DE69936382T3

DE69936382T3 - Therapeutische verwendungen von il-17 homologe polypeptide

Info

Publication number: DE69936382T3
Application number: DE69936382T
Authority: DE
Inventors: Jian Plainsborough CHEN; Ellen San Francisco FILVAROFF; Audrey San Francisco Goddard; Austin L. Belmont GURNEY; Hanzhong San Mateo LI; William I. Hillsborough WOOD
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2011-07-07
Anticipated expiration: 2019-05-15
Also published as: EP1076703A2; CA2328496A1; CY1106885T1; WO1999060127A3; DK1076703T4; WO1999060127A9; US7749500B2; PT1076703E; US20090022725A1; DE69936382T2; CA2328496C; DK1076703T3; US20060205038A1; EP2333069A2; US20020052027A1; US7115398B2; NZ508878A; DE69936382D1; ES2292242T3; US8075888B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen antagonistische Antikörper für ein Polypeptid, das Sequenzidentität mit dem Cytokin IL-17 und dem zytotoxischen T-Lymphozyten-assoziierten Antigen 8 (CTLA-8) aufweist, das hierin als PRO1122-Polypeptid bezeichnet wird, und deren therapeutische Verwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wurde berichtet, dass das Cytokin Interleukin 17 (IL-17) Epithel-, Endothel- und Fibroblastenzellen stimuliert, Cytokine, wie z. B. IL-6, IL-8, und Granulozytenkoloniestimulierenden Faktor sowie Prostaglandin E2 zu sekretieren. Während die Expression von IL-17 auf aktivierte T-Zellen beschränkt ist, wird der IL-17-Rezeptor in großem Maß exprimiert – eine Eigenschaft, die mit den pleiotropen Aktivitäten von IL-17 übereinstimmt. Weiters wurde gezeigt, dass Fibroblasten, wenn sie in Gegenwart von IL-17 kultiviert wurden, die Proliferation der bevorzugten Reifung von CD34+ zu Neutrophilen unterstützen konnte. In der Folge könnte IL-17 ein früher Verstärker oder sogar ein Erhalter der T-Zellen-abhängigen Entzündungsreaktion und/oder ein Element des Cytokin-Netzwerks sein, das das Immunsystem mit der Blutbildung verbindet. Siehe Yao et al., J. Immunol. 155 (12), 5483–5486 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183 (6), 2593–2603 (1996); Kennedy et al., J. Interferon Cytokine Res. 16 (8), 611–617 (1996).
Im Allgemeinen sind neue Proteine von Interesse. Extrazelluläre Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Bildung, Differenzierung und Erhaltung von multizellulären Organismen. Die Bestimmung vieler individueller Zellen, z. B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder die Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhaltene Information bestimmt. Diese Information wird oft durch sekretierte Polypeptide (z. B. mitogene Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxische Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone) übertragen, die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen aufgenommen und interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder Signalmoleküle passieren gewöhnlicherweise den zellulären Sekretionsweg, um ihre Wirkstelle im extrazellulären Umfeld zu erreichen.
Sekretierte Proteine haben verschiedene gewerbliche Anwendungen, wie z. B. in pharmazeutischen Produkten, Diagnosemitteln, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten derzeit verfügbaren Proteinarzneimittel, wie z. B. thrombolytische Mittel, Interferone, Interleukine, Erythropoietine, Kolonie-stimulierende Faktoren und verschiedene weitere Cytokine, sind sekretorische Proteine. Deren Rezeptoren, die Membranproteine sind, weisen ebenfalls ein Potential als therapeutische oder diagnostische Wirkstoffe auf.
Es werden seitens der Industrie sowie im akademischen Bereich Bemühungen unternommen, neue native sekretierte Proteine zu identifizieren. Viele Bemühungen konzentrieren sich auf das Screenen von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken zur Identifizierung der Sequenzen, die für neue sekretierte Proteine kodieren. Beispiele für Screening-Verfahren und -Techniken sind in der Literatur beschrieben [siehe beispielsweise Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108–7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637 ). Die Ergebnisse dieser Bemühungen werden hierin vorgestellt.
Interleukin-17 ist ein kürzlich beschriebenes Cytokin, das von T-Zellen abstammt, wobei man erst beginnt, dessen biologische Funktionen zu verstehen. Spriggs et al., J. Clin. Immunol. 17, 366 (1997); H. E. Broxmeyer, J. Exp. Med. 183, 2411 (1996). Als IL-17 anfangs als c-DNA-Klon eines Nagetier-T-Zellen-Lymphoms identifiziert wurde, wurde erkannt, dass es eine ähnliche Sequenz wie ein offener Leseraster eines Primaten-Herpesvirus, Herpesvirus saimiri, aufwies – Rouvier et al., J. Immunol. 150, 5445 (1993); Yao et al., Immunity 3, 811 (1995) [Yao-1], Fossiez et al., J. Exp. Med. 183, 2593 (1996). In der Folge wurde bestätigt, dass dieses virale Protein zahlreiche, wenn nicht alle, immunstimulierenden Aktivitäten für den Wirt IL-17 aufweist. Fleckenstein und Desrosiers, ”Herpesvirus saimiri and herpesvirus ateles”, in: The Herpesviruses, 82, I. B. Roizman (Hrsg.), Plenum Publishing Press, New York (1982); B. I. Biesinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3116 (1992).
Menschliches IL-17 ist ein 20–30 kDa großes, homodimeres Protein mit Disulfid-Bindungen und variabler Glykosylierung. Yao-1, s. o.; Fossier et al., s. o. Ein offener Leserater mit 155 Aminosäuren, der eine N-terminale Sekretionssignalsequenz mit 19–23 Aminosäuren umfasst, kodiert dafür. Die Aminosäuresequenz von IL-17 ist nur dem oben beschriebenen Herpesvirus-Protein ähnlich und weist keine signifikante Identität mit den Sequenzen anderer Cytokine oder anderer bekannter Proteine auf. Zusätzlich dazu wurde die für IL-17 kodierende mRNA nur in aktivierten CD4⁺-Gedächtnis-T-Zellen und PMA/Ionomycin-stimulierten PBMC-Zellen nachgewiesen.
Trotz der eingeschränkten Gewebeverteilung weist IL-17 pleiotropische biologische Aktivitäten in Bezug auf verschiedene Zelltypen, wie z. B. Fibroblasten, Endothelzellen und Epithelzellen, auf. M. K. Spriggs, s. o.; H. E. Broxmeyer, s. o. Es wurde festgestellt, dass IL-17 die Produktion vieler Cytokine stimuliert: TNF-α und IL-1β bei Makrophagen [Jovanovic et al., J. Immunol. 160, 3513 (1998)]; 1L-6, IL-8 und das intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM-1) bei menschlichen Fibroblasten. Fossiez et al., s. o., Yao et al., J. Immunol. 155, 5483 (1995) [Yao-2]; Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSM) und Prostaglandin (PGE-2) bei Synoviozyten, Fossiez et al., s. o. Durch das Einführen einiger Cytokine kann IL-17 eine große Bandbreite an, hauptsächlich proinflammatorischen und hämatopoetischen, Reaktionen vermitteln. Dies führte zu der Vermutung, dass IL-17 eine wesentliche Rolle bei der Initiierung oder dem Aufrechterhalten einer Entzündungsantwort spielen kann. Jovanovic et al., s. o.
In Übereinstimmung mit der grollen Bandbreite der Wirkung von IL-17 wurde festgestellt, dass der Zelloberflächenrezeptor für IL-17 in zahlreichen Geweben und Zelltypen verbreitet exprimiert wird – Yao et al., Cytokine 9, 794 (1997) [Yao-3]. Während die Aminosäuresequenz des hIL-17-Rezeptors (866 Aminosäuren) ein Protein mit einer einzigen Transmembrandomäne und einer langen intrazellulären Domäne mit 525 Aminosäuren vorhersagt, ist die Rezeptorsequenz einzigartig und keinem anderen Rezeptor aus der Cytokin/Wachstumsfaktor-Rezeptor-Familie ähnlich. In Verbindung mit der mangelnden Ähnlichkeit von IL-17 selbst mit anderen bekannten Proteinen deutet das darauf hin, dass IL-17 und sein Rezeptor Teil einer neuen Familie von Signalproteinen und Rezeptoren sein könnte.
Es wurde durch intrazelluläre Signalübertragung weiters gezeigt, dass IL-17 ein vorübergehendes Ca²⁺-Einströmen und eine Reduktion von [cAMP]; bei menschlichen Makrophagen stimuliert. Jovanovic et al., s. o. Mit IL-17 behandelte Fibroblasten und Makrophagen induzieren die Aktivierung von NF-κB – Yao-1, s. o.; Jovanovic et al., s. o. – während damit behandelte Makrophagen NF-κB und Mitogen-aktivierte Proteinkinasen aktivieren. Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem. 273, 27467 (1998).
Die vorliegende Offenbarung beschreibt das Klonieren und die Charakterisierung von zwei neuen Proteinen, die als PRO1031 (IL-17B) und PRO1122 (IL-17C) bezeichnet werden, sowie aktive Varianten davon, die IL-17 in Bezug auf ihre Aminosäuresequenz ähnlich sind. Die Erfindung betrifft Letzteres, PRO1122 (IL-17C).
WO99/61617 , die ausschließlich für die Bewertung der Neuheit relevant ist, betrifft ebenfalls dasselbe Protein, wobei es darin als IL-21 bezeichnet wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben einen cDNA-Klon identifiziert, der für ein Polypeptid kodiert, das eine Sequenzidentität mit IL-17 aufweist, wobei das Polypeptid in der vorliegenden Anmeldung als PRO1122 bezeichnet wird.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, antagonistische Antikröper eines nativen PRO1122-Polypeptids bereit.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, eine Zusammensetzung, die einen wie obenstehend definierten PRO1122-Polypeptid-Antagonisten in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, die Verwendung eines PRO1122-Antagonisten zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung einer degenerativen Knorpelerkrankung eingesetzt werden kann.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die von den Nucleotiden 42–581 aus Seq.-ID Nr. 2 abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1). In 1 wird auch das Signalpeptid, eine N-Glykosylierungsstelle, eine Region, die mit IL-17 Sequenzidentität aufweist, Molekulargewicht und der ungefähre pI angeführt.
2 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 2), die die Nucleotidsequenz einer Nativsequenz-PRO1031-cDNA umfasst (Nucleotide 42-581 von Seq.-ID Nr. 2), wobei die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 2) ein Klon ist, der hierin als ”UNQ516” und/oder ”DNA59294-1381” bezeichnet wird.
3 zeigt die von den Nucleotiden 50–640 aus Seq.-ID Nr. 4 abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3). Es werden auch die ungefähren Stellen des Signalpeptids, eine Leucin-Zipper-Struktur in einer Region, die Sequenzidentität mit IL-17 aufweist, angeführt. Das ungefähre Gewicht in Dalton und der ungefähre pI werden auch angeführt.
4 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4), die eine Nucleotidsequenz einer Nativsequenz-PRO1122-cDNA (Nucleotide 50–640 von Seq.-ID Nr. 1) enthält, wobei die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4) ein Klon ist, der hierin als ”UNQ561” und/oder DNA62377-1381-1” bezeichnet wird. Die Komplementärsequenz und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden auch angeführt.
5 zeigt DNA47332 (Seq.-ID Nr. 5), ein virtuelles DNA-Fragment, das zur Isolierung von DNA59294 (Seq.-ID Nr. 2) verwendet wird.
6 zeigt DNA49665 (Incyte EST 1347523) (Seq.-ID Nr. 7), ein virtuelles Fragment, das zur Isolierung von DNA62377 (Seq.-ID Nr. 4) verwendet wird.
7 zeigt den Abgleich der durch DNA59624 (IL17-B) (Seq.-ID Nr. 6), DNA62377 (IL17-C) (Seq.-ID Nr. 3) und IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) kodierten Proteinsequenzen. Die vermutlichen Signalsequenzen sind unterstrichen, potentielle N-verbundene Glykosylierungsstellen sind doppelt unterstrichen, und die konservierten Tryptophan- und Cystein-Reste sind mit Sternen gekennzeichnet. IL-17, IL-17B und IL-17C weisen eine Aminosäureidentität von 26–28% miteinander auf. 7B zeigt nur den Abgleich der durch DNA59624 (Seq.-ID Nr. 1) und DNA62377 (Seq.-ID Nr. 3) kodierten Proteine.
8 ist eine RNA-Blot-Analyse von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1). Der Northern-Blot zeigt mRNA von menschlichen Geweben (Clontech), die an eine menschliche IL-17B-spezifische, radioaktiv markierte Sonde wie in Beispiel 8 beschrieben hybridisiert ist. RNA-Größenmarken sind links angeführt. Eine Rehybridisierung desselben Blots mit einer menschlichen β-Actin-cDNA-Sonde ist unten angeführt.
9A–9B zeigen Balkendiagramme, die die biologische Aktivität von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) veranschaulichen. 9A zeigt menschliche Vorhaut-Fibroblasten-(HFF-)Zellen, die mit Kontroll-Fc-Fusionsprotein, IL-17, IL17-B.Fc (Seq.-ID Nr. 12) oder IL-17C.Fc (Seq.-ID Nr. 13) in einer Menge von 100 ng/ml 18 h lang kultiviert werden, wobei die konditionierten Medien in Bezug auf IL-6 (Seq.-ID Nr. 14) wie in Beispiel 10 beschrieben getestet wurden. 9B zeigt die menschliche leukämische Zelllinie THP1, die mit denselben Cytokinen (100 ng/ml) wie oben unter denselben Bedingungen behandelt wurde, wobei die Überstände in Bezug auf das Maß der TNF-α-Freisetzung getestet wurden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert +/– SF von dreifachen Bestimmungen eines repräsentativen Experiments ausgedrückt.
10 ist eine Zeitkurve, die die Abhängigkeit von durch IL-176 und IL-17C aktivierter TNF-α-Freisetzung von THP1-Zellen zeigt. In 10A wurden THP1-Zellen mit 100 ng/ml (2,2 nM) IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12) oder IL-17C.Fc 8 (Seq.-ID Nr. 13) 0,5 bis 32 h lang inkubiert, die konditionierten Medien wurden geerntet, und die TNF-α-Konzentration wurde wie in Beispiel 10 beschrieben mengenmäßig bestimmt. In 10B wurden THP1-Zellen mit IL-17B.Fc und IL-17C.Fc in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 120 nM 18 h lang behandelt, und die TNF-α-Freisetzung wurde bestimmt.
11 ist eine Immunfällung von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID Nr. 3). His-markierte IL-17-Rezeptor-ECD wurde in 293-Zellen exprimiert und metabolisch mit ³⁵S markiert, wie in Beispiel 11 beschrieben. Der Überstand wurde gesammelt, und Ni-NTA-Perlen wurden zur Affinitätsfällung der His-markierten IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) in dem Überstand eingesetzt (Spur 1). In 11A wurden IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12) und IL-17C.Fc (Seq.-ID Nr. 13) oder Kontroll-Fc-Fusionsproteine mit dem Überstand inkubiert, und Protein-A-Agarose-Perlen wurden zur Ausfällung der Fc-Fusionsproteine zugesetzt. Zur IL-17-Immunfällungsreaktion wurden Anti-IL-17-Antikörper zugeführt. 11B zeigt die Ergebnisse eines kompetitiven Bindungsexperiments, wobei die Immunfällung von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 22) durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) in Gegenwart eines fünffachen Überschusses an IL-17B.his (Seq.-ID Nr. 23) und His-markierter Kontrollproteine erfolgte. Die Fällungsprodukte in 11A und 11B wurden mittels Elektrophorese auf NuPAGE- (4–12% Bis-Tris) Gelen analysiert. Molekulargewichtmarker werden bei jeder Tafel links angezeigt.
12 zeigt die FACS-Analyse der Bindung von IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12) und IL-17C.Fc (Seq.-ID Nr. 13) an THP1-Zellen. THP1-Zellen wurden mit IL-17B.Fc (A) oder IL-17C.Fc (B) oder Kontroll-Fc-Fusionsproteinen in PBS (5% Pferdeserum) inkubiert, wonach FITC-konjugierte sekundäre Anti-Fc-Antikörper zugesetzt wurden.
13 zeigt die Wirkung von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) auf artikuläre Knorpel. Knorpelexplantate wurden in der angegebenen Konzentration von IL-17 allein (durchgehende Linie) oder in Gegenwart von IL-1α in der angegebenen Konzentration (schraffiert) (Seq.-ID Nr. 25) oder IL1ra (IL-1-Rezeptorantagonist, R&D Systems, 1 μg/ml) (Seq.-ID Nr. 26) 72 h lang kultiviert. Die Freisetzung von Proteoglykan (PG) in die Medien (obere Tafel) deutet auf einen Abbau der Matrix hin. Die Matrixsynthese wurde durch die Inkorporation von ³⁵S-Sulfat in das Gewebe bestimmt (untere Tafel).
14 zeigt die Wirkung von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) auf die Freisetzung von Stickoxid. Explantate wurden mit IL-17 (10 ng/ml) allein (linke Balken) oder in Gegenwart von IL-1α (10 ng/ml) (Seq.-ID Nr. 25) (rechte Balken) behandelt. Nach 48 h wurden die Medien in Bezug auf Nitritkonzentration getestet.
15 zeigt die Wirkung von NO auf durch IL-17 induzierte Veränderungen im Matrixstoffwechsel. Explantate wurden mit IL-17 (5 ng/ml) (Seq.-ID Nr. 11) allein (+) oder mit einem irreversiblen Hemmer von Stickoxidsynthase, NOS (L-NIO, Caymen Chemical, 0,5 mM), behandelt. Nach 72-stündiger Behandlung wurden die Medien in Bezug auf (A) Nitrit und (B) Proteoglykane (PG) getestet. (C) Die Proteoglykan-Synthese wurde durch das Inkorporieren von ³⁵S-Sulfat in das Gewebe bestimmt.
16 zeigt die Wirkung der NO-Hemmung auf durch IL-1α induzierte Veränderungen im Proteoglykan-(PG-)Stoffwechsel. Artikuläre Knorpelexplantate wurden mit IL-1α (5 ng/ml) (Seq.-ID Nr. 25) allein (+) oder mit NOS-Hemmern (L-NIO oder L-NIL) (L-NIL: reversibler NOS-Hemmer, Caymen Chemical) oder IL-1ra (1L-1 Rezeptoranatagonist, R&D Systems, 1 μg/ml) (Seq.-ID Nr. 26) behandelt. Nach 72-stündiger Behandlung wurden die Medien in Bezug auf (A) Nitritkonzentration und (B) Proteoglykan-Menge getestet. (C) Die Matrixsynthese wurde durch das inkorporieren von ³⁵S-Sulfat in das Gewebe bestimmt.
17 zeigt die Wirkung von UNQ516 (Seq.-ID Nr. 1) auf artikuläre Knorpel. Explantate wurden mit UNQ561 in einer Konzentration von 1% oder 0,1% ohne (erste 3 Balken von links) oder in Gegenwart (erste 3 Balken von rechts) von IL-1α (Seq.-ID Nr. 25) in einer Menge von 10 ng/ml behandelt, und die Proteoglykan-(PG-)Synthese und die Nitritproduktion wurden wie in Beispiel 16 beschrieben bestimmt.
18 zeigt die Wirkung von UNQ561 (Seq.-ID Nr. 3) auf artikuläre Knorpel. Explantate wurden mit UNQ561 in einer Konzentration von 1% oder 0,1% ohne (erste 3 Balken von links) oder in Gegenwart (erste 3 Balken von rechts) von IL-1α(+) (10 ng/ml) (Seq.-ID Nr. 25) behandelt, und die Proteoglykan-(PG-)Freisetzung und -Synthese werden als Menge über der Kontrollmenge angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Die Bezeichnungen ”PRO1122-Polypeptid” und ”PRO1122” umfassen, wie hierin verwendet, Nativsequenz-PRO1122 und Polypeptidvarianten davon (die hierin genauer definiert sind). Das PRO1122-Polypeptid kann aus einer Reihe von Quellen isoliert werden, wie z. B. aus menschlichen Gewebearten oder aus einer anderen Quelle, oder durch Rekombinations- oder synthetische Verfahren hergestellt werden.
Ein ”Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid” umfasst ein Polypeptid, das dieselbe Aminosäuresequenz wie ein natürliches PRO1122-Polypeptid aufweist. Ein solches Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid kann aus der Natur isoliert werden oder durch Rekombinations- oder synthetische Verfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung ”Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid” umfasst spezifisch natürlich vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen eines PRO1122-Polypeptids (z. B. lösliche Formen, die beispielsweise eine extrazelluläre Domänensequenz enthalten), natürlich vorkommende Varianten (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allele von PRO1122-Polypeptid.
In der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem verwendeten Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid um ein Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid voller Länge oder ein reifes Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid, das die Aminosäuren 1 oder 19 bis 197 aus 3 (Seq.-ID Nr. 3) umfasst. Obgleich gezeigt wird, dass das in 3 offenbarte PRO1122-Polypeptid (d. h. UNQ 561) mit einem Methionin-Rest beginnt, der als Aminosäureposition 1 bezeichnet wird, ist es auch vorstellbar und möglich, dass ein anderer Methionin-Rest, der sich entweder stromauf oder stromab von Aminosäureposition 1 in 3 befindet, als Ausgangsaminosäurerest verwendet werden kann.
Die Bezeichnung ”UNQ561” bezieht sich auf das spezifische Nativsequenz-PRO1122-Protein, die in 3 dargestellt ist. Fakultativ wird das PRO1122-Polypeptid durch das Exprimieren des durch das cDNA-Insert von dem unter der ATCC-Zugriffsnummer 203522 hinterlegten Vektor DNA62377-1381-1 kodierten Polypeptids erhalten oder kann auf diese Weise erhalten werden.
”PRO1122-Variante” bezeichnet ein ”aktives” PRO1122-Polypeptid wie untenstehend definiert, das zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit dem PRO1122-Polypeptid aufweist, das die abgeleitete Aminosäuresequenz aus den Resten 1 oder etwa 19 bis 197, wie in 3 (Seq.-ID Nr. 3) dargestellt, für ein Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid voller Länge oder ein reifes Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid aufweist. Solche PRO1122-Polypeptid-Varianten umfassen beispielsweise PRO1122-Polypeptide, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus oder innerhalb der in 3 dargestellten Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) hinzugefügt, substituiert oder deletiert wurden. Gewöhnlicherweise weist eine PRO1122-Polypeptidvariante zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98% Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 99% Aminosöuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz aus 3 (Seq.-ID Nr. 3) auf, mit oder ohne Signalpeptid (z. B. mit Signalpeptidaminosäureresten 1 bis 197 der Seq.-ID Nr. 3, ohne Signalpeptid etwa 19 bis 197 von Seq.-ID Nr. 3). Die hierin bereitgestellten Varianten schließen die Nativsequenz-PRO1122-Sequenzen sowie die hierin beschriebenen Polypeptide und Nucleinsäuren aus, mit denen die PRO1122-Polypeptide 100% Identität aufweisen und/oder die bereits auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
”Prozentsatz (%) der Aminosäuresequenzidentität” ist in Bezug auf die hierin identifizierten PRO1122-Aminosäuresequenzen als Prozentsatz der Aminosäurereste in einer möglichen Sequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in einer PRO1122-Polypeptidsequenz ident sind, nachdem die Sequenzen abgeglichen wurden und, bei Bedarf, Lücken eingeführt wurden, um den maximalen Prozentsatz in Bezug auf die Sequenzidentität zu erzielen, wobei konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität erachtet werden. Der Abgleich zum Zweck der Bestimmung des Prozentsatzes der Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise unter Einsatz einer allgemein verfügbaren Computersoftware, wie z. B. ALIGN-, ALIGN-2-, Megalign-(DNASTAR) oder BLAST-(z. B. Blast-, Blast-2-, WU-Blast-2-) Software. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können geeignete Parameter zur Messung des Abgleichs bestimmen, wie z. B. Algorithmen, die erforderlich sind, um einen maximalen Abgleich über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen. Die hierin verwendeten %-Identitätswerte wurden beispielsweise unter Einsatz von WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 260–280 (1996)) erhalten. Die meisten WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf die Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf die Standardwerte eingestellt sind, d. h. die einstellbaren Parameter, werden mit folgenden Werten festgelegt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM 62. Für die Zwecke hierin wird ein Aminosäuresequenzidentitäts-%-Wert durch das Dividieren (a) der Anzahl der übereinstimmenden identen Aminosäurereste der Aminosäuresequenz des PRO1122-Polypeptids von Interesse und der Vergleichsaminosäuresequenz von Interesse (d. h. der Sequenz, mit der das PRO1122-Polypeptid von Interesse verglichen wird), wie durch WU-BLAST-2 bestimmt, durch (b) die Gesamtanzahl der Aminosäurereste des PRO1122-Polypeptids von Interesse.
