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DE69837975T2 - Diagnostisches Abbildungsverfahren - Google Patents

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DE69837975T2
DE69837975T2 DE69837975T DE69837975T DE69837975T2 DE 69837975 T2 DE69837975 T2 DE 69837975T2 DE 69837975 T DE69837975 T DE 69837975T DE 69837975 T DE69837975 T DE 69837975T DE 69837975 T2 DE69837975 T2 DE 69837975T2
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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf diagnostische Bilderzeugungstechniken, mit denen ein Krankheitszustand unter Verwenden eines Zielkontrastmittels abgebildet werden kann. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung derartiger Kontrastmittel, bei denen der Targetingvektor an Rezeptoren bindet, die mit Angiogenese assoziiert sind. Derartige Kontrastmittel können daher für die Diagnose von beispielsweise malignen Krankheiten, Herzkrankheiten, entzündungs-bezogenen Krankheiten, rheumatoider Arthritis und Kaposi-Sarkom verwendet werden.
  • Neue Blutgefäße können durch zwei verschiedene Mechanismen gebildet werden:
    Vaskulogenese oder Angiogenese. Angiogenese ist die Bildung neuer Blutgefäße durch Abzweigung von existierenden Gefäßen. Der primäre Stimulus für diesen Prozess kann eine unangemessene Versorgung von Zellen in einem Gewebe mit Nährstoffen und Sauerstoff (Hypoxia) sein. Die Zellen können durch Absondern von angiogenen Faktoren reagieren, von denen es viele gibt; ein Beispiel, auf das häufig Bezug genommen wird, ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF). Diese Faktoren initiieren die Sekretion von proteolytischen Enzymen, die die Proteine der Basalmembran zerlegen, wie auch Inhibitoren, die die Wirkung dieser möglicherweise schädlichen Enzyme beschränken. Die andere herausragende Wirkung von angiogenen Faktoren ist es, endotheliale Zellen zu veranlassen, dass sie wandern und sich teilen. Endotheliale Zellen, die an die Basalmembran gebunden sind, die ein kontinuierliches Stück um Blutgefäße auf der kontraluminalen Seite bildet, durchlaufen keine Mitose. Die kombinierte Wirkung des Verlustes der Bindung und der Signale von den Rezeptoren für angiogene Faktoren ist, dass die endothelialen Zellen veranlasst werden, sich zu bewegen, zu vervielfachen und sich selbst wieder anzuordnen, und schließlich eine Basalmembran um die neuen Gefäße zu synthetisieren.
  • Angiogenese ist herausragend beim Wachstum und der Remodellierung von Geweben, einschließlich der Wundheilung und entzündlicher Prozesse. Tumore müssen Angiogenese initiieren, wenn sie eine Millimetergröße erreichen, um ihre Wachstumsgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten. Da die Angiogenese von charakteristischen Änderungen in den endothelialen Zellen und ihrer Umgebung begleitet ist, ist dieser Prozess ein vielversprechendes Ziel für die therapeutische Intervention. Die Inhibierung von Angiogenese wird auch als eine vielversprechende Strategie für eine Antitumortherapie betrachtet. Die Transformationen, die Angiogenese begleiten, sind auch sehr vielversprechend für die Diagnose, ein offensichtliches Beispiel ist die maligne Krankheit, aber das Konzept berechtigt auch zu großen Hoffnungen bei einer Entzündung und einer Vielzahl von entzündungs-bezogenen Krankheiten, einschließlich Atherosklerose, wobei die Makrophagen von frühen atherosklerotischen Läsionen mögliche Quellen von angiogenen Faktoren sind. Diese Faktoren können auch in die Revaskularisation von Teilen des Myokards, die von einen Infarkt betroffen sind, involviert sein, was auftritt, falls eine Stenose innerhalb kurzer Zeit gelöst wird.
  • Bei der Angiogenese sind Rezeptoren involviert, die für endotheliale Zellen einmalig sind. Die Oberfläche dieser Zellen wird bei der Vorbereitung für die Migration remodelliert und verborgene Strukturen werden freigelegt, wo die Basalmembran abgebaut wird, zusätzlich zu der Vielzahl von Proteinen, die beim Bewirken und Kontrollieren der Proteolyse involviert sind.
  • Eine Anzahl bekannter Rezeptoren/Targets, die mit Angiogenese assoziiert sind, sind unten in Tabelle 1 aufgelistet. Im Falle von Tumoren ist das resultierende Netzwerk von Blutgefäßen üblicherweise disorganisiert mit der Bildung von scharfen Knicken und auch arteriovenösen Shunts. Unter Verwenden der Targetingprinzipien, die in der vorliegenden Offenbarung beschrieben werden, kann Angiogenese durch die Mehrzahl der Bilderzeugungsmodalitäten, die in der Medizin verwendet werden, detektiert werden. Tabelle 1 Rezeptoren/Targets, assoziiert mit Angiogenese
    Rezeptoren/Targets α2-Antiplasmin Basalmembrankomponenten basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Biglycan (Dermatansulfatproteglycan) Cartilage-derived Inhibitor [Inhibitor] CD34 Collagen Typ I, IV, VI, VIII Decorin (Dermatansulfatproteoglycan) Dermatansulfatproteoglycane Endoglin Endosialin Endothelin epidermaler Wachstumsfaktor (Heparin-bindend) Fibrin Fibrinopeptid B Fibroblast Growth Factor, FGF-3, basic Fibronectin Flt-1/KDR, Flt-4 (VEGF-Rezeptor) FLT-1 (fms-ähnliche Tyrosinkinase) (VEGF-A-Rezeptor) Heparansulfat Hepatozyt-Wachstumsfaktor Hepatozyt-Wachstumsfaktorrezeptor (c-met) Hyaluronan Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor/Mannose-6-Phosphatrezeptor
    Integrine: β3 und β5, Integrin αvβ3, Integrin α6β1 (Lamininrezeptor), Integrin α6, Inregrin β1, Integrin α2β1, Integrin α5 (Untereinheit des Fibronectinrezeptors), Integrin αvβ5, Fibrinrezeptoren Interferon-α, -β [Inhibitoren] Interleukine: IL-8, IL-12 [Inhibitoren] Jagged Gene Product Laminin Lamininfragmente Leukämie inhibierender Faktor Ly-6 (ein Lymphozytenaktivierungsprotein) Matrixmetalloprotease-2 Metalloproteinasen Metalloproteinaseinhibitoren MHC Klasse II Notch Gene Product Plazental Growth Factor platzentales Proliferin-bezogenes Protein Plasminogen Plasminogenaktivator Plasminogenaktivatorinhibitor-1 Plasminogenaktivatorrezeptor Platelet-derived Growth Factor (z.B. Typ BB) Platelet-derived Endothelial Cell Growth Factor Platelet Factor 4 [Inhibitor] Pleiotropin Proliferin, Proliferin-bezogenes Protein Rezeptortyrosinkinasen Selektine: E-Selektin SPARC Stressproteine (molekulare Charperone) (Glucose-reguliert, Heat Shock Families) Syndecan
    Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen (z.B. TIMP-2) Thrombin Thrombinrezeptor aktivierendes Tetradecapeptid Thrombospondin [Inhibitor] TIE-Rezeptoren (Tyrosinkinasen mit Ig- und EGF-ähnlichen Domänen) Gewebefaktor transformierender Wachstumsfaktor-α, β Tumorwachstumsfaktor-α Tumornekrosefaktor Urokinase-artiger Plasminogenaktivator-Rezeptor vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-A auf vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor bezogenes Protein vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor A-Rezeptor Vitronectin von Willebrand-Faktor
    • Anmerkung: Viele Hormone, Wachstumsfaktoren und andere Verbindungen, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, können als Vektoren wirken durch Binden an ihre Rezeptoren, oder, wenn sie bereits an die Zelloberfläche gebunden sind, sind sie Targets für Vektoren, die an sie binden, z.B. Antikörper.
  • Wie oben erläutert sind viele unerwünschte Zustände mit Neovaskularisation oder Angiogenese, der Entwicklung oder Proliferation neuer Blutgefäße assoziiert. Beispiele für derartige Zustände sind unten in Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 2 – Krankheiten und Indikationen, assoziiert mit Angiogenese
    Krankheiten/Indikationen
    arteriovenöse Missbildungen Astrozytome Atherosklerose Brustkrebsarten Choriokarzinome kolorektale Krebsarten Gingivitis Glioblastome Gliome Hämangiome (Kindheit, kapillar) Hepatome Hyperplastisches Endometrium Entzündung (z.B. chronisch) Ischämisches Myokard Kaposi-Sarkom Lungenkrebsarten Maculadegeneration Melanom Metastasen Neuroblastome Occluding Peripheral Artery Disease Osteoarthritis Ovarialkrebsarten Pankreaskrebsarten Prostatakrebsarten Psoriasis Retinopathia (Diabetika, proliferative) rheumatoide Arthritis Sklerodermie Seminomarten Hautkrebsarten Bildung eines festen Tumors Colitis ulcerosa
  • Die Oberflächenzellen, endothelialen Zellen, von derartigen neuen Blutgefäßen haben Konzentrationen verschiedener Oberflächen- oder Transmembranrezeptoren, die größer sind als normal, wie beispielsweise Rezeptortyrosinkinasen (RTK), und es wurde vorgeschlagen, radiomarkierte oder Chromophor-markierte Antikörper gegen derartige Rezeptoren zu verwenden, oder auf ähnliche Weise markierte Analoga von natürlichen Proteinliganden für derartige Rezeptoren, als ein Mittel zum Detektieren der Zentren von Angiogenese (siehe z.B. WO95/26364 (Orion), WO96/30046 (Genentech) und WO95/1 2414 (Repligen)).
  • Peptidische Liganden haben jedoch relativ wenig Bindungsstellen für detektierbare Marker (Reporter) und die Bindung von Reportern an viele Stellen auf derartigen peptidischen Liganden wird die Konformationen beeinflussen, die der Ligand annehmen kann. Ein weiteres Problem mit Peptiden ist, dass sie in vivo oft instabil sind.
  • Es gibt deshalb immer noch eine Notwendigkeit für Verfahren, die Bilder erzeugen, in denen wirksame zielausgerichtete Kontrastmittel mit Affinitäten für mit Angiogenese assozierte Rezeptoren verwendet werden.
  • Daher stellt die Erfindung, ausgehend von einem Aspekt, ein Verfahren zum Erzeugen eines Bildes eines lebenden menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Subjektes bereit, dem zuvor ein Kontrastmittel verabreicht worden ist, umfassend Erzeugen eines Bildes mindestens eines Teils des Subjekts, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontrastmittel eine Zusammensetzung eines Materials der Formel (I) ist, V-L-R (I) wobei V eine Vektoreinheit mit einer Affinität für einen angiogenese-bezogenen endothelialen Zellrezeptor ist, L eine Linkereinheit oder eine Bindung ist und R eine detektierbare Einheit ist, dadurch gekennzeichnet, dass V eine nicht-peptidische organische Gruppe ist, oder V peptidisch ist und R eine makromolekulare oder teilchenförmige Spezies ist, die eine Vielzahl von Markern vorsieht, die in einer in-vivo-Bilderzeugung detektierbar sind.
  • Wo R eine makromolekulare oder teilchenförmige Spezies ist, die eine Vielzahl von Markern bereitstellt, können diese Marker sein, die individuell detektierbar sind (z.B. paramagnetische oder radioaktive Spezien) oder sie können Wechselwirken, um ein detektierbares Material zu erzeugen, z.B. mittels eines kooperativen magnetischen Phänomens. Beispiele derartiger Multireporter umfassen Polychelate und polyionische Spezien und ferromagnetische, ferrimagnetische und superparamagnetische Teilchen.
  • In vielen Fällen wird die Stoffzusammensetzung der Formel I eine charakterisierbare Verbindung sein. In anderen kann sie eine Kombination von Verbindungen sein, die gebunden oder andernfalls miteinander assoziiert, z.B. konjugiert sind. Der Einfachheit halber wird die Stoffzusammensetzung im Folgenden als ein Mittel bezeichnet.
  • Kontrastmittel, umfassend Gas-enthaltende Reporter, sind beschrieben in unserer parallel anhängigen Internationalen Patenanmeldung Nr. PCT/GB97/02958 , eingereicht am 28. Oktober 1997.
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes eines lebendigen menschlichen oder nicht-menschlichen (bevorzugt Säuger oder Vogel) tierischen Subjektes, dem zuvor ein Kontrastmittel verabreicht worden war, z.B. in das vaskuläre System oder den Gi-Trakt, und zur Erzeugung eines Bildes mindestens eines Teils des Subjektes, an das das Kontrastmittel verabreicht wurde, z.B. durch Röntgenstrahlung, MR, Ultraschall, Szintigraphie, PET, SPECT, Electrical Impedance, licht- oder magnetometrische Bilderzeugungsmodalitäten, dadurch gekennzeichnet, dass als das Kontrastmittel ein Mittel der Formel I verwendet wird.
  • Von einem weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zum Überwachen des Effekts einer Behandlung eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Subjekts mit einem Arzneimittel, um einen mit Angiogenese verbundenen Zustand zu bekämpfen z.B. ein zytotoxisches Mittel, wobei das Verfahren umfasst Detektieren der Aufnahme einer zuvor verabreichten Zusammensetzung der Formel I V-L-R (I)wobei V eine Vektoreinheit mit einer Affinität für einen Angiogenese-bezogenen endothelialen Zellrezeptor ist, L eine Linkereinheit oder eine Bindung ist, und eine detektierbare Einheit ist, dadurch gekennzeichnet, dass V eine nicht-peptidische organische Gruppe ist, oder V peptidisch ist und R eine makromolekulare oder teilchenförmige Spezies ist, die eine Vielzahl von Markern bereitstellt, die in der in-vivo-Bildgebung detektierbar sind, durch Angiogenese-bezogene endotheliale Zellrezeptoren, durch Erzeugen eines Bildes mindestens eines Teils des Subjekts, wobei die Verabreichung und Detektion gegebenenfalls, aber bevorzugt wiederholt bewirkt wird, z.B. vor, während oder nach der Behandlung mit dem Arzneimittel.
  • Die Mittel der Formel I haben drei charakteristische Komponenten: einen Vektor (V); einen Linker (L); und einen Reporter (R). Der Vektor muss die Fähigkeit haben, die Verbindung in einen Bereich der Angiogenese ins Ziel zu bringen, der Reporter muss in einer in vivo-Diagnosebilderzeugungsprozedur detektierbar sein; und der Linker muss den Vektor an den Reporter koppeln, zumindest bis der Reporter an den Bereich der Angiogenese geliefert wurde, und bevorzugt bis die Bilderzeugungsprozedur abgeschlossen ist.
  • Vektoren
  • Als der Vektor kann eine beliebige peptidische oder bevorzugter nicht-peptidische Verbindung mit einer Affinität für Rezeptoren, assoziiert mit Angiogenese, verwendet werden.
  • Nicht-peptidische Verbindungen werden bevorzugt verwendet, da peptidische Vektoren im Allgemeinen eine schlechte biologische Stabilität besitzen werden und unerwünschte Reaktionen des Körpers provozieren können.
  • Bevorzugt ist der Vektor eine Verbindung, die keinerlei nicht akzeptable biologische Reaktion auslöst, insbesondere eine Verbindung, die tatsächlich nicht Angiogenese fördert.
  • Besonders bevorzugt ist der Vektor ein Angiogeneseinhibitor, insbesondere bevorzugt ein nicht-peptidischer Angiogeneseinhibitor.
  • Beispiele von nicht-peptidischen Angiogeneseinhibitoren werden in WO94/17084 (British Biotech), EP-A-618208 (Daiichi), WO94/13277 (ICRT), WO95/06473 (Nippon Kayaku), WO94/21612 (Otsuka), WO97/37655 (Merck), WO97/30035 (Zeneca), EP-A-678296 (Tsumura), WO94/18967 (Harvard), WO95/08327 (Dept. of Health and Human Services) (siehe auch US-A-4590201 (Merck)) und EP-A-652000 (Eli Lilly) beschrieben.
  • Beispiele von peptidischen Angiogeneseinhibitoren werden in WO94/02446 (British Biotech), WO94/02447 (Britisch Biotech), WO94/21625 (British Biotech), WO94/24140 (British Biotech), WO95/04033 (Celltech), EP-A-589719 (Eli Lilly), US-A-5399667 (Frazier), EP-A-241830 (The General Hospital Corporation) und WO97/38009 (Merck) beschrieben.
  • Besondere Angiogeneseinhibitoren in Entwicklung umfassen jene, die unten in Tabelle 3 aufgelistet sind: Tabelle 3 – Angiogeneseinhibitoren
    Verbindung Zielindikationen Firma Bemerkungen
    Natrium-Tecogalan Kaposi-Sarkom, feste Tumoren Daiichi Sulfatierter Polysaccharidpeptidoglycankomplex
    AGM-1470 Kaposi-Sarkom, maligne Tumoren Takeda/ Abbott Fumagillin-Analogon
    00-01 Krebs Metastase Carbomed Polysaccharid-Exotoxin
    Mitoflaxon Feste Tumoren Lipha
    GM-1603 Glycomed Modifiziertes Heparin
    rPF4 Kaposi-Sarkom, Kolonkrebs, Gliom, Renalzellenkarzinom, malignes Melanom Replistatin Repligen Recombinant Human Platelet Factor-4
    MPF-4 Lilly Modified Human
    Platelet Factor-4
    rekombinantes Angiostatin EntreMed
    Endostatin Collagenfragment
    Thalidomid Gehirn, Brust- und EntreMed
    Prostatakrebs
    DC101 ImClone Monoklonaler
    Systems Antikörper
    OLX-514 feste Tumoren, Sepsis Aronex
    Raloxifenhydrochlorid Lilly
    Natrium-Suramin Metastasiertes hormonrefraktäres Prostatakarzinom Parke-Davis
    IL-12 Nierenkrebs Roche
    Marimastat Pankreas-, Lungen- und Gehirnkrebs British Biotech
    CAI Weiter Bereich von Krebsarten NCI Calcium-Kanal-Blocker
    wie auch die folgenden peptischen und nicht-peptidischen Arzneimittelverbindungen:
    Figure 00120001
    Figure 00130001
    Figure 00140001
  • Andere bekannte Verbindungen, die des Targetings von Bereichen der Angiogenese fähig sind, sind unten in Tabelle 4 aufgelistet. Tabelle 4 – Vektormoleküle mit bekannter Affinität für Rezeptoren, assoziiert mit Angiogenese
    Vektormoleküle
    Angiopoietine Angiostatin [Plasminogenfragment] [Inhibitor] Angiotensin II α2-Antiplasmin kombinatorischen Bibliotheken, Verbindungen von z.B. Verbindungen, die an die Basalmembran nach dem Abbau binden β-Cyclodextrintetradecasulfat Endoglin
    Endosialin Endostatin [Collagenfragment] epidermaler Wachstumsfaktor (Heparin-bindend) Fibrin Fibrinopeptid B Fibroblast Growth Factor, FGF-3, basic Fibronectin Fumagillin und Analoga Heparin Hepatozyt-Wachstumsfaktor Hyaluronan Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor Interferon-α, -β [Inhibitoren] Interleukine: IL-8, IL-12 [Inhibitor] Laminin, Lamininfragemente Leukämie inhibierender Faktor Linomid Matrixmetalloproteinase-2 Metalloproteinasen Metalloproteinaseinhibitoren monoklonale Antikörper zum Beispiel: gegen angiogene Faktoren oder ihre Rezeptoren oder gegen Komponenten des fibrinolytischen Systems Peptide: zum Beispiel cyclisches RGD0FV Plazental Growth Factor plazentales Proliferin-bezogenes Protein Plasminogen Plasminogenaktivator Plasminogenaktivatorinhibitor-1 Antagonisten des Platelet Activating Factor [Inhibitoren] Platelet-derived Growth Factor (z.B. Typ BB) Platelet-derived Growth Factor-Rezeptoren
    Platelet-derived Endothelial Cell Growth Factor Pleiotropin Proliferin, Proliferin-bezogenes Protein Selektine: E-Selektin SPARC Snake Venome (RGD-enthaltend) Substanz P (ein Neuropeptid: Neurokinin) Suramin Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen (z.B. TIMP-2) Thalidomid Thrombin Thrombinrezeptor-aktivierendes Tetradecapeptid Transformierender Wachstumsfaktor-α, -β Rezeptor des transformierenden Wachstumsfaktors Tumorwachstumsfaktor-α Tumornekrosefaktor Vitronectin Anmerkung: Viele Hormone, Wachstumsfaktoren und andere Verbindungen, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, können als Vektoren durch Binden an ihre Rezeptoren wirken, oder, wenn sie bereits an die Zelloberfläche gebunden sind, sind sie Targets für Vektoren, die an sie binden, z.B. Antikörper.
  • Auf ähnliche Weise können die Verbindungen, die in WO95/08327 beschrieben sind, als Vektoren verwendet werden (siehe auch Kohn et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 1307-1311 (1995) und J. Clin. Oncol. 15: 1985-1993 (1997)).
