DE69835206T2

DE69835206T2 - Neuartiger Bacillus-Stamm für die Bekämpfung von Planzenkrankheiten und des Maiswurzelbohrers

Info

Publication number: DE69835206T2
Application number: DE69835206T
Authority: DE
Inventors: Darlene Sherry Davis HEINS; Carol Denise Davis MANKER; Rito Desmond Woodland JIMENEZ; Jay Randy Davis McCOY; Ensio Jimmy Davis ORJALA; Pamela G. Marrone
Original assignee: AgraQuest Inc
Current assignee: AgraQuest Inc
Priority date: 1997-05-09
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2018-05-09
Also published as: JP2001507237A; CN1255143A; PT981540E; IL132533A; CA2289916C; BR9809282A; CA2289916A1; KR100616372B1; NO995462L; BG103855A; EP0981540B1; NZ500506A; JP3471815B2; PL198772B1; MX9910078A; MX244069B; PL336716A1; IL173027A0; DK0981540T3; AU7476798A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung fällt in den Bereich der Biopestizide. Diese Erfindung stützt sich insbesondere auf die Beobachtung, dass ein neuartiger Stamm von Bacillus subtilis, AQ713, eine Reihe von pilz- und bakterieninduzierten Pflanzenkrankheiten hemmen kann und gleichzeitig gegen den Maiswurzelbohrer aktiv ist. Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf antimykotische, antibakterielle und insektizide Zusammensetzungen, die diesen neuartigen Bacillus-Stamm beinhalten, sowie die Antibiotika und Metabolite, die dieser Stamm entweder allein oder in Kombination mit anderen chemischen oder biologischen Pestiziden.
Hintergrund der Erfindung
Seit mehreren Jahren ist bekannt, dass verschiedene Mikroorganismen biologische Aktivität aufweisen und somit geeignet sind, im Pflanzenschutz eingesetzt zu werden. Im Bereich der Bestimmung und Entwicklung biologischer Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung verschiedenartiger Pflanzenkrankheiten, die sowohl in der Landwirtschaft als auch im Gartenbau von Bedeutung sind, sind in letzter Zeit große Fortschritte gemacht worden. Dennoch sind die meisten der verwendeten Pestizide immer noch synthetische Verbindungen. Viele dieser chemischen Fungizide werden von der EPA als kanzerogen eingestuft und sind toxisch für die Umwelt und andere Nicht-Zielarten. Darüberhinaus besteht die Möglichkeit, dass Pathogene Resistenz gegenüber chemischen Pestiziden entwickeln (siehe auch Schwinn et al., S. 244, ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY: PHYTOPHTHORA INFESTANS, THE CAUSE OF LATE BLIGHT OF POTATO (Academic Press, San Diego 1991).
Jedes Jahr werden 250–300 Millionen US-Dollar zur Bekämpfung des Maiswurzelbohrers mit chemischen Pflanzenschutzmitteln ausgegeben. Viele dieser chemischen Pestizide sind für Mensch, Tier- und Pflanzenwelt und andere Nicht-Zielarten toxisch. Manche von ihnen wurden sogar im Grundwasser nachgewiesen. Die Kosten der Entwicklung neuer chemischer Insektizide belaufen sich auf 100 Millionen US-Dollar.
Biologische Schädlingsbekämpfung bietet eine attraktive Alternative gegenüber synthetischen chemischen Fungiziden. Biopestizide (lebende Organismen und die von ihnen auf natürlichem Wege gebildeten Verbindungen) können sowohl sicherer, als auch in größerem Maße biologisch abbaubar sein. Sie sind außerdem billiger zu entwickeln.
Screening-Tests haben ergeben, dass bestimmte Stämme gewisser Bacillus-Arten (B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis) pilzhemmende Aktivität aufweisen. (Siehe auch Stabb et al. (1990) Applied Environ. Microbiol. 60: 4404-4412). Es wurde nachgewiesen, dass diese Stämme Zwittermicin-A und/oder Kanosamin bilden (Milner et al. (1996) Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3066), zwei antibiotisch wirkende Mittel, die gegen die bodenbürtigen Erreger der Keimlingskrankheiten (Umfall- und Auflaufkrankheiten) Phytophthora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum oder Sclerotinia minor wirksam sind (siehe auch Stabb et al. siehe oben). Zwittermicin-A ist ein wasserlösliches, säurestabiles lineares Aminopolyolmolekül (siehe He et al. (1994) Tetra. Lett. 35 (16) 2499-2502).
Das US Patent 5.049.379 von Handelsman et al. Beschreibt, wie Zwittermicin-A Keimlingskrankheiten in Alfalfa und der Sojabohne bekämpft. Wenn Samen mit B. cereus ATCC 53422 überzogen wurde, war die pathogene Aktivität des die Wurzelfäule erregenden Pilzes gehemmt. Ähnliche Anwendungen von auf Sporen basierenden Formulierungen bestimmter B. cereus-Stämme an Sojabohnensamen oder am die Sojabohnensaat umgebenden Boden zeigten einen verbesserten Ertrag an Sojabohnen in den Versuchsparzellen. (Siehe Osburne et al. (1995) Am. Phytopathol. Soc. 79(6): 551-556). In dem Fachgebiet sind mehrere verschiedene Verfahren der Anwendung von Biopestiziden bekannt, zum Beispiel in Form benetzbarer Pulver, fließfähiger Trockenprodukte, Mikroeinkapselungen der wirksamen Agenzien sowie Flüssig- oder Trockenrezepturen der antibiotischen Anteile geeigneter Bakterienkulturen (siehe US-Patent Nr. 5.061.495 von Rossall oder US-Patent Nr. 5.049.379 von Handelsman).
Smith et al. (1993) Plant Disease 77(2) 139-142 berichten, dass die Aktivität des bodenbürtigen Pilzes Pythium aphanidermatum, des Erregers der Stängelgrundfäule der Gurke, durch den Zwittermicin produzierenden Stamm von B. cereus UW85 unterdrückt werden kann. Leifert et al. (1995) berichten in J. Appl. Bacteriol. 78: 97-108 von der Produktion der Anti-Botrytis- und Anti-Alternaria-Antibiotika durch die beiden Bacillus-Stämme B. subtilis CL27 und B. pumilis CL45. Sowohl die Gesamtbrühe als auch die zellfreien Filtrate wiesen in in vitro-Tests Aktivität gegenüber Botrytis und Alternaria auf und in in vivo-Tests an kleinen Pflanzen von Astilbe Aktivität gegen Botrytis. Im US Patent 5.597.565 offenbaren Leifert et al. (1997), dass B. subtilis, B. pumilis und B. polymyza in besonderem Maße wirksam in der Hemmung von Pilzkrankheiten sind, die nach der Ernte auftreten. Sie beschreiben ferner, dass Antibiotika in zellfreien Kulturfiltraten aufgetreten sind, sowie deren Aktivität bei verschiedenen pH-Werten; diese Verbindungen werden dabei allerding nicht identifiziert.
Das US-Patent Nr. 5.344.647 von Rossall (1994) offenbart Bacillus subtilis-Stämme mit einer breitgefächerten antimykotischen Aktivität. Sholberg et al. (1995) Can. J. Microbiol. 41: 247-252, Swineburne et al. (1975) Trans. Brit. Mycol. Soc. 65: 211-217, Singh und Deverall (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83: 487-490, und Ferreira et al. (1991) Phytopathology 81: 283-287. Baker et al. (1983) Phytopathology 73: 1148-1152 offenbaren die Verwendung von Bacillus-Arten und Bacillus subtilis als biologische Schädlingsbekämpfungsagenzien von von Pilzen hervorgerufenen Pflanzenkrankheiten. Baker et al. (1983) Phytopathology 73: 1148-1152 berichten daneben auch von einem antimykotisch wirkenden Bacillus subtilis, das gegen Pflanzenschädlinge verwendet wird. Pusey et al. (1988) Plant. Dis. 72: 622-626, Pusey und Robins (US Patent Nr. 5.047.239) sowie McKeen et al. (1986) Phytopathology 76: 136-139 offenbaren die Bekämpfung der Fruchtfäule nach der Aberntung durch B. subtilis. McKeen et al., siehe oben, haben nachgewiesen, dass Antibiotika, die den ein geringes Molekulargewicht aufweisenden zyklischen Polypeptiden der Iturin-Klasse ähnlich sind, zu dieser antimykotischen Aktivität von B. subtilis beitragen.