”Isoliert” bezeichnet, wenn es zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide herangezogen wird, ein Polypeptid, das identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder aus dieser gewonnen wurde. Vorzugsweise weist das isolierte Polypeptid keine Assoziation mit Komponenten auf, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Verunreinigende Komponenten aus seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen des Polypeptids beeinträchtigen würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhaltige oder nicht-proteinhaltige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Polypeptid (1) unter Einsatz eines Zentrifugenröhrchensequenzierers bis zu einem Grad gereinigt, der ausreicht, um zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (2) mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfarbstoff bis zur Homogenität gereinigt. isoliertes Polypeptid umfasst Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente des natürlichen Umfelds von PRO1122-Polypeptid nicht vorhanden ist. Gewöhnlicherweise wird isoliertes Polypeptid jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Die Bezeichnung ”Kontrollsequenzen” bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel verbundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die für Prokaryoten geeigneten Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promoter, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosom-Bindungsstelle. Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer nutzen.
Eine Nucleinsäure ist ”operabel verbunden”, wenn sie sich in funktioneller Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz befindet. Die DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader ist beispielsweise operabel mit der DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosom-Bindungsstelle ist operabel mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie zur Erleichterung der Translation angeordnet ist. Im Allgemeinen bedeutet ”operabel verbunden”, dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in der Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Verbindung erfolgt über eine Ligation an angemessenen Restriktionsstellen. Wenn solche Stellen nicht vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonucleotidadapter oder -linker gemäß der herkömmlichen Praxis eingesetzt.
Die ”Stringenz” der Hybridisierungsreaktionen kann durch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung leicht bestimmt werden und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, der Waschtemperatur und der Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für angemessenes Annealing, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit der denaturierten DNA ab, erneut einen Doppelstrang zu bilden, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unterhalb der Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher das Maß der erwünschten Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher die relative Temperatur, die eingesetzt werden kann. In der Folge kann daraus geschlossen werden, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen, die Reaktionen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen sie weniger stringent machen. Für zusätzliche Details und Erklärungen in Bezug auf die Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
”Stringente Bedingungen” oder ”hochstringente Bedingungen” können, wie hierin definiert, als jene identifiziert werden, bei denen (1) eine geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen zum Waschen eingesetzt werden, wie z. B. 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie z. B. Formamid, eingesetzt wird, wie z. B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardtsche Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Wäschen bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C gefolgt von einer hochstringenten Wäsche aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55°C verwendet wird.
”Moderat stringente Bedingungen” können als jene identifiziert werden, die von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1989), beschrieben werden, und umfassen die Verwendung von Waschlösungen und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Ionenstärke und% SDS), die weniger stringent sind als die oben beschriebenen. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist die Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung, die Folgendes umfasst: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardtsche Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, wie sie die Temperatur, die Ionenstärke etc. nach Bedarf anpassen müssen, um Faktoren, wie z. B. der Sondenlänge und dergleichen, gerecht zu werden.
Die Bezeichnung ”Epitop-markiert” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf ein chimäres Polypeptid, das PRO1122-Polypeptid oder eine Domänensequenz davon an ein ”Markierungspolypeptid” fusioniert umfasst. Das Markierungspolypeptid weist ausreichend Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann oder das durch einen anderen Wirkstoff identifiziert werden kann und doch kurz genug ist, dass es die Aktivität des PRO1122-Polypeptids nicht beeinträchtigt. Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise auch relativ einzigartig, so dass der Antikörper im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und gewöhnlicherweise zwischen etwa 8 bis etwa 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 bis etwa 20 Reste) auf.
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung ”Immunadhäsin” auf Antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eine ”Adhäsion”) mit den Effektorfunktionen konstanter Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell umfassen die Immunadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der erwünschten Bindungsspezifität, die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet (d. h. ”heterolog” ist), und einer konstanten Immunglobulindomänensequenz. Der Adhäsin-Teil eines Immunadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die konstante Immunglobulindomänensequenz in dem Immunadhäsin kann aus einem beliebigen Immunglobulin, wie z. B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (umfassend IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM, erhalten werden.
Die Bezeichnung ”Antikörper” wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst spezifisch einzelne monoklonale Anti-PRO1122-Palypeptid-Antikörper (umfassend Agonist-, Antagonist- und neutralisierende Antikörper), Anti-PRO1122-Antikörper-Zusammensetzungen mit polyeptioper Spezifität, einkettige Anti-PRO1122-Antikörper und Fragmente von Anti-PRO1122-Antikörpern. Die Bezeichnung ”monoklonaler Antikörper” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörper erhalten wird, d. h. die einzelnen Antikörper, die die Population bilden, sind bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, ident.
”Aktiv” oder ”Aktivität” bezieht sich für die Zwecke hierin auf eine Form/Formen von PRO1122, die weiterhin die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten von nativen oder natürlich vorkommenden Polypeptiden aufweisen. Weiters bezieht sich ”biologische” Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder hemmend oder stimulierend), die durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO1122 hervorgerufen wird, abgesehen von der Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, die von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO1122 aufgewiesen wird; und eine ”immunologische Aktivität” bezieht sich nur auf die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, die von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO1122 aufgewiesen wird. Eine bevorzugte biologische Aktivität umfasst beispielsweise das Freisetzen von TNF-α aus THP1-Zellen.
”Degenerative Knorpelerkrankung” beschreibt eine Reihe von Störungen, die im Wesentlichen dadurch gekennzeichnet sind, dass die Knorpelmatrix zerstört wird. Zusätzliche Pathologien umfassen Stickoxidproduktion und erhöhten Proteoglykan-Abbau. Beispielhafte Störungen, die diese Definition umfasst, umfassen beispielsweise Arthritis (z. B. Osteoarthritis, rheumatische Arthritis, Arthritis psoriatica), Sepsis, Colitis ulcerosa, Psoriasis, Multiple Sklerose, Typ-I-Diabetes, Riesenzellarteriitis, systemischen Lupus erythematodes und Sjörgen-Syndrom.
Die Bezeichnung ”Antagonist” wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst alle Moleküle, die die biologische Aktivität eines hierin offenbarten nativen PRO1122-Polypeptids teilweise oder vollständig blockieren, hemmen oder neutralisieren, wobei die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, auf antagonistische Antikörper beschränkt ist. Auf ähnliche Weise wird die Bezeichnung ”Agonist” hierin im weitesten Sinn verwendet und umfasst alle Moleküle, die eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten nativen PRO1122-Polypeptids nachahmen. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen spezifisch Agonisten- oder Antagonisten-Antikörper oder -Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen PRO1122-Polypeptiden, Peptide, kleine organische Moleküle etc. Ein Verfahren zur Identifizierung der Agonisten oder Antagonisten eines PRO1122-Polypeptids können das Kontaktieren eines PRO1122-Polypeptids mit einem möglichen Agonisten- oder Antagonistenmolekül und das Messen der nachweisbaren Veränderung in Bezug auf eine oder mehrere biologische Aktivitäten, die gewöhnlicherweise mit dem PRO1122-Polypeptid assoziiert werden, umfassen.
”Antikörper” (Abs) und ”Immunglobuline” (Igs) sind Glykoproteine mit denselben strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper eine Bindungsspezifität für ein spezifisches Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline Antikörper und Antikörperähnliche Moleküle, die keine Antigen-Spezifität aufweisen. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in geringem Maß vom Lymphsystem und in höherem Maβ von Myelomen produziert. Die Bezeichnung ”Antikörper” wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst spezifisch, ohne Einschränkung, intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper), die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und Antikörperfragmente, solange diese die erwünschte biologische Aktivität aufweisen.
Die Bezeichnungen ”behandeln”, ”Behandlung” und ”Therapie” beziehen sich, wie hierin verwendet, auf kurative, prophylaktische und präventive Therapie. Ein Beispiel einer ”präventiven Therapie” ist die Prävention oder die Minderung einer pathologischen Erkrankung oder Störung. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen die, die bereits an der Störung leiden, sowie die, die zur Entwicklung der Störung neigen, oder die, bei denen das Auftreten der Störung verhindert werden soll.
”Chronische” Verabreichung bezieht sich auf die kontinuierliche Verabreichung eines Wirkstoffs/von Wirkstoffen im Gegensatz zu einer akuten Verabreichung, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) über einen längeren Zeitraum hinweg aufrechtzuerhalten. Eine ”intermittierende” Verabreichung bezeichnet eine Behandlung, die nicht fortlaufend ohne Unterbrechung erfolgt, sonder eher zyklischer Natur ist.
Die Bezeichnung ”Säugetier” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf ein als Säugetier klassifiziertes Tier, umfassend Menschen, Haus- und Nutztiere, sowie Zoo-, Sport und Stubentiere, wie z. B. Rinder (z. B. Kühe), Pferde, Hunde, Schafe, Schweine, Kaninchen, Ziegen, Katzen etc. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Säugetier um einen Menschen.
Die Verabreichung ”in Kombination mit” einem oder mehreren weiteren therapeutischen Wirkstoffen umfasst die gleichzeitige und die aufeinander folgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
Eine ”therapeutisch wirksame Menge” ist die Mindestmenge eines Wirkstoffs (z. B. PRO1122, eines Antagonisten oder Agonisten davon), die erforderlich ist, damit das Säugetier therapeutischen Nutzen aus der Behandlung ziehen kann. Eine ”therapeutisch wirksame Menge” für ein Säugetier, das an einer degenerativen Knorpelstörung leidet, dazu neigt, diese zu entwickeln, oder dessen Erkrankung daran verhindert werden soll, entspricht einer solchen Menge, die eine Verbesserung der pathologischen Symptome, des Fortschreitens der Erkrankung, des physiologischen Zustands in Zusammenhang mit Resistenz gegen eine oder Entwicklung einer Erkrankung, die im Wesentlichen durch die Zerstörung der Knorpelmatrix gekennzeichnet ist, induziert, steigert oder auf andere Weise hervorruft.
”Träger” umfassen, wie hierin verwendet, pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren, die in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch für die Zelle oder das Säugetier sind, das diesen ausgesetzt wird. Oft handelt es sich bei dem physiologisch annehmbaren Träger um eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidationsmittel, wie z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenwasserstoffe, umfassend Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. TWEEN^®, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Die Bezeichnung ”Antikörperfragmente” umfasst einen Teil eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigen-Bindungsregion oder die variable Region eines intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diakörper; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Engin. 8 (10), 1057–1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle und multispezifische Antikörper aus Antikörperfragmenten.
Durch den Papainverdau von Antikörpern entstehend zwei idente Antigen-Bindungsfragmente, die als ”Fab”-Fragmente bezeichnet werden, wobei jedes eine einzige Antigen-Bindungsstelle aufweist, und ein Rest-”Fc”-Fragment, wobei dessen Bezeichnung dessen Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Eine Pepsinbehandlung liefert ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigenkombinationsstellen aufweist und weiterhin ein Antigen vernetzen kann.
”Fv” ist das kleinste Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer aus einer variablen Schwer- und Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Bindung. In dieser Anordnung treten die drei CDR jeder variablen Domäne in Wechselwirkung, um eine Antigen-Bindungsstelle auf der Oberfläche des VH-VL-Dimers zu definieren. Kollektiv verleihen die 6 CDR dem Antikörper eine Antigen-Bindungsspezifität. Auch eine einzige variable Domäne (oder die Hälfte einer Fv, die nur drei für ein Antigen spezifische CDR umfasst) weist jedoch die Fähigkeit auf, ein Antigen zu erkennen und zu binden, wenngleich mit einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch eine konstante Leichtketten-Domäne und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fv-Fragmenten durch die Hinzufügung von wenigen Resten am Carboxy-Ende der Schwerketten-CH1-Domäne, umfassend ein oder mehrere Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH bezeichnet hierin Fab', worin der Cystein-Rest/die Cystein-Reste der konstanten Domänen eine freie Thiol-Gruppe aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Fab'-Fragmentpaare hergestellt, die Gelenks-Cysteine zwischen ihnen aufweisen. Andere chemische Verbindungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die ”Leichtketten” von Antikörpern (Immunglobulinen) einer beliebigen Wirbeltierspezies können baierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen einem von zwei verschiedenen Typen, κ und λ, zugeordnet werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei einige von diesen weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden können, z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA Lind IgA2.
”Einkettige Fv-” oder ”sFv”-Antikörperfragmente umfassen die VH- und die VL-Domänen des Antikörpers, wobei diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen der VH- und der VL-Domäne, der es ermöglicht, dass sFv die erwünschte Struktur zur Antigenbindung bildet. Für einen Überblick über Fv siehe Pluckthun, in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Band 113, 269–315, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York (1994).
Die Bezeichnung ”Diakörper” bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerketten-Domäne (VH) umfassen, die in derselben Polypeptidkette mit einer variablen Leichtketten-Domäne (VL) verbunden ist (VH-VL). Unter Einsatz eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarbildung der beiden Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, sind die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu schaffen. Diakörper werden umfassender beispielsweise in EP 404.097 , WO 93/11161 und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
Ein ”isolierter” Antikörper ist ein Antikörper, der identifiziert und von einer Komponente seines natürlichen Umfelds getrennt und/oder daraus gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seines natürlichen Umfelds sind Materialien, die die diagnostischen und therapeutischen Verwendungen des Antikörpers beeinträchtigen würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhaltige oder nicht-proteinhaltige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) auf mehr als 95 Gew.-% Antikörper gereinigt, wie durch das Lowry-Verfahren bestimmt, und besonders bevorzugt auf mehr als 99 Gew.-%, (2) unter Einsatz eines Zentrifugenröhrchensequenzierers bis zu einem Maß gereinigt, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (3) mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfarbstoff bis zur Homogenität gereinigt. Ein isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente des natürlichen Umfelds des Antikörpers nicht vorhanden ist. Gewöhnlicherweise wird der isolierte Antikörper jedoch zumindest durch einen Reinigungsschritt hergestellt.
Das Wort ”Markierung” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen ”markierten” Antikörper zu erzeugen. Die Markierung kann selbst nachweisbar sein (z. B. Radioisotopmarkierungen oder Fluoreszenzmarkierungen) oder, im Fall einer Enzymmarkierung, eine chemische Veränderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die nachweisbar ist.
”Festphase” ist die Bezeichnung für eine nicht-wässrige Matrix, an der der Antikörper der vorliegenden Erfindung haften kann. Beispiele für Festphasen hierin umfassen jene, die teilweise oder vollständig aus Glas bestehen (z. B. Glas mit gesteuerter Porengröße), Polysaccharide (z. B. Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silicone. In bestimmten Ausführungsformen kann die Festphase in Abhängigkeit vom Zusammenhang den Well einer Testplatte umfassen; in anderen handelt es sich um eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase getrennter Teilchen, wie z. B. die in US-Patent Nr. 4.275.149 beschriebene.
Ein ”Liposom” ist ein kleines Bläschen, das aus verschiedenen Arten von Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensiden besteht, was für die Zufuhr eines Arzneimittels (wie z. B. PRO1122-Polypeptid oder des Antikörpers dazu) an ein Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind gewöhnlicherweise in einer Doppelschichtanordnung angeordnet, ähnlich wie die Lipid-Anordnung in biologischen Membranen.
Ein ”kleines Molekül” ist hierin als Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Dalton definiert.
”Modulieren” bezeichnet die Beeinflussung (z. B. Up-, Down-Regulation oder Steuerung in einer anderen Form) der Ebene des Signalwegs. Durch Signaltransduktion gesteuerte zelluläre Prozesse umfassen die Transkription von bestimmten Genen, normale Zellfunktionen, wie z. B. Stoffwechsel, Wachstum, Differenzierung, Adhäsion, Apoptose und Überleben, sowie abnormale Prozesse, wie z. B. Transformation, Blockieren von Differenzierung und Metastasenbildung, sind aber nicht auf diese beschränkt.
II. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Verfahren
A. PRO1122-Polypeptid voller Länge
Die vorliegende Offenbarung identifiziert und isoliert Nucleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO1122 bezeichnet werden. Insbesondere haben die Anmelder cDNA identifiziert und isoliert, die für ein PRO1031- (z. B. UNQ516, IL-17B, Seq.-ID Nr. 1) und ein PRO1122- (z. B. UNQ561, IL-17C, Seq.-ID Nr. 3) Polypeptid kodiert, wie in den untenstehenden Beispielen detaillierter offenbart wird. Unter Einsatz der Computerprogramme BLAST und FastA zum Sequenzabgleich haben die Anmelder festgestellt, dass verschiedene Abschnitte des PRO1031- und des PRO1122-Polypeptids Sequenzidentität mit IL-17 aufweisen. Dementsprechend wird gegenwärtig angenommen, dass das in der vorliegenden Anmeldung offenbarte PRO1031- und das PRO1122-Polypeptid Mitglieder der Cytokin-Familie sind und somit an Entzündungen und/oder der Immunsystemfunktion beteiligt sein könnten.
Wie bereits erläutert bezieht sich die Bezeichnung ”PRO 1122” auf die native Sequenz und Varianten, während sich die Bezeichnung ”UNQ561” auf die spezifische Aminosäuresequenz in 3 (Seq.-ID Nr. 3) und/oder die durch die unter der Zugriffsnummer 203552 bei der American Type Culture Collection hinterlegte cDNA kodierten Proteine bezieht.
Wie in den untenstehenden Beispielen offenbart, wurde der hierin als DNA62377-1381-1 bezeichnete cDNA-Klon bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächliche Nucleotidsequenz des Klons kann durch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung leicht durch das Sequenzieren des hinterlegten Klons unter Einsatz von Routineverfahren auf dem Gebiet der Erfindung bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann unter Einsatz von Routineverfahren ausgehend von der Nucleotidsequenz bestimmt werden. Für das hierin beschriebene PRO1122-Polypeptid und die kodierende Nucleinsäure haben die Anmelder den Leseraster identifiziert, von dem angenommen wird, dass es sich um den mit der gegenwärtig verfügbaren Sequenzinformation am besten identifizierbaren Leseraster handelt.
B. PRO1122-Varianten
Zusätzlich zum hierin beschriebenen Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid voller Länge wird in Betracht gezogen, dass PRO1122-Varianten hergestellt werden können. PRO1122-Varianten können durch das Vornehmen geeigneter Nucleotidveränderungen in der DNA, die für PRO1122 kodiert, oder durch die Synthese des gewünschten PRO1122-Polypeptids erzeugt werden. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass Veränderungen der Aminosäuren die posttranslationalen Prozesse des Polypeptids verändern können, wie z. B. die Veränderung der Anzahl oder der Position von Glykosylierungsstellen oder die Veränderung der Membranverankerungseigenschaften.
Variationen des Nativsequenz-PRO1122 voller Länge oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO1122-Polypeptids können beispielsweise unter Einsatz eines beliebigen Verfahrens und unter Anwendung der Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen erfolgen, die beispielsweise in US-Patent Nr. 5.364.934 erläutert werden. Bei den Variationen kann es sich um Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Codons handeln, die für das PRO1122-Polypeptid kodieren, was im Vergleich mit der nativen Sequenz von PRO1122 zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz des PRO1122-Polypeptids führt. Fakultativ erfolgt die Variation durch die Substitution zumindest einer Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO1122-Polypeptids. Eine Anleitung zur Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität zu beeinträchtigen, kann ermittelt werden, indem die Sequenz des PRO1122-Polypeptids mit der eines homologen bekannten Proteinmoleküls verglichen wird und die Anzahl der Aminosäuresequenzveränderungen in Regionen mit hoher Homologie minimiert wird. Aminosäuresubstitutionen können das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie z. B. das Ersetzen eines Leucins durch ein Serin, d. h. das Ergebnis von konservativen Aminosäureersetzungen. Insertionen oder Deletionen können fakultativ im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren erfolgen. Die mögliche Variation kann durch das systematische Vornehmen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz und das Testen der resultierenden Varianten in Bezug auf die Aktivität der nativen Sequenz voller Länge oder der reifen nativen Sequenz (z. B. durch einen der in den untenstehenden Beispielen beschriebenen In-vitro-Tests) bestimmt werden.
PRO1122-Polypeptidfragmente werden hierin bereitgestellt. Solche Fragmente können am N- oder C-Terminus trunkiert sein, oder ihnen können beispielsweise im Vergleich mit einem Protein voller Länge oder einem nativen Protein im Inneren Reste fehlen. Bestimmten Resten fehlen Aminosäurereste, die für eine gewünschte biologische Aktivität des PRO1122-Polypeptids nicht wesentlich sind.
PRO1122-Fragmente können durch ein beliebiges einer Reihe von herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Gewünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst das Erzeugen von PRO1122-Fragmenten mittels Enzymverdau, z. B. durch die Behandlung des Proteins mit einem Enzym, von dem bekannt ist, dass es Proteine an durch bestimmte Aminosäurereste definierten Stellen spaltet, oder durch den Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und die Isolation des gewünschten Fragments. Ein weiteres geeignetes Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein gewünschtes Polypeptidfragment kodiert, mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die gewünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR eingesetzt. Vorzugsweise teilen die PRO1122-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem in 3 dargestellten nativen PRO1122-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 3).

In bestimmten Ausführungsformen werden konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 1 in der Spalte ”Bevorzugte Substitutionen” angeführt. Wenn solche Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, werden umfassendere Veränderungen, die in Tabelle 1 als Beispielsubstitutionen bezeichnet werden, wie weiter unten in Bezug auf die Aminosäureklassen beschrieben, durchgeführt, und die Produkte werden gescreent. Tabelle 1 Konservative Substitutionen

Ursprünglicher Rest	Beispielsubstitutionen	Bevorzugte Substitutionen
Ala (A)	val, leu, ile	val
Arg (R)	lys, gln, asn	lys
Asn (N)	gln, his, lys, arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro, ala	ala
His (H)	asn, gln, lys, arg	arg
Ile (I)	leu, val, met, ala, phe, Norleucin	leu
Leu (L)	Norleucin, ile, val, met, ala, phe	ile
Lys (K)	arg, gln, asn	arg
Met (M)	leu, phe, ile	leu
Phe (F)	leu, val, ile, ala, tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr, phe	tyr
Tyr (Y)	trp, phe, thr, ser	phe
Val (V)	ile, leu, met, phe, ala, Norleucin	leu

Wesentliche Modifikationen der Funktion oder immunologischen Identität von PRO1122-Polypeptid werden erzielt, indem Substitutionen ausgewählt werden, die sich in ihrer Wirkung auf das Beibehalten (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette stark unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden bezogen auf ihre gemeinsamen Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) Hydrophob: sys, ser, thr;
(2) Neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) Sauer: asp, glu;
(4) Basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: gly, pro; und
(6) Aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen umfassen den Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen durch das Mitglied einer anderen Klasse. Auf diese Weise substituierte Reste können an den konservativen Substitutionsstellen eingeführt werden oder noch bevorzugter an den verbleibenden (nicht-konservativen) Stellen.
