DE69829654T2

DE69829654T2 - Verfahren zur herstellung von rhizoferrin

Info

Publication number: DE69829654T2
Application number: DE69829654T
Authority: DE
Inventors: J. Raymond BERGERON
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 1997-01-10
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2018-01-09
Also published as: EP0973726A4; NZ336544A; JP3470902B2; CA2276598C; EP0973726B1; NO993394D0; DE69829654D1; NO993394L; AU727715B2; ATE292616T1; CA2276598A1; EP0973726A1; AU5813698A; KR20000070057A; US5739395A; JP2000514089A; WO1998030534A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Chelatbildners Rhizoferrin.
Beschreibung des Standes der Technik
Eisen ist für nahezu alle Lebensformen lebensnotwendig. Jedoch haben aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Fe(OH)₃, (K_sp = 2 × 10^–39), der vorherrschenden Form des Übergangsmetalls in der Umwelt, praktisch alle Lebensformen recht komplexe Eisenchelat-bildende und Transportsysteme zur Nutzung des Metalls entwickelt. Höherentwickelte Tiere neigen zur Nutzung von Proteinen zum Transportieren und Assimilieren von Eisen.
Mikroorganismen erzeugen eine Gruppe von Chelatbildnern oder Siderophoren mit niedrigem Molekulargewicht [Bergeron, „Synthesis and Solution Structure of Microbial Siderophores", Chem. Rev., Vol. 84, Seite 587–602 (1984); Tait, „The Identification and Biosynthesis of Siderochromes Formed by Micrococcus denitrificans, Biochem. J., Vol. 146, Seite 191–204 (1975); Griffiths et al, „Vibriobactin, a Siderophore from Vibrio cholerae", J. Biol. Chem, Vol. 259, Seite 383–385 (1984); Aksoy et al, „Hypertransfusion and Iron Chelation in Thalassaemia", Seite 80, Hans Huber Publishers, Bern (1985) und Bickel et al, „Metabolic products of actinomycetes. Ferrioxamine B", Helv. Chim. Acta., Vol 43, Seite 2129–2138 (1960)] zum Zweck des Erhalts von Eisen. Das Metall kommt in der Biosphäre in großen Mengen im unlöslichen Eisenstadium vor und wäre sonst ohne solche Liganden für Bakterien nicht zugänglich. Obwohl bereits eine Vielzahl von Siderophoren identifiziert wurde, fallen diese zum größten Teil unter zwei Strukturklassen: die Catecholamide und die Hydroxamate [Bergeron, oben]. Viele der Liganden beider Strukturtypen enthalten Polyamin-Hauptketten. Während die hexakoordinierten Catecholamide Parabactin [Tait, oben] und Vibriobactin [Griffiths et al, oben] auf den Triaminen Spermidin bzw. Norspermidin basieren, werden die Hydroxamate häufig von den Diaminen Putrescin oder Cadaverin oder von deren biochemischen Vorläufern Ornithin oder Lysin abgeleitet [Bergeron, oben]. Zum Beispiel bestehen aus dem Streptomyces pilosus isolierten Siderophoren, die Desferrioxamine A–I aus einer Gruppe von Hydroxamaten entweder mit sich wiederholenden Putrescin- oder Cadaverineinheiten in ihren Hauptketten [Aksoy et al, oben]. Der am besten bekannte dieser Chelatbildner, Desferrioxamin B (DFO) [Bickel et al, oben], ist ein linearer Trihydroxamatligand, welcher einen sehr stabilen hexakoordinierten, oktaedrischen Komplex [Modell et al, „The Clinical Approach to Thalassaemia", Seite 217, Grune and Stratton, London (1984)] mit Eisen (III), K_f = 1 × 10³⁰ M^–1 bildet. Obwohl DFO eine Reihe unterschiedlicher +3-Kationen, z.B. Al(III), Ga(III), Cr(III) bindet, zeigt es eine hohe Spezifität für Eisen (III). Es ist daher nicht zu überraschend, dass das Mesylat-Salz von Desferrioxamin, Desferal^® bei der Behandlung verschiedener Eisenüberladungserkrankungen wie Thalassämie eingesetzt wurde [Anderson, „Inorganic Chemistry in Biology and Medicine", Kapitel 15, American Chemical Society, Washington, D. C. (1973) und Fisher et al, „Development of an Intravenous Desferrioxamine Mesylate Treatment Protocol for Swine: Monitoring of Desferrioxamine and Metabolites By High-Performance Liquid Chromatography", Pharmacology, Vol. 41, Seite 263–271 (1990)]. Die Tatsache jedoch, dass Patienten aufgrund der kurzen Halbwertszeit des Medikamentes im Körper kontinuierlich Infusionen erhalten müssen, hat Wissenschaftler dazu gezwungen, die Suche nach besseren therapeutischen Eisenchelatbildnern fortzusetzen.
