DE69836333T2

DE69836333T2 - Neisseria lactoferrin-bindendes protein

Info

Publication number: DE69836333T2
Application number: DE69836333T
Authority: DE
Inventors: Margareta Annika PETTERSSON-FERNHOLM; Petrus Johannes TOMMASSEN
Original assignee: STW TECHNOLOGY FOUNDATION; TECHNOLOGY FOUNDATION (TECHNOLOGIESTICHTING STW); Rijksuniversiteit Utrecht
Current assignee: STW TECHNOLOGY FOUNDATION; TECHNOLOGY FOUNDATION (TECHNOLOGIESTICHTING STW); Rijksuniversiteit Utrecht
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: CN1204253C; PL338649A1; ATE344325T1; JP2001514894A; NZ502750A; CN1275164A; NO20000731D0; BR9811907A; KR20010022952A; IL134436A0; ES2275314T3; CA2301332A1; AU9261398A; WO1999009176A1; PL194800B1; US20040131634A1; US7105316B2; DE69836333D1; AU744733B2; NO20000731L

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polypeptide und Verwendung solcher Polypeptide und ihre Herstellung. Genauer gesagt betreffen die erfindungsgemäßen Polypeptide die Familie der äußerem Membranproteine (OMP) von Neisseria und insbesondere das Lactoferrinbindende Protein B (LbpB). Außerdem betrifft die Erfindung die therapeutische Verwendung von LbpB, wie zur Impfung gegen Neisseria-Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Eine Meningitis ist entweder bakteriellen oder viralen Ursprungs, wobei die Bakterien bei weitem die schwerste bilden. Die hauptsächlich verantwortlichen Bakterien sind Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae. Seit der Einführung eines Konjugatimpfstoffs gegen H. influenzae Typ B (Hib) und dessen Einschluß in die Routineimpfung von Kleinkindern, nimmt N. meningitidis die führende Rolle an Ursachen von Meningitis in der Welt ein, wobei alleine 2600 Fälle in den USA geschätzt werden.
Die Spezies N. meningitidis wird nach der Zusammensetzung der Kapselpolysaccharide in 13 Serogruppen unterteilt. Zusätzlich wird jede Serogruppe auf Grundlage anderer Bestandteile der Bakterien in Serotypen, Subtypen und Immunotypen subklassifiziert. Drei Serogruppen (A, B und C) machen mehr als 90% der Fälle von Meningitis aus, und in entwickelten, industriellen Nationen ist die Serogruppe B für 50 bis 80% der Fälle verantwortlich.
Wirksame Impfstoffe, die auf Kapselpolysacchariden beruhen, um Meningitis zu verhindern, die durch N. menigitidis-Serogruppen A und C verursacht wird, sind vorhanden. Die Impfstoffe mit Polysacchariden der Serogruppe C erzeugen keine schützende Wirkung in Kindern von weniger als 2 Jahren Alter (dem Altersbereich, in dem das größte Risiko der Entwicklung einer Meningitis besteht), jedoch kann dieser Nachteil durch Konjugieren dieser Polysaccharide an ein Trägerprotein überwunden werden. Die Konju gierung hat den zusätzlichen Vorteil eine immunologische Erinnerung gegen das Antigen zu induzieren.
Im Gegensatz dazu weisen die Polysaccharide der N. meningitidis-Serogruppe B geringe oder keine Immunogenizität bei Menschen auf, unabhängig davon, ob sie in konjugierter Form vorliegen oder nicht. Es wäre daher sehr wünschenswert, einen Impfstoff gegen Neisseria-Erkrankungen zu erhalten, die durch N. meningitidis (insbesondere der Serogruppe B) induziert werden und die anders als auf Polysacchariden basierende Impfstoffe sind.
Eine versprechende Klasse an Impfstoffkandidaten sind solche, die die äußeren Membranproteine (OMPs) von N. meningitidis verwenden, da sie Antigene bereitstellen, die immunogen sind, und der menschlichen Immunantwort zugänglich sind. Die für die Aufnahme von Eisen in die Zelle verantwortlichen OMPs sind besonders vielversprechend..
Eisen ist ein wesentlicher Nährstoff für die meisten Bakterien. In den extrazellulären Räumen des menschlichen Körpers wird Eisen im Serum hauptsächlich an Transferrin komplexiert und auf Schleimhautoberflächen (Finkelstein et al., 1983) an Lectoferrin, und mit nur vernachlässigbaren Mengen in freier Form. Daher ist die ausreichende Eisenaufnahme ein wichtiger Virulenzfaktor für pathogene Bakterien. Insbesondere im Hinblick auf N. meningitidis (ein ausschließliches Pathogen des Menschen), wird dessen Eisenbedarf durch Rezeptoren für Eisen-chelierende Proteine des Menschen, wie Transferrin oder Lactoferrin erfüllt, welche der Zelle ermöglichen, an diese Proteine zu binden, und das für das Wachstum benötigte Eisen aufzunehmen. Die Synthese dieser Rezeptorproteine wird induziert, wenn die Bakterien einen Eisenmangel merken.
Die Rezeptorproteine, die an der Aufnahme von Eisen von Transferrin, TbpA und TbpB (Cornelissen et al., 1992; Legrain et al., 1993; Anderson et al. 1994) und des Lactoferrin-bindenden Proteins A (LbpA) (Pettersson et al., 1993; 1994b; Biswas und Sparling, 1995) beteiligt sind, sind kloniert und sequenziert worden. Die Transferrin-bindende Rezeptorproteine bilden einen Komplex in der äußeren Membran. Bei N. meningitidis scheinen TbpA und TbpB beide für den Eisentransport notwendig zu sein (Irwin et al., 1993). TbpA ist ein integrales Membranprotein, während TbpB ein Lipoprotein ist und nur durch seinen Lipidrest in der Membran verankert ist. Das geläufige Modell zum Mechanismus des Rezeptors schlägt vor, daß eisenbeladenes Transferrin an den Rezeptorkomplex bindet. In diesem Komplex unterscheidet das TbpB-Protein zwischen Ferro- und Apotransferrin. Die Bindung von Transferrin führt zu einer konformationalen Änderung des Rezeptors, welcher Eisen aus Transferrin freisetzt, und eine eingeschränkte verfügbare Pore in TbpA öffnet und Eisen kann über die äußere Membran transportiert werden (Cornelissen und Sparling, 1994; 1996).
Von dem Lactoferrin-Rezeptor wird ebenfalls vermutet, daß er ein wichtiger Virulenzfaktor von N. meningitidis ist. Die Haupteintrittsstelle in den menschlichen Körper ist der Nasen-Rachenraum, worin Lactoferrin die Haupteisenquelle ist. Des weiteren zeigten vorläufige Berichte, daß Lactoferrin in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke bei einer akuten Entzündung zu überschreiten (Gschwentner et al., 1997). Es ist möglich, daß Lactoferrin ebenfalls eine bedeutende Eisenquelle für Meningococcen in einem späteren Stadium der Infektion ist, wenn Bakterien die Meningen erreicht haben. Durch die Verwendung eines Affinitätsisolierungsverfahrens, wurde ursprünglich ein einzelnes Lactoferrin-bindendes Protein identifiziert (Schryvers und Morris, 1988). Das Strukturgen dieses Rezeptors, bezeichnet als LbpA, ist charakterisiert worden (Pettersson et al., 1993; 1994b; Biswas und Sparling, 1995) und ein Topologiemodell des Proteins in der äußeren Membran ist vorgeschlagen worden (Pettersson et al., 1994a). Das Protein weist Homologie mit TbpA auf. Zusätzlich wurde ein Teil eines möglichen offenen Leserasters stromaufwärts des LbpA-Gens identifiziert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte Homologie mit TbpB (Pettersson et al., 1994a). Die kanadische Patentanmeldung CA-A-2 162 193 (Connsught Laboratories Limited) offenbart ein Lactoferrin-Rezeptorprotein, das aus bakteriellen Pathogenen isoliert und gereinigt wurde.
TbpB und andere gereinigte Meningococcen-OMPs waren der Gegenstand vorhergehender Patentanmeldungen, bezüglich ihrer Verwendung als Impfstoffe gegen N. meningitidis (z.B. TbpB, WO 93/07172; 22 kDa Oberflächenprotein, WO 9b/29412; Hämoglobin-Rezeptor, WO 96/12020; Porin-Protein, WO 95/03413; Pilin-Proteine, WO 94/08013; 64 kDa OMP, EP 474313-B1).
Es besteht daher ein Bedarf zur Identifizierung und Charakterisierung weiterer Mitglieder der OMP-Familie, die eine Rolle bei der Verhinderung, Verbesserung oder Korrektur von Fehlfunktion oder Erkrankungen führen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Neisseria-Erkrankungen (zum Beispiel Meningitis).
Antikörper gegen LbpA scheinen nicht bakterizid zu sein, und können daher als Impfstoffkandidaten von begrenztem Nutzen sein (Pettersson et al., 1993).
Diese Erfindung identifiziert und charakterisiert andere Lactoferrinbindende Rezeptorproteine, Lactoferrin-bindendes Protein B (LbpB), dessen Rolle bei der Benutzung von Eisen von Lactoferrin und dessen therapeutischen Verwendungen.
Es gibt mehrere Vorteile, die LbpB gegenüber anderen OMP-Impfstoffkandidaten hat. Zuerst ist für das durch Blut übertragene Stadium von Miningococcenerkrankungen menschliches Lactoferrin für den Organismus wesentlich, und es hat eine dreifach höhere Affinität zur Bindung von Eisen als das humane Transferrin, und daher ist die Verwendung von Lactoferrin als eine Eisenquelle für den Organismus wesentlich. Zweitens hat Lactoferrin einen bekannten antibakteriellen Effekt, und seine Konzentration im Blut erhöht sich bei der Infektion. Es ist daher wichtig für den Organismus, humanes Lactoferrin als einen Weg zum Erreichen eines gewissen Widerstands gegen diese Wirkung zu binden. Schließlich ist humanes Lactoferrin die Hauptquelle für Eisen für N. meningitidis an der Eintrittsstelle der Bakterien in den menschlichen Körper (den Nasen-Rachenraum).
Die Bedeutung dieser Vorteile liegt darin, daß LbpB-Antigene wahrscheinlich bei der größten Vielzahl an Meningococcen im Körper an der Zelloberfläche exprimiert werden, daß die Zelloberflächendomäne von LbpB wahrscheinlich sehr konserviert ist, da sie Lactoferrin wirksam binden muß, und daß eine Immunreaktion, die sich gegen das LbpB-Antigen richtet, nicht nur jede Art der Infektion von Menikgococcen im Blut stoppen kann, sondern auch das Weitertragen des Organismus im Nasopharynx stoppen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt betrifft die Erfindung nicht-lipidierte LbpB-Polypeptide, die von Impfstoffen umfaßt werden sowie rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung von LbpB-Polypeptid-Impfstoffen. Solche Verwendungen schließen die Prävention und die Behandlung von Neisseria-Erkrankungen (zum Beispiel Meningitis) neben anderen ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Western-Blot-Analyse von Proteinen aus gesamten Zellen, die unter Eisenmangel gezüchtet wurden. Spuren 1 und 5, Stamm BNCV; Spuren 2 und 6, LbpA-Mutante CE1452; Spuren 3 und 7, LbpB-Mutante CE1454; Spuren 4 und 8, LbpAB-Mutante CE1402. Die verwendeten Antiseren waren gegen synthetische Peptide gerichtet, auf Grundlage der LbpB-Sequenz. Die Spuren 1 bis 4, Serum 17-3 gegen Peptid C1. Spuren 5 bis 8, Serum 19-1 gegen Peptid E1. Die Positionen der molekularen Größenstandards sind auf der rechten Seite in Tausendern angegeben. Das LbpB-Protein ist mit einem Pfeil an der linken Seite markiert.
2. Restriktionskarte der DNA-Fragmente, die LbpB- und LbpA-Gene des Stamms BNCV enthalten. Die Einschübe in den verschiedenen rekombinanten Plasmiden und das PCR-Produkt (PCR) werden als offene Boxen gezeigt. Die Plasmide pAM23 und pAM1 enthalten Fragmente des lbpBA-Locus, welche zuvor charakterisiert worden sind (Pettersson et al., 1993), 1994a). Die offenen Leseraster werden mit dicken Pfeilen markiert. Sonden, die zum Durchmustern der Bibliothek oder zum Southern-Blotting verwendet wurden, sind über den offenen Leserastern gezeigt. Die Positionen der Primer, die für PCR-Amplifikationen verwendet wurden, sind unterhalb der offenen Leseraster gezeigt. Die Insertionsstelle der Kanamycin-Resistenzbox in pAM6K ist durch ein offenes Dreieck angezeigt. Die Erythromycin-Resistenzbox in pAM23E ist als gefülltes Dreieck gezeigt.
3. Aneinanderlagerung der Proteine LbpB des Stamms BNCV und TbpB des Stamms B16B6. Identische Aminosäuren werden schraffiert angezeigt. Die Zahlen an der rechten Seite geben die Positionen der Aminosäuren an. Leerstellen (-) wurden eingefügt, um eine optimale Anlagerung zu erreichen. Peptide, die verwendet wurden, um Mäuse zu immunisieren sind über der Sequenz von LbpB angegeben. Zwei Abschnitte, die reich an negativ geladenen Resten sind, sind unterstrichen. Die vermutliche Peptidase II-Schnittstelle wird mit einem Pfeil oberhalb der Sequenz gezeigt.
4. Sequenz des Promotorbereichs stromaufwärts von LbpB. Die Translationsinitiationsstelle (ATG) wird fett markiert. Die Ribosomen-Bindungsstelle und die vermutete -10- und -35-Boxen sind unterstrichen (dicke Linie bzw. dünne Linien). Die vermutete Fur-Box ist eingekastelt.
5. Western-Blot-Analysis von Proteinen aus ganzen Zellen, die in TBS-Medium gezüchtet wurden (Spuren 1, 3, 5 und 7) oder in TSB mit EDDA (Spuren 2, 4, 6 und 8). Die verwendeten Antikörper waren die monoklonalen mn98k1 und mn98k2, die sich gegen LbpA (Panel A) oder Antiserum 17-3 gegen LbpB-Peptid C1 (Panel B) richten. Spuren 1 und 2, Stamm BNCV; Spuren 3 und 4, LbpA-Mutante CE1452; Spuren 5 und 6 LbpB-Mutante CE1454; Spuren 7 und 8 LbpAB-Mutante CE1402.