  • Besondere Beispiele von Vektorverbindungen, die in einigen der oben erwähnten Patentveröffentlichungen erwähnt werden, sind wie folgt:
    WO95/08327 (Dept. of Health and Human Services) beschreibt Angiogeneseinhibitorverbindungen der Formeln I und II: Y-(CH2)p-Ar1-X-Ar2 (II) wobei
    Ar1 und Ar2 aromatische Gruppen sind und verschieden oder dieselben sein können; und X eine verbindende Gruppe ist, z.B. o, S, SO2, CO, CHCN, Alkyl, Alkoxy oder Alkoxyalkyl, und
    Figure 00170001
    wobei
    A für N oder CH steht; R1 für H, -CONH, -CONHR5, COOH, -COOR5, SO2NH2 steht; R2 für H, NH2, NHCOPh, -NHCOR5, -NHCHO, -NHR5, -N(R5)2 steht; und R5 ein Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist, z.B.
  • Figure 00170002
  • WO95/06473 (Nippon Kayaku Kabushiki Kasai) offenbart Antitumor- und Angiogeneseinhibitorverbindungen der Formeln 1 und 2:
    Figure 00170003
    wobei
    X für O, COO steht; und M ein Übergangsmetall ist; und
    Figure 00180001
    wobei
    X1 und X2 substituierte oder unsubstituierte Phenyl- oder Naphthylgruppen sind; Y1 und Y2 Halogenatome, Aminogruppen oder mono- oder di-substituierte Aminogruppen sind; und Z für NHC2H4NH steht oder ein substituierter oder unsubstituierter aromatischer Diaminrest ist, z.B.
  • Figure 00180002
  • WO95/04033 (Celltech Limited) offenbart die folgenden Angiogeneseinhibitoren:
    Figure 00190001
    wobei R1 =
    Figure 00190002
    R3 für H, Halogen oder CH3, CF3 oder OCH3 steht; R2 für H oder CH3 steht, z.B. N4-Hydroxy-N1-(1-(S)-carbamoyl-2,2-dimethylpropyl)-2-(R)-4(chlorophenylpropyl)succinamid; N4-Hydroxy-N1-(1-(S)-carbamoyl-2,2-dimethylpropyl)-2-(R)-(4-methylphenylpropyl)succinamid; N4-Hydroxy-N1-(1-(S)-carbamoyl-2,2-dimethylpropyl)-2-(R)-(4-methoxyphenylpropyl)succinamid; und N4-Hydroxy-N1-(1-(S)-carbamoyl-2,2-dimethylpropyl)-2-(R)-(4-trifluormethylphenylpropyl)succinamid.
  • EP 241830 (The General Hospital Corporation) offenbart die Reinigung des Hepatoma-derived Growth Factors (HDGF), welcher ein endotheliales Mitogen und ein leistungsfähiger angiogener Faktor ist. Die Verwendung von HDGF beim Kontrollieren von Angiogenese und Detektieren von krebsartigen Lebertumoren durch Verwendung eines immunodiagnostischen Assays wird auch beschrieben. Das HDGF-Peptidfragment besitzt eine N-terminale Aminosäuresequenz, worin die ersten 16 Aminosäuren sind:
    leu-pro-ala-leu-pro-glu-asp-gly-gly-xx-gly-ala-phe-pro-pro-gly
    (xx = unidentifizierte Aminosäureeinheit).
  • Ein HDGF-Peptidfragment ist auch offenbart, das eine N-terminale Aminosäureextensionssequenz besitzt, die umfasst:
    (ala/ser)-(leu/arg)-pro-(ala/gly)-(leu/pro)-ala-gly-thr-met-ala-(ala)-gly-ser-(isoleu)-thr-thr-leu
  • EP 652000 (Eli Lilly and Company) offenbart Angiogeneseinhibitor- und Inhibitorverbindungen angiogener Krankheiten mit der Formel:
    Figure 00200001
    wobei
    R1 und R3 für H, Me, -C(O)(C1-C6 Alkyl), -C(O)Ar stehen; Ar optional substituiertes Phenyl ist; und R2 Pyrrolidino oder Piperidino ist, z.B.
  • Figure 00200002
  • EP 652000 [589719?] (Eli Lilly and Company) offenbart einen modifizierten Platelet Factor-4 mit der Aminosäuresequenz:
  • MPF-4
    • NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH
  • CPF-4
    • NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH-disulfid, gebunden an ein zweites Protein mit der Aminosäuresequenz NH2-Glu-Ala-Glu-Glu-Asp-Gly- Asp-Leu-Gln-Cys-Leu-Cys-Val-Lys-Thr-Thr-COOH. Es gibt Disulfidbrücken zwischen Cys-20 von MPF-4 und Cys-10 des genannten zweiten Proteins und zwischen Cys-36 von MPF-4 und Cys-12 des genannten zweiten Proteins.
  • WO94/13277 (Imperical Cancer Research Technology Limited) offenbart die Verwendung von Verbindungen der Formel I:
    Figure 00210001
    wobei
    R1 bis R4 jeweils unabhängig für eines oder mehrere von -X, N3, -NO2, Halo, Trifluormethyl, R5, OR5, -CH2OR6, -OCOR5, -CH2COOR5, -NHCOR5, -CH2NHCOR5, -NR5R6, -CH2NR5R6, -CH2NO2, CONR5R6, CH2CONR5R6, -COOR5, -CH3COOR5, -CHO und CH2CHO steht und -X unabhängig für -SO3R5, -CH2PO3R5R6, -CH2O3R5, -OSO3R5, -CH2OSO3R5, -NHSO3R5, -CH2NHSO3R5, OPO3R5R6, -CH2OPO3R5R6 und -PO3R5R6 steht, wobei R5 und R6 unabhängig aus -H und Niederalkyl ausgewählt sind und wobei A eine chemische Gruppe ist, die mindestens 5 bis nicht mehr als 30 Bindungen umfasst, die die Naphthylgruppen direkt verbinden, vorausgesetzt, dass (i) die Verbindung nicht Suramin ist und (ii) wenn A nicht
    Figure 00210002
    ist, wobei
    m und n unabhängig 0, 1 oder 2 sind, dann mindestens eine von R1 bis R4 für -OH oder eine saure Gruppe steht; und der pharmazeutisch annehmbaren Salze, Ester, Salze derartiger Ester oder Amide derartiger Verbindungen.
  • Es werden auch Verbindungen beschrieben, in denen die Verbindung von A zum Naphthylring über eine Amid- oder Sulfonamidgruppe stattfindet. Außerdem kann A in einigen Fällen eine Gruppe der Formel II sein. A kann auch von geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen, Arylgruppen, Alkylarylgruppen, aliphatischen Dicarbonsäuren, Polgenen und Derivaten davon und Polyolen und Derivaten davon ausgewählt sein. Einige weitere Verbindungen besitzen die Formeln:
    Figure 00220001
    Figure 00230001
    Figure 00240001
  • EP 678296 (Tsumura & Co.) offenbart Angiogeneseinhibitoren der allgemeinen Formeln:
    Figure 00240002
    z.B.
  • Figure 00240003
  • Figure 00250001
  • WO94/18967 (President and Fellows of Harvard College) offenbart eine Klasse von Imidazolen, die Angiogenese inhibieren:
    Figure 00250002
  • EP-A-618208 (Daiichi Pharmaceutical) offenbart Verbindungen der Formel:
    Figure 00250003
    z.B.
  • Figure 00260001
  • WO94/02446 (British Biotechnology Limited) offenbart Verbindungen der Formel:
    Figure 00260002
    z.B.
  • Figure 00270001
  • WO94/02447 (British Biotechnology Limited) offenbart Verbindungen der Formel:
    Figure 00270002
    z.B.
  • Figure 00270003
  • WO 94/21625 (British Biotechnology Limited) offenbart Verbindungen der Formel:
    Figure 00280001
    z.B.
  • Figure 00280002
  • WO94/24149 (British Biotechnology Limited) offenbart Verbindungen der Formel (I):
    Figure 00280003
    wobei
    X für -CONHOH oder COOH steht, in erster Linie gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer Gruppe der Formel (II) im Substituenten R3 und/oder R4
    Figure 00280004
    z.B.
  • Figure 00290001
  • Besonders bevorzugte Vektoren umfassen Aminosäurederivate, wie in WO94/02446 beschrieben, Hydroxamsäurederivate, wie in WO94/02447 beschrieben, Thiazolpyrimidine, wie in EP-A-618208 beschrieben, Triazole, wie in WO95/08327 beschrieben, Chinazoline, wie in WO97/30035 beschrieben, Isoindolone, wie in WO97/37655 beschrieben, Integrininhibitoren, VEGF-Antagonisten, bFGF-Antagonisten, Thrombospondin und Thrombospondinfragmente, CD36 und Wachstumsfaktoren (z.B. VEGF, bFGF, etc.).
  • CAM-D und andere in Frage kommenden Identifikations- und Evaluationstechniken wie oben erwähnt können auch verwendet werden, um weitere in Frage kommende peptidische und nicht-peptidische Vektoren zu finden oder zu bewerten.
  • Daher ist es auch möglich, Moleküle zu erhalten, die speziell an mit Angiogenese assoziierte Rezeptoren binden, durch direktes Screenen molekularer Bibliotheken. Screening peptidischer Bibliotheken kann auch verwendet werden, um allgemein wirksame peptidische Strukturen zu identifizieren, von denen nicht-peptidische Analoga durch herkömmliche oder kombinatorische Chemie erzeugt werden können. Bindungseinheiten, die auf diese Weise identifiziert sind, können an ein Linkermolekül gekoppelt werden, was ein allgemeines Werkzeug zum Binden eines beliebigen Vektormoleküls (oder -moleküle) an den Reporter bildet.
  • Vektormoleküle können aus kombinatorischen Bibliotheken erzeugt werden, ohne notwendigerweise das genaue molekulare Target zu kennen, durch funktionelles Selektieren (in vitro, ex vivo oder in vivo) von Molekülen, die an den Bereich/die Struktur, die abgebildet werden soll, binden.
  • Wie oben erwähnt, umfassen die Mittel der Formel I Vektor-, Linker- und Reportereinheiten. Eine Linkereinheit kann dazu dienen, einen Vektor mit einem Reporter zu verbinden; alternativ kann sie mehr als einen Vektor und/oder mehr als einen Reporter miteinander verbinden. Auf ähnliche Weise kann ein Reporter oder ein Vektor mit mehr als einem Linker verbunden werden. Die Verwendung einer Mehrzahl von Reportern auf diese Weise (z.B. mehrere Linker-Reportereinheiten, gebunden an einen Vektor oder mehrere Reporter, gebunden an einen Linker, der selbst an einen Vektor gebunden ist) kann ermöglichen, dass die Detektierbarkeit des Kontrastmittels vergrößert wird (z.B. durch Vergrößern der Strahlenundurchlässigkeit, der Echogenität oder der Relaxivity) oder kann ermöglichen, dass es in mehr als einer Bilderzeugungsmodalität detektiert wird. Eine Verwendung einer Mehrzahl von Vektoren auf diese Weise kann die Targetingeffizienz des Kontrastmittels vergrößern oder kann das Kontrastmittel befähigen, auf mehr als eine Stelle, z.B. verschiedene Rezeptoren für ein Mittel, das eine Rezeptorheterogenität hat, zu zielen. Daher kann zum Beispiel das Mittel der Formel I Vektoreinheiten mit Affinitätsstellen umfassen, die andere sind als mit Angiogenese assoziierte Rezeptoren, z.B. mit Affinitäten für Zeltoberflächen auf Körperduktuswandoberflächen. Demgemäß kann das Mittel Vektoren umfassen, wie Antikörperfragmente und Oligopeptide, z.B. RGD oder analoge Zelloberflächenbindungspeptidmotife (z.B. wie in EP-A-422937 und EP-A-422938 (Merck) beschrieben) oder andere Vektoren, wie in GB 9700699.3 beschrieben. Derartige zusätzliche Vektoren können auch aus beliebigen der Moleküle ausgewählt werden, die sich natürlicherweise in einem ausgewählten Zielorgan, Gewebe, Zelle oder Gruppe von Zellen oder einem anderen Ort in einem Sängerkörper in vivo konzentrieren. Diese können Aminosäuren, Oligopeptide (z.B. Hexapeptide), Molecular Recognition Units (MRUs), Einzelkettenantikörper (SCAs), Proteine, nicht-peptidische organische Moleküle, Fab-Fragmente und Antikörper umfassen. Beispiele von ortsgerichteten Molekülen umfassen Polysaccharide (z.B. CCK und Hexapeptide), Proteine (wie Lectine, Asialofetuin, polyklonales IgG, Blutgerinnungsproteine (z.B. Hirudin), Lipoproteine und Glycoproteine), Hormone, Wachstumsfaktoren, Gerinnungsfaktoren (wie PF4), polymerisierte Fibrinfragmente (z.B. E1), Serumamyloidprecursor (SAP)-Proteine, Low Density Lipoprotein-(LDL)-Precursor, Serumalbumin, Oberflächenproteine intakter roter Blutzellen, rezeptorbindende Moleküle, wie Östrogene, leberspezifische Proteine/Polymere wie Galactosyl-Neoglycoalbumin (NGA) (siehe Vera et al. in Radiology 151:191 (1984)) N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (HMPA)-Copolymere mit variierenden Anzahlen gebundener Galactosamine (siehe Duncan et al., Biochem. Biophys. Acta 880:62 (1986)) und Allyl- und 6-Aminohexylglycoside (siehe Wong et al., Carbo. Res. 170:27 (1987)) und Fibrinogen. Das ortsgerichtete Protein kann auch ein Antikörper sein. Die Auswahl des Antikörpers, insbesondere die Antigenspezifität des Antikörpers wird von der besonderen beabsichtigten Zielstelle für das Mittel abhängen. Monoklonale Antikörper werden gegenüber polyklonalen Antikörpern bevorzugt. Die Herstellung von Antikörpern, die mit einem erwünschten Antigen reagieren, ist gut bekannt. Antikörperpräparate sind kommerziell von einer Vielzahl von Quellen erhältlich. Fibrinfragment E1 kann, wie von Olexa et al. in J. Biol. Chem. 254:4925 (1979) beschrieben, hergestellt werden. Die Herstellung LDL-Precursorn und SAP-Proteinen ist von de Beer et al. in J. Immunol. Methods 50:17 (1982) beschrieben.
  • Es ist besonders bevorzugt, dass derartige zusätzliche Vektoren derart binden sollten, dass sie die Bewegung des Mittels im Blutstrom verlangsamen, aber sie nicht verhindern, und es am Ort verankern, wenn es an eine Rezeptorstelle assoziiert mit Angiogenese gebunden wird.
  • Funktionelle Gruppen (z.B. Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Carboxygruppen, Thiolgruppen, etc.) auf der Vektorverbindung können zum Binden des Vektors an die Linkereinheit oder direkt an die Reportereinheit verwendet werden, z.B. unter Verwenden konventioneller chemischer Kopplungstechniken.
  • Wo der Vektor eine peptidische Verbindung ist, ist der Reporter ein Multireporter, z.B. ein metallierter Polychelatbildner (bevorzugt ein dendrimerer Polychelatbildner), ein magnetisches (bevorzugt superparamagnetisches) Teilchen, ein Vesikel, das konstratwirksame Teilchen oder eine Lösung eines kontrastwirksamen Moleküls enthält, eine polyionische Spezies (z.B. ein Polymer, das eine Vielzahl ionischer Gruppen, bevorzugt anionischer Gruppen trägt, z.B. ein Carboxylat, Phosphat oder Sulfonatpolymer).
  • Wo der Vektor nicht-peptidisch ist, kann der Reporter ein Multireporter sein oder alternativ einen oder eine kleine Anzahl (z.B. bis zu 10) detektierbarer Marker aufweisen, z.B. chelatierte paramagnetische Metallionen, kovalent gebundene oder chelatierte Radioisotope und Chromophore (oder Fluorophore, etc.). Wo der Reporter ein kovalent gebundenes Radionuklid ist oder aufweist, ist dies ein lodradionuklid bevorzugt gegenüber einem Tritium- oder 13C-Atom.
  • Linker
  • Eine breite Vielzahl von Linkern kann verwendet werden, einschließlich bioabbaubare Linker und Biopolymere.
  • Die Linkerkomponente des Kontrastmittels ist am einfachsten eine Bindung zwischen dem Vektor und Reportereinheiten. Allgemeiner wird der Linker jedoch ein mono- oder multimolekulares Skelett bereitstellen, das kovalent oder nicht-kovalent einen oder mehrerer Vektoren mit einem oder mehreren Reportern verbindet, z.B. ein lineares, cyclisches, verzweigtes oder vernetztes molekulares Skelett, oder ein molekulares Aggregat, mit eingebauten oder seitlichen Gruppen, die kovalent oder nicht-kovalent, z.B. koordinativ, an die Vektor- und Reportereinheiten binden oder die derartige Einheiten einkapseln, einfangen oder verankern.
  • Daher kann das Verbinden einer Reportereinheit mit einem erwünschten Vektor durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel erreicht werden, wobei üblicherweise eine Wechselwirkung mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen angeordnet auf dem Reporter und/oder Vektor involviert ist. Beispiele von chemisch reaktiven funktionellen Gruppen, die für diesen Zweck eingesetzt werden können, umfassen Amino-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Carboxyl- und Carbonylgruppen, wie auch Kohlenhydratgruppen, vicinale Diole, Thioether, 2-Aminoalkohole, 2-Aminothiole, Guanidinyl-, Imidazolyl- und Phenolgruppen.
  • Kovalentes Koppeln von Reporter und Vektor kann daher bewirkt werden unter Verwenden von verbindenden Mitteln, die reaktive Einheiten enthalten, die der Reaktion mit der derartigen funktionellen Gruppen fähig sind. Beispiele von reaktiven Einheiten, die der Reaktion mit Sulfhydrylgruppen fähig sind, umfassen α-Haloacetylverbindungen des Typs X-CH2CO-(wobei X = Br, Cl oder I), die eine besondere Reaktivität für Sulfhydrylgruppen zeigen, die aber auch verwendet werden können, um Imidazolyl-, Thioether-, Phenol- und Aminogruppen zu modifizieren, wie von Gurd, F.R.N. in Methods Enzymol. (1967) 11, 532 beschrieben. N- Maleimidderivate können auch als selektiv gegenüber Sulfhydrylgruppen angesehen werden, können aber auch beim Koppeln an Aminogruppen unter bestimmten Bedingungen nützlich sein. Reagenzien, wie 2-Iminothiolan, z.B. wie beschrieben von Traut, R. et al. in Biochemistry (1973) 12, 3266, die eine Thiolgruppe durch Umwandlung einer Aminogruppe einführen, können als Sulfhydrylreagenzien angesehen werden, falls Verbinden durch die Bildung von Disulfidbrücken vorkommt. Daher können Reagenzien, die reaktive Disulfidbindungen in entweder den Reporter oder den Vektor einführen, nützlich sein, da das Verbinden durch Disulfidaustausch zwischen dem Vektor und dem Reporter herbeigeführt werden kann; Beispiele derartiger Reagenzien umfassen Ellman-Reagens (DTNB), 4,4'-Dithiodipyridin, Methyl-3-nitro-2-pyridyldisulfid und Methyl-2-pyridyldisulfid (beschrieben von Kimura, T. et al. in Analyt. Biochem. (1982) 122, 271).
  • Beispiele reaktiver Einheiten, die der Reaktion mit Aminogruppen fähig sind, umfassen alkylierende und acylierende Mittel. Repräsentative alkylierende Mittel umfassen:
    • i) α-Haloacetylverbindungen, die eine Spezifität gegenüber Aminogruppen in Abwesenheit reaktiver Thiolgruppen zeigen und vom Typ X-CH2CO- sind (wobei X=Cl, Br oder I), z.B. wie beschrieben von Wong, Y-H.H. in Biochemistry (1979) 24, 5337;
    • ii) N-Maleimidderivate, die mit Aminogruppen entweder über eine Reaktion des Michael-Typs oder über Acylierung durch Addition an die Ringcarbonylgruppe reagieren können, wie von Smyth, D.G. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1960) 82, 4600 und Biocher. J. (1964) 91, 589, beschrieben;
    • iii) Arylhalogenide, wie reaktive nitrohaloaromatische Verbindungen;
    • iv) Alkylhalogenide, wie von McKenzie, J.A. et al. in J. Protein Chem. (1988) 7, 581 beschrieben;
    • v) Aldehyde und Ketone, die der Schiff-Basenbildung mit Aminogruppen fähig sind, wobei die gebildeten Addukte üblicherweise über eine Reduktion stabilisiert werden, um ein stabiles Amin zu ergeben;
    • vi) Epoxidderivate, wie Epichlorohydrin und Bisoxirane, die mit Amino-, Sulfhydryl- oder Phenolhydroxylgruppen reagieren können;
    • vii) Chlor enthaltende Derivate von s-Triazinen, die gegenüber Nukleophilen, wie Amino-, Sulfhydryl- und Hydroxygruppen, sehr reaktiv sind; viii) Aziridine, die auf oben im Detail angegebenen s-Triazinverbindungen basieren, z.B. wie beschrieben von Ross, W.C.J. in Adv. Cancer Res. (1954) 2, 1, die mit Nukleophilen, wie Aminogruppen, durch Ringöffnung reagieren;
    • ix) Quadratsäurediethylester, wie von Tietze, L.F. in Chem. Ber. (1991) 124, 1215 beschrieben; und
    • x) α-Haloalkylether, die reaktivere Alkylierungsmittel als normale Alkylhalogenide sind wegen der Aktivierung, die durch das Ethersauerstoffatom verursacht sind, z.B. wie beschrieben von Benneche, T. et al. in Eur. J. Med. Chem. (1993) 28, 463.