Die Variationen können unter Einsatz von Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z. B. Olignucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können auf die klonierte DNA zur Herstellung der für PRO1031 kodierenden DNA-Variante angewandt werden.
Scanning-Aminosäureanalyse kann auch eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren in einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren gehören relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure von dieser Gruppe, da es die Seitenkette über das β-Kohlenstoffatom hinausgehend eliminiert und die Wahrscheinlichkeit geringer ist, dass es die Hauptkettenkonformation der Variante verändert. Alanin ist auch deshalb typischerweise zu bevorzugen, da es die häufigste Aminosäure ist.
Weiters kommt es häufig in bedeckten und freiliegenden Positionen vor [Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co., New York; Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Wenn Alaninsubstitution nicht ausreichende Mengen einer Variante liefert, kann eine isoterische Aminosäure eingesetzt werden.
C. Modifikationen von PRO1122
Kovalente Modifikationen von PRO1122-Polypeptiden sind Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung wie in den Ansprüchen definiert. Eine Art einer kovalenten Modifikation umfasst die Umsetzung der Ziel-Aminosäurereste des PRO1122-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten eines PRO1122-Polypeptids zu reagieren. Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, um beispielsweise PRO1122 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung in dem Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO1122-Antikörpern zu vernetzen und umgekehrt. Herkömmlicherweise eingesetzte Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, umfassend Disuccinimidylester, wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylproprionat), bifunktionelle Maleinimide, wie z. B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Mittel, wie z. B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]proprioimidat.
Weitere Modifikationen umfassen das Desamidieren von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten, das Hydroxylieren von Prolin und Lysin, das Phosphorylieren der Hydroxylgruppen von Seryl- und Threonylresten, das Methylieren der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, 79–86, W. H. Freeman & Co., San Francisco (1983)], das Acetylieren von N-terminalem Amin und das Amidieren von C-terminalen Carboxylgruppen.
Eine weitere Art der kovalenten Modifikation des PRO1122-Polypeptids, die Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung wie in den Ansprüchen definien ist, umfasst das Verändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. ”Veränderung des nativen Glykosylierungsmusters” bezieht sich für die Zwecke hierin auf die Deletion einer oder mehrerer Kohlenwasserstoffgruppierungen im Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid und/oder die Hinzufügung einer oder mehrere Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid nicht vorhanden sind. Zusätzlich dazu umfasst die Phrase qualitative Veränderungen in Bezug auf die Glykosylierung der nativen Proteine, umfassend eine Veränderung in Bezug auf die Natur und die Proportionen der verschiedenen vorhandenen Kohlenwasserstoffgruppierungen.
Die Hinzufügung von Glykosylierungsstellen zu PRO1122-Polypeptiden kann durch die Veränderung der Aminosäuresequenz erzielt werden. Die Veränderung kann beispielsweise durch die Hinzufügung oder Substitution eines oder mehrerer Serin- oder Threonin-Reste im Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid erfolgen (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Die PRO1122-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Veränderungen auf DNA-Ebene verändert werden, insbesondere durch die Mutation der DNA, die für das PRO1122-Polypeptid kodiert, an vorbestimmten Basen, so dass die erzeugten Codons in die gewünschten Aminosäuren translatieren.
Ein weiteres Mittel zur Steigerung der Anzahl von Kohlenwasserstoffgruppierungen an dem PRO1122-Polypeptid besteht in der chemischen oder enzymatischen Bindung von Glycosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung beispielsweise in WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Die Entfernung der an dem PRO1122-Polypeptid vorhandenen Kohlenwasserstoffgruppierungen kann chemisch oder enzymatisch oder mittels Mutationssubstitution von Codons erfolgen, die für Aminosäurereste kodieren, die als Glykosylierungsziele dienen. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 258, 52 (1987), und Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann unter Einsatz verschiedener Endo- und Exo-Glykosidasen wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben erfolgen.
Eine weitere Art kovalenter Modifikation von PRO1122 umfasst die Bindung des PRO1122-Polypeptids an eines von verschiedenen nicht-proteinhaltigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, auf die in den US-Patenten Nr. 4.640.835 , 4.496.689 , 4.301.144 , 4.670.417 , 4.791.192 oder 4.179.337 beschriebene Weise.
PRO1122-Polypeptide können auch so modifiziert werden, dass sie chimäre Moleküle bilden, die ein PRO1122-Polypeptid umfassen, das an ein anderes heterologes Polypeptid oder eine andere heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist. In einer Ausführungsform umfasst ein solches chimäres Molekül eine Fusion eines PRO1122-Polypeptids mit einem markierten Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitop-Markierung wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxy-Terminus des PRO1122-Polypeptids angeordnet. Die Gegenwart solcher Epitop-markierter Formen eines PRO1122-Polypeptids kann unter Einsatz eines Antikörpers gegen das Markierungspolypeptid nachgewiesen werden. Das Bereitstellen einer Epitop-Markierung ermöglicht auch, dass das PRO1122-Polypeptid rasch mittels Affinitätsreinigung unter Einsatz eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Affinitätsmatrix-Typs, der an die Epitop-Markierung bindet, gereinigt wird.
Verschiedene Markierungspolypeptide und die entsprechenden Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Polyhistidin-(poly-his-) oder Polyhistidinglycin-(poly-his-gly-)Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dazu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)] sowie die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(gD-)Markierung und seinen Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)]. Weitere Markierungspolypeptide umfassen Flag-Peptide [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)]; das KT3-Epitop-Peptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)]; ein α-Tubulin-Epitop-Peptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)] und die T7-Gen-10-Protein-Peptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)].
In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion eines PRO1122-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls könnte eine solche Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Transmembrandomäne (deletierte oder inaktivierte Form) eines PRO1122-Polypeptids anstelle zumindest einer variablen Region in einem Ig-Molekül. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3-, oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-, Regionen eines IgG1-Moleküls. Zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130 , ausgegeben am 27. Juni 1995.
In einer weiteren Ausführungsform können die PRO1122-Polypeptide auch zur Bildung eines chimären Moleküls modifiziert werden, das ein an einen Leucin-Zipper fusioniertes PRO1122-Polypeptid umfasst. Verschiedene Leucin-Zipper-Polypeptide wurden bereits auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben. Siehe z. B. Landschulz et al., Science 240, 1759 (1988); WO 94/10308 ; Hoppe et al., FEBS Letters 344, 1991 (1994); Maniatis et al., Nature 341, 24 (1989). Es wird angenommen, dass der Einsatz eines an ein PRO1122-Polypeptid fusionierten Leucin-Zippers erwünscht sein könnte, um das Dimerisieren oder Trimerisieren eines löslichen PRO1122-Polypeptids in Lösung zu unterstützen. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass der Leucin-Zipper an den N- oder C-Terminus des PRO1122-Moleküls fusioniert werden kann.
D. Herstellung von PRO1122
Die untenstehende Beschreibung betrifft hauptsächlich die Herstellung von PRO1122 durch das Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor, der für PRO1122-Polypeptid kodierende Nucleinsäure enthält, transformiert oder transfiziert wurden. Selbstverständlich wird in Betracht gezogen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von PRO1122-Polypeptiden eingesetzt werden können. Beispielsweise kann die PRO1122-Sequenz oder Teile davon mittels direkter Peptidsynthese unter Einsatz von Festphasenverfahren hergestellt werden [siehe z. B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman & Co., San Francisco, Calif. (1969); J. Merrifield, Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann unter Einsatz von manuellen Verfahren oder automatisch erfolgen. Die automatische Synthese kann beispielsweise unter Einsatz eines Peptidsynthesegeräts von Applied Biosystems (Foster City, Calif.) gemäß den Angaben des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile von PRO1122-Polypeptiden können getrennt voneinander chemisch synthetisiert werden und unter Einsatz von chemischen oder enzymatischen Verfahren kombiniert werden, um ein PRO1122-Polypeptid voller Länge herzustellen.
1. Isolierung von für PRO1122 kodierender DNA
DNA, die für ein PRO1122-Polypeptid kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem man annimmt, dass es die PRO1122-mRNA aufweist und diese in nachweisbarem Maß exprimiert. Dementsprechend kann DNA, die für menschliches PRO1122 kodiert, einfach, wie in den Beispielen beschrieben, aus einer cDNA-Bibliothek aus menschlichem Gewebe erhalten werden. Das für PRO1122 kodierende Gen kann auch aus einer Genom-Bibliothek oder durch bekannte synthetische Verfahren (z. B. automatische Syntheseverfahren, Oligonucleotidsynthese) erhalten werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie z. B. Antikörpern gegen ein PRO1122-Polypeptid oder Oligonucleotiden mit zumindest etwa 20–80 Basen) gescreent werden, die so gestaltet sind, dass sie das Gen von Interesse oder das durch dieses kodierte Protein identifizieren. Das Screenen der cDNA- oder Genom-Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Einsatz von Standardverfahren erfolgen, wie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989), beschrieben. Ein alternatives Mittel zur Isolation der Gene ist der Einsatz des PCR-Verfahrens [Sambrook et al., s. o.; Dieffenbach et al., PCR-Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)].
Die untenstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichend lang und ausreichend eindeutig sein, um falsche positive Ergebnisse zu minimieren. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es bei der Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Verfahren zur Markierung sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen den Einsatz von radioaktiven Markierungen, wie z. B. ³²P-markiertem ATP, Biotinylieren und Enzymmarkierung. Die Hybridisierungsbedingungen, umfassend gemäßigt- und hochstringente Bedingungen, werden in Sambrook et al., s. o., bereitgestellt.
Die durch solche Bibliothek-Screeningverfahren identifizierten Sequenzen können verglichen und mit anderen bekannten Sequenzen abgeglichen werden, die in öffentlichen Datenbanken, wie z. B. GenBank, oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und verfügbar sind. Sequenzidentität (auf Aminosäure- oder Nucleotidebene) in definierten Regionen des Moleküls oder über die volle Länge der Sequenz kann unter Einsatz von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, und wie hierin beschrieben (z. B. durch Sequenzabgleich unter Einsatz von Computersoftwareprogrammen, wie z. B. ALIGN, DNAstar, BLAST, BLAST-2, INHERIT und ALIGN-2, die verschiedene Algorithmen zur Messung der Homologie einsetzen) bestimmt werden.
Eine Nucleinsäure mit einer Sequenz, die für Proteine kodiert, kann durch das Screenen ausgewählter cDNA- oder Genom-Bibliotheken unter Einsatz der hierin erstmals offenbarten abgeleiteten Aminosäuresequenz und, bei Bedarf, unter Einsatz herkömmlicher Primer-Extensionsverfahren, wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben, zur Detektion der Vorläufer und Verarbeitung von mRNA-Zwischenprodukten, die möglicherweise nicht in cDNA revers transkribiert wurden, erhalten werden.
2. Auswahl und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit hierin beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren zur Herstellung von PRO1122-Polypeptid transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die nach Bedarf zum induzieren von Promotoren, zur Auswahl von Transformanten oder zum Amplifizieren von Genen, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert sind. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können durch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Im Allgemeinen sind Grundlagen, Protokolle und praktische Verfahren zum Maximieren der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und Sambrook et al., s. o., zu linden.
Transfektionsverfahren, wie z. B. CaPO₄ und Elektroporation, sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Einsatz eines Standardverfahrens, das für die entsprechenden Zellen geeignet ist. Die Calciumbehandlung unter Einsatz von Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen eingesetzt, die deutliche Zellwandbarrieren aufweisen. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen eingesetzt, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in WO 89105859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphatausfäliungsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), eingesetzt werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellenwirtsystemtransformationen wurden in US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe erfolgen typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 76, 3829 (1979). Andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie z. B. durch Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zeilen oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, können jedoch auch eingesetzt werden. In Bezug auf verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der Nucleinsäure (z. B. DNA) in dem Vektor umfassen hierin prokaryotische Zellen, Hefezellen oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien, wie z. B. Gramnegative oder Gram-positive Organismen, wie z. B. Enterobacteriaceae, wie z. B. E. coli, sind aber nicht auf diese beschränkt. Verschiedene E.-coli-Stämme sind allgemein verfügbar, wie z. B. der E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriacea, wie z. B. Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41 P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein verbreiteter Wirtsstamm für die Fermentation von rekombinanten DNA-Produkten ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Stamm W3110 kann beispielsweise modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen zu bewirken, die für in Bezug auf den Wirt endogene Proteine kodieren, wobei Beispiele für solche Wirte den E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollsgtändigen Genotyp tonA, ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nicht-Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist, und einen E.-coli-Stamm umfassen, der mutierte periplasmatische Protease aufweist, wie in US-Patent Nr. 4.946.783 , ausgegeben am 7. August 1990, offenbart. Alternativ dazu sind In-vivo-Klonierungsverfahren, wie z. B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerase-Reaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. fädige Pilze oder Hefe, als Klonierungs- oder Expressionswirte für PRO1122-kodierende Vektoren geeignet. Saccharomyces cerevisiae ist ein herkömmlicherweise eingesetzter niederer eukaryotischer Wirtsorganismus. Weitere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nature, Nature 290, 140 (1981); EP139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1995); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)), wie z. B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), Van den Berget al., Bio/Technology 8, 135 (1990); K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ); Sreekishna et al., J. basic Microbiol. 28, 265–278 (1988); Candid; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76, 5359–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und fädige Pilze wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans (Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4170–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrope Hefen werden aus den Gattungen Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula ausgewählt. Eine Liste spezifischer Spezies, die Beispiele dieser Hefeklasse sind, sind in C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982), zu linden.
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosyliertem PRO1122 stammen von multizellulären Organismen. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen, wie z. B. Drosohpila S2 und Spodoptera Sf9, Spodoptera high5, sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen die durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Zelllinie (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryonierenzelllinie (293- oder 293-Zellen, die zum Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065) und Mammatumorzellen der Maus (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Auswahl von geeigneten Wirtszellen wird als auf dem Gebiet der Erfindung bekannt erachtet.
3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für das gewünschte PRO1122-Polypeptid kodiert, kann zum Klonieren (Amplifizieren der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind allgemein verfügbar. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, Viruspartikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch verschiedene Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA an (einer) geeigneten Restriktionsendonuclease-Stelle(n) unter Einsatz von Verfahren insertiert, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, erfolgt unter Einsatz von Standard-Ligationsverfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
Das PRO1122-Polypeptid kann nicht nur direkt rekombinant produziert werden, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das eine Signalsequenz sein kann, oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder ein Teil der PRO1122-kodierenden DNA, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der aus alkalischen Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Zur Hefe-Sekretion kann es sich bei der Signalsequenz z. B. um Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (umfassend Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letztere in US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben werden) oder saure-Phosphatase-Leader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal handeln. Bei der Säugetierzellexpression können die Säugetiersignalssequenzen zur direkten Sekretion des Proteins, wie z. B. Signalsequenzen von sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader eingesetzt werden.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für zahlreiche Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Ursprung der Replikation des Plasmids pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene Virusursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen geeignet.
Expressions- und Klonierungsvektoren umfassen typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel ergänzen oder (c) wesentliche Nährstoffe liefern, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das Gen, das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodiert.
Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die PRO1122-kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszeile bei Verwendung von Wildtyp-DHFR ist die CHO-Zelllinie, die mangelhafte DHFR-Aktivität aufweist und wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das in dem Hefeplasmid Yrp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, der nicht in der Lage ist, in Tryptophan zu wachsen, wie z. B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten gewöhnlicherweise einen Promotor, der operabel mit der PRO1122-kodierenden Nucleinsäuresequenz verbunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Reihe von potenziellen Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotor-Systeme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] und Hybridpromotoren, wie z. B. der tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in Bakteriensystemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno(S.D.-) Sequenz, die operabel mit der DNA verbunden ist, die für das PRO1122-Polypeptid kodiert.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Weitere Hefe-Promotoren, bei denen es sich um induzierbare Promotoren handelt, die den zusätzlichen Vorteil haben, dass die Transkription durch die Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotor-Regionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, Abbauenzyme in Zusammenhang mit dem Stickstoffstoffwechsel, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefe-Expression sind weiters in EP 73.657 beschrieben.
PRO1122-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise von Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, wie z. B. Polyoma-Virus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogelsarkomvirus, Cytomegalievirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus-40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, und aus Hitzeschock-Promotoren erhalten, vorausgesetzt, dass diese Promotoren mit dem Wirtszellensystem verträglich sind.
Die Transkription von DNA, die für PRO1122-Polypeptid kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch das Insertieren einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, gewöhnlicherweise in einer Größe von etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu steigern. Viele Enhancer-Sequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer von einem eukaryotischen Virus eingesetzt. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), den frühen Cytomegalievirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Die Enhancer können in den Vektor an Position 5' oder 3' der PRO1122-Kodierungssequenz gespleißt werden, befinden sich aber vorzugsweise an der 5'-Stelle vom Promotor.
Die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschlichen oder kernhaltigen Zellen anderer multizellulärer Organismen) verwendeten Vektoren enthalten auch Sequenzen, die für die Beendigung der Transkription und die Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind allgemein aus den nicht translatierten 5'-, und gelegentlich 3'-, Regionen von eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im nicht translatierten Teil der mRNA, die für PRO1122 kodiert, transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Anpassung an die Synthese von PRO1122-Polypeptiden in rekombinanten Wirbeltierzellkulturen geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46(1979); EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben.
4. Nachweis von Genamplifikation/-expression
Genamplifikation und/oder -expression können direkt in einer Probe gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA mengenmäßig zu bestimmen (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisieren unter Einsatz einer angemessen markierten Sonde basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe erkennen können, wie z. B. DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Test kann erfolgen, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so dass bei Blidung des Duplexes an der Oberfläche die Gegenwart des an den Duplex gebundenen Antikörpers nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie z. B. immunohistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeteilen und Testen von Zellkulturen oder Körperflüssigkeiten, erfolgen, um die Expression des Genprodukts direkt mengenmäßig zu bestimmen. Antikörper, die für immunohistochemisches Färben und/oder das Testen von Probeflüssigkeiten nützlich sind, können monoklonal oder polyklonal sein und in einem Säugetier hergestellt werden. Die Antikörper können auf geeignete Weise gegen ein Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid oder ein synthetisches Peptid basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz, die an PRO1122-kodierende DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörper-Epitop kodiert, hergestellt werden.
5. Reinigung des Polypeptids
Formen von PRO1122 können aus dem Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Wenn sie Membran-gebunden sind, können sie unter Einsatz einer geeigneten Detergenslösung (z. B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung von der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO1122-Polypeptiden eingesetzt werden, können durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel, wie z. B. Gefrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanischen Aufschluss oder Zelllysiermittel, aufgeschlossen werden.
Es kann wünschenswert sein, PRO1122 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: durch Fraktionieren auf einer Ionenaustausch-Säule; Ethanolausfällen; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Siliciumdioxid oder auf einem Kationenaustauschharz, wie z. B. DEAE; Chromatofokussieren; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatausfällen; Gelfiltration unter Einsatz von z. B. Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen, wie z. B. IgG; und Metallchelatorsäulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen von PRO1122-Polypeptid. Verschiedene Verfahren zur Proteinreinigung können eingesetzt werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York (1982), beschrieben. Der gewählte Reinigungsschritt/die gewählten Reinigungsschritte hängen beispielsweise von der Natur des eingesetzten Herstellungsverfahrens und dem speziellen PRO1122-Palypeptid, das hergestellt wird, ab.
E. Verwendungen für PRO1122
Nucleotidsequenzen (oder deren Komplement), die für PRO1122-Polypeptide kodieren, können auf dem Gebiet der Molekularbiologie vielfältig angewandt werden, wie z. B. als Hybridisierungssonden, bei der Kartierung von Chromosomen und Genen und zur Herstellung von Antisense-RNA oder -DNA. PRO1122-kodierende Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von PRO1122-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren nützlich.
Die DNA62377-1381-1-Nucleotidsequenz voller Länge (Seq.-ID Nr. 4) oder die native PRO1122-Nucleotid-kodierende Sequenz voller Länge oder Teile davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek eingesetzt werden, um PRO1122-Gen oder andere Gene zu isolieren (z. B. die, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO1122 oder Entsprechungen von anderen Spezies kodieren), die eine gewünschte Sequenzidentität mit der in 4 offenbarten PRO1122-Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4) aufweisen. Fakultativ beträgt die Länge der Sonden etwa 20 bis 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von der DNA62377-1381-1-Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 4, wie in 4 dargestellt, oder von Genomsequenzen, wie z. B. Promotoren, Enhancer-Elementen und Introns, der für Nativsequenz-PRO1122 kodierenden DNA stammen. Ein Screening-Verfahren umfasst beispielsweise das Isolieren der kodierenden Region des PRO1122-Gens unter Einsatz der bekannten DNA-Sequenz zum Synthetisieren einer ausgewählten Sonde mit etwa 40 Basen. Hybridisierungssonden können durch verschiedene Markierungen markiert werden, wie z. B. durch Radionucleotide, wie z. B. ³²P oder ³⁵S, oder Enzymmarkierungen, wie z. B. alkalische Phosphatase, die mittels Avidin/Biotin-Verbindungssystemen an die Sonde gebunden ist. Markierte Sonden, die eine zu der des PRO1122-Gens der vorliegenden Erfindung komplementäre Sequenz aufweisen, können zum Screenen von Bibliotheken von menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA eingesetzt werden, um zu bestimmen, an welche Elemente dieser Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungsverfahren werden in den untenstehenden Beispielen detaillierter beschrieben.
Eine beliebige EST-Sequenz (oder ein Fragment davon), die in der vorliegenden Anmeldung offenbart wird, kann auf ähnliche Weise unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren als Sonde eingesetzt werden.
Weitere nützliche Fragmente von PRO1122-Nucleinsäuren umfassen Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, die eine einsträngige Nucleinsäuresequenz (RNA oder DNA) umfassen, die in der Lage ist, an die Ziel-PRO1122-mRNA (Sense) der PRO1122-DNA-(Antisense)Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide umfassen gemäß der vorliegenden Erfindung ein Fragment der kodierenden Region von PRO1122-DNA. Ein solches Fragment umfasst im Allgemeinen etwa 14 Nucleotide, vorzugsweise etwa 14 bis 30 Nucleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder Sense-Nucleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Protein kodiert, abzuleiten, wird beispielsweise in Stein und Cohen, Cancer Res. 48, 2659 (1988), und van der Krol et al., BioTechniques 6, 958 (1988), beschrieben.
Die Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonucleotiden an Zielnucleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Duplexen, die die Transkription oder Translation der Zielsequenz durch ein oder mehrere Mittel blockieren, wie z. B. durch verstärkten Abbau der Duplexe, verfrühte Beendigung von Transkription oder Translation oder durch andere Mittel. Die Antisense-Oligonucleotide können demnach eingesetzt werden, um die Expression von PRO11122-Proteinen zu blockieren. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide umfassen weiters Oligonucleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Gerüsten (oder anderen Zuckerbindungen, wie z. B. die in WO 91/06629 beschriebenen), in denen solche Zuckerbindungen endogenen Nucleasen gegenüber resistent sind. Solche Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (d. h. in der Lage, gegenüber enzymatischem Abbau zu bestehen), weisen aber weiterhin Sequenzspezifität auf, um in der Lage zu sein, an die Zielnucleotidsequenzen zu binden.
