DE69920219T2

DE69920219T2 - Bioaktive molke-eiweisshydrolysate

Info

Publication number: DE69920219T2
Application number: DE69920219T
Authority: DE
Inventors: Ralf-Christian Schlothauer; May Linda SCHOLLUM; Maria Anne SINGH; Robert Julian REID
Original assignee: New Zealand Dairy Board
Current assignee: New Zealand Dairy Board
Priority date: 1998-06-17
Filing date: 1999-06-14
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2019-06-15
Also published as: US20040086958A1; US6919314B1; WO1999065326A1; NO320644B1; AU761477B2; US20090258387A1; NO20006305D0; DK1087668T3; NZ508867A; ATE275831T1; US7148034B2; TWI225490B; NO20006305L; EP1087668A1; US20050164340A1; PE20000717A1; EP1087668B1; MY126517A; DE69920219D1; AU4535999A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von hydrolysierten Molkeproteinprodukten, die frei von bitteren Aromen sind und die bioaktive Peptide enthalten. Die Produkte des Verfahrens haben eine gute Verdaubarkeit und gute organoleptische Eigenschaften. Die Produkte können entweder einen milden oder leicht süßen Geschmack haben und sind frei von seifigen oder brühigen Aromen. Die hydrolysierten Molkeproteinprodukte können fakultativ Oligosaccharide enthalten und sind nützliche Quellen für bioaktive Peptide zum Einbau in funktionelle Nahrungsmittel.
STAND DER TECHNIK
Eine Anzahl von Nahrungsinhaltsstoffen und Nahrungsmitteln sind aus der Hydrolyse einer Proteinquelle erzeugt worden, wie etwa den Milchproteinen, Casein und Molkeproteinen.
Hydrolysierte Proteinnahrungsmittel können gegenüber nicht-hydrolysierten Proteinnahrungsmitteln Vorteile in einer Anzahl von Gebieten der Gesundheitsfürsorge haben. Zum Beispiel ist bekannt, daß enzymatisch hydrolysierte Proteine weniger allergen sind. Sie werden auch rascher verdaut und absorbiert als ganze Proteine. Nahrungsmittel, enthaltend hydrolysierte Proteine, sind ebenso bei der Ernährung von Krankenhauspatienten mit z.B. Verdauungskrankheiten nützlich.
Es ist bekannt, daß die Hydrolyse von Molkeproteinen und Caseinen bioaktive Peptide freisetzt, die eine Anzahl von physiologischen Effekten aufweisen können (Maubois et al, 1991; EP 474506 ). Eine Anzahl von Publikationen beschreiben solche bioaktiven Peptide, z.B. sind ACE-inhibierende Peptide, die Anti-Bluthochdruck-Eigenschaften haben, durch Proteolyse von Molke ( JP 10033115 ) und durch eine enzymatische Behandlung von bovinem β-Lactoglobulin und Molkeproteinkonzentraten (Mullally et al, 1997) freigesetzt worden. ACE-inhibitorische Peptide werden ebenso in saurer Milch und in Hydrolysaten von α_S- und β-Casein gefunden ( JP 4282400 ; Nakamura et al 1994, Yamamoto et al 1994).
Mullally et al., International Dairy Journal, 1997, S. 299-303, betrifft den gastrischen und pankreatischen Proteinaseverdau von Molkeproteinen, bis zu einem DH von 8%, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung bei 80°C für 20 Minuten, um bioaktive Peptide mit ACE-inhibitorischer Aktivität zu erhalten.
EP 474506 offenbart die Hydrolyse des Milchproteins Lactoferrin in Molke, um Lactoferricin freizusetzen, das als ein antimikrobielles Mittel fungiert, das zum Behandeln von Durchfall, Fußpilz, Augeninfektionen, Mastitis etc. bei Menschen und Tieren nützlich ist.
Jedoch ist bekannt, daß die Hydrolyse der meisten Nahrungsmittelproteine, insbesondere die Hydrolyse von Molke und Casein-enthaltenden Produkten, Bitterkeit erzeugt. Dies verursacht Probleme mit dem Wohlgeschmack, insbesondere beim Versuch, oral aufnehmbare Produkte zu formulieren, die Milchproteinhydrolysate als eine Quelle für bioaktive Peptide beinhalten.
Auf dem Gebiet der Proteinhydrolyse werden einer oder beide von zwei Ansätzen zum Kontrollieren oder Entfernen von Bitterkeit in Proteinhydrolysaten häufig verwendet, um den Wohlgeschmack der Produkte zu erhöhen.
Es ist bekannt, daß die umfassende Hydrolyse des Proteinsubstrats in Milchproteinhydrolysaten die Bitterkeit verringert ( EP 065663 ; EP 117047 ; US 3970520 ). Weniger bittere Produkte werden auf diese Weise relativ leicht und billig hergestellt. Jedoch verringert eine umfassende Hydrolyse die Kettenlängen aller Peptide, einschließlich der bioaktiven Peptide von Interesse. Eine umfassende Hydrolyse des Proteinsubstrats zerstört die funktionelle und biologische Aktivität des Peptids von Interesse. Zusätzlich entwickeln sich oft seifige und brühige Nebenaromen mit der Folge, daß der Wohlgeschmack des Endprodukts im Vergleich mit dem ursprünglichen mild schmeckenden Proteinsubstrat schlecht bleibt. Ein weiterer Nachteil ist am Ende, daß für einige Hydrolysate die Bitterkeit nur teilweise entfernt wird (Roy 1992 and 1997).
Ein zweites häufiges Verfahren für die Kontrolle der Bitterkeit in Proteinhydrolysaten ist es, Enzyme zum Entfernen der Bitterkeit („debittering enzymes"), insbesondere diejenigen aus Aspergillus oryzae, zu verwenden.