  • Repräsentative aminoreaktive Acylierungsmittel umfassen:
    • i) Isocyanate und Isothiocyanate, insbesondere aromatische Derivate, die stabile Harnstoff- bzw. Thioharnstoffderivate bilden und für die Proteinvernetzung verwendet wurden, wie von Schick, A.F. et al. in J. Biol. Chem. (1961) 236, 2477 beschrieben;
    • ii) Sulfonylchloride, die von Herzig, D.J. et al. in Biopolymers (1964) 2, 349 beschrieben wurden, und die für die Einführung einer fluoreszierenden Reportergruppe in den Linker nützlich sein können,
    • iii) Säurehalogenide;
    • iv) aktive Ester, wie Nitrophenylester oder N-Hydroxysuccinimidylester;
    • v) Säureanhydride, wie gemischte, symmetrische oder N-Carboxyanhydride;
    • vi) andere nützliche Reagenzien für die Amidbindungsbildung, wie von Bodansky, M. et al. in "Principles of Peptide Synthesis" (1984) Springer-Verlag beschrieben;
    • vii) Acylazide, z.B. in denen die Azidgruppe aus einem vorgebildeten Hydrazidderivat unter Verwenden von Natriumnitrit erzeugt wird, z.B. wie beschrieben von Wetz, K. et al. in Anal. Biochem. (1974) 58, 347;
    • viii) Azlactone, gebunden an Polymere, wie Bisacrylamid, z.B. wie von Rasmussen, J.K. in Reactive Polymers (1991) 16, 199 beschrieben; und
    • ix) Imidoester, die stabile Amidine bei der Reaktion mit Aminogruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Hunter, M.J. und Ludwig, M.L. in J. Am. Chem. Soc. (1962) 84, 3491.
  • Carbonylgruppen, wie Aldehydfunktionen, können mit schwachen Proteinbasen bei einem derartigen pH zur Reaktion gebracht werden, dass die nukleophilen Proteinseitenkettenfunktionen protoniert werden. Schwache Basen umfassen 1,2-Aminothiole, wie jene, die in N-terminalen Cysteinresten gefunden werden, die selektiv stabile 5-gliedrige Thiazolidinringe mit Aldehydgruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Ratner, S. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1937) 59, 200. Andere schwache Basen, wie Phenylhydrazone können verwendet werden, z.B. wie beschrieben von Heitzman, J. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71, 3537.
  • Aldehyde und Ketone können auch mit Aminen zur Reaktion gebracht werden, um Schiff-Basen zu bilden, die vorteilhafterweise über reduktive Aminierung stabilisiert werden können. Alkoxylaminoeinheiten reagieren leicht mit Ketonen und Aldehyden, um stabile Alkoxamine zu produzieren, z.B. wie von Webb, R. et al. in Bioconjugate Chem. (1990) 1, 96 beschrieben.
  • Beispiele reaktiver Einheiten, die der Reaktion mit Carboxylgruppen fähig sind, umfassen Diazoverbindungen, wie Diazoacetatester und Diazoacetamide, die mit hoher Spezifität reagieren, um Estergruppen zu erzeugen, z.B. wie von Herriot R.M. in Adv. Protein Chem. (1947) 3, 169 beschrieben. Carbonsäure modifizierende Reagenzien, wie Carbodiimide, die über O-Acylharnstoffbildung, gefolgt von Amidbindungsbildung reagieren, können auch nützlich verwendet werden; das Verbinden kann vereinfacht werden durch die Zugabe eines Amins oder kann zu einer direkten Vektor-Rezeptorkopplung führen. Nützliche wasserlösliche Carbodiimide umfassen 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid (CMC) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), z.B. wie von Zot, H.G. und Puett, D. in J. Biol. Chem. (1989) 264, 15552 beschrieben. Andere nützliche Carbonsäure modifizierende Reagenzien umfassen Isoxazoliumderivate, wie Woodwards-Reagenz K; Chloroformiate, wie p-Nitrophenylchloroformiat, Carbonyldiimidazole, wie 1,1'-Carbonyldiimidazol; und N-Carbalkoxydihydrochinoline, wie N-(Ethoxycarbonyl)-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin.
  • Andere möglicherweise nützliche reaktive Einheiten umfassen vicinale Dione, wie p-Phenylendiglyoxal, die verwendet werden können, um mit Guanidinylgruppen zu reagieren, z.B. wie von Wagner et al. in Nucleic acid Res. (1978) 5, 4065 beschrieben; und Diazoniumsalze, die elektrophilen Substitutionsreaktionen unterzogen werden können, z.B. wie von Ishizaka, K. und Ishizaka, T. in J. Immunol. (1960) 85, 163 beschrieben. Bis-Diazoniumverbindungen können leicht durch Behandlung von Aryldiaminen mit Natriumnitrit in sauren Lösungen hergestellt werden. Es wird anerkannt werden, dass funktionelle Gruppen in dem Reporter und/oder Vektor, falls es erwünscht ist, zu anderen funktionellen Gruppen vor der Reaktion umgewandelt werden können, z.B. um eine zusätzliche Reaktivität oder Selektivität zu verleihen. Beispiele von Verfahren, die für diesen Zweck nützlich sind, umfassen die Umwandlung von Aminen zu Carbonsäuren unter Verwendung von Reagenzien, wie Dicarbonsäureanhydride; die Umwandlung von Aminen zu Thiolen unter Verwendung von Reagenzien, wie N-Acetylhomocysteinthiolacton, S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid, 2-Iminothiolan oder Thiol enthaltende Succinimidylderivate; die Umwandlung von Thiolen zu Carbonsäuren unter Verwenden von Reagenzien, wie α-Haloacetate; die Umwandlung von Thiolen zu Aminen unter Verwenden von Reagenzien, wie Ethylenimin oder 2-Bromethylamin; die Umwandlung von Carbonsäuren zu Aminen unter Verwenden von Reagenzien, wie Carbodiimide, gefolgt von Diaminen; und die Umwandlung von Alkoholen zu Thiolen unter Verwenden von Reagenzien, wie Tosylchlorid, gefolgt von Umesterung mit Thioacetat und Hydrolyse zum Thiol mit Natriumacetat.
  • Die Vektor-Reporter-Kopplung kann auch bewirkt werden unter Verwenden von Enzymen wie Zero-Length-Vernetzungsmitteln; daher, wurden, z.B. Transglutaminase, Peroxidase und Xanthinoxidase verwendet, um vernetzte Produkte zu erzeugen. Reverse Proteolyse kann auch verwendet zum Vernetzen über Amidbindungsbildung.
  • Nicht-kovalente Vektor-Reporter-Kopplung kann zum Beispiel durch elektrostatische Ladungswechselwirkungen bewirkt werden, über Chelatbildung in der Form stabiler Metallkomplexe oder über Hochaffinitätsbindungswechselwirkung.
  • Ein Vektor, der an einen Peptid-, Lipo-Oligosaccharid- oder Lipopeptid-Linker gekoppelt ist, der ein Element enthält, das fähig ist, eine Membraneinlagerung zu vermitteln, kann auch nützlich sein. Ein Beispiel wird von Leenhouts, J.M. et al. in Febs Letters (1995) 370(3), 189-192 beschrieben.
  • Die Kopplung kann auch bewirkt werden, unter Verwenden von Avidin oder Streptavidin, die vier Hochaffinitätsbindungsstellen für Biotin besitzen. Avidin kann deshalb verwendet werden, um einen Vektor mit einem Reporter zu konjugieren, falls sowohl der Vektor, als auch der Reporter biotinyliert sind. Beispiele werden von Bayer, E.A. und Wilchek, M. in Methods Biochem. Anal. (1980) 26, 1 beschrieben. Dieses Verfahren kann auch erweitert werden, um das Verbinden des Reporters mit einem Reporter einzuschließen, ein Prozess, der die Assoziierung des Mittels und eine folgende möglicherweise erhöhte Wirksamkeit fördert. Alternativ kann Avidin oder Streptavidin direkt an die Oberfläche von Reporterteilchen gebunden werden.
  • Nicht-kovalente Kopplung kann auch die bifunktionelle Natur von bispezifischen Immunoglobulinen nutzen. Diese Moleküle können spezifisch zwei Antigene binden, und sie so zu verbinden. Zum Beispiel können entweder bispezifische IgG- oder chemisch erzeugte bispezifische F(ab)'2-Fragmente als Verbindungsmittel verwendet werden. Es wurde auch von heterobifunktionellen, bispezifischen Antikörpern zum Verbinden zweier verschiedener Antigene berichtet, z.B. wie beschrieben von Bode, C. et al. in J. Bio. Chem. (1989) 264, 944 und von Staerz, U.D. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 1453. Auf ähnliche Weise kann ein beliebiger Reporter und/oder Vektor, der zwei oder mehr antigene Determinanten besitzt (z.B. wie von Chen, Aa et al. in Am. J. Pathol. (1988) 130, 216 beschrieben), durch Antikörpermoleküle vernetzt werden und zur Bildung von vernetzten Ansammlungen von Mitteln der Formel I einer möglicherweise erhöhten Wirksamkeit führen.
  • Sogenannte Zero-Length-Verbindungsmittel, die eine direkte kovalente Verbindung zweier reaktiver chemischer Gruppen ohne die Einführung von zusätzlichem verbindendem Material induzieren (z.B. wie in der Amidbindungsbildung, die unter Verwenden von Carbodiimiden oder enzymatisch induziert wird), können, falls erwünscht, in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden, wie auch viele Mittel, wie Biotin/Avidin-Systeme, die eine nicht-kovalente Reporter-Vektorverbindung induzieren und Mittel, die elektrostatische Wechselwirkungen induzieren.
  • Im allgemeinsten Falle wird das Verbindungsmittel jedoch zwei oder mehr reaktive Einheiten aufweisen, z.B. wie oben beschrieben, verbunden durch ein Spacerelement. Die Anwesenheit eines derartigen Spacers erlaubt bifunktionellen Linkern, mit spezifischen funktionellen Gruppen innerhalb eines Moleküls oder zwischen zwei verschiedenen Molekülen zu reagieren, was zu einer Bindung zwischen diesen zwei Komponenten und Einführen von extrinsischem, vom Linker erhaltenem Material in das Reporter-Vektor-Konjugat führt. Die reaktiven Einheiten in einem Verbindungsmittel können dieselben (homobifunktionelle Mittel) oder verschiedene (heterobifunktionelle Mittel oder, wo mehrere unähnliche reaktive Einheiten vorhanden sind, heteromultifunktionelle Mittel) sein, was zu einer Vielfalt möglicher Reagenzien führt, die eine kovalente Bindung zwischen beliebigen chemischen Spezien entweder intramolekular oder intermolekuar herbeiführen können.
  • Die Natur extrinsischen Materials, das durch das Verbindungsmittel eingeführt wird, kann von kritischem Belang für die Targetingfähigkeit und allgemeine Stabilität des Endproduktes sein. Daher kann es erwünscht sein, labile Verbindungen einzuführen, z.B. die Spacerarme enthalten, welche bioabbaubar oder chemisch empfindlich sind, oder die enzymatische Spaltungsstellen eingebaut haben. Alternativ kann der Spacer polymere Komponenten umfassen, z.B. um als oberflächenaktive Mittel zu wirken und die Stabilität des Mittels zu verbessern. Der Spacer kann auch reaktive Einheiten enthalten, z.B. wie oben beschrieben, um die Oberflächenvernetzung zu verbessern.
  • Spacerelemente können tpyischerweise aus aliphatischen Ketten bestehen, die die reaktiven Einheiten des Linkers über Distanzen zwischen 5 und 30 Å trennen. Sie können auch makromolekulare Strukturen, wie Poly(ethylen)glykole enthalten. Derartige polymere Strukturen, die im Folgenden als PEGs bezeichnet werden, sind einfache, neutrale Polyether, denen in biotechnischen und biomedizinischen Anwendungen große Aufmerksamkeit zuteil wurde (siehe z.B. Milton Harris, J. (Hrsg.) "Poly(ethylene glycol) chemistry, biotechnical and biomedical applications", Plenum Press, New York, 1992). PEGs sind in den meisten Lösemitteln einschließlich Wasser löslich und werden in wässrigen Umgebungen stark hydratisiert, wobei zwei oder drei Wassermoleküle an jedes Ethylenglykolsegment gebunden werden; dies hat die Wirkung des Verhinderns einer Adsorption entweder von anderen Polymeren oder von Proteinen an die PEG-modifizierten Oberflächen. PEGs sind dafür bekannt, dass sie nichttoxisch sind und aktive Proteine oder Zellen nicht schädigen, während kovalent gebundene PEGs dafür bekannt sind, dass sie nicht immunogen und nicht antigen sind. Außerdem können PEGs leicht modifiziert und an andere Moleküle mit nur einer geringen Wirkung auf ihre Chemie gebunden werden. Ihre vorteilhafte Löslichkeit und biologischen Eigenschaften sind von den vielen möglichen Verwendungen von PEGs und den zugehörigen Copolymeren, einschließlich Blockcopolymeren, wie PEG-Polyurethane und PEG-Polypropylene offenbar.
  • Geeignete Molekulargewichte für PEG-Spacer, die in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden, können beispielsweise zwischen 120 Daltons und 20 kDaltons liegen.
  • Der Hauptmechanismus für die Aufnahme von Teilchen durch die Zellen des Retikuloendothelialen Systems (RES) ist die Opsonisierung durch Plasmaproteine im Blut; diese markieren Fremdteilchen, welche dann von dem RES aufgenommen werden. Die biologischen Eigenschaften von PEG-Spacerelementen, die in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden, können dazu dienen, die Zirkulationszeit des Mittels auf eine ähnliche Weise zu erhöhen, wie jene, die für PEGylierte Liposomen beobachtet wurde (siehe z.B. Klibanov, A.L. et al. in FEBS Letters (1990) 268, 235-237 und Blume, G. und Cevc, G. in Biochim. Biophys. Acta (1990) 1029, 91-97). Eine vergrößerte Kopplungseffizienz an Gebiete von Interesse kann auch unter Verwenden von Antikörpern erreicht werden, die an die Termini von PEG-Spacern gebunden sind (siehe z.B. Maruyama, K. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1234, 74-80 und Hansen, C.B. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1239, 133-144).
  • Andere repräsentative Spacerelemente umfassen Polysaccharide des Strukturtyps, wie Polygalacturonsäure, Glykosaminoglycane, Heparinoide, Cellulose und marine Polysaccharide, wie Alginate, Chitosane und Carrageeenans; Polysaccharide des Speichertyps, wie Stärke, Glykogen, Dextran und Aminodextrane, Polyaminosäuren und Methyl- und Ethylester davon, wie in Homo- und Copolymeren von Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; und Polypeptide, Oligosaccharide und Oligonukleotide, die Enzymspaltungsstellen enthalten können oder nicht.
  • Im Allgemeinen können Spacerelemente spaltbare Gruppen enthalten wie vicinale Glykol-, Azo-, Sulfon-, Ester-, Thioester- oder Disulfidgruppen. Spacer, die bioabbaubare Methylendiester oder Diamidgruppen der Formel -(Z)m.Y.X.C(R1R2).X.Y.(Z)n enthalten [wobei X und Z von -O-, -S- und -NR- (wobei R Wasserstoff oder eine organische Gruppe ist) ausgewählt sind; jedes Y eine Carbonyl-, Thiocarbonyl-, Sulfonyl-, Phosphoryl- oder eine ähnliche säurebildende Gruppe ist; m und n jeweils Null oder 1 sind; und R1 und R2 jeweils Wasserstoff, eine organische Gruppe oder eine Gruppe -X.Y.(Z)m- sind oder zusammen eine divalente organische Gruppe bilden], können auch nützlich sein; wie zum Beispiel in WO-A-9217436 diskutiert ist, werden derartige Gruppen leicht in der Anwesenheit von Esterasen biologisch abgebaut, z.B. in vivo, sind aber in der Abwesenheit derartiger Enzyme stabil. Sie können deshalb vorteilhafterweise mit therapeutischen Mitteln verbunden werden, um deren langsame Freisetzung zu ermöglichen.
  • Poly[N-(2-Hydroxyethyl)methacrylamide] sind möglicherweise nützliche Spacermaterialien dank ihres niedrigen Grads an Wechselwirkung mit Zellen und Geweben (siehe z.B. Volfová, I., Rihová, B. und V.R., und Vetvicka, P. in J. Bioact. Comp. Polymers (1992) 7, 175-190). Eine Arbeit über ein ähnliches Polymer, das hauptsächlich aus dem nahe verwandten 2-Hydroxypropylderivat bestand, zeigte, dass es durch das mononukleare Phagocytensystem nur in einem ziemlich geringen Ausmaß durch Endocytose aufgenommen wurde (siehe Goddard, P., Willamson, I., Bron, J., Hutchkinson, L.E., Nicholls, J. und Petrak, K. in J. Bioct. Compat. Polym. (1991) 6, 4-24).
  • Andere möglicherweise nützliche Polymerspacermaterialien umfassen:
    • i) Copolymere von Methylmethacrylat mit Methacrylsäure; diese können erodierbar sein (siehe Lee, P.I. in Pharm. Res. (1993) 10, 980) und die Carboxylatsubstituenten können einen höheren Grad an Ausdehnung als mit neutralen Polymeren verursachen;
    • ii) Blockcopolymere von Polymethacrylaten mit bioabbaubaren Polyestern (siehe z.B. San Roman, J. und Guillen-Garcia, P. in Biomaterials (1991) 12, 236-241);
    • iii) Cyanoacrylate, d.h. Polymere von Estern von 2-Cyanoacrylsäure – diese sind bioabbaubar und wurden in der Form von Nanoteilchen für selektive Arzneimittelverabreichung verwendet (siehe Forestier, F., Gerrier, P., Chaumard, C., Quero, A.M., Couvreur, P. und Labarre, C. in J. Antimicrob. Chemoter. (1992) 30, 173-179);
    • iv) Polyvinylalkohole, die wasserlöslich sind und allgemein als biokompatibel angesehen werden (siehe z.B. Langer, R. in J. Control. Release (1991) 16, 53-60);
    • v) Copolymere von Vinylmethylether mit Maleinsäureanhydrid, von denen festgestellt wurde, dass sie bioerodierbar sind (siehe Finne, U., Hannus, M. und Urtti, A., in Int. J. Pharm. (1992) 78, 237-241);
    • vi) Polyvinylpyrrolidone, z.B. mit einem Molekulargewicht, das geringer als ungefähr 25.000 ist, die schnell durch die Nieren gefiltert werden (siehe Hespe, W., Meier, A. M. und Blankwater, Y.M. in Arzheim.-Forsch./Drug Res. (1977) 27, 1158-1162);
    • vii) Polymere und Copolymere von kurzkettigen aliphatischen Hydroxysäuren, wie Glykol-, Milch-, Butter-, Valerian- und Capronsäuren (siehe z.B. Carli, F. in Chim. Ind. (Milan) (1993) 75, 494-9), einschließlich Copolymere, die aromatische Hydroxysäuren einbauen, um ihre Abbaugeschwindigkeit zu erhöhen (siehe Imasaki, K., Yoshida, M., Fukuzaki, H., Asano, M., Kumakura, M., Mashimo, T., Yamanaka, H. und Nagai. T. in Int. J Pharm. (1992) 81, 31-38);
    • viii) Polyester, die aus alternierenden Einheiten von Ethylenglykol und Terephthalsäure bestehen, z.B. DacronR, die nicht abbaubar sind, aber hoch biokompatibel;
    • ix) Blockcopolymere, die bioabbaubare Segmente von aliphatischen Hydroxysäurepolymeren umfassen (siehe Younes, H., Nataf, P.R., Cohn, D., Appelbaum, Y.J., Pizov, G. und Uretzky, G. in Biomater. Artif Cells Artif. Organs (1988) 16, 705-719), beispielsweise in Zusammenhang mit Polyurethanen (siehe Kobayashi, H., Hyon, S.H. und Ikada, Y. in "Watercurable and biodegradable prepolymers" – J. Biomed. Mater. Res. (1991) 25, 1481-1494);
    • x) Polyurethane, die als gut toleriert in Implantaten bekannt sind und die kombiniert werden können mit flexiblen "weichen" Segmenten, z.B. die Poly(tetramethylenglykol), Poly(propylenglykol) oder Poly(ethylenglykol) umfassen, und aromatischen "harten" Segmenten, z.B. die 4,4'-Methylenbis(phenylenisocyanat) umfassen (siehe z.B. Ratner, B.D., Johnston, A.B. und Lenk, T.J. in J. Biomed. Mater. Res: Applied Biomaterials (1987) 21, 59-90; Sa Da Costa, V. et al. in J. Coll. Interface Sci. (1981) 80, 445-452 und Affrossman, S. et al. in Clinical Materials (1991) 8, 25-31);
    • xi) Poly(1,4-dioxan-2-one), die als bioabbaubare Ester angesichts ihrer hydrolysierbaren Esterverbindungen betrachtet werden können (siehe z.B. Song, C. X., Cui, X.M., und Schindler, A. in Med. Biol. Eng. Comput. (1993) 31, S147-150), und Glycolideinheiten umfassen können, um ihre Absorptionsfähigheit zu verbessern (siehe Bezwada, R.S., Shalaby, S.W. und Newman, H.D.J. in Agricultural and synthetic polymers: Biodegradability and utilization (1990) (Hrsg. Glass, J.E. und Swift, G.), 167-174 – ACS Symposium Series, #433, Washington D.C., U.S.A. – American Chemical Society);
    • xii) Polyanhydride, wie Copolymere von Sebacinsäure (Octandisäure) mit bis(4-Carboxyphenoxy)propan, für die in Studien mit Kaninchen (siehe Brem, H., Kader, A., Epstein, J.I., Tamargo, R.J., Domb, A. Langer, R. und Leong, K.W. in Sel. Cancer Ther. (1989) 5, 55-65) und Studien mit Ratten (siehe Tamargo, R.J., Epstein, J.I. Reinhard, C.S., Chasin, M. und Brem, H. in J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23, 253-266) gezeigt wurde, dass sie für die kontrollierte Freisetzung von Arzneimitteln im Gehirn ohne evidente toxische Wirkungen nützlich sind; xiii) bioabbaubare Polymere, die Orthoestergruppen enthalten, welche für die kontrollierte Freisetzung in vivo eingesetzt wurden (siehe Maa, Y.F. und Heller, J. in J. Control Release (1990) 14, 21-28); und
    • xiv) Polyphosphazene, welche anorganische Polymere sind, die aus alternierenden Phosphor- und Stickstoffatomen bestehen (siehe Crommen, J.H., Vandorpe, J. und Schacht, E.H. in J. Control. Release (1993) 24, 167-180).