Weitere Beispiele für Sense- oder Antisense-Oligonucleotide umfassen jene Oligonucleotide, die kovalent an organische Gruppierungen gebunden sind, wie z. B. die in WO 90/10048 beschriebenen, sowie an andere Gruppierungen, die die Affinität des Oligonucleotids in Bezug auf eine Zielnucleinsäuresequenz steigern, wie z. B. Poly-L-Lysin. Weiters können interkalierende Mittel, wie z. B. Ellipticin, und Alkylierungsmittei oder Metallkomplexe an die Sense- oder Antisense-Oligonucleotide gebunden sein, um die Bindungsspezifitäten dieser Antisense- oder Sense-Oligonucleotide in Bezug auf die Zielnucleotidsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonucleotide können durch ein beliebiges Gen-Übertragungsverfahren, wie z. B. CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder unter Einsatz von Gen-Transfervektoren, wie z. B. des Epstein-Barr-Virus, in eine Zelle eingeführt werden, die die Zielnucleinsäuresequenz enthält. Bei einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor insertiert. Eine Zelle, die die Zielnucleinsäuresequenz enthält, wird mit dem rekombinanten retroviralen Vektor, in vivo oder ex vivo, kontaktiert. Geeignete retrovirale Vektoren umfassen die von den Maus-Retroviren M-MuLV, N2 (ein von M-MuLV abgeleitetes Retrovirus) abgeleiteten Vektoren oder die als CDT5A, DCT5B und DCT5C bezeichneten Doppelkopievektoren (siehe WO 90/13641 ), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Sense- oder Antisense-Oligonukleotide können auch durch Bildung eines Konjugats mit einem Liganden-Bindungsmolekül, wie in WO 91/04753 beschrieben, in eine Zelle eingeführt werden, die die Zielnucleotidsequenz enthält. Geeignete Liganden-Bindungsmoleküle umfassen Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Vorzugsweise beeinträchtigt die Konjugation mit dem Ligand-Bindungsmolekül die Fähigkeit des Liganden-Bindungsmoleküls, an das entsprechende Molekül oder den entsprechenden Rezeptor zu binden oder das Eindringen des Sense- oder Antisense-Oligonucleotids oder dessen konjugierter Version in die Zelle zu blockieren, nicht wesentlich.
Alternativ dazu kann ein Sense- oder Antisense-Oligonucleotid durch Bildung eines Oligonucleotid-Lipid-Komplexes in eine Zelle, die die Zielnucleinsäuresequenz enthält, eingeführt werden, wie in WO 90/10448 beschrieben. Der Sense- oder Antisense-Olignucleotid-Lipid-Komplex wird in der Zelle vorzugsweise durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die Sonden können auch in PCR-Verfahren zur Erzeugung eines Sequenz-Pools zur Identifikation von nahe verwandten PRO1122-Sequenzen eingesetzt werden.
Nucleotidsequenzen, die für ein PRO1122-Polypeptid kodieren, können auch zur Konstruktion von Hybridisierungssonden zum Kartieren des Gens, das für das PRO1122-Polypeptid kodiert, sowie für die genetische Analyse vom Individuen mit genetischen Störungen eingesetzt werden. Die hierin bereitgestellte Nucleotidsequenz kann unter Einsatz von bekannten Verfahren, wie z. B. In-situ-Hybridisieren, Bindungsanalyse in Bezug auf bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungsscreening mit Bibliotheken, in Bezug auf Chromosome und spezifische Regionen eines Chromosoms kartiert werden.
Wenn die Kodiersequenzen für PRO1122 für ein Protein kodieren, das an ein anderes Protein bindet (beispielsweise wenn PRO1122-Polypeptid als Rezeptor dient), kann das PRO1122-Polypeptid in Tests zur Identifikation der anderen Proteine oder Moleküle, die an der Bindungswechselwirkung beteiligt sind, eingesetzt werden. Durch solche Verfahren können Hemmer der Rezeptor/Liganden-Biridungswechselwirkung identifiziert werden. Proteine, die an solchen Bindungswechselwirkungen beteiligt sind, können auch zum Screenen auf Peptide oder kleinmolekulare Hemmer oder Agonisten der Bindungswechselwirkung eingesetzt werden. Das PRO1122-Rezeptor-Polypeptid kann auch zur Isolierung von (einem) korrelativen Liganden eingesetzt werden. Screening-Tests können so gestaltet werden, dass sie die Leitstruktur-Verbindungen finden, die die biologische Aktivität von nativem PRO1122 oder einein PRO1122-Rezeptor nachahmen. Solche Screening-Tests umfassen auch Tests, die für Hochdurchsatzscreening von chemischen Bibliotheken angewandt werden können, wodurch sie besonders zur Identifikation von kleinmolekularen potentiellen Arzneimitteln geeignet sind. Kleine Moleküle, die in Betracht gezogen werden, umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Tests können in verschiedenen Formaten durchgeführt werden, z. B. als Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierte Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung alle hinreichend charakterisiert sind.
Nucleinsäuren, die für PRO1122-Polypeptid kodieren, oder eine seiner modifizierten Formen können auch eingesetzt werden, um nicht-menschliche transgene Tiere oder nicht-menschiiche ”Knockout”-Tiere zu erzeugen, die wiederum für die Entwicklung und das Screening von therapeutisch wirksamen Reagenzien nützlich sind. Ein nicht-menschliches transgenes Tier (z. B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier oder einen Vorfahren des Tiers in einer pränatalen, z. B. einer embryonischen, Phase eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann cDNA, die für PRO1122-Polypeptid kodiert, eingesetzt werden, um genomische DNA, die für PRO1122 kodiert, gemäß den etablierten Verfahren zu klonieren, und die genomischen Sequenzen können eingesetzt werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, die DNA exprimieren, die für PRO1122 kodiert. Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere, insbesondere von Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung verbreitet und beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise wären bestimmte Zellen das Ziel für die PRO1122-Transgen-Inkorporation mit Gewebe-spezifischen Enhancern. Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens umfassen, das für PRO1122 kodiert und in einer embryonalen Phase in die Keimbahn des Tiers eingeführt wurde, können eingesetzt werden, um die Wirkung der gesteigerten Expression von PRO1122-kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien eingesetzt werden, von denen angenommen wird, dass sie beispielsweise Schutz in Bezug auf pathologische Zustände in Zusammenhang mit dessen Überexpression verleihen. Gemäß dieser Facette der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagenz behandelt, und ein Auftreten des pathologischen Zustands in geringerem Maße im Vergleich mit Tieren, die das Transgen aufweisen, aber nicht behandelt wurden, würde auf eine potentielle therapeutische Intervention in Bezug auf den pathologischen Zustand hindeuten.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe von PRO1122 eingesetzt werden, um ein PRO1122-”Knockout”-Tier zu erzeugen, das aufgrund der homologen Rekombination zwischen dem PRO1122-kodierenden endogenen Gen und der PRO1122-kodierenden veränderten genomischen DNA, die in eine Embryozelle des Tiers eingeführt wurden, ein defektes oder verändertes Gen aufweist, das für PRO1122 kodiert. Beispielsweise kann PRO1122-kodierende cDNA eingesetzt werden, um genomische DNA, die für PRO1122 kodiert, gemäß etablierten Verfahren zu klonieren. Ein Teil der genomischen DNA, die für PRO1122 kodiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie z. B. durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der eingesetzt werden kann, um die Integration zu überwachen. Typischerweise sind mehrere Kilobasenpaare unveränderter flankierender DNA (an den 5'- und den 3'-Enden) Teil des Vektors (siehe z. B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie eingeführt (z. B. mittels Elektroporation), und Zellen, in denen die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert wurde, werden ausgewählt (siehe z. B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers injiziert (z. B. eine Maus oder Ratte), um Aggregationschimären zu bilden (siehe z. B. Bradley, in: Teratocarcinomas und Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 113–152, E. J. Robertson (Hrsg.), Oxford, Irland (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeigfetes pseudoträchtiges weibliches Pflegetier implantiert werden, und der Embryo kann ausgetragen werden, um dann ein ”Knockout”-Tier zu sein. Nachkommen, die die homogen rekombinierte DNA in ihrer Keimlinie aufweisen, können unter Einsatz von Standarderfahren identifiziert werden und zur Zucht von Tieren eingesetzt werden, in denen alle Zellen die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise in Bezug auf ihre Fähigkeit, bestimmte pathologische Zustände abzuwehren, und die Entwicklung pathologischer Zustände aufgrund des Fehlens des PRO1122-Polypeptids charakterisiert werden.
Nucleinsäure, die für PRO1122-Polypeptide kodiert, kann auch in der Gentherapie eingesetzt werden. Bei Gentherapie-Anwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um eine In-vivo-Synthese des therapeutisch wirksamen Genprodukts zu erzielen, beispielsweise um ein defektes Gen zu ersetzen. ”Gentherapie” umfasst herkömmliche Gentherapie, bei der eine andauernde Wirkung mit einer einzigen Behandlung erzielt wird, sowie die Verabreichung von gentherapeutischen Wirkstoffen, was die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNA und -DNA können als therapeutische Wirkstoffe zum Blockieren der Expression bestimmter Gene in vivo eingesetzt werden. Es wurde bereits gezeigt, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, wo sie trotz ihrer geringen intrazellulären Konzentrationen aufgrund ihrer beschränkten Aufnahme durch die Zellmembran als Hemmer wirken. Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 (1986). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um deren Aufnahme zu steigern, z. B. durch das Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
Es stehen verschiedene Verfahren zum Einführen von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen zur Verfügung. Die Verfahren variieren in Abhängigkeit davon, ob die Nucleinsäure in vitro in eine kultivierte Zelle oder in vivo in die Zellen des gewünschten Wirts eingeführt werden. Verfahren, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, umfassen den Einsatz von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat Ausfällungsverfahren etc. Die derzeit bevorzugten Verfahren für In-vivo-Gentransfer umfassen die Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und Virushüllprotein-Liposom-vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 (1993)). In manchen Situationen ist es wünschenswert, eine Nucleinsäurequelle mit einem Wirkstoff bereitzustellen, der auf die Zielzellen abzielt, wie z. B. ein Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder die Zielzelle spezifisch ist, ein Ligand für einen Rezeptor an den Zielzellen etc. Wenn Liposomen eingesetzt werden, können Proteine, die an ein Zelloberflächenmembranportein, das mit Endocytose assoziiert ist, binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme eingesetzt werden, z. B. Kapsidproteine oder Fragmente davon, die für einen speziellen Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Zyklieren internalisiert werden, Proteine, die auf die intrazelluläre Lokalisierung abzielen und die intrazelluläre Halbwertszeit steigern. Das Verfahren zur Rezeptor-vermittelten Endocytose wird beispielsweise in Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987), und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben. Für eine Übersicht über Gen-Markierung und Gen-Therapieprotokolle siehe Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992).
Die hierin beschriebenen PRO1122-Polypeptide können auch als Molekulargewicht Marker zu Zwecken der Proteinelektrophorese eingesetzt werden.
Das Nucleinsäuremolekül, das für die PRO1122-Polypeptide kodiert, oder hierin beschriebene Fragmente davon sind für die Chromosomenidentifikation nützlich. In dieser Hinsicht besteht ein dauerhafter Bedarf, neue Chromosomen-Marker zu identifizieren, da derzeit relativ wenige Chromosom-Markierungsreagenzien bezogen auf tatsächlichen Sequenzdaten verfügbar sind. Jedes PRO1122-Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann als Chromosomen-Marker eingesetzt werden.
Die PRO1122-Polypeptide und Nucleinsäuremoleküle können auch für Gewebetypisierung eingesetzt werden, wobei die PRO1122-Polypeptide in einem Gewebe im Vergleich mit einem anderen anders exprimiert werden können. PRO1122-Nucleinsäuremoleküle können auch zur Erzeugung von Sonden für PCR, Northern-Analyse, Southern-Analyse und Western-Analyse Anwendung finden.
PRO1122-Polypeptide, die biologische Aktivität aufweisen, die mit der von IL-17 verwandt ist, können sowohl in vivo zu therapeutischen Zwecken als auch in vitro eingesetzt werden. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, wie die PRO1122-Polypeptide für solche Zwecke einzusetzen sind.
PRO1122 kann in Tests mit Polypeptiden, mit denen es Identität aufweist, eingesetzt werden, um die relativen Aktivitäten zu bestimmen. Die Ergebnisse können dementsprechend verwendet werden.
Ein Abgleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz von IL-17B (z. B. UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) mit der bekannten Sequenz von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) zeigt, dass es sich um eine Familie verwandter Sequenzen mit 26–28% Aminosäureidentität zwischen den drei Elementen handelt (7). Alle drei Polypeptide enthalten eine hydrophobe Sequenz am N-Terminus, von der man annimmt, dass sie als Sekretionssignalsequenz von 18–20 Aminosäuren funktioniert, wodurch man einen vorhergesagten Größenbereich für die Elemente dieser Familie erhält, der 155 bis 197 Aminosäuren beträgt (reifes Molekulargewicht: 17 bis 20 kDa). Der Abgleich in 7 zeigt verschiedene konservierte Aminosäuren, umfassend einen Tryptophan-Rest und 5 Cysteine in der C-terminalen Hälfte der Proteine.
Die PRO1122-kodierende Nucleinsäure oder Fragmente davon können auch zur Chromosomen-Lokalisation eingesetzt werden. Die Chromosomenlokalisierung von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) wurde unter Einsatz von Tawqman-Primern und Sonden ermittelt, die in den nicht-translatierten 31 Regionenvon IL-17B und IL-17C gestaltet wurden, erfolgte mittels PCR mit einem Stanford-Radiation-Hybrid-Panel-G3-Panel. IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) wurde in Bezug auf das menschliche Chromosom 5q32-34 kartiert, während IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) in Bezug auf Chromosom 16q24 lokalisiert wurde. Menschliches IL-17 selbst ist auf Chromosom 2q31 zu finden. Rouvier et al., M. Immunol. 150, 5445 (1993).
Durch die Isolation und Charakterisierung der beiden neuen Verwandten von IL-17 haben die Anmelder die potentielle Rolle dieser Familie von Cytokinen in Bezug auf proinflammatorische Immunantworten und andere Reaktionen festgestellt und erweitert. Die drei Elemente der Familie, IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL.-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID Nr. 3), sind in Bezug auf die Primärstruktur mit insgesamt etwa 27% Aminosäureidentität, umfassend 5 konservierte Cystein-Reste (7), mäßig eng verwandt. Die drei Elemente der Familie weisen alle eine Reihe von Merkmalen auf – sie sind alle 150–200 Aminosäurereste lang, sie werden von Zellen über eine hydrophobe Sekretionssignalsequenz sekretiert, und sie werden als Homodimere mit Disulfid-Bindungen exprimiert, wobei diese in manchen Fällen glykosyliert scheinen.
Wenngleich sie basierend auf Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit Elemente derselben Genfamilie sind, werden die drei Proteine in verschiedenen Geweben exprimiert und im Genom dispergiert. Es wurde berichtet, dass die Expression von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) nur in aktivierten T-Zellen erfolgt – Fossiez et al., J. Exp, Med. 183, 2593 (1996); Yao et al., J. Immunol. 155, 5483 (1995) [Yao-3], während hierin gezeigt wird, dass IL-17B (DNA59294) (Seq.-ID Nr. 2) in normaler menschlicher adulter Bauchspeicheldrüse, Dünndarm und Magen exprimiert wird (8). Die Expressionsstruktur von IL-17C (DNA62377) (Seq.-ID Nr. 4) ist jedoch viel eingeschränkter, da bisher noch keine bestätigte Expression in anderen Geweben entdeckt wurde.
Die hierin beschriebenen Charakterisierungen zeigen, dass die biologische Aktivität von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) sich deutlich von den bestätigten Aktivitäten von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) unterscheiden. IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) rufen beide keine Induktion der IL-6-Produktion in menschlichen Vorhaut-Fibroblasten hervor (Beispiel 10) (9A). Das steht im Gegensatz zu der für IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) bekannten deutlichen Induktion. Yao et a1., Immunity 3, 811 (1995) [Yao-1], Yao et al., J. Immunol. 155, 5483 (1995) [Yao-31. Umgekehrt induzieren IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) beide die Freisetzung von TNF-α aus der monozytären Zelllinie, THP1, während IL-17 nur eine geringe Wirkung hat (9B). Die stimulierte Freisetzung von TNF-α in THP1-Zellen durch IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) ist zeit- und konzentrationsabhängig (Beispiel 10) (10), wobei IL-178 (Seq.-ID Nr. 1) etwa 10-mal potenter ist als IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) [EC₅₀ = 2,4 nM für IL-17B vs. 25 nM für IL-17C].
Die verschiedenen biologischen Wirkungen von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) im Vergleich mit IL-17B oder C (Seq.-ID Nr. 1 und 3) deuten darauf hin, dass sie über verschiedene Zelloberflächenrezeptoren (oder unterschiedliche Rezeptorkomponenten) funktionieren könnten als der bekannte IL-17-Rezeptor. Yao et al., Cytokine 9, 794 (1997) [Yao-3]. In einer Bemühung, die Frage der Rezeptor-Spezifität direkt zu untersuchen, haben die Anmelder gezeigt, dass sowohl IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) als auch IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) nicht in der Lage sind, an die IL-17-Rezeptor-ECD (Seq.-ID Nr. 16) (11A) zu binden sowie mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) um die Bindung an seine Rezeptor-ECD (Seq.-ID Nr. 16) (11B) zu konkurrieren. IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) binden an die Oberfläche von THP1-Zellen, wo sie Aktivität aufweisen (12). Die Wechselwirkung ist zumindest in dem Maß spezifisch, dass ein Kontroll-Fc-Fusionsprotein nicht in der Lage ist, an diese Zellen zu binden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine Reihe von Rezeptoren geben könnte, die das Signal von der Familie von IL-17-Cytokinen binden und transduzieren – ein Rezeptor/Liganden-Modell, das für viele Cytokin- und Wachstumsfaktor-Familien gefunden wurde.
Die hierin offenbarten neuen Cytokine, PRO1031 (z. B. 516) und PRO1122 (z. B. UNQ561), unterscheiden sich in Bezug auf ihre Expressionsstruktur und ihre biologischen Aktivitäten von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11). Die unterschiedliche Expression in Verbindung mit der mangelnden Wechselwirkung mit dem bekannten IL-17-Rezeptor deutet auf eine erweiterte Rolle der IL-17-Familie in pro-entzündlichen Immunreaktionen hin.
F. Anti-PRO1122-Antikörper
Die vorliegende Erfindung offenbart Anwendungen von Anti-PRO1122-Polypeptid-Antikörper. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper.
1. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO1122 Antikörper, die in der vorliegenden Offenbarung eingesetzt werden, können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Wirkstoffs und, nach Wunsch, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise werden der immunisierende Wirkstoff und/oder das Adjuvans durch mehrere subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier injiziert. Der immunisierende Wirkstoff kann PRO1122-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann auch nützlich sein, den immunisierenden Wirkstoff an ein Protein zu binden, von dem bekannt ist, dass es in dem zu immunisierenden Säugetier immunogen ist. Beispiele für solche immunogene Proteine umfassen Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyreoglobulin und Sojabohnen-Trypsin-Hemmer, sind aber nicht auf diese beschränkt. Beispiele für das Adjuvans, das eingesetzt werden kann, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl Lipid A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
2. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO1122-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Einsatz von Hybridom-Verfahren hergestellt werden, wie z. B. durch die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen. Bei einem Hybridom-Verfahren wird typischerweise eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier mit einem immunisierenden Wirkstoff immunisiert, um Lymphozyten zu produzieren, die Antikörper, die spezifisch an den immunisierenden Wirkstoff binden, erzeugen oder in der Lage sind, diese zu erzeugen. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Der immunisierende Wirkstoff umfasst typischerweise PRO1122-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden periphere Blutlymphozyten (”PBL”) eingesetzt, wenn Zellen mit menschlichem Ursprung gewünscht werden, oder Milzoder Lymphknotenzellen, wenn nicht-menschliche Säugetierquellen gewünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Einsatz eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, zur Bildung einer Hybridomzelle fusioniert (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103, Academic Press (1986)). Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind gewöhnlicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern oder menschlichen Ursprungs. Gewöhnlicherweise werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum und das Überleben der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen. Wenn den Elternzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Nährmedium für die Hybridomen typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (”HAT-Medium”), wobei diese Substanzen das Wachstum von Zellen mit HGPRT-Mangel verhindern.
Bevorzugte, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, eine stabile Expression von Antikörpern durch die ausgewählten Antikörperproduzierenden Zellen in hohem Maß unterstützen und in Bezug auf ein Medium, wie z. B. HAT-Medium, empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise von dem Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, bezogen werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch in Bezug auf die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker Inc., New York (1987)).
Das Nährmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann in Bezug auf das Vorhandensein von gegen PRO1122-Polypeptid gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von durch die Hybridomzellen produzierten Antikörpern durch Immunfällung oder durch einen Invitro-Bindungstest bestimmt, wie z. B. einen Radioimmuntest (RIA) oder eine enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA). Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nach der Identifikation der gewünschten Hybridomzellen können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch herkömmliche Verfahren [Goding, s. o.] gezüchtet werden. Geeignete Nährmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die durch die Subklone sekretierten monoklonalen Antikörper können isoliert oder aus dem Nährmedium oder der Aszitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie z. B. durch die in US-Patent Nr. 4.816.567 beschriebenen. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung kodiert, kann unter Einsatz von herkömmlichen Verfahren (z. B. unter Einsatz von Oligonucleotid-Sonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten von Maus-Antikörpern kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die erfindungsgemäßen Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle für diese DNA. Wenn die DNA isoliert wurde, kann sie in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen, wie z. B. Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstockzellen (CHO) oder Myelomzellen, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu bewirken. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch das Substituieren der Sequenz, die für menschliche konstante Schwer- und Leichtketten-Domänen kodiert, anstelle der homologen Maus-Sequenzen ( US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)) oder durch die kovalente Bindung der gesamten, für ein Nicht-Immunglobulin-Peptid kodierenden Sequenz oder eines Teils davon an die Immunglobulin-kodierende Sequenz. Ein solches Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann für die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder für die variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers substituiert werden, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu erzeugen.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung von einwertigen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein Verfahren umfasst beispielsweise die rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette wird im Allgemeinen an einem Punkt in der Fc-Region trunkiert, um Schwerketten-Vernetzung zu vermeiden. Alternativ dazu werden die relevanten Cystein-Reste durch andere Aminosäurereste substituiert oder deletiert, um eine Vernetzung zu vermeiden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung von einwertigen Antikörpern geeignet. Der Verdau von Antikörpern zur Herstellung von Fragmenten davon, insbesondere von Fab-Fragmenten, kann unter Einsatz von Routineverfahren erfolgen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
3. Humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO1122-Antikörper, die in der vorliegenden Offenbarung eingesetzt werden, können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindestsequenz aufweisen, die von nicht-menschlichem Immunglobulin stammt. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt wurden. In manchen Fällen werden Fv-Rahmenreste von menschlichem Immunglobulin durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder in dem Empfänger-Antikörper noch in der importierten CDR oder Rahmensequenz zu finden sind. im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die ganze von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen oder alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise die eines menschlichen Immunglobulins (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988), und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593–596 (1992)).
Verfahren zum Humanisieren von nicht-menschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in diesen aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als ”Import”-Reste bezeichnet, die typischerweise von einer variablen ”Import”-Domäne stammen. Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und seinen Mitarbeitern erfolgen (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), indem Nagetier-CDR oder -CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers substituiert werden. Dementsprechend handelt es sich bei solchen ”humanisierten” Antikörpern um chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis handelt es sich bei humanisierten Antikörpern typischerweise um menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Einsatz von verschiedenen Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z. B. Phagendisplay-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. stehen auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern zur Verfügung (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77, Alan R. Liss (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147 (1), 86–95, (1991)). Auf ähnliche Weise können menschliche Antikörper durch das Einführen von menschlichen Immunglobulinloci in transgene Tiere, z. B. Mäuse, hergestellt werden, in denen die endogenen Immunglobulin-Gene teilweise oder vollständig inaktiviert wurden. Bei Provokation ist die Produktion von menschlichen Antikörpern zu beobachten, die der Produktion von Antikörpern in Menschen in jeder Hinsicht, umfassend Gen-Neuordnung, -Anordnung und Antikörper-Repertoire, sehr ähnlich ist. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807 , 5.545.806 , 5.569.825 , 5.625.126 , 5.633.425 , 5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg und Huszar, intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
4. Antikörper-abhängige Enzym-gesteuerte Prodrug-Therapie (ADEPT)
Die Antikörper der vorliegenden Offenbarung können auch in ADEPT eingesetzt werden, indem der Antikörper an ein Prodrug-aktivierendes Enzym konjugiert wird, das ein Prodrug (z. B. einen Peptidyl-Chemotherapie-Wirkstoff, siehe WO 81/01145 ) in ein aktives Anti-Krebs-Arzneimittel umsetzt. Siehe beispielsweise WO 88/07378 und US-Patent Nr. 4.978.278 .