Es wird davon ausgegangen, daß die Erzeugung von „Bitterkeit" bei der Proteinhydrolyse auf der Anwesenheit von großen hydrophoben „bitteren" Peptiden beruht. Enzyme zum Entfernen der Bitterkeit hydrolysieren selektiv die in den Proteinhydrolysaten vorhandenen bitteren Pep tide. Ein Fachmann kann – aufgrund der gezielten Auswahl von Enzymen zum Entfernen der Bitterkeit und den Behandlungsbedingungen – im Effekt die Milchproteinhydrolysate von ihrer Bitterkeit befreien und die jeweiligen bioaktiven Peptide von Interesse intakt lassen. Jedoch macht die Verwendung von Enzymen zum Entfernen der Bitterkeit das Verfahren teurer, und die Konservierung von einigen der bioaktiven Peptiden wird nicht leicht oder erfolgreich erzielt. Ein weiterer Nachteil ist, daß Behandlungen mit Enzymen zum Entfernen der Bitterkeit eine Tendenz haben, freie Aminosäuren in das Endprodukt freizusetzen, und infolge davon entwickeln die Hydrolysate unangenehme brühige oder seifige Aromen (Roy 1992 and 1997).
Die verschiedenen Verfahren zum Entfernen der Bitterkeit der Proteinhydrolysate führen zu zusätzlichen Verfahrensschritten und verursachen weitere Kosten bei der Herstellung des Endprodukts. Zusätzlich erhält das Endprodukt einen Überschuß an freien Aminosäuren.
Es wäre am vorteilhaftesten, wenn ein Verfahren zum Hydrolysieren von Protein entwickelt werden könnte, das bioaktive Peptide von Interesse freisetzt und das die Bildung von bitteren Peptiden und freien Amninosäuren beschränkt, wodurch ermöglicht wird, daß der ursprüngliche milde Geschmack der Milchproteinsubstrate beibehalten wird.
Einige bioaktive Peptide – insbesondere die Anti-Bluthochdruck-Peptide – sind relativ stabil während der Proteinhydrolyse und werden sehr früh während der Hydrolyse des Milchproteinsubstrats freigesetzt, wie in 1 gezeigt.
Die bitteren Aromen der Milchproteinhydrolysate können verbessert werden durch Zugabe von Zuckern oder durch Hydrolysieren von natürlichen Zuckern, wie etwa Lactose, die bereits in dem Milchproteinsubstrat vorhanden sind (Bernal and Jelen, 1989). Zum Beispiel werden saure Molken und Käsemolken wohlschmeckender gemacht, wenn sie mittels β-Galactosidase- und Lactasehydrolyse von Lactose versüßt worden sind ( FR 2309154 ; US 4358464 ; JP 8056568 ).
Um eine hohe Geschmacksakzeptanz für ein hydrolysiertes Proteinprodukt zu erzielen, das bioaktive Peptide enthält, ist eine genaue Kontrolle der Hydrolyse erforderlich, um zu verhindern, daß Bitterkeit auftritt.
Ein häufiges Verfahren zum Beenden der Hydrolyse ist die Deaktivierung der Enzyme, gewöhnlich mittels thermischer Deaktivierung bei hohen Temperaturen, typischerweise > 90 – 100°C für eine ausgedehnte Zeitperiode. Jedoch kann dieses Verfahren nicht verwendet werden, um die Hydrolyse von Molkeproteinen zu unterbrechen, da jegliches intakte nicht-hydrolysierte Molkeprotein, das in der Mischung verbleibt, denaturieren und ausfallen würde, was das Endprodukt weniger löslich und weniger akzeptabel für die Verwendung als Nahrungsmittelinhaltsstoff macht.
Es wäre vorteilhaft, wenn ein Verfahren zum Hydrolysieren von Molkeproteinen kontrolliert werden könnte, so daß es direkt ein Hydrolysat erzeugte, das bioaktive Peptide zum Einbau in funktionelle Nahrungsmittel umfaßte, die nicht bitter schmecken würden, und wobei die Enzyminaktivierungsschritte nicht die Unversehrtheit der intakten Proteine in dem Endprodukt in Mitleidenschaft ziehen würden.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, sich auf das Erreichen dieser Ziele in gewisser Weise zuzubewegen oder zumindest der Öffentlichkeit eine nützliche Auswahl zu bieten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Entsprechend kann pauschal gesagt werden, daß die Erfindung aus einem Verfahren zum Herstellen eines Molkeproteinhydrolysats besteht, enthaltend bioaktive Peptide, umfassend das Hydrolysieren eines Molkeprotein-enhaltenden Substrats mit einem oder mehreren Enzymen, dadurch gekennzeichnet daß:

i) das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Protease P6, Protease A, Protease M, Peptidase, Neutrase, Validase, und AFP 2000,
ii) die Hydrolyse bei einer Temperatur von zwischen 30°C und 65°C durchgeführt wird, bei einem pH von 3,5 bis 9, wenn besagtes Enzym eine neutrale Protease ist, bei einem pH von 2,5 bis 6, wenn besagtes Enzym eine saure Protease ist, und bei einem pH von 5 bis 10, wenn besagtes Enzym eine alkalische Protease ist,
iii) die Hydrolyse beendet wird, wenn ein Hydrolysegrad von nicht größer als 10% erreicht worden ist, und
iv) die Hydrolyse durch Erhitzen besagten Hydrolysats für eine bis zehn Sekunden auf eine Temperatur zwischen 85°C und 100°C beendet wird.

Bevorzugt ist besagtes Substrat Süßmolke oder Süßmolkenproteinkonzentrat.
Alternativ wird besagtes Enzym auf einem inerten Träger während besagten Hydrolyseschrittes ii) immobilisiert.
Bevorzugt ist besagter inerter Träger Roehn Eupergit, Carrageenanpartikel, Chitosanpartikel oder jedes andere geeignete inerte Trägermaterial.
Bevorzugt ist der Hydrolysegrad von 3% bis ungefähr 5%.
Bevorzugt enthält das Substrat ebenso Lactose in einer Menge von bis zu 50 Gew.%.