Liu et al. (1995) US Patent Nr. 5.403.583 offenbaren ein Bacillus megaterium, ATCC 55000, sowie ein Verfahren, mit dem der die Krankheit auslösende Pilz Rhizoctonia solani bekämpft werden kann. Islam und Nandi (1985) Journal of Plant Disease and Protection 92(3): 241-246 offenbaren ein Bacillus megaterium, das antagonistisch zu Drechslera oryzae wirkt, dem Erreger der Blattfleckenkrankheit des Reises. Dieselben Autoren, Islam und Nandi (1985) Journal of Plant Disease and Protection 92(3): 233-240 berichten außerdem vom Antagonismus von B. megaterium gegenüber Drechslera oryzae, Alternaria alternata und Fusarium roseum in in vitro-Versuchen. Sie diskutieren drei Komponenten im Kulturfiltrat. Das Antibiotikum mit der höchsten Aktiviät hatte hervorragende Löslichkeit sowohl in Wasser als auch in Methanol mit einem UV-Peak bei 255 nm und einer Schulter bei 260 nm. Es erwies sich als polyoxinähnliches Lipopeptid. Cook ((1987) Proceedings Beltwide Cotton Production – Mechanization Research Conference, Cotton Council, Memphis, S. 43- 45) berichtet von der Verwendung einer Bakteriensuspension von Bacillus megaterium zur Reduktion der Anzahl an Baumwollpflanzen, die durch den Erreger der Baumwollwurzelfäule, Phymatotrichum omnivorum, abgetötet werden.
Im CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vols. I-XIV, (CRC Press, Inc. Boca Raton, FL 1980-87) stellte Berdy die Produktion von Antibiotika durch B. megaterium fest und berichtete von der Produktion von Peptid-Antibiotika, wie Ansamitocin-PDMO, Bacimethrin, Megacin, Pentapeptiden und Homopeptiden, die auf niedere Säugetiere toxisch wirken.
Bacilli sind dafür bekannt, antimykotische und antibakterielle sekundäre Metabolite zu bilden (Korzybski et al. (1978)). Wissenschaftler an den Universitäten University of Wisconsin und Cornell haben eine neuartige antimykotisch wirkende Verbindung entdeckt, das Zwittermicin A, das von Bacillus-Arten gebildet wird (He et al. (1994) Tetra. Lett. 35(16): 2499-2502). Ein zweiter, vom selben Bakterien-Stamm gebildeter, antimykotisch wirkender Metabolit wurde vor kurzem als der bereits bekannte Aminozucker Kanosamin identifiziert (Milner et al. (1996) Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3065).
Eine weitere Gruppe von in früheren Publikationen beschriebenen Bacillus-Metaboliten sind die zyklischen Lipopeptide der Iturin-Klasse, von denen einige hochwirksame antimykotische Agenzien darstellen. Diese Agenzien bestehen aus einem zyklischen Oktapeptid mit sieben α-Aminosäuren und einer β-Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette. Unter den Iturinen gibt es mehrere Gruppen, die sich im Hinblick auf Anordung und Inhalt ihrer Aminosäuresequenzen voneinander unterscheiden. Diese sind in Tabelle 1 (siehe unten) dargestellt. Allgemein kann man feststellen, dass dabei eine Abfolge einander verwandter Moleküle gebildet wird, die sich in Länge und Verzweigung des aliphatischen Aminosäurerests voneinander unterscheiden. Im Test mit Saccharomyces cerevesiae wurde Mycosubtilin als der wirksamste Bestandteil erkannt (LC50 = 10 μg/mL), gefolgt von Iturin-A und Bacillomycin L (beide LC50 = 30 μg/mL) (Beeson et al. (1979) J. Antibiotics 32(8): 828-833). Es wurde beschrieben, dass die Wirkungsweise dieser zyklischen Lipopeptide auf eine Wechselwirkung mit den Pilzmembranen zurückzuführen ist, wobei Transmembran Kanäle gebildet werden, die die Freisetzung lebenswichtiger Ionen erlauben (Latoud et al. (1986) Biochem. Biophys. Acta 856: 526-535). Iturin-C ist gegenüber Pilzen wie Penicillium chrysogenum nicht aktiv (Peypoux et al. (1978) Tetrahedron 34: 1147-1152).
Tabelle 1 Strukturen der Antibiotika der Iturin-Familie
Eine Forschergruppe am USDA hat die Beziehung zwischen Aufbau und Aktivität von Iturinen untersucht, indem sie eine Reihe analoger Moleküle synthetisch herstellten, die sich in der Läge ihrer Aminsäureseitenketten von einander unterschieden. Wie die Wissenschafter berichteten, nimmt die Aktivität der Iturine mit zunehmender Länge der Fettsäureseitenketten und der terminalen Verzweigung in der Reihenfolge iso>normal>anteiso zu (Bland et al. (1995) Proc. Plant Growth Regulation Soc. Am. 22nd: 105-107). Sie stellen außerdem fest, dass die "Mengen des auf natürlichem Wege gewonnenen Iturins zur kommerziellen Ausbeutung unzureichend sind" und beziehen sich dabei auf ihre Arbeit mit einer Reihe Iturin produzierender Bacillus-Stämme.
Eine weitere Gruppe zyklischer Lipopeptide, die von B. cereus isoliert wurden, sind die Plipastatine. Diese Verbindungen bilden eine Gruppe von acylierten Decapeptiden, deren Struktur in 1 gezeigt ist (Nishikiori et al. (1986) J. Antibiotics 39(6): 755-761. Diese Verbindungen wurden ursprünglich als Inhibitoren der Phospholipase A₂ aus der Bauchspeicheldrüse von Schweinen isoliert (Umezawa et al. (1986) J. Antibiotics 39(6): 737-744); später fand man jedoch heraus, dass sie auf pflanzenpathogene Pilze wie Botrytis, Pyricularia und Alternaria eine hemmende Wirkung haben (Yamada et al. (1990) Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1): 95-96). Yamada berichtete außerdem einen synergistischen Effekt zwischen Iturin A und den Plipastatinen beobachtet zu haben, die beide von demselben B. subtilis-Stamm gebildet werden.
Es sind Untersuchungen ausgeführt worden, die die Verbesserung der Fermentation von Iturinen sowohl in der Flüssig- (Phae und Shoda (1991) J. Ferment. Bioeng. 71: 118-121); Ohno et al. (1992) J. Ferment. Bioeng. 71: 463-465) als auch der Festbettfermentation (Ohno et al. (1992) Biotech. Lett. 14(9): 817-822; Ohno et al. (1995) J. Ferment. Bioeng. 5: 517-519) zum Thema hatten. Ein Zusammenwirken der nahe verwandten Surfactine, die ihrerseits inaktiv sind, mit den von demselben B. subtilis-Stamm produzierten Iturinen wird berichtet ((Hiraoka et al. (1992) J. Gen. Appl. Microbiol. 38: 635-640). Die Nucleotid-Sequenz für das Gen, das die Biosynthese von Iturin A und Surfactin mitreguliert, ist veröffentlicht worden (Huang et al. (1993) J. Ferment. Bioeng. 76(6): 445-450). Feldarbeit an Iturin-bildenden Bakterien-Stämmen hat sich bisher auf die Behandlung des Bodens zur Bekämpfung von Rhizoctonia konzentriert (Asaka und Shoda (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 4081-4085), über die Anwendung von Iturinen auf Blättern im Feldversuch wird nicht berichtet.
Eine weitere von B. subtilis gebildete zyklische Lipopeptidverbindung ist das Surfactin, das eine außergewöhnlich hohe Oberflächenaktivität aufweist (Kaninuma et al. (1969) Agric. Biol. Chem. 33: 973-976). Surfactin enthält eine C₁₄- oder C₁₅-β-Hydroxyfettsäure, die über einen Laktonring mit einem Heptapeptidrest mit einer LLDLLDL-Sequenz verbunden ist (Arima et al. (1968) Biochem. Biophys. Res. Commun. 31: 488-494). Sandrin et al. ((1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 370-375) entdeckten B. subtilis-Stämme, die sowohl Surfactin als auch Iturin A bilden, sowie die Bacillomycine F und Mycosubtilin.
Der von den Erfindern entdeckte neuartige Mikroorganismus AQ713, der früher für einen Bacillus megaterium-Stamm gehalten wurde, nun aber als Bacillus subtilis-Stamm identifiziert werden konnte, bildet A-Iturine, Plipastatine und Surfactine. Von einer Lipopeptidbildung in dieser Kombination durch einen Mikroorganismus ist bisher noch nicht berichtet worden. Darüberhinaus haben die Autoren erkannt, dass AQ713 auch eine neu beschriebene Gruppe von Verbindungen bildet, die hier als "Agrastatine" bezeichnet werden. Die Kombination aller drei oben erwähnten Verbindungen zusammen mit dem neuartigen Agrastatin ist ebenfalls neu.