N¹,N⁴-Bis(1-Oxo-3-Hydroxy-3,4-Dicarboxybutyl)Diaminobutan (Rhizoferrin) wurde zuerst aus der Rhizopus microsporus Var. Rhizopodiformis isoliert, einem Organismus der mit Mukormykose in Verbindung gebracht wird, welcher bei Dialysepatienten gefunden wurde [Drechsel et al, Biol. Met., Vol. 4, Seite 238–243 (1991)], und welcher bei verschiedenen Zygomyceten-Pilzstämmen vorkommt [Thieken et al, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 94, Seite 37–42 (1992)]. Wie die natürlichen Chelatbildner Parabactin und DFO bildet Rhizoferrin einen 1:1-Komplex mit Eisen(III)ionen [Drechsel et al, Biol. Met., Vol. 5, Seite 141–148 (1992)], jedoch wurde die Bildungskonstante des Chelats nicht gemessen. Die Strukturbestimmung von Rhizoferrin [Drechsel et al, 1991, oben] zeigte ein Putrescinzentrum, das an seinem 1-Carboxylat durch Zitronensäure symmetrisch diacyliert ist:
Obwohl Rhizoferrin eine Polyaminhauptkette aufweist, ist es dennoch kein Mitglied einer der beiden Klassen von Chelatbildnern. Es ist eher ein Hydroxypolycarboxylat, zusammen mit Rhizobactin [Smith, Tetrahedron Lett., Vol. 30, Seite 313–316 (1989)] und Staphyloferrin A [Konetschny-Rapp et al, Eur. J. Biochem., Vol. 191, Seite 65–74 (1990)], welche auf L-Lysin bzw. D-Ornithin vorhergesagt werden. Im Gegensatz zu den Hydroxamaten Aerobactin, Arthrobactin, Schizokinen [Bergeron et al, „Synthesis of Catecholamide and Hydroxamate Siderophores", im Handbook of Microbial Iron Chelators, Winkelmann, Hrsg., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, Seite 271–307 (1991)] und Nannochelin [Samejima et al, Chem. Pharm. Bull., Vol. 32, Seite 3428–3435 (1984)], bei denen Zitronensäure symmetrisch 1,3-disubstituiert ist, ist der prochirale Kohlenstoff jeder unsymmetrisch funktionalisierten Zitronensäure in Rhizoferrin asymmetrisch. Diese beiden Stellen des Moleküls befinden sich gemäß der Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie im Vergleich zu natürlicher (R,R)-Weinsäure in der (R)-Konfiguration [Drechsel et al, 1992, oben].
Appl. Microbiol. Biotech. (1996) 45: 664–670 offenbart die Herstellung von Rhizoferrin durch Fermentation.
SYNTHESIS Nr. 12, Dezember 1994, 1450–1456 offenbart eine chemische Synthese, welche das Schützen, Acylieren und Entfernen des Schutzes einer Aminogruppe beinhaltet.
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 6, Nr. 20, 2405–2410 offenbart den Schutz bestimmter Carbonsäuregruppen während der Reaktion einer weiteren Carbonsäuregruppe zur Bildung eines Amids.
