbesondere bei Durchfall hervorrufenden Krankheiten in Tieren.
Erfindungsgemäß umfaßt eine Zubereitung, die zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Darmkrankheiten bei Tieren geeignet ist, zwei oder mehrere Milchsäurebakterien, ausgewählt aus Phänotypen der folgenden Spezies, nämlich: Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Streptococcus sp. (Enterococcus) spp. und Leuconostoc spp.
Nach der Erfindung kann die Zubereitung Milchsäurebakterien von zwei oder mehreren Stämmen enthalten, ausgewählt von:
Lb. sake L2622, Lb. Curvatus L2623, Lb. casei (rham) L2624, Lb. curvatus L2625, Lb. sake L2626, Lb. coryniformis L2627, Lb. curvatus L2628, Lb. curvatus L2629,, Lb. curvatus L2630, Lb. curvatus L2632, Lb. Curvatus L2635, Lb. curvatus L2638, Lb. casei(rham) L2640, Lb. bavaricus L2641, Lb. coryniformis L2643, Lb. sake L2644, Lb. curvatus L2645, Lb. coryniformis L2546, Lb. curvatus L2647, Lb. coryniformis L2651, Lb. coryniformis L2653, Lb. curvatus L2654, Lb. curvatus L2655, Lb. sake L 2656, Lb. curvatus L2657, Lb. coryniformis L2658, Lb. curvatus L2659, Streptococcus sp. L2801, Leuconostoc sp. L2806, und Leuconostoc sp. L2807 umfaßt, wobei die Stämme wie im Teil (b) des Beispiels 4 einschließlich Tabelle 3 angegeben typisch sind. Nach einer bevorzugten Form der Erfindung umfaßt die Zubereitung die Kombination von dreißig Milchsäurebakterien-Stämmen, wie sie oben erwähnt sind. Die Zubereitung kann zusätzlich einen oder mehrere Stämme aus der folgenden Gruppe umfassen: Lb. bavaricus L2648, Leuconostoc sp. L2803 und Enterococcus , wie sie im Beispiel 4 (b) dargestellt sind.
Die Zubereitung nach der Erfindung liegt vorzugsweise in Form eines Trockenpulvers vor, kann jedoch ebenfalls in jeglicher anderen Form zubereitet werden, die zur Administration in den Verdauungstrakt eines Tieres geeignet ist, das eine solche Behandlung braucht. Die Zubereitung kann deshalb alternativ eine flüssige Zusammensetzung umfassen, die die Milchsäurebakterien in einem flüssigen Träger enthält, welcher pharmazeutisch akzeptabel und gegenüber den Bakterien nichttoxisch ist. Der flüssige Träger kann Wasser umfassen. Der flüssige Träger besitzt vorteilhafterweise einen Nährstoff, der darin aufgelöst ist und geeignet ist, die Bakterien aufrechtzuerhalten. Der Nährstoff ist vorteilhafterweise ein milchsäurenbakterienspezifischer Nährstoff.
Die trockene Form der Zubereitung umfaßt vorteilhafterweise zwischen 0,5x10&sup6; und 1x10&sup9; Milchsäurebakterien pro Gramm des Gesamtgewichtes.
In der bevorzugten trockenen Form der Erfindung umfaßt die Zubereitung zusätzlich zu den vorgenannten Milchsäurebakterien einen Träger, der den Rest eines geeigneten Zuchtmediums für die ausgewählten Milchsäurebakterien umfaßt, wobei der Zuchtmittelrest ebenfalls für das damit zu behandelnde Tier nicht-toxisch ist.
Auf diese Art und Weise kann der Träger den Milchsäurebakterien-Kultivierungsrest irgendeinen oder mehrere der folgenden Stoffe umfassen:
Luzernenmahl, Maismahl, Weizenmahl,Molke oder irgendein anderes nicht-toxisches organisches Material, das dazu in der Lage ist, das Anwachsen der ausgewählten Milchsäurebakterien zu unterstützen.
In der bevorzugten Form der erfindungsgemäßen Zubereitung umfaßt der Träger einen Luzernenmahlrest.
Die erfindungsgemäße Zubereitung ergibt typischerweise die folgende Analyse in Gewicht:
Protein 148,1 (23,7N) g/Kg
Fett 98,7
Asche 47,8
Faser 96,5
Calcium 5,3
Phosphor 3,0
Kalium 12,3
Magnesium 2,6
Natrium 1,9
Ca/P 1,77
Die Zubereitung ist ferner vorteilhafterweise im wesentlichen frei von Salmonella und Clostridia, zumindest vom pathogenischen Niveau solcher Organismen.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zum Herstellen einer Zubereitung vorgesehen, geeignet zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Darmkrankheiten bei Tieren, umfassend die Stufen des Impfens eines geeigneten nicht-toxischen organischen Zuchtmittels mit einem Milchsäurebakterien- Impfmittel , umfassend zwei oder mehrere Milchsäurebakterien, die von den Phänotypen folgender Spezies ausgewählt werden, nämlich: Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, Lactobacullus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Streptococcus sp. (Enterococcus spp.) und Leuconostoc spp., Kultivieren des geimpften Zuchtmittels unter Bedingungen, die die Vervielfachung der Milchsäurebakterien bis zu einer bevorzugten Population ermöglichen und wahlweise Entwässern des Zuchtmittels und seiner zugehörigen Population der Milchsäurebakterien unter Bedingungen, die im wesentlichen nicht-vernichtend für die Milchsäurebakterien sind, um die Zubereitung zu erhalten.
Das Impfmittels umfaßt vorteilhafterweise zwei oder mehrere der folgenden Milchsäurebakterienstämme:
Lb.sake L2622, Lb.curvatus L2623, Lb. casei (rham) L2624, Lb. curvatus L2625, Lb.sake L2626, Lb.coryniformis L2627,
Lb. curvatus L2628, Lb. curvatus L2629, Lb. curvatus L2630, Lb. curvatus L2632, Lb. curvatus L2635, Lb. curvatus L2638, Lb. casei (rham) L2640, Lb. bavaricus L2641, Lb. coryniformis L2643, Lb. sake L2644, Lb. curvatus L2645, Lb. coryniformis L2546, Lb. curvatus L2647, Lb. coryniformis L2651, Lb. coryniformis L2653, Lb. curvatus L2654, Lb. curvatus L2655, Lb. sake L2656, Lb. curvatus L2657, Lb. coryniformis L2658, Lb. curvatus L2659, Streptococcus sp. L2801 Leuconostoc sp. L2806, und Leuconostoc sp. L2807, wie im Beispiel 4 (b) als typisch angegeben sind.
Alternativ und vorteilhafterweise umfaßt das Impfmittel die Kombination von 30 Milchsäurebakterienstämmen, die oben erwähnt worden sind, in Kombination mit einem oder mehreren der Stämme
Lb. bavaricus L2648 und Leuconostoc sp. L2803, wie im Beispiel 4 (b) als typisch angegeben.
Das Impfmittel umfaßt vorteilhafterweise mindestens 1x10&sup6; Milchsäurebakterien gro Gramm und wird zum Zuchtmittel mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Gramm pro 10 Kg. des Zuchtmittels hinzugefügt.
Das Zuchtmittel kann jegliches geeignete nicht-toxische organische Medium umfassen, das dazu in der Lage ist, die Kultivierung der ausgewählten Milchsäurebakterien zu stützen und kann z.B. Luzernenmahl, Maismahl, Weizenmahl, Molke o. dgl. umfassen.
Wo es anwendbar ist, wird das Zuchtmittel benetzt, unter Ausbildung eines Zuchtmittels in Form einer festen, nassen Pulpe.
Das Zuchtmittel kann ebenfalls mit irgendeiner geeigneten nicht-toxischen Flüssigkeit befeuchtet werden, vorzugsweise jedoch mit Wasser.