Ein allgemein verwendetes Biopestizid ist das gram-positive Bakterium Bacillus thuringiensis. Von den als Pestizide wirkenden B. thuringiensis-Stämmen ist bekannt, dass sie während der Sporulation Kristallproteine bilden, die auf bestimmte Ordnungen und Arten von Insekten und Nematoden gezielt toxisch wirken (siehe auch US-Patente Nr. 4.999.192 und 5.208.017). Proteinartige Endotoxine wie sie von B. thuringiensis gebildet werden wirken auch als Insektizide gegen den Maiswurzelbohrer und andere Käfer (z.B. US Patent Nr. 5.187.091; Johnson, T.J. et al. (1993), J. Economic Entomology 86: 330-333). Es wurde gezeigt, dass die Endotoxine von B. thuringiensis sowohl in Form gereinigter Kristalle, gewaschener Zellpellets als auch als exprimierte Proteine wirksam sind. Warren et al. (WO 96/10083) offenbaren Proteine, die von Bacillus cereus und B. thuringiensis während ihrer vegetativen Phase gebildet werden, aber keine Endotoxine sind. Diese vegetativen Proteine Vip1 und Vip2 weisen eine hohe Aktivität gegenüber dem (nördlichen und westlichen) Maiswurzelbohrer auf (Estruch et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 137-141 und Mullins et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol 63 (im Druck).
Einer der thermostabilen Metabolite von B. thuringiensis, das sogenannte Beta-Exotoxin, weist ebenfalls schädlingsvernichtende Eigenschaften auf. Burgjeron und Biach ((1979), Entomophaga 11: 279-284 berichten von einem Beta-Exotoxin, das gegen den Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) wirksam ist. Darüberhinaus weisen die bereits bekannten Beta-Exotoxine von B. thuringiensis auch unspezifische schädlingsbekämpfende Aktivität auf und töten nicht nur Nematoden ab, sondern auch Fliegen, die Mottenart Pseudaletia unipuncta (army worm), Milben und Maiswurzelbohrer. Sigma-Exotoxin hat eine dem Beta-Exotoxin ähnliche Struktur und wirkt gegen den Kartoffelkäfer (Argauer et at. (1991) J. Entomol. Sci. 26: 206-213). Alpha-Exotoxin wirkt toxisch auf die Larven der Stubenfliege (Musca domestica) (Cluthy (1980) FEMS Microbiol. Lett. 8: 1-7). Gamma-Exotoxine sind verschiedene proteolytische Enzyme, Chitinasen und Proteasen. Die toxische Wirkung der Gamma-Exotoxine kommt nur in Kombination mit Beta-Exotoxin oder Delta-Exotoxin zum Ausdruck. Forsberg et al. (1976) "Bacillus thuringiensis: Its effects in Environmental Quality", National Research Council of Canada. Stonard et al. ((1994) ACS Symposium Series 551: 25) beschreiben einen wasserlöslichen sekundären Metaboliten mit Aktivität gegenüber dem Maiswurzelbohrer im Überstand eines B. cereus-Stammes.
In der Literatur sind keine Bacillus-Stämme aufgeführt mit sowohl antimykotischer als auch Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer. Es gibt keine bisher bekannten von Bacillus subtilis gebildeten Metabolite, die ein Molekulargewicht von unter 10.000 aufweisen und in einem unpolaren Lösungsmittel extrahierbar sind.
Offenbarung der Erfindung
Ein neuartiger Antibiotika- und Metabolit-produzierender Stamm von Bacillus subtilis – früher unter dem Namen Bacillus megaterium bekannt – wird bereitgestellt. Er weist breitgefächerte antimykotische und antibakterielle Aktivität auf und ist auch gegen den Maiswurzelbohrer aktiv. Es wird auch ein neuer Metabolit dieses neuartigen B. subtilis-Stammes beschrieben, der Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer aufweist. Ebenso wird ein Verfahren bereitgestellt zur Behandlung oder zum Schutz von Pflanzen vor Pilz- und bakteriellen Infektionen; es beinhaltet die Anwendung einer wirksamen Menge des Antibiotika-produzierenden Bacillus subtilis. Das Antibiotika-produzierende Bacillus subtilis kann entweder als Suspension in einer Gesamtkulturbrühe bereitgestellt werden oder als Antibiotika-enthaltender Überstand, der aus der Gesamtkulturbrühe des Antibiotika-produzierenden Bacillus-Stammes gewonnen wurde. Zusätzlich wird ein Verfahren bereitgestellt zur Behandlung oder zum Schutz von Pflanzenwurzeln vor einem Befall mit dem Maiswurzelbohrer, umfassend: die Ausbringung einer wirksamen Menge des neuartigen Metabolit-bildenden Bacillus subtilis. Der neue Metabolit-bildende Bacillus subtilis kam als eine Suspension in einer Gesamtkulturbrühe oder als Metabolit-enthaltender Überstand bereitgestellt werden.
Zusätzlich werden neuartige Verbindungen, die Agrastatine, die von diesem neuartigen Stamm AQ713 gebildet werden, sowie eine neuartige Kombination von Verbindungen, umfassend Iturin A, ein Plipastatin, ein Surfactin und ein Agrastatin bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Struktur der Plipastatin-Antibiotika
2 zeigt das HPLC-Chromatogramm der AQ713-Metabolite
Methoden der Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt den neuartigen Stamm AQ713 von Bacillus subtilis bereit, früher als Bacillus megaterium bekannt, oder eine seiner Mutanten mit einer breitgefächerten antimykotischen und antibakteriellen Aktivität, sowie die neue Kombination von antimykotischer Aktivität und Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer. Der neuartige Stamm wird AQ713 benannt und wurde am NRRL am 07. März 1997 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren unter der Zugangsnummer B21661 hinterlegt. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Verhinderung und Behandlung von Pilz- und bakteriellen Pflanzenkrankheiten, wobei diese Bakterienstämme angewendet werden, bzw. Antibiotika enthaltende Überstände derselben oder die reinen Antibiotika, die aus diesen Bakterienstämmen gewonnen wurden. Die hierin erwähnten Antibiotika sind dabei in Zusammensetzungen wie in den Ansprüchen formuliert enthalten. Die Erfindung beinhaltet daneben Behandlungsmethoden für Pflanzenwurzeln oder Boden, mit denen die Larven des Maiswurzelbohrers mittels einer bakteriellen Suspension von AQ713 oder des Metabolit-haltigen Überstandes einer AQ713 Kultur bekämpft werden können. Des weiteren beinhaltet die Erfindung neue Verbindungen, die Agrastatine, die von diesem neuartigen Mikroorganismus gebildet werden. Ebenso beinhaltet diese Erfindung eine neuartige Kombination, umfassend ein Iturin des A-Typs, ein Plipastatin, ein Surfactin und ein Agrastatin.
Definitionen
Wie hier verwendet, ist der Begriff "biologische Schädlingsbekämpfung" definiert als die Bekämpfung von Krankheitserregern (Pathogenen) oder Insekten unter Zuhilfenahme eines zweiten Organismus. Ein bekannter Mechanismus der biologischen Schädlingsbekämpfung ist z.B. die Anwendung von Darmbakterien, die Wurzelfäule bekämpfen, indem sie mit den Pilzen um einen Platz an der Wurzeloberfläche konkurrieren und jene dabei verdrängen. Bakterielle Toxine, wie z.B. Antibiotika, werden zur Schädlingsbekämpfung angewandt. Dabei können diese Toxine entweder isoliert und direkt auf die Pflanzen ausgebracht werden oder es können die Bakterienarten ausgebracht werden, so dass sie das Toxin in situ produzieren.
Der Begriff "Pilz(e)" beinhaltet eine Vielzahl zellkernhaltiger sporenbildender Organismen, die kein Chlorophyll enthalten. Beispiele von Pilzen sind Hefen, Schimmelpilze, Mehltau, Rostpilze und Ständerpilze.
Der Begriff "Bakterien" beinhaltet jeglichen prokaryontischen Organismus, der keinen echten Zellkern besitzt.
"Fungizid" beschreibt die Fähigkeit einer Substanz, die Sterblichkeitsrate eines Pilzes zu erhöhen oder sein Wachstum zu hemmen.
"Antibiotisch" und "Antibiotikum" beschreiben jegliche Substanzen, die fähig sind, Mikroorganismen zu hemmen oder abzutöten. Antibiotika können dabei von einem Mikroorganismus oder auf synthetische oder semi-synthetische Weise gebildet werden. Der Begriff schließt somit auch Substanzen ein, die Pilze hemmen oder abtöten, wie beispielsweise Zwittermicin A oder Kanosamin.
"Antimykotisch" wird jegliche Substanz genannt, die fähig ist, das Wachstum von Pilzen zu hemmen oder sie abzutöten.