Alternativ enthält das Substrat ebenso Lactose in einer Menge von bis zu 30 Gew.%.
Bevorzugt wird das Substrat ebenso mit Lactase und/oder β-Galactosidase behandelt, entweder vor oder während der Molkeproteinhydrolyse, um die Lactose zu Galactose und Glucose zu hydrolysieren und Galacto-Oligosaccharide zu synthetisieren.
In einer anderen Ausführungsform besteht die Erfindung aus einem Molkeproteinhydrolysat, erhältlich durch das oben beschriebene Vefahren, enthaltend ein oder mehrere bioaktive Peptide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus AFE, LFSH, ILKEKH, LIVTQ, MKG, LDIQK, VF, ALPMH, VTSTAV, LHLPLP, LVYPFPGPIPNSLPQNIPP und LFRQ.
Der Enzymhydrolyseschritt kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die für das jeweilige verwendete Enzym geeignet sind, was von einem Fachmann verstanden werden würde.
Die Molkeproteinsubstrate werden bei einer Konzentration im Bereich von 5 bis 50% Feststoffgehalt hydrolysiert, und das Enzym oder die Enzymmischungen werden zugegeben, um ein Enzym-zu-Substrat-Verhältnis zwischen 0,01 % und 3% Gew./Gew. gesamter Feststoffgehalt zu ergeben, bevorzugt zwischen 0,01 % und 1,0% Gew./Gew. gesamter Feststoffgehalt.
Proteinsubstrate, die mit sauren Proteasen behandelt worden sind, können bei einem pH zwischen 2,5 und 6,0 hydrolysiert werden, bevorzugt zwischen pH 3,0 und 5,0.
Proteinsubstrate, die mit neutralen Proteasen behandelt worden sind, können bei einem pH zwischen 3,5 und 9,0 hydrolysiert werden, bevorzugt zwischen pH 6,0 und 8,0.
Proteinsubstrate, die mit alkalischen Proteasen behandelt worden sind, können in einem pH-Bereich zwischen 5 und 10,0 hydrolysiert werden, bevorzugt zwischen pH 6,0 und 8,0.
Die Proteinhydrolyse kann in einem Temperaturbereich von 30 – 65°C, bevorzugt von 50 – 60°C durchgeführt werden.
Die Hydrolyse von Lactose kann in einem früheren Stadium als die Molkeproteinhydrolyse, gleichzeitig damit oder darauffolgend durchgeführt werden. Die für die Lactosehydrolyse verwendeten Enzyme können Lactase und/oder β-Galactosidase umfassen und können aus Hefe- oder Pilzquellen ausgewählt werden, z.B. Klyvermyces lactis, Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragillis, z.B. Aspergillus niger, Aspergillus oryza, wie etwa Maxilact (Gist Brocades) und Novolact (Novo Nordisk). Die Lactosehydrolyse wird unter Bedingungen durchgeführt, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
In einer Ausführungsform, die nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt, wird die Beendigung der Hydrolyse durch Deaktivieren des einen oder mehrerer Molkeproteinhydrolyseenzymen (und/oder der zuvor zugegebenen Lactose-hydrolysierenden Enzymen) erzielt, indem zuerst der pH der Reaktionsmischung auf einen pH verändert wird, bei dem das Enzym (die Enzyme) entweder inaktiv oder weniger aktiv ist (sind), und/oder indem die Reaktionsmischung auf eine vergleichsweise milde Temperatur unter Verwendung eines Wärmetauschers erhitzt wird, um das Enzym, nicht aber die intakten Molkeproteine in dem Substrat zu denaturieren. Ein geeigneter Temperaturbereich, der die Enzyme denaturieren würde, liegt in der Größenordnung von 55 – 70°C, bevorzugt 65°C.
Gemäß einer weiteren Möglichkeit, die nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt, abhängig von dem (den) verwendeten Enzym(en), können das Enzym oder die Enzymmischung ebenso durch Verdampfungs- und Trocknungsprozeduren deaktiviert werden.
Gemäß einer anderen Möglichkeit, die nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt, kann das Enzym oder die Enzymmischung ebenso mit oder ohne eine vorherige pH-Veränderung deaktiviert werden.
Alternativ kann das ein oder die mehreren Enzyme, die verwendet werden, um das Molkeprotein selektiv zu hydrolysieren, auf einem inerten Träger immobilisiert sein, wie etwa Roehm Eupergit, Carrageenanpartikel, Chitosanpartikel oder jedes andere geeignete Material, und dann in einem gerührten Tank oder einem Festbettreaktor oder auf einer Membran oder einem Hohlfaserreaktor verwendet werden.
Alternativ könnte(n) das (die) Enzym(e), das für die Hydrolyse verwendet werden soll, an einen geeigneten inerten Träger vor der Hydrolysereaktion quervernetzt werden und darauffolgend aus der Hydrolysereaktion unter Verwendung einer Mikrofiltrationsmembran abgetrennt werden.
Alternativ, nicht unter den Umfang der Ansprüche fallend, kann das Enzym von der Hydrolysemischung unter der Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem nominalen Molekulargewichts-Cutoff im Bereich von 10 – 500 kDa abgetrennt werden, wenn die Hydrolyse abgeschlossen ist.
Nach der Hydrolyse und der Deaktivierung von Enzymen kann das Hydrolysat fakultativ einer umgekehrten Osmose unter Bedingungen ausgesetzt werden, bei denen Salz und Wasser aus dem Hydrolysat entfernt werden. Das aufgereinigte entsalzte Hydrolysat, umfassend Molkeproteine und bioaktive Peptide, wird dann wiedergewonnen. Wenn ebenso eine Lactosehydrolyse gewählt wird, dann wird das Hydrolysat ebenso Glucose, Galactose und/oder Galacto-Oligosaccharide enthalten.