Es besteht Bedarf für ein Verfahren zum Synthetisieren von Rhizoferrin und anderen Verbindungen, welche eine Citratkomponente der gewünschten Konfiguration in einer Amidbindung aufweisen. Die Hauptherausforderung für eine solche Synthese ist das Herstellen eines Citrat-Synthons der korrekten Konfiguration zur Bindung an eine Amingruppe, um die Endkonfiguration des Endproduktes eindeutig zu definieren.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen solchen synthetischen Pfad bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese und weitere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung realisiert, wobei eine Ausführungsform davon ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit der Formel:
betrifft,
wobei C* ein chirales Kohlenstoffatom ist;
a und b gleich oder verschieden sein können, und ganze Zahlen von 0 bis 10, jeweils einschließlich, sind; und
R gleich H, Alkyl, Arylalkyl, Carboxyl oder
ist,
wobei C* und b die oben zugeschriebene Bedeutung haben,
welches Folgendes aufweist:

1. das Acylieren eines Polyamins mit der Formel:
wobei a, b und R die oben zugeschriebene Bedeutung haben, und Q eine Amin-Schutzgruppe ist, mit einer enantiomeren Form eines Diesters der Zitronensäure, welche folgende Formel aufweist:
wobei: R' gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Cycloalkyl mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, zur Herstellung eines Amids mit der Formel:
2. das Hydrolysieren des Amids (IV) zur Herstellung einer Säure mit der Formel:
(3) das Entfernen des Schutzes der Säure (V) zum Entfernen der Q-Gruppen, wodurch die Säure der Formel (I) erzeugt wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird detailliert mit Verweis auf die Synthese von Rhizoferrin beschrieben; dabei wird der Fachmann verstehen, dass die hierin allgemein beschriebenen Prinzipien der Erfindung für die Herstellung jeder Verbindung mit der Formel (I) gelten, welche eine Zitronensäurekomponente der bestimmten enantiomeren Konfiguration, über eine Amidbindung an ein Amin gebunden, aufweist.
Das synthetische Schema zur Herstellung von Rhizoferrin ist Folgendes:
Das Enantiomer (III) kann über das folgende Schema hergestellt werden:
In den oben dargestellten Strukturformeln und Schemata kann R der Rest jedes geeigneten veresternden Alkohols mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen wie Alkyl (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl), Aryl (z.B. Phenyl), Aralkyl (z.B. Benzyl) oder Cycloalkyl (z.B. Cyclopentyl, Cyclobenzyl) sein.
Der Diaminreaktant kann jede geeignete Amin-enthaltende primäre Amingruppe mit der Formel (II) sein. Dabei kann R Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Cycloalkyl sein, wobei jedes davon bis zu 10 Kohlenstoffatome oder
aufweist.
Der Ausdruck „Amino-Schutzgruppe" (Q) dient wie hierin verwendet der Bezeichnung der Q-Gruppe, welche anstelle eines Wasserstoffatoms einer Aminogruppe oder von Aminogruppen eingefügt ist, um die Aminogruppe/n während der Synthese zu schützen.
Die Auswahl einer geeigneten Amino-Schutzgruppe ist abhängig vom Grund für den Schutz und der letztendlichen Verwendung des geschützten Produktes. Wird die Schutzgruppe lediglich zum Schutz während der Synthese verwendet, kann eine herkömmliche Amino-Schutzgruppe eingesetzt werden. Geeignete Amino-Schutzgruppen sind in der Technik bekannt und zum Beispiel von Bodanszky in Principles of Synthesis, Springer Verlag, New York (1984), von Ives in US-Patentschrift Nr. 4,619,915 und in den verschiedenen Publikationen, auf welche in letzterer Bezug genommen wird, beschrieben. Siehe auch Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl, Vol. 15., Nr. 1 für Schutzgruppen und Vol. 15, Nr. 2 für Verfahren der Peptidsynthese. Zu repräsentativen Amino-Schutzgruppen zur synthetischen Verwendung gehören Benzyl- und Acylgruppen wie Tert-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Benzoyl, Acetyl und ähnliche. Weitere herkömmliche Amino-Schutzgruppen zum Einsatz bei der Synthese sind in der Literatur beschrieben [Bodanszky, oben, und Ives, oben].
Die Synthese von Rhizoferrin beginnt normalerweise mit Trimethylcitrat, welches durch sterisch kontrollierte Verseifung in 1,2-Dimethylcitrat umgewandelt wird [Hirota et al, Chemistry Lett., Seite 191–194 (1980)]. Die Enantiomere der Carbonsäure werden durch Bildung ihrer (–)-Brucinsalze getrennt. Nach fünf fraktionierten Kristallisationen aus Wasser lässt sich das kristalline Salz durch Einzelkristall-Röntgendiffraktion mit 1,2-Dimethylcitrat in der (R)-Konfiguration nachweisen. Die Behandlung des Salzes mit 1 N HCl und die Extraktion mit Ethylacetat ergibt (R)-1,2-Dimethylcitrat.
Mit der richtigen enantiomeren Säure wurde N¹,N⁴-Dibenzyl-1,4-Diaminobutan [Samejima et al, oben] mit (R)-1,2-Dimethylcitrat (2 Äquivalente) unter Verwendung von Diphenylphosphorylazid (Et₃N/DMF) [Shioiri et al, J. Am. Chem. Soc., Vol. 94, Seite 6203–6205 (1972)] acyliert. Man erhielt das Diamid mit einem Ertrag von 26% nach einer Flash-Säulenchromatographie, wodurch Nebenprodukte einschließlich Olefine aufgrund der Eliminierung des tertiären Alkohols, wie durch NMR angezeigt, entfernt wurden. Die Methylester wurden mit Natriumhydroxid in wässrigem Methanol hydrolysiert und die Acidifizierung ergab N,N'-Dibenzyl-Rhizoferrin.