Die Begriffe "züchten" und "kultivieren" beziehen sich auf die Vermehrung von Organismen in Kulturmedien verschiedener Art. "Gesamtkulturbrühe" bezeichnet eine Flüssigkultur, die sowohl Zellen als auch Kulturmedium enthält. "Überstand" bezeichnet die Flüssigkeit, die übrig bleibt, nachdem die in der Brühe gewachsenen Zellen durch Zentrifugieren, Filtration, Sedimentation oder auf andere einschlägig bekannte Weise entfernt worden sind.
Eine "wirksame Menge" ist die Menge, die ausreicht, um eine nutzbringende oder die gewünschten Wirkung zu erzielen. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehreren Verabreichungen verabreicht werden. In Bezug auf Behandlung und Schutz der Pflanzen bedeutet eine "wirksame Menge" diejenige Menge, die ausreicht, den von Pilzen oder Bakterien hervorgerufenen Krankheitszustandes zu verbessern oder zu stabilisieren bzw. sein Fortschreiten rückgängig zu machen, zu verlangsamen oder zu verzögern.
Der Begriff "Insekten" wie er hier verwendet wird schließt alle Organismen der Klasse "Insecta" ein. Insekten im "Vor-Imago-Stadium" bezieht sich auf jegliche Form eines Organismus, die dem Erwachsenenstadium vorangeht, also z.B. Eier, Larven und Nymphen. "Insektizid" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Substanz, die Sterblichkeitsrate von Insekten zu erhöhen oder ihr Wachstum zu hemmen. "Nematizid" bezeichnet die Fähigkeit einer Substanz, die Sterblichkeitsrate von Nematoden zu erhöhen oder ihr Wachstum zu hemmen. "Pestizid" bezeichnet die Fähigkeit einer Substanz, die Sterblichkeitsrate von Insekten, Nematoden und Milben zu erhöhen oder ihr Wachstum zu hemmen.
Eine "positive Kontrollprobe" ist eine Verbindung, von der die pestizide Aktivität bekannt ist. "Positive Kontrollproben" umfassen, sind aber nicht beschränkt auf im Handel erhältliche chemische Pestizide. "Negative Kontrollprobe" bedeutet, dass von einer Verbindung keine pestizide Aktivität bekannt ist. Beispiele negativer Kontrollproben sind Wasser oder Essigsäureethylester.
Der Begriff "Lösungsmittel" beinhaltet jegliche Flüssigkeit, in der eine andere Substanz gelöst werden kann. "Lösungsmittelextrahierbar" bezieht sich auf jegliche Substanz, die sich in einem Lösungsmittel lösen lässt und die dann aus diesem Lösungsmittel isoliert werden kann. Beispiele von Lösungsmitteln umfassen, sind aber nicht beschränkt auf organische Lösungsmittel wie Essigsäureethylester.
Der Begriff "Metabolit" bezieht sich auf alle Verbindungen, Substanzen oder Nebenprodukte, die bei der Fermentation von Mikroorganismen gebildet werden und welche pestizide Aktivität haben. Ein Antibiotikum im oben definierten Sinne ist ein Metabolit, der gezielt gegen einen Mikroorganismus wirkt.
Der Begriff "Agrastatin" bezieht sich auf eine Gruppe neuartiger Verbindungen mit folgender Struktur:
wobei R₁ eine verzweigte oder gerade aliphatische Seitenkette ist, mit C8-C20; X entweder Ala oder Val ist; R₂ ein Acetat oder ein Esterderivat ist; und Glx Gln oder Glu ist. Diese Verbindungen haben antibakterielle und antimykotische Aktivität wie auch Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer.
Wir beschreiben hier einen neuartigen Metabolit- und Antibiotika-produzierenden Stamm von Bacillus subtilis, zuvor als Bacillus megaterium identifiziert, welcher breitgefächerte antimykotische und antibakterielle Aktivität aufweist und gleichzeitig die Larven des Maiswurzelbohrers abtötet oder verkümmern lässt. Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Schutz oder zur Behandlung von Pflanzen vor Pilz- oder bakteriellen Infektionen. Diese umfasst den Einsatz einer wirksame Menge des aus der Gesamtkulturbrühe des Bacillus subtilis-Stammes AQ713 gewonnenen Überstandes. Der Überstand kann durch dem Fachmann bekannte Methoden, wie Zentrifugieren, Filtration, Sedimentation und dergleichen gewonnen werden.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Schutz oder zur Behandlung von Pflanzen vor Pilz- oder bakteriellen Infektionen. Diese umfasst den Einsatz einer wirksamen Menge der Gesamtkulturbrühe des neuartigen Stammes von Bacillus subtilis.
Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Schutz oder zur Behandlung von Pflanzenwurzeln gegen einen Befall durch den Maiswurzelbohrer. Dieses umfasst den Einsatz einer wirksame Menge des aus der Gesamtkulturbrühe des Bacillus subtilis-Stammes AQ713 gewonnenen Überstandes. Der Überstand kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden, wie Zentrifugieren, Filtration, Sedimentation und dergleichen gewonnen werden.
Außerdem umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Schutz oder zur Behandlung von Pflanzen vor einem Befall mit dem Maiswurzelbohrer. Dieses umfasst den Einsatz einer wirksame Menge der Gesamtkulturbrühe des neuartigen Stammes von Bacillus subtilis.
Um eine gute Verteilung und Adhäsion der Zusammensetzungen dieser Erfindung zu gewährleisten könnte es vorteilhaft sein, Gesamtkulturbrühe, Überstand und/oder Metabolit bzw. Antibiotikum unter Verwendung von Komponenten herzustellen, die eine gute Verteilung und Adhäsion begünstigen. Entsprechend geeignete Rezepturen sind den Fachleuten bekannt.
Die von der vorliegenden Erfindung umfassten Zusammensetzungen können in Form benetzbarer Pulver, Granula und dergleichen hergestellt werden oder können in einem geeigneten Medium eingekapselt werden. Weitere Beispiele von Formulierungen beinhalten – sind jedoch nicht auf diese beschränkt – Pulver, benetzbare Granula, trockene fließfähige Produkte, wässrige fließfähige Produkte, benetzbare dispersible Granula, emulgierbare Konzentrate sowie wässrige Suspensionen. Andere geeignete Rezepturen sind den Fachleuten bekannt.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine neuartige Gruppe von Verbindungen, die als "Agrastatine" benannt werden. Diese Verbindungen weisen antibakterielle und antimykotische Aktivität auf, zusätzlich zur Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer.
Des weiteren wird in der vorliegenen Erfindung eine neuartige Zusammensetzung bereitgestellt, die Typ-A Iturin, ein Plipastatin, ein Surfactin und ein Agrastatin umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Behandlung oder zum Schutz von Pflanzen vor Pilz- und bakteriellen Krankheiten umfassend den Einsatz einer wirksame Menge einer neuartigen Zusammensetzung von Verbindungen, die Typ-A Iturin, ein Plipastatin, ein Surfactin und ein Agrastatin enthalten.
Diese Erfindung soll in den folgenden Beispielen illustriert werden. Diese Beispiele dürfen dabei nicht als einschränkend ausgelegt werden.
Beispiele
Beispiel 1
Charakterisierung des Stammes AQ713
Das Isolat wurde unter Zuhilfenahme der Biolog-Mikrotiterplatten (Biolog, Inc. hayward, CA) identifiziert, wie in Bochner (1989) Nature 339: 157-158 beschrieben. Die Biolog-Mikrotiterplatte besteht aus 96 Vertiefungen ('panel wells'), die im trockenen Zustand mit 95 verschiedenen Kohlentstoffsubstraten befüllt wurden, die für gram-positive und für gram-negative Bakterien erhältlich sind. Das Isolat wurde im Flüssigmedium bei 28° C 24 h lang gezüchtet. Danach wurde jede Plattenvertiefung einer GP-Mikrotiterplatte (Biolog, Inc.) mit einer in 0,85% Kochsalzlösung gewaschenen Zellsuspension inokuliert. Nach 24 h bei 28°C wurde die Kohlenstoffverwertung ausgewertet. Die Substratverwertungsprofile wurden sodann mit der Biolog-Datenbank für gram-positive Bakterien (Version 3.50) verglichen und auf die am nächsten verwandte Art hin isoliert. Die Biolog-Untersuchung ergab einen Ähnlichkeitsindex mit Bacillus megaterium von 0,883. Eine umfangreichere Charkterisierung von AQ713 wurde von der American Type Culture Collection, Rockville, Md. durchgeführt.