Fakultativ können die hydrolysierten Molkeproteine, enthaltend die bioaktive Peptidfraktion mit einer UF-Membran von 5-200 kDa-Cutoff bevorzugt 10-50 kDa-Cutoff getrennt werden. Die bioaktiven Peptide, andere Peptide und, fakultativ, hydrolysierte Lactose wird in dem Permeat wiedergewonnen.
Gemäß einer weiteren Möglichkeit, kann Ionenaustausch oder hydrophobe Adsorption oder hydrophobe Wechselwirkungschromatographie oder Kombinationen dieser Prozesse verwen det werden, um die hydrolysierte bioaktive Fraktion aus den Hydrolysaten in einer angereicherten Form zu gewinnen.
Zusätzlich erzeugt Lactase- und β-Galactosidase-Hydrolyse von Lactose Galakto-Oligosaccharide, von denen bekannt ist, daß sie das Wachstum einer vorteilhaften Darmflora stimulieren, wodurch sie zu den bioaktiven Eigenschaften der Hydrolysate beitragen.
Hydrolysate, die behandelt worden sind, um Lactose zu hydrolysieren, sind nützlich als Nahrungsmittelzusatzstoffe für Konsumenten, die Lactose-intolerant sind.
Das hydrolysierte Molkeproteinprodukt der Erfindung hat eines oder mehrere der folgenden Merkmale:

• Anti-Bluthochdruck-ACE-I-Aktivität
• Bifidus-Wachstums-fördernde Aktivität
• nicht-klebend, nicht-bitterer Geschmack
• angenehmer bis leicht süßer Geschmack
• gute organoleptische Eigenschaften.

Die Erfindung besteht aus dem Vorhergehenden und sieht Konstruktionen vor, für die die folgenden Beispiele angegeben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird jetzt unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben werden, bei denen:
1 eine Auftragung von Bitterkeit und Bioaktivität auf der Ordinate gegen den Hydrolysegrad auf der Abszisse ist. Das „Gelegenheitsfenster" („opportunity window") zum Erhalt eines Produkts gemäß der vorliegenden Erfindung, enthaltend bioaktive Peptide und mit akzeptablen Aromen, bevor die Hydrolysereaktion bittere Peptide erzeugt, liegt zwischen den Linien x₁ und x₂.
2 eine Auftragung des systolischen Blutdrucks von vier Gruppen von Ratten mit Bluthochdruck ist, die mit verschiedenen Nahrungsplänen über eine Periode von acht Wochen gefüttert wurden.
3 eine Auftragung der kleinsten Fehlerquadratanalyse von Ratten ist, die mit einer Kontrolle von kommerziellem Rattenfutter gefüttert wurden, gegen Gruppen von Ratten, die mit Hydrolysat in zwei unterschiedlichen Konzentrationen pro Tag gefüttert wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben diskutiert, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen eines hydrolysierten Molkeproteinprodukts, enthaltend bioaktive Peptide, bereit, wobei die Hydrolyse mit einem hohen Kontrollgrad durchgeführt wird, um zu verhindern, daß sich unerwünschte Aromen während der Hydrolyse entwickeln (z.B. bitter, seifig und brühig). Die Hydrolyse wird innerhalb des „Gelegenheitsfensters" beendet, d.h. bevor eine wesentliche Bitterkeit auftritt – wie in 1 gezeigt – um Hydrolysate mit guten organoleptischen Eigenschaften und maximalen bioaktiven Peptiden bereitzustellen. In 1 wird der Hydrolysegrad qualitativ auf der x-Achse dargestellt. Das Gelegenheitsfenster liegt zwischen den Punkten x₁ und x₂, die in Abhängigkeit von dem Enzym, das verwendet wird, variieren werden. Die optimalen Bedingungen, die gesucht werden, sind eine maximale Bioaktivität mit einem akzeptablen Niveau an Bitterkeit.
Das Enzym, das die Molkeproteine hydrolysiert, ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protease P6, Protease A, Protease M, Peptidase, Neutrase, Validase und AFP 2000 (alle wie hierin definiert), und die Hydrolyse der Molkeproteine wird durch Hitzebehandlung bei 85 – 100°C für 1-10 Sekunden beendet. Die Anmelder haben überraschenderweise gefunden, daß die obigen Enzyme (1) in der Lage sind, ein Molkeproteinhydrolysat zu erzeugen, das eine gute Konzentration an bioaktiven Peptiden enthält, und (2) durch eine kurzzeitige Hochtemperaturbehandlung inaktiviert werden können, die nur eine partielle Denaturierung der Molkeproteine in dem Hydrolysat verursacht und überraschenderweise die organoleptischen Eigenschaften der Molkeproteine hinsichtlich der Bereitstellung eines Produktes verbessert, das in seiner Textur cremig ist (eine relativ geringe Partikelgröße hat) und im wesentlichen weiß im Erscheinungsbild ist.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele dargestellt: Beispiele 1, 3, 15 und 16 fallen nicht unter den Umfang der Ansprüche.
Beispiel 1
Eine 10%-Lösung eines Süßmolkenproteinkonzentrats mit 80% Proteingehalt (ALACEN^TM 392,2 l) wurde bei 50°C mit dem kommerziell erhältlichen Enzym Neutrase aus Bacillus subtilis (Novo Nordisk, Dänemark) hydrolysiert. Ein pH von 7,0 und ein Enzym-Substrat-Verhältnis von 0,3% Gew./Gew. wurde für die Hydrolyse verwendet. Das Hydrolysat wurde auf pH 5,0 eingestellt und auf 65°C für 30 min erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Das Hydrolysat (DH von 4,5%) wurde sprühgetrocknet und auf Angiotensin-umwandelndes Enzym-Inhibitor (ACE-I)-Aktivität und Geschmack getestet. Die ACE-I Aktivität in dem getrockneten Produkt wurde unter Verwendung von FAPGG als ein Substrat bestimmt (Produkt 305-10 von Sigma Chemical Corporation St. Louis, MO, USA) gemäß dem Verfahren von D W Cushman & H S Cheung (1971). ACE-I-Aktivitäten werden als die Menge an Material (g/L) ausgedrückt, die benötigt wird, um die Aktivität des ACE-I-Enzyms um 50% zu verringern. IC₅₀-ACE-I-Aktivität in dem Hydrolysat betrug 0,44 g/L, und der Geschmacksakzeptanzwert, bestimmt anhand einer Geschmackstestgruppe („taste panel"), war sehr hoch.