Schließlich ergaben, da N-Benzylamide resistent gegen Hydrogenolyse sind [Williams et al, Tetrahedron Lett., Vol. 30, Seite 451–454 (1989)], die Entfernung des Schutzes der vierbasigen Säure unter auflösenden Metallreduktionsbedingungen (Li/NH₃/THF) [Kim et al, J. Org. Chem., Vol. 46, Seite 5383–5389 (1981)], die Protonierung der Salze auf einer Kationenaustauschharzsäule und die Reinigung auf einer C-18-Umkehrphasensäule das Endprodukt Rhizoferrin. Das Hochfeld-NMR- und das hochaufgelöste Massenspektrum der synthetischen Verbindung waren im Wesentlichen identisch mit den veröffentlichten Spektren des natürlichen Produktes [Drechsel et al, 1991, oben]. Die absoluten Konfigurationen (R, R) der synthetischen Probe und des natürlichen Materials sind identisch, da beide bei der gleichen Wellenlänge einen negativen Cotton-Effekt zeigten [Drechsel et al, 1992, oben].
Rhizoferrin cyclisiert, wenn es ruht, durch die Dehydrierung zu Imidorhizoferrin und Bis-Rhizoferrin, welche einen bzw. zwei fünfgliedrige Ringe besitzen [Drechsel et al, 1992, oben]. Mittels der NMR wurde beobachtet, dass die Geschwindigkeitskonstante nullter Ordnung für diese Ringformation bei pH 5,0 6,9 × 10^–2 h^–1 ist. Bei pH 3 waren die Erkenntnisse zum Umfang der Cyclisierung ähnlich denen in der Literatur [Drechsel et al, 1992, oben]; somit erhielt man die analytischen Daten bevor diese Dekomposition stattfand.
Diese synthetische Methodik für Rhizoferrin kann auch verwendet werden, um den Hydroxy-polycarboxylierten Siderophor Staphyloferrin A herzustellen [Konetschny-Rapp et al, oben und Meiwes et al, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 67, Seite 201–206 (1990)], bei welchem D-Ornithin an seinem 1-Carboxylat mit Zitronensäure N^α,N^δ-diacyliert ist. Außerdem können Analoga von Rhizoferrin, bei welchen die Kettenlänge der zentralen Methylenbrücke variiert, für Strukturaktivitätsstudien synthetisiert werden.
Pharmazeutikazusammensetzungen, welche eine Verbindung der allgemeinen Formel I, hergestellt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, aufweisen, enthalten bevorzugt eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz, durch welche es möglich ist, die Verbindung oder Mischung oral als Tablette, Kapsel oder Pille, oder parenteral oder transdermal zu verabreichen. Die aktiven Inhaltsstoffe können beigemischt oder mit einer herkömmlichen, pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz vermischt sein. Der Fachmann wird verstehen, dass jegliche/s Art der Verabreichung, Vehikel oder Trägersubstanz, welche/s konventionell eingesetzt wird, und welche/s in Bezug auf den aktiven Wirkstoff inaktiv ist, für die Herstellung und Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden kann. Erläuternd sind solche Verfahren, Vehikel und Trägersubstanzen zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 4. Ed. (1970) beschrieben. Der Fachmann wird keine Schwierigkeiten bei der Bestimmung geeigneter und angemessener Vehikel, Bindemittel und Trägersubstanzen oder bei der Mischungsherstellung der aktiven Inhaltsstoffe damit zur Bildung des Pharmazeutikums haben.
Die therapeutisch effektive Menge des aktiven Wirkstoffes, welche der pharmazeutischen Zusammensetzung beizufügen ist, hängt in jedem Fall von mehreren Faktoren ab, z.B. dem Typ, der Größe und dem Zustand des Patienten, von der zu behandelnden Störung, der beabsichtigten Art der Verabreichung, der Fähigkeit des Patienten, die beabsichtigte Dosierungsform aufzunehmen, usw. Im Allgemeinen wird jeder Dosierungsform eine Menge des aktiven Wirkstoffes beigefügt, so dass zwischen etwa 50 bis etwa 500 mg, bevorzugt zwischen etwa 50 und etwa 250 mg bereitgestellt werden.