Die Enzym-Komponente des Immunkonjugats, das für ADEPT eingesetzt werden kann, umfasst ein beliebiges Enzym, das in der Lage ist, so auf ein Prodrug zu wirken, dass es in seine aktivere, zytotoxische Form umgesetzt wird.
Enzyme, die in dem Verfahren wirksam sind, umfassen Glycosidase, Glucoseoxidase; menschliches Lysosym; menschliche Glucuronidase; alkalische Phosphatase, die zur Umsetzung von Phosphat-hältigen Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam ist; Arylsulfatase, die zur Umsetzung von Sulfat-hältigen Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam ist; Cytosindeaminase, die zur Umsetzung von nicht-toxischem 5-Fluorcytosin in das Anti-Krebs-Arzneimittel 5-Fluoruracil wirksam ist; Proteasen, wie z. B. Serratiaprotease; Thermolysin; Substilisin; Carboxypeptidasen (z. B. Carboxypeptidase G2 und Carboxypeptidase A) und Cathepsine (wie z. B. Cathepsin B und L), die zur Umsetzung von Peptid-hältigen Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, die zur Umsetzung von Prodrugs, die D-Aminosäure-Substituenten umfassen, wirksam sind; Kohlenwasserstoff-spaltende Enzyme, wie z. B. β-Galactosidase und Neuraminidase, die zur Umsetzung von glykosylierten Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam sind; β-Lactamase, die zur Umsetzung von mit β-Lactamen derivatisierten Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam ist; sowie Penicillin-Amidasen, wie z. B. Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, die zur Umsetzung von an ihren Aminstickstoffatomen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetylgruppen derivatisierten Prodrugs in freie Arzneimittel wirksam sind, sind aber nicht auf diese beschränkt. Alternativ dazu können auch Antikörper mit Enzymaktivität, die auf dem Gebiet der Erfindung auch als ”Abzyme” bekannt sind, eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Prodrugs in freie aktive Arzneimittel umzusetzen (siehe z. B. Massey, Nature 328, 457–458 (1987)). Antiköper-Abzym-Konjugate können wie hierin beschrieben zur Zufuhr des Abzyms zu einer Tumorzellpopulation hergestellt werden.
Die Enzyme können mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z. B. unter Einsatz der oben angeführten heterobifunktionellen Vernetzungsmittel, kovalent an die Anti-PRO1122-Antikörper gebunden werden. Alternativ dazu können Fusionsproteine, die zumindest die Antigen-Bindungsregion des Antikörpers gebunden an zumindest einen funktionell aktiven Enyzmabschnitt umfassen, unter Einsatz von DNA-Rekombinationstechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, hergestellt werden (siehe z. B. Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984)).
5. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten ist eine Bindungsspezifität für ein PRO1031-Polypeptid und die andere eine Bindungsspezifität für ein anderes Antigen, vorzugsweise für ein Zelloberflächen-Protein, -Rezeptor oder -Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-/Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der zufälligen Anordnung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch aus zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die richtige bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des richtigen Moleküls erfolgt gewöhnlicherweise durch Affinitätschromatographie-Schritte. Ähnliche Verfahren werden in WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörper-Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an konstante Immunglobulin-Domänensequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerketten-Domäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Vorzugsweise umfasst die erste konstante Schwerkettenregion (CH1) die Stelle, die für die Bindung von Leichtketten, die zumindest in einer der Fusionen vorkommen, erforderlich ist. DNA, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen und, nach Wunsch, die Immunglobulin-Leichtketten kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Für weitere Details zur Herstellung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 120 (1986).
Gemäß einem anderen Ansatz, der in WO 96/27011 beschrieben wird, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar Antikörpermolekülen so verändert werden, dass der Prozentsatz an Heterodimeren maximiert wird, die aus der rekombinanten Zellkultur gewonnen werden. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörper-Domäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z. B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensatorische ”Hohlräume”, die dieselbe oder eine ähnliche Größe wie die längere(n) Seitenkette(n) aufweisen, werden auf der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls gebildet, indem die langen Aminosäureseitenketten durch kleinere (z. B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden. Dadurch wird ein Mechanismus zur Steigerung der Heterodimer-Ausbeute gegenüber anderen ungewünschten Endprodukten, wie z. B. Homodimeren, bereitgestellt.
Bispezifische Antikörper können als Antikörper voller Länge oder Antikörperfragmente (z. B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden. Verfahren zur Erzeugung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten sind in der Literatur beschrieben. Bispezifische Antikörper können beispielsweise unter Einsatz von chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, bei dem intakte Antikörper proteolytisch zur Erzeugung von F(ab')₂-Fragmenten gespalten werden. Diese Fragmente werden in Gegenwart von Dithiol komplexierendem Natriumarsenit zur Stabilisierung benachbarter Dithiole und zur Vermeidung intermolekularer Disulfid-Bildung reduziert. Die erzeugten Fab'-Fragmente werden dann in Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivate umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann mittels Reduktion mit Mercaptoethylamin zu Fab'-Thiol rückumgesetzt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats zur Bildung des bispezifischen Antikörpers gemischt. Die hergestellten bispezifischen Antikörper können als Wirkstoffe zur selektiven Immobilisierung von Enzymen eingesetzt werden.
Fab'-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch zur Bildung von bispezifischen Antikörpern verbunden werden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Herstellung eines vollständig humanisierten bispezifischen F(ab')₂-Antikörpermoleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde getrennt von E. coli sekretiert und in vitro einer gerichteten chemischen Verbindung zur Bildung des bispezifischen Antikörpers unterzogen. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, an Zellen, die ErbB2-Rezeptor überexprimierten, und normale menschliche T-Zellen zu binden sowie die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumorziele auszulösen.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolierung von bispezifischen Antikörperfragmenten unmittelbar aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenfalls beschrieben. Bispezifische Antikörper wurden beispielsweise unter Einsatz von Leucin-Zippern erzeugt, Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5), 1547–1553 (1992), wobei die Leucin-Zipper-Peptide von Fos- und Jun-Proteinen mittels Genfusion an die Fab'-Abschnitte zweier verschiedener Antikörper gebunden wurden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion zur Bildung von Monomeren reduziert und dann zur Bildung der Antikörper-Heterodimere erneut oxidiert. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren eingesetzt werden. Das von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschriebene ”Diabody”-Verfahren stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von bispezifischen Antikörperfragmenten bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (V_H), die über einen Linker mit einer variablen Leichtketten-Domäne (V_L) verbunden ist, wobei der Linker zu kurz ist, um die Paarbildung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Dementsprechend sind die V_H- und die V_L-Domänen eines Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen entstehen. Eine weitere Strategie zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente unter Einsatz eines einkettigen Fv-(sFv-)Dimers wurde ebenfalls beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls in Betracht gezogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
Beispielhafte bispezifische Antikörper können an zwei verschiedene Epitope an einem bestimmten ”PRO”-Protein hierin binden. Alternativ dazu kann ein Anti”PRO”-Proteinarm mit einem Arm kombiniert werden, der an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten, wie z. B. einem T-Zell-Rezeptormolekül (z. B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z. B. RcγRI (CD64), RcγRII (CD32) und FcγIII (CD16), bindet, um die Zellverteidigungsmechanismen auf die Zelle zu fokussieren, die das spezielle ”PRO”-Protein exprimiert. Diese Antikörper weisen einen ”PRO”-Bindungsarm und einen Arm auf, der einen zytotoxischen Wirkstoff oder einen Radionuklid-Chelatbildner, wie z. B. EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA, bindet. Ein weiterer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das ”PRO”-Polypeptid und bindet außerdem Gewebefaktor (TF).
6. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper sind auch Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper bestehen aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern. Es wurde beispielsweise vorgeschlagen, dass solche Antikörper Immunsystemzellen auf ungewünschte Zellen richten ( US-Patent Nr. 4.676.980 ) sowie zur Behandlung von HIV-Infektion ( WO 91/00360 ; WO 921200373 ; EP 03089 ). Es wird in Betracht gezogen, dass die Antikörper in vitro unter Einsatz von in der synthetischen Proteinchemie bekannten Verfahren hergestellt werden können, umfassend Verfahren, bei denen Vernetzungsmittel eingesetzt werden. Immuntoxine können beispielsweise unter Einsatz einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung hergestellt werden. Beispiele für zu diesem Zweck geeignete Reagenzien umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene, die beispielsweise in US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart werden.
7. Effektorfunktions-Engineering
Es kann wünschenswert sein, die in der Erfindung verwendeten Antikörper in Bezug auf die Effektorfunktion zu modifizieren, um die Wirksamkeit des Antikörpers zu steigern. Beispielsweise kann ein Cystein-Rest/können Cystein-Reste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Interketten-Disulfid-Bindungen in dieser Region ermöglicht wird. Die so erzeugten homodimeren Antikörper können eine verbesserte Internalisierungskapazität und/oder ein gesteigertes Komplement-vermitteltes Töten von Zellen und eine gesteigerte Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und B. Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Antitumor-Aktivität können auch unter Einsatz von heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben, hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein Antikörper mit doppelten Fc-Regionen durch genetische Veränderung hergestellt werden, wodurch er eine gesteigerte Komplement-Lyse und ADCC-Kapazitäten aufweisen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
8. Immunkonjugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an einen zytotoxischen Wirkstoff, wie z. B. einen chemotherapeutischen Wirkstoff, ein Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin, das von Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren stammt, oder Fragmente davon oder ein kleinmoleküliges Toxin), oder ein radioaktives Isotop konjugiert ist (d. h. ein Radiokonjugat).
Chemotherapeutische Wirkstoffe, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden bereits obenstehend beschrieben. Enzymatisch aktive Proteintoxine und Fragmente davon, die eingesetzt werden können, umfassen die Diphtherie-A-Kette, nicht-bindende aktive Fragmente des Diphtherie-Toxins, Cholera-Toxin, Botulinus-Toxin, die Exotoxin-A-Kette (von Pseudomonas aeruginosa), die Ricin-A-Kette, die Abrin-A-Kette, die Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-Charantia-Hemmer, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Hemmer, Gelonin, Saporin, Mitgellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Kleinmolekülige Toxine umfassen beispielsweise Calicheamicine, Maytansinoide, Palytoxin und CC1065. Verschiedene Radionuklide stehen zur Herstellung radiokonjugierter Antikörper zur Verfügung. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate aus dem Antikörper und dem zytotoxischen Wirkstoff werden unter Einsatz verschiedener bifunktioneller Protein-Kopplungsmittel hergestellt, wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie z. B. Dimethyladipimidat HCL), aktive Ester (wie z. B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (wie z. B. Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z. B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivate (wie z. B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanate (wie z. B. Tolyen-2,6-diisocyanat) und Bis-aktive Fluorverbindungen (wie z. B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol). Ein Ricin-Immuntoxin kann beispielsweise wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. Kohlenstoff-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner für die Konjugation eines Radionucleotids an den Antikörper. Siehe WO 94/11026 .
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen ”Rezeptor” (wie z. B. Streptavidin) zur Verwendung zum Tumor-Prätargeting konjugiert werden, wobei das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung des ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Einsatz eines Klärungsmittels und der darauf folgenden Verabreichung eines ”Liganden” (z. B. Avidin), das an einen zytotoxischen Wirkstoff (z. B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
9. Immunliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z. B. die in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980), und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschriebenen Verfahren. Liposomen mit verbesserter Zirkulationszeit sind in US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung hergestellt werden, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) enthält. Liposomen werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu erhalten. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben über eine Disulfid-Austauschreaktion an die Liposomen konjugiert werden. Ein chemotherapeutischer Wirkstoff (wie z. B. Doxorubicin) ist gegebenenfalls in dem Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
10. Pharmazeutische Antikörper-Zusammensetzungen
Antikörper, die spezifisch an das hierin identifizierte PRO1122-Polypeptid sowie an andere, mittels der obenstehend offenbarten Screening-Tests identifizierte Moleküle binden, können in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung verschiedener Störungen verabreicht werden.
Wenn ein PRO1122-Polypeptid intrazellulär ist und ganze Antikörper als Hemmer eingesetzt werden, sind internalisierende Antikörper zu bevorzugen. Es können jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen eingesetzt werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment in die Zellen einzuführen. Wenn Antikörperfragmente eingesetzt werden, ist das kleinste hemmende Fragment, das spezifisch an die Bindungsdomäne des Zielproteins bindet, zu bevorzugen. Basierend auf den Sequenzen der variablen Region eines Antikörpers können beispielsweise Peptidmoleküle gestaltet werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Zielproteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Siehe z. B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als eine aktive Verbindung aufweisen, wie es für die bestimmte, zu behandelnde Erkrankung erforderlich ist, wobei die aktiven Verbindungen vorzugsweise komplementäre Aktivitäten aufweisen, die einander nicht beeinträchtigen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung einen Wirkstoff umfassen, der ihre Funktion verbessert, wie z. B. einen zytotoxischen Wirkstoff, Cytokine, einen chemotherapeutischen Wirkstoff oder einen wachstumshemmenden Wirkstoff. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind.
Die Wirkstoffe können auch eingeschlossen in Mikrokapseln beispielsweise durch Coazervations-Verfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielweise Hydroxymethylcellulose- oder Felatin-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Arzneimittelzufuhrsystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s. o., offenbart.
Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden sollen, müssen steril sein. Dies kann einfach durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen sichergestellt werden.
Es können Retard-Präparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formgegenständen vorliegen, z. B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere aus L-Glutaminsäure-γ-ethyl-L-glutamat, nicht abbaubarem Ethylenvinylacetat, abbaubaren Milchsäure-Glycolsäure-Copolymeren, wie z. B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)3-hydroxybuttersäure. Während Polymere, wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glycolsäure, die Freisetzung der Moleküle im Verlauf von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele die Proteine in einem kürzeren Zeitraum frei. Wenn eingekapselte Antikörper eine lange Zeit über im Körper bleiben, können sie aufgrund dessen, dass sie Feuchtigkeit bei 37°C ausgesetzt sind, denaturieren oder Aggregate bilden, wodurch es zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen Veränderungen in Bezug auf die Immunogenität kommt. Es können rationale Strategien zur Stabilisierung in Abhängigkeit von den beteiligten Mechanismen entwickelt werden. Wenn beispielsweise festgestellt wird, dass es sich bei dem Aggregationsmechanismus um die Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thiosulfidaustausch handelt, kann die Stabilisierung durch die Modifikation der Sulfhydryl-Reste, das Lyophilisieren aus sauren Lösungen, die Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts unter Einsatz von geeigneten Additiven und die Entwicklung spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen erfolgen.
G. Verwendungen für Anti-PRO1122-Antikörper
Die Anti-PRO1122-Antikörper der vorliegenden Erfindung können auf verschiedene Weise genutzt werden. Beispielsweise können die Anti-PRO1122-Antikörper in Diagnosetests für PRO1122-Polypeptide eingesetzt werden, z. B. zum Nachweis der Expression in bestimmten Zellen, Gewebe oder Serum. Verschiedene Diagnosetest-Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können eingesetzt werden, wie z. B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwicht-Tests und Immunfällungstests, die in heterogenen oder homogenen Phasen durchgeführt werden (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC Press, Inc. (1987)). Die in den Tests eingesetzten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare Gruppierung sollte in der Lage sein, direkt oder indirekt, ein nachweisbares Signal zu produzieren. Die nachweisbare Gruppierung kann ein Radioisotop, wie z. B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z. B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein. Ein beliebiges Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann zum Konjugieren des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung eingesetzt werden, umfassend die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981), und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschriebenen Verfahren.
Anti-PRO1122-Antikörper sind auch zur Affinitätsreinigung von PRO1122-Polypeptiden aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen ein PRO1122-Polypeptid auf einem geeigneten Träger, wie z. B. einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Einsatz von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, immobilisiert. Der immobilisierte Antirköper wird dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende PRO1122-Polypeptid enthält, wonach der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen wird, das im Wesentlichen alle Materialien in der Probe mit Ausnahme des PRO1122-Polypeptids, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das das PRO1122-Polypeptid von dem Antikörper löst.
H. PRO1122-Antagonisten/Agonisten
Diese Offenbarung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die das PRO1122-Polypeptid nachahmen (Agonisten) oder die Wirkung der PRO1122-Polypeptid hemmen (Antagonisten). Screening-Tests für mögliche Antagonisten-Arzneimittel sind so gestaltet, dass sie Verbindungen identifizieren, die an die PRO1122-Polypeptide, für die die hierin identifizierten Gene kodieren, binden oder Komplexe mit diesen bilden oder die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Proteinen auf andere Weise beeinflussen. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die für das Hochdurchsatzscreening von chemischen Bibliotheken geeignet sind, wodurch sie besonders zur Identifizierung der möglichen kleinmoleküligen Arzneimittel geeignet sind.
Die Tests können in verschiedenen Formaten durchgeführt werden, wie z. B. Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierende Tests, deren Merkmale auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Um für Antagonisten und/oder Agonisten der PRO1122-Signalübertragung zu screenen, wird das Testgemisch unter Bedingungen inkubiert, unter denen PRO1122, außer bei Gegenwart des möglichen pharmakologischen Wirkstoffs, die TNF-α-Freisetzung aus THP-1-Zellen mit einer Bezugsaktivität hervorruft. Alternativ dazu kann es sich bei der getesteten Aktivität um das Freisetzen von Stickstoffoxid (NO) und Proteoglykanen aus mit IL-17 und/oder IL-1α behandelten artikulären Knorpeln handeln.
In Bindungstests besteht die Wechselwirkung in der Bindung, und der gebildete Komplex kann isoliert oder im Reaktionsgemisch nachgewiesen werden. In einer speziellen Ausführungsform wird das PRO1122-Polypeptid, für das das hierin identifizierte Gen kodiert, oder das mögliche Arzneimittel auf einer Festphase, z. B. einer Mikrotiterplatte, mittels kovalenter oder nicht kovalenter Bindungen immobilisiert. Eine nicht kovalente Bindung wird im Allgemeinen dadurch hergestellt, dass die feste Oberfläche mit einer Lösung aus PRO1122-Polypeptid beschichtet und getrocknet wird. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z. B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende PRO1122-Polypeptid spezifisch ist, eingesetzt werden, um es an der festen Oberfläche zu verankern. Der Test erfolgt durch die Zugabe der nicht immobilisierten Komponente, die durch eine nachweisbare Markierung markiert sein kann, zu der immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein kann. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten, z. B. durch Waschen, entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe werden nachgewiesen. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung aufweist, deutet der Nachweis der auf der Oberfläche immobilisierten Markierung darauf hin, dass es zu einer Komplexbildung gekommen ist. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente keine Markierung aufweist, kann die Komplexbildung beispielsweise unter Einsatz eines markierten Antikörpers erfolgen, der spezifisch an den immobilisierten Komplex bindet.
Wenn die mögliche Verbindung mit einem bestimmten PRO1122-Polypeptid, für das ein hierin identifiziertes Gen kodiert, in Wechselwirkung tritt, aber nicht an dieses bindet, kann die Wechselwirkung mit diesem Polypeptid durch Verfahren getestet werden, die für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannt sind. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z. B. Vernetzen, Co-Immunfällung und Co-Reinigung unter Einsatz von Gradienten oder Chromatographiesäulen. Zusätzlich dazu können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Einsatz eines Gensystems auf Hefe-Basis, wie von Fields und Mitarbeitern beschrieben, überwacht werden (Fields und Song, Nature 240, 245–246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991), wie von Chevray und Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5791 (1991), offenbart). Viele Transkriptionsaktivatoren, wie z. B. Hefe-GAL4, bestehen aus zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei eine als DNA-Bindungsdomäne dient, während die andere als Transkriptionsaktivierungsdomäne funktioniert. Das in den zuvor genannten Publikationen beschriebene Hefe-Expressionssystem (im Allgemeinen als ”Zwei-Hybrid-System” bezeichnet) nutzt diese Eigenschaft und setzt zwei Hybridproteine ein, eines, in dem das Zielprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein anderes, in dem die möglichen aktivierenden Proteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression des GAL1-lacZ-Reportergens gesteuert durch einen GAL4-aktivierten Promotor hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die das wechselwirkende Polypeptid enthalten, werden mit dem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Einsatz des Zwei-Hybrid-Verfahrens ist im Handel von Clontech erhältlich. Dieses System kann auch erweitert werden, um die Proteindomänen zu kartieren, die an spezifischen Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, und Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen wesentlich sind, zu lokalisieren.
Verbindungen, die die Wechselwirkung eines Gens, das für ein hierin identifiziertes PRO1122-Polypeptid kodiert, und weiteren intra- oder extrazellulären Komponenten stört, können wie folgt getestet werden: Gewöhnlicherweise wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Genprodukt und die intra- oder extrazelluläre Komponente unter Bedingungen und über einen Zeitraum hinweg enthält, die die Wechselwirkung und die Bindung der beiden Produkte ermöglichen. Um die Fähigkeit einer vermutlichen Verbindung in Bezug auf die Bindungshemmung zu testen, erfolgt die Reaktion ohne die und in Gegenwart der Testverbindung. Zusätzlich dazu kann zu einem dritten Reaktionsgemisch ein Placebo zugesetzt werden, das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der in dem Gemisch vorhandenen intra- oder extrazellulären Komponente wird wie oben beschrieben überwacht. Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion/den Kontrollreaktionen, aber nicht in dem Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, deutet darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung zwischen der Testverbindung und ihrem Reaktionspartner beeinflusst.
Antagonisten können durch Kombination des PRO1122-Polypeptids und eines potentiellen Antagonisten mit membrangebundenen PRO1122-Polypeptid-Rezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen kompetitiven Inhibitionstest geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden. Das PRO1122-Polypeptid kann, z. B. durch Radioaktivität, markiert sein, so dass die Anzahl der PRO1122-Polypeptid-Moleküle, die an den Rezeptor gebunden sind, eingesetzt werden kann, um die Wirksamkeit des potentiellen Antagonisten zu bestimmen. Das Gen, das für den Rezeptor kodiert, kann durch verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise mittels Liganden-Panning und FACS-Sortierung, identifiziert werden. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1 (2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren eingesetzt, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf das PRO1122-Polypeptid reagiert, und eine aus dieser RNA hergestellte cDNA-Bibliothek wird in Pools aufgeteilt und eingesetzt, um COS-Zellen oder andere Zellen, die nicht COS-Zellen oder andere Zellen, die nicht auf PRO1122-Polypeptid reagieren, zu transfizieren. Die transfizierten Zellen, die auf den Glasträgern gezüchtet werden, werden markiertem PRO1122-Polypeptid ausgesetzt. Das PRO1122-Polypeptid kann durch verschiedene Mittel markiert sein, wie z. B. Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nach Fixierung und Inkubation werden die Träger einer autoradiographischen Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden hergestellt und erneut unter Einsatz eines interaktiven Sub-Pooling- und Screening-Verfahrens transfiziert, wodurch man schlussendlich einen einzigen Klon erhält, der für den vermutlichen Rezeptor kodiert.