Beispiel 2
Eine 50%-Lösung von ALACEN^TM 421 Molkeproteinkonzentrat (56% Proteingehalt, 10 l) wurde mit kommerzieller Lactase aus Kluveromyces lactis behandelt (Lactozyme 3000L von Novo Nordisk) bei einem Enzym-zu-Substrat-Verhältnis von 0,3% bei 50°C für zwei Stunden. Die Lactase-behandelte Lösung wurde mit Neutrase (Novo Nordisk, Dänemark) für eine Stunde bei 50°C bei einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 0,3% hydrolysiert. Aktive Enzyme wurden durch UHT-Behandlung (5s bei 95°C) inaktiviert nach einer 5-fachen Verdünnung der Mischung. Das Hydrolysat wurde sprühgetrocknet. Das getrocknete Pulver (DH 2,8%) enthielt keine Spuren an aktivem Enzym und hatte eine ACE-I-Aktivität von 2,18 g/l. Der Geschmackswert war ausnehmend hoch aufgrund der Einführung einer niedrigen Konzentration an Süßmittel in das Produkt. ACE-I-Messungen und die Geschmacksakzeptanzbewertung wurden wie für Beispiel 1 bestimmt.
Beispiel 3
Ein 500 1-Hydrolysat, hergestellt aus ALACEN^TM 392 auf eine ähnliche Weise wie die in Beispiel 1, wurde auf 10°C nach Enzyminaktivierung abgekühlt. Eine Teilprobe des ursprünglichen Hydolysats wurde getrocknet. Das verbleibende Hydrolysat wurde einer Ultrafiltration bei 10°C mit einer Membran mit nominalem Molekulargewichts-Cutoff von 10000 Dalton unterzogen (HFK 131, Koch Membrane Systems, USA). Das Hydrolysat (bei einem DH zwischen 3,8% und 4,2%) wurde auf einer VCF 10 aufkonzentriert, und der Rückstand wurde direkt getrocknet. Das Permeat wurde durch Verdampfung auf näherungsweise 25% Feststoffgehalt aufkonzentriert und getrocknet. Die ACE-I-Messung und Geschmacksakzeptanzbewertung wurden wie für Beispiel 1 bestimmt. Die ACE-I-Aktivität wurde in dem Permeat-Pulver angereichert (IC₅₀ des Permeatpulvers betrug 0,15 g/l). Die ACE-I-Aktivität in der Teilprobe des getrockneten Hydrolysats vor der Ultrafiltration betrug 0,43 g/l. Die Geschmacksakzeptanzwerte bezüglich des Rückstandspulvers und des sprühgetrockneten Pulvers der Zuführung waren beide hoch.
Beispiel 4
Drei unterschiedliche Lösungen aus ALACEN^TM 392, ALACEN^TM 421 und einer Mischung aus ALACEN^TM 392 und Lactose wurden hergestellt mit einem Feststoffgehalt von 15%, um 150 1 zu ergeben. Die Lösung wurde mit einer kommerziellen Protease aus Bacillus subtilis-Neutrase (Novo, Nordisk, Dänemark) und einer kommerziellen Lactase aus Klyvermyces lactis (Lactozyme 3000L von Novo Nordisk) behandelt. Die Zugaberate an Enzym betrug 0,3% Gew./Gew. (auf Proteinbasis) für Neutrase und 1,2% Gew./Gew. (auf Lactase-Basis) für Lactozyme. Die Reaktion wurde für 2 h bei 50°C bei einem pH von 7,0 fortgesetzt. Proben von 35 l wurden alle 0,5 h entnommen, bei 88°C für 3 Sekunden inaktiviert und darauffolgend sprühgetrocknet. Die ACE-I-Aktivität, wie in Beispiel 1 spezifiziert, ergab 0,424 g/l, 0,336 g/l und 0,432 g/l für die drei Mischungen auf einer Proteinbasis. Die Bitterkeit der Proben aus ALACEN^TM 392 wurde formell gegen die beiden Standardhydrolysate bewertet. Die Werte für die Bitterkeit auf einem Maßstab von 1 bis 10, wobei 10 den bittersten Wert darstellt, waren 1,9 für eine Probe nach 0,5 h-Hydrolyse, 2,3 für die 2 h-Hydrolyse im Vergleich zu 5 und 7 für die Standard-Hydrolyse-Proben mit größeren Hydrolysegraden.
Die Proben von ACLACEN^TM 421 und einer Mischung von ALACEN^TM 392 und Lactose entnommen nach 2 h, hatten eine mittlere Partikelgröße von 3 μm bzw. 2 μm. Die Probe von ALACEN^TM 392 hatte eine mittlere Partikelgröße von 6 μm nach 2 h-Hydrolyse und Inakti vierung, wie spezifiziert. Eine geringere sandige und kreidige Beschaffenheit wurde auf die geringeren Partikelgrößenproben zurückgeführt.
Die Löslichkeit der hydrolysierten ALACEN^TM 392/Lactose-Mischung war am höchsten mit näherungsweise 85% über den pH-Bereich. Die ALACEN^TM 392-, ALACEN^TM 421-Proben sind bis zu ungefähr 70% löslich mit einer geringfügigen Abnahme hinsichtlich der Löslichkeit auf 65% bei pH 3,5.
Beispiel 5
Drei verschiedene Lösungen aus ALACEN^TM 392, ALACEN^TM 421 und einer Mischung von ALACEN^TM 392 und Lactose wurden mit 30% Feststoffgehalt hergestellt, um 75 l zu ergeben. Die Enzymbehandlung wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die in halbstündigen Intervallen entnommenen Proben wurden auf 15% Feststoffgehalt verdünnt. Ansonsten wurde die Hitzebehandlung wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die ACE-I-Aktivität, gemessen wie in Beispiel 1 spezifiziert, betrug 0,560 g/l, 0,440 g/l und 0,728 g/l.