  • Die folgenden Tabellen listen Verbindungsmittel auf, die in targetingfähigen Mitteln in Übereinstimmung mit der Erfindung nützlich sein können. Heterobifunktionelle Verbindungsmittel
    Verbindungsmittel Reaktivität 1 Reaktivität 2 Bemerkungen
    ABH Kohlenhydrat Photoreaktiv
    ANB-NOS -NH2 Photoreaktiv
    APDP(1) -SH Photoreaktiv Iodierbarer Disulfidlinker
    APG -NH2 Photoreaktiv Reagiert selektiv mit Arg bei pH 7-8
    ASIB(1) -SH Photoreaktiv Iodierbar
    ASBA(1) -COOH Photoreaktiv Iodierbar
    EDC -NH2 -COOH Zero-Length-Linker
    GMBS -NH2 -SH
    Sulfo-GMBS -NH2 -SH Wasserlöslich
    HSAB -NH2 Photoreaktiv
    Sulfo-HSAB -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslich
    MBS -NH2 -SH
    Sulfo-MBS -NH2 -SH Wasserlöslich
    M2C2H Kohlenhydrat -SH
    MPBH Kohlenhydrat -SH
    NHS-ASA(1) -NH2 Photoreaktiv Iodierbar
    Sulfo-NHS-ASA(1) -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslich, iodierbar
    Sulfo-NHS-LC-ASA(1) -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslich, Iodierbar
    PDPH Kohlenhydrat -SH Disulfidlinker
    PNP-DTP -NH2 Photoreaktiv
    SADP -NH2 Photoreaktiv Disulfidlinker
    Sulfo-SADP -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslicher Disulfidlinker
    SAED -NH2 Photoreaktiv Disulfidlinker
    SAND -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslicher Disulfidlinker
    SANPAH -NH2 Photoreaktiv
    Sulfo-SANPAH -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslich
    SASD(1) -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslicher iodierbarer Disulfidlinker
    SIAB -NH2 -SH
    Sulfo-SIAB -NH2 -SH Wasserlöslich
    SMCC -NH2 -SH
    Sulfo-SMCC -NH2 -SH Wasserlöslich
    SMPB -NH2 -SH
    Sulfo-SMPB -NH2 -SH Wasserlöslich
    SMPT -NH2 -SH
    Sulfo-LC-SMPT -NH2 -SH Wasserlöslich
    SPDP -NH2 -SH
    Sulfo-SPDP -NH2 -SH Wasserlöslich
    Sulfo-LC-SPDP -NH2 -SH Wasserlöslich
    Sulfo-SAMCA(2) -NH2 Photoreaktiv
    Sulfo-SAPB -NH2 Photoreaktiv Wasserlöslich
    Anmerkungen: (1) = iodierbar; (2) = fluoreszierend
    Homobifunktionelle Verbindungsmittel
    Verbindungsmittel Reaktivität Bemerkungen
    BS -NH2
    BMH -SH
    BASED(1) Photoreaktiv Iodierbarer Disulfidlinker
    BSCOES -NH2
    Sulfo-BSCOES -NH2 Wasserlöslich
    DFDNB -NH2
    DMA -NH2
    DMP -NH2
    DMS -NH2
    DPDPB -SH Disulfidlinker
    DSG -NH2
    DSP -NH2 Disulfidlinker
    DSS -NH2
    DST -NH2
    Sulfo-DST -NH2 Wasserlöslich
    DTBP -NH2 Disulfidlinker
    DTSSP -NH2 Disulfidlinker
    EGS -NH2
    Sulfo-EGS -NH2 Wasserlöslich
    SPBP -NH2
    Biotinylierungsmittel
    Mittel Reaktivität Bemerkungen
    Biotin-BMCC -SH
    Biotin-DPPE* Herstellung von biotinylierten Liposomen
    Biotin-LC-DPPE* Herstellung von biotinylierten Liposomen
    Biotin-HPDP -SH Disulfidlinker
    Biotinhydrazid Kohlenhydrat
    Biotin-LC-Hydrazid Kohlenhydrat
    lodacetyl-LC-Biotin -NH2
    NHS-Iminobiotin -NH2 Reduzierte Affinität für Avidin
    NHS-SS-Biotin -NH2 Disulfidlinker
    Photoaktivierbares Biotin Nukleinsäuren
    Sulfo-NHS-Biotin -NH2 Wasserlöslich
    Sulfo-NHS-LC-Biotin -NH2
    Anmerkungen: DPPE = Dipa Imitoylphosphatidylethanolam in; LC = Langketten
    Mittel für die Proteinmodifizierung
    Mittel Reaktivität Funktion
    Ellmanns-Reagens -SH quantifiziert/detektiert/schützt
    DTT -S.S- Reduktion
    2-Mercaptoethanol -S.S- Reduktion
    2-Mercaptylamin -S.S- Reduktion
    Trauts-Reagens -NH2 führt -SH ein
    SATA -NH2 führt geschütztes -SH ein
    AMCA-NHS -NH2 Fluoreszenzmarker
    AMCA-Hydrazid Kohlenhydrat Fluoreszenzmarker
    AMCA-HPDP -S.S- Fluoreszenzmarker
    SBF-Chlorid -S.S- Fluoreszenzerfassung von -SH
    N-Ethylmaleimid -S.S- blockiert -SH
    NHS-Acetat -NH2 blockiert und acetyliert -NH2
    Citraconsäureanhydrid -NH2 Blockiert reversibel und führt negative Ladungen ein
    DTPA -NH2 führt einen Chelator ein
    BNPS-Skatol Tryptophan spaltet Tryptophanrest
    Bolton-Huber para-Iodphenylalanin -NH2 führt eine iodierbare Gruppe ein
  • Zusätzlich zu den bereits in Betracht gezogenen geradkettigen und verzweigten PEG-ähnlichen Linkern (z.B. Polyethylenglykole und andere, die 2 bis 100 sich wiederholende Einheiten von Ethylenoxid enthalten), können Linker im VLR-System unabhängig eine chemische Bindung oder der Rest einer verbindenden Gruppe sein. Der Ausdruck "Rest einer verbindenden Gruppe" wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Einheit, die bleibt, resultiert oder erhalten wird aus der Reaktion einer vektorreaktiven Gruppe mit einer reaktiven Stelle auf einem Vektor. Der Ausdruck "vektorreaktive Gruppe" wie hier verwendet, bezieht sich auf eine beliebige Gruppe, die mit funktionellen Gruppen reagieren kann, die typischerweise auf Vektoren gefunden werden, deren Derivatisierung die Fähigkeit des Vektors, an seinen Rezeptor zu binden, nur minimal beeinflusst. Jedoch wird besonders in Betracht gezogen, dass derartige vektorreaktive Gruppen auch mit funktionellen Gruppen reagieren können, die typischerweise auf relevanten Proteinmolekülen gefunden werden. Daher werden in einem Aspekt die Linker, die in der Ausführung dieser Erfindung nützlich sind, von jenen Gruppen erhalten, die mit beliebigen relevanten Molekülen reagieren können, die einen Vektor wie oben beschrieben aufweisen, der eine reaktive Gruppe enthält, ob solch ein relevantes Molekül ein Protein ist oder nicht, um eine verbindende Gruppe zu bilden.
  • Bevorzugte verbindende Gruppen werden von vektorreaktiven Gruppen erhalten, die ausgewählt sind aus, aber nicht beschränkt sind auf:
    eine Gruppe, die direkt mit Carboxy, Aldehyd, Amin (NHR), Alkoholen, Sulfhydrylgruppen, aktivierten Methylenen und dergleichen auf dem Vektor reagieren, zum Beispiel aktives Halogen enthaltende Gruppen einschließlich beispielsweise Chlormethylphenylgruppen und Chloracetyl-[ClCH2C(=O)-]-Gruppen, aktivierte 2-(Austrittsgruppen substituierte)-Ethylsulfonyl- und Ethylcarbonylgruppen, wie 2-Chlorethylsulfonyl und 2-Chlorethylcarbonyl; Vinylsulfonyl; Vinylcarbonyl; Epoxy; Isocyanato, Isothiocyanato; Aldehyd; Aziridin; Succinimidoxycarbonyl; aktivierte Acylgruppen, wie Carboxylsäurehalogenide; gemischte Anyhdride und dergleichen.
  • Eine Gruppe, die leicht mit modifizierten Vektormolekülen reagieren kann, die eine vektorreaktive Gruppe enthalten, z.B. Vektoren, die eine reaktive Gruppe enthalten, die modifiziert ist, um reaktive Gruppen wie jene in den oben angegebenen Tabellen erwähnt zu enthalten, zum Beispiel durch Oxidiation des Vektors zu einem Aldehyd oder einer Carbonsäure, wobei in diesem Fall die "verbindende Gruppe" von reaktiven Gruppen erhalten werden kann, die ausgewählt sind aus Amino, Alkylamino, Arylamino, Hydrazino, Alkylhadrazino, Arylhydrazino, Carbazido, Semicarbazido, Thiocarbazido, Thiosemicarbazido, Sulfhydryl, Sulfhydrylalkyl, Sulfhydrylaryl, Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl und Carboxyaryl. Die Alkylteile der genannten verbindenden Gruppen können 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatome enthalten. Die Arylteile der genannten verbindenden Gruppen können ungefähr 6 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatome enthalten; und eine Gruppe, die mit dem Vektor, der eine reaktive Gruppe enthält, oder mit dem wie oben angegebenen modifizierten Vektor durch Verwenden eines Vernetzungsmittels verbunden werden kann. Die Reste bestimmter nützlicher Vernetzungsmittel, wie z.B. homobifunktionelle und heterobifunktionelle Gelatinehärtungsmittel, Bisepoxide und Bisisocyanate können ein Teil einer verbindenden Gruppe während der Vernetzungsreaktion werden. Andere nützliche Vernetzungsmittel können jedoch das Vernetzen vereinfachen, zum Beispiel wie konsumierbare Katalysatoren, und sind nicht in dem Endkonjugat vorhanden. Beispiele derartiger Vernetzungsmittel sind Carbodiimid- und Carbamoylonium-Vernetzungsmittel, wie in US 4,421,847 offenbart und die Ether von US 4,877,724 . Bei diesen Vernetzungsmitteln muss einer der Reaktanten, wie der Vektor, eine Carboxylgruppe besitzen und der andere, wie beispielsweise ein Langkettenspacer, muss eine reaktive Amin-, Alkohol- oder Sulhydrylgruppe besitzen. Bei der Amidbindungsbildung reagiert zuerst das Vernetzungsmittel selektiv mit der Carboxylgruppe und wird dann während der Reaktion der so "aktivierten" Carboxylgruppe mit einem Amin, um eine Amidverbindung dazwischen zu bilden, abgespalten, wobei so die zwei Einheiten kovalent gebunden werden. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Vernetzung ähnlicher Moleküle, z.B. Vektor zu Vektor, vermieden wird, wohingegen die Reaktion beispielsweise von homobifunktionellen Vernetzungsmitteln nicht selektiv ist und unerwünschte vernetzte Moleküle erhalten werden.
  • Bevorzugte nützliche Verbindungsgruppen werden von verschiedenen heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien erhalten, wie jene, die in Pierce Chemical Company Immunotechnology Catalog – Protein Modification Section (1995 und 1996) aufgelistet sind. Nützliche nicht beschränkende Beispiele derartiger Reagenzien umfassen:
    Sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat
    Sulfo-SIAB Sulfosuccinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat
    Sulfo-SMPB Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat
    2-IT 2-Iminothiolan
    SATA N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat.
  • Zusätzlich zu der vorstehenden Beschreibung können die verbindenden Gruppen ganz oder teilweise auch aus komplementären Sequenzen von Nukleotiden und Resten von Nukleotiden bestehen und davon erhalten werden, die beide natürlich auftreten und modifiziert sind, bevorzugt nicht selbst assoziierende Oligonukleotidsequenzen. Besonders nützliche, nicht beschränkende Reagenzien für den Einbau von modifizierten Nukleotideinheiten, die reaktive funktionelle Gruppen enthalten, wie Amin- und Sulfhydrylgruppen, in eine Oligonukleotidsequenz sind kommerziell erhältlich von beispielsweise Clontech Laborstories Inc. (Palo Alto California) und umfassen Uni-Link AminoModifier (Catalog # 5190), Biotin-ON Phosphoramidit (Catalog # 5191), N-MNT-C6-AminoModifier (Catalog # 5202), AminoModifier II (Catalog # 5203), DMT-C6-3'Amin-ON (Catalog # 5222), C6-ThiolModifier (Catalog # 5211) und dergleichen. In einem Aspekt werden die verbindenden Gruppen dieser Erfindung aus der Reaktion einer reaktiven funktionellen Gruppe, wie beispielsweise einer Amin- oder Sulfhydrylgruppe, wie sie in den oben genannten Clontech Reagenzien zur Verfügung stehen, erhalten, von denen eine oder mehrere in eine Oligonukleotidsequenz eingebaut wurden, mit beispielsweise einer oder mehrerer der zuvor beschriebenen vektorreaktiven Gruppen, wie eine heterobifunktionelle Gruppe auf dem Vektor.
  • Durch Binden zweier komplementärer Oligonukleotidsequenzen, eine davon an den Vektor und die andere an den Reporter, weist das resultierende doppelsträngige hybridisierte Oligonukleotid dann die verbindende Gruppe zwischen dem Vektor und dem Reporter auf.
  • Andere Polymersysteme, die als Linker dienen, umfassen:
    Poly(L- oder D- oder DL-Aminosäuren) = Proteine und Peptide; natürlich auftretend oder synthetisch
    Pseudo-Poly(aminosäuren) = (Aminosäuren, die durch Nichtamidbindungen verbunden sind);
    Poly (L- oder D- oder DL-Lactid) und die Copolymere, z.B. Poly (L-Lactid/DL-Lactid)
    Poly(glycolid)
    L-Lactid/Glycolidcopolymere
    Poly-Caprolacton und seine Copolymere
    Polyanhydride
    Poly(orthoester)
    Polyphosphazene
    Langkettige, gerade oder verzweigte Lipide (& Phospholipide)
    Zucker und Kohlenhydrate
    Oligonukleotide (siehe oben)
    wie auch Mischungen der oben genannten.
  • Verbindungsmittel, die gemäß der Erfindung verwendet werden, werden im Allgemeinen ein Verbinden des Vektors mit dem Reporter oder des Reporters mit dem Reporter mit einigem Grad an Spezifität herbeiführen, und können auch verwendet werden, um ein oder mehrere therapeutisch wirksame Mittel zu binden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß ein Werkzeug zur therapeutischen Arzneimittelverabreichung in Kombination mit vektorvermitteltem Leiten des Produktes an die erwünschte Stelle bereit. Mit "therapeutisch" oder "Arzneimittel" ist ein Mittel gemeint, das eine günstige Wirkung auf eine spezielle Krankheit in einem lebenden Menschen oder nicht-menschlichen Tier besitzt.
  • Therapeutische Verbindungen können im Inneren eines molekularen Aggregats oder teilchenförmigen Linkers eingekapselt werden oder an die einkapselnden Wände eines vesikulären Linkers gebunden oder darin eingebaut werden. Daher kann die therapeutische Verbindung an einen Teil der Oberfläche gebunden werden, zum Beispiel durch kovalente oder ionische Bindungen, oder kann physikalisch in ein einkapselndes Material gemischt werden, insbesondere, falls das Arzneimittel eine Polarität oder Löslichkeit ähnlich zu dem Material besitzt, um es so davon abzuhalten, aus dem Produkt zu entweichen, bevor beabsichtigt ist, dass es im Körper wirkt. Die Freisetzung des Arzneimittels kann lediglich durch benetzenden Kontakt mit Blut auf die Verabreichung folgend oder als eine Folge anderer interner oder externer Einflüsse initiiert werden, z.B. Auflösungsprozesse, die durch Enzyme katalysiert werden, oder die Verwendung von magnetischem Heizen, wo der Reporter ein magnetisches Teilchen ist.
  • Die therapeutische Substanz kann kovalent an die einkapselnde Membranoberfläche eines vesikulären Linkers gebunden werden unter Verwenden eines geeigneten Verbindungsmittels, z.B. wie hier beschrieben. Daher kann man beispielsweise anfänglich ein Phospholipidderivat herstellen, an das das Arzneimittel durch eine bioabbaubare Bindung oder Linker gebunden wird, und dann dieses Derivat in das Material, das zum Herstellen der Vesikelmembran verwendet wurde, einbauen, wie oben beschrieben.
  • Alternativ kann das Mittel anfänglich ohne das Therapeutikum hergestellt werden, das dann an teilchenförmige (z.B. vesikuläre) Mittel vor der Verwendung gekoppelt wird oder darauf aufgebracht wird. Daher könnte zum Beispiel ein Therapeutikum zu einer Suspension von Liposomen in wässrigem Medium gegeben werden und geschüttelt werden, um das Therapeutikum an die Liposomen zu binden oder daran haften zu lassen.
  • Das Therapeutikum kann beispielsweise ein Arzneimittel oder ein Prodrug sein, das für die Verwendung zur Bekämpfung von Angiogenese oder Tumoren bekannt ist.
  • Durch Targeting (Zielausrichten) eines Mittels, das ein Prodrug aktivierendes Enzym enthält, in Gebiete der Pathologie kann man das Targeting des Enzyms abbilden, was es möglich macht zu visualisieren, wenn das Mittel genau ins Ziel gebracht wird und wenn das Mittel von Nichtzielgebieten verschwunden ist. Auf diese Weise kann man die optimale Zeit für die Injektion des Prodrugs in individuelle Patienten bestimmen.
  • Eine andere Alternative ist es, ein Prodrug, ein Prodrug aktivierendes Enzym und einen Vektor in denselben teilchenförmigen Linkerreporter auf eine derartige Weise einzubauen, dass das Prodrug nur nach einem externen Stimulus aktiviert werden wird. Ein derartiger Stimulus kann beispielsweise die Lichtstimulierung eines chromophoren Reporters oder das magnetische Heizen eines superparamagnetischen Reporters sein, nachdem das gewünschte Targeting erreicht wurde.
  • Sogenannte Prodrugs können auch in Mitteln gemäß der Erfindung verwendet werden. Daher können Arzneimittel derivatisiert werden, um ihre physikochemischen Eigenschaften zu ändern und das Mittel der Erfindung zu adaptieren; derartige derivatisierte Arzneimittel können als Prodrugs betrachtet werden und sind üblicherweise inaktiv, bis eine Spaltung der derivatisierenden Gruppe die aktive Form des Arzneimittels regeneriert.
  • Therapeutika können auf einfache Weise an Stellen von Angiogenese geliefert werden.
  • Zum Beispiel wo der Reporter eine chelatierte Metallspezies ist (zum Beispiel ein paramagnetisches Metallion oder ein Metallradionuklid), kann der Linker eine Kette umfassen, die an eine Metall chelatierende Gruppe gebunden ist, eine polymere Kette mit einer Mehrzahl von Metall chelatierenden Gruppen, die seitlich am molekularen Rückgrat oder in das molekulare Rückgrat eingebaut sind, ein verzweigtes Polymer mit Metall chelatierenden Gruppen an Verzweigungstermini (z.B. ein dendrimerer Polychelatbildner), etc. Was für den Linker erforderlich ist, ist einfach, dass er die Vektor- und Reportereinheiten miteinander für eine angemessene Zeitdauer verbindet. Mit angemessener Zeitdauer ist eine Zeitdauer gemeint, die für das Kontrastmittel ausreichend ist, um seine erwünschten Wirkungen auszuüben, z.B. den Kontrast in vivo während einer diagnostischen Bilderzeugungsprozedur zu verbessern.
