CN103805533A

CN103805533A - 一种蜡状芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN103805533A
Application number: CN201310595681.6A
Authority: CN
Inventors: 孙庆元; 张雪崧
Original assignee: DOUSHIDAI (DALIAN) AGRICULTURE SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: DOUSHIDAI (DALIAN) AGRICULTURE SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2014-05-21

Abstract

本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌及其应用，属于促生菌生物技术领域。所述蜡状芽孢杆菌的分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QD5，保藏编号为：CGMCC No.8316。所述QD5菌株在豆芽生产中可促进豆芽的生长，并同时具有抑制豆芽腐烂菌的繁殖的作用，尤其适用于绿豆芽。通过将所述QD5菌株接种于豆芽的发芽液和生长喷洒液中，在实际应用中具有良好的促生效果，具有良好的经济和社会效益，符合有机农业的要求。

Description

一种蜡状芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌及其应用，具体地说，涉及一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QD5，所述蜡状芽孢杆菌QD5可促进豆芽生长，属于促生菌生物技术领域。

背景技术

细菌不但可以与植物在体内共生，也可以在体外共生。体内共生关系最常见的例子就是豆科植物与固氮菌形成的根瘤。体外共生关系主要是指植物根际菌，是植物根系与土壤之间的界面中的细菌和真菌。根际细菌对调节植物根系从土壤中吸收养分和通过分泌植物生长调节素调节植物的生长起着至关重要的作用。国内外报道较多的是假单胞杆菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、布克霍尔德氏菌(Burkholderia)在植物根际具有抗病促生作用，所述菌类对作物生长促进或抑制取决于作物本身的性质以及细菌的种类和数量。

豆芽是市民菜篮子中一个很重要的品种，由于其发育过程主要靠种子自身贮藏的营养物质，不需要补充吸收矿物质营养和进行光合作用，是一种简便的无土栽培形式，可就地取材，不受时间、地点的限制，一年四季均可栽培，时间短、周转快，维生素丰富，对调节蔬菜淡季供应起着重要作用。为了提高豆芽的生产量，缩短生产周期，同时抑制在生产过程中豆芽腐烂病菌的生长繁殖，在不施用任何农药、化肥、添加剂的条件下，施用促生菌是有效的技术手段之一。在国内外从植物根际分离筛选很多微生物并作为菌肥已经广泛应用于农业生产，但是，利用促生菌促进豆芽生长还未见报道。

在我国，食品安全已成为千家万户关注的问题。食品安全不仅直接关系人民群众的身体健康和生命安全，而且还影响经济和社会的稳定，随着社会的发展，食品本身也蕴含了人类的进步和文明。豆芽是人们最为喜欢的蔬菜品种之一。利用促生菌生产豆芽不仅可向市场提供无毒有机的豆芽，而且促生菌可提高豆芽的产量、缩短生产周期，提高生产效率，具有良好的经济和社会效益。

发明内容

针对现有技术中尚无一种蜡状芽孢杆菌作为促进豆芽生长的促生菌的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种蜡状芽孢杆菌QD5，本发明的目的之二在于提供一种蜡状芽孢杆菌QD5作为豆芽促生菌的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QD5(以下简称QD5菌株)，所述QD5菌株是通过对大豆、绿豆、花生和苜蓿的幼苗根际土壤样品进行筛选、驯化选育获得的；所述QD5菌株于2013年10月10日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)，保藏编号为CGMCC No.8316。

QD5菌株具有下述特征与性质：

(1)形态特征及生理生化性质

在LB琼脂平板培养基上，37℃，培养24h，形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样色)，直径5mm～7mm。在显微镜下，呈杆状，芽孢圆形，中端或次端生，包囊无明显膨大。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×3.0～5.0μm。革兰氏阳性，无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。

(2)分子生物学鉴定

利用16S rDNA的通用引物Seq forward(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)、Seq reverse(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和Seq internal(5′-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3′)，以QD5菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，得到PCR产物，回收，测序，得到QD5菌株的16S rDNA基因全序列，见序列表SEQ ID No.1；所述序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST检索程序系统进行序列同源性分析，发现与芽胞杆菌属(Bacillus)的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)的ITS(internal transcribed spacers)序列99％同源，如表1所示，与已知蜡状芽胞杆菌至少存在1％的非同源性差异，说明所述QD5菌株为新菌株。

表1 QD5菌株与已知菌株的ITS序列的最大同源性

参照《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey′s manual of systematic bacteriology)(第二版)和《常见细菌系统鉴定手册》(著译者：东秀珠，蔡妙英等编著2001)，根据本发明所述QD5菌株的形态特征、生理生化性质和分子生物学鉴定特征，鉴定QD5菌株属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，并定名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QD5。

一种本发明所述QD5菌株的应用，所述应用为将QD5菌株作为豆芽促生剂；具体地说，所述QD5菌株在豆芽生产中促进豆芽的生长，并同时抑制豆芽腐烂菌的繁殖，尤其适用于绿豆芽。