Die Proben aus Beispiel 4 und 5 wurden in einer Konzentration von 0,1% zu den Standardwachstumsmedien von Bifidobacterium lactis zugegeben und führten zu einem schnelleren Zellwachstum und einer höheren finalen Zelldichte des Stamms als die Kontrolle ohne jeglichen Zusatz.
Die Oligosaccharid-Konzentration (Trisaccharide und höher) von diesen drei hydrolysierten Proben betrug 0,2%, 2,1 % und 7,0% in ALACEN^TM 392, ALACEN^TM 421 bzw. der Mischung aus ALACEN^TM 392 und Lactose.
Beispiel 6
Die in Beispiel 5 hergestellten Hydrolysatpulver wurden als ein Zusatz für Joghurt in Zugaberaten von 2,5% und 5% des endgültigen Joghurts verwendet und führten zu einer erhöhten Cremigkeit und verbesserten die Textur im Vergleich mit der Kontrolle.
Beispiel 7
Die in Beispiel 5 hergestellten Hydrolysatpulver wurden als die Proteinquelle in einem Rezept für einen Müsliriegel bei einer 6%- und 12%-Gew./Gew.-Zugaberate verwendet. Alle Testpersonen bevorzugten die Hydrolysatriegel gegenüber der nicht-hydrolysierten WPC-Kontrolle. Die besten Resultate wurden mit hydrolysierten ALACEN^TM 421 und einer Mischung aus ALACEN^TM 392 und Lactose erzielt, hergestellt in Beispiel 5.
Beispiel 8
Das in Beispiel 5 hergestellte Hydrolysatpulver wurde als ein Inhaltsstoff in einer Probe für ein Mahlzeitersatz-Konzept verwendet. ALACEN^TM 421, hydrolysiert in Lactose und Protein, wurde bei einer Rate von 45% Gew./Gew. zu Vollmilchpulver, Maltodextrin, Saccharose und Milchcalcium zugegeben (ALAMIN^TM), um zu einem Prototyp eines pulvrigen Mahlzeitersatzes zu führen. Im Vergleich mit einer Kontrollprobe ohne hydrolysiertes Molkeprotein wurde gefunden, daß hydrolysiertes Molkeprotein, das in Beispiel 5 hergestellt wurde, akzeptabler war.
Beispiel 9
Ein Molkeproteinnahrungsgetränk wurde formuliert, enthaltend 8% Gew./Gew. ALACEN^TM 392 oder ALACEN^TM 421 oder eine Mischung aus ALACEN^TM 392 und Lactose, hydrolysiert wie in Beispiel 5 spezifiziert. Das Getränk enthielt ebenso Saccharose, Zitronensäure, Aromen und Farbstoffe. Der pH des Getränks wurde auf 4,3 eingestellt. Das Getränk kombinierte die Ernährungs- und Gesundheitsvorteile von Molkeproteinen mit dem erfrischenden Geschmack eines nicht-alkoholischen Getränks. Im Vergleich mit einem Getränk, das eine unbehandelte Molkeproteinkontrolle enthielt, war die pH-Stabilität verbessert, und das Getränk hatte eine stärkere milchartige Erscheinung als die Kontrolle.
Beispiel 10
Ein weiteres Nahrungsproteingetränk wurde formuliert, enthaltend 12,5% Gew./Gew. an ALACEN^TM 421, hydrolysiert wie in Beispiel 5 in Wasser, gemischt mit pasteurisierter Vollmilch. Saccharose wurde zugegeben, um 6% der endgültigen Formulierung zu ergeben, ebenso wie ein Stabilisator. Das Getränk wurde, sofern erwünscht, mit Banane, Vanille oder ähnlichen Geschmacksrichtungen aromatisiert. Um eine ausgedehnte Haltbarkeit zu erzielen, wur de das Getränk auf 140°C für 3 Sekunden ultrahocherhitzt. Die mittlere Partikelgröße bleibt bei 3 Mikron nach der zusätzlichen UHT-Hitzebehandlung.
Beispiel 11
Die Hydrolyse wurde durchgeführt, wie in Beispiel 5 spezifiziert, aber anstatt ALACEN^TM 421-Pulver zu rekonstituieren, wurde ein frischer Rückstand von ALACEN^TM auf 30% Feststoffgehalt in der Lösung aufkonzentriert. Die Neutrase-Zugaberate wurde auf 0,9% Gew./Gew. (auf einer Proteinbasis) variiert, die Lactasekonzentration war wie spezifiziert. Die Reaktionsmischung wurde bei 15% Feststoffgehalt nach 2 h inaktiviert. Die ACE-I-Aktivität ergab 0,480 g/l. Die organoleptischen Eigenschaften, Partikelgröße und Nahrungsverabreichung waren Beispiel 4 und 5 sehr ähnlich.
Beispiel 12
Die Hydrolyse wurde durchgeführt, wie in Beispiel 4 mit ALACEN^TM 421-Pulver spezifiziert. Die Neutrase-Zugaberate wurde auf 0,9% Gew./Gew. (einer Proteinbasis) variiert. Die Lactose wurde mit einer Lactase aus Aspergillus oryzae umgewandelt (Pilz-Lactase 30.000, Kyowa Enzymes Co. Ltd. Japan) bei einer Zugaberate von 0,4% Gew./Gew. (auf einer Lactosebasis). Die Reaktionsmischung wurde nach 1,5 h mit einer direkten Dampfinjektion inaktiviert, um eine Temperatur von 88°C für entweder 1,5 Sekunden oder 3 Sekunden zu erzielen.
Die Partikelgröße betrug 2,3 Mikon. Organoleptische Eigenschaften und Nahrungsverabreichung waren sehr ähnlich dem Produkt aus Beispiel 4.