Als alternativen Ansatz zur Rezeptor-Identifikation kann markiertes PRO1122-Polypeptid mit Zellmembranen oder Extraktpräparaten, die das Rezeptormolekül exprimieren, Photoaffinitäts-verbunden werden. Vernetztes Material wird mittels PAGE aufgelöst und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann abgetrennt werden, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzierung unterzogen werden. Die Aminosäuresequenz, die durch das Mikrosequenzieren erhalten wird, würde eingesetzt werden, um einen Satz degenerierter Oligonucleotid-Sonden für das Screenen einer cDNA-Bibliothek zur Identifizierung des Gens herzustellen, das für den vermutlichen Rezeptor kodiert.
In einem anderen Test für Antagonisten werden Säugetierzellen oder ein Membranpräparat, die den Rezeptor exprimieren, mit markiertem PRO1122-Polypeptid in Gegenwart der vermutlichen Verbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu fördern oder zu blockieren, könnte dann entfernt werden.
Spezifischere Beispiele potentieller Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das an die Fusionen von Immunglobulinen mit PRO1122-Polypeptid bindet, und insbesondere Antikörper, die ohne Einschränkung poly- und monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, einkettige Antikörper, anti-idiotypische Antikörper und chimäre oder humanisierte Formen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschliche Antikörper und Antikörperfragmente umfassen. Alternativ dazu kann es sich bei einem potentiellen Antagonisten um ein nahe verwandtes Protein handeln, beispielsweise um eine mutierte Form von PRO1122-Polypeptid, die den Rezeptor erkennt, aber keine Wirkung hat, wodurch die Wirkung von PRO1122-Polypeptid kompetitiv gehemmt wird. Die Erfindung beschränkt sich, wie in den Ansprüchen definiert, auf antagonistische Antikörper.
Eine weiterer potentieller PRO1122-Polypeptid-Antagonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Kosntrukt, das unter Einsatz eines Antisense-Verfahrens hergestellt wird, wobei z. B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch das Hybridisieren an Ziel-mRNA direkt blockiert und die Translation in Protein verhindert. Antisense-Verfahren können eingesetzt werden, um die Genexpression durch Tripelhelixbildung oder Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Der kodierende 5'-Abschnitt der Polynucleotidsequenz, die für reife PRO1122-Polypeptide hierin kodiert, wird beispielsweise eingesetzt, um eine Antisense-RNA-Oligonucleotidsequenz zu gestalten, die für die reifen PRO1122-Polypeptide hierin kodiert, und wiederum eingesetzt, um Antisense-RNA-Oligonucleotide mit einer Länge von 10 bis 40 Basenpaaren zu gestalten. Ein DNA-Oligonucleotid wird gestaltet, um in Bezug auf eine Region des an der Transkription beteiligten Gens komplementär zu sein (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch die Transkription und die Produktion von PRO1122-Polypeptid verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls zum PRO1122-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 546, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Florida (1988)). Die oben beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von PRO1122-Polypeptid zu hemmen. Wenn Antisense-DNA eingesetzt wird, sind Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsinitiationsstelle stammen, z. B. etwa zwischen den Positionen –10 und +10 der Zielgennucleotidsequenz, zu bevorzugen.
Potentielle Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die an die aktive Stelle, die Rezeptorbindungsstelle, die Wachstumsfaktorbindungsstelle oder andere bedeutende Bindungsstellen des PRO1122-Polypeptids binden, wodurch sie die normale biologische Aktivität von PRO1122-Polypeptid blockieren. Beispiele für kleine Moleküle umfassen kleine Peptide oder Peptid-ähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche Peptide, und synthetische organische oder anorganische Nicht-Peptidyl-Verbindungen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch Sequenz-spezifische Hybridisierung an komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen in einer potentiellen Ziel-RNA können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für weitere Details siehe z. B. Rossi, Current Biology 4, 469–471 (1994), und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelixanordnung, die zur Transkriptionshemmung eingesetzt werden, sollten einsträngig sein und aus Desoxynucleotiden bestehen. Die Grundzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so gestaltet, dass sie die Tripelhelix-Bildung über Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördern, die im Allgemeinen große Abschnitte Purine und Pyrimidine auf einem Duplexstrang erfordern. Für weitere Details siehe PCR-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , s. o.
I. Diagnostische Verwendungen
Eine weitere Verwendung der hierin offenbarten Verbindungen (z. B. PRO1122-Varianten und Anti-PRO1122-Antikörper), hierin beschrieben, besteht darin, dabei zu helfen zu diagnostizieren, ob eine Störung, bis zu einem gewissen Maß, durch PRO1122 modulierte Signalübertragung hervorgerufen wird.
Ein Diagnosetest zur Bestimmung, ob eine bestimmte Störung (z. B. eine degenerative Knorpelstörung) durch PRO1122-Signalübertragung hervorgerufen wird, kann unter Einsatz der folgenden Schritte durchgeführt werden: (1) Kultivieren von Testzellen oder -geweben, die PRO1122 exprimieren; (2) Verabreichen einer Verbindung, die die durch PRO1122 modulierte Signalübertragung hemmen kann, und (3) Messen der durch PRO1122 vermittelten phänotypischen Wirkung in den Testzellen. Die Schritte können unter Einsatz von Standardverfahren im Licht der vorliegenden Offenbarung durchgeführt werden. Standardverfahren können beispielsweise eingesetzt werden, um Zellen oder Gewebe zu isolieren und in vivo zu kultivieren.
Verbindungen mit einem verschiedenen Ausmaß an Selektivität sind für die Diagnose der Rolle von PRO1122 nützlich. Verbindungen, die PRO1122 zusätzlich zu einer anderen Form eines Adaptormoleküls aufweisen, können beispielsweise als anfängliche Testverbindungen eingesetzt werden, wenn eines oder mehrere Adaptormoleküle die Störung hervorrufen. Die selektiven Verbindungen können dann eingesetzt werden, um die mögliche Rolle anderer Adaptorproteine beim Auslösen der Störung weiter auszuschließen.
Testverbindungen sollten bei der Hemmung intrazellulärer Signalaktivität potenter sein als beim Ausüben einer zytotoxischen Wirkung (z. B. ein IC₅₀/LD₅₀ von mehr als 1). Der IC₅₀ und LD₅₀ können auch durch Standardverfahren gemessen werden, wie z. B. durch einen MTT-Test oder durch die Messung der Menge an freigesetzter LDH. Das Maß an IC₅₀/LD₅₀ einer Verbindung sollte bei der Bewertung des Diagnosetests berücksichtigt werden. Im Allgemeinen ist die Information umso relativer, je größer das Verhältnis ist. Geeignete Kontrollen berücksichtigen die mögliche zytotoxische Wirkung einer Verbindung, wie z. B. die Behandlung von Zellen, die nicht mit einer Zellproliferationsstörung in Zusammenhang stehen (z. B. Kontrollzellen), mit einer Testverbindung, wobei diese auch Teil eines Diagnosetests sein können. Die Diagnoseverfahren der vorliegenden Erfindung umfassen das Screening in Bezug auf Wirkstoffe, die die Wirkung von PRO1122 auf degenerative Knorpelstörungen modulieren. Beispielhafte Nachweisverfahren umfassen radioaktive Markierung und Immunfällung ( US-Patent Nr. 5.385.915 ).
Antikörper, umfassend Antikörperfragmente, können beispielsweise eingesetzt werden, um die Expression von Proteinen, für die die Gene kodieren, die mit der Erkrankung in Zusammenhang stehen, qualitativ und quantitativ nachzuweisen (”Marker-Gen-Produkte”). Der Antikörper ist vorzugsweise mit einer nachweisbaren, z. B. einer fluoreszierenden, Markierung versehen, und die Bindung kann durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren überwacht werden.
Der In-situ-Nachweis der Bindung von Antikörpern an die Marker-Gen-Produkte kann beispielsweise mittels Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie erfolgen. Zu diesem Zweck wird eine histologische Probe aus dem Patienten entfernt, ein markierter Antikörper wird auf diese angewandt, vorzugsweise indem der Antikörper auf einer biologischen Probe überschichtet wird. Dieses Verfahren ermöglicht auch die Bestimmung der Verteilung des Marker-Gen-Produkts in dem untersuchten Gewebe. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass eine Vielzahl an histologischen Verfahren für den In-situ-Nachweis zur Verfügung steht.
J. Pharmazeutische Zusammensetzungen
PRO1122 oder Antagonisten davon (z. B. Antikörper) sowie andere durch die zuvor hierin offenbarten Screening-Tests identifizierte Moleküle können als therapeutische Wirkstoffe eingesetzt werden. Solche therapeutischen Wirkstoffe werden gemäß bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch wirksamer Zusammensetzungen formuliert, wobei PRO1122, der Antagonist oder Agonist davon in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert wird.
Wenn das Protein, für das das amplifizierte Gen kodiert, intrazellulär ist und ganze Antikörper als Hemmer eingesetzt werden, sind im Fall von PRO1122-Antagonisten-Antikörpern internalisierende Antikörper zu bevorzugen. Lipofektionen oder Liposomen können jedoch auch zur Zufuhr des Antikörpers oder eines Antikörperfragments in Zellen eingesetzt werden. Wenn Antikörperfragmente eingesetzt werden, ist das kleinste hemmende Element, das spezifisch an die Bindungsdomäne des Zielproteins bindet, zu bevorzugen. Basierend auf den Sequenzen der variablen Region eines Antikörpers können beispielsweise Peptidmoleküle gestaltet werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Zielproteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert werden und/oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z. B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993)).
Therapeutische Formulierungen werden zur Lagerung hergestellt, indem der Wirkstoff, der einen gewünschten Reinheitsgrad aufweist, mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen gemischt wird (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)). Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für den Rezipienten nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidationsmittel, wie z. B. Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z. B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid; Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z. B. Methyl- oder Propylparaben; Catechin; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol und m-Cresol); niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als 10 Resten); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zucker, wie z. B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; Metallkomplexe (z. B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nicht-ionische Tenside, wie z. B. TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, wie für die spezielle Erkrankung, die behandelt werden soll, erforderlich ist, wobei die aktiven Verbindungen vorzugsweise komplementäre Aktivitäten aufweisen, die einander nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung einen zytotoxischen Wirkstoff, ein Cytokin oder einen wachstumshemmenden Wirkstoff umfassen. Solche Moleküle sind auf geeignete Weise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den gewünschten Zweck wirksam sind.
Die Wirkstoffe können auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisierung hergestellt werden, wie z. B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Arzneimittelzufuhrsystemen (z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung eingesetzt werden sollen, müssen steril sein. Das kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erzielt werden.
Therapeutische Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einem Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung platziert, beispielsweise einem Beutel mit einer intravenösen Lösung oder einer Phiole mit einem Verschluss, der mit einer hypodermalen Injektionsnadel durchstochen werden kann.
Es können Retard-Präparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formgegenständen vorliegen, z. B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere aus L-Glutaminsäure- und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubarem Ethylenvinylacetat, abbaubaren Milchsäure-Glycolsäure-Copolymeren, wie z. B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)3-hydroxybuttersäure. Die Mikroverkapselung von rekombinanten Proteinen für kontrollierte Freisetzung wurde erfolgreich mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon-(rhlFN-), Interleukin-2 und MN rpg 120 durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, ”Design and Production fo Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”, in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, 439–462, Powell und Newman (Hrsg.), Penum Press, New York (1995); WO 97103692 ; WO 96/40072 ; WO 96/07399 und US-Patent Nr. 5.654.010 .
Die Retard-Formulierungen dieser Proteine können unter Einsatz von Polymilch-co-glykolsäure-(PLGA-)Polymer aufgrund dessen Bioverträglichkeit und weitreichender bioabbaubarer Eigenschaften hergestellt werden. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäure können im menschlichen Körper schnell gereinigt werden. Außerdem kann die Abbaubarkeit dieses Polymers im Bereich von Monaten bis Jahren in Abhängigkeit von seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung angepasst werden. Lewis, ”Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”, in: Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, 1–41, M. Chasin und R. Langer (Hrsg.), Marcel Dekker, New York (1990).
Während Polymere, wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen über einen Zeitraum von 100 Tagen hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine innerhalb eines kürzeren Zeitraums frei. Wenn die verkapselten Antikörper über lange Zeit hinweg im Körper bleiben, kann es aufgrund dessen, dass sie Feuchtigkeit bei 37°C ausgesetzt sind, dazu kommen, dass sie denaturieren oder aggregieren, wodurch es zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen Veränderungen in Bezug auf die Immunogenität kommt. Es können in Abhängigkeit von dem beteiligten Mechanismus rationale Strategien zur Stabilisierung entwickelt werden. Wenn beispielsweise festgestellt wird, dass es sich bei dem Aggregationsmechanismus um die Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thiosulfidaustausch handelt, kann die Stabilisierung durch die Modifikation der Sulfhydryl-Reste, das Lyophilisieren aus sauren Lösungen, die Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts unter Einsatz von geeigneten Additiven und die Entwicklung spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen erfolgen.
K. Behandlungsverfahren
Es wird in Betracht gezogen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden können, wie z. B. für die Erkrankungen, die durch eine Überexpression und/oder Aktivierung der hierin identifizierten, mit einer Erkrankung assoziierten Gene gekennzeichnet sind. Die Erfindung stellt ähnliche Verwendungen für PRO1122-Antagonisten sowie Antagonisten zur Verwendung in solchen Verfahren, wie in den Ansprüchen beschrieben, bereit. Beispielhafte Erkrankungen oder Störungen, die mit solchen Antikörpern umfassen degenerative Knorpelerkrankungen, einschließlich Entzündungs- und Immunerkrankungen, die durch den Abbau der Knorpelmatrix gekennzeichnet sind, wie z. B. Arthritis (z. B. Osteoarthritis, Arthritis psoriatica, rheumatische Arthritis).
Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, z. B. Antikörper, werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, gemäß den bekannten Verfahren verabreicht, wie z. B. mittels intravenöser Verabreichung als Bolus oder kontinuierlicher Infusion über einen bestimmten Zeitraum hinweg, intramuskulär, intraperitoneal, intracerebral, intracerobrospinal, subkutan, intraartikulär, intrasynovial, intrathekal, intraokkular, intraläsional, oral, topisch, mittels Inhalation oder durch kontrollierte Freisetzung.
Weitere Therapieschemata können mit der Verabreichung der antagonistischen Antikörper der vorliegenden Erfindung kombiniert werden.
Zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen hängt die geeignete Dosierung eines Wirkstoffs (z. B. eines Antikörpers) von der Art der zu behandelnden Erkrankung, wie oben definiert, der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, vorhergehenden Therapien, der Krankengeschichte des Patienten und dessen Reaktion auf den Wirkstoff sowie davon ab, ob der Wirkstoff zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, und liegt im Ermessen des behandelnden Arztes. Der Wirkstoff wird dem Patienten auf geeignete Weise ein Mal oder in einer Reihe von Behandlungen verabreicht.
Die Dosierung und die gewünschte Arzneimittelkonzentration der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit von der speziellen angedachten Verwendung variieren. Die Bestimmung der geeigneten Dosierung oder des Verabreichungswegs gehört zu den Fähigkeiten von Fachleuten auf dem Gebiet. Tierversuche stellen eine verlässliche Orientierung zur Bestimmung der wirksamen Dosierung für die Therapie bei Menschen bereit. Die Interspezies-Skalierung wirksamer Dosierungen kann gemäß den durch J. Mordenti und W. Chappell, ”The Use of Interspecies Scaling in Toxiokinetics”, in: Toxiokinetics and New Drug Development, 42–46, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York (1989), dargelegten Grundsätzen erfolgen.
Wenn In-vivo-Verabreichung eines PRO1122-Polypeptids oder Agonisten oder Antagonisten davon eingesetzt wird, können normale Dosierungsmengen im Bereich von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag liegen, vorzugsweise etwa 1 μg/kg/Tag bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag, abhängig vom Verabreichungsweg. Orientierung in Bezug auf die speziellen Dosierungen und Zufuhrverfahren wird in der Literatur bereitgestellt; siehe z. B. US-Patente Nr. 4.567.760 , 5.206.344 oder 5.255.212 . Es ist Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene Behandlungsverbindungen und verschiedene Störungen wirksam sind, so dass die Verabreichung, die auf ein Organ oder Gewebe abzielt, beispielsweise die Zufuhr auf einem anderen Weg erfordern kann als die Zufuhr zu einem anderen Organ oder Gewebe. Außerdem können die Dosierungen durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden. Bei wiederholter Verabreichung über mehrere Tage hinweg oder länger, abhängig von der Erkrankung, wird die Behandlung fortgesetzt, bis die gewünschte Unterdrückung der Erkrankungssymptome eintritt. Es können jedoch auch andere Dosierungschemata wirksam sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht durch herkömmliche Verfahren und Tests überwacht werden.
L. Fabrikate
Es kann ein Fabrikat bereitgestellt werden, das Materialien enthält, die für die Diagnose und Behandlung der oben beschriebenen Störungen wirksam sind. Das Fabrikat umfasst einen Behälter und eine Markierung. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus verschiedenen Materialien, wie z. B. Glas oder Kunststoff, bestehen. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Beahndlung der Erkrankung wirksam ist, und kann eine sterile Zugangsöffnung aufweisen (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel mit einer intravenösen Lösung oder eine Phiole mit einem Verschluss sein, der mit einer Nadel zur subkutanen Injektion durchstochen werden kann). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist typischerweise ein PRO1122-Polypeptid, ein Antagonist oder ein Agonist davon. Die Markierung auf oder in Verbindung mit dem Behälter weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung der jeweiligen Erkrankung eingesetzt wird. Das Fabrikat kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z. B. Phosphat-gepufferte Salzlösung, Ringersche Lösung und Dextroselösung, umfasst. Er kann weiters andere Materialien umfassen, die aus kommerzieller Hinsicht oder aus Sicht des Anwenders wünschenswert sind, wie z. B. weitere Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anwendungshinweisen.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, wenn nicht anders angegeben, gemäß den Herstellerhinweisen eingesetzt. Die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ist die Quelle der in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung identifizierten, mit ATCC-Zugriffsnummern bezeichneten Zellen.
Beispiel 1 nach dem Stand der Technik: Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO1031 kodieren
Die extrazellulären Domänen-(ECD-)Sequenzen (umfassend das Sekretionssignal, falls vorhanden) von etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen von der öffentlichen Swiss-Prot-Proteindatenbank wurden eingesetzt, um exprimierte Sequenzmarkierungs-(EST-)Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche EST-Datenbanken (GenBank, Merck/Wash U.) und eine private EST-DNA-Datenbank (LIFESEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Kalifornien). Die Suche erfolgte unter Einsatz des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenz. Diese Vergleiche, die ein BLAST-Ergebnis von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder mehr erbrachten und nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden mit dem Programm ”phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) in Consensus-DNA-Sequenzen geclustert und angeordnet.
Ein anfängliches virtuelles Sequenzfragment (Consensus-Anordnung) wurde unter Verwendung von phrap relativ zu anderen EST-Sequenzen assembliert. Die anfängliche Consensus-DNA-Sequenz wurde unter Einsatz wiederholter BLAST- und phrap-Zyklen verlängert, um die Consensus-Sequenz so wett wie möglich unter Einsatz der oben genannten EST-Sequenzquellen zu verlängern. Das Ergebnis dieser Anordnung wird in 5 (Seq.-ID Nr. 5) dargestellt und wird auch als DNA47332 bezeichnet.
Eine Sequenz, die die Consensus-Anordnung umfasst, W74558 (Klon 344649) (Seq.-ID Nr. 6), wurde weiterführend untersucht. Die Sequenz wurde vom IMAGE-Konsortium erhalten und analysiert. Lennon et al., Genomics 33, 151 (1996). DNA-Sequenzieren ergab die DNA-Sequenz voller Länge von PRO1031 (hierin als DNA-59294-1381 bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 2) und die abgeleitete PRO1031-Proteinsequenz (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1).
Die voltständige Nucleotidsequenz von DNA59294-1381 ist in 2 dargestellt (Seq.-ID Nr. 2). Klon DNA59294-1381 enthält einen einzigen offenen Leserater mit einer offensichtlichen Translationinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 42–44 und endet am Stopp-Codon an den Nucleotidpositionen 582–584 (2) (Seq.-ID Nr. 2). Der vorhergesagte Polypeptid-Vorläufer ist 180 Aminosäuren lang (1) (Seq.-ID Nr. 1). Das PRO1031-(UNQ516-)Protein voller Länge, das in 2 (Seq.-ID Nr. 2) dargestellt ist, weist ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 20437 und einen pl von etwa 9,58 auf. Klon DNA59294-1381 (Seq.-ID Nr. 2) wurde bei der ATCC hinterlegt und hat die Zugriffsnummer 209866 zugeordnet bekommen. Wenn Sequenzierunregelmäßigkeiten oder Fehler in den hierin bereitgestellten Sequenzen auftreten, ist klar, dass der hinterlegte Klon die korrekte Sequenz für DNA59624 (Seq.-ID Nr. 2) enthält. Außerdem sind die hierin bereitgestellten Sequenzen das Ergebnis bekannter Sequenzierungsverfahren.
Die Analyse der Aminosäuresequenz des PRO1031-Polypeptids voller Länge (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) deutet darauf hin, dass es sich um ein neues Cytokin handelt.
Eine weitere Analyse der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 zeigt, dass sich das vermutliche Signalpeptid etwa bei den Aminosäuren 1–20 von Seq.-ID Nr. 2 befindet. Eine N-Glykosylierungsstelle befindet sich etwa bei den Aminosäuren 75–78 von Seq.-ID Nr. 2. Eine Region, die Sequenzidentität mit IL-17 aufweist, befindet sich etwa bei den Aminosäuren 96–180. Die entsprechenden Nucleotide können anhand der hierin bereitgestellten Sequenzen routinemäßig bestimmt werden.
BEISPIEL 1: Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO1122 kodieren.
Eine exprimierte Sequenzmarkierungs-(EST-)DNA-Datenbank (LIFESEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Kalifornien) wurde durchsucht, und eine EST wurde identifiziert. Dabei handelte es sich um Incyte 1347523 (Seq.-ID Nr. 7), die auch als DNA49665 bezeichnet wird. Basierend auf DNA49665 (Seq.-ID Nr. 7) wurden Oligonucleotide synthetisiert: 1) zur Identifikation einer cDNA-Bibliothek, die die Sequenz von Interesse enthielt, mittels PCR und 2) zur Verwendung als Sonden zur Isolation eines Klons der für PRO1122-kodierenden Sequenz voller Länge (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)).
Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer umfassen im Allgemeinen 20 bis 30 Nucleotide und sind oft so gestaltet, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100–1000 bp liefern. Die Sondensequenzen sind typischerweise 40–55 bp lang. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensus-Sequenz mehr als 1–1,5 kpb aufweist. Um verschiedene Bibliotheken in Bezug auf einen Klon voller Länge zu screenen, wurde die DNA von den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation, nach Ausuble et al., Current Protocols in Molecular Biology, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um unter Einsatz des Sondenoligonucleotids und eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
PCR-Primer (Vorwärts-, Rückwärts- und Hybridisierungs-) wurden synthetisiert:
Um verschiedene Bibliotheken in Bezug auf eine Quelle eines Klons voller Länge zu screenen, wurde DNA von den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation mit dem oben identifizierten PCR-Primerpaar gescreent. Dann wurde eine positive Bibliothek verwendet, um unter Einsatz der Oligonucleotidsonde und einem der PCR-Primer Klone zu isolieren, die für das PRO1122-Gen kodieren.