  • Daher kann es unter bestimmten Umständen erwünscht sein, dass der Linker nach der Verabreichung biologisch abgebaut wird. Durch Auswählen eines geeigneten bioabbaubaren Linkers ist es möglich, die Biodistributions- und Bioeliminationsmuster für den Vektor und/oder Reporter zu modifizieren. Wo der Vektor und/oder der Reporter biologisch aktiv sind oder fähig sind, unerwünschte Wirkungen auszuüben, falls er zurückbehalten wird nachdem die Bilderzeugungsprozedur vorüber ist, kann es erwünscht sein, eine Linker-Bioabbaubarkeit einzuplanen, die eine geeignete Bioelimination oder eine metabolische Zersetzung der Vektor- und/oder Reportereinheiten sichert. Daher kann ein Linker eine bioabbaubare Funktion enthalten, die beim Zersetzen Zersetzungsprodukte mit modifizierten Biodistributionsmustern ergibt, die aus der Freisetzung des Reporters von dem Vektor oder aus der Fragmentierung einer makromolekularen Struktur resultieren. Beispielsweise ist es für Linker, die chelatierte Metallionenreporter tragen, möglich, dass der Linker eine bioabbaubare Funktion eingebaut hat, die beim Zersetzen eine ausscheidbare Chelatverbindung freisetzt, die den Reporter enthält.
  • Demgemäß können bioabbaubare Funktionen, falls erwünscht, innerhalb der Linkerstruktur eingebaut sein, bevorzugt an Stellen, die (a) Verzweigungsstellen, (b) an oder nahe von Bindungsstellen für Vektoren oder Reporter, oder (c) derart sind, dass der biologische Abbau physiologisch tolerierbare oder schnell ausscheidbare Fragmente ergibt.
  • Beispiele von geeigneten bioabbaubaren Funktionen umfassen Ester-, Amid-, Doppelester-, Phosphoester-, Ether-, Thioether-, Guanidyl-, Acetal- und Ketalfunktionen.
  • Wie oben diskutiert kann die Linkergruppe, falls erwünscht, in ihrem molekularen Rückgrat Gruppen eingebaut haben, die die Biodistribution des Kontrastmittels beeinflussen oder die eine geeignete räumliche Konformation für das Kontrastmittel sicherstellen, z.B. um Wasser Zugang zu chelatierten paramagnetischen Metallionenreportern zu ermöglichen. Beispielsweise kann das Linkerrückgrat teilweise oder im Wesentlichen ganz aus einer oder mehreren Polyalkylenoxidketten bestehen.
  • Daher kann der Linker als ein Verbund aus optional bioabbaubaren Vektorbindungs(Vb)- und Reporterbindungs-(Rb)-Gruppen, verbunden über Linkerrückgrat-(Lb)-Gruppen, angesehen werden, wobei die Linkergrückgrat-Gruppen Linkerseitenketten-(Lsc)-Gruppen tragen können, um die Biodistribution etc. zu modifizieren, und können selbst bioabbaubare Funktionen einbauen. Die Rb- und Vb-Bindungsgruppen können seitlich am Linkerrückgrat oder können an Linkerrückgrattermini sein, zum Beispiel mit einer Rb- oder Vb-Gruppe an einem Lb-Terminus, wobei Rb- oder Vb-Gruppen zwei Lb-Termini verbinden oder ein Lb-Terminus zwei oder mehrere Rb- oder Vb-Gruppen trägt. Die Lb- und LSC-Gruppen werden günstigerweise oligomere oder polymere Strukturen sein (z.B. Polyester, Polyamide, Polyether, Polyamine, Oligopeptide, Polypeptide, Oligo- und Polysaccharide, Oligonukleotide, etc.), bevorzugt Strukturen, die mindestens teilweise eine hydrophile oder lipophile Natur besitzen, z.B. hydrophile, amphiphile oder lipophile Strukturen.
  • Der Linker kann ein niedriges, mittleres oder hohes Molekulargewicht besitzen, z.B. bis zu 2 MD. Im Allgemeinen werden Linker eines höheren Molekulargewichts bevorzugt werden, falls sie mit einer Vielzahl von Vektoren oder Reportern beladen werden sollen oder falls es nötig ist, den Vektor und den Reporter räumlich zu trennen, oder falls der Linker selbst dazu dient, eine Rolle bei der Modifikation der Biodistribution anzubieten. Im Allgemeinen werden jedoch Linker ein Molekulargewicht von 100 bis 100.000 D, insbesondere 120 D bis 20 kD besitzen.
  • Die Konjugation des Linkers mit dem Vektor und des Linkers mit dem Reporter kann durch eine beliebige geeignete chemische Konjugationstechnik ausgeführt werden, z.B. kovalentes Binden (z.B. Ester- oder Amidbildung), Metall-Chelatierung oder eine andere Metall-koordinative oder ionische Bindung, wieder wie oben beschrieben.
  • Beispiele von geeigneten Linkersystemen umfassen die Magnifier-Polychelatbildnerstrukturen von US-A-5364613 und PCT/EP90/00565 , Polyaminosäuren (z.B. Polylysin), funktionalisiertes PEG, Polysaccharide, Glykosaminoglycane, dendritische Polymere, wie in WO93/06868 und von Tomalia et al. in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-175 (1990) beschrieben, PEG-chelatbildende Polymere, wie in WO94/08629 , WO94/09056 und WO96/26754 beschrieben, etc.
  • Wo der Reporter ein chelatiertes Metallion ist, wird die Linkergruppe im Allgemeinen die Chelatbildnereinheit einbauen. Alternativ kann das chelatierte Metall auf oder in einem teilchenförmigen Reporter getragen werden. Es können in jedem Fall konventionelle Metall chelatierende Gruppen, wie sie in den Gebieten der Radiopharmazeutika und MRI-Kontrastmedien bekannt sind, verwendet werden, z.B. lineare, cyclische und verzweigte Polyamino-Polycarbonsäuren und Phosphorsauerstoffsäuren-Äquivalente, und andere Schwefel- und/oder Stickstoffliganden, die in der Technik bekannt sind, z.B. DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DO3A, TMT (siehe beispielsweise US-A-5367080 ), BAT und Analoga (siehe beispielsweise Ohmono et al., J. Med. Chem. 35:157-162 (1992) und Kung et al. J. Nucl. Med. 25:326-332 (1984)), der N2S2-Chelatbildner ECD von Neurolite, MAG (siehe Jurisson et al. Chem. Rev. 93:1137-1156 (1993)), HIDA, DOXA (1-oxa-4,7,10-Triazacyclododecantriessigsäure), NOTA (1,4,7-Triazacyclononantriessigsäure), TETA (1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecantetraessigsäure), THT 4'-(3-Amino-4- methoxyphenyl)-6,6'-bis(N',N'-dicarboxymethyl-N-methylhydrazino)-2,2':6',2''-terpyridin), etc. In diesem Zusammenhang wird der Leser auf die Patentliteratur von Sterling Winthrop, Nycomed (einschließlich Nycomed Imaging und Nycomed Salutar), Schering, Mallinckrodt, Bracco und Squibb aufmerksam gemacht, die sich auf chelatierende Mittel für diagnostische Metalle beziehen, z.B. in MR-, röntgen- und radiodiagnostischen Mitteln. Siehe beispielsweise US-A-4647447 , EP-A-71564 , US-A-4687659 , WO89/00557 , US-A-4885363 und EP-A-232751 .
  • Reporter
  • Die Reportereinheiten in den Kontrastmitteln der Erfindung können eine beliebige Einheit sein, die der Definition entweder direkt oder indirekt in einer in vivo diagnostischen Bilderzeugungsprozedur zugänglich sind, z.B. Einheiten, die eine detektierbare Strahlung emittieren oder veranlasst werden können, diese zu emittieren (z.B. durch radioaktiven Zerfall, Fluoreszenzanregung, Spinresonanzanregung, etc.), Einheiten, die lokale elektromagnetische Felder beeinflussen (z.B. paramagnetische, superparamagnetische, ferrimagnetische oder ferromagnetische Spezien), Einheiten, die Strahlungsenergie absorbieren oder streuen (z.B. Chromophore und Fluorophore), Teilchen (einschließlich Flüssigkeit enthaltende Vesikel), schwere Elemente und Verbindungen davon und Einheiten, die eine detektierbare Substanz erzeugen, etc.
  • Ein sehr weiter Bereich von Materialien, die durch diagnostische Bilderzeugungsmodalitäten detektierbar sind, ist aus der Technik bekannt, und der Reporter wird gemäß der zu verwendenden Bilderzeugungsmodalität ausgewählt werden. Daher wird zum Beispiel für Ultraschallbilderzeugung ein echogenes Material oder ein Material, das fähig ist ein echogenes Material zu erzeugen, normalerweise ausgewählt werden, für Röntgenstrahlungsbilderzeugung wird der Reporter im Allgemeinen ein schweres Atom sein oder es enthalten (z.B. eines Atomgewichts von 38 oder mehr), für MR-Bilderzeugung wird der Reporter entweder ein Nicht-Null-Kernspinisotop sein (wie beispielsweise 19F) oder ein Material, das ungepaarte Elektronenspins und daher paramagnetische, superparamagnetische, ferrimagnetische oder ferromagnetische Eigenschaften besitzt, für eine Lichtbilderzeugung wird der Reporter ein Lichtstreuer sein (z.B. ein gefärbtes oder nicht gefärbtes Teilchen), ein Lichtabsorber oder ein Lichtemitter, für magnetometrische Bilderzeugung wird der Reporter detektierbare magnetische Eigenschaften besitzen, für Electrical Impedance Imaging wird der Reporter die elektrische Impedanz beeinflussen und für die Szintigraphie, SPECT, PET, etc. wird der Reporter ein Radionuklid sein.
  • Beispiele von geeigneten Reportern sind aus der Literatur der diagnostischen Bilderzeugung weit bekannt, z.B. magnetische Eisenoxidteilchen, Röntgenstrahlungskontrastmittel enthaltende Vesikel, chelatierte paramagnetische Metalle (z.B. Gd, Dy, Mn, Fe, etc.). Siehe beispielsweise US-A-4647447 , PCT/GB97/00067 , US-A-4863715 , US-A-4770183 , WO96/09840 , WO85/02772 , WO92/17212 , PCT/GB97/00459 , EP-A-554213 , US-A-5228446 , WO91/15243 , WO93/05818 , WO96/23524 , WO96/17682 , US-A-5387080 , WO95/26205 , GB9624918.0 , etc.
  • Als Reporter besonders bevorzugt sind: chelatierte paramagnetische Metallionen, wie Gd, Dy, Fe und Mn, insbesondere, wenn sie durch makrocyclische chelatbildende Gruppen chelatiert sind (z.B. Tetraazacyclododecan-Chelatbildner, wie DOTA, DO3A, HP-DO3A und Analoga davon) oder durch chelatbildende Linkergruppen wie DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DPDP, etc; Metallradionuklide, wie 90Y, 99mTc, 111In, 47Sc, 67/Ga, 51Cr, 177mSn, 67Cu, 167Tm, 97Ru, 188Re, 177Lu, 199Au 203Pb und 141Ce; superparamagnetische Eisenoxidkristalle; Chromophore und Fluorophore mit Absorptions- und/oder Emissionsmaxima im Bereich von 300 bis 1400 nm, insbesondere 600 nm bis 1200 nm, insbesondere 650 bis 1000 nm; chelatierte Schwermetallclusterionen (z.B. W- oder Mo-Polyoxoanionen oder die Schwefel- oder gemischten Sauerstoff/Schwefelanaloga); kovalent gebundene Nichtmetallatome, die entweder eine hohe Atomnummer besitzen (z.B. Iod) oder radioaktiv sind, z.B. 123I, 131I, etc., -atome; iodierte Verbindung enthaltende Vesikel; etc.
  • Allgemein gesagt kann der Reporter (1) ein chelatierbares Metall oder ein polyatomares Metall enthaltendes Ion sein (z.B. TcO, etc.), wobei das Metall ein Metall einer hohen Atomnummer ist (z.B. einer Atomnummer größer als 37), eine paramagnetische Spezies (z.B. ein Übergangsmetall oder Lanthanid), oder ein radioaktives Isotop, (2) eine kovalent gebundene nicht-metallische Spezies, die eine ungepaarte Elektronenstelle besitzt (z.B. ein Sauerstoff oder Kohlenstoff in einem stabilen freien Radikal), ein Nicht-Metall einer hohen Atomnummer oder ein Radioisotop, (3) ein polyatomarer Cluster oder Kristall, der Atome hoher Atomnummer enthält, und der ein kooperatives magnetisches Verhalten zeigt (z.B. Suparamagnetismus, Ferrimagnetismus oder Ferromagnetismus) oder Radionuklide enthält, (4) ein Chromophor (wobei mit diesem Ausdruck Spezien eingeschlossen sind, die fluoreszierend oder phosphoreszierend sind), z.B. eine anorganische oder organische Struktur, insbesondere ein komplexiertes Metallion oder eine organische Gruppe mit einem ausgedehnten delokalisierten Elektronensystem, oder (5) eine Struktur oder eine Gruppe mit variierenden Eigenschaften der elektrischen Impedanz, z.B. aufgrund eines ausgedehnten delokalisierten Elektronensystems.
  • Beispiele besonderer bevorzugter Reportergruppen werden unten detaillierter beschrieben:
    Chelatierte Metallreporter: Metallradionuklide, paramagnetische Metallionen, fluoreszierende Metallionen, Schwermetallionen und Clusterionen
  • Bevorzugte Metallradionuklide umfassen 90Y, 99mTc, 111In, 47Sc, 67Ga, 51Cr, 177mSn, 67Cu, 167Tm, 97Ru, 188Re, 177Lu, 199Au, 203Pb und 141Ce.
  • Bevorzugte paramagnetische Metallionen umfassen Ionen von Übergangs- und Lanthanidmetallen (z.B. Metallen mit Atomnummern von 6 bis 9, 21-29, 42, 43, 44 oder 57-71), insbesondere Ionen von Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb und Lu, insbesondere von Mn, Cr, Fe, Gd und Dy, mehr insbesondere Gd.
  • Bevorzugte fluoreszierende Metallionen umfassen Lanthanide, insbesondere La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb und Lu. Eu ist besonders bevorzugt.
  • Bevorzugte Schwermetall enthaltende Reporter können Atome von Mo, Bi, Si und W enthalten, und insbesondere können sie polyatomare Clusterionen sein (z.B. Bi-Verbindungen und W- und Mo-Oxide), wie in WO91/14460 , WO92/17215 , WO96/40287 und WO96/22914 beschrieben.
  • Die Metallionen werden erwünschterweise durch chelatbildende Gruppen an der Linkereinheit oder in oder auf einem Teilchen chelatiert (z.B. ein Vesikel oder ein poröser oder nichtporöser anorganischer oder organischer Feststoff) insbesondere lineare, makrocyclische, Terpyridin- und N2S2-Chelatbildner, wie beispielsweise DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DO3A, TMT. Weitere Beispiele von geeigneten chelatbildenden Gruppen sind in US-A-4647447 , WO89/00557 , US-A-5367080 , US-A-5364613 , etc. offenbart.
  • Die Linkereinheit oder das Teilchen können eine oder mehrere derartige chelatbildende Gruppen enthalten, falls erwünscht, metalliert durch eine oder mehrere Metallspezien (z.B. um Reporter zu ergeben, die in unterschiedlichen Bilderzeugungsmodalitäten detektierbar sind).
  • Insbesondere wo das Metall nicht radioaktiv ist, ist es bevorzugt, dass ein polychelatbildender Linker oder ein teilchenförmiger Reporter verwendet werden.
  • Eine chelatbildende oder chelatierende Gruppe wie hier erwähnt kann den Rest einer oder mehrerer einer breiten Vielzahl von chelatierenden Mitteln umfassen, die ein Metallion oder ein polyatomares Ion komplexieren können (z.B. TcO).
  • Wie gut bekannt ist, ist ein chelatierendes Mittel eine Verbindung, die Donoratome enthält, die sich durch koordinative Bindung mit einem Metallion kombinieren können, um eine cyclische Struktur zu bilden, die ein Chelationkomplex oder ein Chelat genannt wird. Diese Klasse von Verbindungen ist in der Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Band 5, 339-368 beschrieben.
  • Der Rest eines geeigneten chelatierenden Mittels kann ausgewählt werden aus Polyphosphaten, wie Natriumtripolyphosphat und Hexametaphosphorsäure; Aminocarbonsäuren, wie Ethylendiamintetraessigsäure, N-(2-Hydroxy)ethlendiamintriessigsäure, Nitrilotriessigsäure, N,N-Di(2-Hydroxyethyl)glycin, Ethylenbis(hydroxyphenylglycin) und Diethylentriaminpentaessigsäure; 1,3-Diketone, wie Acetylaceton, Trifluoracetylaceton und Thenoyltrifluoraceton; Hydroxycarbonsäuren, wie Weinsäure, Zitronensäure, Gluconsäure und 5-Sulfosalicylsäure; Polyamine, wie Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetraamin und Triaminotriethylamin; Aminoalkohole, wie Triethanolamin und N-(2-Hydroxyethyl)ethylendiamin, aromatische heterocyclische Basen, wie 2,2'-Diimidazol, Picolinamin, Dipicolinamin und 1,10-Phenanthrolin; Phenole, wie Salicylaldehyd, Disulfopyrocatechol und Chromotropsäure; Aminophenole, wie 8-Hydroxychinolin und Oximsulfonsäure, Oxime, wie Dimethylglyoxim und Salicylaldoxim; Peptide, die eine proximale chelatierende Funktionalität enthalten, wie Polycystein, Polyhistidin, Polyasparaginsäure, Polyglutarsäure oder Kombinationen derartiger Aminosäuren; Schiff-Basen, wie Disalicylaldehyd-1,2-propylendiimin; Tetrapyrrole, wie Tetraphenylporphin und Phthalocyanin; Schwefelverbindungen, wie Toluoldithiol, meso-2,3-Dimercaptobernsteinsäure, Dimercaptopropanol, Thioglykolsäure, Kaliumethylxanthat, Natriumdiethyldithiocarbamat, Dithizon, Diethyldithiophosphorsäure und Thioharnstoff; synthetische makrocyclische Verbindungen, wie Dibenzo[18]-Krone-6, (CH3)6-[14]-4,11]-dien-N4 und (2.2.2-Cryptat), Phosphonsäuren, wie Nitrilotrimethylenphosphonsäure, Ethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) und Hydroxyethylidendiphosphonsäure oder Kombinationen zweier oder mehrerer der oben genannten Mittel. Der Rest von geeigneten chelatierenden Mitteln umfasst bevorzugt eine Polycarbonsäuregruppe und bevorzugte Beispiele umfassen: Ethylendiamin-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EDTA); N,N,N',N'',N''-Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA); 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N''-tetraessigsäure (DOTA); 1,4,7,10-Tetraazacyclodeodecan-N,N',N''-triessigsäure (DO3A); 1-Oxa-4,7,10-triazacyclododecan-N,N',N''-triessigsäure (OTTA); trans(1,2)-Cyclohexandiethylentriaminpentaessigsäure (CDTPA).
  • Andere geeignete Reste von chelatierenden Mitteln umfassen Proteine, die für die Chelatierung von Metallen, wie Technetium und Rhenium modifiziert sind, wie in US 5078985 beschrieben ist.
  • Geeignete Reste von chelatierenden Mitteln können auch von N3S und N2S2 enthaltenden Verbindungen erhalten werden, wie beispielsweise jene, die in US 4444690 , 4670545 ; 4673562 ; 4897255 ; 4965392 ; 4980147 ; 4988496 ; 5021556 und 5075099 offenbart sind.
  • Andere geeignete Reste von chelatierenden Mitteln sind in PCT/US91/08253 beschrieben.
  • Bevorzugte chelatierende Gruppen sind aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus 2-Aminomethylpyridin, Iminoessigsäure, Iminodiessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-Tetraessigsäure (DOTA), Carbonyliminodiessigsäure, Methyleniminoessigsäure, Methyleniminodiessigsäure, Ethylenthioethyleniminoessigsäure, Ethylenthioethyleniminodiessigsäure, TMT, eine Terpyridinylgruppe, ein chelatierendes Mittel mit einer Terpyridylgruppe und einer Carboxymethylaminogruppe, oder ein Salz einer beliebigen der vorstehenden Säuren. Besonders bevorzugte chelatierende Gruppen sind DTPA, DTPA-BMA, DPDP, TMT, DOTA und HPDO3A.
  • Repräsentative chelatierende Gruppen sind auch beschrieben in US 5559214 A , WO 9526754 , WO 9408624 , WO 9409056 , WO 9429333 , WO 9408624 , WO 9408629 A1 , WO 9413327 A1 und WO 9412216 A1 .
  • Verfahren zum Metallieren beliebiger vorliegender chelatierender Mittel liegen innerhalb des Niveaus des Fachwissens. Metalle können in eine chelatbildende Einheit durch ein beliebiges von drei allgemeinen Verfahren eingebaut werden: direkter Einbau, Templatsynthese und/oder Transmetallierung. Direkter Einbau ist bevorzugt.