6. Eine Western-Blot-Analyse der Proteine aus der äußeren Membran des Meningococcen-Stammes BNCV, welcher unter Eisenmangel gezüchtet wurde. Die äußeren Membranproteine wurden elektrophoretisch unter nichtdenaturierenden Bedingungen aufgetrennt, und das LbpB-Protein wurde mit dem Serum nachgewiesen, das gegen das synthetische Peptid A1 gerichtet ist. Die Spuren 1 und 2 zeigen Proben, die bei 0°C bzw. 95°C vor der Elektrophorese inkubiert wurden, Die Positionen der Molekulargrößenstandards sind auf der rechten Seite in Tausendern angegeben. B. Lactoferrin-Bindungsassay auf einem Western-Blot mit Proteinen von äußeren Membrankomplexen des Meningococcen-Stammes BNCV, welcher unter Eisenmangel gezüchtet wurde. Die Proteine der äußeren Membrankomplexe wurden unter nicht-denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt, und der Blot wurde mit Peroxidase gekoppeltem Human-Lactoferrin inkubiert. Die Spuren 1 bis 3 zeigen Proben, die vor der Elektrophorese bei 0°C, 37°C bzw. 95°C inkubiert wurden. Die Positionen der Molekulargrößenstandards sind auf der rechten Seite in Tausendern angegeben.
7. Bindung von Lactoferrin an lbp-Mutanten in einem Gesamtzell-ELISA-artigen Assay. Stämme, angegeben an der rechten Seite, wurden in Wells geschichtet. Lactoferrin wurde in Konzentrationen von 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 bzw. 0 ng/ml (Reihen 1-8) gegeben. Lactoferrin, das an die Zellen gebunden wurde, wurde mit einem Peroxidase-konjugierten Lactoferrin-spezifischen Antiserum nachgewiesen.
8. Plattenzuführassays von Stämmen für rekombinantes humanes Lactoferrin. Nur der relevante Teil der Platte wird gezeigt. Zellen von Stämmen, die auf der rechten Seite angegeben sind, wurden auf eisenrestringierten Platten ausplattiert. Eine Wachstumsstimulation durch Lactoferrin-Tropfen bei den angegebenen Konzentrationen wurde nach dem Übernachtwachstum beobachtet. Die Pfeile zeigen die Position der Tropfen in Panel B an. In diesem Experiment wurde 11% eisengesättigtes Lactoferrin verwendet.
9. Anlagerung der LbpB-Proteine von fünf Meningococcen-Stämmen. Die Aneinanderlagerung wurde mit dem CLUSTAL-Programm (PC Gene, IntelliGenetics) durchgeführt, und von Hand optimiert. Die Zahlen auf der rechten Seite geben die Position der Aminosäuren an. Es wurden Leerstellen (-) eingeführt, um optimale Anlagerungen zu erzielen. Positionen, wo alle fünf Sequenzen identisch sind, werden mit einem * markiert.
10A. Restriktionskarten der relevanten Teile von jJP29 (Bosch et al., 1986), pAM31 und pAM32. Es wurden nur Insertionen gezeigt. Der Vektor ist pACYC184, pJP29 enthält das phoE-Gen (in Hellgrün) hinter seinem eigenen Promotor. Die Promotor- und flankierenden Sequenzen sind in Weiß. Die PstI-Schnittstelle liegt am Rand der Sequenzen, die der Signalsequenz entsprechen, und der reife Teil des phoE-Proteins. pAM31 enthält von links nach rechts: Den phoE-Promotor (in Weiß) und ein rekombinantes Gen, das die Signalsequenz von PhoE (Hellgrau codiert) und das reife LbpB (Schwarz) kodiert. DNA-Fragmente, die dem N-Terminus von LbpA (Dunkelgrün) entsprechen, der C-Terminus von PhoE (Hellgrau) und flankierende Sequenzen (Weiß) sind ebenfalls vorhanden. pAM32 wurde aus pAM31 durch die Insertion eines Linkers (gestreifte Box), codierend ein His-Tag und eine Faktor Xa-Spaltstelle, in die PstI-Schnittstelle von pAM31 konstruiert. Siehe Beispiel 8 für Details über die Konstruktion von pAM31 und pAM32. Die Restriktionsstellen bei pAM32 sind in Klammern, da sie während des Klonierungsverfahrens verlorengehen.
B. Die Aminosäuresequenzen des rekombinanten LbpB-Konstrukts (unten) im Vergleich mit dem Wild-Typ LbpB-Sequenzen (oben). Nur die letzten und die ersten Aminosäurereste der LbpB/PhoE-Signalsequenzen und des reifen LbpB sind jeweils gezeigt. Der His-Tag und der Faktor Xa-Spaltstelle sind insgesamt gezeigt. Leader-Peptidase I und II (LPaseI bzw. II) und Faktor Xa-Spaltstellen sind durch Pfeile angezeigt.
11. PAGE des gereinigten rekombinanten LbpB-Proteins. Spuren 1 und 2 zeigen Proben, die bei 0°C bzw. 100°C inkubiert wurden, vor der Elektrophorese. Die Position der Molekulargewichtsstandards sind auf der rechten Seite im kDa angezeigt.
12. Western-Blot mit gefaltetem (Spuren 1, 3, 5, 7 und 9) und denaturiertem (Spuren 2, 4, 6, 8 und 10) rekombinanten LbpB mit fünf menschlichen konvaleszenten Seren. Spuren 1 und 2, Serum 69; Spuren 3 und 4, Serum 262439; Spuren 5 und 6, Serum 262532; Spuren 7 und 8, Serum 263017, Spuren 9 und 10, Serum 330. Die Positionen der Molekulargrößenstandards sind auf der rechten Seite in Kilodalton angezeigt. Die Pfeile an der linken Seite zeigen die Positionen des denaturierten (dLbpB) und gefalteten LbpBs (fLbpB) an.
13. Ergebnisse des Anti-Gesamtzell und Anti-LbpB-ELISA (Tabelle 2), welche wie in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt wurde. A. Anti-LbpB-Reaktion in Mäusen die entweder mit LbpB oder Gesamtzellen des N. meningitidis-Stamms BNCV immunisiert wurden. Eine Kontrollimmunisierung wurde mit PBS-Lösung durchgeführt. B. die Gesamtzell- (Stamm BNCV gezüchtet unter Eisenmangelbedingungen) Reaktion in Mäusen, die entweder mit LbpB oder Gesamtzellen des N. meningitidis-Stamms BNCV immunisiert wurden. Eine Kontrollimmunisierung wurde mit PBS-Lösung durchgeführt. C. Anti-Gesamtzell- (Stamm H44/76 gezüchtet unter Eisenmangelbedingungen) Reaktion in Mäusen, die entweder mit LbpB oder Gesamtzellen des N. meningitidis- Stamms BNCV immunisiert wurden. Eine Kontrollimmunisierung wurde mit PBS-Lösung durchgeführt.
14. Ergebnis der bakteriziden Wirkungen (Tabelle 8) von Anti-Gesamtzell- und Anti-BNCV-LbpB-Stamm-Seren, durchgeführt wie in Beispiel 10 beschrieben. A. Bakterizider Titer gegen N. meningitidis-Stamm H44/76 (gezüchtet unter eisenreichen Bedingungen). B. Bakterizider Titer gegen N. meningitidis-Stamm H44/76 (gezüchtet unter Eisen-depletierten Bedingungen).
Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Die folgenden Definitionen werden eingeführt, um das Verständnis bestimmter Begriffe zu erleichtern, die hierin häufig verwendet werden.
"LbpB" bezieht sich allgemein auf ein Polypeptid, bevorzugt ein Lipoprotein, mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 aufgeführt ist, oder eine Allel-Variante davon.
"LbpB-Aktivität oder LbpB-Polypeptidaktivität" oder "biologische Aktivität des LbpB oder LbpB-Polypeptid" betrifft die metabolische oder physiologische Funktion des LbpB, einschließlich ähnlicher Aktivitäten. Genauer gesagt ist die LbpB-Aktivität die Fähigkeit an humanes Lactoferrin zu binden. Diese Aktivität von LbpB kann unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens getestet werden. Ebenfalls in diese Definition eingeschlossen sind antigene und immunogene Wirkungen dieses LbpB. Diese Antigenizität kann unter Verwendung des in Beispiel 9 beschriebenen Immunblot-Verfahrens, bevorzugterweise unter Verwendung eines polyklonalen Serums gegen LbpB des Meninogococcen-Stammes BNCV wie in Beispiel 10A beschrieben, getestet werden. Die Immunogenizität kann am besten durch Messen der Antikörperreaktionen (unter Verwendung polyklonaler Sera, die gegen die Variante erzeugt wurden) in einem ELISA unter Verwendung von gereinigtem LbpB des Meningococcen-Stammes BNCV getestet werden, wie in Beispiel 10B beschrieben.
"LbpB-Gen" betrifft ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz 100-22747, die in SEQ ID NO:1 ausgeführt ist, oder die komplette Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO:3, 5, 7 oder 9 aufgeführt ist oder allele Varianten davon und/oder ihre Komplemente.
"Antikörper" schließen so wie es hier verwendet wird polyklonale und monoklonale Antikörper ein, chimäre, Einzelketten und humanisierte Antikörper wie auch Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab- oder andere Immunglobulin-Expressionsbibliothek.
"Isoliert" bedeutet "durch die menschliche Hand" gegenüber dem natürlichen Zustand geändert. Wenn eine "isolierte" Zusammensetzung oder Substanz in der Natur auftritt, ist sie aus ihrem ursprünglichem Umfeld verändert oder entfernt worden, oder beides. Beispielsweise ist ein Polynukleotid, oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier natürlicherweise vorhanden ist nicht "isoliert", sondern das Polynukleotid oder Polypeptid, das von dem gemeinsam vorhandenen Materialien in dem natürlichen Zustand abgetrennt ist, ist "isoliert" so wie der Begriff hier verwendet wird.
"Polynukleotid" betrifft im allgemeinen jedes Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, welches unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. "Polynukleotide" schließen ohne Begrenzung einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, Hybridmoleküle umfassend DNA und RNA, die einzelsträngig oder, typischerweise, doppelsträngig sind, oder ein Gemisch aus einzel- und doppelstränigen Regionen ist, ein. Zusätzlich betrifft "Polynukleotid" dreisträngige Regionen, umfassend RNA oder DNA oder beides RNA und DNA. Der Begriff Polynukleotid schließt auch DNAs und RNAs ein, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten, und DNAs und RNAs mit Rückgrat-Strukturen, die zur Stabilisierung oder aus anderen Gründen modifiziert sind. "Modifizierte" Basen schließen beispielsweise tritylierte Basen und ungewöhnliche Basen wie Inosin ein. Eine Vielzahl von Modifizierungen ist an DNA und RNA gemacht worden; so umfaßt "Polynukleotid" Gemische, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynukleotiden, die typischerweise in der Natur gefunden werden, wie auch die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen charakteristisch sind. "Polynukleotid" umfaßt auch relativ kurze Polynukleotid, die häufig als Oligonukleotide bezeichnet werden.
"Polypeptid" betrifft jedes Peptid oder Protein, das zwei oder mehr Aminosäuren umfaßt, die miteinander durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen verbunden sind, d.h. Peptidisostere. "Polypeptid" betrifft sowohl kurzkettige, gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnete Ketten und längere Ketten, allgemeine als Proteine bezeichnet. Polypeptide können Aminosäure enthalten, die anders als die 20 Gen-codieren Aminosäuren sind. "Polypeptid" schließen auch Aminosäuresequenzen ein, die entweder durch natürliche Verfahren wie posttranslationale Prozessierung oder durch chemische Modifikationstechniken, die in dem Fachgebiet gut bekannt sind, modifiziert sind. Solche Modifikationen sind in grundlegenden Texten und detaillierten Monographien sowie auch in der voluminären Recherchenliteratur gut beschrieben. Modifizierungen können irgendwo in einem Polypeptid auftreten, einschließlich im Peptid-Rückgrad, den Aminosäureseitenketten und Amino- oder Carboxytermini. Es wird begrüßt, daß die gleiche Art von Modifizierung in gleichen oder verschiedenen Graden an verschiedenen Stellen in einem gegebenen Polypeptid vorhanden ist. Ein gegebenes Polypeptid kann auch viele Arten von Modifikationen enthalten. Polypeptide können verzweigt sein, aufgrund einer Ubiquitinierung und sie können cyclisch sein, mit oder ohne Verzweigung. Cyclische, verzweigte und verzweigte cyclische Polypeptide können durch posttranslationale natürliche Prozesse hervorgehen oder sie können durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Modifizierungen schließen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Anhängung von Flavin, kovalente Anhängung eines Häm-Restes, kovalente Anhängung eines Nukleotids oder eines Nukleotid-Derivats, kovalente Anhängung eines Lipids oder Lipid-Derivats, kovalente Anhängung von Phosphotidylinositol, Vernetzung, Cyclisierung, Disulfidbrückenbildung, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzung en, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatisierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine wie Arginylierung und Ubiquitinierung ein. Siehe beispielsweise PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2. Auflage, T.E. Creighten. W.H. Freeman and Company, New York, 1993 und Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, Seiten 1-22 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for Protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990), 182:626-646 und Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann: NY Acad. Sci. (1992), 663:48-62.