Nach einer Form der Erfindung kann das Zuchtmittel geimpft werden, indem man das Impfmittel in einer 10 % m/m Suspension in Wasser bei einem ausgewählten pH suspendiert unter Bildung einer konzentrierten Impfmittel-Suspension, wobei der konzentrierten Impfmittel-Suspension ermöglicht wird, bei Raumtemperatur zwischen 30 und 90 min. zu stehen, und wobei die konzentrierte Impfmittel- Suspension in einem vorbestimmten Volumen sterilen Wassers unter Bildung einer geimpften Befeuchtungssuspension verdünnt wird, und wobei die Befeuchtungssuspension mit dem Zuchtmittel vermischt wird, um ein geimpftes, befeuchtetes Zuchtmedium zu erhalten. Typischerweise kann das Zuchtmittel bzw. Medium ein Gemisch von etwa 1:3 (m/m) Luzernenmahl : Wasser enthalten.
In einer bevorzugten Form der Erfindung wird das geimpfte Zuchtmittel unter sauren Bedingungen kultiviert. Das Zuchtmittel kann so einen Anfangs- pH zwischen 3,5 und 6,9 besitzen. Vorteilhafterweise wird die Kultivierung bei einem Anfangs-pH von 4,5 durchgeführt. Der pH des Kultivierungsmediums kann mittels irgendeiner geeigneten Säure eingestellt werden, vorteilhafterweise mittels einer organischen Säure, wie z.B.Essigsäure.
Ein geeignetes Fungizid (Lebensmittelqualität, nicht-toxisch für Tiere), das im wesentlichen nicht-toxisch für Milchsäurebakterien ist, kann dem kultivierenden Zuchtmedium zugesetzt werden. Auf diese Weise kann Natriumsorbat zum Kultivierungs-Zuchtmittel in einer Menge von etwa 0,2 Gew.-% hinzugefügt werden.
Die Kultivierung kann für eine Spanne zwischen 12 und 100 Stunden ablaufen, vorteilhafterweise läuft sie 72 Stunden, bevor mit der Trocknung des kultivierten Produktes begonnen wird.
Wo es anwendbar ist, kann das kultivierte Zuchtmittel vorteilhafterweise durch Ausbreiten desselben entwässert werden, über das man dann einen Luftstrom bei einer Temperatur zwischen 15 ºC und 40 ºC hinwegführt.
Das getrocknete Produkt wird vorteilhafterweise durch ein feines Sieb geschüttet und homogenisiert und bildet die Zubereitung in Form eines trocknen Pulvers aus.
In einer alternativen Form der Erfindung können die kultivierten Milchsäurebakterien vom Zuchtmittelrest isoliert werden unter Ausbildung einer gereinigten Form der Zubereitung. Eine solche Isolierung kann mittels Verfahren durchgeführt werden, die im Handel zur Isolierung von Mikroorganismen bekannt sind.
Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen eines der Impfmittel geschaffen, das geeignet ist zur Verwendung bei der Durchführung des Verfahrens zum Herstellen einer oben beschriebenen Zubereitung, wobei das Verfahren die Stufen des Sammelns der Inhalte des Verdauungstraktes von geschlachteten, gesunden Tieren umfaßt, um eine repräsentative Probe solcher Inhalte zu erhalten, Kultivieren der Mikroorganismen in solcher Probe in einem geeigneten Zuchtmittel für Milchsäurebakterien und Entwässern des kultivierten Gemisches, um ein Muttermischungs-Impfmittel von Milchsäurebakterien zu erhalten. Die repräsentative Probe zur Kultivierung von Milchsäurebakterien wird vorzugsweise aus dem Verdauungstrakt eines geschlachteten, gesunden Wiederkäuers erhalten. Der Wiederkäuer wird vorteilhafterweise aus der Gruppe ausgewählt, die Rinder und Schafe umfaßt.
Während der Kultivierung ist es bevorzugt, zu kultivieren und dadurch zwei oder mehrere Milchsäurebakterien anzureichern, die als Phänotypen der Arten Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Streptococcus sp. (Enterococcus spp.) und Leuconostoc spp. identifiziert werden.
Vorteilhafterweise wird die Kultivierung und Anreicherung der Milchsäurebakterien aus folgenden Gruppen vorgenommen:
Lb. sake L2622, Lb. curvatus L2623, Lb. casei (rham) L2624, Lb. curvatus L2625, Lb. sake L2626, Lb. coryniformis L2627, Lb. curvatus L2628, Lb. curvatus L2629, Lb. curvatus L2630, Lb. curvatus L2632, Lb. curvatus L2635, Lb. curvatus L2638, Lb. casei (rham) L2640, Lb. bavaricus L2641, Lb. coryniformis L2643, Lb. sake L2644, Lb. curvatus L2645, Lb. coryniformis L2546, Lb. curvatus L2647, Lb. coryniformis L2651, Lb. coryniformis L2653, Lb. curvatus L2654, Lb. curvatus L2655, Lb. sake L2656, Lb. curvatus L2657, Lb. coryniformis L2658, Lb. curvatus L2659, Streptococcus sp.2801, Leuconostoc sp.2806 und Leuconostoc sp.2806, wobei die Stämme typischerweise im Beispiel 4 (b) typifiziert sind.
Die kultivierten Stämme können zusätzlich umfassen Lb. bavaricus und verschiedene Leuconostoc spp. und Streptococcus spp. erwähnt werden, wie sie im Beispiel 4(b) angegeben sind.
Das Impfmittel umfaßt vorteilhafterweise zwischen 0,5x10&sup6; und 1x10&sup9; Milchsäurebakterien pro Gramm.
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Verwendung der oben erwähnten Milchsäurebakterien bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Verwendung in der Behandlung von Darmkrankheiten bei Tieren.
Dieser Aspekt richtet sich ferner an die Verwendung von Milchsäurebakterien (vorteilhafterweise mit dem Rest eines Zuchtmittels dafür), bei der Herstellung einer Zubereitung zur Verwendung bei der Steigerung der Futterumwandlungswirksamkeit bei Tieren oder bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von Darmkrankheiten, insbesondere Durchfall hervorrufenden Krankheiten bei Tieren.
In dieser Beschreibung ist der Ausdruck "Tiere" dazu gedacht, Menschen, Haus- und Wildtiere zu umfassen, sowie Zugehörige der Vogelfamilie, und wobei Bezugnahmen auf den "pharmazeutischen" Bereich ebenfalls dazu gedacht sind, den Veterinärbereich zu umfassen. Ferner ist der Ausdruck "Darmkrankheiten" dazu gedacht, gastritische und Eingeweidekrankheiten zu umfassen, die zu Durchfall oder Verstopfung führen, bei Eingeweidekrankheiten, wie z.B. Bandwurminfektion, sowie Krankheiten, die andere Organe in Mitleidenschaft ziehen, z.B. Nierenentzündung oder-erweichungen ebenfalls mit umfaßt werden. In dem Fall, wo sich die Krankheit selbst als Durchfallkrankheit manifestiert, kann die Krankheit ein Ergebnis von Salmonella, Shigella, E. coli, Corona virus, coccidiosis oder irgendeine andere Infektion sein.
Die Zahl der Stämme der verschiedenen Lactobacilli-Stämme, auf die sich diese Beschreibung bezieht, sind die Kontrollzahlen, unter denen diese Stämme in der Lactobacilli- Kultursammlung der Universität von Pretoria, Republik Südafrika, hinterlegt sind. Die so identifizierten Stämme sind bei dieser Quelle erhältlich. Die in Frage stehenden Stämme sind ferner erhältlich aus einer natürlichen Quelle, nämlich aus dem Verdauungstrakt eines Wiederkäuers, wobei solche Stämme unter Bezugnahme auf ihren in vitro-Antagonismus gegenüber den dreizehn Versuchsstämmen enteropathogenischer Bakterien typifiziert werden können, wie sie in Tabelle 3 im Beispiel 2 weiter unten angegeben sind. Diese dort angegebenen Versuchsstämme sind aus der Kultursammlung der Universität von Pretoria oder vom South African Institute for Veterinary Sciences in Onderstepoort, Republik Südafrika, erhältlich.
Ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu begrenzen, wird die Erfindung im folgenden unter Bezugnahme auf die beiliegenden Beispiele näher erläutert.