  • Daher ist es erwünscht, dass das Metallion leicht an das chelatierende Mittel komplexiert wird, zum Beispiel durch lediglich Aussetzen oder Mischen einer wässrigen Lösung der das chelatierende Mittel enthaltenden Einheit mit einem Metallsalz in einer wässrigen Lösung, die bevorzugt einen pH im Bereich von ungefähr 4 bis ungefähr 11 besitzt. Das Salz kann ein beliebiges Salz sein, aber bevorzugt ist das Salz ein wasserlösliches Salz des Metalls, wie ein Halogensalz, und bevorzugter sind solche Salze so ausgewählt, dass sie nicht mit dem Binden des Metallions an das chelatierende Mittel interferieren. Die das chelatierende Mittel enthaltende Einheit befindet sich bevorzugt in einer wässrigen Lösung bei einem pH zwischen ungefähr 5 und ungefähr 9, bevorzugter einem pH zwischen ungefähr 6 bis ungefähr 8. Die das chelatierende Mittel enthaltende Einheit kann mit Puffersalzen, wie Citrat, Acetat, Phosphat und Borat gemischt werden, um den optimalen pH zu erzeugen. Bevorzugt sind die Puffersalze so ausgewählt, dass sie nicht mit dem nachfolgenden Binden des Metallions an das chelatierende Mittel interferieren.
  • Bei der diagnostischen Bilderzeugung enthält das Vektor-Linker-Reporter-(VLR)-Konstrukt bevorzugt ein Verhältnis von Metallradionuklidion zu chelatierendem Mittel, das in derartigen diagnostischen Bilderzeugungsanwendungen wirksam ist. In bevorzugten Ausführungsformen reicht das Molverhältnis von Metallion pro chelatierendem Mittel von ungefähr 1:1000 bis ungefähr 1:1.
  • In radiotherapeutischen Anwendungen enthält das VLR bevorzugt ein Verhältnis von Metallradionuklidion zu chelatierendem Mittel, das in derartigen therapeutischen Anwendungen wirksam ist. In bevorzugten Ausführungsformen reicht das Molverhältnis von Metallion pro chelatierendem Mittel von ungefähr 1:100 bis ungefähr 1:1. Das Radionuklid kann ausgewählt werden beispielsweise von Radioisotopen von Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Ru, Sn, Sr, Sm, Lu, Sb, W, Re, Po, Ta und Tl. Bevorzugte Radionuklide umfassen 44Sc, 64Cu, 67Cu, 212Pb, 68Ga, 90Y, 153Sm, 212Bi, 186Re und 188Re. Von diesen ist 90Y besonders bevorzugt. Diese Radioisotope können atomar oder bevorzugt ionisch sein.
  • Die folgenden Isotope oder Isotopenpaare können sowohl für die Bilderzeugung als auch für die Therapie verwendet werden, ohne dass die Radiomarkierungsmethode oder der Chelator gewechselt werden muss: 47Sc21; 141Ce58; 188Re75; 177Lu71; 199Au79; 47SC21; 131I53; 67CU29; 131I53 und 123I53; 188R75 und 99mTc43; 90Y39 und 87Y39; 47Sc21 und 44Sc21; 90Y39 und 123I53; 146Sm62 und 153Sm62; und 90Y39 und 111In49 Wo die Linkereinheit einen einzelnen Chelatbildner enthält, kann der Chelatbildner direkt an die Vektoreinheit gebunden werden, z.B. über eine der Metallkoordinationsgruppen des Chelatbildners, die eine Ester-, Amid-, Thioester- oder Thioamidbindung mit einer Amin-, Thiol- oder Hydroxygruppe auf dem Vektor bilden kann. Alternativ können der Vektor und der Chelatbildner direkt über eine Funktionalität an das Chelatbildnerrückgrat gebunden sein, z.B. eine CH2-Phenyl-NCS-Gruppe, gebunden an einen Ringkohlenstoff von DOTA, wie vorgeschlagen wie Meares et al. in JACS 110:6266-6267 (1988), oder indirekt über einen homo- oder heterobifunktionellen Linker, z.B. ein Bisamin, Bisepoxid, Diol, Diacid, difunktionalisiertes PEG, etc. In diesem Fall wird der bifunktionelle Linker günstigerweise eine Kette von 1 bis 200, bevorzugt 3 bis 30 Atomen zwischen dem Vektor und dem chelatbildenden Rest bereitstellen.
  • Wo die Linkereinheit eine Mehrzahl von chelatbildenden Gruppen enthält, ist oder enthält der Linker bevorzugt Teile der Formeln
    Figure 00660001
    wobei Ch eine chelatbildende Einheit und Li eine Linkerrückgratkomponente ist, d.h. der Linker besitzt bevorzugt seitliche Chelatbildner, Chelatbildner im Rückgrat oder terminale Chelatbildner oder eine Kombination davon. Die seitlichen und im Rückgrat befindlichen polymeren Strukturen können verzweigt sein oder sind bevorzugter linear und die Wiederholungseinheiten (LiCh) oder andere Wiederholungseinheiten im Polymer können im Rückgrat befindliche oder seitliche biodistributionsmodifizierende Gruppen besitzen, z.B. Polyalkylengruppen, wie in WO94/08629 , WO94/09056 und WO96/20754 . Die terminalen chelatbildenden Strukturen Li(Ch)n, die dendritische Polymere wie in WO93/06868 sein können, können biodistributionsmodifizierende Gruppen besitzen, die an Termini gebunden sind, die nicht von Chelatbildnern besetzt sind und können den Bioabbau verbessernde Stellen innerhalb der Linkerstruktur besitzen, wie in WO95/28966 .
  • Die chelatbildenden Einheiten innerhalb des polychelatbildenden Linkers können über Rückgratfunktionalisierung des Chelatbildners oder durch Nutzen einer oder mehrerer der Metall koordinierenden Gruppen des Chelatbildners oder durch eine Amid- oder Etherbindungsbildung zwischen dem Säurechelatbildner und einem ein Amin oder Hydroxyl tragenden Linkerrückgrat gebunden werden, z.B. wie in Polylysin-polyDTPA, Polylysin-polyDOTA und in den sogenannten Magnifierpolychelatbildnern von PCT/EP96/00565 . Derartige polychelatbildende Linker können mit einer oder mehrerer Vektorgruppen entweder direkt (z.B. unter Nutzung von Amin-, Säure- oder Hydroxylgruppen in dem polychelatbildenden Linker) oder über eine bifunktionelle Linkerverbindung, wie oben für monochelatbildende Linker diskutiert, konjugiert werden.
  • Wo die chelatierte Spezies von einem teilchenförmigen (oder Molekularaggregat-, z.B. vesikulären) Linker getragen wird, kann das Chelat zum Beispiel ein nichtgebundenes Mono- oder Polychelat (wie Gd DTPA-BMA oder Gd HP-DO3A), eingeschlossen innerhalb des Teilchens, sein oder es kann ein Mono- oder Polychelat sein, das mit dem Teilchen entweder durch kovalente Bindung oder durch Wechselwirkung einer Ankergruppe (z.B. einer lipophilen Gruppe) auf dem Mono/Polychelat mit der Membran eines Vesikels konjugiert ist (siehe z.B. PCT/GB95/02378 ).
  • Nichtmetallatomreporter
  • Bevorzugte Nichtmetallatomreporter umfassen Radioisotope wie 123I und 131I, wie auch Nicht-Null-Kernspinatome wie 19F und schwere Atome wie I.
  • Derartige Reporter, bevorzugt eine Mehrzahl davon, z.B. 2 bis 200, können kovalent an ein Linkerrückgrat gebunden werden, entweder unter direktem Verwenden konventioneller chemischer Synthesetechniken oder über eine Trägergruppe, z.B. eine Triiodphenylgruppe.
  • In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird die Verwendung von Radioisotopen von Iod besonders in Betracht gezogen. Zum Beispiel, falls der Vektor oder Linker aus Substituenten besteht, die durch Iod in einer Kovalentbindungsbildungsreaktion chemisch substituiert werden können, wie beispielsweise Substituenten, die eine Hydrophenylfunktionalität enthalten, können derartige Substituenten durch Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind, mit einem Radioisotop von Iod markiert werden. Die Iodspezien können in therapeutischen und diagnostischen Bilderzeugungsanwendungen verwendet werden. Während zur gleichen Zeit ein Metall in einem chelatierenden Mittel auf demselben Vektor-Linker auch in entweder therapeutischen oder diagnostischen Bilderzeugungsanwendungen verwendet werden kann.
  • Wie mit den oben diskutierten Metallchelatbildnern, können derartige Metallatomreporter an den Linker gebunden sein oder in oder auf einem teilchenförmigen Linker getragen werden, z.B. in einem Vesikel (siehe WO95/26205 und GB9624918.0 ).
  • Linker des oben in Zusammenhang mit den Metallreportern beschriebenen Typs können für Nichtmetallatomreporter verwendet werden, wobei der Nichtmetallatomreporter oder Gruppen, die derartige Reporter tragen, die Stelle einer oder aller chelatbildenden Gruppen einnehmen.
  • Organische chromophore oder fluorophore Reporter
  • Bevorzugte organische chromopore und fluorophore Reporter umfassen Gruppen mit einem ausgedehnten delokalisierten Elektronensystem, z.B. Cyanine, Merocyanine, Phthalocyanine, Naphthalocyanine, Triphenylmethine, Porphyrine, Pyryliumfarbstoffe, Thiapyryliumfarbstoffe, Squaryliumfarbstoffe, Croconiumfarbsroffe, Azuleniumfarbstoffe, Indoaniline, Benzophenoxaziniumfarbstoffe, Benzothiaphenothiaziniumfarbstoffe, Anthrachinone, Naphthochinone, Indathrene, Phthaloylacridone, Trisphenochinone, Azofarbstoffe, intramolekulare und intermolekulare Charge-Transfer-Farbstoffe und -Farbstoffkomplexe, Tropone, Tetrazine, Bis(dithiolen)komplexe, Bis(benzoldithiolat)komplexe, Iodanilinfarbstoffe, Bis(S,O-dithiolen)komplexe, etc. Beispiele von geeigneten organischen oder metallierten organischen Chromophoren können gefunden werden in "Topics in Applied Chemistry: Infrared absorbing dyes" Hrsg. M. Matsuoka, Plenum, NY 1990, "Topics in Applied Chemistry: The Chemistry and Application of Dyes", Waring et al., Plenum, NY, 1990, "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" Haugland, Molecular Probes Inc., 1996, DE-A-4445065 , DE-A-4326466 , JP-A-3/228046 , Narayanan et al. J. Org. Chem. 60:2391-2395 (1995), Lipowska et al. Heterocyclic Comm. 1:427-430 (1995), Fabian et al. Chem. Rev. 92:1197 (1992), WO96/23525 , Strekowska et al. J. Org. Chem. 57:4578-4580 (1992), WO (Axis) und WO96/17628 . Besondere Beispiele von Chromophoren, die verwendet werden können, umfassen Xylencyanol, Fluorescein, Dansyl, NBD, Indocyaningrün, DODCI, DTDCI, DOTCI und DDTCI.
  • Besonders bevorzugt sind Gruppen, die Absorptionsmaxima zwischen 600 und 1000 nm besitzen, um Interferenz mit Hämoglobinabsorption zu vermeiden (z.B. Xylencyanole).
  • Weitere derartige Beispiele umfassen: Cyaninfarbstoffe: wie Heptamethincyaninfarbstoffe, z.B. Verbindungen 4a bis 4g Tabelle II auf Seite 26 von Matsuoka (supra)
    Figure 00690001
    • 4a: wobei Y=S, X=I, R=Et
    • 4b: wobei Y=S, X=ClO4, R=Et
    • 4c: wobei Y=CMe2, X=1, R=Me
    • 4d: wobei Y=CMe2, X=ClO4, R=Me
    • 4e: wobei Y=CH=CH, X=I, R=Et
    • 4f: wobei Y=CH=CH, X=Br, R=Et
    • 4g: wobei Y=CH=CH, X=ClO4, R=Et
    und in Tabelle III auf Seite 28 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00690002
    wobei Y=O, X=1, R=Me
    wobei Y=CMe2, X=I, R=Me
    wobei Y=S, X=Br, R=Et
    Chalcogenpyrylomethinfarbstoffe, z.B. Verbindungen 12 auf Seite 31 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00700001
    wobei Y = Te, Se, O or NR;
    Monochalcogenpyrylomethinfarbstoffe, z.B. Verbindungen 13 auf Seite 31 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00700002
    wobei n = 1 oder 2;
    Pyryliumfarbstoffe, z.B. Verbindungen 14 (X=O) auf Seite 32 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00700003
    wobei X = O, S oder Se;
    Thiapyryliumfarbstoffe, z.B. Verbindungen 15 auf Seite 32 und Verbindung I auf Seite 167 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00710001
    wobei n = 1 oder 2;
    Squaryliumfarbstoffe, z.B. Verbindung 10 und Tabelle IV auf Seite 30 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00710002
    wobei X = CH=CH, Y = H und R = Et,
    X=S, Y=H und R=Et und
    X = CMe2, Y = H und R = Me,
    und Verbindung 6, Seite 26 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00710003
    wobei X = CH=CH, Y = H und R=Et;
    Croconiumfarbstoffe, z.B. Verbindung 9 und Tabelle IV auf Seite 30 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00710004
    wobei X = CH=CH, Y = H und R = Et,
    X = S, Y = H und R = Et
    X = CMe2, Y = H und R = Me
    und Verbindung 7, Seite 26 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00720001
    wobei X = CH=CH, Y = H und R = Et;
    Azuleniumfarbstoffe, d.h. Verbindung 8 auf Seite 27 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00720002
    Merocyaninfarbstoffe, z.B. Verbindung 16, R = Me, auf Seite 32 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00720003
    Indoanilinfarbstoffe, wie Kupfer- und Nickelkomplexe von Indoanilinfarbstoffen, z.B. Verbindung 6 auf Seite 63 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00730001
    wobei R = Et, R = Me, M = Cu,
    R = Et, R' = Me, M = Ni
    R = Me, R' = H, M = Cu oder
    R = Me, R' = H, M = Ni,
    Benzo[a]phenoxaziniumfarbstoffe und Benzo[a]phenothiaziniumfarbstoffe, z.B. wie auf Seite 201 von Matsuoka (supra) gezeigt, d.h.
    Figure 00730002
    wobei X = O oder S;
    1,4-Diaminoanthrachinon(N-alkyl)-3'-thioxo-2,3-dicarboximide, z.B. Verbindung 20 auf Seite 41 von Matsuoka (supra)
    Figure 00730003
    Indanthrenpigmente, z.B.
    Figure 00740001
    siehe Verbindung 21 auf Seite 41 von Matsuoka (supra);
    2-Arylamino-3,4-phthaloylacridonfarbstoffe, z.B. Verbindung 22 auf Seite 41 von Matsuoka (supra)
    Figure 00740002
    Trisphenochinonfarbstoffe, z.B. Verbindung 23 auf Seite 41 von Matsuoka (supra)
    Figure 00740003
    Azofarbstoffe, z.B. der Monoazofarbstoff, Verbindung 2 auf Seite 90 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00750001
    wobei X = CH=C(CN)2, R1 = R2 = Et, R3 = R4 = H,
    X = C(CN)=C(CN)2, R1 = R2 = Et, R3 = R4 = H oder
    X=
    Figure 00750002
    und Y = C=O, R1 = R2 = Et, R3 = R4 = H,
    oder Y = SO2, R1 = H, R2 = CH (Me) nBu, R3 = OMe und R4 = NHAc;
    Azofarbstoffe, z.B. der Polyazofarbstoff, Verbindung 5 auf Seite 91 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00750003
    Intramolekular-Charge-Transfer-Donor-Akzeptor-Infrarotfarbstoffe, z.B. Verbindungen 6 und 7 auf Seite 91 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00750004
    und
    Figure 00760001
    nichtbenzoide aromatische Farbstoffe, z.B. Verbindung 8, ein Tropon, auf Seite 92 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00760002
    Tetrazinradikalfarbstoffe, z.B. Verbindung 9 auf Seite 92 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00760003
    worin, X = p-Phenylen oder
    X = p-Terphenylen, wie auch Verbindung 10 auf Seite 92 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00770001
    worin X = p-Biphenyl;
    kationische Salze von Tetrazinradikalfarbstoffen, z.B. Verbindung 11 auf Seite 92 von Matsuoka (supra)
    Figure 00770002
    worin X = p-Phenylen;
    Donor-Akzeptor-Intramolekular-Charge-Transfer-Farbstoffe, z.B. CT-Komplexe von Verbindungen 13b und 14a bis 14c auf Seite 93 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00770003
    wobei X = CH=N-N(Ph)2 im Donor und
    • a) Y = CN, Z = NO2
    • b) Y = CN, Z = H oder
    • c) Y = Cl, Z = NO2 in dem Akzeptor;
    Anthrachinonfarbstoffe, z.B. Verbindungen 12 (X = S oder Se) auf Seite 38 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00780001
    worin X = S oder Se und Y = Tetrachlor, Tetrabrom, 2,3-Dicarbonsäure, 2,3-Dicarbonsäureanhydrid oder 2,3-Dicarbonsäure-N-phenylimid;
    Naphthochinonfarbstoffe, z.B. Verbindungen 2, 3 und 4 auf Seite 37 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00780002
    und
    Figure 00790001
    metallierte Azofarbstoffe, wie Azofarbstoffe, die Nickel, Kobalt, Kupfer, Eisen und Mangan enthalten; Phthalocyaninfarbstoffe, z.B. Verbindung 1 in Tabelle II auf Seite 51 von Matsuoka (supra), z.B.
    Figure 00790002
    Naphthalocyaninfarbstoffe, z.B. Verbindung 3 in Tabelle II auf Seite 51 von Matsuoka (supra), z.B.
    Figure 00790003
    Metallphthalocyanine, wie Phthalocyanine, die Aluminium, Silicium, Nickel, Zink, Blei, Cadmium, Magnesium, Vanadium, Kobalt, Kupfer und Eisen enthalten, z.B. Verbindung 1 in Tabelle III auf Seite 52 von Matsuoka (supra), z.B.
    Figure 00800001
    worin beispielsweise M = Mg;
    Metallnaphthocyanine, wie Naphthalocyanine, die Aluminium, Zink, Kobalt, Magnesium, Cadmium, Silicium, Nickel, Vanadium, Blei, Kupfer und Eisen enthalten, siehe Verbindung 3 in Tabelle III auf Seite 52 von Matsuoka (supra), z.B.
    Figure 00800002
    worin beispielsweise M = Mg;
    Bis(dithiolen)metallkomplexe, die ein Metallion wie Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen koordiniert an vier Schwefelatome in einem Bis(S,S'-bidentat)ligandkomplex aufweisen, z.B. siehe Tabelle I auf Seite 59 von Matsuoka (supra)
    Figure 00810001
    wobei
    R1 = R2 = CF3, M = Ni
    R1 = R2 = Phenyl, M = Pd,
    R1 = R2 = Phenyl, M = Pt,
    R1 = C4 bis C10 Alkyl, R2 = H, M = Ni,
    R1 = C4 bis C10 Alkyl, R2 = H, M = Pd,
    R1 = C4 bis C10 Alkyl, R2 = H, M = Pt,
    R1 = R2 = Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = p-CH3-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = p-CH3O-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = p-Cl-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = p-CF3-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = 3,4-diCl-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = o-Cl-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = o-Br-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = 3,4-diCl-Phenyl, M = Ni,
    R1 = R2 = p-CH3, M = Ni,
    R1 = R2 = 2-Thienyl, M = Ni,
    R1 = p-(CH3)2 N-Phenyl, R2 = Phenyl, M = Ni, und
    R1 = p-(CH3)2 N-Phenyl, R2 = p-H2N-Phenyl, M = Ni;
    Bis(benzoldithiolat)metallkomplexe, die ein Metallion aufweisen, wie Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen, koordiniert an vier Schwefelatome in einem Ligandkomplex, z.B. siehe Tabelle III auf Seite 62 von Matsuoka (supra), d.h.
    Figure 00820001
    wobei
    X = Tetramethyl, M = Ni,
    X = 4,5-Dimethyl, M = Ni,
    X = 4-Methyl, M = Ni,
    X = Tetrachlor, M = Ni,
    X = H, M = Ni,
    X = 4-Methyl, M = Co,
    X = 4-Methyl, M = Cu, und
    X = 4-Methyl, M = Fe;
    N,O-Bidentatindoanilinfarbstoffe, die ein Metallion aufweisen, wie Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen koordiniert an zwei Stickstoff- und zwei Sauerstoffatome von zwei N,O-Bidentatindoanilinliganden, z.B. Verbindung 6 in Tabelle IV auf Seite 63 von Matsuoka (supra), z.B.
    Figure 00820002
    wobei R = Et, R' = Me, M = Cu,
    R = Et, R' = Me, M = Ni,
    R = Me, R' = H, M = Cu, und
    R = Me, R' = H, M = Ni,
    bis(S,O-Dithiolen)metallkomplexe, die ein Metallion aufweisen, wie Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen koordiniert an zwei Schwefelatome und zwei Sauerstoffatome in einem Bis(S,O-bidentat)ligandkomplex, z.B. siehe US 3,806,462 , z.B.
    Figure 00830001
    a-Diimindithiolenkomplexe, die ein Metallion aufweisen, wie Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen koordiniert an zwei Schwefelatome und zwei Imino-Stickstoffatome in einem gemischten S,S- und N,N-Bidentatdiligandkomplex, z.B. siehe Tabelle II auf Seite 180, zweite von unten, von Matsuoka (supra) (siehe auch JP-Patente: 62/39,682 , 63/126,889 und 63/139,303 ), z.B.