"Variante" so wie der Begriff hier verwendet wird, ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenzpolynukleotid oder -Polypeptid jeweils unterscheidet, aber die wesentlichen biologischen Eigenschaften behält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich in der Nukleotidsequenz von einem anderen Referenzpolynukleotid. Änderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids ändern oder nicht ändern, das durch ein Referenzpolynukleotid codiert wird. Nukleotidänderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen im Polypeptid führen, das durch die Referenzsequenz codiert wird, wie unten diskutiert wird. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen Referenzpolypeptid. Im allgemeinen sind die Unterschiede begrenzt, so daß die Sequenzen des Referenzpolypeptids und der Variante insgesamt nahezu ähnlich sind und vielen Bereichen identisch sind. Eine Variante und ein Referenzpolypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch ein oder mehrere Substitutionen, Additonen, Deletion in irgendeiner Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder inserierter Aminosäurerest kann durch den genetischen Code codiert sein oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder eines Polypeptids kann natürlich auftreten, wie eine Allele-Variante (zum Beispiel sind SEQ ID NO:3, 5, 7 oder 9 Varianten des LbpB-Polynukleotids mit SEQ ID NO:1, und SEQ ID NO:4, 6, 8 oder 10 sind Varianten des LbpB-Polypeptid der SEQ ID NO:2), oder es kann eine Variante sein, die nicht dafür bekannt ist, natürlich aufzutreten. Nicht-natürlich auftretende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenese-Techniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden. Varianten sollten ein oder mehrere der biologischen Aktivitäten des LbpB-Polypeptids bewahren. Sie sollen entweder in der Lage sein, an humanes Lactoferrin zu binden (vorzugsweise wie in dem Test für diese Aktivitäten in Beispiel 6 beschrieben), oder ähnliche antigene oder immunogene Aktivitäten wie LbpB haben. Die Antigenizität kann am besten unter Verwendung des in Beispiel 9 beschriebenen Immunblot-Verfahrens getestet werden, bevorzugterweise unter Verwendung von polyklonalen Seren gegen LbpB von dem Meningococcen-Stamm BNCV wie in Beispiel 10A beschrieben. Die Immunogenizität kann am besten durch Messen der Antikörperreaktionen (unter Verwendung polyklonaler Seren, die gegen diese Variante erzeugt wurden) in einem ELISA unter Verwendung gereinigtem LbpBs von Meningococcen-Stamm BNCV, wie in Beispiel 10B beschrieben, getestet werden. Vorzugsweise wird eine Variante alle der oben genannten biologischen Aktivitäten behalten.
"Identität" ist ein Maß der Identität von Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen. Im allgemeinen werden Sequenzen so aneinandergelagert, daß Übereinstimmung im höchsten Ausmaß erzielt wird. "Identität" per se hat eine in dem Fachgebiet anerkannte Bedeutung und kann unter Verwendung veröffentlichter Techniken berechnet werden. Siehe z.B. (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATIC AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W. Hrsg., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M., und Griffin, H.G., Hrsg. Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heijne G., Academic Press, 1987; und SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg , M. Stockton Press, New York, 1991). Während es eine Vielzahl von Verfahren zum Messen der Identität zwischen zwei Polynukleotiden oder Polypeptidsequenzen gibt, ist der Begriff "Identität" Fachleuten wohlbekannt (Carillo, H. und Lipton, D., SIAM J. Applied Math. (1988), 48:1073). Für gewöhnlich verwendete Verfahren, um die Identität oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf solche die im to Huge Computers, Martin J. Bishop, Hrsg., Academic Press, San Diego, 1994 und Carillo, H. und Lipton, D., SIAM J. Applied Math. (1988) 48:1073 offenbart sind. Verfahren zum Bestimmen der Identität und Ähnlichkeit sind in Computerprogrammen codifiziert. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen schließen, ein, sind aber nicht begrenzt auf, GCS programm package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research (1984), 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. etal., J. Molec. Biol. (1990) 215:403).
Als Darstellung wird unter einem Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens beispielsweise 95% "Identität" zu einem Referenznukleotid mit der SEQ ID NO: SEQ ID NO:1, verstanden, daß die Nukleotidsequenz des Polynukleotids mit der Referenzsequenz identisch ist, außer daß die Polynukleotidsequenz durchschnittlich bis zu fünf Punktmutationen je 100 Nukleotide der Referenznukleotidsequenz SEQ ID NO:1 haben kann. Anders gesagt, um ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz von mindestens 95% Identität zu einer Referenz-Nukleotidsequenz zu erhalten, können bis 5% Nukleotid in der Referenzsequenz durch ein anderes Nukleotid deletiert oder substituiert werden, oder eine Anzahl an Nukleotiden bis zu 5% der Gesamtnukleotide in der Referenzsequenz können in der Referenzsequenz inseriert sein. Diese Mutation der Referenzsequenz können an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenz-Nukleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen auftreten, entweder individuell entlang der Nukleotide in der Referenzsequenz verteilt oder in ein oder mehreren durchgehenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz.
Gleichermaßen unter einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens beispielsweise 95% "Identität" mit einer Referenz-Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 wird beabsichtigt, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit der Referenzsequenz identisch ist, außer, daß die Polypeptidsequenz durchschnittlich bis zu 5 Aminosäureveränderungen je 100 Aminosäuren der Referenz-Aminosäure SEQ ID NO:2 haben kann. Anders gesagt, um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 95% Identität zu einer Referenz-Aminosäuresequenz zu erhalten, können bis zu 5% der Aminosäuresequenz in der Referenzsequenz deletiert sein, oder durch eine andere Aminosäure substituiert sein, oder eine Anzahl an Aminosäuren von bis zu 5% der Gesamtaminosäurereste in der Referenzsequenz inseriert sein. Diese Veränderungen der Referenzsequenz können an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenzaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen auftreten, entweder einzeln entlang der Reste in der Referenzsequenz verteilt oder in einer oder mehreren durchgehenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz.
Polypeptid-Impfstoffe der Erfindung
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Impfstoffe umfassend LbpB-Polypeptide (oder LbpB-Proteine). Die LbpB-Polypeptide schließen die Polypeptide SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 ein (die Reste 1-18 in dem natürlichen Signalpeptids eines jeder dieser Proteine und des Rests Cys19 in der N-terminalen Aminosäure, welche in dem natürlichen reifen Protein lipidiert ist); wie auch Polypeptide, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 umfassen, und Polypeptide, die die Aminosäuresequenz umfassen, welche mindestens 70% Identität mit der von SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 über deren gesamte Länge, und noch bevorzugter mindestens 80% Identität und sogar noch mehr bevorzugt mindestens 90% Identität mit SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 haben. Außerdem sind solche mit mindestens 95-99% stark bevorzugt. Ebenfalls in die LbpB eingeschlossen, sind Polypeptide mit der Aminosäuresequenz, die über deren Gesamtlänge mindestens 70% Identität mit dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 haben, und noch mehr bevorzugt mindestens 80% Identität und sogar noch mehr bevorzugt mindestens 90% Identität mit SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10. Außerdem sind solche mit mindestens 95-99% stark bevorzugt.
Die LbpB-Polypeptide, die in SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 und 10 bereitgestellt werden, sind die LbpB-Polypeptid der Neisseria meningitidis-Stämme BNCV, M981, H44/76, M990 und 881607.
Die LbpB-Polypeptide können in Form eines "reifen" Proteins vorliegen, oder sie können ein Teil eines größeren Proteins sein, beispielsweise als Fusionsprotein. Es kann vorteilhaft sein, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leader-Sequenzen einschließt (siehe die natürliche LbpB-Leader-Sequenz; Reste 1-18 in der SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 und 10), Pro-Sequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung helfen, wie mehrere Histidin-Reste, oder eine zusätzliche Sequenz für die Stabilität während der rekombinanten Reproduktion.
Fragmente der LbpB-Polypeptide sind ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen. Ein Fragment ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die insgesamt gleich ist wie ein Teil, aber nicht alle der Aminosäuresequenz der oben erwähnte LbpB-Polypeptide. Bei LbpB-Polypeptiden können Fragmente "frei vorliegen" oder von einem größeren Polypeptid umfaßt sein, von dem sie einen Teil oder eine Region bilden, am meisten bevorzugt als einzelne durchgänige Regionen. Entsprechende Beispiele für Polypeptid-Fragmente der Erfindung schließen beispielsweise Fragmente von ungefähr Aminosäuren 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100 und 101 bis zum Ende des LbpB-Polypeptids ein. In diesem Zusammenhang schließt "ungefähr" die besonders genannten Bereiche ein, die einige 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäure an jedem Ende oder an beiden Enden länger oder kürzer sind.
Bevorzugte Fragmente schließen beispielsweise verkürzte Polypeptide mit der Aminosäuresequenz der LbpB-Polypeptide, ausgenommen eine Deletion einer kontinuierlichen Abfolge von Resten ein, die den Aminoterminus einschließen, oder eine durchgehende Abfolge, die den Carboxy-Terminus und/oder die Transmembranregion einschließt, oder die Deletion von zwei durchgängigen Abfolgen an Resten, eine die den Amino-Terminus einschließt und eine andere den Carboxy-Terminus einschließt. Ebenfalls bevorzugt sind Fragmente, die durch Strukturale oder funktionale Eigenschaften charakterisiert werden, wie Fragmente, die eine alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Region umfassen, beta-Faltblätter und beta-Faltblätterformende Bereiche, Biegungen und Biegungen bildende Bereiche, Schlaufen und Schlaufen-bildende Regionen, hydrophile Bereiche, hydrophile Bereiche, hydrophobe Bereiche, alpha-amphipatische Bereiche, beta-amphipatische Bereiche, flexible Bereiche, oberflächenbildende Bereiche, Substratbindende Bereiche und Bereiche mit einem hohen Antigen-Index. Andere bevorzugte Fragmente sind biologisch aktive Fragmente. Biologisch aktive Fragmente sind solche, die die LbpB-Aktivität vermitteln, einschließlich solcher mit einer ähnlichen Aktivität oder einer verbesserten Aktivität, oder mit einer verminderten ungewünschten Aktivität. Ebenfalls eingeschlossen sind solche, die in einem Tier, insbesondere bei Menschen antigen oder immunogen sind.
Fragmente sollten ein oder mehrere der biologischen Eigenschaften des LbpB-Polypeptids bewahren. Bevorzugt sollten die Polypeptid-Fragmente mit einer antigenen oder immunogenen biologischen Wirkung, welche das LbpB-Polypeptid vollständiger Länge von dem es abstammt, ebenfalls besitzt durchgängige Abfolgen (über 16 Aminosäuren) einer Aminosäuresequenz sein, die von der SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 abstammen.
Varianten der angegebenen Sequenz und Fragmente bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung. Bevorzugte Varianten sind solche, die sich von den Referenzen durch konservative Aminosäure-Substitutionen unterscheiden, d.h. solche, die einen Rest mit anderen oder ähnlichen Eigenschaften substituieren. Typischerweise finden solche Substitutionen zwischen Ala, Val, Leu und Ile statt; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu; zwischen Asn und Gln; und zwischen den basischen Resten Lys und Arg; oder den aromatischen Resten Phe und Tyr. Besonders bevorzugt sind Varianten, in denen mehrere, 5-10, 1-5 oder 1-2 Aminosäuren substituiert, deletiert oder in irgendeiner Form hinzugefügt wurden.
Am meisten bevorzugte Varianten sind solche, die von den Referenzen durch solche Aminosäure-Substitution variieren, die in strukturell äquivalenten Positionen gefunden werden (wie durch eine Homologieanlagerung) mit anderen LbpB-Sequenzen gefunden werden (zum Beispiel die Homologie-Anlagerung von 5 LbpB-Sequenzen, die in 9 gezeigt wird). Besonders bevorzugt sind Varianten, die die Aminosäuresequenz umfassen, die über deren Gesamtlänge mindestens 65% Identität mit der einer Referenzsequenz hat, zum Beispiel SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10), und noch mehr bevorzugt mindestens 70% Identität, und noch mehr bevorzugt mindestens 80% Identität und sogar noch mehr bevorzugt mindestens 90% Identität. Außerdem sind solche mit mindestens 95-99% stark bevorzugt. Beispielsweise ist in 9, wenn LbpB von BNCV die Referenzsequenz ist, eine Variante eine, die Reste 300-308 umfaßt, die durch irgendeinen der Reste in den äquivalenten Positionen in den LbpB-Sequenzen des Stamms H44/76 (entsprechend den Resten 305-313), dem Stamm M990 (entsprechend den Resten 307-315), dem Stamm N981 (die Reste 302-310) oder dem Stamm 881607 (entsprechend den Resten 303-311) ersetzt sind. Die Aminosäuresequenz NPDLAKSHA könnte daher durch STDVATNLA substituiert werden [ST (von den M981-Resten 302-303), D (des Restes 302 von BNCV), V (vom Rest 306 aus 881607), A (von dem Rest 311 von M990), T (von dem Rest 310 aus H44/76), NLA (aus den Resten 313-315 aus M990)] und das daraus resultierende Protein kann als eine Variante klassifiziert werden, und als Polypeptid der Erfindung.
Solche Substitutionen können auch Deletionen einschließen, zum Beispiel, wenn die Reste 357-366 aus LbpB des Stammes M981 deletiert sind (da es keine äquivalenten LbpB-Aminosäurepositionen des Stamms BNCV gibt – siehe 9), so daß so ein Protein eine Variante bilden kann, und ein Polypeptid der Erfindung ist.
Solche Substitutionen können auch Deletionen einschließen, zum Beispiel, wenn die Reste 357-366 des LbpB des Stamms M981 deletiert sind (da es keine äquivalenten Aminosäurepositionen in LbpB des Stamms BNCV gibt – siehe 9), so daß ein solches Protein eine Variante und ein Polypeptid der Erfindung bilden kann.
Zusätzlich ist es allseits bekannt, daß die Genome von Neisseria meningitidis und andere Neisseria-Stämme (zum Beispiel Neisseria gonorrhoeae) genomisch miteinander sehr homolog sind. Die Genome von Neisseria meningitidis und Moraxella catarrhalis (zuvor als Neisseria catarrhalis bezeichnet) sind ebenfalls ausreichend homolog, um Genaustausche stattfinden zu lassen. Die LbpB-äquivalenten Proteine (oder LbpB-Allel-Varianten) der Neisseria-Stämme und von Moraxella catarrhalis-Stämmen bilden ebenfalls Polypeptide der Erfindung wenn sie die oben beschriebenen prozentualen Sequenzidentitätskriterien erfüllen. Und zusätzlich noch würden solche äquivalenten Proteine ebenfalls Polypeptide der Erfindung bilden, wenn sie über ihre gesamte Länge bevorzugt mindestens 70% Sequenzähnlichkeit mit einer der Referenzsequenzen (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10) haben, wenn das mit dem Programm BLAST (Altschul, S.F. et.al. (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Karlin, S. und Altschul, S.F. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. und Altschul, S.F. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-7) gemessen wird, und mehr bevorzugt mindestens 80% Ähnlichkeit und noch mehr bevorzugt mindestens 90%. Außerdem sind solche mit mindestens 95 bis 99% stark bevorzugt. Solche Proteine sollten Human-Lactoferrin (per Definition) binden und sollen auch in der Lage sein, mit polyklonalem Serum gegen LbpB von Meningococcen-Stämme zu reagieren. Die präzise Aminosäuresequenz solcher Varianten kann unter Verwendung von Information der Meningococcen-Polynukleotid- und -Polypeptidsequenzen der SEQ ID NO:1-10 leicht bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen LbpB-Polypeptide können auf jede geeignete Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide schließen isolierte natürlich auftretende Lipopolypeptide ein, rekombinant produzierte Polypeptide oder Lipopolypeptide, synthetisch produzierte Polypeptid oder Polypeptide die durch eine Kombination aus diesen Verfahren hergestellt werden. Mittel zum Herstellen solcher Polypeptide sind in dem Fachgebiet allgemein verstanden.