Isolat vorgelegt als: Unbekannt; Stamm AQ713
Isolat identifiziert als: Unter Verwendung der erhältlichen physiologischen und biochemischen Daten entspricht dieser Stamm am ehesten Bacillus subtilis
Zellmorphologie: Die freibeweglichen Zellen treten einzeln auf, mit einer Endospore in der Zellmitte oder am subterminalen Ende. Die Zellen lassen sich einheitlich grampositiv färben.
Morphologie der Zellkolonien: Die Kolonien sind opak und unregelmässig, convex erhaben mit einer rauhen, matten Oberfläche und eingekerbtem Rand.

Anmerkung: Unter Verwendung der vorhandenen physiologischen und biochemischen Daten gleicht dieser Stamm am ehesten Bacillus subtilis.

Hauptergebnisse der Charakterisierung
Quelle:

Gordon, R.E, W.C. Haynes und C.H.N. Pang. 1973. The Genus Bacillus. Handbook No. 427. U.S. Department of Agriculture, Washington, D.C.

Beispiel 2
Aktivität von AQ713 gegen den Maiswurzelbohrer
Bacillus-Proben wurden in einem Bacillus-Kulturmedium gezüchtet. Das Kulturmedium 2 enthielt 5% Pepton, 5% Dextrose, 3% Hefeextrakt, 3% Malzextrakt, 1,5% Proflo-Baumwollsamenextrakt (59% Eiweiß, 4,26% Fett, 6,73% Asche, 3,19% Faseranteil und Spuren von Gossypol; der Rest wird von Wasser ausgemacht), 10% Sojamehl und 0,5% MgSO₄ × 7H₂O. Medium 3 enthielt die gleichen Komponenten, außer dass es 20% Pepton und 3,4% KH₂PO₄ und 4,3% K₂HPO₄ enthielt. Mit Schikanen versehene 250ml Schüttelkolben wurden mit ausgestrichenen, einen Tag alten Kulturen inokuliert. Die Kolben wurden bei 200 Upm und 29°C 5 Tage lang geschüttelt. Um die insektizide Aktivität zu prüfen, wurden 35 ml Kulturbrühe bei 5.200 Upm 20 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand in den unten beschriebenen Microassays verwendet.
Die Assays wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Vertiefung enthielt ein Festagarsubstrat, einen Testorganismus und entweder eine positive Kontrollprobe, eine negative Kontrollprobe oder den Überstand des unter Beispiel 1 gewonnenen neuartigen Bacillus-Stammes.
Um die insektizide Aktivität zu prüfen, wurde für die Vertiefungen der Mikrotiterplatten ein Agarsubstrat nach Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293 hergestellt. Um die Aktivität gegen Nematoden zu prüfen, wurde stattdessen normaler Agar (1,5%) in den Vertiefungen verwendet.
Als positive Kontrollprobe wurde eine 1 ppm-Lösung von Avid^® (Avermectin) verwendet. Als negative Kontrollprobe wurde entionisiertes Wasser verwendet. Für jeden Assay wurden 2 Durchläufe von Test- bzw. Kontrollprobe gefahren. In jede Vertiefung wurden 40μl des Probenüberstandes oder der in Medium 1, 2 oder 3 kultivierten Gesamtkulturbrühe pipettiert. Die Platten wurden daraufhin unter dem Abzug 2–3 Stunden stehen gelassen, bis die Agarlösung getrocknet war.
Testorganismen waren entweder Vor-Imago-Stadien des Maiswurzelbohrers (Diabrotica undecimpunctata), Vor-Imago-Stadien der Deutschen Schabe (Blatella germanica), Vor-Imago-Stadien der Rübenmotte (Spodoptera exigua), Vor-Imago-Stadien der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) oder der N2-Stamm des Nematods Caenorhabditis elegans. Die Testorganismen wurden in 0,1% Agar so verdünnt, dass eine Konzentration von etwa 5 Organismen pro 25μl Agar in jeder Vertiefung erreicht wurde. Die Mikrotiterplatten wurden mit einer Substanz wie Mylar^® luftdicht abgeschlossen und jede Vertiefung mit einer 'Pinpress' belüftet. Die Platten wurden bei 27°C bis zu 7 Tagen inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen ausgewertet, indem die Neugeborenensterblichkeitsrate bzw. der Entwicklungszustand der Larven gemessen wurde. Vertiefungen, deren Proben aus gänzlich abgestorbenen oder verkümmerten Larven bestand, wurde der Wert 1 gegeben, Vertiefungen, die einige tote und stark verkümmerte Larven enthielten, wurde der Wert 2 zugeteilt, lebende aber verkümmerte Larven wurden mit dem Wert 3 belegt und Vertiefungen, deren Proben keinerlei tote Larven enthielt, erhielten den Wert 4. Für jedes Beispiel wurde aus allen Wiederholungen ein Durchschnittswert der Punktezahl ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 zusammenfassend dargestellt. Tabelle 2: Wertebilanz von AQ713 gegen Schadinsekten-Gesamtbrühe