本发明进一步提供了菌株的保存条件。采用灭菌的脱脂牛乳洗脱试管斜面上的菌落，制成浓厚菌悬液。然后用无菌移液枪滴入小试管底部。每管一滴，然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记后，将小试管装在15×150mm的试管中，在大试管底部放入1.5cm高的P₂O₅或KOH，管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧，然后蜡封。将大试管与真空泵连通，抽真空至0.1mm～0.2mm汞柱时，将玻璃管熔封，放置室温暗处或冰箱-20℃保存。

有益效果

本发明提供了一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QD5，所述QD5菌株可促进豆芽生长并抑制抑制瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)；通过将筛选出的菌株接种于豆芽的发芽液和生长喷洒液中，在实际应用中具有良好的促生效果，具有良好的经济和社会效益，符合有机农业的要求。

附图说明

图1为QD5菌株在LB培养基上的菌落形态照片。

图2为QD5菌株的16s rDNA片段的PCR扩增结果图。

图3为QD5菌株的系统发育树。

图4为光学荧光显微镜油镜下革兰氏染色QD5菌株的菌体形态照片。

图5为QD5菌株在培养过程中生长的变化。

图6为QD5菌株培养时间与芽孢形成的关系。

图7为培养液pH值与QD5菌株生长量之间的关系。

图8为温度对QD5菌株菌体生长量的影响。

图9为QD5菌株的促进豆芽生长和抑制腐烂菌的效果对比图片。

保藏生物材料的说明

本发明的QD5菌株，已于2013年10月10日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所；所述QD5菌株的分类命名为蜡状芽孢杆菌，Bacillus cereus，保藏编号为CGMCC No.8316。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步地阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

以下实施例中涉及的主要原辅材料、试剂和仪器设备如下：150A生化培养箱、SHA-C水浴恒温振荡器、7GL-16A高速离心机、LD4-2离心机、752紫外可见分光光度计、JY99-2D超声波细胞粉碎机、MLS-3020高压蒸汽灭菌锅、EppendorfPCR，Bio-Rad Model200/2.0电泳仪，其他实验用试剂均为分析纯。

根际细菌的采集：选取大连市庄河大棚和农田中生长茁壮的大豆、绿豆、花生、苜蓿带根幼苗，自然抖落去土后，装入自封袋中，立即带回实验室，放置在4℃冰箱中保存备用。在无菌室内，取幼苗根部，用灭菌剪刀自根部以上剪除，把剪下的根放入装有灭菌蒸馏水的三角瓶中，盖上棉塞。室温下180r/min，震荡40min，幼苗根系干净呈白色后，在无菌室将幼苗根取出后，得到根际细菌的采集液，棉塞封口并放置在4℃冰箱中备用。

实施例1

分离、培养和纯化的细菌完全培养基

细菌完全液态培养基：根据《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著)配制每升培养基，在950ml去离子水中加入葡萄糖5g，牛肉膏3g，胰蛋白胨10g，MgSO₄·7H₂O 2g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L的NaOH调pH至7.2，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min。

细菌完全培养固体培养基(即LB固体培养基)：在950ml去离子水中加入葡萄糖5g，牛肉膏3g，胰蛋白胨10g，MgSO4·7H2O2g，摇动容器直至溶质溶解；用5mol/L的NaOH调pH至7.2，用去离子水定容至1L，加15g琼脂粉，在15psi高压下蒸汽灭菌21min，将融化的LB固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时(手可触摸)加入氨苄青霉素(ampicillin)，充分摇匀，10ml倒1个平板，每个LB固体平板培养基加入0.1mg氨苄青霉素。培养基倒入培养皿后，打开盖子，平置并紫外照射10min～15min；用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，30天内使用。

豆芽促生菌的分离

将根际细菌的采集液静置5min，取悬浮液，按10的稀释梯度(10-1-10-10cfu/m1)涂布于所述加入氨苄青霉素的LB固体平板培养基。各设2次重复，放置35℃培养箱中培养72h。按照菌落的大小、形态、颜色挑选单菌落，如图1所示，放入10ml去离子水中重复涂布于LB固体平板培养基，在光学显微镜油镜下观察菌体一致后，确定为纯化菌株并进行LB固体斜面培养基接种，并在4℃冰箱保存备用。

将以上所分离并纯化的菌株分别进行豆芽促生长实验(具体实验见实施例3，重复多次)。选择与对照(无菌)相比使豆芽产量较高，根茎比较小的QD5菌株作为待选菌株。

将待选菌株进行小白鼠灌胃实验。取18g～22g健康小白鼠，雌雄各半，每只灌胃QD5菌液0.5ml/次，调整菌液活菌数4×10⁹cfu/ml，连续3d，观察7d，称重；空白对照组：等量的0.9％的生理盐水。在实验观察期间，对照组和灌胃组的小白鼠体征、行为、活动、皮毛和色泽未见明显异常；饮食、粪便均未发现明显差异，如表2所示。

表2 用QD5菌液小白鼠灌胃前后体重

使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(宝生物工程(大连)有限公司)，在含有QD5菌落的LB固体平板培养基中挑取菌体中挑取菌体于50μl的TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中变性后离心取上清作为模板。反应条件：80℃，15min，使用TaKaRa16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)，进行PCR扩增目的片段，引物如表3所示。