Der in den pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzte aktive Wirkstoff kann ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder einen Komplex der Verbindungen der Formel I, z.B. Natrium, Kalium oder andere nichttoxische Metallsalze, Aminsalze, usw. sowie Hydrogensalze, z.B. mit HCl, HAc, usw. aufweisen.
Die Verbindung der Formel I ist von Nutzen bei der Behandlung von Schwermetall-Überladungserkrankungen, z.B. mit Eisen, wie Thalassaemia.
Dem Fachmann wird bewusst sein, dass die Mengen der verschiedenen Komponenten der einem Patienten zu verabreichenden Zusammensetzungen von den oben genannten Faktoren abhängen. Im Allgemeinen werden die Mengen des aktiven Wirkstoffes jedoch so verabreicht, dass Dosierungen davon zwischen etwa 50 bis etwa 500 mg/kg, bevorzugt zwischen etwa 50 bis etwa 250 mg/kg bereitgestellt werden, wobei die Häufigkeit der Verabreichung und Dauer der Behandlung vom Typ und der Art des Patienten und der behandelten Störung abhängen.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht, wobei Silikagel 32–63 (40 μm „Flash") oder Silikagel 60 (70–230 Mesh) für die Säulenchromatographie verwendet wurde. Optische Rotationen wurden in CH₃OH bei 589 nm (Na-Lampe) bei Raumtemperatur durchgeführt, mit c als Gramm der Verbindung pro 100 ml. ¹H NMR-Spektren wurden bei 300 oder 600 MHz aufgezeichnet und im angegebenen deuterierten organischen Lösemittel oder in D₂O mit chemischen Verschiebungen angegeben in Teilen je Million nach tieferen Feldern verschoben von Tetramethylsilan bzw. 3-(Trimethylsilyl)Propion-2,2,3,3-d₄-Säure, Natriumsalz durchgeführt. Es wurden Röntgendiffraktionsdaten bei 173 K auf einer Siemens SMART PLATFORM ausgestattet mit einem CCD-Bereichsdetektor und einem Graphit-Monochromator mit Hilfe von MoK_αStrahlung (λ = 0,71073 A) gesammelt. Die Zellparameter wurden mit Hilfe von bis zu 6233 Reflektionen verfeinert. Eine Datenhemisphäre (1381 Frames) wurde mit Hilfe der ω-Scan-Methode (0,3° Frame-Weite) gesammelt. Die ersten 50 Frames wurden am Ende der Datenerfassung nochmals gemessen, um das Instrument und die Kristallstabilität zu überwachen (maximale Korrektur bei I war < 1%). Psi-Scanabsorptionskorrekturen wurden auf Grundlage des gesamten Datensatzes angewandt.
Zirkulardichroismusspektren erhielt man mit einem Jasco Modell J500C Spektropolarimeter ausgestattet mit einer Jasco IF-500II-Schnittstelle und einem CompuAdd 286 Computer; Datenerfassung und -verarbeitung erfolgten mit Jasco DP-500/PC System Version 1.28 Software. Die Zellpfadlänge betrug 2,00 cm.
Ultraviolettspektroskopiespektren erhielt man mit einem Shimadzu UV-2501PC ausgestattet mit einer AST 486/33 Computerdatenstation. Die Zellpfadlänge war 1,00 cm.
BEISPIEL 1
1,2-Dimethylcitrat (2) wurde durch Modifikation eines veröffentlichten Verfahrens [Hirota et al, oben] hergestellt. Natriumhydroxid (0,1 N, 215 ml) wurde über 2 Stunden mit kräftigem Rühren bei Raumtemperatur zu einer Lösung Trimethylcitrat (1) (10,0 g, 42,7 mmol) in 50% wässrigem (CH₃OH (200 ml) gegeben. Die Lösung wurde auf etwa 150 ml konzentriert und mit EtOAc (3 × 150 ml) extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 1 N HCl (45 ml) azidifiziert und mit EtOAc (3 × 150 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, was 3,70 g (39%) von (2) als farbloses Öl ergab: ¹H NMR (d₆-DMSO) δ 5,60 (br s, 1H, OH), 3,64 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,57 (s, 3H, CO₂CH₃), 2,87 (d, 1H, J = 15 Hz, 1/2 CH₂), 2,81 (d, 1H, J = 15 Hz, 1/2 CH₂), 2,65 (d, 1H, J = 15 Hz, 1/2 CH₂).