Beispiel 13
Eine 10% Gew./Gew.-Lösung von ALACEN^TM wurde mit einer kommerziellen Protease aus Bacillus subtilis-Neutrase (Novo Nordisk, Dänemark) bei einer Enzymkonzentration von 0,9% Gew./Gew. hydrolysiert. Die Reaktion wurde für 6 h bei 50°C fortgesetzt. Proben von 200 ml wurden alle 1h entnommen, bei 88°C für 8 Sekunden inaktiviert und darauffolgend gefriergetrocknet.
ACE-I-Aktivität, Hydrolysegrad, pH der Lösung und die Bitterkeit entwickelten sich mit der Zeit wie folgt. Je höher der Bitterkeitwert war, desto bitterer ist der Geschmack. Je geringer die gemessene Konzentration, desto höher ist die ACE-I-Aktivität.
TABELLE 1: Hydrolyse von ALACEN^TM 392 WPC
Beispiel 14
Eine 10% Gew./Gew.-Lösung von ALACEN^TM 392 wurde mit der den folgenden kommerziellen Proteasen bei 1% Gew./Gew., 50°C für 1 h hydrolysiert. Die Reaktion wurde bei 88°C für 8 Sekunden inaktiviert, und darauffolgend wurde das Hydrolysat gefriergetrocknet.
TABELLE 2: Hydrolyse mit unterschiedlichen Enzymen
Beispiel 15
Identifizierung von ACE-I-Peptiden und Messen ihrer Aktivitäten.
200 mg Permeat aus Beispiel 3 wurde in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) aufgelöst und auf eine präparative Jupiter-Umkehrphasen-HPLC-Säule (10 Mikron, C18, 22 × 250 mm [Phenomenex NZ]), äquillibriert mit Lösungsmittel A (0,1 % TFA), aufgetragen und mit einem FPLC-System (Pharmacia) verbunden. Peptide wurden sequentiell von der Säule mit einem Gradient von 0 bis 43% Lösungsmittel B (0,08% TFA in Acetonitril) in 245 min bei einer Durchflußrate von 10 ml/min eluiert. Peptide, die von der Säule eluierten, wurden durch Überwachung der Extinktion des Eluats bei 214 nm nachgewiesen. Das Eluat wurde mit einem automatischen Fraktionssammler eingesammelt, der eingestellt wurde, 3 min-Fraktionen zu sammeln.
Jede Fraktion wurde lyophilisiert, und die Menge an Peptidmaterial, die vorhanden war, wurde gravimetrisch gemessen. Fraktionen wurden auf ACE-I-Aktivität unter Verwendung eines In-vitro-Assay-Systems getestet (Reagenzien von Sigma Produkt 305-10), bestehend aus Kaninchenlungen-ACE und dem kolorimetrischen ACE-Substrat Furylacryloylphenylalanylglycylglycin (FAPGG) getestet; ACE hydrolysiert FAPGG, um die Produkte FAP und GG zu ergeben, was zu einer Abnahme der Extinktion bei 340 nm führt. Wenn ein Peptid ACE inhibiert, wird die Veränderung in der Extinktion bei 340 nm verringert. Fraktionen, enthaltend die höchste ACE-inhibitorische Aktivität pro mg Peptidmaterial wurden erneut auf die präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgetragen und unter Verwendung eines flachen Gradienten von Lösungsmittel B eluiert, d.h. 0,09% Zunahme an Lösungsmittel B Konzentration/min. Das Eluat wurde unter Verwendung des Fraktionssammlers eingesammelt, der eingestellt war, um 0,5-min-Fraktionen zu sammeln.
Proben aus jeder Fraktion wurden unter Verwendung einer analytischen Umkehrphasen-HPLC-Säule analysiert, und diejenigen Fraktionen, die ein einzelnes identisches Peptid enthielten, wurden vereinigt. Jede vereinigte Fraktion wurde lyophilisiert, und das Gewicht des vorhandenen Peptids wurde gravimetrisch bestimmt. Die aufgereinigten Peptide wurden auf ACE-I-Aktivität wie zuvor getestet, und der IC₅₀ wurde für jedes individuelle Peptid berechnet.
Das Molekulargewicht jeden Peptids wurde mittels Elektrosprayionisierungsmassenspektrometrie bestimmt (Sciex API 300 Dreifachquadrupol-Massenspektrometer). Tandem-Massenspektrometrie wurde ebenso für jedes Peptid durchgeführt, um CAD-Spektren unter Verwendung von MSMS-Experiment-Scans zu erzeugen. Jedes Peptid wurde ebenso mit einem automatisierten N-terminalen Sequenzierer analysiert (ABI-Proteinsequenzierer Modell 476A). Daten, gesammelt aus allen drei Techniken, wurden verwendet, um die Sequenz aller Peptide zu ermitteln, die ACE-I-Aktivität besitzen. Der Ursprung jedes der aktiven Peptide wurde bestimmt durch Recherchieren einer Datenbank, enthaltend die bekannten Sequenzen aller bovinen Milchproteine.
Die Peptide, ihre Ursprünge, Aktivitäten und bekannten Ähnlichkeiten werden in Tabelle 3 dargestellt. Obwohl die letzten drei Peptide aus einem Casein stammen, waren sie aus einem Molkeproteinhydrolysat. Das Lab, das zum Fällen des Caseins verwendet wurde, fällte diese Caseinfraktionen nicht aus, und sie verblieben bei den Molkeproteinen.
TABELLE 3: ACE-I-Peptide und ihre Aktivitäten
Beispiel 16
Der Effekt des in Beispiel 3 hergestellten Hydrolysatpulvers (ohne Ultrafiltration) auf in-vivo-Blutdruck wurde getestet unter Verwendung von spontan zu Bluthochdruck neigenden Ratten (SHR/N) („spontaneously hypertensive"). Der Rattenstamm ist spezifisch auf die Entwicklung von hohem Blutdruck bei der Reifung ausgewählt worden und wird in großem Umfang verwendet, um den Effekt von blutdrucksenkenden Mitteln zu überwachen. Sie wurden von Animal Resources Center, POX 1180 Canning Vale, Western Australia 6155, erworben.