表3 QD5菌株16S rDNA测序用引物序列

QD5菌株模板DNA5ng～100ng，PCR Premix25μ1，Forward Primer0.5μl，Reverse Primerl或Reverse Primer20.5μl，16S-free H₂O50μ1。阳性对照取Positive Control DNA(试剂盒提供)作为模板。阴性对照使用1μ1的16S-free H₂O替代QD5菌株模板DNA。

PCR结果及菌株鉴定

QD5菌株16S rDNA PCR的鉴定结果如图2所示，图2中M为DL2，000 DNA Marker，从下到上依次为：100、250、500、750、1000、2000bp；1为CTF(CCAAT transcription factor)861-3-2-PCR产物；+为阳性对照；-为阴性对照。阳性对照结构说明16S rDNA PCR扩增成功，阴性对照结果说明PCR扩增过程无污染或干扰，QD5菌株16S rDNA CTF扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离出一明亮1500bp DNA带，然后将这一产物进行DNA测序。测序结果见序列表SEQ ID No.1。

将DNA测序结果与NCBI数据库的核苷酸序列进行BLAST对比分析，并ClustalX软件和MEGA4.1中的Neighbor-joining法，得到QD5菌株在系统发育树中的地位，如图3所示。因此确定QD5菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)如表1所示。

实施例2QD5菌株的生理生化测定

结合伯杰氏系统细菌学手册(Bergey′s manual of systematic bacteriology)(第二版)和《常见细菌系统鉴定手册》(著译者：东秀珠，蔡妙英等编著，2001)对QD5菌株进行了形态学观察。用草酸铵结晶紫色染色后，用95％(v/v)乙醇脱色，再用0.5％(w/v)的番红复染色后，在光学荧光显微镜油镜下(1000×镜下光染)，QD5菌株呈杆菌长为371μm，直径为6μm；未发现菌体分歧和芽孢；菌体排列中有明显的分隔，说明是从一个母菌分裂繁殖而来子菌体。镜下未发现其他有规律的异常菌体，如图4所示。同时，对QD5菌株进行了生理生化特征分析，结果如表4所示。

表4 QD5菌株的生理生化实验结果

将QD5菌株接种到含不同pH的细菌完全液态培养基液中，进行不同温度(5℃～60℃)对QD5菌株生长的影响分析。在pH为7.5最适温度为35℃时，测定QD5菌株的产孢率和菌体的生长曲线。将菌液在752紫外可见分光光度计进行OD值得测定。结果表明，在pH为7.5、温度为35℃培养，40小时进入生长相对静止期，在54h将进入衰落期，如图5所示。培养30小时后开始产孢，54h时产孢率达到最高，如图6所示。QD5菌株在pH为7～8，如图7所示，35℃的条件下，生长最快，如图8所示。

实施例3QD5菌株在豆芽生产中的应用

具体地说，按5％(v/v)比例接种根际菌液(QD510⁸cfu/m1)到pH为中性的35℃温水中培养10min，得到接菌水待用。以绿豆为例，用60℃水浸泡绿豆60秒后，转入接菌水。绿豆与接菌水的重量比为1：2，在恒温35℃搅拌培养6h，绿豆膨胀露白后放入27℃豆芽培养箱中培养。每2h喷淋26℃的接菌水，90h后测量豆芽长度，直径和重量以及根茎比。

空白对照用水替换接菌水，其他条件相同。结果表明，芽长增加8.87％，根长减少2.61％，而芽径增加了18.51％，豆芽产量增加11.13％，如表5，图9所示。

抑菌评估：将10株绿豆芽放入100ml无菌水中，室温下以180r/min转速摇床震荡40min，将绿豆芽从无菌水取出后，接种于PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000m1，自然pH)；36h后检查菌落个数，结果如表6所示。施用接菌水的绿豆芽在浸豆后7天每100g绿豆芽检出1×10²/m1个瓜果腐霉菌，对比未施用接菌水的空白对照(用水替换接菌水，其他条件相同)的绿豆芽含瓜果腐霉菌少1000倍；在浸豆后6天内未检出瓜果腐霉菌。

食用评价：施用接菌水绿豆芽口感觉得有咬头，不脆，有微微的绿豆味，炒菜锅里不出水。10公斤绿豆芽发送给10户居民食用后，未发现腹泻和不良反应。

表5 QD5菌株对绿豆生长的影响

表6 施用接菌水后对瓜果腐霉数量(个/100g绿豆芽)的影响

注：-未检出。

Claims

1.一种蜡状芽孢杆菌，其特征在于：分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)QD5，其保藏编号为：CGMCC No.8316。

2.一种如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌的应用，其特征在于：QD5菌株在豆芽生产中促进豆芽的生长，并同时抑制豆芽腐烂菌的繁殖的应用。

3.根据权利要求2所述的一种蜡状芽孢杆菌的应用，其特征在于：豆芽为绿豆芽。