BEISPIEL 1

Zubereitung des Impfmittels

Aus dem Verdauungstrakt eines frisch geschlachteten,gut ernährten, gesunden Ochsens wurde eine Probe aus dem Inhalt des Pansens und anderer Stellen entlang des Verdauungstraktes entnommen, um eine repräsentative, kombinierte Probe der Inhalte des gesamten Verdauungstraktes zu erhalten.
Die so erhaltene Probe, die Milchsäurebakterien enthält, wurde für 72 Stunden bei 27 ºC auf einem Luzernenmahl kultiviert bzw. gezüchtet, das mit sterilem Wasser angefeuchtet war, und dessen pH auf 5,5 eingestellt wurde. Die Kultur wurde unter Luftströmung getrocknet und der getrocknete Rest wurde verwendet, um eine neue Luzernenmahl-Partie zu impfen.
Dieser Vorgang wurde einige Male wiederholt, um eine symbiotisch stabile Steigerung oder eine dominante Population von Milchsäurebakterien zu erhalten. Das entstandene, endgültige Restprodukt wurde als Master- Impfmittel bei der Herstellung der weiter unten beschriebenen Zubereitungen verwendet.

BEISPIEL 2

Herstellung der Zubereitung RB

50 Kg fein durchgesiebtes, trockenes Luzernenmahl wurde in ein Fermentationsgefäß eingewogen. Etwa 150 Liter Leitungswasser wurden mit der Hilfe von Essigsäure auf einen pH von 4,5 eingestellt. Eine pilzhemmende, wirksame Menge (etwa 0,2 Gew.-%) Kaliumsorbat wurde zum Wasser hinzugegeben.
Etwa 100 bis 200 Gramm des Mutterimpfmittels, das hergestellt worden ist, wie es im vorliegenden Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde danach mit dem pH eingestellten Wasser vermischt und das geimpfte Wasser wurde zum ausgewogenen Luzernenmahl hinzugeführt, um eine Pulpe bzw. einen Brei zu erzeugen.
Die Pulpe wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Züchtung der Bakterien zu ermöglichen. Während der Züchtung wurden Gase aus der Brühe freigesetzt. Der Luftausschluß wurde herbeigeführt, indem das Gefäß mit wassergefüllten Kunststoffbeuteln abgedeckt wurde, alternativ kann eine anaerobische Atmosphäre in einem hermetisch abgedichteten Fermentationskessel erzeugt werden.
Nach 72 Stunden wurde die Brühe bzw. der Brei über einen trockenen Tisch ausgebreitet und in einem Windtunnel bei etwa 40 ºC getrocknet.
Das getrocknete Produkt wurde durchgesiebt, um ein feines Pulver zu erhalten, das homogenisiert war. Die so erhaltene Zubereitung wurde mit RB kodiert.
Das getrocknete Produkt war gelbbraun bis olivgrün-gelb hinsichtlich seiner Farbe und seine chemische Analyse war wie folgt: Protein Fett Asche Fasern Calcium Posphor Kalium Magnesium Natrium
Eine alternative und reinere Form der Zubereitung wurde in der gleichen Weise hergestellt, außer daß das Luzernenmahl für 2 Stunden dampfsterilisiert wurde, bevor es mit einem alternativen Impfmittel geimpft wurde, und wobei das alternative Impfmittel zubereitet wurde, indem man das Impfmittel des Beispiels 1 durch das Gießplattenverfahren auf MRS und Rogosa agar, wie es im Handel bekannt ist, kultiviert, sammelt und die Milchsäurebakterien, die Kolonien auf diesen Mitteln gebildet haben, kombiniert. Die auf diese Art und Weise erhaltenen isolierten Produkte dienen als alternatives Impfmittel für eine Herstellungspartie, die in der oben beschriebenen Art und Weise zubereitet werden. Das auf diese Art und Weise erhaltene Produkt wurde mit RB-P bezeichnet bzw. kodiert und enthielt einen unbestimmten Teil des vollen Spektrums der dominanten Milchsäurebakterienpopulation, die oben erwähnt wurde.