Acht Wochen alte Ratten wurden individuell in Plastikrattenkäfigen untergebracht und während des gesamten Versuchs in Temperatur-kontrollierten Räumlichkeiten gehalten. Sie hatten unbeschränkten Zugang zu Wasser und bekamen kommerzielles Rattenfutter ad libitum gefüttert. Die Testprodukte wurden oral als eine einzelne tägliche Dosis für 8 Wochen verabreicht, währenddessen Veränderungen im Blutdruck überwacht wurden. Ihr Blutdruck wurde unter Verwendung eines speziell entworfenen Schwanzmanschetten- und Blutdrucküberwachungsgeräts gemessen (IITC Inc., Life Science Instruments, 23924 Victory Blvd, Woodland Hilld, CA 91367). Dem experimentellen Design wurde von dem Massey University Animal Ethics Committee, Protokoll-Nr. 98/141, zugestimmt.
Die Veränderungen im systolischen Blutdruck von jeder Gruppe von Tieren über die acht Wochen werden in 2 (als die kleinsten Fehlerquadrate) aufgetragen. Das Hydrolysat sowohl bei 2 g/kg Körpergewicht/Tag und 4 g/kg Körpergewicht/Tag senkte den systolischen Blutdruck von SHRs signifikant ab im Vergleich mit Tieren, die nur kommerzielles Rattenfutter gefüttert bekamen (p<0,004 mittels kleinster Fehlerquadratanalyse, siehe 3). Der Effekt des Hydrolysats war nicht so groß wie der von Captopril, einer bekannten ACE-I-inhibitorischen Arznei, die bei 30 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht wurde, war aber eine signifikante Verbesserung für Tiere, die nur ein kommerzielles Rattenfutter gefüttert bekamen.
LITERATURANGABEN

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Claims

Verfahren zum Herstellen eines Molkeproteinhydrolysats, enthaltend bioaktive Peptide, umfassend das Hydrolysieren eines Molkeprotein-enthaltenden Substrats mit einem oder mehreren Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß i) das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Protease P6, Protease A, Protease M, Peptidase, Neutrase, Validase und AFP 2000, ii) die Hydrolyse bei einer Temperatur von zwischen 20°C und 65°C durchgeführt wird, bei einem pH von 3,5 bis 9, wenn besagtes Enzym eine neutrale Protease ist, und bei einem pH von 2,5 bis 6, wenn besagtes Enzym eine saure Protease ist, und bei einem pH von 5 bis 10, wobei besagtes Enzym eine alkalische Protease ist, iii) die Hydrolyse beendet wird, wenn ein Hydrolysegrad von nicht größer als 10% erreicht worden ist, und iv) die Hydrolyse durch Erhitzen besagten Hydrolysats für eine bis zehn Sekunden auf eine Temperatur zwischen 85°C und 100°C beendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagtes Substrat Süßmolke oder Süßmolkenproteinkonzentrat ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagtes Enzym auf einem inerten Träger während besagten Hydrolyseschritts ii) immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei besagter inerter Träger Roehn Bupergit, Carrageenanpartikel, Chitosanpartikel oder jedes andere geeignete inerte Trägermaterial ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Hydrolysegrad 3-5% ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Substrat ebenso Lactose enthält, in einer Menge von ungefähr 5 Gew.% oder höher.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei besagter Lactosegehalt ungefähr 10 Gew.% oder höher ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Menge an Lactose, die in dem Substrat vorhanden ist, bis ungefähr 30 Gew.% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Menge an Lactose, die in dem Substrat vorhanden ist, bis ungefähr 50 Gew.% beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Substrat ebenso mit Lactase und/oder β-Galactosidase behandelt wird, entweder vor, während oder nach der Molkeproteinhydrolyse, um die Lactose zu Galactose und Glucose zu hydrolysieren und Galacto-Oligosaccharide zu synthetisieren.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das so hergestellte Hydrolysat ein oder mehrere der bioaktiven Peptide enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus AFE, LFSH, ILKEKH, LIVTQ, MKG, LDIQK, VF, ALPMH, VTSTAV, LHLPLP, LVYPFPGPIPNSLPQNIPP und LFRQ.
Ein nicht-bitteres Molkeproteinhydrolysat, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Produkt nach Anspruch 12, wobei der Hydrolysegrad der Molkeproteine 3 bis 5% beträgt.
Produkt nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei die mittlere Partikelgröße der Molkeproteine in dem Produkt weniger als ungefähr 30 Mikron beträgt.
Produkt nach Anspruch 14, wobei besagte mittlere Partikelgröße weniger als ungefähr 3 Mikron beträgt.
Produkt nach einem der Ansprüche 12 bis 15, das ein im wesentlichen weißes Erscheinungsbild hat.
Produkt nach einem der Ansprüche 12 bis 16, das ebenso Galactooligosaccharide enthält.
Produkt nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei ein oder mehrere besagter bioaktiver Peptide ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus AFE, LFSH, ILKEKH, LIVTQ, MKG, LDIQK, VF, ALPMH, VTSTAV, LHLPLP, LVYPEPGPIPNSLPQNIPP und LFRQ.
Nahrungsprodukt, enthaltend ein Molkeproteinhydrolysat nach einem der Ansprüche 12 bis 18.
Ein beliebiges oder eine beliebige Kombination von zwei oder mehreren der bioaktiven Peptide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus AFE, LFSH, ILKEKH, LIVTQ, MKG, LDIQK, ALPMH, VTSTAV, LVYPFPGPIPNSLPQNIPP und LFRQ.
Molkeproteinhydrolysat, enthaltend ein oder mehrere der bioaktiven Peptide nach Anspruch 20.