RNA zur Herstellung der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem fötalem Nierengewebe isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die zur Isolation der cDNA-Klone eingesetzt wurden, wurden unter Einsatz von Standardverfahren und im Handel erhältlichen Reagenzien, wie z. B. jenen von Invitrogen, San Diego, Kalifornien, erstellt. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem Blunt-Ende an SalI-hemikinasierte Adaptoren gebunden, mit NotI gespalten, durch Gelelektrophorese angemessen klassiert und in einer definierten Orientierung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie z. B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die Sfil-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et a1., Science 235, 1278–1280 (1991)) an den einzigen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
DNA-Sequenzieren der wie oben beschrieben isolierten Klone ergab eine DNA-Sequenz voller Länge für PRO1122 (hierin als DNA62377-1381-1 bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 4) und die abgeleitete Protein-PRO1122-Sequenz (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3).
Die vollständige Nucleotid-Sequenz von DNA62377-1381-1 (Seq.-ID Nr. 4) ist in 4A–4B (Seq.-ID Nr. 4) dargestellt. Klon DNA62377-1381-1 (Seq.-ID Nr. 4) enthält einen einzigen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 50–52 und einem Ende am Stopp-Codon an den Nucleotidpositionen 641–643 von Seq.-ID Nr. 4 (4A–4B). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 197 Aminosäuren lang (3) (Seq.-ID Nr. 3). Das PRO1122-Protein voller Länge in 3 (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) weist schätzungsweise ein Molekulargewicht von etwa 21765 Dalton und einen pI von etwa 8,53 auf. Klon DNA62377-1381-1 wurde am 22. Dezemter 1998 bei der ATCC hinterlegt und hat die Zugriffsnummer 203552 zugeordnet bekommen. Es ist klar, dass im Falle einer Sequenzirregularität oder eines Fehlers in den hierin bereitgestellten Sequenzen die hinterlegte Sequenz die korrekte Sequenz ist. Außerdem sind alle hierin bereitgestellten Sequenzen das Ergebnis bekannter Sequenzierungsverfahren.
Die Analyse der Aminosäuresequenz von isoliertem PRO1122 (UNQ561) voller Länge deutet darauf hin, dass dieses Ähnlichkeit mit IL-17 aufweist, was darauf hinweist, dass PRO1122 (UNQ561) ein neues Cytokin sein kann. 3 (Seq.-ID Nr. 3) zeigt auch die ungefähren Stellen, an denen sich die Signalpeptide, die Leucin-Zipper-Struktur und eine Region mit Sequenzidentität mit IL-17 befinden. Die entsprechenden Nucleotide können routinemäßig z. B. unter Bezugnahme auf 4A–4B bestimmt werden.
BEISPIEL 2: Verwendung von für PRO1122 kodierender DNA als Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz, die für PRO1122 kodiert, als Hybridisierungssonde.
DNA, die die Kodiersequenz für PRO1122 voller Länge (wie in 4 dargestellt, Seq.-ID Nr. 4) oder ein Fragment davon umfasst, wird als Sonde für das Screenen in Bezug auf homologe DNA (wie z. B. die, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO1122 in menschlichen Gewebe-cDNA-Bibiotheken oder menschlichen Gewebe-Genombibliotheken kodieren) eingesetzt.
Das Hybridisierung und Waschen von Filtern, die DNA aus einer der Bibliotheken enthalten, erfolgt unter folgenden hochstringenten Bedingungen. Hybridisierung von radioaktiv markierten, von PRO1122-Polypeptid abgeleiteten Sonden an die Filter erfolgt 20 h lang in einer Lösung aus 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardtscher Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C. Das Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen Lösung aus 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C.
DNA mit der erwünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für das Nativsequenz-PRO1122-Polypeptid voller Länge kodiert, kann dann unter Einsatz von Standardverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
BEISPIEL 3: Expression von PRO1122-Polypeptiden in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von unglykosylierten Formen von PRO1122-Polypeptiden durch rekombinante Expression in E. coli.
Die DNA-Sequenz, die für PRO1122 voller Länge oder ein Fragment oder eine Variante davon kodiert, wird zunächst unter Einsatz von ausgewählten PCR-Primern amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen an dem ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Verschiedene Expressionsvektoren können eingesetzt werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit dem Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die mit PCR amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotika-Resistenz-Gen kodieren, einen trp-Promotor, einen Poly-His-Leader (umfassend die ersten 6 STII-Codons, eine Poly-His-Sequenz und eine Enterokinasespaltungsstelle), die für PRO1122 kodierende Region, λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird dann eingesetzt, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Einsatz der in Sambrook et al., s. o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, wonach Antibiotika-Resistenz-Kolonien ausgewählt werden. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
Ausgewählte Klone können über Nacht in einem flüssigen Nährmedium, wie z. B. mit Antibiotika ergänzter LB-Kulturlösung, gezüchtet werden. Die Über-Nacht-Kulturkann in der Folge eingesetzt werden um eine Kultur größeren Maßstabs zu inokulieren. Die Zellen werden dann zu einer gewünschten optischen Dichte gezüchtet, wobei währenddessen der Expressionspromotor angeschaltet ist.
Nach dem Kultivieren der Zellen für mehrere weitere Stunden können die Zellen durch Zentrifugieren geerntet werden. Das durch Zentrifugieren erhaltene Zellpellet kann unter Einsatz verschiedener Mittel, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO1122-Polypeptid kann dann unter Einsatz einer Metallchelatsäule unter Bedingungen gereinigt werden, die eine enge Bindung des Polypeptids ermöglichen.
BEISPIEL 4: Expression von PRO1122-Polypeptiden in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von glykosylierten Formen von PRO1122-Polypeptiden durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Faktultativ wird die für PRO1122 kodierende DNA unter Einsatz von Ligationsverfahren, wie den in Sambrook et al., s. o., beschriebenen, mit ausgewählten Restriktionsenzymen in pRK5 ligiert, um die Insertion von für PRO1122 kodierender DNA zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO1122 bezeichnet.
In einer Ausführungsform kann es sich bei den ausgewählten Wirtszellen um 293-Zellen handeln. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden in Gewebekulturplatten in einem Medium, wie z. B. mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika ergänztem DMEM, zu Konfluenz gezüchtot. Etwa 10 μg pRK5-PRO1122-DNA wird mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)) kodiert, gemischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ gelöst. Zu diesem Gemisch werden 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugetropft, und die Bildung von Niederschlag wird 10 min lang bei 25°C ermöglicht. Der Niederschlag wird dann suspendiert und zu den 293-Zellen zugesetzt und kann sich dann etwa 4 h lang bei 37°C absetzen. Das Nährmedium wird abgesaugt, und 2 ml 20%iges Glycerin in PBS wird 30 s lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
Etwa 24 h nach den Transfektionen wird das Nährmedium entfernt und durch Nährmedium (allein) oder Nährmedium, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer 12-stündigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem Rotationsfilter konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet werden und für eine bestimmte Dauer einem Film ausgesetzt werden, um das Vorhandensein von PRO1122-Po1ypeptid zu zeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiter inkubiert werden (in serumfreiem Medium), und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
Bei einem alternativen Verfahren kann für PRO1122 kodierende DNA vorübergehend in 293-Zellen eingeführt werden, indem das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschriebene Dextransulfat-Verfahren eingesetzt wird. 293-Zellen werden in einer Spinnerflasche zu maximaler Dichte gezüchtet, und 700 μg pRK5-PRO1122-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zunächst aus der Spinnerflasche mittels Zentrifugieren konzentriert und mit PBS gewaschen. Der DNA-Dextran-Niederschlag wird auf dem Zellpellet 4 h lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin 90 s lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Spinnerflasche gefüllt, die Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält. Nach etwa 4 Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und zur Entfernung von Zellen und Zellbruchstücken filtriert. Die Probe, die exprimiertes PRO1122-Polypeptid enthält, kann dann durch ein beliebig ausgewähltes Verfahren, wie z. B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann das PRO1122-Polypeptid in CHO-Zellen exprimiert werden. Der pRK5-PRO1122-Vektor kann in CHO-Zellen unter Einsatz von bekannten Reagenzien, wie z. B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran, transfiziert werden.
Wie oben beschrieben können die Zellkulturen inkubiert werden und das Medium durch Nährmedium (allein) oder ein Medium ersetzt werden, das radioaktive Markierungen, wie z. B. ³⁵S-Methionin, enthält. Nach Bestimmung des Vorhandenseins von PRO1122-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, wonach das konditionierte Medium geerntet wird. Das Medium, das exprimiertes PRO1122-Polypeptid enthält, kann dann durch ein beliebig ausgewähltes Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
Epitop-markiertes PRO1122-Polypeptid kann auch in CHO-Wirtszellen exprimiert werden. Die für PRO1122 kodierende DNA kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um im Raster mit einer ausgewählten Epitop-Markierung, wie z. B. einer Poly-His-Markierung, in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das Poly-His-markierte, für PRO1122 kodierende DNA-Insert kann dann in einen SV40-gesteuerten Vektor, der einen Selektionsmarker, wie z. B. DHFR, zur Auswahl von stabilen Klonen enthält, subkloniert werden. Schließlich können die CHO-Zellen mit dem SV40-gesteuerten Vektor (wie oben beschrieben) transfiziert werden. Es kann eine Markierung durchgeführt werden, wie oben beschrieben, um die Expression zu verifizieren. Das Kulturmedium, das das exprimierte Poly-His-markierte PRO1122-Polypeptid enthält, kann dann durch ein beliebig ausgewähltes Verfahren, wie z. B. Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
BEISPIEL 5: Expression eines PRO1122-Polypeptids in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO1122-Polypeptiden in Hefe.
Zunächst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO1122-Polypeptid aus dem ADH2/GAPDH-Promotor hergestellt. DNA, die für das PRO1122-Polypeptid von Interesse, ein ausgewähltes Signalpeptid und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen in dem ausgewählten Plasmid zur Steuerung der intrazellulären Expression des PRO1122-Polypeptids insertiert. Zur Sekretion kann die DNA, die für das PRO1122-Polypeptid kodiert, in das ausgewählte Plasmid, gemeinsam mit der für den ADH2/GAPDH-Promotor kodierenden DNA, der Hefe-α-Faktor-Sektetionssignal-/Leader-Sequenz und (bei Bedarf) Linker-Sequenzen, zur Expression des PRO1122-Polypeptids kloniert werden.
Hefezellen, wie z. B. Hefestamm AB110, können durch das oben beschriebene Expressionsplasmid transformiert und in ausgewählten Fermentationsmedien kultiviert werden. Die transformierten Hefeüberstände können durch Ausfällung mit 10% Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff analysiert werden.
Rekombinantes PRO1122-Polypeptid kann in der Folge isoliert werden und durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium mittels Zentrifugieren und anschließendes Konzentrieren des Mediums unter Einsatz von ausgewählten Patronenfiltern gereinigt werden. Das Konzentrat, das das PRO1122-Polypeptid enthält, kann unter Einsatz ausgewählter Säulenchromatographie-Harze weiter gereinigt werden.
BEISPIEL 6: Expression von PRO1122-Polypeptiden in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO1122-Polypeptiden in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
Die für PRO1122 kodierende DNA wird stromauf einer Epitop-Markierung fusioniert, die Teil eines Baculovirus-Expressionsvektors ist. Solche Epitop-Markierungen umfassen Poly-His-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie z. B. Fc-Regionen von IgG). Verschiedene Plasmide können eingesetzt werden, wie z. B. Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z. B. pVL1393 (Novagen), stammen. Kurz gesagt wird die für PRO1122 kodierende DNA oder der gewünschte Teil der für PRO1122 kodierenden DNA (wie z. B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die in Bezug auf die 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann (ausgewählte) flankierende Restriktionsenzymstellen aufweisen. Das Produkt wird dann mit den ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch das Co-Transfizieren des oben genannten Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda(”Sf9”-)Zellen (ATCC CRL 1711) unter Einsatz von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach 4- bis 5-tägiger Inkubation bei 28°C wurden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen eingesetzt. Virusinfektion und Proteinexpression erfolgen wie von O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, Oxford (1994), beschrieben.
Exprimiertes Poly-His-markiertes PRO1122-Polypeptid kann dann beispielsweise durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten Virus-infizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben hergestellt. Kurz gesagt werden Sf9-Zellen gewaschen, erneut in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10% Glycerin; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) suspendiert und zwei Mal 20 s lang auf Eis beschallt. Die beschallten Präparate werden durch Zentrifugieren gereinigt, und der Überstand wird 50fach in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarose-Säule (im Handel von Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Das filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird mit Ladepuffer auf A₂₈₀-Basislive gewaschen, wobei an diesem Punkt das Sammeln der Fraktionen beginnt. Dann wird die Säule mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht-spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach erneutem Erreichen der A₂₈₀-Basislive wird die Säule mit einem Imidazol-Gradienten von 0 bis 500 mM in dem zweiten Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärben oder Western-Blotting mit an alkalische Phosphatase konjugiertem Ni²⁺-NTA (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die das eluierte His₁₀-markierte PRO1122-Polypeptid enthalten, werden gepoolt und gegen Ladepuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO1122-Polypeptids unter Einsatz bekannter Chromatographieverfahren, wie z. B. Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, erfolgen.
BEISPIEL 7: Herstellung von Antikörpern, die PRO1122-Polypeptide binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an PRO1122-Polypeptide binden können.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s. o., beschrieben. Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigtes PRO1122-Polypeptid, Fusionsproteine, die ein PRO1122-Polypeptid enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO1122-Polypeptid auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens kann durch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren erfolgen.
Mäuse, wie z. B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freundschem Adjuvans emulgierten PRO1122-Immunogen, das subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1–100 μg injiziert wird, immunisiert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfotenballen der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem, in dem ausgewählten Adjuvans emulgiertem Immunogen geboostet. Danach können die Mäuse mehrere Wochen lang mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben der Mäuse können regelmäßig durch retro-orbitale Blutabnahmen für ELISA-Tests zum Nachweis von Anti-PRO1122-Polypeptid-Antikörpern erhalten werden.
Nach Nachweis eines geeigneten Antikörper-Titers kann den in Bezug auf Antikörper ”positiven” Tieren eine letzte intravenöse Injektion des PRO1122-Polypeptids injiziert werden. 3 bis 4 Tage später werden die Mäuse getötet, und die Milzzellen werden geerntet. Die Milzzellen werden dann (unter Einsatz von 35% Polyethylenglykol) an eine ausgewählte Mausmyelomzelllinie, wie z. B. P3X63AgU.1, erhältlich von ATCC, Nr. CRL 1597, fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, die HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin)Medium enthalten, zur Hemmung der Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellenhybriden ausplattiert.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA-Test in Bezug auf Reaktivität gegenüber PRO1122-Polypeptid gescreent. Die Bestimmung ”positiver” Hybridomzellen, die die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen ein PRO1122-Polypeptid sekretieren, ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngene Balb/c-Mäuse zur Herstellung von monoklonale Anti-PRO1122-Polypeptid-Antikörper aufweisendem Aszites injiziert werden. Alterantiv dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollerflaschen kultiviert werden. Die Reinigung der in dem Aszites produzierten monoklonalen Antikörper können unter Einsatz von Ammoniumsulfat-Ausfällung gefolgt von Gelausschlusschromatographie erfolgen. Alternativ dazu kann eine Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung des Antikörpers an Protein A oder Protein G eingesetzt werden.
BEISPIEL 8: RNA-Expression
Mehrfach-Gewebe-Blots, die Poly-K-RNA (2 μg pro Spur) aus verschiedenen menschlichen Geweben enthielten, wurden von Clontech (Palo Alto, Kalifornien) bezogen. Die vollständigen CKdierregionen von menschlichem IL-17B (UNQ516) (700 bp) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (1,1 kbp) (Seq.-ID Nr. 18) wurden als Hybridisierungssonden eingesetzt. DNA-Sonden wurden mit [α-³²P]-dCTP durch zufälliges Primen von DNA-Markierungsperlen (Pharmacia Biotech) markiert. Die Hybridisierung erfolgte unter Einsatz von Expresshyb (Clontech), das die radioaktiv markierten Sonden enthielt, 1 h lang bei 68°C. Die Blots wurden dann mit 2 × SSC/0,05% SDS-Lösung bei Raumtemperatur 40 min lang gewaschen, gefolgt von Waschen in 0,1 × SSC/0,05% SDS-Lösung 40 min lang bei 55°C mit einem Austausch durch frische Lösung. Die Blots wurden in einem Phosphor-Bildgeber entwickelt, und das resultierende Bild wurde dann als 8 hierin aufgenommen.
Für IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) wurde ein 800-bp-mRNA-Transkript in Bauchspeicheldrüse, Dünndarm und Magen von adultem menschlichem Gewebe gefunden; eine schwächere Bande wurde in den Hoden nachgewiesen (8). IL-17C- (Seq.-ID Nr. 2) Expression wurde in denselben adulten menschlichen Geweben untersucht, wobei jedoch keine nachweisbaren Signale beobachtet wurden.
Beispiel 9: Erzeugung von Fc/His-Fusionsproteinen
Die Kodiersequenzen von IL-17B (Seq.-ID Nr. 17) und IL-17C (Seq.-ID Nr. 18) wurden mittels PCR amplifiziert und in die EcoRI- und SmaI-Stellen von pBPH.His.c zur Erzeugung einer C-terminalen GHHHHHHHH-Markierung (Seq.-ID Nr. 19) oder die EcoRI- und Stu-Stellen von pBPH.IgG zur Erzeugung einer C-terminalen Fusion mit der Fc-Region von menschlichem IgG1 subkloniert. Die Vektoren pBPH.His.c und pBPH.IgG sind Derivate des Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen). Ein Fc- oder His-markiertes Kontrollprotein wurde auf ähnliche Weise durch die C-terminale Verbindung von Pancreatitis-assoziiertem Protein (175 Aminosäuren) an den Fc-Anteil von menschlichem IgG1 oder eine His8-Markierung hergestellt.
Die Fusionsproteine wurden in H5-Zellen unter Einsatz des durch den Hersteller empfohlenen Verfahrens (Invitrogen) exprimiert. Kurz gesagt wurden die DNA-Konstrukte mit BaculoGold-Baculovirus-DNA (Pharmingen) in einem 7:1 Verhältnis in adhärente Sf9-Zellen co-transfiziert. Die Zellen wurden 4 Tage lang bei 28°C inkubiert, und der Überstand wurde geerntet. Der Transfektionsüberstand wurde amplifiziert und durch Protein-A-Sepharose-Perlen (Pharmacia) für Fc-Fusionsproteine oder Ni-NTA-Agaroseperlen (QIAGEN) für His-markierte Proteine einer Affinitätsreinigung unterzogen.
Um die Proteinexpression zu untersuchen, wurde eine SDS-PAGE-Analyse der affinitätsgereinigten rekombinanten Proteine unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen gefolgt von Silberfärben durchgeführt.
Beispiel 10: Induktion von IL-6- und TNF-α-Freisetzung
Unter Einsatz des in Yao et al., J. Immunol. 155, 5483 (1995) (Yao-2), für IL-6-(Seq.-ID Nr. 14)Freisetzung beschriebenen Verfahrens wurden menschliche Vorhautfibroblastenzellen (ATCC CRL-2091) in MEM-Medien (10% FBS) mit dem Testcytokin kultiviert. Nach 18-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurden die konditionierten Medien in Bezug auf IL-6 unter Einsatz eines ELISA-Sets (R&D Systems) getestet. Zur TN F-α-Sekretion wurden menschliche Leukämie-Monozyten-THP-1-Zellen in RPMI-Medien (10% FBS) mit dem Testcytokin kultiviert. Nach 18-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurden die konditionierten Medien in Bezug auf TNF-α (Seq.-ID Nr. 20) unter Einsatz eines ELISA-Testsets (R&D Systems) mengenmäßig analysiert.
Menschliche Vorhaut-Fibroblastenzellen (ATCC) wurden getrennt in MEM-Medien (10% FBS) in Gegenwart von IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und 1L-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) kultiviert. Nach 18-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurden die konditionierten Medien unter Einsatz eines ELISA-Sets (R&D Systems) in Bezug auf IL-6 (Seq.-ID Nr. 14) getestet. Im Gegensatz zu dem durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) induzierten hohen IL-6-Spiegel (Seq.-ID Nr. 14) gelang es weder IL-17B (Seq.-ID Nr. 1) noch IL-17C (Seq.-ID Nr. 3), die Sekretion von IL-6 (Seq.-ID Nr. 14) in Fibroblastenzellen zu stimulieren (9A).
Unter Einsatz des in Yao et al., Cytokine 9, 194 (1997) (Yao-3), dargelegten Verfahrens wurde eine menschliche Leukämie-Monozyten-Zelllinie, THP1, zum Testen der Stimulation der TNF-α-(Seq.-ID Nr. 20)Freisetzung durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), UNQ516 (Seq.-ID Nr. 1) und UNQ561 (Seq.-ID Nr. 3) durch Kultivieren in RPMI-Medien (10% FBS) eingesetzt. Nach 18-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurde TNF-α (Seq.-ID Nr. 19) in den konditionierten Medien unter Einsatz eines ELISA-Sets (R&D Systems) mengenmäßigen bestimmt. Während IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) nur einen geringen TNF-α-Spiegel (Seq.-ID Nr. 19) in THP-1-Zellen induzierte, stimulierten sowohl IL-17B als auch IL-17C (als Fc-Fusionsproteine) TNF-α-Produktion in THP-1-Zellen (9B). Ein Kontroll-Fc-Fusionsprotein zeigte keine Wirkung.
Um die Stimulation von TNF-α-Freisetzung durch IL-17B und IL-17C weiter zu charakterisieren, wurden Zeitverlauf und Konzentrationsabhängigkeit der Reaktion in THP-1-Zellen analysiert. 10 zeigt, dass IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) die Freisetzung von TNF-α (Seq.-ID Nr. 19) in Abhängigkeit von Zeit und Konzentration stimulieren. Der EC₅₀ für die Stimulation durch IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) beträgt 2,4 nM, während jener für IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) 25 nM beträgt.
Während die in diesen Experimenten verwendeten IL-17B- (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C- (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) Präparate nicht nachweisbare Mengen Endotoxin (weniger als 1 EU/ml) enthielten, wurden zusätzliche Kontrollexperimente durchgeführt, um zu bestätigen, dass die TNF-α- (Seq.-ID Nr. 19) Feisetzung durch THP-1-Zellen real und kein Artefakt war. Die IL-17B- (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C- (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) Aktivitäten wurden durch eine Polymyxin-B-Behandlung nicht beeinträchtigt und durch Hitzebehandlung aufgehoben, was weiter die Ansicht unterstützt, dass die Proteine selbst, und nicht das verunreinigende Endotoxin, für die Aktivitäten verantwortlich waren.
Beispiel 11: IL-17-Rezeptorbindunq
Klonieren der ECD eines hIL-17-Rezeptors:
Um die ECD eines menschlichen IL-17-Rezeptors zu klonieren, wurden zwei Oligonucleotid-Primer an den 5'- und 3'-Enden von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) basierend auf der veröffentlichten Sequenz hergestellt. Yao et al., s. o. (Yao-3). Die beiden Sonden hatten die folgenden Sequenzen:
Die oben genannte Primer wurden in PCR-Reaktionen zur Amplifizierung von cDNA voller Länge aus einer menschlichen Hoden-cDNA-Bibliothek mit Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Promega) eingesetzt. Eine C-terminale His-Markierung wurde mittels PCR durch die Hinzufügung von Nucleotiden, die für 8 Histidine kodieren, zu dem 3'-Endprimer eingeführt. Das PCR-Produkt wurde dann in einen Expressionsplasmidvektor pRK5B subkloniert. Die Sequenzanalyse bestätigte, dass das insert ein DNA-Fragment enthält, das für die extrazelluläre Domäne (1–320 Aminosäuren) des veröffentlichten hIL-17-Rezeptors (Seq.-ID Nr. 15) kodiert.