BEISPIEL 3

Quantitative Analyse und Stabilität des RB

Die quantitative Analyse der Milchsäurebakterienpopulation in dem RB-Produkt wurde ausgeführt, indem eine 10-%ige m/m Suspension von RB in sterilem Wasser auf einen pH von 5,5 mit Essigsäure eingestellt wurde. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, nachdem eine Verdünnung mit Wasser durchgeführt wurde, das auf den gleichen pH eingestellt war.
Rogosa-agar wurde nach den Liefervorschriften hergestellt, erwärmt und in Petri-Schüsseln gefüllt, worauf das Impfmittel dann für 4 Tage bei 28 ºC bei einer Feuchtigkeit von 70 % ausgebrütet wurde. Sämtliche sichtbaren Kolonien wurden als Milchsäurebakterien entfernt.
Proben des wie im Beispiel 2 beschrieben zubereiteten RB wurden in Papierbeuteln bei 25 ºC gelagert und wurden wöchentlichen Analysen über eine Zeitspanne von 2 Monaten unterworfen. Eine Endanalyse wurde nach weiteren 6 Wochen durchgeführt.
Standard-mikrobiologische Anlysen wurden wie folgt durchgeführt:
- Reihenverdünnungen wurden durchgeführt, indem 20 g Proben von RB in 180 ml ein Viertel starken Ringerpuffer (steril) für 2 Minuten in einem Stomacher homogenisiert wurden.
- Weitere Verdünnungen wurden von dieser 1:10 Verdünnung in 9 ml Blindverdünnungen hergestellt.
- Gesamte aerobische Mikroben-Population ("kultivierte Mikroben") wurden am Standard I - agar (Merck) festgestellt; Inkubation: aerob. 2 - 3 Tage/30 ºC.
- Gesamte Milchsäurebakterienzählung:
- MRS-agar mit 0,1 % K-sorbat ph 5,7; anaerobische Inkubation bei 30 ºC/3 Tage
- Rogosa-agar (Merck) (pH 5,4): anaerobische Inkubation bei 30 ºC/ 4 - 5 Tage.
- Pilze:
direkt auf St. I-agar, basierend auf unterscheidbarer Kolonie-Art.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. TABELLE 1 Lebend-Zählungen pro g von RB Lactobacilli Lagerung Zeit Wochen Gesamtpopulation Pilz MRS Rogosa
Es ist ersichtlich, daß es keine größere Verringerung in der Anzahl der Mikroben über die Zeitspanne gegeben hat, und daß die Milchsäurebakterien zwischen 50 % und 90 % der Gesamtpopulation repräsentieren. Es sollte ebenfalls im Gedächtnis behalten werden, daß sämtliche Milchsäurebakterien nicht notwendigerweise auf den ausgewählten Mitteln wachsen und daß ihre Population tatsächlich höher sein könnte.
Auf der Basis extrapolierter Versuchsergebnisse kann angenommen werden, daß RB eine Milchsäurebakterienpopulation von mindestens 1x10&sup6;/g nach 6-monatiger Lagerung besitzen würde.

BEISPIEL 4

Qualitative Analyse

Representative Isolierungen wurden von den Plattenzählungen, auf die in Beispiel 3 Bezug genommen wird, über die ersten 3 bis 4 Wochen gemacht. Orientierungsuntersuchungen wurden durchgeführt (durch Mikroskop und Katalase-Tests) nach anfänglicher Reinigung unter Bestätigung, daß sämtliche Isolierungen Milchsäurebakterien waren.
(a) Zur Phänotyp-Charakterisierung wurden die folgenden Versuche durchgeführt:
- Fermentationspotential mit Bezug auf 29 verschiedene Zucker,
- Hydrolyse von Arginin,
- Konfiguration der gebildeten Milchsäure,
- Gegenwart von Diaminopimelinsäure in der Zellwandung,
- Schleimbildung von Sacharose,
- Zucht in 4,5 % und 10 & NaCl,
- Zucht bei 4 ºC, 15 ºC, 37 ºC und 45 ºC,
- Reaktion in Lakmusmilch. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. TABELLE 2 Phänotyp-Kennzeichnung der Milchsäurebakterien in RB Anzahl der Stämme Lactobacillus bavaricus Lactobacillus casei ssp. rhamnosus Lactobacillus coryniformis Lactobacillus curvatus Lactobacillus sake Streptocuccus sp. Leuconostoc spp.
(b) Der in vitro-Antagonismus der 32 isolierten Milchsäurebakterienstämme gegen 13 enteropathogenische Versuchsstämme wurde untersucht, um die 32 Stämme zu kennzeichnen, die vom RB-Produkt isoliert worden sind.
Die verschiedenartigen Isolierungen der Milchsäurebakterien wurden auf MRS agar gezüchtet und Scheiben wurden aus dem Zuchtmedium herausgeschnitten. Die enteropathogenischen Versuchsstämme wurden auf einem Standard I-agar durch das Gießplattenverfahren eingeimpft und die Scheiben der kultivierten Milchsäurebakterien wurden auf das eingeimpfte Mittel gelegt. Nach einer Inkubation von 1 bis 2 Tagen bei 30 ºC wurden die Durchmesser der entstandenen klaren Inhibitionszonen gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 zusammengefaßt, wobei das Ausmaß der Inhibition bzw. Hemmung wie folgt angedeutet wird:
- Inhibitionszone geringer als 0,5 cm
+ Inhibitionszone größer als 0,5 cm, jedoch geringer als 1,0 cm
++ Inhibitionszone größer als 1,0 cm TABELLE 3 Lactobacillus-Isolierungen Versuchsstämme Spezies/Stamm-Nr. S. java (UP) S. typhimurium (UP) Strep. Faecium (UP) S. typhi S. anatum S. loma-linda E. coli Lb. sake Lb. curvatus Lb. casei (rham) Lb. coryniformis Lb. bavaricus Streptococcus sp. Leuconostoc sp.
Ausmaß der Inhibition
- Inhibitionszone 0,5 cm
+ Inhibitionszone 0,5 cm, jedoch 1,0 cm
++ Inhibitionszone 1,0 cm