BEISPIEL 2
1,2-Dimethyl-3-[(S)-sec-Phenethyl]-Citrat (3) wurde durch Hinzufügen von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (103 mg, 0,5 mmol) zu einer Lösung aus (2) (110 mg, 0,5 mmol), (S)-(–)-sec-Penethylalkohol (61 mg, 0,5 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (3 mg) in trockenem CH₂Cl₂ (10 ml) bei 0°C hergestellt, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Die Mischung wurde gefiltert und das Filtrat wurde konzentriert und durch Flash-Chromatographie (1:2 EtOAc/Hexan) gereinigt, was 60 mg (37%) von (3) als ein farbloses Öl ergab: ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,35–7,28 (m, Ph), 5,97 (q, J = 7 Hz, CHPh), 5,88 (q, J = 7 Hz, CHPh), 3,77 (s, CH₃O), 3,73 (s, CH₃O), 3,69 (s, CH₃O), 3,68 (s, CH₃O), 2,98–2,74 (m, CH₂), 1,54 (d, J = 7 Hz, C-CH₃), 1,52 (d, J = 7 Hz, C-CH₃).
BEISPIEL 3
(–)-Brucinsalz von (R)-1,2-Dimethylcitrat wurde durch das Hinzufügen von (2) (7 g, 31,8 mmol) zu einer Lösung aus (–)-Brucin (12,5 g, 31,8 mmol) (ACHTUNG: toxisch) in EtOAc (460 ml) unter kräftigem Rühren über Nacht hergestellt. Nach der Filterung wurde das Präzipitat (10,5 g) aus Wasser (5×) rekristallisiert und getrocknet, was 2,04 g weiße Kristalle ergab: mp 165–168°C.
Das diastereomere Salz kristallisiert in der monoklinen Raumgruppe C2 und hat folgende Zellmaße: a = 13,8947 (3), b = 12,4224 (3) und c = 17,5408 (3) Å; α = 90°, β = 104,556 (1) und δ = 90°. Die Struktur wurde durch die Direkten Verfahren in SHELXTL [Sheldrick, SHELXTL, Siemens XRD Corporation, Madison, WI (1995)] gelöst und wurde mit Hilfe der vollen Matrix kleinster Quadrate verfeinert. Die nicht-H-Atome wurden anisotropisch behandelt. Die Methylwasserstoffatome wurden in idealer Position berechnet und befanden sich auf ihren entsprechenden Kohlenstoffatomen; die restlichen H-Atome wurden ohne Beschränkungen verfeinert. Zwei Wassermoleküle wurden in der asymmetrischen Einheit lokalisiert. Eines wurde mit voller Belegung verfeinert und seine H-Atome wurden lokalisiert. Das andere Wassermolekül, welches sich auf einer 2-fachen Rotationsachse befand, wurde auf eine 30% Belegung verfeinert. Basierend auf der Kenntnis der Stereochemie von Brucin wurde dem Citratteil des Salzes eine absolute Konfiguration von (R) zugewiesen. Die Parameter (521) wurden im abschließenden Verfeinerungszyklus mit Hilfe von 3855 Reflektionen mit I > 2σ (I) verfeinert, um R₁ und wR₂ von 0,0434 bzw. 0,1040 zu erreichen. Die Verfeinerung wurde mit Hilfe von F² durchgeführt.
BEISPIEL 4
(R)-1,2-Dimethylcitrat (4). HCl (1 N, 4 ml) wurde zu einer Lösung des (–)-Brucinsalzes von (R)-1,2-Dimethylcitrat (2,04 g, 3,32 mmol) in Wasser (50 ml) hinzugefügt und das Rühren wurde für 5 Minuten fortgesetzt. Die Extraktion mit EtOAc (3 × 50 ml), Trocknung über Na₂SO₄ und Konzentrierung ergab 630 mg (86%) von (4) als ein farbloses Öl: [α] +4,0 (c 1,00), die NMR war identisch zu (2).