Polynukleotide zur Verwendung im verfahren eines Impfstoffs
LbpB Polynukleotide schließen isolierte Polynukleotide ein, die die LbpB-Polynukleotide und -Fragmente codieren, und Polynukleotide, die hiermit nahe verwandt sind. Genauer gesagt, schließen LbpB-Polynukleotide ein Polynukleotid ein, das die Nukleotidsequenz umfaßt, die in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 oder 9 enthalten ist, welche das LbpB-Polynukleotid SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 bzw. 10 codieren und Polynukleotide mit genau der Sequenz SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 oder 9. LbpB-Polynukleotide schließen weiter ein Polynukleotid ein, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die mindestens 65% Identität über die gesamte Länge mit einer Nukleotidsequenz hat, die das LbpB Polypeptid in SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 codiert, und ein Polynukleotid, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die mindestens 65% identisch mit Nukleotid 100 bis Nukleotid 2274 in SEQ ID NO:1 ist, und ein Polynukleotid umfassend eine Polynukleotidsequenz, die mindestens 65% identisch zu der in SEQ ID NO:3, 5, 7 oder 9 ist. In dieser Hinsicht sind Polynukleotide die mindestens 70% identisch sind mehr bevorzugt. Polynukleotide, die zu mindestens 80% identisch sind, sind besonders bevorzugt und solche mit mindestens 90% sind besonders bevorzugt. Außerdem sind solche mit mindestens 95% stark bevorzugt und solche mit mindestens 98 bis 99% am stärksten bevorzugt, wobei mindestens 99% die am meisten bevorzugten sind. Ebenfalls in die LbpB-Polynukleotide eingeschlossen ist eine Nukleotidsequenz, die ausreichend Identität mit einer Nukleotidsequenz hat, die in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 oder 9 enthalten ist, um unter Bedingungen zu hybridisieren, die für die Amplifizierung verwendbar sind, oder zur Verwendung als Sonde oder Marker. Ebenfalls eingeschlossen sind Polynukleotide, die komplementär zu solchen LbpB-Polynukleotiden sind.
Die in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 und 9 bereitgestellten Polynukleotide sind die LbpB-Polynukleotide der Neisseria meningitidis-Stämme BNCV, M981, H44/76, M990 bzw. 881607.
Die Nukleotidsequenz, die das LbpB-Polypeptid in SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 codiert, kann mit dem Polypeptid identisch sein, das die Sequenz codiert, die in Nukleotiden 100 bis 2274 der SEQ ID NO:1 enthalten ist, oder die Polypeptid-codierende Sequenz, die in SEQ ID NO:3, 5,% bzw. 9 enthalten ist, oder kann eine Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen Codes auch die Polypeptid in SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10 codiert.
Wenn Polynukleotide für die rekombinante Herstellung von LbpB-Polypeptid verwendet werden, kann das Polynukleotid die codierende Sequenz eines reifen Polypeptids einschließen (Rest 19 bis zum C-Terminus der SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 und 10) oder ein Fragment daraus, die codierende Sequenz des reifen Polypeptids oder ein Fragment in einem Leseraster mit anderen codierenden Sequenzen, wie solchen, die eine Leader- oder sekretorische Sequenz codieren, eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz, oder andere Fusionspeptidteile (zum Beispiel die Reste 1 bis 18 der SEQ ID NO:2, der natürlichen Signalsequenz von LbpB). Beispielsweise kann eine Markersequenz, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert, codiert sein. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Markersequenz ein Hexa-Histidin-Peptid, wie in dem pQE-Vektor (Qioagen, Inc.) bereitgestellt wird, und in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. beschrieben ist oder sie ist ein HA-Tag oder eine Glutathion-S-Transferase. Ebenfalls bevorzugt wird LbpB an dessen natürliche Signalsequenz (Reste 1 bis 18 der SEQ ID NO:2) fusioniert. Das Polynukleotid kann auch nicht-codierende 5'- oder 3'-Sequenzen enthalten, wie transkribierte, nicht-translatierte Sequenzen, Spleißing- und Polyadenylierungssignale, Ribosomen-Bindungsstellen und Sequenzen, die die mRNA stabilisieren.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die LbpB-Polypeptid-Varianten codieren, die früher beschrieben wurden. Am meisten bevorzugt umfassen sie die Aminosäuresequenz des LbpB-Polypeptid SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10, in denen einige, 10-25, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 oder 1 Aminosäurereste in irgendeiner Kombination substituiert, deletiert oder addiert sind, und sie mindestens eine der biologischen Aktivitäten des LbpB-Polypeptids bewahren.
Weitere Ausführungsformen sind Polynukleotide, die mit den hier oben beschriebenen Sequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betreffen andere Ausführungsformen insbesondere Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier oben beschriebenen Polynukleotiden hybridisieren. So wie es hier verwendet wird, bedeutet der Begriff "stringente Bedingungen" daß eine Hybridisierung nur auftritt, wenn mindestens 80%, und bevorzugt mindestens 90% und mehr bevorzugt mindestens 95% und noch mehr bevorzugt 97 bis 99% Identität zwischen den Sequenzen vorliegen.
Polynukleotide die identisch sind oder ausreichend identisch zu einer Nukleotidsequenz sind, die in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 oder 9 oder einem Fragment davon enthalten ist, können als Hybridisierungssonden für cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAs und genomische Klone vollständiger Länge zu isolieren, die LbpB-Polypeptid codieren, und um cDNA und genomische Klone anderer Gene zu isolieren (einschließlich Genen, die Homologe und Orthologe von Spezies codieren, die nicht Neisseria meningitidis sind), welche hohe Sequenzähnlichkeit mit dem LbpB-Gen haben. Solche Hybridisierungstechniken sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Typischerweise sind diese Nukleotidsequenzen 80% identisch, bevorzugt 90% identisch und mehr bevorzugt 95% identisch mit der der Referenz. Die Sonden umfassen im allgemeinen mindestens 15 Nukleotide. Bevorzugt haben solche Sonden mindestens 30 Nukleotide und können mindestens 50 Nukleotide haben. Besonders bevorzugte Sonden haben einen Bereich zwischen 30 und 50 Nukleotiden.
In einer Ausführungsform zum Erhalt eines Polynukleotids codierenden LbpB-Polypeptids, einschließlich homologer und orthologer von Spezies die nicht Neisseria meningitidis sind, sind die Schritte des Durchmusterns einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde, die eine Nukleotidsequenz umfaßt, die in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 oder 9 oder einem Fragment davon enthalten sind; und das Isolieren der cDNA vollständiger Länge und der genomischen Klone, die diese Polynukleotidsequenz enthalten. Das heißt, daß in einem weiteren Aspekt LbpB-Polynukleotide weiter eine Nukleotidsequenz einschließen, die eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 oder 9 oder einem Fragment davon enthalten ist, hybridisiert. Ebenfalls eingeschlossen in die LbpB-Polypeptide sind Polypeptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die von Nukleotidsequenzen codiert werden, welche durch die oben erwähnten Hybridisierungsbedingungen gewonnen werden. Solche Hybridisierungstechniken sind Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind so, wie oben definiert, oder alternativ dazu Bedingungen bei einer Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5xSS C (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH7,6), 5x Denhardt's-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA umfaßt, gefolgt vom Waschen der Filter 0,1 x SSC bei 65°C.
Die hier beschriebenen Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als Recherchemittel und Materialien zum Entdecken von Behandlungen und Diagnostika für Tier- und Menschenerkrankungen verwendet werden.
Vektoren, Wirtszellen, Expression zur Verwendung in dem Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs
Die Impfstoffe der Erfindung werden gegebenenfalls unter Verwendung von Wirtszellen hergestellt, die genetisch mit Vektoren, die die Polynukleotide, welche LbpB codieren, modifiziert sind, und die Produktion der Polypeptide der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs, die von den beschriebenen DNA-Konstrukten stammen, herzustellen. Für die rekombinante Produktion können Wirtszellen genetisch manipuliert werden, um Expressionssysteme oder Teile davon für die beschriebenen Polynukleotide einzuschließen. Die Einschleusung von Polynukleotiden in Wirtszellen kann durch in vielen Standardlaborhandbüchern beschriebene Verfahren durchgeführt, wie in Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), wie Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextranvermittelte Transfektion, Transfektion, Mikroinjektion, Kationen-Lipidvermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, "scrape loading", ballistische Einschleusung oder Infektion.
Entsprechende Beispiele geeigneter Wirte schließen bakterielle Zellen wie Meningococcen, Streptococcen, Staphylococcen, E. coli, Streptomyces und Bacillus subtilis-Zellen; Pilzzellen wie Hefezellen und Aspergillus-Zellen; Insektenzellen wie Drosophila S2- und Spodoptera S19-Zellen, Tierzellen wie CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293 und Bowes-Melanom-Zellen sowie Pflanzenzellen ein.
Ein großer Bereich an Expressionssystemen kann verwendet werden. Solche Systeme schließen u.a. chromosomale, episomale und von Viren stammende Systeme ein, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden stammen, von Bakteriophagen, von Transposons, von Hefe-Episomen, von Insertionselementen, von Hefe-Chromosom-Elementen, von Viren, wie Baculoviren, von Papovaviren, wie SV40, von Vacciniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabiesviren und Retroviren, und Vektoren, die von Kombinationen davon abstammen, wie solche, die von Plasmid- und Bacteriophagen-Genelementen abstammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssysteme können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren wie auch hervorrufen. Im allgemeinen kann jedes System oder Vektor, der geeignet ist Polynukleotide zu behalten, propagieren oder exprimieren, verwendet werden, um ein Polypeptid herzustellen. Die geeignete Nukleotidsequenz in einem Expressionsvektorsystem durch irgendeine der vielbekannten und Routinetechniken insert werden, wie beispielsweise durch in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) aufgeführte.
Zur Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums in den Periplasmaraum oder in das extrazelluläre Umfeld, können geeignete Sekretionssignale in das gewünschte Polypeptid eingeschlossen werden. Diese Signale können dem Polypeptid endogen angehören (Reste 1 bis 18 der SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10) oder können heterologe Signale sein.
Um lipidiertes rekombinantes LbpB zu exprimieren, wird das endogene Signalpeptid vorzugsweise durch das Genkonstrukt codiert, und das bevorzugte Wirtsystem wäre ein bakterieller Wirt.
Wenn das LbpB Polypeptid zur Verwendung in Screening-Assays exprimiert wird, wird es im allgemeinen bevorzugt, daß das Polypeptid an der Zelloberfläche produziert wird. In diesem Fall können die Zellen vor der Verwendung im Screening-Aassay geerntet werden. Wenn LbpB-Polypeptid in das Medium sezerniert wird, kann das Medium gewonnen werden, um das Polypeptid zu gewinnen und reinigen; wenn es intrazellulär produziert wird, müssen die Zellen zuerst lysiert werden, bevor das Polypeptid gewonnen wird.
LbpB-Polypeptide können von rekombinanten Zellkulturen durch bekannte Verfahren einschließlich Ammoniumsulfat und Ethanol-Präzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austauschchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie gewonnen und gereinigt werden. Am meisten bevorzugt wird Hochleistungsflüssigchromatographie für die Reinigung verwendet. Allseits bekannte Verfahren zum Rückfalten von Proteinen können verwandt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
Impfstoffe
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren, zum Induzieren einer immunologischen Reaktion in einem Säuger (bevorzugterweise einem Menschen), welches das Inokulieren eines LbpB-Polypeptids oder Epitope-tragender Fragmente, Analoga, äußere Membranvesikel oder Zellen (attenuiert oder sonstwie) in den Säuger umfaßt, welche geeignet sind, Antikörper und/oder eine T-Zellimmunreaktion hervorzurufen, um dieses Tier unter anderem, gegen eine Neisseria-Erkrankung zu schützen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Reaktion in einem Säuger (bevorzugt einem Menschen), das das Einschleusen eines LbpB-Polypeptids über einen Vektor umfaßt, welcher die Expression von LbpB-Polynukleotid in vivo antreibt, um eine solche immunologische Reaktion zu induzieren, um Antikörper herzustellen, die dieses Tier vor Erkrankungen schützen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft eine immunologsische Zusammensetzung oder eine Impfstofformulierung, welche, wenn sie in einen Säugerwirt (bevorzugterweise einen Menschen) eingeschleust wird, in diesem Säuger eine immunologische Reaktion gegen ein LbpB-Polypeptid induziert, wobei die Zusammensetzung ein LbpB-Gen, oder ein LbpB-Polypeptid oder Epitope-tragende Fragmente, Analoga, äußere Membranvesikel oder Zellen (attenuiert oder sonstwie) umfaßt. Die Impfstofforumulierung kann weiter einen geeigneten Träger umfassen. LbpB-Impfstoffzusammensetzung wird bevorzugterweise oral oder parenteral verabreicht(einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser, intradermaler etc. Injektion). Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind schließen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein, welche Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten, welche die Formulierung mit dem Blut des Empfängers isotonisch machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel einschließen. Die Formulierungen können in Einheitsdosis oder Mehrfachdosisbehältern vorliegen, beispielsweise als versiegelte Ampullen und Phiolen, und sie können in einem gefriergetrockneten Zustand aufbewahrt werden, welcher nur die Zugabe eines sterilen flüssigen Trägers direkt vor der Verwendung benötigt. Die Impfstofformulierung kann auch Adjunvanssysteme zur Steigerung der Immunogenizität der Formulierung wie Öl-in-Wasser-System und andere im Fachgebiet bekannte Systeme umfassen. Die Dosierung wird von der spezifischen Aktivität des Impfstoffs abhängen und kann durch Routineexperimente leicht bestimmt werden.
Wolf et al., Science (1990) 247; 1465-8 haben von Techniken zur immunologischen/Impfstofformulierung für Polynukleotide berichtet.