BEISPIEL 5

Toxizität

(a) Überdosis
Die empfohlene Dosierung von RB für junge Kälber liegt bei 4 g pro zweimaliger Zugabe am Tag.
Es wurden keine Veränderungen im Zustand, im generellen Gesundheitsbild oder Körpergewicht junger Kälber beobachtet im Vergleich zu einer nicht behandelten Kontrollgruppe junger Kälber, wenn
(i) 16 g zweimal am Tag für 6 Wochen verabreicht wurden, d.h. die vierfache empfohlene Dosis, oder
(ii) die 20-fache empfohlene Dosis wurde zweimal am Tag für 5 Tage verabreicht oder
(iii) die 125-fache empfohlene Dosis über 2 Tage verabreicht wurde.
(b) Da die Zubereitung gedacht ist zur Verabreichung bei Jungtieren und nicht bei ausgewachsenen Tieren, wurde die Feststellung von teratogenischen oder mutagenischen Effekten als nicht erforderlich angesehen.
(c) Reste
Da die Produktzusammensetzung im wesentlichen dem Teil des Inhaltes des Verdauungstraktes äquivalent ist, konnten in den Muskeln der behandelten Tiere keine Metaboliten festgestellt werden.

BEISPIEL 6

Prophylaktische Behandlung gegen Durchfallerkrankung

Auf einem Milchwirtschaftsgut mit einem Gestüt von etwa 60 friesischen Kühen war die Überlebensgeschichte anhand aufgezogener Kälber über 3 Jahre wie folgt: Jahr geborene Kälber Todesfälle Überlebende
Dementsprechend betrug die Durchschnittsüberlebensrate 20,3 % und die meisten der Kälber verstarben nach einer schwerwiegenden Durchfallerkrankung.
Im vierten Jahr wurden sämtliche Kälber mit RB behandelt, indem 4 g RB-Pulver in ihrer Milch bei jeder Fütterung suspendiert wurden. Während dieser Zeitspanne wurde keine antibakterielle Behandlung verabreicht. Die Kälber wurden zwei Tage nach der Geburt mit ihren Müttern zusammengelassen und danach in Lagern auf Stroh (Kikuyu) getrennt, wo grobe Nahrung, Kalbszuchtmahl und frisches Wasser konstant erhältlich waren. Die Kälber wurden Kälberparatyphus und Pasteurella nach 1 und 4 Wochen geimpft und mit MULTISPEC R (einem Produkt, das bei Janssen Pharmaceuticals vermarktet wird) im ersten und vierten Monat, in Abhängigkeit vom Zustand behandelt.
Die Überlebensrate war wie folgt: Jahr geborene Kälber Todesfälle Überlebende
Dementsprechend wurde eine Überlebensrate von 90.7 % erzielt und diejenigen Todesfälle, die auftraten, waren nicht auf Durchfallerkrankungen zurückzuführen.

BEISPIEL 7

Heilbehandlung von Durchfallerkrankungen mit unbekanntem Grund

Neun friesische Kälber des Alters zwischen 3 und 5 Tagen, die sämtlich an schwerer Durchfallerkrankung litten, wurden in abgetrennte Laufställe verlegt, und zwei Kälber, die zur Kontrolle genommen wurden, erhielten keine Behandlung. Die anderen 7 erhielten 8 g von RB-P in einem halben Liter Milch pro Fütterung für die ersten drei Tage vom Anfang des Versuches an, und in allen 7 Fällen wurden die Durchfallerkrankungen angehalten, außer in 2 Fällen, wo eine schwache Durchfallerkrankung immer noch vorlag. Am vierten Tag wurde keine Behandlung durchgeführt. Am fünften Tag wurden den beiden Kälbern, die Zeichen leichter Durchfallerkrankung aufwiesen, wiederum 8 g von RB-P in einem halben Liter Milch verabreicht, während den anderen 4 g von RB-P in einem halben Liter Milch pro Fütterung gegeben wurde.
Die Behandlung mit einem Maß von 4 g von RB-P wurde für alle sieben bis zum Abgewöhnen sechs Wochen lang durchgeführt, außer bei einem der behandelten Kälber, das am 27. Tag wegen Lungenentzündung stark.
Die beiden nicht behandelten Kälber zeigten beide eine fortgesetzte Verschlimmerung und starben beide am dritten Tag, nachdem mit dem Versuch begonnen wurde, und nachdem sie an einer sehr schweren Durchfallerkrankung litten.
In sämtlichen Fällen hatten die Kälber freien Zugang zum Zuchtmahl, zur groben Nahrung und zum Wasser.
Der Grund der Durchfallerkrankungen wurde in diesem Versuch nicht nachgewiesen.

BEISPIEL 8

Behandlung von durch E. coli-haltiges Ungenießbares hervorgerufene Durchfallerkrankungen

Zwei friesische Kälber mit 18 bzw. 22 Tagen Alter, beide an sehr schwerer Durchfallerkrankung leidend, wurden durch die Verabreichung von 8 g RB-P zweimal täglich behandelt.
Die Exkremente beider Kälber wurden vor der Behandlung durch das S.A. Research Institute for Veterinary Sciences analysiert und enthielten E. coli-Ungenießbares. In einem dieser Fälle waren die Exkremente in der Farbe weißlich und im anderen Fall blutig.
Nach 12-stündiger Behandlung begann sich die Durchfallerkrankung abzuschwächen und hörte vollständig nach 36 Stunden auf.
Die Behandlung von zweimal 8 g RB-P pro Tag wurde für sieben Tage fortgeführt und danach auf zweimal 4 g RB-P pro Tag für weitere 14 Tage abgeändert.
Beide Kälber erholten sich vollständig.