BEISPIEL 5
N,N'-Dibenzylrhizoferrin, Tetraethylester (6). Diphenylphosphorylazid (760 mg, 2,76 mmol) und NEt₃ (1,5 ml, 11 mmol) wurden zu einer Lösung von (4) (610 mg, 2,77 mmol) und N¹,N⁴-Dibenzyl-1,4-Diaminobutan [Samejima et al, oben] (370 mg, 1,38 mmol) in DMF (20 ml) bei 0°C unter Stickstoff hinzugefügt. Die Lösung wurde für 1 Stunde bei 0°C gerührt und dann weiter bei Raumtemperatur für 23 Stunden. Nachdem die Lösemittel unter Hochvakuum entfernt wurden, wurde der Rest in EtOAc (25 ml) aufgenommen und mit gesättigtem NaHCO₃ (25 ml), Wasser (25 ml), 0,5 N HCl (25 ml) und Wasser (25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄) und konzentriert. Flash-Chromatographie, Eluieren mit 4:1 EtOAc/Hexan erzeugte 240 mg (26%) (6) als ein blassgelbes Öl: [α] +8,25 (c 1,00); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,42–7,24 (m, 10H), 4,65–4,48 (m, 4H), 3,81 (s, 3H, OCH₃), 3,79 (s, 3H, OCH₃), 3,69 (s, 3H, OCH₃), 3,65 (s, 3H, OCH₃), 3,40–3,12 (m, 4H), 3,10–2,67 (m, 8H), 1,57–1,41 (m, 4H). Anal. berechnet für C₃₄H₄₄N₂O₁₂: C 60,70, H 6,59, N 4,16. Ergebnis: C 60,64, H 6,61, N 4,15.
BEISPIEL 6
N,N'-Dibenzylrhizoferrin (7). Eine Lösung aus (6) (170 mg, 0,253 mmol) in CH₃OH (7 ml) und 1 N NaOH (7 ml) wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. HCl (1 N, 8 ml) wurde hinzugegeben, und die Lösung wurde auf etwa 15 ml konzentriert. Nach der Extraktion mit EtOAc (3 × 15 ml) wurde die organische Schicht getrocknet (Na₂SO₄) und konzentriert, was 120 mg (77%) (7) als ein farbloses Glas ergab: [α] +12,27 (c 1,00); ¹H NMR (CD₃OD) δ 7,42–7,20 (m, 10H, 2 Ph), 4,67–4,47 (m, 4H, CH₂Ph), 3,35–3,23 (m, 4H, 2 NCH₂), 3,19–2,69 (m, 8H, 4 CH₂CO), 1,58–1,41 (m, 4H, 2 CH₂). Anal. berechnet für C₃₀H₃₆N₂O₁₂·H₂O: C 56,78, H 6,04, N 4,41. Ergebnis: C 56,88, H 6,08, N 4,34.
BEISPIEL 7
Rhizoferrin. Eine Lösung aus (7) (110 mg, 0,178 mmol) in destilliertem THF (1,5 ml) wurde zu Li (33 mg, 4,8 mmol) in NH₃ (100 ml) hinzugefügt, und die Mischung wurde für 3 Stunden auf –78°C gehalten. Wässriges H₃OH (50%, 10 ml) wurde hinzugefügt bis die blaue Farbe verschwand. Ammoniak wurde verdampft und der Rest wurde über eine Kationenaustauschharzsäule (Bio Rad., AG 50W-X8) in Wasser (50 ml) aufgenommen. Das das Produkt enthaltende Elutionsmittel (pH = 3) wurde mit EtOAc (50 ml) extrahiert, welches bis zur Trockenheit konzentriert wurde. Der Rest wurde in destilliertem EtOH (2 ml) aufgelöst, gefiltert und konzentriert, um 50 mg (64%) Rhizoferrin als farbloses Glas zu erhalten: HRMS (FAB, m-Nitrobenzylalkoholmatrix) berechnet für C₁₆H₂₅N₂O₁₂: 437,1407 (M + H), Ergebnis 437,1407 (Base). Anal. berechnet für C₁₆H₂₄N₂O₁₂·H₂O: C 42,29, H 5,77, N 6,17. Ergebnis: C 42,49, H 5,80, N 5,84.
Eine Lösung des Rohproduktes (10 mg) wurde durch Umkehrphasen-HPLC [Drechsel et al, 1992, oben] (C-18 präparative Säule, 21,4 mm × 25 cm, bezogen von Rainin) gereinigt. Die anfängliche Konzentration der mobilen Phase von 3% CH₃CN in 0,1% TFA wurde für 15 Minuten aufrecht erhalten, gefolgt von Gradientenelution von 3–11% CH₃CN in 0,1% TFA über 35 Minuten, dann mit 11% CH₃CN in 0,1% TFA gehalten für 20 Minuten. Die Fliesgeschwindigkeit wurde bei 4 ml pro Minute aufrechterhalten. Die Retentionszeit betrug 56 Minuten. Lyophilisierung ergab 4,32 mg (9,90 μmol) isoliertes Rhizoferrin als ein farbloses Glas: [α] –16,7 (26°C) (c 0,1613); ¹H NMR (D₂O) δ 3,21–3,15 (m, 4H), 3,02 (d, 2H, J = 16,0 Hz), 2,79 (d, 2H, J = 16,0 Hz), 2,76 (d, 2H, J = 14,6 Hz), 2,65 (d, 2H, J = 14,6 Hz), 1,53–1,47 (m, 4H).