Formulierung und Verabreichung
Peptide, wie die lösliche Form von LbpB-Polypeptiden und antagonistische Polypeptide oder kleine Moleküle können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger formuliert werden. Solche Formulierungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids oder Verbindung, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten. Solche Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen daraus. Formulierungen sollten dem Darreichungsmodus entsprechen und sind im Fachgebiet allseits bekannt. Die Erfindung betrifft weiter pharmazeutischen Verpackungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Inhaltsstoffe der zuvor erwähnten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind.
Polypeptide und andere Verbindungen der vorliegende Erfindung können alleine oder zusammen mit anderen Verbindungen, wie therapeutischen Verbindungen, benutzt werden.
Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung schließen die Injektion, typischerweise die intravenöse Injektion ein. Andere Injektionsrouten wie subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal können verwendet werden. Alternative Mittel für die systemische Verabreichung schließen die transmuköse und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Penetrationsmitteln wie Gallensalzen oder Fusidinsäuren oder anderen Detergentien ein. Zusätzlich können ebenfalls orale Verabreichungen möglich sein, wenn sie in enterische oder verkapselte Formulierungen in passender Form formuliert sind. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann auch topisch und/oder lokalisiert in Form von Salben, Pasten, Gelen und ähnlichen stattfinden.
Der benötigte Dosierungsbereich hängt von der Auswahl des Peptids, dem Verabreichungsweg, der Art der Formulierung, der Art der Umstände des Individuums und der Beurteilung des aufgesuchten Hausarzts ab. Geeignete Dosierungen liegen jedoch in einem Bereich von 0,1-100 μg/kg des Individuums. Umfassende Variationen der benötigten Dosierungen werden jedoch im Hinblick auf die Vielzahl von Verbindungen, die verfügbar sind und aufgrund der verschiedenen Wirksamkeiten der zahlreichen Verabreichungswege zu erwarten sein. Beispielsweise wird bei einer oralen Verabreichung erwartet werden, daß höhere Dosierungen benötigt werden, als bei der Verabreichung mittels intravenöser Injektion. Variierungen dieser Dosismengen können in standardisierten empirischen Routineverfahren zur Optimierung eingestellt werden, die allseits im Fachgebiet bekannt sind.
Beispiele
Die unten stehenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die allseits bekannt sind und für Fachleute Routine sind, außer wenn es ansonsten im Detail beschrieben ist. Diese Beispiele stellen die Erfindung dar, beschränken sie jedoch nicht.
Beispiel 1: Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen
Die verwendeten bakteriellen Stämme werden in Tabelle 1 aufgelistet. Meningococcen wurden über Nacht auf GC-Agarplatten (Difco), ergänzt durch Vitox (Oxoid), in einer feuchten 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Optimale Expression der durch Eisen regulierten Proteine wurde durch die Zugabe von 5 μg/ml des Eisenchelators Ethylendiamindi-o-hydroxyphenylessigsäure(EDDA, Sigma) erreicht. Zur Herstellung von Proben für die SDS-PAGE, Immunblotting und für die Isolierung der chromosomalen DNA wurden Zellen, wie zuvor beschrieben, gezüchtet (Pettersson et al., 1993).
Der E. coli-Stamm Y1090 (Young und Davis, 1983), welcher verwendet wurde, um den γgt11-Phagen zu propagieren, wurde in Luria-Bertoli (LB)-Medium gezüchtet, welches mit Ampicillin (100 μl/ml), 0,2% Maltose und 10 mM MgCl₂ ergänzt war. Der Stamm DH5α, welcher für die Klonierung verwendet wurde, wurde in LB-Medium gezüchtet, welches mit 100 μl/ml Ampicillin, 25 μg/ml Kanamycin oder 100 μg/ml Erythromycin ergänzt war, wenn es für die Selektion der Rekombinanten benötigt wurde. Nach der Transformation mit pEMBL19-Derivaten wurden Zellen auf LB-Platten ausplattiert, die mit dem geeigneten Antibiotikum ergänzt waren, und mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (40 μg/ml) und 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, um auf Plasmide mit Insertionen zu screenen. Der Stamm PC2494, welcher für die Herstellung von einzelsträngiger DNA verwendet wurde, wurde auf Minimalmediumplatten gehalten, welche mit 5 μg/ml Thiamin und 0,2% Glucose supplementiert waren.
Beispiel 2
2A: Herstellung von Maus-Antiserum gegen Peptide
Peptide (3) wurden unter Verwendung eines automatisierten multiplen Peptidsynthesegeräts synthetisiert und wurden an Tetanustoxoid gebunden, wie beschrieben wurde (von der Ley et al., 1991). BALB/c-Mäuse wurden mit 50 μg Peptid und 20 μg Quil A als Adjuvans immunisiert. Es wurden zwei Booster verabreicht. Das Serum wurde 54 Tage nach der ersten Injektion eingesammelt.
2B: Identifizierung des LbpB-Genprodukts
Um zu untersuchen, ob das vermutete LbpB-Gen ein Protein codiert, wurden Antiseren gegen synthetische Peptide erzeugt (angezeigt als A1-E1 in 3), welche auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz eines Teils eines offenen Leserasters beruhen. Die Antiseren wurden auf Western-Blots gegen Gesamtzellen des Stamms BNCV, getestet, welcher unter Eisenmangel gezüchtet wurde. Seren gegen Peptid B1 zeigten keine Reaktion (keine Daten gezeigt). Antiseren gegen andere Peptide reagierten mit einer Bande von ungefähr 95 kDa (1). Da diese Bande in der LbpB-Mutante (hergestellt, wie unten beschrieben) (1, Spuren 3 und 7) fehlte, wurde daraus abgeleitet, daß das LbpB-Gen in Wildtyp-Stamm exprimiert wird, und daß es ein Protein mit einem augenscheinlichen Molekulargewicht (Mr) von 95 000 codiert. Einige der Seren gegen die Peptide D1 und E1 zeigten eine zusätzliche Reaktion mit einer Bande bei einem Mr von 60 000 (1). Diese beiden Peptide enthalten die Sequenz VVFGAK, welche ebenfalls in TbpB (3) vorhanden ist. Daher könne die 68K-Bande TbpB sein. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden eine TbpB-Mutante N91, und dessen Parentalstamm B16B6 in Western-Blots getestet. Serum 19-1 (gegen Peptid E1) reagierte mit zwei Banden von 95K bzw. 68K im Stamm B16B6, aber nur mit der 95K-Bande im Stamm N91. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß die 68K-Bande tatsächlich TbpB ist (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3: SDS-PAGE und Immunblotting
SDS-PAGE von Gesamtzellproteinen wurde wie zuvor beschrieben (Pettersson et al., 1990, 1993) durchgeführt. In Experimenten, wo eine Denaturierung von LbpB verhindert werden mußte, wurden die folgenden Modifizierungen eingeschlossen. Der Probenpuffer enthielt kein β-Mercaptoethanol. Die äußerem Membrankomplexe wurden vor der Elektrophorese nicht bei 95°C im Probenpuffer erwärmt, sondern entweder auf Eis oder bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. In dem Lactoferrin-Bindungsexperiment, setzte sich das Polyacrylamidgel aus einem 5%igen (W/V) Sammelgel und einem 8%igen (W/V) Auflösungsgel enthaltend 0,05% (W/V) SDS zusammen. Der Elektrodenpuffer enthielt nur 0,05% anstelle von 0,1% SDS. Die Elektrophorese wurde bei einer gleichmäßigen Spannung von 100 v für 2 h bei 4°C durchgeführt. Standardprobenpuffer mit 2% SDS wurde verwendet.
Die Elektrophorese der äußeren Membranproteine, um gefaltete Formen von LbpB nachzuweisen, wurde mit dem PhastSystem (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, indem 7,5% (W/V) homogene Polyacrylamidgele mit SDS-Pufferstreifen verwendet wurden.
Das Immunblotting wurde, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (Pettersson et al., 1990, 1993). Im Falle der PhastSystem-Gele, enthielt der Blot-Puffer 0,05% (W/V) SDS und die Aktivität der Peroxidase wurde mit ECL-System gemäß den Anweisungen des Herstellers (Amersham) nachgewiesen. Die Maus-Antiseren wurden bei einer Verdünnung von 1:5000 verwendet. Die LbpA-spezifischen monoklonalen Antikörper mn98K1 und mn98K2 (Pettersson et al., 1993) wurden als Cocktail jeweils bei einer Verdünnung von 1:2000 verwendet.
Beispiel 4
4A: Klonierung und Sequenzierungsstrategien
Die λgt11-Genbibliothek des Stamms BNCV wurde ursprünglich von E.C. Gotschlich (The Rockefeller University, New York, USA) zur Verfügung gestellt. Die Bibliothek wurde im E. coli-Stamm Y1090 propargiert und mit den DNA-Sonden BE1 und AP6 (2) durchmustert. BE1 wurde durch Isolierung des 355 bp BstEII-EcoRI-Fragments des Plasmids pAM1 (Pettersson et al., 1993) hergestellt. AP6 war das 417 bp EcoRI-EcoRV-Fragment, das aus dem Plasmid pAM6 hergestellt wurde. Die Sondenmarkierung, die Plaque-Blotting und die Nachweise wurden wie beschrieben durchgeführt (Pettersson et al., 1993), indem der DIG-DNA-Labeling und Detection Kit (Boehringer Mannheim) verwendet wurde. λ-DNA wurde isoliert (Sambrook et al., 1989) und die Insertionen wurden in das Phagemid pEMBL19 subkloniert. Plasmid-DNA wurden auf Jetstar-Minisäulchen (Genomed) isoliert, wie vom Hersteller beschrieben. Einzelsträngige DNA wurde unter Verwendung des Helferphagen VCSM13 (Stratagene) propagiert.
Chromosomale DNA wurde wie beschrieben isoliert (Ausubel et al., 1989). Die DNA wurde mit AccI und DraI verdaut, und auf einen 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Das Southern-Blotting wurde wie beschrieben durchgeführt (Pettersson et all, 1993). Die Sonde ES1 (2) wurde durch Isolieren des 320 bp EcoRI-SalI-Fragments aus pAM13 hergestellt, und wie oben beschrieben markiert. Die Sonde reagierte mit einem 1,5 kb-Fragment in der mit AccI/DraI-verdauten chromosomalen DNA auf dem Southern-Blot. Fragmente von 1,5 kb wurden aus dem Gel isoliert und in pEMBL19 ligiert. Der Ligationsmix wurde mit dem M13-Universalprimer (Pharmacia) und dem LB11-Primer (Tabelle 2) PCR-amplifiziert. Goldstar-Polymerase, ein Taq-Polymerase-Derivat (Erogentec) wurde für die PCR-Amplifikation gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Das PCR-Produkt von 1,3 kb-Basen wurde aus dem Agarosegel gereinigt.
Die DNA-Sequenzierung wurde manuell unter Verwendung des Deaza G/A T7-Sequenziergemischs (Pharmacia) oder automatisch unter Verwendung der AB1 Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) durchgeführt. Für die automatische Sequenzierung wurde die Markierung mit dem Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) durchgeführt. Interne Primer (synthetisiert von Pharmacia oder Gibco BRL) und der M13-Universal- und reverse Primer (Pharmacia) wurden für die Sequenzierung der einzelsträngigen DNA, der doppelsträngigen Plasmid-DNA oder des PCR-Produkts verwendet.
Ähnliche Strategien wurden auf die Sequenz des LbpB-Gens aus H44/76 und dem M981-Stamm von N. meningitidis angewandt.
4B: Klonierung und Sequenz des LbpB-Gens
Um den fehlenden Teil des LbpB-Gens zu klonieren, wurde eine λgt11-Genbibliothek des Stamms BNCV mit DNA-Sonden durchmustert. Zwei verschiedene Lambda-Klone wurden gefunden. Die Insertionen wurden in pEMBL19 subkloniert, welche zu den Plasmiden pAM6 und pAM13 (2) führten, und sequenziert. Der Promotor und der Beginn des LbpB-Gens wurden auf diese Weise nicht gefunden. Einige andere Versuche, das 5'-Ende des Gens zu klonieren, schlugen fehl, was vermuten läßt, daß seine Expression in E. coli toxisch ist. Um den Rest der Sequenz zu gewinnen, wurde eine reiche Bank von AccI- und DraI-verdauter chromosomalen DNA hergestellt. Chromosomale DNA-Fragmente von ungefähr 1,5 kb wurden in pEMBL19 ligiert und eine PCR-Amplifikation wurde direkt im Ligationsmix durchgeführt, indem ein Primer (LB11, siehe 2), der auf einem bekannten Teil der LbpB-Sequenz beruhte, mit einem M13-Primer verwendet wurden. Das erhaltene PCR-Produkt (2) wurde direkt für die Sequenzierung verwendet. Diese Strategie vermeidet das Klonieren des möglicherweise toxischen Gens in E. coli.
Die Sequenzierung der verschiedenen LbpB-Fragmente offenbarte ein offenes Leseraster von 2175 Basenpaaren. Es codiert ein Protein von 725 Aminosäureresten (3) mit einer molekularen Masse von 79,4 kDa. Die Analyse der N-terminalen Sequenz zeigte die Eigenschaften einer Signalsequenz auf, welche durch Signalpeptidase II erkannt wird (von Heijne, 1989). Solche Signalsequenzen sind in den Vorläufern der Lipoproteine, die am endterminalen Cysteinrst des reifen Proteins acyliert sind. Eine ähnliche Signalsequenz wurde im TbpB-Protein gefunden, welches sich tatsächlich als Lipid-modifiziert erwies (Anderson et al., 1994). Das reife LbpB-Protein hat eine kalkulierte molekulare Masse von 77,5 kDa, was beträchtlich niedriger als die augenscheinliche molekulare Masse von 95 kDa ist, die bei der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS-PAGE) (1) beobachtet wurde. Die Durchmusterung der Swiss Prot-Datenbank auf Ähnlichkeiten zu anderen Proteinen offenbarte eine Homologie mit TbpB von Neisseria und Actinobacillus pleuropneumoniae. Die höchste Homologie, 33% Identität (unter Verwendung des PALIGN-Programms) wurde in TbpB von N. meningitidis-Stamm B16B6 (Legrain et al. 1993) (3) gefunden. Im TbpB-Protein wurden einige interne Wiederholungen gefunden, und es ist vorgeschlagen worden, daß das Molekül eine Struktur mit zwei Schlaufen hat, die sich nach einer internen Verdopplung entwickelt hat (Fuller et al., 1996, Renauld-Mongénie et al., 1996). Wenn man die Nterminalen 354 Aminosäuren des reifen LbpB-Proteins mit den C-terminalen 353 Aminosäuren aneinanderlagerte, wurde eine 30%ige Identität und 10%ige Ähnlichkeit herausgefunden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnis läßt vermuten, daß auch LbpB in einer zweischlaufigen Struktur vorliegen kann. Der isoelektrische Punkt des Proteins ist 4,5. Zwei lange Abfolgen, reich an sauren Resten, konnten in der Sequenz (3) erkannt werden. wenn diese Abfolgen in TbpB fehlen, können sie wichtig für die Bindung an Lactoferrin sein, welches im Gegensatz zu Transferin ein positiv geladenes Molekül ist.