BEISPIEL 9

Behandlung einer bekannten pathogenischen E. coli-hervorgerufenen Durchfallerkrankung

Drei gesunde zwei Tage alte Kälber wurden in getrennte Gehege verbracht. Für die ersten drei Tage wurde jedem Kalb ein Liter Colostrum zweimal täglich und ein Liter lauwarmes Wasser täglich gegeben. Vom sechsten Tag an wurde das Colostrum ersetzt durch einen Milchersatz.
Vom Beginn des Versuches an wurde einem Kalb 4 g RB pro Fütterung und einem zweiten Kalb 4 g RB-P pro Fütterung gegeben. Das dritte Kalb wurde unbehandelt gelassen.
Beim Alter von sieben Tagen wurden sämtliche drei Kälber mit einer Dosis von pathogenem E.coli 09:K30,99 infiziert, das durch das Research Institute for Veterinary Sciences zubereitet worden war.
Das unbehandelte Kalb entwickelte am zweiten Tag nach der Infektion Durchfall, der sich über den nächsten Tag steigerte, und das Kalb starb am folgenden Tag.
Das mit RB behandelte Kalb zeigte keine Zeichen von Durchfallerkrankung und wurde im Alter von 43 Tagen entwöhnt.
Das mit RB-P behandelte Kalb entwickelte einen leichten Durchfall und die Behandlungsdosis wurde auf 8 g RB-P pro Fütterung für drei Tage erhöht. Die Durchfallerkrankung verschwand nach einem Tag und die Behandlung wurde auf die normale Dosis reduziert bis zur Entwöhnung im Alter von 43 Tagen.

BEISPIEL 10

Behandlung einer durch Corona-Virus hervorgerufenen Durchfallerkrankung

Auf einem Jersey Gestüt-Milcherzeugungsbetrieb mit Tieren sehr hoher Qualität, hat man die Erfahrung gemacht, daß Kälber,die zwei Tage mit ihren Müttern verbrachten, einen weißlichen Druchfall entwickelten, der nach der Trennung rötlich wurde. Obwohl nur relativ wenige Kälber starben, da sich der Zustand normalerweise selbst innerhalb von drei Tagen auflöst, ist solches Auftreten natürlich für das Image des Gestüts abträglich.
Das Research Institue for Veterinary Sciences isolierte den Corona-Virus von den Exkrementen der betroffenen Kälber, wobei jedoch einige Versuche,die Situation zu verbessern, nicht erfolgreich waren.
Nachdem die Kälber einer Behandlung unterzogen wurden, die die Verabreichung von 4 g RB pro Fütterung enthält, wird der Durchfall angehalten, wobei jedoch die typische Durchfallerkrankung wieder auftritt, wenn die Behandlung für vier Tage unterbrochen wird.

BEISPIEL 11

Behandlung von Nierenerweichung u. dgl.

Es ist beobachtet worden, daß der Transport von Schafen oder eine Veränderung in den Nahrungsmitteln bei Schafen häufig zu einer erhöhten Verbreitung von Todesfällen als Ergebnis von Nierenerweichungen bei solchen Schafen führt.
(a) Um die Wirkung von RB auf Schafe zu bewerten, die Bedingungen ausgesetzt sind, welche das Risiko des Eintretens von Nierenerweichungen steigern, wurde eine Herde von 50 Merinoschafen im Karroo gekauft und zu einem Futtergelände im Transvaal transportiert, wo die Futtermittelanpassung in der Vergangenheit häufig zum Tode aufgrund von Nierenerweichungen geführt hat.
Die Hälfte der Herde erhielt keine Behandlung als Kontrollgruppe, während die anderen 25 Schafe 4 g von RB pro Tag erhielten, indem das trockene Pulver nach der Ankunft für drei Tage auf die Zunge gelegt wurde.
Die Kontrollgruppe erlitt einen bedeutenden Körperverlust und drei von den 25 starben als Ergebnis der Nierenerweichung.
Die behandelte Gruppe erlitt keinerlei bedeutsame Körperverluste, und es traten in dieser Gruppe auch keine Todesfälle auf.
(b) In vitro-Versuche am Nierenerweichung hervorrufenden Organismus zeigen, daß solch ein Organismus im wesentlichen mittels des RB-Produktes eliminiert wurde.

BEISPIEL 12

Coccidiosis

Vorangehende Indikationen, die bei Versuchen mit Lämmern erhalten worden sind, die an typischen Coccidiosissymptomen litten, deuteten eine Aktivität von RB gegenüber dieser Form der Infektion an. Diese Versuche werden gegenwärtig fortgeführt.

BEISPIEL 13

Bandwurmkontrolle

Die Arbeiten zur Bewertung der Kontrolle, die RB gegenüber Bandwurmheimsuchung leistet, sind vielversprechend genug gewesen, um weitere Untersuchungen zu rechtfertigen.

BEISPIEL 14

Salmonellen

Eine Herde von Schafen eines Futterplatzes, die an Salmonella-hervorgerufener Diarrhoe bzw. Durchfallerkrankung litten, wurde in vier Gruppen aufgeteilt. Zwei Gruppen wurden mit registrierten chemotherapeutischen Zusammensetzungen behandelt, die für Salmonelleninfektionen gedacht sind, eine dritte Gruppe wurde als eine nicht behandelte Kontrollgruppe eingesetzt, währen die vierte Gruppe mit RB behandelt wurde.
Sämtliche mit RB behandelten Tiere erholten sich, während die nicht behandelten und Chemotherapie-behandelten Kontrollgruppen sämtlich unter Todesfällen litten, die im Bereich von 30 bis 50 % der infizierten Tiere lag.

BEISPIEL 15

Futterumwandlungswirksamkeit

Zwei Gruppen von Merinoschafen annähernd gleichen Anfangsgewichts (28 Kg im Durchschnitt) erhielten die gleichen Rationen über eine Zeitspanne von 63 Tagen vor der Schlachtung.
Einer Versuchsgruppe wurde zusätzlich ebenfalls 10 ml des flüssigen RB-Produktes verabreicht, das wie im weiter unten stehenden Beispiel 16 beschrieben hergestellt wurde, und zwar zu Beginn des Versuches, während die Kontrollgruppe keine RB erhielt.
Die durchschnittliche tägliche Massen- bzw. Gewichtszunahme (lebende Masse) der Testgruppe war 10,8 % höher als die der Kontrollgruppe, was einer Futterumwandlungswirksamkeit entspricht, die 5,9 % besser als die der Kontrollgruppe ist. Der letztendliche körperliche Massengewinn der behandelten Gruppe war etwa 8,6 % besser als der der nicht behandelten Gruppe, während die Futterumwandlung zur Körpermasse 10,7 % besser in der behandelten Gruppe war, im Vergleich zur nicht behandelten Gruppe. Die Qualität des Fleiches der behandelten Gruppe war ebenfalls höher. Diese Faktoren zusammengenommen ergeben einen 25,9 % besseren Ertrag für die behandelte Gruppe, relativ zur nicht behandelten Gruppe. Das gleiche Experiment wurde mit ausgewachsenen Schafen durchgeführt (Durchschnittsanfangsgewicht 35 Kg) und in diesem Fall war der Endertrag für die behandelte Gruppe 23,8% besser als der für die nicht behandelte Gruppe.