Immunfällung von IL-17R-ECD:
Die differentielle Aktivität von IL-17 im Vergleich mit IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) und IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) deutet darauf hin, dass sie verschiedene Zelloberflächenrezeptoren binden und aktivieren könnten. Um zu testen, ob IL-17B (UNQ516) (Seq.-ID Nr. 1) oder IL-17C (UNQ561) (Seq.-ID Nr. 3) direkt an den Rezeptor binden, wurde ein Expressionsplasmid, das IL-17R (C-terminal His-markiert) (Seq.-ID Nr. 22) enthielt, in 293-Zellen unter Einsatz von SuperFect-Transfektionsreagens (Qiagen) transfiziert. Die metabolische Markierung von 293-Zellen erfolgte 16 h nach der Transfektion 6 h lang unter Einsatz eines Gemischs aus 50 μCi/ml _[ ³⁵S]-Cys/Met. Konditioniertes Medium wurde gesammelt und konzentriert (Centricon-10, Amicon). Um die Expression von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) zu untersuchen, wurden Ni-NTA-Perlen (Qiagen) eingesetzt, um die His-markierte IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 22) aus dem konditionierten Medium affinitätszufällen.
Das konditionierte Medium wurde in RIPA-Puffer (1% NP40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS in PBS) verdünnt und mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) und den Fc-Fusionsproteinen über Nacht bei 4°C inkubiert. Protein-A-Agaroseperlen (Pierce) wurden zur Ausfällung der Fc-Fusionsproteine zugesetzt. Die Niederschläge wurden 3-mal gewaschen, um die Fc-Fusionsproteine auszufällen. Die Niederschläge wurden 3-mal in RIPA-Puffer gewaschen, in SDS-Probepuffer denaturiert und auf 4–12% Bis-Tris-NuPAGE-Gelen (Novex) einer Elektrophorese unterzogen. Für die Immunfällung von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) wurde Anti-IL-17-Antikörper (R&D Systems) zugesetzt. In einem kompetitiven Bindungsexperiment erfolgt die Immunfällung von IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) durch IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) in Gegenwart eines 5fachen molaren Überschusses an IL-17B.his (Seq.-ID Nr. 23), IL-17C.his (Seq.-ID Nr. 24) und His-markiertem Kontrollprotein.
Die IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) migrierte als eine 60-kDa-Bande, wenn sie über die Histidin-Markierung gereinigt wurde (11A, Spur 1). Außerdem wurde die IL-17R-ECD (Seq.-ID Nr. 15) auch in Kombination mit IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) (Spur 3) ausgefällt. Sowohl IL-176 (Seq.-ID Nr. 1) als auch IL-17C (Seq.-ID Nr. 3) gelang es jedoch nicht, um die Bindung von IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) für die markierte IL-17-Rezeptor-ECD (Seq.-ID Nr. 15) zu konkurrieren (11B, Spur 15 und 16).
Beispiel 12: Analyse der Bindung an THP-1-Zellen mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsortierer (FACS)
THP-1-Zellen (5 × 10⁵) wurden in PBS, die 5% Pferdeserum enthielt, bei 4°C 30 min lang vorinkubiert, um nicht-spezifische Bindung zu blockieren. IL-17 (Seq.-ID Nr. 11), IL-17B.Fc (Seq.-ID Nr. 12), IL-17C.Fc (Seq.-ID Nr. 13) oder Kontroll-Fc (jeweils 1 μg) wurden zugesetzt und mit den THP-1-Zellen in einem Volumen von 0,25 ml 1 h lang auf Eis inkubiert. Für das IL-17-Bindungsexperiment wurden primäre Anti-hIL-17-Antikörper (1:100 verdünnt) und an FITC (Jackson Immunology Lab, 1:100 verdünnt) konjugierte sekundäre Ziegen-Anti-Maus-Antikörper aufeinanderfolgend zugesetzt, mit 30- bis 60-minütiger Inkubation und umfassendem Waschen vor jeder Zugabe. Für die Fc-Fusionsproteine wurden die Zellen mit FITC-konjugierten Ziegen-Anti-Mensch-IgG (Fc-spezifisch, Jackson Immunology Lab, 1:100 verdünnt) gefärbt. Nach sorgfältigem Waschen wurden mindestens 5.000 Zellen unter Einsatz eines FACS-can (Becton Dickinson) analysiert.
Das Ergebnis des oben beschriebenen Verfahrens war, dass IL-17B-(Seq.-ID Nr. 12) und IL-17C- (Seq.-ID Nr. 13) Fc-Fusionsproteine im Vergleich mit einem Kontroll-Fc-Fusionsprotein eine Bindung an THP-1-Zellen aufwiesen (13).
Beispiel 13: Reinigung von PRO1122-Polypeptiden unter Einsatz spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO1122-Polypeptide können durch verschiedene Standardverfahren auf dem Gebiet der Proteinreinigung gereinigt werden. Pro-PRO1122-Polypeptid, reifes PRO1122-Polypeptid oder Prä-PRO1122-Polypeptid wird beispielsweise mittels Immunaffinitätschromatographie unter Einsatz von für das PRO1122-Polypeptid von Interesse spezifischen Antikörpern gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch die kovalente Bindung des Anti-PRO1122-Antikörpers an ein aktiviertes Chromatographieharz hergestellt.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung auf immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersey) hergestellt. Auf ähnliche Weise werden monoklonale Antikörper aus Maus-Aszitenflüssigkeit durch Ammoniumsulfatausfällung oder Chromatographie auf immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz, wie z. B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^® (Pharmacia LKB Biotechnology), gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das Harzderivat wird gemäß den Herstellerhinweisen gewaschen.
Eine solche Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von PRO1122-Polypeptid durch die Herstellung einer Zellfraktion, die PRO1122-Polypeptid in löslicher Form enthält, eingesetzt. Dieses Präparat wird mittels Solubilisierung der gesamten Zelle oder eines subzellulären Anteils abgeleitet, der durch differentielles Zentrifugieren durch die Zugabe eines Detergens oder durch andere Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten wird. Alternativ dazu kann lösliches PRO1122-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in nützlicher Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
Ein Präparat, das ein lösliches PRO1122-Polypeptid enthält, wird durch eine Immunaffinitätssäule geleitet, und die Säule wird unter Bedingungen gewaschen, die die bevorzugte Absorption von PRO1122-Polypeptid ermöglichen (z. B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart eines Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die die Antikörper-PRO1122-Polypeptid-Bindung trennen (z. B. ein Puffer mit niedrigem pH, wie z. B. etwa pH 2–3, oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops, wie z. B. Harnstoff oder Thiocyanat-Ion), und PRO1122-Polypeptid wird gesammelt.
Beispiel 14: Arzneimittel-Screening
Diese Erfindung ist insbesondere für das Screenen von Verbindungen unter Einsatz von PRO1122-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon bei verschiedenen Arzneimittel-Screeningverfahren nützlich. Das PRO1122-Polypeptid oder Fragment davon, das in einem solchen Test eingesetzt wird, kann frei in Lösung, an einen festen Träger gebunden, auf einer Zelloberfläche getragen oder intrazellulär lokalisiert sein. Ein Verfahren des Arzneimittel-Screening setzt eukaryotische und prokaryotische Wirtszellen ein, die stabil mit rekombinanten Nucleinsäuren transformiert sind, die das PRO1122-Polypeptid oder ein Fragment davon exprimieren. Arzneimittel werden gegenüber diesen transformierten Zeilen in kompetitiven Bindungstests gescreent. Solche Zellen können in lebensfähiger oder fixierter Form für Standardbindungstests eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Komplexbildung zwischen PRO1122-Polypeptid oder einem Fragment davon und dem getesteten Wirkstoff gemessen werden. Alternativ dazu kann die Verringerung der Komplexbildung zwischen PRO1122-Polypeptid und dessen Zielzelle oder Zielrezeptoren, die durch den getesteten Wirkstoff verursacht wird, untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt demnach Screeningverfahren für Arzneimittel und andere Wirkstoffe bereit, die eine Erkrankung oder Störung in Zusammenhang mit PRO1122-Polypeptiden beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren eines solchen Wirkstoffs mit einem PRO1122-Polypeptid oder einem Fragment davon und das Testen (i) des Vorhandenseins eines Komplexes zwischen dem Wirkstoff und dem PRO1122-Polypeptid oder Fragment davon oder (ii) des Vorhandenseins eines Komplexes zwischen dem PRO1122-Polypeptid oder Fragment davon und der Zelle mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Bei solchen kompetitiven Bindungstest ist das PRO1122-Polypeptid oder Fragment davon typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO1122-Polypeptid oder freie Fragmente davon von dem in gebundener Form vorhandenen getrennt, und die Menge freier oder nicht komplexierter Markierung dient als Maß für die Fähigkeit des jeweiligen Wirkstoffs, an PRO1122 zu binden oder den PRO1122-Polypeptid/Zell-Komplex zu beeinflussen.
Ein weiteres Verfahren für das Arzneimittel-Screening stellt ein Hochdurchsatz-Screening für Verbindungen bereit, die eine geeignete Bindungsaffinität für ein Polypeptid aufweisen, und wird detailliert in WO 84103564 , veröffentlicht am 13. September 1984, beschrieben. Kurz zusammengefasst wird eine große Anzahl verschiedener kleiner Peptid-Testverbindungen auf einem festen Substrat, wie z. B. Kunststoffnadeln oder einer anderen Oberfläche, hergestellt. Bei Anwendung auf ein PRO1122-Polypeptid werden die Peptid-Testverbindungen mit PRO1122-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO1122 wird durch Verfahren nachgewiesen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Gereinigtes PRO1122-Polypeptid kann auch zur Verwendung in den zuvor genannten Arzneimittel-Screeningverfahren direkt auf Platten beschichtet werden. Zusätzlich dazu können nicht-neutralisierende Antikörper eingesetzt werden, um das Peptid einzufangen und auf dem festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung zieht auch die Verwendung kompetitiver Arzneimittel-Screeningtests in Betracht, bei denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, PRO1122-Polypeptid zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung in Bezug auf die Bindung an PRO1122-Polypeptid oder Fragmente davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper eingesetzt werden, um das Vorhandensein eines Peptids nachzuweisen, das eine oder mehrere Antigen-Determinanten mit PRO1122-Polypeptid teilt.
Beispiel 15: Rationale Wirkstoffentwicklung
Das Ziel rationaler Wirkstoffentwicklung besteht in der Produktion struktureller Analoga biologisch aktiver Polypeptide von Interesse (d. h. eines PRO1122-Polypeptids) oder kleiner Moleküle, mit denen diese in Wechselwirkung treten, z. B. Agonisten, Antagonisten oder Hemmer. Jedes dieser Beispiele kann eingesetzt werden, um Arzneimittel herzustellen, die aktivere oder stabilere Formen des PRO1122-Polypeptids darstellen oder die die Funktion des PRO1122-Polypeptids in vivo verbessern oder beeinflussen (siehe Hodgson, Bio/Technology 9, 19–21 (1991)).
Bei einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO1122-Polypeptids oder eines PRO1122-Polypeptid-Hemmer-Komplexes mittels Röntgenkristallographie, durch Computer-Modellerstellung oder typischerweise insbesondere durch eine Kombination beider Ansätze bestimmt. Die Form und Ladungen von PRO1122 müssen ermittelt werden, um die Struktur und die aktive(n) Stelle(n) des Moleküls zu bestimmen. Seltener kann nützliche Information in Bezug auf die Struktur von PRO1122 durch Modellerstellung basierend auf der Struktur homologer Proteine erhalten werden. In beiden Fällen wird relevante Strukturinformation eingesetzt, um analoge PRO1122-Polypeptid-ähnliche Moleküle herzustellen oder wirksame Hemmer zu Identifizieren. Wirksame Beispiele für rationale Wirkstoffentwicklung kann Moleküle betreffen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton und Wells, Biochemistry 31, 7796–7801 (1992), gezeigt, oder die als Hemmer, Agonisten oder Antagonisten nativer Peptide wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742–746 (1993), gezeigt.
Es ist auch möglich, einen Ziel-spezifischen Antikörper, der durch einen funktionellen Test ausgewählt wurde, wie oben beschrieben, zu isolieren und dann dessen Kristallstruktur zu bestimmen. Dieser Ansatz liefert im Prinzip ein Pharmacore, das als Basis für die folgende Arzneimittelentwicklung dienen kann. Es ist möglich, Protein-Kristallographie gänzlich zu umgehen, indem Anti-Idiotyp-Antikörper (Anti-Ids) in Bezug auf einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper hergestellt werden. Als Spiegelbild eines Spiegelbilds würde die Bindungsstelle der Anti-Anti-Ids erwartungsgemäß ein Analogon des ursprünglichen Rezeptors sein. Der Anti-Id könnte dann eingesetzt werden, um Peptide aus den Reihen chemisch oder biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als Pharmacore dienen.
Durch die vorliegende Erfindung können ausreichende Mengen des PRO1122-Polypeptids hergestellt werden, um solche analytischen Studien wie Röntgen-Kristallographien durchzuführen. Zusätzlich dazu stellt das hierin bereitgestellte Wissen in Bezug auf die PRO1122-Polypeptid-Aminosäuresequenz Orientierungshilfen für jene bereit, die Computermodeilerstellungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie einsetzen.
Beispiel 16: Test in Bezug auf artikuläre Knorpelexplantate
Einleitung:
Wie zuvor erwähnt spielt IL-17 wahrscheinlich eine Rolle bei der Auslösung oder Aufrechterhaltung der proinflammatorischen Reaktion. IL-17 ist ein Cytokin, das von CD4⁺-T_h-Zellen exprimiert wird, und induziert die Sekretion von proinflammatorischen und hämatopoetischen Cytokinen (z. B. IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, GM-CSF; Aarvak et al., J. Immunol. 162, 1246–1251 (1999); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183, 2593–2603 (1996); Jovanovic et al., J. Immunol. 160, 3513–3521 (1998)) in einer Reihe von Zelltypen, umfassend Synoviozyten und Makrophagen. In Gegenwart von IL-17 erhalten Fibroblasten die Proliferation von hämatopoetischen CD34⁺-Vorläufern aufrecht und induzieren ihre bevorzugte Reifung in Neutrophile. In der Folge kann IL-17 ein früher Initiator der T-Zell-abhängigen Entzündungsreaktion und Teil des Cytokin-Netzwerks sein, das das Immunsystem mit der Hämatopoese verbindet.
Es wurde festgestellt, dass die Expression von IL-17 in der Gelenksflüssigkeit von Patienten mit rheumatischer Arthritis, Arthritis psoriatica oder Osteoarthritis vorhanden ist, aber nicht in normalen Gelenksgeweben. IL-17 kann mit den von Monozyten stammenden, proinflammatorischen Cytokinen IL-1β oder TNF-α synergieren, um IL-6 und GM-CSF zu induzieren. Indem IL-17 direkt auf Synoviozyten wirkt, könnte es die Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen in vivo fördern und somit die Gelenksentzündung und -zerstörung verstärken.
Um die mögliche Rolle von IL-17 besser zu verstehen, haben die Anmelder die Wirkungen von IL-17 auf den Knorpelmatrix-Metabolismus getestet. Im Lichte der bekannten katabolischen Wirkungen von Stickstoffoxid (NO) auf Knorpel und des Vorhandenseins eines hohen NO-Spiegels in arthritischen Gelenken wurde auch die NO-Produktion gemessen.
Verfahren:
Artikuläre Knorpelexplantate: Das metacarpophalangeale Gelenk eines 4–6 Monate alten weiblichen Schweins wurde aseptisch aufgeschnitten, und artikulärer Knorpel wurde freihändig vorsichtig herausgeschnitten, um den darunter liegenden Knochen nicht zu beschädigen. Der Knorpel wurde zerkleinert und unverpackt zumindest 24 h lang in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft, 5% CO₂ in serumfreiem (SF-) Medium (DME/F12 1:1) mit 0,1% BSA und Antibiotika kultiviert. Nach dreimaligem Waschen wurden etwa 80 g artikulärer Knorpel in Micronics-Röhrchen aliquotiert und zumindest 24 h lang im obigen SF-Medien inkubiert. Testproteine wurden in einer Konzentration von 1% entweder alleine oder in Kombination mit IL-1α (10 ng/ml) (Seq.-ID Nr. 25) zugesetzt. Die Medien wurden geerntet und zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 24, 48, 72 h) getauscht und unter Einsatz des 1,9-Dimethylmethylen-Blau-(DMB-)Kolorimetrietests, der in Farndale und Buttle, Biochem. Biophys. Acta 883, 173–177 (1985), beschrieben wird, in Bezug auf Proteoglykan-Gehalt getestet. Nach Markierung (über Nacht) mit ³⁵S-Schwefel wurden die Röhrchen gewogen, um die Gewebemenge zu bestimmen. Nach Verdau über Nacht wurden die Menge des in dem Gewebe verbleibenden Proteoglykan sowie die Proteoglykan-Synthese (³⁵S-Inkorporation) bestimmt.
Messung der NO-Produktion:
Der Test basiert auf dem Prinzip, dass 2,3-Diaminonaphthalin (DAN) mit Nitrit unter sauren Bedingungen reagiert, um 1-(H)-Naphthotriazol, ein fluoreszierendes Produkt, zu bilden. Da NO schnell in Nitrit (NO₂ ^–1) und Nitrat (NO₃ ^–4) metabolisiert wird, ist der Nachweis von Nitrit eine Möglichkeit zum Nachweis für das tatsächlich produzierte NO (wenngleich zu wenig nachgewiesen wird). 10 μl DAN (0,05 mg/ml in 0,62 M HCl) wird zu 100 μl Probe (Zellkulturüberstand) zugesetzt, gemischt und bei Raumtemperatur 10–20 min lang inkubiert. Die Reaktion wird mit 5 ml 2,8 N NaOH beendet. Die Bildung von Diaminonaphthotriazol wurde unter Einsatz eines Cytoflor-Fluoreszenz-Plattenlesegeräts mit Anregung bei 360 nm und Ablesen der Emission bei 450 nm gemessen. Für die optimale Messung von Fluoreszenzintensität wurden schwarze Platten mit klarem Boden eingesetzt.
Ergebnisse und Diskussion:
Es wurde beobachtet, dass IL-17 (Seq.-ID Nr. 11) die Freisetzung von Proteoglykanen steigert und deren Synthese reduziert (13). Außerdem verstärkte diese Wirkung die bei IL-1α beobachtete Wirkung (13) (Seq.-ID Nr. 25). Die Wirkungen von IL-17 werden weder durch die Produktion von Stickstoffoxid gefördert, noch verstärkt die Hemmung der Stickstoffoxidfreisetzung den Matrixabbau. UNQ561 (Seq.-ID Nr. 3) verstärkt den Matrixabbau und hemmt die Matrixsynthese. Somit ist es wahrscheinlich, dass die Expression von PRO1122 mit degenerativen Knorpelstörungen in Zusammenhang steht. Andererseits steigert UNQ516 (Seq.-ID Nr. 1) die Matrixsynthese und hemmt die Freisetzung von Stickstoffoxid durch artikuläre Knorpelexplantate.
Folglich trägt IL-17 wahrscheinlich zum Verlust artikulären Knorpels in arthritischen Gelenken bei, womit die Hemmung der Aktivität von IL-17 Entzündung und Knorpelzerstörung einschränken könnte. IL-1 und IL-17 weisen aufgrund ihrer Verwendung von verschiedenen Rezeptoren und überlappenden Stromab-Signalmechanismen ähnliche, aber dennoch verschiedene Aktivitäten auf.
In Anbetracht der Erkenntnisse in Bezug auf die potenten katabolischen Wirkungen von IL-17 auf artikuläre Knorpelexplantate und der Homologie von UNQ561 und UNQ561 mit IL-17 können Antagonisten eines oder aller dieser Proteine wirksam zur Behandlung von Entzündungserkrankungen und Knorpelschäden, wie z. B. Arthritis, sein. Die Erkenntnis der Erfinder, dass UNQ516 die NO-Produktion hemmt und die Matrixsynthese fördert, deutet jedoch darauf hin, dass dieses Protein und Agonisten davon positive Wirkungen in dem Gelenk haben könnten und somit an sich wirksam zur Behandlung der zuvor genannten Störungen sein könnten.
Schließlich ist bekannt, dass Wachstumsfaktoren Zwei-Phasen-Wirkungen haben können und erkranktes Gewebe anders als normales Gewebe auf einen bestimmten Faktor in vivo reagieren kann. Aus diesen Gründen können Antagonisten oder Agonisten (z. B. die Proteine selbst) von UNQ561 zur Behandlung von Entzündungserkrankungen und Gelenksstörungen, wie z. B. Arthritis, zweckdienlich sein.
Hinterlegung von Material:
Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA 20110–2209, hinterlegt:

Material ATCC-Hinterlegungsnr. Hinterlegungsdatum

DNA59294-1381 209866 14. Mai 1998

DNA62377-1381-1 203552 22. Dezember 1998
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags betreffend die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und dessen Ausführungsordnung (Budapester Vertrag). Dadurch wird sichergestellt, dass 30 Jahre lang beginnend mit dem Hinterlegungsdaum eine lebensfähige Kultur erhalten wird. Die Hinterlegung wird durch die ATCC gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt und unterliegt einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC, das die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des relevanten US-Patents oder Offenlegung einer US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem was zuerst eintritt, sicherstellt und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsidenten des Patentamts der Vereinigten Staaten bestimmt wurde, gemäß 35 USC §122 und den entsprechenden Regeln des Präsidenten (umfassend 37 CFR §1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) darauf Anspruch zu haben, sicherstellt.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass, wenn eine Kultur des hinterlegten Materials sterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, das Material umgehend bei Benachrichtigung durch eine andere Kultur desselben Materials ersetzt wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als Ermächtigung dazu auszulegen, die Erfindung entgegen der durch die Autorität einer Regierung gemäß ihres Patentrechts gewährten Rechte umzusetzen.
Die vorhergehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zu ermöglichen, die Erfindung umzusetzen. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll nicht durch das hinterlegte Konstrukt eingeschränkt werden, da die hinterlegte Ausführungsform nur als eine Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung dienen soll. Durch die Hinterlegung von Material hierin wird nicht eingeräumt, dass die schriftliche Beschreibung, die hierin enthalten ist, unzureichend ist, um die Umsetzung jedes Aspekts der vorliegenden Erfindung, umfassend der besten Art der Durchführung, zu ermöglichen, noch soll sie als Einschränkung des Umfangs der Ansprüche auf die spezifischen veranschaulichenden Beispiele, die sie darstellt, ausgelegt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Sequenzprotokoll

Claims

Antagonist eines PRO1122-Polypeptids, worin der Antagonist einen Anti-PRO1122-Antikörper umfasst, der an ein PRO1122-Polypeptid, das aus der in 3 (Seq.-ID Nr. 3) gezeigten Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 19 bis 197 besteht, spezifisch bindet und der Aktivität des aus der in 3 (Seq.-ID Nr. 3) gezeigten Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 19 bis 197 bestehenden PRO1122-Polypeptids entgegenwirkt, um den Matrixabbau zu erhöhen und die Matrixsynthese in artikulären Knorpelexplantaten zu hemmen.
Therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den PRO1122-Antagonisten nach Anspruch 1 in einer Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren-Träger.
Antagonist eines PRO1122-Polypeptids zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren, worin der Antagonist wie in Anspruch 1 definiert ist.
Antagonist nach Anspruch 3, worin es sich bei der Behandlung um die Behandlung einer degenerativen Knorpelerkrankung handelt.
Antagonist nach Anspruch 4, worin es sich bei der Behandlung um die Behandlung von Arthritis handelt.
Verwendung eines Antagonisten nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer degenerativen Knorpelerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 6, worin es sich bei der Behandlung um die Behandlung von Arthritis handelt.