In dem Promotorbereich konnte eine typische Shine-Delgarno-Sequenz erkannt werden. Zusätzlich wurden die vermuteten -10- und -35-Boxen gefunden (4). Eine Sequenz, die an eine Fur-Bindungsstelle erinnert, überlaßt mit der -10-Box. Fur wirkt zusammen mit Fe²⁺ als Repressor eisenregulierter Gene, durch die Bindung an eine 19 bp-Sequenz in der Promotorregion (Bagg und Neilands, 1987). Konsensus-Sequenz einer solchen Fur-Box ist GATAATGATAATCATTATC und 16 der 19 Basenpaare dieser Sequenz sind in diesem Element in dem LbpB-Promotor konserviert. Weiter stromaufwärts des Promotors wurde eine direkte Wiederholung von 131 bp gefunden (Daten nicht gezeigt). Diese Sequenz ist zweimal an dieser Position vorhanden. Die gleiche direkte Wiederholung wurde stromabwärts des LbpA-Gens gefunden (Prinz et al., unveröffentlichte Beobachtung). Eine FASTA-Homologierecherche zeigte eine Homologie dieser Wiederholung mit einer Anzahl an Neisseria-Sequenzen auf, die meistens offene Leseraster flankieren (Daten nicht gezeigt).
Die Sequenzhomologie zwischen den LbpB-Proteinen der BNCV- und M981-Stämme von Meningitidis und zwischen den LbpB-Proteinen der BNCV und H44/76-Stämme von N. meningitidis ist 72,7% bzw. 78,5%.
Beispiel 5
5A: Herstellung isogener Mutanten
Die Plasmide pAM23 und pAM6 wurden für die insertionelle Inaktivierung von LbpA bzw. LbpB verwendet. Die Erythromycin-Resistenz (Erm^r)-Kassette aus pER2 (Jennings et al., 1993) wurde mit ClaI und HindII ausgeschnitten. Das Fragment wurde mit T4-DNA-POlymerase behandelt und mit dem EcoRV-verdauten pAM23 ligiert, was zum Plasmid pAM23E führte. Die Kanamycin-Resistenz (km^r)-Kassette aus pUC4K (Pharmacia) wurde mit HincII ausgeschnitten. Plasmid pAM6 wurde mit BglII linearisiert und mit T4-DNA-Polymerase behandelt. Die Km^r-Kassette wurde an diese Stelle ligiert, was zum Plasmid pAM6K führte. Ein Linker, der sich aus den Oligonukleotiden nus1 und nus2 (Tabelle 2) zusammensetzt, welcher die Neisseria-Aufnahmesequenz (GCCGTCTGAA) und KpnI-kompatible einzelsträngige Enden enthält, wurde in die KpnI-Schnittstelle von pAM6K kloniert, was zu Plasmid pAM6Knus führte. Die Antibiotika-Resistenzgene liegen in gleicher Richtung wie lbpA und LbpB in Plasmiden pAM23E und pAM6K (-nus). Plasmid pAM23E, welches mit KpnI linearisiert wurde, wurde verwendet, um den Stamm H44/76 wie zuvor beschrieben, zu transformieren (von der Ley und Poolmaqn, 1992). Transformanten wurden auf GC-Platten ausgewählt, die 5 μg Erythromycin je ml enthalten. Ein korrekter Genaustausch in einer der Transformanten, bezeichnet als CE1449, wurde unter Verwendung der Primer FW5 und DVAS2 (Tabelle 2) mittels PCR überprüft und mittels Southern-Blot-Analyse unter Verwendung der Sonde AP23 (2; isoliert als 184 bp SspI-HindII-Fragment aus pAM23). Für den Southern-Blot wurde chromosomale DNA mit ClaI und SalI verdaut. Die isogenen Mutanten im Stamm BNCV wurden durch Elektroporation hergestellt (Genco et al., 1991), das dieser Stamm nicht transformierbar erschien. Die chromosomale DNA der LbpA-Mutante CE1449 wurde verwendet, um die LbpA-Mutante herzustellen. Transformanten wurden auf GC-Platten mit Erythromycin ausgewählt und wie zuvor erwähnt überprüft. Plasmid pAM6K-nus wurde verwendet, um die LbpB-Mutante herzustellen. Die Transformanten wurde auf GC-Platten selektioniert, die 100 μg/ml Kanamycin enthalten. Ein korrekter Genaustausch wurde unter Verwendung der Primer SDA1 und PR1 (Tabelle 2) mittels PCR überprüft, und durch Southern-Blot unter Verwendung der Sonde AP23.
5B: Herstellung isogener Mutanten
Um die Identität des 94 kDa-Proteins zu überprüfen, und um die Rolle der individuellen Lactoferrin-bindenden Proteine bei der Lactoferrin-Bindung und -Verwendung zu untersuchen, wurde ein Satz isogener Derivate von BNCV, denen entweder LbpA oder LbpB fehlt, wie in Beispiel 5A beschrieben, hergestellt. Ein korrekter Genaustausch wurden in PCR-Reaktionen und durch Southern-Blotting (Daten nicht gezeigt) verifiziert. Die Expression von LbpA und LbpB in den Mutanten wurde auf Western-Blots überprüft (5). Die LbpA-Mutante CE1452 exprimierte LbpA (5A, Spur 4), und die LbpB-Mutante CE1454 exprimierte das 94 kDa-Protein (5B, Spur 6) jeweils nicht. Dieses Ergebnis bestätigt, daß das LbpB-Gen tatsächlich im Wildtyp-Stamm exprimiert wird, und daß es ein Protein mit einem Molekulargewicht Mr von 94 000 codiert, welches beträchtlich höher als seine kalkulierte molekulare Masse von 77,5 kDa ist. Außerdem zeigen die Ergebnisse in 4, daß die Inaktivierung von LbpB keine polarisierende Wirkung auf die LbpA-Expression (5A, Spur 6). Dies wurde erwartet, da die Kanamycin-Resistenzkassette, welche in LbpB inseriert wurde, keinen Transkriptionsterminator enthält. Die zuvor beschriebene spontane LbpA-Mutante CE1402 (Pettersson et al., 1994b) schien ebenfalls keine LbpB-Expression zu haben (5B, Spur 8). Da sowohl diese Mutante und BNCV-Derivate des Stamms M986 sind, ist der genetische Hintergrund der gleiche wie der anderer Mutanten. Die Expression sowohl von LbpA als auch LbpB schienen eisenreguliert zu sein (5). Eine schwache Expression von LbpA wurde im Stamm CE1454 selbst dann bemerkt, wenn die Zellen ohne eine Eisen-Chelator (5A, Spur 5) gezüchtet wurden. Diese Expression ist aufgrund einer Transkription vom Promotor des Kanamycin-Resistenzgens LbpB wahrscheinlich. Jedoch war die Expression von LbpA auch in diesem Fall mehrfach erhöht, wenn der Stamm in Gegenwart eines Eisenchelators gezüchtet wurde (5A, Spur 6).
Beispiel 6:
6A: Lactoferrin-Bindungsassay
Die Lactoferrin-Bindung an ganze Zellen wurde in einem ELISA-artigen Assay untersucht. Rekombinantes humanes Lactoferrin, hergestellt in Aspergillus avamori, wurde freundlicherweise von Agennix Inc., Houston, Texas, USA zur Verfügung gestellt. Das Lactoferrin wurde mit Eisen gesättigt, wie beschrieben (van Berkel et al., 1995), jedoch mit den folgenden Veränderungen. FeCL₃wurde anstelle von Fe(NO₃)₃ verwendet, und die Dialyse wurde gegen 5 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄-Puffer pH 7,7 für 4 h durchgeführt. Kolonien der Platten wurden in Tris-gepufferter Salzlösung, pH 7,5 (TBS) suspendiert und durch Erwärmen für 30 min bei 56°C abgetötet. Proben (100 μl) mit einer optischen Dichte von 0,05 bis 620 nm wurden in die Wells einer Mikrotiterplatte verteilt. Den Proben wurde ermöglicht, über Nacht bei 37°C zu trocknen. Der Assay wurde bei 37°C durchgeführt. Eine nicht-spezifische Bindung wurde durch 100 μl einer Blockierungslösung für 1 h verhindert, die 0,5% Protifar (Nutricia) und 0,1% Tween 20 in TBS enthält. Nach der Blockierung wurden die Wells mit verschiedenen Konzentrationen an Lactoferrin in einer Blockierungslösung gefüllt. Die Konzentration von Lactoferrin in den Wells variierte von 3,125 bis 200 ng/ml. Nach der Inkubation für 1 h und drei Waschschritten mit Leitungswasser wurde eine Peroxidase-gekoppeltes Kaninchen-polyklonales Antiserum gegen menschliches Lactoferrin (ICN Biomedicals) zu den Wells hinzugegeben. Der Antikörper wurde bei einer Verdünnung von 1:5000 in Blockierungspuffer verwendet. Nach der Inkubation für 1 h und drei Waschschritten mit Leitungswasser wurde die Peroxidasemenge detektiert (Abdillahi und Poolman, 1987).
Die Lactoferrin-Bindung an einen Blot wurde wie folgt durchgeführt. Unspezifische Bindungen wurden durch Inkubieren der Membran in 0,2 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄-Puffer, pH 5,7, enthaltend 1% Tween 20 und 0,5% Protifar (Nutricia) für 2 h blockiert. Der Blot wurde mit 1,2 μg/ml Peroxidasekonjugiertem humanem Lactoferrin (Pettersson et al., 1993) für 1 h in Blockierungspuffer inkubiert, und dreimal mit Blockierungspuffer gewaschen. Die Aktivität der Peroxidase wurde in dem ECL-System gemäß den Anweisungen des Herstellers (Amersham) nachgewiesen.
6B: Plattenzuführer-Assays
Meningococcen wurden über Nacht in TSB gezüchtet, welches mit Vitox supplementiert war, wie in Beispiel 1 beschrieben. Von der Übernacht-Kultur wurden 300 μl in 3 ml Top-Agar suspendiert (1% GC-Agar mit 20 μg EDDA je ml, heruntergekühlt auf 42°C) und sofort auf GC-Agarplatten, die mit Vitox und 20 μg EDDA je Mittel supplementiert waren, ausplattiert. Tropfen (10 μl) rekombinantes humanes Lactoferrin (11% Eisen gesättigt oder gesättigt wie oben beschrieben) wurden auf die Platten getröpfelt. Die Konzentration an Lactoferrin in den Tropfen betrug 10 bzw. 20 mg/ml. Die Platten wurden über Nacht inkubiert.
6C: Bindung von Lactoferrin an gefaltetes LbpB auf Blots
Um zu untersuchen, ob Lactoferrin an LbpB auf Blots binden kann, wurden SDS-PAGE-Bedingungen gesucht, unter denen LbpB nicht denaturiert wird (siehe Beispiel 6A). Wenn die Proben vor der Elektrophorese nicht in Probepuffer erwärmt wurden, wurde eine schnell migrierende Form des LbpB-Proteins nachgewiesen, was wahrscheinlich die native, gefaltete Form des Protein darstellt (6A). Diese Form hatte einen Mr von ungefähr 80 kDa. Nach der Erwärmung für 10 min bei 95°C, war das LbpB-Protein vollständig denaturiert und migrierte an die 94 kDa-Position (6A, Spur 2). Interessanterweise reagierte nur das Serum gegen das Peptid Al (2) mit der schneller migrierenden Form des Proteins. Dieses Peptid enthält eine der zwei Abfolgen, die an negativ geladenen Aminosäuren reich sind und ist möglicherweise an der Lactoferrinbindung beteiligt. Die Bindung der Antikörper an das gefaltete Protein läßt vermuten, daß dieser Teil des Proteins exponiert ist, während alle anderen Peptid-Epitope in der gefalteten Struktur von LbpB versteckt sind.
Die Bindung von Lactoferrin an das gefaltete LbpB-Protein wurde anschließend untersucht. Äußere Membranproteine des Stamms BNCV wurden auf Mikrozellulosemembran geblottet und wurden mit Peroxidase-gekoppeltem humanen Lactoferrin inkubiert. Die Spezifität der Lactoferrin-Bindung schien extrem empfindlich gegenüber den Inkubationsbedingungen zu sein, am stärksten gegenüber dem pH-Wert. Unter optimierten Bedingungen band Lactoferrin spezifisch an eine Proteinbande mit einem Mr von 80 kDa (6B, Spuren 1 und 2). Es wurde keine Bindung beobachtet, wenn die Proben für 10 min für 95°C vor der SDS-PAGE erwärmt wurden (6B, Spur 3). Die Bande wurde nicht in den Proben der LbpB-Mutante CE1454 (Daten nicht gezeigt) detektiert. Daher wird geschlossen, daß die schneller migrierende Form des LbpB-Proteins wahrscheinlich die gefaltete Form des Proteins darstellt, und in der Lage ist, an Lactoferrin zu binden.
6D: Lactoferrin-Bindung und Verwendung in ganzen Zellen
Die Lactoferrin-Bindung an ganze Zellen wurde in einem ELISA-artigen Assay untersucht. Die ELISA-Platten wurden mit ganzen Zellen des Stamms BNCV der isogenen Mutanten beschichtet, und Lactoferrin wurde in verschiedenen Konzentrationen zu den Wells hinzugegeben. Die Bindung von Lactoferrin an die Zellen wurde mit einem Peroxidase-konjugierten Antikörper gegen humanes Lactoferrin geprobt (7). Die LbpB-Mutante war in ihrer Fähigkeit an Lactoferrin zu binden, leicht reduziert. Die LbpA-Mutante band Lactoferrin weniger effizient als die LbpB-Mutante, während die Doppelmutante nahezu überhaupt kein Lactoferrin band (7).