BEISPIEL 16

Zubereitung der flüssigen Zusammensetzung und Kit bzw. Ausrüstung zur Verwendung derselben

Eine Ausrüstung zur Verwendung bei der Herstellung einer flüssigen Zubereitung wird in Fig. 1 aufgezeigt, die eine teilweise weggebrochene perspektivische Ansicht des Behälters zeigt, der Teil der Ausrüstung ist und die anderen Elemente zeigt. Die Ausrüstung umfaßt typischerweise einen Einliterbehälter 1, der aus Polymermaterial besteht und in den die Nährlösung 2 eingefüllt ist, umfassend:
Pepton 4 g
Hefe Extrakt 5 g
Glucose 8 g
Triammonium Citrat 3 g
Natrium Acetat 5 g
Magnesium Sulfat 0,1 g
Mangan Sulfat 0,05 g
Di-Kalium Phosphat 2 g
Kalium Sorbat 1 g um den pH der wäßrigen Lösung auf etwa 5,8 zu bringen und eine Milchsäurebakterien-Impfmischung in einem Halter, wie weiter unten beschrieben.
Der Halter besitzt die Form eines permeablen Papierbeutels 3 von der Art, die üblicherweise als Tee- oder Kaffeebeutel verwendet wird, in den eine 100 g Menge des RB-Produktes eingefüllt wird, das nach dem oben beschriebenen Beispiel 2 zubereitet wurde.
Der Beutel 3 wurde mit einer Schnur versehen, mittels derer er in den Behälter 1 hineingehängt wird und an seinem Platz gehalten werden kann, indem die Schnur 4 zwischen der Ausgießöffnung 5 und der Kappe 6 des Behälters eingeklemmt wird.
Bei der Verwendung des Behälters, der das Nährmittel enthält, wurde dieser einfach mit Wasser gefüllt und geschüttelt, um den Nährstoff aufzulösen. Der Beutel 3 wurde danach in die Nährlösung eingeführt und an seinem Platz aufgehängt, indem die Schnur 4 zwischen der Tülle 5 und der Kappe 6 eingeklemmt wurde, die ihrerseits lose an der Tülle angebracht wurde, damit Gase aus dem Behälter entweichen können.
Man ließ den Behälter für etwa 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um die Zucht der Milchsäurebakterien zu ermöglichen. Das Wasser-Gemisch wurde während dieser Zeitspanne aufgrund des Vorhandenseins der Bakterien milchig.
Der Impfungsbeutel wurde entfernt und die flüssige Zusammensetzung wurde oral mittels eines spritzenartigen Dosierungslaufes den Tieren verabreicht, die eine solche Behandlung benötigen. Das so erhaltene Produkt wird im obigen Beispiel 15 als flüssiges RB bezeichnet. 5 bis 10 ml Dosen diese Produktes können den Tieren in Abhängigkeit von der Größe verabreicht werden. Die Wirksamkeit des so zubereiteten Produktes läßt sich vergleichen mit der des oben beschriebenen trockenen RB- Produktes.
Viele Variationen der Erfindung können durchgeführt werden, ohne jedoch den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Erfolgreiche Behandlungen sind ebenfalls bei von Hand aufgezogenen Lämmern erzielt worden (bei 1 g pro Einzelfütterung pro Tag), ebenso bei Menschen, jedoch werden zur Bestätigung dieser Ergebnisse Versuche weiterhin durchgeführt.

Claims

1. Zubereitung, geeignet zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Darmkrankheiten bei Tieren, umfassend zwei oder mehrere Milchsäurebakterien, ausgewählt aus Phänotypen der folgenden Spezies, nämlich: Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Streptococcus sp. (Enterococcus spp.) und Leuconostoc spp.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, die Milchsäurebakterien von zwei oder mehreren (vorzugsweise sämtliche) Stämme von Lb. sake L2622, Lb. curvatus L2623, Lb. casei (rham) L2624, Lb. curvatus L2625, Lb. sake L2626, Lb. coryniformis L2627, Lb. curvatus L2628, Lb. curvatus L2629, Lb. curvatus L2630, Lb. curvatus L2632, Lb. curvatus L2635, Lb. curvatus L2638, Lb. casei (rham) L2640, Lb. bavaricus L2641 , Lb. coryniformis L2643, Lb. sake L2644, Lb. curvatus L2645, Lb. coryniformis L2546, Lb. curvatus L2647, Lb. corynifarmis L2651 , Lb. coryniformis L2653, Lb. curvatus L2654, Lb. curvatus L2655, Lb. sake L2656, Lb. curvatus L2657, Lb. coryniformis L2658, Lb. curvatus L2659, Streptococcus sp. L2801 , Leuconostoc sp. L2806, und Leucoconstoc sp. L2807 umfaßt, wobei die Stämme wie im Teil (b) des Beispiels 4 einschließlich Tabelle 3 angegeben typisch sind.

3. Zubereitung nach Anspruch 2, die zusätzlich eine oder mehrere Stämme umfaßt, die aus Lb. bavaricus L2648 Leuconostoc sp.L2803 ausgewählt werden, wie sie im Beispiel 4 (b), einschließlich Tabelle 3, dargestellt sind.

4. Zubereitung nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 3, die (a) in Form eines Trockenpulvers vorliegt, das vorzugsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Träger in Form des Restes eines geeigneten Zuchtmittels für Milchsäurebakterien umfaßt (z.B. ein Zuchtmittel, ausgewählt aus Luzernenmahl, Maismahl, Weizenmahl und Molke) oder (b) in Form einer flüssigen Zusammensetzung, die vorzugsweise eine wäßrige Zusammensetzung ist und einen wasserlöslichen milchsäurebakterienspezifischen Nährstoff enthält.