    Figure 00830002
    und
    tris-(a-Diimin)komplexe, die ein Metallion aufweisen, das mit sechs Stickstoffatomen in einem Triligandkomplex koordiniert ist, z.B. siehe Tabelle II auf Seite 180 von Matsuoka (supra), letzte Verbindung (siehe auch JP-Patente 61/20,002 und 61/73,902 ), z.B.
    Figure 00840001
  • Repräsentative Beispiele von sichtbaren Farbstoffen umfassen Fluoresceinderivate, Rhodaminderivate, Cumarine, Azofarbstoffe, metallierbare Farbstoffe, Anthrachinonfarbstoffe, Benzodifuranonfarbstoffe, polycyclische aromatische Carbonylfarbstoffe, indigoide Farbstoffe, Polymethinfarbstoffe, Azacarbocyaninfarbstoffe, Hemicyaninfarbstoffe, Barbiturate, Diazahemicyaninfarbstoffe, Styrylfarbstoffe, Diarylcarboniumfarbstoffe, Triarylcarboniumfarbstoffe, Phthalocyaninfarbstoffe, Quinophthalonfarbstoffe, Triphenodioxazinfarbstoffe, Formazanfarbstoffe, Phenothiazinfarbstoffe, wie Methylenblau, Azur A, Azur B und Azur C, Oxazinfarbstoffe, Thiazinfarbstoffe, Naptholactamfarbstoffe, Diazahemicyaninfarbstoffe, Azopyridonfarbstoffe, Azobenzolfarbstoffe, Beizenfarbstoffe, saure Farbstoffe, basische Farbstoffe, metallisierte und vormetallisierte Farbstoffe, Xanthenfarbstoffe, Direktfarbstoffe, Leukofarbstoffe, die oxidiert werden können, um Farbstoffe zu erzeugen, die bathochrom verschoben von denjenigen der Precursor-Leukofarbstoffe getönt sind, und andere Farbstoffe, wie jene, die aufgelistet wurden von Waring, D.R. und Hallas, G. in "The Chemistry and Application von Dyes", Topcis in Applied Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y., 1990. Zusätzliche Farbstoffe können gefunden werden aufgelistet in Haugland, R.P., "Handbook of Fluorscent Probes and Research Chemicals", 6. Ausgabe, Molecular Probes, Inc., Eugene OR, 1996.
  • Derartige Chromophore und Fluorophore können entweder direkt an den Vektor oder innerhalb einer Linkerstruktur kovalent gebunden sein. Wieder können Linker des oben zusammen mit den Metallreportern beschriebenen Typs für organische Chromophore oder Fluorophore verwendet werden, wobei die Choromophore/Fluorophore den Platz von einigen oder allen chelatbildenden Gruppen einnehmen.
  • Wie mit den oben diskutierten Metallchelatbildnern können Chromophore/Fluorophore in oder auf teilchenförmigen Linkereinheiten getragen werden, z.B. in oder auf einem Vesikel, oder können kovalent an inerte Matrixteilchen gebunden sein, die auch als ein Lichtstreuungsreporter dienen können.
  • Teilchenförmige Reporter oder Linker-Reporter
  • Die teilchenförmigen Reporter und die Linker-Reporter fallen im Allgemeinen in zwei Kategorien – jene, bei denen das Teilchen eine Matrix oder Schale aufweist, die den Reporter trägt oder enthält, und jene, bei denen die Teilchenmatrix selbst der Reporter ist. Beispiele der ersten Kategorie sind: Vesikel (z.B. Micellen und Liposomen), die eine flüssige oder feste Phase enthalten, die den kontrastwirksamen Reporter enthält, z.B. ein chelatiertes paramagnetisches Metall oder Radionuklid, oder ein wasserlösliches iodiertes Röntgenstrahlungskonstrastmittel; poröse Teilchen, die mit dem Reporter beladen sind, z.B. mit paramagnetischem Metall beladene Teilchen eines Molekularsiebes; und feste Teilchen, z.B. ein inertes biotolerables Polymer, auf dem der Reporter gebunden oder aufgebracht ist, z.B. mit Farbstoff beladene Polymerteilchen.
  • Beispiele der zweiten Kategorie sind: lichtstreuende organische oder anorganische Teilchen, magnetische Teilchen (z.B. superparamagnetische, ferromagnetische oder ferrimagnetische Teilchen); und Farbstoffteilchen.
  • Bevorzugte teilchenförmige Reporter oder Reporter-Linker umfassen superparamagnetische Teilchen (siehe US-A-4770183 , PCT/GB97/00067 , WO96/09840 , etc.), echogene Vesikel (siehe WO92/17212 , PCT/GB97/00495 , etc.), Iod enthaltende Vesikel (siehe WO95/26205 und GB9624918.0 ) und mit Farbstoff beladene Polymerteilchen (siehe WO96/23524 ).
  • Die teilchenförmigen Reporter können einen oder mehrere Vektoren besitzen, die direkt oder indirekt an ihre Oberflächen gebunden sind. Im Allgemeinen wird es bevorzugt werden, eine Mehrzahl (z.B. 2 bis 50) von Vektoreinheiten pro Teilchen zu binden. Besonders günstig wird man, neben dem erwünschten Targetingvektor, auch flussverlangsamende Vektoren an die Teilchen binden, d.h. Vektoren, die eine Affinität für das Kapillarlumen oder andere Organoberflächen besitzen, die ausreichend ist, um die Passage des Kontrastmittels durch die Kapillaren oder das Zielorgan zu verringern, aber nicht selbst ausreicht, um das Kontrastmittel zu immobilisieren. Derartige flussverlangsamende Vektoren (z.B. beschrieben in GB9700699.3 ) können außerdem dazu dienen, das Kontrastmittel zu verankern, sobald es an seine Zielstelle gebunden ist.
  • Das Mittel, durch das die Vektor-an-Teilchen-Bindung erreicht wird, wird von der Natur der Teilchenoberfläche abhängen. Für anorganische Teilchen kann die Verbindung mit dem Teilchen beispielsweise mittels einer Wechselwirkung zwischen einer Metallbindungsgruppe (z.B. einer Phosphat-, Phosphonat- oder Oligo- oder Polyphosphatgruppe) auf dem Vektor oder auf einem Linker gebunden an den Vektor ausgeführt werden. Für organische (z.B. polymere) Teilchen kann die Vektorbindung mittels direkter kovalenter Bindung zwischen Gruppen auf der Teilchenoberfläche und reaktiven Gruppen im Vektor, z.B. Amid- oder Esterbindung, oder durch kovalente Bindung des Vektors und des Teilchens an einen Linker ausgeführt werden. Linker des oben zusammen mit chelatierten Metallreportern diskutierten Typs können verwendet werden, obwohl im Allgemeinen die Linker nicht verwendet werden, um Teilchen miteinander zu koppeln.
  • Für nicht-feste Teilchen, z.B. Tröpfchen (z.B. von wasserunlöslichen iodierten Flüssigkeiten, wie in US-A-5318767 , US-A-5451393 , US-A-5352459 und US-A-5569448 beschrieben) und Vesikel, kann der Linker günstigerweise hydrophobe "Anker"-Gruppen enthalten, z.B. gesättigte oder ungesättigte C12-30-Ketten, die die Teilchenoberfläche durchdringen und den Vektor an das Teilchen binden. Daher kann für Phospholipidvesikel der Linker dazu dienen, den Vektor kovalent an Phospholipid kompatibel mit der Vesikelmembran zu binden. Beispiele von Linkerbindung an Vesikel und anorganische Teilchen sind in GB9622368.0 und PCT/GB97/00067 beschrieben.
  • Außer den Vektoren können andere Gruppen an die Teilchenoberfläche gebunden werden, z.B. Stabilisatoren (um eine Aggregration zu verhindern) und Biodistributionsmodifizierer, wie PEG. Derartige Gruppen werden beispielsweise in PCT/GB97/00067 , WO96/09840 , EP-A-284549 und US-A-4904479 diskutiert.
  • Bevorzugt werden die V-L-R-Mittel der Erfindung die Rezeptortargetingvektoren direkt oder indirekt an einen Reporter gekoppelt haben, z.B. mit kovalent gebundenen Iodradioisotopen, mit Metallchelaten, die direkt oder über eine organische Linkergruppe gebunden sind, oder gekoppelt an einen teilchenförmigen Reporter oder Linker-Reporter, z.B. superparamagnetische Kristalle (optional beschichtet, z.B. wie in PCT/GB97/00067 ) oder ein Vesikel, z.B. eine Micelle oder ein Liposom, die/das ein iodiertes Kontrastmittel enthält.
  • Kurz gesagt können für die Bilderzeugungsmodalitäten MRI, Röntgenstrahlung, Lichtbilderzeugung, Nuklearbilderzeugung, Magnetotomographie und Electrical Impedance Tomography die favorisierten Reporter folgende sein:
    MRI superparamagnetische Eisenoxidteilchen, im Allgemeinen mit einer Teilchengröße kleiner als ungefähr 80 nm. Insbesondere Eisenoxide, bedeckt mit verschiedenen Bedeckungsmaterialien, wie Polyelektrolyte, PEG, Stärke und hydrolysierte Stärke sind bevorzugt. Paramagnetische Metallsubstanzen einschließlich sowohl Chelate als auch teilchenförmige Materialien sind auch nützlich.
    Lichtbilderzeugung Eine beliebige lichtbilderzeugende Reportergruppe. Der Fokus sollte auf Substanzen liegen, die im Bereich des nahen Infrarots absorbieren.
    Nuklearmedizin Radioaktive Chelate, die 99Tc oder 111In aufweisen, wie auch direkt radiomarkierte Vektoren mit radiomarkierten Halogensubstituenten, wie 123I, 125I, 131I, 75Br oder 77Br.
    Magnetotomographie Superparamagnetische Eisenoxideteilchen wie oben beschrieben.
    Electrical Impedance Tomography Polyionische Spezien, z.B. Polymere mit Tomography ionischen Gruppen in den Wiederholungseinheiten.
  • Die Mittel der Erfindung können an Patienten zur Bilderzeugung in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, um den erwünschten Kontrast mit der bestimmten Bilderzeugungstechnik zu ergeben. Wo der Reporter ein Metall ist, sind im Allgemeinen Dosierungen von ungefähr 0,001 bis 5,0 mmol chelatiertes Bilderzeugungsmetallion pro Kilogramm des Patientenkörpergewichts wirksam, um angemessene Kontrastverbesserungen zu erhalten. Für die meisten MRI-Anwendungen werden die bevorzugten Dosierungen an bilderzeugendem Metallion im Bereich von 0,02 bis 1,2 mmol/kg Körpergewicht liegen, während für Röntgenstrahlungsanwendungen Dosierungen von 0,05 bis 2,0 mmol/kg im Allgemeinen wirksam sind, um eine Röntgenstrahlungsabschwächung zu erreichen. Bevorzugte Dosierungen für die meisten Röntgenstrahlungsanwendungen sind 0,1 bis 1,2 mmol der Lanthandien- oder Schwermetallverbindung/kg Körpergewicht.
  • Wo der Reporter ein Radionuklid ist, werden Dosierungen von 0,01 bis 100 mCi, bevorzugt 0,1 bis 50 mCi normalerweise pro 70 kg Körpergewicht ausreichen. Wo der Reporter ein superparamagnetisches Teilchen ist, wird die Dosierung normalerweise zwischen 0,5 bis 30 mg Fe/kg Körpergewicht sein.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit konventionellen pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Hilfsstoffen formuliert werden, zum Beispiel Emulgatoren, Fettsäureester, Geliermittel, Stabilisatoren, Antioxidanzien, die Osmolalität einstellende Mittel, Puffer, den pH einstellende Mittel, etc., und können in einer Form vorliegen, die für die parenterale Verabreichung, beispielsweise Injektion oder Infusion oder die Verabreichung direkt in die Vaskulatur geeignet ist. Daher können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in konventionellen pharmazeutischen Verabreichungsformen vorliegen, wie beispielsweise Lösungen, Suspensionen und Dispersionen in physiologisch annehmbaren Trägermedien, zum Beispiel Wasser für Injektionen.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können deshalb für die Verabreichung unter Verwenden physiologisch annehmbarer Träger oder Exzipienten in einer Weise formuliert werden, die voll innerhalb des Fachwissens liegt. Beispielsweise können die Verbindungen, optional mit der Zugabe von pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, in einem wässrigen Medium suspendiert oder aufgelöst werden, wobei die resultierende Lösung oder Suspension dann sterilisiert wird.
  • Parenteral verabreichbare Formen, z.B. intravenöse Lösungen, sollten steril und frei von physiologisch nicht annehmbaren Mitteln sein, und sollten eine niedrige Osmolalität besitzen, um eine Irritation oder andere nachteilige Wirkungen bei der Verabreichung zu minimieren, und daher sollte das Kontrastmedium bevorzugt isotonisch oder leicht hypertonisch sein. Geeignete Vehikel umfassen wässrige Vehikel, die üblicherweise für die Verabreichung parenteraler Lösungen verwendet werden, wie Natriumchloridinjektion, Ringers-Injektion, Dextroseinjektion, Dextrose- und Natriumchloridinjektion, Laktierte Ringers-Injektion und andere Lösungen, wie in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Ausgabe, Easton: Mack Publishing Co., S. 1405-1412 und 1461-1487 (1975) und The National Formulary XIV, 14. Ausgabe, Washington: American Pharmaceutical Association (1975) beschrieben. Die Lösungen können Konservierungsstoffe, antimikrobielle Mittel, Puffer und Antioxidanzien, die üblicherweise für parenterale Lösungen verwendet werden, Exzipienten und andere Additive enthalten, die mit den Chelaten kompatibel sind und die nicht mit der Herstellung, Lagerung oder der Verwendung von Produkten interferieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun weiter veranschaulicht mittels der folgenden Beispiele. Wenn nicht anders bezeichnet, sind alle Prozentsätze in Gewichtsprozent angegeben.
  • Beispiel 1
  • Kontrastmittel für MR-Bilderzeugung von Angiogenese
  • Verbindung 1
  • Lysin (0,1 g, 0,7 mmol) wird zu einer Lösung von N2-[3S-Hydroxy-4-(N-hydroxyamino)2R-isobutylsuccinyl]-L-(4-oxymethylcarboxy)phenylalanin-N1-methylamid (hergestellt gemäß WO94/02447 , 0,3 g, 0,7 mmol) und DCC (N,N-Dicyclohexylcarbodiimid) in trockenem DMF (N,N-Dimethylformamid) gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei einer Umgebungstemperatur gerührt, gefolgt von TLC.
  • Die Dispersion wird über Nacht bei +4°C belassen. Die Dispersion wird gefiltert und das Lösemittel wird am Rotationsverdampfer verdampft, bevor die Substanz durch Chromatographie gereinigt wird.
  • Verbindung 2
  • Diethylentriaminpentaessigsäuredieanhydrid (17,9 g, 50 mmol) wird in trockenem DMF aufgelöst und die Verbindung 1 (0,3 g, 0,5 mmol), aufgelöst in trockenem DMF, wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei erhöhter Temperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Der Reaktion folgt eine TLC. Das Lösemittel wird am Rotationsverdampfer verdampft und die Substanz durch Chromatographie gereinigt.
  • Gd(III)-Chelat der Verbindung 2
  • Zu einer Lösung der Verbindung 2 (0,4 g, 0,4 mmol) in Wasser wird Gadoliniumoxid Gd2O3 (0,1 g, 0,2 mmol) zugegeben und die Mischung wird bei 95°C erwärmt. Nach der Filtration wird die Lösung verdampft und in vacuo bei 50°C getrocknet.
  • Beispiel 2
  • Kontrastmittel für MR-Bilderzeugung von Angiogenese
  • Verbindung 3
  • Lysin (0,1 g, 0,7 mmol) wird zu einer Lösung von N-(4-Octylphenyl)-3-(2-carboxyethyl)-6,7-dihydro-5H-thiazolo[3,2-a]pyrimidin-2-carboxamid (hergestellt gemäß EP-A-618208 , 0,3 g, 0,7 mmol) und DDC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid) in trockenem DMF (N,N-Dimethylformamid) gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Umgebungstemperatur gerührt, gefolgt von TLC. Die Dispersion wird über Nacht bei +4°C belassen. Die Dispersion wird gefiltert und das Lösemittel wird am Rotationsverdampfer verdampft, bevor die Substanz durch Chromatographie gereinigt wird.
  • Verbindung 4
  • Diethylentriaminpentaessigsäuredianhydrid (17,9 g, 50 mmol) wird in trockenem DMF aufgelöst und die Verbindung 3 (0,3 g, 0,5 mmol), aufgelöst in trockenem DMF, wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei erhöhter Temperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Der Reaktion folgt TLC. Das Lösemittel wird am Rotationsverdampfer verdampft und die Substanz wird durch Chromatographie gereinigt.
  • GD(III)-Chelat der Verbindung 4
  • Zu einer Lösung der Verbindung 4 (0,4 g, 0,4 mmol) in Wasser wird Gadoliniumoxid Gd2O3 (0,1 g, 0,2 mmol) gegeben und die Mischung wird bei 95°C erwärmt. Nach der Filtration wird die Lösung verdampft und in vacuo bei 50°C getrocknet.
  • Beispiel 3
  • Kontrastmittel für Nuklearmedizin zur Erfassung von Angiogenese
  • 99mTc-Chelat der Verbindung 2
  • Die Verbindung 2 von Beispiel 1 (1 mg) wird in 0,1 N NaOH aufgelöst. SnCl2·2H2O (100 μg), aufgelöst in 0,05 N HCl und eine Lösung von 10-100 mCi 99mTc in der Form von Natriumpertechnetat in Salzlösung wird zugegeben. Der pH der Lösung wird auf pH 7-8 durch Zugabe von 0,5 M Phosphatpuffer (pH 5) nach weniger als einer Minute eingestellt. Der Reaktion folgt TLC und die Substanz wird durch Chromatographie gereinigt.
  • Beispiel 4
  • Kontrastmittel für Nuklearmedizin zur Erfassung von Angiogenese
  • 99mTc-Chelat Verbindung 4
  • Die Verbindung 4 von Beispiel 2 (1 mg) wird in 0,1 N NaOH aufgelöst. SnCl2·2H2O (100 μg), aufgelöst in 0,05 N HCl und eine Lösung von 10-100 mCi 99mTc in der Form von Natriumpertechnetat in Salzlösung wird zugegeben. Der pH der Lösung wird auf pH 7-8 durch Zugabe von 0,5 M Phosphatpuffer (pH 5) nach weniger als einer Minute eingestellt. Der Reaktion folgt TLC und die Substanz wird durch Chromatographie gereinigt.
  • Beispiel 5
  • Kontrastmittel für Nuklearmedizin zur Erfassung von Angiogenese
  • Eine wässrige Lösung von 131I2 (2 Äquivalente) und Natriumperchlorat (1 Äquivalent) wird zu einer wässrigen Lösung von N2-[3S-Hydroxy-4-hydroxyamino)-2R-isobutylsuccinyl]-L-phenylalanin-N1-methylamid (hergestellt gemäß WO94/02446 , 1 Äquivalent) zugegeben. Das Lösemittel wird am Rotationsverdampfer verdampft und die Substanz wird durch Chromatographie gereinigt.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von DTPA-Monoamidgadoliniumkomplex umfassend einen Vektor zum Targeting eines VEGF-Rezeptors für MR-Erfassung von Angiogenese
    Figure 00930001
  • a) Synthese von 6,7-Dimethoxy-3H-Chinazolin-4-on
  • Eine Mischung von 2-Amino-4,5-dimethoxybenzoesäure (9,9 mg, 0,050 mmol) und Formamid (5 ml) wurde bei 190°C 6 Stunden lang erwärmt. Die Mischung wurde auf 80°C gekühlt und auf Wasser gegossen (25 ml). Präzipitiertes Material wurde abgefiltert, mit Wasser gewaschen und in vacuo betrocknet. Ausbeute 1,54 g (15 %), braunes Pulver. Die Struktur wurde durch 1H (500 MHz)- und 13C-NMR (125 MHz)-Analyse bestätigt.
  • b) Synthese von 4-Chlor-6,7-dimethoxychinazolin
  • Eine Suspension der Verbindung von a) (1,03 g, 5,00 mmol) in Phosphoroxychlorid (20 ml) wurde 3 Stunden unter Rückfluss gekocht. Die dunkle Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde durch eine kurze Silicasäule gefiltert und konzentriert, um 392 mg (35 %) eines cremefarbenen Materials zu ergeben. 1H-NMR (300 MHz)- und 13C-NMR (75 MHz)-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • c) Synthese von [4-(6,7-Dimethoxychinazolin-4-ylamino)-phenyl]essigsäure
  • Eine Mischung der Verbindung von b) (112 mg, 0,500 mmol) und 4-Aminophenylessigsäure (76 mg, 0,50 mmol) in 2-Propanol (8 ml) wurde 3 Stunden lang unter Rückfluss gekocht. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und präzipitiertes Material wurde isoliert, mit 2-Propanol gewaschen und in vacuo getrocknet. Ausbeute 183 mg (97 %), blassgelbes festes Material. Die Struktur wurde mit 1H-NMR (500 MHz)- und 13C-NMR (125 MHz)-Analyse verifiziert. Weitere Charakterisierung wurde unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäurematrix) ausgeführt, was m/z für [MH]+ bei 341 ergab, erwartet 340.