Die Fähigkeit Lactoferrin als einzige Quelle von Eisen zu verwenden, wurden in Platten-Fütterungs-Assays untersucht. Meningococcen wurden unter Eisenentzug auf Platten gezüchtet, Tropfen rekombinantes menschliches Lactoferrin wurden auf die Platten getröpfelt, und die Wachstumsstimulierung wurde überwacht. Die LbpB-Mutante war in der Lage auf Lactoferrin zu wachsen, während die LbpA-Mutante nicht in der Lage war (8). Das Lactoferrin war 11% eisengesättigt. Das gleiche Experiment wurde mit eisenbeladenem Lactoferrin durchgeführt, welches im wesentlichen die gleichen Ergebnisse ergab (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigen, daß das LbpA-Protein für die Eisenaufnahme über Lactoferrin notwendig ist, während LbpB nicht wesentlich zu sein scheint.
Beispiel 7:
Um die Variabilität des Meningococcen-LbpB-Proteins zu untersuchen, wurden die LbpB-Gene von vier weiteren Stämmen sequenziert: H44/76, M990, M981, 881607 (siehe Tabelle 1).
7A: Sequenzierung von LbpB von vier weiteren Menigococcen-Stämmen -Methoden
Bakterien wurden auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Chromosomale DNA wurde aus den Bakterien isoliert, die auf Platten gezogen wurden. Nach dem Wachstum über Nacht wurden die Bakterien von den Platten heruntergekratzt und 1,5 ml 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8 und 10 μl Lysozym (10 mg/ml) wurde hinzugegeben. Die Suspension wurde für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor 1,5 ml 2% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8 hinzugegeben wurde. Nach 15 min Inkubation wurden 10 μl Proteinase K (10 mg/ml) hinzugegeben. Die Röhrchen wurden für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde einmal mit Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol (gemischt im Verhältnis 24:24:1) extrahiert, und einmal mit Chloroform, das wassergesättigt war. Die chromosomale DNA wurde mit Ethanol präzipitiert.
Chromosomale DNA wurde verwendet, um mittels PCR die LbpB-Gene zu amplifizieren. Die Primer LB20 und REV2 (Tabelle 3) wurden an den Stämmen H44/76, M990 und 881607 verwendet. Die Primer LB20 und LB23 wurden am M981-Stamm verwendet. Die Primer beruhen auf der Sequenz von LbpB des Stamms BNCV. LB20 bindet stromaufwärts des LbpB-Gens und LB23 und REV2 zu Beginn des LbpA-Gens. LB23 hat eine zusätzliche BamHI-Schnittstelle am 5'-Ende. Goldstar-Polymerase, ein Taq-Polymerase-Derivat (Eurogenetic) wurde für die PCR-Amplifikation gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet. Die Anlagerungstemperatur war in allen Fällen 50°C, und es wurden 30 Zyklen durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden aus Agarosegelen gereinigt, indem β-Agarase (New England Biolabs) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde.
Die DNA-Sequenzierung wurde durch Gene-Walking unter Verwendung von Primern durchgeführt, die für die LbpB-Gene entworfen wurden. Die Primer wurden von Gibco BRL synthetisiert. Die Sequenzierung wurde automatisch unter Verwendung des ABI-Prism 310 Genetic Analyser (Perkin-Elmer) durchgeführt. Die Markierung wurde mit dem Dye Terminator Cycle Sequencing-Kit (Perkin-Elmer) durchgeführt.
Die Computerprogramme TRANSL, PALIGN und CLUSTAL aus dem Software-Paket PC Gene 6.70 (IntelliGenetics) wurden verwendet, um die Nukleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz für die paarweise Anlagerung von Sequenzen bzw. für die mehrfachen Anlagerungen durchzuführen.
7B: Sequenzierung von LbpB von vier weiteren Menigococcen-Stämmen -Ergebnisse
Die Nukleotidsequenzen der LbpB-Gene der vier Stämme sind in SEQ ID NO:3, 5, 7 und 9 gezeigt. Die Nukleotidsequenzen wurden in Aminosäuresequenzen übersetzt, und eine Anlagerung der fünf bekannten Sequenzen der LbpB-Proteine wird in 9 dargestellt. Auf Aminosäureniveau betrug die Identität zwischen den LbpB-Proteinen der verschiedenen Stämme 70-80%. Ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Beispiel 8:
Das Expressionsniveau von LbpB in Neisseria meningitis ist sehr niedrig; das Protein konnte nicht nachgewiesen, wenn die Muster der äußeren Membranproteine mittels SDS-PAGE analysiert wurden. Für immunologische und strukturelle/funktionale Studien des LbpB-Proteins wurde ein Konstrukt für die Expression des Proteins in Escherichia coli hergestellt. Um die Reinigung des rekombinanten Proteins zu erleichtern, enthielt das durch das Konstrukt codierte Protein einen His-tag und die Lipid-Modifizierung des N-Terminus wurde durch Ersetzen der nativen Signalsequenz und der ersten zwei Aminosäurereste der reifen Domäne verhindert.
8A: Expression von rekombinantem LbpB – bakterielle Stämme und Waschungsbedingungen
Der Meningococcen-Stamm BNCV (-:2a:Pl.2) wurde über Nacht auf GC-Agarplatten (Difco), die mit Vitox (Oxoid) suppelementiert waren, in einer feuchten 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Das Konstrukt, das das rekombinante LbpB-Protein codiert, wurde in dem E. coli-Stamm CE1448 (großzügig von C. Jansen zur Verfügung gestellt), welcher ein htrAompT-Derivat des Stamms CE1224 (Thommassen et al., 1983) ist, exprimiert. Der Stamm wurde bei 37°C in einem Hepes-gepufferten synthetischen Medium (Tommassen und Lugtenberg, 1980) gezüchtet, welches mit Wachstumsbedingungen aufgrund der auxotrophen Mutationen und mit 1,32 mM K₂HPO₄ (Phosphat-Ergänzungsbedingungen) supplementiert war. Nach dem Wachstum über Nacht wurde die Kultur 1:13,5 im gleichen Medium verdünnt, aber ohne K₂HPO₄ (Phosphat-depletierte Bedingungen) und für 6 h bei 37°C gezüchtet.
8B: Expression von rekombinantem LbpB – Klonierung in E. coli
Chromosomale DNA wurde aus Meningococcen-Zellen, die über Nacht auf Platten gezüchtet wurden, isoliert. Die Bakterien wurden von den Platten abgekratzt, in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8 suspendiert und 10 μl Lysozym (10 mg/ml) wurde zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert, bevor 1,5 ml 2% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 10 mm EDTA, pH 8 hinzugegeben wurde. Nach 15 min Inkubation wurden 10 μl Proteinase K, (10 mg/ml) hinzugegeben. Die Röhrchen wurden für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wurde aus dem Gemisch durch Zugabe von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (24:24:1 nach Volumen) extrahiert, und weiter durch Extraktion mit Chloroform gereinigt, welches mit Wasser gesättigt ist. Die chromosomale DNA wurde mit Ethanol präzipitiert.
Die chromosomale DNA wurde als Matrize verwendet, um den Teil des LbpB-Gens zu amplifizieren, welches dem reifen LbpB entspricht, indem eine PCR unter Verwendung der Primer LB22 und LB23 (Tabelle 5) verwendet wurden. LB22 bindet an eine Stelle, die dem N-termoinalen Teil des LbpB-entspricht, und fügt eine PstI-Stelle in das PCR-Produkt ein. LB23 bindet genau stromabwärts von LbpB am Beginn des LbpA-Gens und fügt eine BamHI-Schnittstelle ein. Pwo-Polymerase (Boehringer Mannheim) ein Proof-Reading-Enzym wurde in der PCR-Reaktion verwendet, gemäß den Anweisungen, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt sind. Die Anlagerungstemperatur betrug 60°C und es wurden 30 Zyklen durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung von R-Agarase (New England Biolabs) aus einem Gel gemäß den Instruktionen des Herstellers isoliert. Das PCR-Produkt wurde mit PstI und BamHI verdaut, und in pJP29 ligiert (10A), welches ebenfalls mit PstI und BglII verdaut worden ist. In dem erhaltenen Konstrukt pAM31, gehen die BamHI- und BglII-Schnittstellen verloren. Das LbpB-Protein wird in diesem Konstrukt von phoE-Promotor exprimiert und erhält die PhoE-Signalsequenz anstelle der authentischen Signalsequenz. Außerdem wurden die ersten zwei Reste des N-Terminus von Cys und Ile in Ala bzw. Val geändert. Um die Reinigung des Proteins zu erleichtern, wurde in His-Tag zwischen der Signalsequenz und dem reifen Teil des LbpB inseriert. pAM31 wurde mit PstI verdaut und mit einem Linker, der aus den Oligonukleotiden VGO12a und VGO13a (Tabelle 5) zusammengesetzt ist, ligiert, was zum Plasmid pAM32 (10A) führt. Die PstI-Schnittstelle wird nach der Ligation verloren.
Der Linker codiert für sechs His-Reste und eine Faktor-Xa-Schnittstelle (10B).
8C: Reinigung von rekombinantem LbpB
Das rekombinante LbpB wurde in dem Stamm CE1448 enthaltend pAM32 hergestellt. Phosphat-limitierte Zellen einer 5 l-Kultur wurden nach 6 h Wachstum geerntet. Die Zellen wurden einmal mit 500 ml physiologischer Salzlösung gewaschen und in 150 ml 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8 resuspendiert. Die Suspension wurde bei -20°C über Nacht eingefroren. Die Zellen wurden aufgetaut und drei Protease-Inhibitorcocktailtabletten (Complete^TM, Boehringer Mannheim) wurden zugegeben. Die Zellen wurden bei einem Druck von 8000 psi zweimal durch eine French press gedrückt. Nichtaufgebrochene Zellen wurden durch Zentrifugieren in einem Sorvall-GSA-Rotor bei 5000 Upm für 20 min entfernt. Der Überstand wurde in einem Beckman Ti60-Rotor bei 40 000 Upm für 90 Minuten zentrifugiert. Die Zellhüllen wurden in 5 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ ^--Puffer, pH 7,6 gelöst.
Die Zellhüllen wurden zweimal mit 2% n-Octyl-oligo-oxyethylen (Octyl-POE) bei 37°C extrahiert. Die erste Extraktion wurde für 1 h durchgeführt, und die zweite für 3 h. Inzwischen und nach den Extraktionen wurden nicht-lösliche Proteine durch Zentrifugieren in einem Beckman TLA100.2-Rotor bei 100 000 Upm für 1 h zentrifugiert. Überstände, die das LbpB-Protein enthalten, wurden zusammengegeben und zu Ni-NTA-Agarose gegeben. Die Reinigung des Proteins wurde in einem Batch unter nativen Bedingungen, gemäß den Anweisungen die vom Hersteller (Qiagen) angegeben wurden durchgeführt. Die Konzentrationen an Imidazol und NaCl betrugen 20 mM bzw. 300 mM, während der Bindung und beim Waschen. Insgesamt wurden 2 ml Ni-NTA-Agarose verwendet, aufgeteilt auf 10 Röhrchen. Die Elution wurde in Schritten mit 3 ml 100 mM, 200 mM und 250 mM Imidazol durchgeführt. Nach der Elution wurde das Protein zweimal in einem Spectra/Por 2-Dialysebeutel (Spectrum) gegen 2,5 l Phosphat-gepufferter Salzlösung dialysiert. Das Protein wurde in einem Fugisept Maxi Centrifugal Concentrator (Intersept) mit einem Cut-Off von 10 kDa auf konzentriert. Die Zentrifugierung wurde in einem Sorvall GSA-Rohr bei 5000 Upm durchgeführt, bis das Gesamtvolumen 1-1,5 ml betrug.
Die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) wurde mit einigen Veränderungen nach Lugtenberg et al. (1975) durchgeführt. Das Polyacrylamidgel setzte sich aus einem 5%igen Sammel-Gel und einem 11%igen Auflösegel ohne SDS zusammen. Wenn die Denaturierung des LbpB zu verhindern war, enthielt der Probenpuffer (Lugtenberg et al., 1975) kein β-Mercaptoethanol und die Proben wurden vor der PAGE bei 0°C aufbewahrt. Um LbpB zu denaturieren, wurde der Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol supplementiert, und die Proben wurden für 5 Minuten gekocht. Die Elektrophorese wurde bei einem konstanten Strom von 20 mA bei 4°C durchgeführt. Das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt.
8B: Expression und Reinigung von rekombinantem LbpB – Ergebnisse
Eine rekombinante Form von LbpB N. meningitidis-BNCV wurde im E. coli-Stamm CE1448 exprimiert. Ein Konstrukt, pAM32, das das rekombinante Protein codiert, welches aus der Signalsequenz von PhoE, einem His-Tag und dem reifen LbpB-Protein besteht (10A) wurde hergestellt. Das Protein wird vom phoE-Promotor unter Phosphatbeschränkung exprimiert. Die authentische TypII-Signalsequenz von LbpB wird durch eine Typ I-Signalsequenz und ein His-Tag ersetzt, gefolgt von einer Faktor-Xa-Spaltstelle, die zwischen die Signalsequenz und das reife LbpB inseriert wird. Außerdem wurden die zwei ersten Aminosäuren des reifen LbpB, Cys und Ile in Ala und Val geändert (10B). Dadurch kann das rekombinante Protein am Nterminalen Cys nicht Lipid-modifiziert werden. Das rekombinante LbpB-Protein, wird mit den Membranen fraktioniert, und nicht mit den löslichen Proteinen (nicht gezeigte Daten). Daher mußte es mit einem Detergens aus der Membran extrahiert werden. Octyl-POE wurde verwendet, da es ungefähr 50% der Gesamtmenge des rekombinanten LbpB aus der Membran löste. Außerdem, wenn das extrahierte Protein nicht durch Kochen in Probenpuffer denaturiert wird, migriert es in PAGE schneller als das denaturierte Protein (Daten nicht gezeigt), was vermuten läßt, daß das Protein korrekt gefaltet ist. Nach der Extraktion wurde das His-getaggte Protein mittels Ni-Affinitätschromatographie gereinigt. Der Großteil des Proteins eluierte in den 100 mM- und 200 mM-Imidazolfraktionen. Jedoch wurden alle Fraktionen vor der Dialyse zusammengegeben. Das Protein war rein, wie durch ein Coomassie Brilliant Blue-gefärbtes Gel (11) beurteilt wurde, und das meiste lag in gefalteter Form vor, das während der PAGE schneller migrierte als die denaturierte Form. Die gefaltete Form von LbpB, aber nicht die denaturierte Form, erwies sich auf einem Blot in Beispiel 6 als Lactoferrin bindend.