NT = nicht getestet

Tabelle 3: Wertebilanz von AQ713 gegen Schadinsekten-Überstand
Diese Tests belegen, dass AQ713 in beiden Medien in der Gesamtkultur aktiv war, wobei die höchste Aktivität im Medium 2 erzielt wurde. Der Überstand war nur dann aktiv, wenn AQ713 in Medium 2 gewachsen war.
Beispiel 3
Chemische Eigenschaften der gegen den Maiswurzelbohrer aktiven AQ713-Metabolite
50 ml von AQ713 wurde in Medium 2 gezogen. Jeder Kultur wurde 50 ml Essigsäureethylester zugegeben und die Mischung 2 Minuten lang im Scheidetrichter geschüttelt. Die wässrige Schicht wurde sodann entfernt und die organische Schicht in einer Magnesiumsulfat enthaltenden Flasche aufgenommen.
Das organische Filtrat wurde in einen Rundkolben gefiltert und das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer entfernt.
Für den Bioassay wurde der getrocknete organische Extrakt in 2,5 ml Aceton gelöst. Ein 40 ml-Aliquot wurde entnommen und mit einem 70% Aceton/Wasser-Gemisch auf 800 μl verdünnt. Dies ist eine 10-fache Konzentration des organischen Extrakts. Eine Verdünnungsreihe wurde hergestellt, um Proben von frischgeschlüpften Maiswurzelbohrern mit prozentualer Sterblichkeitsrate der frischgeschlüpften Larven nach 7 Tagen zu erhalten (1 pro Vertiefung in den Mikrotiterplatten, die wie oben beschrieben präpariert wurden). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4: Aktivität der Essigsäureethylester-Extrakte von AQ713 gegen den Maiswurzelbohrer
Die Ergebnisse zeigen, dass AQ713 einen mittels Lösungsmittel extrahierbaren Metaboliten bildet, der den Maiswurzelbohrer abtötet.
Um das Molekulargewicht des aktiven Metaboliten festzustellen, wurde eine 50 ml-Kultur von AQ713 in Medium 2 gezogen. 1 ml davon wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei 12.000 Upm 15 Minuten lang zentifugiert. Der Überstand wurde entfernt. 500 μl des Überstands wurden auf einen 10.000 Dalton Molekulargewicht-Centricon-Filter aufgetragen. Dieser wurden nach Herstellerangaben zentrifugiert (12.000 Upm für 35 Minuten). Das Filtrat wurde aufgenommen und der Rückstand durch Zentrifugieren und Waschen des Filters gewonnen. Proben des Überstandes, des Filtrats und des Rückstandes wurden gegen frisch geschlüpfte Maiswurzelbohrerlarven getestet (96 Vertiefung-Mikrotiterplatte mit Insektenfutter, nach Marrone et al. siehe oben;. 40 μl-Probe pro Vertiefung und 8 Vertiefungen für jede Probe, 1 Larve pro Vertiefung). Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Molekulargewicht-Grenze von AQ713
Die Ergebnisse zeigen, dass Überstand und Filtrat aktiv waren, das Molekulargewicht des Metaboliten ist somit geringer als 10.000 Dalton.
Beispiel 4
Chemische Eigenschaften des gegen Pflanzenpathogene aktiven AQ713-Metaboliten
50 ml von AQ713 wurden in Medium 2 gezogen. Jeder Kultur wurden 50 ml Essigsäureethylester zugegeben und die Mischung 2 Minuten lang im Scheidetrichter geschüttelt. Die wässrige Schicht wurde sodann entfernt und die organische Schicht in einer Magnesiumsulfat enthaltenden Flasche aufgenommen. Das organische Filtrat wurde in einen Rundkolben gefiltert und das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer abgedampft.
Für den Bioassay wurde der getrocknete organische Extrakt in 2,5 ml Aceton gelöst. Ein 40 μl-Aliquot wurde entnommen und mit einem 70% Aceton/Wasser-Gemisch auf 800 μl verdünnt. Dies ist eine 10-fache Konzentration des organischen Extrakts. Auf einer 96 Vertiefung-Mikrotiterplatte (Beschreibung unten) wurde ein Pflanzenpathogen-Assay mit Pythidium ultimum und Botrytis cinerea durchgeführt, um die Aktivität des organischen Extrakts zu ermitteln. Die Gesamtbrühe ergab einen 100%-igen Bekämpfungserfolg (Wert 1), der 10-fach konzentrierte organische Extrakt jedoch zeigte keinen Bekämpfungserfolg gegenüber den beiden Pflanzenpathogenen (Wert 4). Dies deutet darauf hin, dass die aktiven Antibiotika ungleich der von AQ713 gebildeten Metabolite, die gegen den Maiswurzelbohrer aktiv sind, nicht in einem organischen Lösungsmittel wie Essigsäureethylester extrahierbar sind.
In weiteren Versuchen wurde eine neuartige Verbindung, das Agrastatin A, isoliert. Aus der Fermentationsbrühe wurde ein Butanolextrakt gewonnen, indem die Brühe zuerst zweimal mit dem gleichen Volumen Essigsäureethylester extrahiert wurde und die Schichten aufgetrennt wurden. Sodann wurde die wässrige Fraktion zweimal mit dem gleichen Volumen Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte wurden zusammengegeben und das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer abgedampft. Durch Gefriertrocknung des erhaltenen Extraktes wurde ein Pulver gewonnen.
Das Pulver wurde in einem 80% Acetonitril/Wasser-Gemisch gelöst und mit Ultraschall behandelt. Die Lösung wurde auf eine C-18 Festphasen-Extraktionskartusche (SPE) aufgetragen, die mit Methanol aktiviert und mit 80% Acetonitril/Wasser-Gemisch equilibriert worden war. Die SPE-Kartusche wurde mit einem 80% ACN/Wasser-Gemisch eluiert, das Eluens aufgenommen und das Lösungsmittel entfernt. Das Eluens wurde durch HPLC weiter gereinigt. Dabei wurde eine C-18 HPLC-Säule (1 cm × 25 cm) mit UV-Nachweis bei 220 nm und folgendem Lösungsmittelgradienten (Acetonitril + 0,05% TFA/Wasser + 0,05% TFA) verwendet: 0–20 Minuten mit 33%ACN; 20–30 Minuten mit 40% ACN; 30–45 Minuten mit 45–55% ACN; 45–63 Minuten mit 55%ACN.
Das HPLC-Chromatogramm von AQ713 zeigt das Vorhandensein von Iturinen, iturinähnlichen Verbindungen (Plipastatine und Agrastatine) und Surfactinen an (siehe 1). Die Iturine A2, A3, A4, A7 und A6 wurden durch eine Kombination von NMR-Daten und LC-Massenspektrometrie-Daten und Vergleichswerten aus der Literatur identifiziert. Die Surfactine wurden durch Vergleich mit im Handel erworbenen Surfactinstandards mittels HPLC und LC-Massenspektrometrie identifiziert.
Durch eine Kombination aus Aminosäureanalyse und LC-Massenspektrometrie wurde festgestellt, dass es sich bei den iturinähnlichen Verbindungen um eine Mischung aus Plipastatinen und den neuartigen Agrastatinen handelt. Umfangreiche NMR-Spektroskopie-Daten wurden auch für eine der neuartigen Verbindungen, die Agrastatin A genannt wurde, gesammelt (HPLC-Peak 20). Wie festgestellt wurde, enthält Agrastatin A die folgenden Aminosäuren: Thr; 3 Glu; Pro; Ala; Val; 2 Tyr und Orn. Dieser Aufbau unterscheidet sich von dem des Plipastatin A durch das Vorhandensein von Val und die Abwesenheit von Ile. Das Molekulargewicht von Agrastatin A wurde als 1448 bestimmt und stimmt mit folgender Struktur überein:
Die gerade Kettennatur des Fettsäureanteils wurde durch ¹H-NMR-Spektrometrie bestätigt. Die Position der Aminosäuren innerhalb des zyklischen Peptids wurde mittels detailierter Analyse der TOCSY- und ROESY-Datensätze bestimmt.
Massenspektrometrie und Aminosäureanalyse von Agrastatin B (HPLC-Peak 26) deuten darauf hin, dass seine Struktur der von Piplastatin B2 ähnlich ist, wobei der Ile-Rest durch Val ersetzt wird. Die Struktur ist unten dargestellt:
Beispiel 5
Aktivität von AQ713 gegen Pflanzenschädlinge in in vitro-Kultur (96 Vertiefung-Mikrotiterplatte)
Um festzustellen, ob AQ713 gegen die Pilze Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani und Alternaria solani wirksam ist, wurden folgende Versuche durchgeführt. 96 Vertiefung-Mikrotiterplatten (flacher Boden, 400 Microliter pro Vertiefung, Marke Nunc) wurden mit einem Agarmedium gefüllt (Kartoffeldextroseagar) (PDA, Difco). Phytophthora infestans-Kulturen wurden 3 Tage lang in flüssigem YPG-1-Medium (0,4 g Hefe, 0,1 % KH₂PO, 0,5% MgSO₄ × 7H₂O, 1,5% Glucose) kultiviert. Bei den anderen Pilzen wurden Sporen von der Oberfäche der Petrischalen abgekratzt und 0,1–0,2 ml-Aliquots aus entionisiertem Wasser und Sporensuspension der Pathogene (Konzentration ca. 2 × 10⁶ Sporen/ml) auf den Agar aufgetragen.
AQ713 wurde 72 Stunden lang in Medium 2 oder 3 gezüchtet, wie in Beispiel 2 beschrieben. Um Überstände zu erhalten, wurde die Gesamtkulturbrühe bei 5.200 Upm 20 Minuten lang zentrifugiert. Die für die Pflanzen schädlichen Pilze wurden auf 96 Vertiefung-Mikrotiterplatten pipettiert (8 Vertiefungen pro Pathogen). Das Vorhandensein oder Fehlen von Pilzwachstum wurde für jede der 8 Vertiefungen protokolliert. Jeder Vertiefung wurden etwa 40 μl AQ713-Überstand bzw. 20 μl Gesamtbrühe zugegeben. Ein Wert von 1 bedeutet vollständige Hemmung des Pilzwachstums. Ein Wert von 4 bedeutet keine Hemmung des Pilzwachstums. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Tabelle 6: in vitro-Hemmung von Pilzwachstum (96 Vertiefung-Mikrotiterplatte)