Eine Stammlösung wurde durch Auflösen des isolierten Produktes in 50,00 ml destilliertem Wasser hergestellt; eine 10,00 ml Aliquote wurde auf 20,00 ml verdünnt und mit 1,90 ml 0,010 N HCl auf pH = 3,02 eingestellt (abschließende Rhizoferrinkonzentration = 9,04 × 10^–5 M). CD- und UV-Spektren wurden sofort nach der pH-Einstellung aufgenommen. Sämtliche Spektren wurden mit destilliertem Wasser, welches wie oben azidifiziert wurde, Basislinienkorrigiert.
CD-Ergebnisse
Die CD-Spektren von Rhizoferrin zeigten einen negativen Cotton-Effekt zwischen 200 und 220 nm, mit einem einzigen Minimum bei 205 nm, Δε = –2,7 im Vergleich zu einem aufgezeichneten einzigen Minimum [Drechsel et al, 1992, oben] bei 204 nm, Δε = –4,3.
UV-Ergebnisse

Claims

Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit der Formel:
wobei C* ein chirales Kohlenstoffatom ist; a und b das Gleiche oder etwas anderes sein können, und ganze Zahlen von 0 bis 10, jeweils einschließlich, sind; und R H, Alkyl, Arylalkyl, Carboxyl oder
ist, wobei C* und b die oben zugeschriebene Bedeutung haben, welches Folgendes umfasst: (1) Acylieren eines Polyamins mit der Formel:
wobei a, b und R die oben zugeschriebene Bedeutung haben, und Q eine Amin-Schutzgruppe ist, mit einer enantiomeren Form eines Diesters der Zitronensäure, welche folgende Formel aufweist:
wobei: R' Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Cycloalkyl mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, zur Herstellung eines Amids mit der Formel:
(2) Hydrolysieren des Amids (IV) zur Herstellung einer Säure mit der Formel:
(3) Entfernen des Schutzes der Säure (V) zum Entfernen der Q-Gruppen, wodurch eine Säure der Formel (I) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei a = 1, b = 1 und R = H.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Polyamin ein aliphatisches Diamin, bevorzugt 1,4-Diaminobutan ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Q eine Benzylgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R Methyl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Diester der Zitronensäure (III) ein (R) Enantiomer ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Polyamin 1,4-Diaminobutan und die Verbindung (I) Rhizoferrin ist.
Verfahren zum Synthetisieren von Rhizoferrin, welches das Acylieren von N¹,N⁴-Dibenzyl-1,4-Diaminobutan mit (R)-1,2-Dimethylcitrat umfasst, zum Herstellen einer Verbindung mit der Formel:
Hydrolysieren der Formel (VII) zum Herstellen der Säure mit der Formel:
und Debenzylieren der Formel (VIII) zum Herstellen von Rhizoferrin.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Acylierung mit Hilfe von Diphenylphosphorylazid und Triethylamin bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Acylierung in einem Lösemittel bewirkt wird, welches Dimethylformamid enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Hydrolyse der Formel (VII) zum Herstellen der Formel (VIII) in alkalischem Methanol durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Debenzylierung der Formel (VIII) zum Herstellen von Rhizoferrin unter lösenden Metallreduktionsbedingungen, z.B. Li in NH₃, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, einschließlich des Schrittes der Herstellung des Zitronensäurediesters (III) durch die sterisch kontrollierte Verseifung eines Zitronensäuretriesters mit der Formel:
wobei R die oben zugeschriebene Bedeutung hat.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei R Methyl ist, und die sterisch kontrollierte Verseifung der Formel (VI) in einer alkalischen Methylalkohol-Lösung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, einschließlich des Schrittes der Herstellung des Enantiomers des Zitronensäurediesters (III), z.B. durch das Trennen des Enantiomers von einem racemischen Gemisch des Zitronensäurediesters (III), bevorzugt durch das Reagieren des Gemisches mit einer chiralen Base zur Herstellung eines diastereoisomeren Salzes.