Beispiel 9
Um die Immunogenizität des LbpB-Proteins im Menschen zu untersuchen, wurde das Vorliegen von Antikörpern, die das LbpB-Protein des Stamms BNCV erkennen, in den Seren von konvaleszenten Menschen in Immunblots getestet.
9A: Immunogenizität von LbpB bei Menschen – Verfahren
Seren von 10 konvaleszenten Menschen wurden SmithKline Beecham Biologicals SA, Belgien bezogen, und 7 Seren vom National Institute of Public Health and the Environment, Niederlande (Tabelle 6). Die Individuen sind mit Stämmen verschiedener Sero- und Subtypen infiziert gewesen.
Rekombinantes LbpB wurde unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrens isoliert. Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) wurde wie von Lugtenberg et al. (1975) mit einigen Veränderungen durchgeführt. Das Polyacrylamid-Gel setzte sich aus einem 5%igen Sammelgel und einem 11%igen Auflösungsgel ohne SDS zusammen. Wenn eine Denaturierung von LbpB zu vermeiden war, enthielt der Probenpuffer kein (β-Mercaptoethanol, und die Proben wurden vor der Elektrophorese bei 0°C aufbewahrt. Um das LbpB zu denaturieren, wurde der Probenpuffer mit (β-Mercaptoethanol supplementiert, und die Proben wurden für 5 min gekocht. Die Elektrophorese wurde bei einem konstanten Strom von 20 mA bei 4°C durchgeführt.
Immunblotting wurde wie von Pettersson et al. (1993) beschrieben, durchgeführt. Humanseren wurden 1:500 verdünnt. Peroxidase-konjugiertes Kaninchen-anti-Human-IgG (Dako A/S) wurde als Sekundärantikörper bei einer Arbeitskonzentration von 1:5000 verwendet. Die Aktivität der Peroxidase wurde mit dem ECL-System gemäß den Anweisungen, die vom Hersteller bereitgestellt wurden (Amersham) nachgewiesen.
9B: Immunogenizität von LbpB bei Menschen – Ergebnisse
Das Vorliegen LbpB-spezifischer Antikörper in Humanseren wurde gegen gereinigtes rekombinantes LbpB-Protein des Stamms BNCV (-:2a:Pl.2) in Immunblots getestet. Die Reaktivität wurde sowohl gegen gefaltete LbpB und gegen das denaturierte Protein (siehe 12 für Beispiele) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Vier der Seren reagierten sowohl mit der denaturierten und der gefalteten Form von LbpB stark. Fünf Seren reagierten mit beiden Formen schwach, zwei Seren reagierten nur mit der gefalteten Form schwach, zwei Seren nur mit der denaturierten Form schwach und vier Seren reagierten mit LbpB überhaupt nicht. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Meningococcen-LbpB bei Menschen immunogen ist und lassen einen beträchtlichen Grad an immunologischer Kreuzreaktivität zwischen den LbpB-Proteinen verschiedener Stämme vermuten.
Beispiel 10: ELISA & bakterizide Tests zur Verwendung von Seren, die von Mäusen gewonnen wurden, die mit den Menigococcen-Zellen oder LbpB immunisiert wurden
10A: Immunisierungsprotokoll
Immunisierung mit N. meningitidis-Stamm BNCV: Gruppen aus 10 Mäusen (6 Wochen alte BALB/C) wurden immunisiert (100 μl intraperitoneal oder 100 μl subkutan) dreimal mit 5x10⁸ CFU hitzeinaktivierter BNCV Gesamtzellen in SBAS2-Adjuvans. Die drei Immunisierungen wurden in 21-tägigen Abständen durchgeführt, und es wurde am Tag 56 Blut durch intrakardiale Punktion abgenommen. Die Seren pro Gruppe wurden gepoolt.
Die Immunisierung von LbpB von N. meningitidis-Stamm BNCV: Dies wurde durch das gleiche Verfahren wie oben durchgeführt, außer daß die zwei ersten Immunisierungen mit 10 μg an rohem LbpB (E. coli-Zellhülle, enthaltend das rekombinante LbpB) durchgeführt wurden, und die dritte Immunisierung mit 2,5 μg reinem LbpB durchgeführt wurde (auf gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben).
10B: Messung der Reaktion in Gesamtzell-ELISA (WCE) und gereinigten LbpB-ELISA
Flachboden-96-Well-Immunplatten wurden verwendet. 100 μl hitzeinaktivierter Neisseria meningitidis B-Stamm [welcher unter Eisenmangelbedingungen (fe-) unter Verwendung von EDDA wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wurden] (20 μg/ml Gesamtprotein) Suspension in PBS wurde in die einzelnen Wells der Platten aliquotiert und es wurde ihnen ermöglicht, über Nacht bei 37°C zu verdampfen.
Die beschichteten Platten wurden viermal mit 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20 gewaschen und wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren mit PBS-Casein 0,3% (Merck) gesättigt und in gleicher Weise gewaschen. 100 μl gepoolter Seren wurden 100-fach in PBS Tween 20 0,05%, Casein 0,1% verdünnt, zur ersten Vertiefung hinzugegeben, dann zweifach bis zu 12 Verdünnungen verdünnt und dann wurden die Platten für 30 Minuten bei 37°C unter Rühren inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 μl einer 2000-fachen Verdünnung von Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulinbiotin (Dakotapatts E0413) in PBS Tween 20 0,05%, Casein 0,3% hinzugegeben, und die Platten wurden auf gleiche Weise wie zuvor inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und dann wurden 100 μl einer 4000-fachen Verdünnung in PB5 Tween 20, 0,05% Streptavidin-biotinylierter Meerrettichperoxidase-Komplex hinzugegeben, und die Platten wurden auf gleiche Weis inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 μl einer frisch hergestellten Lösung aus 4 mg O-Phenyldiamin (OPDA)-Ausgangslösung (Sigma P8787) in 0,1M Citratpuffer, pH 4,5, hinzugegeben, und die Platten wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur in einer Dunkelkammer inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 50 μl in 1N HCl gestoppt. Die Absorptionen wurden bei 490 nm abgelesen.
Anti-LbpB-ELISA funktioniert auf gleiche Weise wie WCE, außer daß die Beschichtung unterschiedlich ist. Die Wells wurden mit 100 μl einer Lösung aus 0,5 μg/ml reinem LbpB in 0,05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer pH 9,6 beschichtet, und über Nacht bei 37°C (nicht verdampft) inkubiert.
10C: Bakterizider Assay
Eine Kultur aus Gruppe B Meningococcen (Stamm H44/76) [gezüchtet entweder unter den Bedingungen einer Eisendepletierung (fe^-) wie in Beispiel 1 beschrieben, oder unter eisenreichen (fe⁺)-Bedingung durch Weglassen der Zugabe von EDDA] in der Log-Phase des Wachstums (OD~) wurde in sterilem Hanks-Medium 0,3% BSA suspendiert, um eine Arbeitszellsuspension zu gewinnen, die auf 20 000 CFU/ml eingestellt ist.
Eine erste Reaktionsmischung (75 μl) wurde hergestellt, die 50 μl/Well 2-facher Verdünnungen der Testseren (Beispiel 10A)-Proben enthält (welche bei 56°C für 30 min hitzeinaktiviert worden waren) und 25 μl/Well der 20 000 CFU/ml Log-Phase Gruppe B-Meningococcen. Die Reaktionsgefäße wurden bei 37°C für 15 Minuten inkubiert und bei 210 Upm geschüttelt. Die endgültige Reaktionsmischung (100 μl) enthielt zusätzlich 25% zuvor getestetes Baby-Kaninchenserum als Komplement-Quelle und es wurde unter den gleichen Bedingungen für 60 Minuten inkubiert. Eine sterile Polystyrol-U-Boden-96-Well-Mikrotiterplatte wurde für diesen Test verwendet.
Ein 10 μl-Aliquot wurde unter Verwendung einer Multikanalpipette aus jedem Well abgenommen, und wurde in Mueller-Hinton-Agarplatten, enthaltend 1% Isovitalex und 1% Hitze-inaktiviertes Pferdeserum getropft und für 18 Stunden bei 37°C in 5% CO2 inkubiert. Einzelne Kolonien konnten bis zu 80 CFU je Aliquot gezählt werden.
Die folgenden drei Testproben wurden als Kontrollen verwendet:
Puffer + Bakterien + Komplement; Puffer + Bakterien + inaktiviertes Komplement; Serum + Bakterien + inaktiviertes Komplement.
Die Titer wurden unter Verwendung des Verfahrens mit dem Programm Excel (Microsoft) berechnet. Dieses Verfahren gibt eine präzise Mischung der Verdünnung an, die 50% Zelltod durch eine Regressionsberechnung entspricht.
Beispiel 10D: Ergebnisse
Tabelle 7 und 13 zeigen, daß die Immunisierung mit LbpB eine gute Reaktion gegen LbpB (13A) wie auch gegen Gesamtzellproben des Stamms BNCV (der Quelle des rekombinanten LbpB) und des Stamms H44/76 (dessen LbpB nur 78,5% Sequenzidentitätmit dem von BNCV hat) induzierte (13B und C). Die unter Verwendung eines Immunisierungsplans, der nur rekombinantes LbpB einschließt, gewonnenen Seren ergab ähnliche Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Eine Immunisierung gegen gesamte Zellen mit dem Stamm BNCV führt ganz klar zu höheren Anti-Gesamtzell-ELISA für sowohl BNCV-Zellen als auch H44/76 Zellen (13B bzw. C).
Zusätzlich induziert die Immunisierung mit rekombinatem LbpB von N. meningitidis-Stamm BNCV Antikörper, die an ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht in Gesamtzellproben von Moraxella catarrhalis binden, welche auf einem Immunblot laufen gelassen wurden, welcher im wesentlichen wie in Beispiel 9 beschrieben, durchgeführt wurde (Daten nicht gezeigt).
Tabelle 8 und 14 zeigen, daß die hergestellten Antikörper in dem Serum nach Immunisierung mit rekombinantem LbpB (vom Stamm BNCV) bakterizid gegen den heterologen Stamm (H44/76) sind, wobei das LbpB nur 78,5% Sequenzidentität mit dem von BNCV hat. Dies war ebenfalls der Fall bei Seren, die nach dem Immunsisierungsplan gewonnen wurden, welcher nur rekombinantes LbpB vorsieht (Daten nichtgezeigt). Dies trifft ebenfalls zu, wenn H44/76 unter Bedingungen, die Eisen enthalten (14A) und bei Eisendepletion (14) gezüchtet worden ist. Dies scheint eine größere Wirkung unter Bedingungen der Eisen-Depletierung zu sein, als erwartet werden konnte, wenn LbpB in größeren Mengen exprimiert wird, wenn das Bakterium unter diesen Bedingungen vorliegt.
LbpB ist daher ein immunschützendes Antigen und außerdem gibt es Beweise einer Kreuzimmunprotektion gegen heterologe Stämme von N. meningitidis. Tabelle 1. Bakterienstämme und verwendete Plasmide

a Serogruppe, Serotyp und Subtyp sind erwähnt, nt: nicht typisierbar

a Sero- und Subtypen des Stamms, mit dem der Patient infiziert war, sind angegeben, wenn sie bekannt sind. NT: nicht typisierbar
b ++ zeigt eine starke Reaktion an, + eine schwache Reaktion und – keine Reaktion mit der nativen oder denaturierten Form des Proteins.
c SKB: SmithKline Beecham Biologicals, RIVM: National Institue of Public Health and the Environment.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Impfstoff umfassend eine wirksame Menge an nicht-lipidiertem Lactoferrin-bindendem Protein B (LbpB)-Polypeptid von Neisseria meningitidis oder ein Fusionsprotein davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.
Impfstoff nach Anspruch 1, umfassend eine wirksame Menge eines rekombinanten LbpB-Polypeptids von Neisseria meningitidis, umfassend eine zusätzliche Aminosäuresequenz, die die Reinigung des Polypeptids erleichtert.
Impfstoff gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend eine wirksame Menge an LbpB-Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die über ihre Gesamtlänge mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NR: 2 SEQ, ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 ist, oder ein Fusionsprotein davon.
Impfstoff gemäß Anspruch 1 oder 2 umfassend eine wirksame Menge an LbpB-Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die über ihre Gesamtlänge mindestens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 ist, oder ein Fusionsprodukt davon.
Impfstoff gemäß Anspruch 1 oder 2 umfassend eine wirksame Menge an LbpB-Polypeptid aus Neisseria meningitidis, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10, von der Aminosäureposition 19 bis zum C-Terminus des Polypeptids, oder ein Fusionsprodukt davon umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 5, wobei das LbpB-Polypeptid die Aminosäuresequenz in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 hat, oder ein Fusionsprodukt davon.
Impfstoff gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei diese Zusammensetzung mindestens ein anderes N. meningitidis-Antigen umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs umfassend die Schritte des Herstellens von rekombinantem nicht-lipidiertem LbpB durch Kultivieren einer Wirtszelle umfassend ein rekombinantes Expressionssystem umfassend eine Nukleotidsequenz, kodierend ein Polypeptid, das über die Gesamtlänge mindestens 70% identisch mit dem in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 ist oder ein Fusionsprotein davon, wobei dieses Expressionssystem in der Lage ist, ein rekombinantes LbpB-Polypeptid in einer kompatiblen Wirtszelle herzustellen; und Gewinnen des Polypeptids aus der Kultur und Formulieren mit einem geeigneten Träger.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das LbpB-Polypeptid, das aus der Kultur gewonnen wurde, Teil eines äußeren Membranvesikels ist.
Nicht-lipidiertes LbpB-Polypeptid von Neisseria meningitidis, umfassend eine Aminosäuresequenz, die über ihre Gesamtlänge mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 ist, oder ein Fusionsprotein davon, zur Verwendung in einer Therapie, wobei das Polypeptid in einer wirksamen Menge verabreicht wird.
Verwendung einer wirksamen Menge an nicht-lipidiertem LbpB-Polypeptid aus Neisseria meningitidis umfassend eine Aminosäuresequenz, die über ihre Gesamtlänge mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 ist oder ein Fusionsprotein davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung von Neisseria-Erkrankungen bei einem Menschen.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Polypeptid oder Protein oral, subcutan, rektal, intratracheal, intramuskulär oder intranasal zu verabreichen ist.