NT = Nicht getestet

Die Ergebnisse zeigen, dass AQ713 in vitro ein breitgefächertes antimykotisches Spektrum aufweist, und dass sowohl die Gesamtbrühe als auch der Überstand in hohem Maße aktiv sind. Der Überstand war gegen Rhizoctonia solani in Medium 3 aktiv, nicht jedoch in Medium 2.
Beispiel 6
Aktivität von AQ713 gegen Pflanzenschädlinge in in vitro-Kultur (Zonenassay)
Um die Aktivität von AQ713 in einem Agarplatten-Diffusions(zonen)assay zu bestimmen, wurden die Sporen der Pflanzenschädlinge auf den Oberflächen von mit Kartoffeldextroseagar gefüllten Petrischalen (10 cm Ø) verteilt. Aus dem Agar wurden 7,0 mm-Vertiefungen ausgestochen und mit 100 μl Überstand des in Medium 2 gezüchteten AQ713 gefüllt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren bei 4.200 Upm für 40 Minuten gewonnen. Der Überstand wurde daraufhin weitere 40 Minuten bei 4.200 Upm zentrifugiert. Das Ergebnis bestand typischerweise aus einer Zone mit entweder keinerlei und/oder vermindertem Wachstum des Pflanzenschädlings um die Vertiefung herum. Die Größe der Zone in Millimeter wurde gemessen und festgehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7: In vitro-Hemmung von pflanzenpathogenem Pilzwachstum (Zonentest)
Beispiel 7
Aktivität von AQ713 gegen bakteriell Pflanzenschädlinge
Ein Standard-Agar-Diffusionsassay wie unter Beispiel 6 beschrieben wurde aufgebaut. Ein Rasen jedes bakteriellen Schädlings wurde über die Oberfläche einer Petrischale verteilt. Eine 100 μl-Probe der in Medium 2 gezüchteten AQ713-Gesamtbrühe wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Größe der Zonen wurde in Millimetern gemessen.
Tabelle 8: In vitro-Hemmung von bakteriellen Pflanzenschädlingen (Zonentest)
AQ713 war gegen alle bakteriellen Pflanzenschädlinge, die in vitro getestet wurden, aktiv.
Beispiel 8
Aktivität von AQ713 gegen Pflanzenschädlinge in Pflanzentests
Die Aktivität von AQ713 gegen den Grauschimmel Botrytis cinerea wurde auf Bohnen und Geraniumblättern getestet, gegen Alternaria solani an Tomatenkeimlingen und gegen den Falschen Mehltau Bremia lactucae an Salatpflanzen.
Beim A. solani-Versuch wurden Tomatenkeimlinge im 2–3-Blatt-Stadium, die in 6er-Anzuchtschalen kultiviert worden waren, mit AQ713-Gesamtbrühe (Medium 2) bis zum Ablaufen besprüht. Nach dem Besprühen wurden die Keimlinge trocknen gelassen (etwa 1,5 Stunden). Die Keimlinge wurden sodann mit 5,0 × 10⁴ Sporen/ml besprüht. Die Keimlinge wurden mit einer Plastikglocke zugedeckt und bei 28° C im Percival-Inkubator gehalten. Wasser ohne AQ713, mit und ohne Sporen des Pflanzenschädlings wurde als negative bzw. positive Kontrollproben verwendet. Nach vier Tagen wurde der Versuch ausgewertet. Auf den nur mit Wasser und A. solani-Sporen behandelten Pflanzen waren gleichförmige krankhafte Veränderungen (Läsionen) auf allen Blättern zu beobachten, die Kotyledonen waren abgelöst und stark befallen (Wert 5 = Totalbefall, keine Bekämpfung). Mit AQ713 behandelte Tomatenkeimlinge wiesen einige leichte über die Blätter verteilte Läsionen auf. Die Kotyledonen hafteten noch an den Keimlingen, wiesen jedoch einige wenige kleine Läsionen auf (Wert 1). Die negative Kontrollprobe war nicht infiziert.
In einem zweiten Versuch wurden abgetrennte Tomatenkeimlinge verwendet (Stängel in Bodennähe abgebrochen), die in mit Wasser gefüllte Tongefässe gestellt, mit Plastikglocken zugedeckt und wie oben aufbewahrt wurden. Die Pflanzen wurden wie oben besprüht und das Schadensbild von A. solani nach vier Tagen aufgezeichnet. In der negativen Kontrollprobe waren keine Symptome zu verzeichnen. Die positive Kontrollprobe wies gleichförmige Läsionen über die Keimlinge verteilt auf. Die mit AQ713 behandelte Probe wurde mit 1 bewertet (wenig oder keine Läsionen). Zwei Tage später waren die Pflanzen der positiven Kontrollprobe zerstört, doch die mit AQ713 behandelten Keimlinge waren nahezu frei von Läsionen und sahen genauso aus wie die der negativen Kontrollprobe (mit Wasser besprühte Pflanzen).
Für den Versuch an Botrytis cinerea wurden die ersten echten Blätter einer Bohnenpflanze verletzt, indem die Öffnung eines 13 × 100-Kulturröhrchens auf jedes Blatt gedrückt wurde. Jedes Blatt erhielt zwei Wunden/Blatt. Die Blätter wurden entweder mit AQ713-Gesamtbrühe (Medium 2) besprüht, oder nur mit Wasser oder nur mit dem Pflanzenpathogen. Nachdem sie getrocknet waren, wurden sie mit B. cinerea-Sporen (0,8 × 106 Sporen/ml) besprüht. Die Blätter wurden in flache Schalen gegeben, mit Plastikglocken bedeckt und bei 18–20° C im Percival-Inkubator aufbewahrt. Fünf Tage später wies die positive Kontrollprobe eine 25 mm im Durchmesser messende Fäulnisstelle auf. Die negative Kontrollprobe (nur Wasser) wies keine Fäulnis auf. AQ713 zeigte an 7 der 8 Kreise, wo die Blatter beschädigt worden waren, keinen Befall. Der einzige Kreis, der befallen war, zeigte an zwei Stellen in der Umgebung des Kreises einen leichten Befall.
Für den Bremia-Versuch wurden Salatsamen in einer Schicht sterilisierter Aussaaterde, die aus einer Mischung aus Torf, Perlit und Vermikulit (Blähglimmer) bestand, in kleinen, durchsichtigen, ca. 8 cm hohen und breiten Plastikpflanzgefässen ausgesät. Nachdem die Salatpflänzchen gekeimt waren (eine Woche), wurden die Salatpflänzchen mit der AQ713-Brühe bzw. der Überstandsprobe besprüht. Die Pflanzen wurden trocknen gelassen. Daraufhin wurden sie mit einer aus befallenen Salatkeimlingen gewonnenen Falscher Mehltau-Sporensuspension besprüht. Die Pflanzen wurden mit den Plastikglocken zugedeckt und bei 18–20° C in einem Percival-Inkubator inkubiert. Eine Woche später wurde der Versuch ausgewertet. AQ713 hatte einen Befall der Salatpflanzen mit Falschem Mehltau von Bremia nicht verhindert.
Beispiel 9
Wirksamkeit von AQ713 gegen Pflanzenkrankheiten (Gewächshausversuch) Falscher Mehltau des Weines

AQ713 wurde in einem 400 Liter fassenden Fermenter über 48 Stunden in einem auf Soja basierenden Medium gezüchtet. Weinreben (Traubensorte Chardonnay) wurden mittels Handsprüher bis zum Ablaufen mit Gesamtbrühe aus dem 400 Liter-Fermentationsbehälter besprüht, die mit keimfreiem Wasser auf eine 0,5-fache bzw. 0,25-fache Konzentration verdünnt worden war. Nachdem die Pflanzen getrocknet waren, wurden sie ein zweites Mal besprüht. Nach dem Trocknen wurden die Pflanzen mit dem Erreger des Falschen Mehltau des Weines, Plasmopara viticola, inokuliert. Bei jeder Anwendung wurden drei Pflanzen behandelt. Jede Pflanze wurde ausgewertet, indem die Schädlingsbekämpfung in Prozent nach einer Skala von 0–100% Bekämpfung bestimmt wurde. 100% Bekämpfung zeigt eine Pflanze mit keinerlei sichtbaren Läsionen. Ein chemisches Fungizid, Metalaxyl, wurde als Vergleichsprobe verwendet. Die Ergebnisse waren wie folgt:

AQ713 0,5-fache Gesamtbrühe	97,7% Bekämpfung
AQ713 0,25-fache Gesamtbrühe	100% Bekämpfung
Metalaxyl 30 ppm	100% Bekämpfung
Metalaxyl 10 ppm	98,3% Bekämpfung
Metalaxyl 1 ppm	80% Bekämpfung

Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass AQ713 eine ebenso wirksame Bekämpfung des Falschen Mehltaus des Weines herbeiführt wie das chemische Fungizid.
Beispiel 10
Wirksamkeit von AQ713 gegen den Echten Mehltau des Kürbis
AQ713 wurde in einem 400 Liter fassenden Fermenter über 48 Stunden in einem auf Soja basierenden Medium gezüchtet. Kürbispflanzen (Sorten: Crookneck und Acorn Squash) wurden mittels Handsprüher bis zum Blattablauf mit Gesamtbrühe aus dem 400 Liter-Fermentationsbehälter besprüht, die mit keimfreiem Wasser auf eine 0,5-fache Konzentration verdünnt worden war. Nach dem Trocknen wurden die Pflanzen mit dem Erreger des Echten Mehltaus des Kürbis, Sphaerotheca fuliginea, inokuliert. Bei jeder Anwendung wurden zwei Pflanzen behandelt. Sprühgetrocknetes Pulver der Gesamtbrühe wurde ebenfalls getestet. Die 400 I-Gärbrühe wurde sprühgetrocknet, um alles Wasser zu entfernen. Die Pflanzen wurden mit 10% und 2,5% sprühgetrockneten Pulverlösungen bis zum Ablaufen wie oben beschrieben besprüht. Das Auftreten eines Befalls mit dem Echten Mehltau wurde mit Werten von 0–5 gemessen. Ein Wert von 5 bedeutet 100% Befall, während ein Wert von 0 keinen Befall darstellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
Gesamtbrühe von AQ713 sowie sprühgetrocknetes Pulver sorgen für eine nahezu vollständige Bekämpfung des Echten Mehltaus des Kürbis.
Beispiel 11
Wirksamkeit von AQ713 gegen Kraut- und Braunfäule, Grauschimmel, Echten Mehltau der Weinrebe, Echten Mehltau des Weizen, Wurzeltöterkrankheit und Blattbrand beim Reis im Gewächshausversuch
AQ713 wurde in einem 250 ml-Schüttelkolben über 72 Stunden in einem auf Soja basierenden Medium gezüchtet. Pflanzenkrankheit, Krankheitserreger und Wirtspflanze sind in Tabelle 11 unten aufgelistet.
Jede Brühe wurde bis zum Ablaufen in 1-facher Konzentration mit einem Handsprüher auf die Testpflanzen gesprüht, trocknen gelassen und daraufhin ein zweites Mal gesprüht. Für jede Krankheit und Behandlungsmethode wurden drei Pflanzen verwendet. Nach dem Trocknen wurden die Pflanzen mit den Krankheitserregern inokuliert. Jede Pflanze wurde ausgewertet, indem die Schädlingsbekämpfung in Prozent nach einer Skala von 0–100% Bekämpfung bestimmt wurde. 100% Bekämpfung bezieht sich auf eine Pflanze mit keinerlei sichtbaren Läsionen. Chemische Fungizide wurden als Vergleichsprobe verwendet. Befallsindex ist die Schwere der Krankheit in den unbehandelten Kontrollpflanzen.
Tabelle 11
AQ713 wies an allen getesteten Krankheitserregern eine Aktivität auf, die der der chemischen Fungizide gleich kam.
Beispiel 12
Wirksamkeit von AQ713 gegen den Falschen Mehltau des Kohls
Der Bacillus-Stamm AQ713 wurde in einem 10 Liter Fermenter über 48 Stunden in einem auf Soja basierenden Medium gezüchtet. Drei Wochen alte Blumenkohl- und Rosenkohlpflänzchen im vollen Keimblattstadium wurde mit der unverdünnten Gesamtkulturbrühe mit einem Airbrush mittels Druckluft besprüht. Drei Versuchsreihen mit je 15–25 Keimlingen pro Topf wurden bei jeder Anwendung besprüht. Quadris^TM, ein Fungizid auf Azoxystrobinbasis von Zeneca, wurde ebenfalls auf die Pflanzen gesprüht (drei pro Behandlung) in Konzentrationen von 250 ppm und 125 ppm. Nachdem der AQ713- bzw. Quadrisnebel getrocknet war, wurden die Brassica-Pflanzen mit einer Sporensuspension des Falschen Mehltaus, Peronospora parasitica, mit 1–5 × 10⁴ Sporen/ml besprüht. Die Pflanzen wurden bei 15–17°C über 24 Stunden zur Infizierung aufbewahrt, dann wurden die Keimlinge bei 20–24°C sechs Tage lang inkubiert. Um die Sporulierung des Krankheitserregers zu ermöglichen wurde die Töpfe über Nacht bei 15–17°C gehalten, bis die Versuchauswertung erfolgte. Jede Pflanze wurde ausgewertet, indem die Schädlingsbekämpfung in Prozent auf einer Skala von 0–100% Bekämpfungserfolg bestimmt wurde. 100% Bekämpfung ist eine Pflanze mit keinerlei Sporulationsläsionen. Die Durchschnittswerte der Ergebnisse aller drei Versuchsreihen sind unten in Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12

NT = nicht getestet

AQ713 hat über drei Wochen hinweg den Falschen Mehltau wirksam bekämpft.
Beispiel 13
Zusammenwirken (Synergismus) von AQ713 und einem im Handel erhältlichen Fungizid
AQ713 wurde in einem 10 Liter-Fermenter über 72 Stunden in einem auf Soja basierenden Medium gezüchtet. Die Bakterienkultur wurde mit entkeimtem Wasser auf eine 0,5- bzw. 0,25-fache Konzentration verdünnt. Drei Wochen alte Paprikapflanzen wurden mit unverdünnter Kultur, 0,5-facher sowie 0,25-facher Konzentration der Kultur mit einem Airbrush mittels Pressluft besprüht. Pro Anwendung wurden drei Pflanzen besprüht. Quadris^TM, ein Fungizid auf Azoxystrobinbasis von Zeneca, wurde ebenfalls auf die Pflanzen gesprüht (drei pro Behandlung) in Konzentrationen von 500 ppm, 250 ppm und 125 ppm. Zusätzlich wurde eine Kombination von Quadris plus der Gesamtkulturbrühe von AQ713 in einem Verhältnis von 1:1 auf die Paprikapflanzen (drei pro Anwendung) gesprüht. Die Anwendungen mit und ohne Quadris sind unten in Tabelle 13 zusammengefasst. Nachdem der AQ713- und Quadrisnebel getrocknet war wurden die Paprikapflanzen mit einer Sporensuspension von Botrytis cinerea, dem Grauschimmel, in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Sporen/ml besprüht. Die Pflanzen wurden drei Tage lang bei 20–22°C gehalten, bis der Versuch ausgewertet wurde. Das Auftreten von Grauschimmel wurde auf einer Skala von 0–5 bewertet. Ein Wert von 5 bedeutet einen Krankheitsbefall von 100%, während ein Wert von 0 keinen Krankheitsbefall bedeutet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 13 dargestellt.
Tabelle 13
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass eine Kombination von Quadris und AQ713 Grauschimmel wesentlich besser bekämpft als sowohl Quadris wie auch AQ713 allein.

Claims

Bacillus subtilis-Stamm AQ713, welcher unter der Zugangsnummer B-21661 am NRRL hinterlegt wurde, oder eine Mutante dieses Stammes, wobei die Mutante antimykotische und antibakterielle Aktivität sowie Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer aufweist.
Stamm nach Anspruch 1, welcher der Bacillus subtilis-Stamm AQ713 ist, hinterlegt unter der Zugangsnummer B-21661 am NRRL.
Gesamtkulturbrühe des Stammes nach Anspruch 1 oder 2.
Überstand, gewonnen aus der Kultur des Stammes nach Anspruch 1 oder 2, welcher antimykotische oder antibakterielle Aktivität sowie Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer aufweist.
Zusammensetzung, umfassend entweder (i) den Stamm nach Anspruch 1 oder 2; (ii) die Gesamtkulturbrühe nach Anspruch 3; oder (iii) den Überstand nach Anspruch 4; und ein chemisches Fungizid oder ein biologisches oder chemisches Pestizid.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, zusätzlich umfassend ein chemisches Fungizid.
Verfahren zum Schutz oder zur Behandlung von Pflanzen und Früchten vor bzw. von Pilz- oder bakteriellen Infektionen oder Maiswurzelbohrerbefall, umfassend den Einsatz einer wirksamen Menge des Stammes nach Anspruch 1 oder 2, der Gesamtkulturbrühe nach Anspruch 3, des Überstandes nach Anspruch 4 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Infektionen durch mindestens einen Mikroorganismus verursacht werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phytophtora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Alternaria brassiciola, Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola, Venturia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator und Peronospora parasitica.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Stamm in Form benetzbarer Pulver, Granula, fließfähiger Produkte oder Mikroeinkapselungen eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei der Stamm nach Anspruch 1 oder 2, die Gesamtkulturbrühe nach Anspruch 3, der Überstand nach Anspruch 4 oder die Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6 auf die Wurzeln der Pflanzen oder den die Wurzeln umgebenden Boden aufgebracht wird.
Zusammensetzung, umfassend ein Iturin A, ein Plipastatin, ein Surfactin und ein Agrastatin, wobei die Verbindungen aus dem Stamm nach Anspruch 1 oder 2 erhältlich sind.
Verfahren zum Schutz oder zur Behandlung von Pflanzen oder Früchten vor Pilz- oder bakteriellen Infektionen, umfassend den Einsatz einer wirksamen Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder einer Zusammensetzung umfassend eine Verbindung mit der Formel
oder eine Verbindung mit der Formel
wobei R₁ eine verzweigte oder unverzweigte aliphatische C8-C20-Seitenkette, X Val oder Ala, R₂ ein Acetat oder Esterderivat und Glx Gln oder Glu ist.