  • d) Synthese von t-Butyl-(6-{2-[4-(6,7-dimethoxychinazolin-4-ylamino)phenyl]acetylamino}hexyl)carbamat
  • Zu einer Suspension der Verbindung von c) (38 mg, 0,10 mmol) und N-Boc-1,6-diaminohexanhydrochlorid (25 mg, 0,10 mmol) in DMF (2,0 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (34 ml, 0,20 mmol) gegeben. Zu der klaren Lösung wurde N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (19 mg, 0,10 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (15 mg, 0,10 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann auf 25 ml Wasser gegossen, das Natriumcarbonat (2,5 g) und Natriumchlorid (4,0 g) enthielt. Organisches Material wurde in Chloroform extrahiert und die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde gefiltert und konzentriert. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silica, Chloroform/Methanol/Essigsäure 85:10:5) gereinigt und schließlich aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 54 mg ( 90 %), gelb-weißes festes Material (Acetat). Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäurematrix) charakterisiert, was m/z für [MH]+ bei 539 wie erwartet ergab.
  • Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von 1H (500 MHz)- und 13C (125 MHz)-NMR-Spektroskopie.
  • e) Synthese von N-(6-Aminohexyl)-[4-(6,7-dimethoxychinazolin-4-ylamino)phenyl]acetamidhydrochlorid
  • Die Verbindung von d) (27 mg, 0,050 mmol) wurde in Dioxan (3 ml) durch sanftes Erwärmen aufgelöst. Zu der Lösung wurde 4 N HCl in Dioxan (0,5 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und in vacuo konzentriert, um eine quantitative Ausbeute der Titelverbindung zu ergeben. Eine Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden der MALDI-Massenspektrometrie (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäurematrix), was m/z für [MH]+ bei 439 wie erwartet ergab. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von analytischem HPLC (Säule Vydac 218TP54, Gradient 12 bis 24 % B über 20 Minuten, A = Wasser/0,1 % TFA, B = Acetonitril/0,1 % TFA, Flussgeschwindigkeit 1,0 ml/min), was einen einzelnen Produktpeak mit einer Retentionszeit von 13,0 min, detektiert bei 340 nm ergab. Eine Charakterisierung wurde auch ausgeführt mittels NMR-Spektroskopie, was 1H (500 MHz)- und 13C (125 MHz)-Spektren in Übereinstimmung mit der Struktur ergab.
  • f) Synthese eines DTPA-Monoamidderivats für Gadoliniumchelatierung (Struktur oben gezeigt)
  • N,N-Diisopropylethylamin (17 μl, 0,10 mmol) wurde zu einer Suspension der Verbindung von e) (0,05 mmol) und DTPA-Anhydrid (179 mg, 0,500 mmol) in DMF (5 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und in vacuo konzentriert. HPLC-Analyse (Säule Vydac 218TP54, Gradient 16-28 % B über 20 Minuten, A = Wasser/0,1 % TFA, B = Acetonitril/0,1 % TFA, Flussgeschwindigkeit 1,0 ml/min) ergab einen Produktpeak bei 7,9 min für die durch LC-MS (ESI) gezeigt wurde, dass sie der Titelverbindung (m/z für [MH]+ bei 813, erwartet 814) entsprach. Das Produkt wurde durch präparative HPLC gereinigt (Säule Vydac 218TP1022, Gradient 16-28 % B über 60 Minuten, A = Wasser/0,1 % TFA, B = Acetonitril/0,1 % TFA, Flussgeschwindigkeit 10,0 ml/min, Erfassung bei 254 nm), was eine Ausbeute von 6,7 mg an gereinigtem Material ergab. Analyse des gereinigten Materials durch analytische HPLC zeigte eine Verschiebung in der Retentionszeit auf 5,6 min (analytische Bedingungen wie oben beschrieben), wofür durch MALDI-Massenspektrometrie gezeigt wurde, dass es dem Eisenkomplex entsprach, was m/z bei 870 für den Komplex und 816 für den freien Ligand ergab.
  • g) Herstellung das Gadoliniumkomplexes der Verbindung von f)
  • Die Verbindung von f) (0,1 mg) wurde in einer wässrigen Lösung von Gadoliniumtrichlorid (Konz. 2 mg/ml, 0,1 ml) aufgelöst. Die Mischung wurde über Nacht gerührt. Die quantitative Umwandlung zum Gadoliniumkomplex wurde durch MALDI-Massenspektrometrie (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäurematrix) verifiziert, was m/z-Peaks bei 970, 992 und 1014 für den Gadoliniumkomplex (Gadolinium, Gadolinium/Natrium bzw. Gadolinium/Dinatrium) und bei 816/838 entsprechend dem freien Liganden/Natriumkomplex ergab. Keine Spur des Eisenkomplexes konnte detektiert werden.
  • Beispiel 7
  • Herstellung eines DTPA-Bisamidgadoliniumkomplexes umfassend einen Vektor zum Targeting eines VEGF-Rezeptors für die MR-Erfassung von Angiogenese
    Figure 00970001
  • a) Synthese eines DTPA-Bisamidderivats für Gadoliniumchelatierung (Struktur oben gezeigt)
  • Die analytische HPLC der Reaktionsmischung in Beispiel 6f) ergab auch einen Peak bei 16,8 min, für das durch LC-MS (EIS)-Analyse gezeigt wurde, dass er dem oben gezeigten DTPA-Bisamid entsprach, was m/z bei 1233 für [MH]+ wie erwartet und 616,6 wie erwartet für [MH2]2+ ergab. Das Produkt wude durch präparative HPLC (Bedingungen wie in Beispiel 6f beschrieben) gereinigt, um 14 mg des reinen Materials nach der Lyophilisierung zu ergeben. Eine Analyse des gereinigten Materials durch analytische HPLC zeigte eine Verschiebung in der Retentionszeit von 16,8 min (in der rohen Mischung) auf 11,1 min aufgrund der Bildung des Eisenkomplexes währed der Reinigung, wie verifiziert durch MALDI-Massenspektrometrie (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäurematrix), was m/z bei 1291 für den Eisenkomplex und 1237 für den freien Ligand ergab.
  • b) Herstellung des Gadoliniumkomplexes der Verbindung von a)
  • Die Verbindung von a) wurde mit Gadoliniumtrichlorid wie in Beispiel 6g) beschrieben behandelt. Nach 2 Stunden Reaktionszeit zeigte MALDI-Massenspektrometrie eine Umwandlung zu dem Gadoliniumkomplex, was m/z bei 1391 für den Gadoliniumkomplex und 1235 für den freien Ligand ergab.
  • Beispiel 8
  • Carboxymethyl-[2-(carboxymethyl-{2-[carboxymethyl-({2-[3-({3-oxo-2-[2-(pyridin-2-ylamino)-ethyl]-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonyl}-amino)propionylamino]-ethylcarbamoyl}-methyl)-amino]-ethyl}-amino)-ethyl]-amino}essigsäure (12)
    Figure 00980001
  • a) 4-Methylisophthalsäure (2)
  • Zu einer THF (130 ml)-Lösung von 3-Brom-4-methylbenzoesäure (5,0 g, 23,25 mmol) unter Stickstoff und gekühlt auf -78°C (Trockeneis/Methanol) wurde MeMgBr in Ether (3,0 M, 8,5 ml, 25,57 mmol) in einer derartigen Geschwindigkeit gegeben, dass die Temperatur nicht -75°C überschritt. Man ließ die Temperatur dann auf -60°C ansteigen und nachdem die Gasentwicklung aufgehört hatte, wurde die Lösung wieder auf -78°C gekühlt. BuLi in Hexan (1,6 M, 29,06 ml, 46,50 mmol) wurde dann tropfenweise derart zugegeben, dass die Temperatur nicht über -75°C anstieg. Die Mischung wurde dann bei dieser Temperatur 15 Minuten lang gerührt, bevor zerstoßenes Trockeneis (4,4 g, 100 mmol) zugegeben wurde. Das Präzipitat wurde heftig gerührt, während man die Temperatur frei auf Umgebungstemperatur ansteigen ließ. Die Mischung wurde unter Verwendung von 6 N HCl sauer gemacht und das feste Material wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Die Umkristallisation aus Wasser ergab die cremefarbene reine Verbindung (81 %) Smp. 296-298°C (sublimiert). NMR bestätigt die erwartete Struktur.
  • b) 4-Methylisophthalmethylester (4)
  • Eine Mischung der Verbindung (2) (2,83 g, 15,71 mmol), Thionylchlorid (50 ml) und DMF (3 Tropfen) wurde 2 Stunden lang unter Rückfluss erwärmt. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wurde überschüssiges Thionylchlorid unter reduziertem Druck (Rotationsverdampfer) entfernt. Das dunkle Öl, das erhalten wurde, wurde in Kohlenstofftetrachlorid (30 ml) aufgelöst, mit Pyridin (1 ml, 12,43 mmol) und Methanol (20 ml) behandelt und bei Umgebungstemperatur 2 Stunden lang gerührt. Die Lösemittel wurden verdampft und der Rückstand wurde durch Flashchromatographie: Silica, Hexan/EtOAc (9:1) gereinigt.
  • c) 4-Bromethylisophthalsäuredimethylester (5)
  • Eine Mischung von (4) (0,96 g, 4,61 mmol), Dibenzoylperoxid (56 mg, 0,23 mmol) und N-Bromsuccinimid (NBS) (0,82 g, 4,61 mmol) in Kohlenstofftetrachlorid (20 ml) wurde 20 Stunden lang unter Rückfluss erwärmt. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur und Filtrieren wurde das Lösemittel verdampft, um ein gelbes Öl zu ergeben. Flashchromatographie: Silica, Hexan/EtOAc (7:3) ergab die reine Verbindung.
  • d) 3-Oxo-2-[2-(pyridin-2-ylamino)-ethyl]2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonsäuremethylester (6)
  • Eine Lösung von (5) (511 mg, 1,78 mmol) in Toluol (10 ml) wurde mit Et3N (744 μl, 5,33 mmol) behandelt und N1-Pyridin-2-yl-ethan-1,2-diamin (244 mg, 1,78 mmol) [hergestellt durch Behandlung von 2-Brompyridin mit überschüssigem Ethylendiamin und Pyridin] behandelt und die Mischung wurde 6 Stunden lang unter Rückfluss gekocht. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur und Verdampfen des Lösemittels wurde der Rückstand durch Flashchromatographie: Silica, CH2Cl2/Aceton (3:2) gereinigt.
  • e) 3-Oxo-2-[2-pyridin-2-ylamino)-ethyl]2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonsäure (7)
  • Eine Methanollösung (6 ml) von (6) (301 mg, 0,97 mmol) und 1 N NaOH (3 ml) wurde bei Umgebungstemperatur 24 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde unter Verwenden von 1 M NaHSO4-Lösung sauer gemacht und das präzipitierte Produkt wurde durch Filtrieren gesammelt, gründlich mit Wasser gewaschen und über P2O5/Bluegel 24 Stunden lang getrocknet.
  • f) 3-({3-Oxo-2-[2-(pyridin-2-ylamino)-ethyl]2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonyl}amino)-propionsäure-tert-butylester (8)
  • Eine Lösung von (7) (166 mg, 0,56 mmol), N-Methylmorfolin (185 μl, 1,68 mmol), BOP (322 mg, 0,73 mmol) und H-β-ala-OtBu (152 mg, 0,84 mmol) in DMF (5 ml) wurde bei Umgebungstemperatur 20 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde mit Ethylactet (10 ml) verdünnt und dann jeweils einmal mit H2O, NaHCO3, 10 % KHSO4 und Salzlauge (5 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und konzentriert. Flashchromatographie (Silica, EtOAc) ergab das Ester (8) als einen weißen Festkörper.
  • g) 3-({3-Oxo-2-[2-(pyridin-2-ylamino)-ethyl]2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonyl}amino)-propionsäure (9)
  • Eine Lösung des Esters (8) (252 mg, 0,60 mmol), TFA (4 ml) und CH2Cl2 (8 ml) wurde bei Umgebungstemperatur 3 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde bis zum Trocknen verdampft und der Rückstand durch Flashchromatographie (Silica, EtOH/NH4OH 19:1) gereinigt, um (9) als cremefarbenen Schaum zu ergeben. NMR bestätigt die Struktur.
  • Figure 01010001
  • h) {2-[3-({3-Oxo-2-[2-(pyridin-2-ylamino)-ethyl]-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonylamino)-propionylaminol-ethyl}-carbaminsäure-tert-butylester (10)
  • Zu einer Lösung der Säure (9) (20 mg, 0,054 mmol) in DMF (2 ml) wurde N-Methylmorfolin (NMM) (16,40 mg, 0,162 mmol), BOP (Castro's-Reagens) 31,05 mg, 0,070 mmol) und das BOC-geschützte Diamin (13 mg, 0,081 mmol) gegeben und die Mischung wurde bei Umgebungstemperatur 20 Stunden lang gerührt. Nach der Verdünnung mit EtOAc (5 ml) wurde die Lösung einmal jeweils mit H2O, gesätt. NaHCO3, 10 % KHSO4 und Salzlauge gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO4) und konzentriert. Flashchromatographie (Silica, 1:1 CH2Cl2/Aceton). MALDI-MS; 510,59.
  • i) 3-Oxo-2-[2-(pyridin-2-ylamino)-ethyl]-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonsäure[2-(2-aminoethylcarbamoyl)-ethyl]-amid (11)
  • Eine CH2Cl2-Lösung (3 ml) von (10) (20 mg, 0,039 mmol) und TFA (2 ml) wurde unter Umgebungsbedingungen 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und der Rückstand durch Flashchromatographie (Silica, 19:1, CH2Cl2/Aceton) gereinigt, um (4) als einen weißen Feststoff zu ergeben. MALDI-MS; 410,48.
  • j) Carboxymethyl-[2-(carboxymethyl-{2-[carboxymethyl-f{2-[3-[{3-oxo-2-[2-[pyridin-2-ylamino)-ethyl]-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carbonyl}-amino)-propionylaminolethylcarbamoyl}-methyl)-amino]-ethyl}-amino)-ethyl]-amino}-essigsäure (12)
  • Eine Lösung von (11) (15 mg, 0,36 mmol), N,N-Diisopropylamin (17 μl, 0,10 mmol) und DTPA-Anhydrid (129 mg„ 0,36 mmol) in DMF (2 ml) wurde bei Umgebungstemperatur 3 Stunden lang gerührt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Acetonitril/0,1 % TFA in Wasser) gereinigt.
  • Beispiel 9
  • Herstellung eines DTPA-Monoamidgadoliniumkomplexes umfassend einen Vektor zum Targeting eines bFGF-Rezeptors für die MR-Erfassung von Angiogenese
    Figure 01020001
  • a) Synthese von: {3-[2-(4-Chlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorphenyl)-ethyl]-3H-imidazol-1-yl}-essigsäure-tert-butylester
  • 1-[2-(4-Chlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorphenyl)-ethyl]-1H-imidazol (1 g, 2,25 mmol) und tert-Butylbromacetat (1 ml, 6,8 mmol) wurden in 15 ml Acetonitril aufgelöst und über Nacht unter Rückfluss erwärmt. TLC zeigte eine volle Umwandlung des Ausgangsmaterials. Das Lösemittel wurde gekühlt, in vacuo verdampft und das Rückstandsöl wurde in Chloroform aufgelöst und mit Ether verrieben. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie identifiziert und in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
  • b) Synthese von: {3-[2-(4-Chlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorphenyl)-ethyl]-3H-imidazol-1-yl}-essigsäure
  • Die Verbindung von a) (500 mg, 1 mmol) wurde in 2 ml Dichlormethan aufgelöst und in einem Eisbad gekühlt. 2 ml Trifluoressigsäure wurde zugegeben, das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang gerührt. TLC zeigte eine volle Umwandlung des Ausgangsmaterials. Das Lösemittel wurde in vacuo entfernt und das Produkt im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
  • c) Synthese von: [6-(2-{3-[2-(4-Chlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorphenyl)-ethyl]-3H-imidazol-1-yl}-acetylamino)-hexyl]-carbaminsäure-tert-butylester
  • Das Produkt von b) wurde zu c) durch die für Beispiel 6d) beschriebene Prozedur umgewandelt, und das Produkt wurde durch Flashchromatographie gereinigt.
  • d) Synthese von: N-(6-Aminohexyl)-2-{3-[2-(4-chlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorphenyl)ethyl]-3H-imidazol-1-yl}-acetamid
  • Das Produkt von c) wurde zu d) durch die für Beispiel 6e) beschriebene Prozedur umgewandelt. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
  • e) Synthese von: ((2-{[2-(Bis-carboxymethvlamino)-ethyl]-carboxymethylamino}ethyl)-{[6-(2-{3-[2-(4-chlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorphenyl)-ethyl]-3H-imidazol-1-yl}acetylamino)-hexylcarbamoyl]-methyl}-amino)-essigsäure
  • Das Produkt von d) wurde zu e) durch die für Beispiel 6f) beschriebene Prozedur umgewandelt. Eine Reinigung wurde durch präparative HPLC wie in Beispiel 6f) beschrieben ausgeführt.
    • f) Die Herstellung des Gadoliniumkomplexes der Verbindung e) wurde durch die in Beispiel 6g) beschriebene Prozedur ausgeführt.
  • LITERATURSTELLEN, ZITIERT IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste von Literaturstellen, die vom Anmelder zitiert sind, ist nur als Annehmlichkeit für den Leser gedacht. Sie bildet nicht Teil der europäischen Patentschrift. Sogar obwohl große Sorgfalt unternommen wurde, die Literaturstellen zusammenzustellen, können Irrtümer oder Unterlassungen nicht ausgeschlossen werden, und das EPA erkennt keinerlei Haftung in dieser Hinsicht an.
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Claims (10)

  1. Verfahren zum Erzeugen eines Bildes eines lebendigen menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Subjekts, dem zuvor ein Kontrastmittel verabreicht worden ist, umfassend Erzeugen eines Bildes mindestens eines Teils des Subjekts, an den das Kontrastmittel abgegeben wurde, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontrastmittel eine Zusammensetzung eines Materials der Formel I ist V-L-R (I)wobei V eine Vektoreinheit mit einer Affinität für einen Angiogenese-bezogenen endothelialen Zellrezeptor ist, L eine Linkereinheit oder eine Bindung ist, und R eine detektierbare Einheit ist, dadurch gekennzeichnet, dass V eine nicht-peptidische organische Gruppe ist, oder V peptidisch ist und R eine makromolekulare oder teilchenförmige Spezies ist, die eine Vielzahl von Markern bereitstellt, die in der in-vivo-Bildgebung detektierbar sind.
  2. Verfahren zum Überwachen des Effekts einer Behandlung eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Subjekts mit einem Arzneimittel, um mit Angiogenese verbundene Effekte zu bekämpfen oder zu provozieren, wobei das Verfahren umfasst Detektieren der Aufnahme einer zuvor verabreichten Zusammensetzung der Formel I V-L-R (I)wobei V eine Vektoreinheit mit einer Affinität für einen Angiogenese-bezogenen endothelialen Zellrezeptor ist, L eine Linkereinheit oder eine Bindung ist, und R eine detektierbare Einheit ist, dadurch gekennzeichnet, dass V eine nicht-peptidische organische Gruppe ist, oder V peptidisch ist und R eine makromolekulare oder teilchenförmige Spezies ist, die eine Vielzahl von Markern bereit stellt, die in der in-vivo-Bildgebung detektierbar sind, durch Angiogenesebezogene endotheliale Zellrezeptoren, durch Erzeugen eines Bildes mindestens eines Teils des Subjekts, wobei die Verabreichung und Detektion gegebenenfalls, aber bevorzugt wiederholt bewirkt wird, z.B. vor, während oder nach der Behandlung mit dem Arzneimittel.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei V ein Vektor für einen Integrin-Rezeptor ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei V ein Vektor für einen Fibronektin-Rezeptor ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei V ein Vektor für den VEGF-Rezeptor ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei V ein Vektor für den Urokinase-Plasminogen-Aktivator-Rezeptor (UPAR) ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei V ausgewählt ist aus der Liste von Vektoreinheiten, die umfasst: N2-[3S-Hydroxy-4-(N-hydroxyamino)2R-isobutylsuccinyl]-L-(4-oxymethylcarboxy)phenylalanin-N1-methylamid, N-(4-Octylphenyl)-3-(2-carboxyethyl)-6,7-dihydro-5H-thiazolo[3,2-a]pyrimidin-2-carboxamid, N2-[3S-Hydroxy-4-hydroxyamino)-2R-isobutylsuccinyl]-L-phenylalanin-N1-methylamid, N-(6-Aminohexyl)-[4-(6,7-dimethoxy-chinazolin-4-ylamino)phenyl]acetamidhydrochlorid, 3-Oxo-2-[2-(pyridin-2-ylamino)-ethyl]-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-carboxylsäure[2-(2-aminoethylcarbamoyl)-ethyl]-amid, und N-(6-Amino-hexyl)-2-{3-[2-(4-chlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorphenyl)-ethyl]-3H-imidazol-1-yl}-acetamid.
  8. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei V-L-R ausgewählt ist aus den folgenden Resten: Gd(III), 99mTc- oder 131I2-Chelate der DTPA-Derivate der Vektoreinheiten nach Anspruch 7.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei R ein Radionuklid ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei R ein Jod- oder Metallradionuklid ist.
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