5. Verfahren zum Herstellen einer Zubereitung, geeignet zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Darmkrankheiten bei Tieren, umfassend die Stufen des Impfens eines geeigneten nicht-toxischen organischen Zuchtmittels mit einem Milchsäurebakterien-Impfmittel, umfassend zwei oder mehrere Milchsäurebakterien, die von den Phänotypen folgender Spezies ausgewählt werden, nämlich: Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus casei, ssp. rhamnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Streptococcus sp. (Enterococcus spp.) und Leuconostoc spp., kultivieren des geimpften Zuchtmittels unter Bedingungen, die die Vervielfachung der Milchsäurebakterien bis zu einer bevorzugten Population ermöglichen und wahlweise Entwässern des Zuchtmittels und seiner zugehörigen Population der Milchsäurebakterien unter Bedingungen, die im wesentlichen nicht-vernichtend für die Milchsäurebaterien sind, um die Zubereitung zu erhalten.

6. Verfahren nach Anspruch 5, beim dem das Impfmittel eine Mischung von Milchsäurebakterien von zwei oder mehreren (vorzugsweise sämtlichen) Stämme umfaßt: Lb. sake L2622, Lb. curvatus L2623, Lb. casei (rham) L2624, Lb. curvatus L2625, Lb. sake L2626, Lb. cornyformis L2627, Lb. curvatus L2628, Lb. curvatus L2629, Lb. curvatus L2630, Lb. curvatus L2632, Lb. curvatus L2635, Lb. curvatus L2638, Lb. casei (rham) L2640, Lb. bavaricus L2641, Lb. coryniformis L2643, Lb. sake L2644, Lb. curvatus L2645, Lb. coryniformis L2546, Lb. curvatus L2647, Lb. coryniformis L2651, Lb. coryniformis L2653, Lb. curvatus L2654, Lb. curvatus L2655, Lb. sake L2656, Lb. curvatus L2657, Lb. coryniformis L2658, Lb. curvatus L2659, Streptococcus sp. L2801, Leuconostoc sp. L2806, und Leuconostoc sp. L2807 wobei die Stämme wie im Beispiel 4 (b),einschließlich Tabelle 3, angegeben typisch sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Impfmittel ferner mindestens eine der Stämme Lb. bavaricus L2648 und Leuconostoc sp. L2803 umfaßt, wie im Beispiel 4 (b), einschließlich Tabelle 3, als typisch angegeben.

8. Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, bei dem das Zuchtmittel ausgewählt wird aus Luzernenmahl, Maismahl, Weizenmahl und Molke, vorzugsweise ein Schlamm des Luzernenmahls in Wasser in einem Gewichtverhältnis von etwa 1:3, wobei das Wasser vorzugsweise auf einen pH zwischen 3,5 und 6,9 (z.B. etwa 4,5) eingestellt wird.

9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 - 8, bei dem das Zuchtmittel ein Fungizid enthält, das nicht-toxisch für Milchsäurebakterien ist, vorzugsweise Natriumsorbat.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 - 9, bei dem das kultivierte Zuchtmittel entwässert wird durch Ausbreiten desselben, über das man dann einen Luftstrom hinwegführt bei einer Temperatur zwischen 15ºC und 40ºC, wobei das getrocknete Produkt wahlweise durch ein feines Gitter hindurchgeführt und homogenisiert wird, um die Zubereitung in Form eines feinen getrockneten Pulvers zu erhalten.

11. Verfahren zum Herstellen eines geeigneten Impfmittels zur Verwendung bei einem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 - 10, umfassend die Stufen des Sammelns der Inhalte des Verdauungstraktes von geschlachteten, gesunden Tieren, um eine representative Probe solcher Inhalte zu erhalten, Kultivieren der Mikroorganismen in solcher Probe in einem geeigneten Zuchtmittel für Milchsäurebakterien und Entwässern des kultivierten Gemisches, um ein Muttermischungs-Impfmittel von Milchsäurebakterien zu erhalten, wobei das Tier vorzugsweise ein Wiederkäuer, vorzugsweise aus Rindern und Schafen ausgewählt, ist.

12. Verfahren zum Herstellen einer flüssigen Zubereitung, geeignet zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Darmkrankheiten bei Tieren, umfassend die Stufen des Vorsehens eines Impfmittels, hergestellt durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 - 10 in einem permeablen Halter dafür (vorzugsweise einer permeablen Papiertüte), Anordnen des Halters in einem flüssigen Zuchtmittel, das Wasser und einen aufgelösten Nährstoff für die Milchsäurebakterien enthält, Ermöglichen, daß die Milchsäurebakterien kultiviert werden und Durchdringen des Halters in das Zuchtmittel hinein und Entfernen des Halters von der so erhaltenen flüssigen Zubereitung, wobei der Nährstoff vorzugsweise eine Kombination der folgenden Stoffe in dem Massenverhältnis enthält, wie es im wesentlichen angegeben ist:

Pepton 4 Teile

Hefe Extrakt 5 Teile

Glucose 8 Teile

Triammonium Citrat 3 Teile

Natrium Acetat 5 Teile

Magnesium Sulfat 0,1 Teile

Mangan Sulfat 0,05 Teile

Di-Kalium Phosphat 2 Teile

Kalium Sorbat 1 Teil

Apfelsäure um den pH der wäßrigen Lösung der Nährstoffe auf etwa 5,8 zu bringen.

13. Verwendung zwei oder mehrerer Milchsäurebakterien, ausgewählt aus den Phänotypen der folgenden Spezies, nämlich: Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Streptococcus sp.(Enterococcus spp.) und Leuconostoc spp. bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Verwendung bei der Steigerung der Futterumwandlungswirksamkeit bei Tieren oder bei der Behanldung oder Prophylaxe von Darmkrankheiten bei Tieren.

14. Kit bzw. Ausrüstung zur Verwendung bei der Herstellung einer flüssigen Zubereitung, geeignet zur Verwendung in der Behandlung oder Prophylaxe von Darmkrankheiten bei Tieren, umfassend einen Behälter, geeignet mit Wasser gefüllt verwendet zu werden, wobei der Behälter einen wasserlöslichen, trockenen Nährstoff für die Milchsäurebakterien und einen entfernbaren Halter enthält, der für Milchsäurebakterien permeabel ist und ein Bakteriengemisch enthält, wie es in den Ansprüchen 1 - 3 definiert ist, und wobei der Nährstoff vorzugsweise ein Gemisch der folgenden Stoffe enthält, im wesentlichen in dem angegebenen Massenverhältnis: