DE69815840T2

DE69815840T2 - Verwendung von tall-104 zellen in kombination mit adriamyzin oder cisplatin zur behandlung von malignen tumoren

Info

Publication number: DE69815840T2
Application number: DE69815840T
Authority: DE
Inventors: Daniela Santoli; Giovanni Rovera; Alessandra Cesano
Original assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1997-05-01
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: EP0980205A1; PT980205E; JP4371437B2; DE69815840D1; EP0980205A4; ES2202847T3; CA2288059A1; JP2002512618A; ATE243522T1; EP0980205B1; US6022538A; WO1998048630A1; AU7274498A; DK0980205T3; CA2288059C; AU734046B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein die Behandlung von Krebserkrankungen und insbesondere die Behandlung von gegen Arzneistoffe resistenten Krebserkrankungen.
Allgemeiner Stand der Technik
Die Verwendung der adoptiven Transfertherapie zusammen mit der Chemotherapie zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung bildet die Grundlage für die adoptive Immunchemotherapie. In Mausmodellen konnten mit dem adoptiven Transfer von T-Zellen in Verbindung mit der Verabreichung gewisser Chemotherapeutika eine beträchtliche Anzahl an tumortragenden Wirtstieren erfolgreich behandelt werden [P. Greenberg et al, J. Exp. Med., 161 : 1122–1134 (1985); M. Bookman et al, J. Immunol., 139 : 3166–3170 (1987); und F. Fornelle et al, Int. J. Cancer, 42 : 952–957 (1988)]. Die Ergebnisse der wenigen, bisher durchgeführten klinischen Versuchsstudien zeigten, daß die TIL/IL-2-Therapie zusammen mit einer Behandlung mit Adriamycin, Mitomycin oder Cyclophosphamid einen vielversprechenden Ansatz bei Patienten mit metastatischen oder primären Lebertumoren und Melanomen darstellt [A. Kawata et al, Am. J. Clin. Oncol., 18 : 257–262 (1995); S. Rosenberg et al, N. Engl. J. Med., 319 : 1676–1680 (1988); und J. Gold et al, Eur. J. Cancer, 31A : 698–708 (1995)]. Die den mit den kombinierten Schemata erzielten verbesserten Antitumorwirkungen zugrundeliegenden Mechanismen sind noch nicht vollständig aufgeklärt worden. Die von einigen Chemotherapeutika gezeigte immunmodulierende Aktivität scheint jedoch eine wesentliche Rolle dabei zu spielen, daß die Immunchemotherapie der Behandlung mit einem einzigen Mittel überlegen ist [M. Awwad et al, Immunology, 65 : 87–92 (1988) und R. North, J. Exp. Med., 155 : 1063–1074 (1982)]. Trotz dieser klinischen Ergebnisse stellen die mit der LAK- oder TIL/IL-2-Therapie verbundene Toxizität [K. Margolin et al, J. Clin. Oncol., 7 : 486 (1989)] sowie die Seltenheit von Tumorproben zur Herstellung und Vermehrung von TIL [S. Topalian et al, J. Immunol. Meth., 102 : 127–141 (1987)] wichtige einschränkende Faktoren bei der Verwendung der Zelltherapie in Verbindung mit anderen Ansätzen dar.
Es wurde eine neue adoptive Transferstrategie gegenüber Krebserkrankungen entwickelt, mit der die Beschränkungen der LAK- und TIL-Therapie überwunden werden könnten, da bei ihr die gleichzeitige Verabreichung exogener, toxischer Zytokine, wie z. B. IL-2, für die Wirksamkeit nicht erforderlich ist. Dieser Ansatz beruht auf der Verwendung einer mit einer Lethaldosis bestrahlten menschlichen T-Zellinie (TALL-104), (CD3/TCRαβ⁺CD8⁺CD16^-) [A. Cesano et al, In Vitro Cell. Dev. Biol., 28A : 648 (1992); A. Cesano et al, J. Immunol., 151 : 2943–2957 (1993); und A. Cesano et al, Cancer Immunol. Immunoth., 40 : 139 (1995)], die mit einer uneingeschränkten MHC-Killeraktivität gegen eine große Vielfalt an Tumoren in mehreren Spezies ausgestattet ist, während Zellen aus Normalgeweben verschont bleiben. Untersuchungen in immundefizienten und immunkompetenten Mausmodellen mit transplantierbaren Tumoren und in Hunden mit spontan auftretenden Krebserkrankungen deuten auf das Potential dieser Zellinie als Antitumormittel in einer klinischen Umgebung hin [A. Cesano et al, J. Clin. Invest., 94 : 1076 (1994); A. Cesano et al, Cancer Res., 55 : 96 (1995); A. Cesano et al, Cancer Res., 56 : 3021 (1996); und A. Cesano et al, Cancer Res., 56 : 4444–4452 (1996)].
Trotz des in den letzten Jahren erzielten Fortschritts bei der Behandlung verschiedener Formen hämatologischer und nicht hämatologischer Malignitäten (d. h. soliden Tumoren) hat es sich jedoch herausgestellt, daß Einzeltherapieansätze, wie z. B. Chirurgie, Chemotherapie, Strahlentherapie, sowie biologische Therapien bei der vollständigen Beseitigung oder drastischen Verringerung der Tumorlast häufig wirkungslos sind. Zur optimalen Therapie hartnäckiger Tumoren werden Mehrfachkombinationsansätze benötigt.
Es besteht daher im Fachgebiet ein Bedarf an Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen, die gegenüber Einzelbehandlungsformen und insbesondere gegenüber der Chemotherapie resistent sind. Darüber hinaus werden Verfahren zur Verringerung der Toxizität ansonsten wirksamer chemotherapeutischer Antikrebsschemata benötigt.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Mittel zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Tumors in einem Säuger und zur Reduzierung der Toxizität eines Chemotherapeutikums gegenüber einem Säuger bereit.
Erfindungsgemäß wird die Verwendung von TALL-104-Zellen, die in vitro durch Behandlung mit IL-2 zur Verbesserung ihrer nicht MHC-beschränkten Zytotoxizität und durch Bestrahlung mit einer für die irreversible Hemmung der Vermehrung dieser Zellen geeigneten, jedoch nicht die zytotoxische Aktivität der Zellen in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, ausgewählt aus Adriamycin und Cisplatin, störenden Dosis modifiziert worden sind, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Krebsbehandlung in einem Säuger bereitgestellt.
Bei einer Therapiekur, bei der zur Behandlung einer Krebserkrankung ein Chemotherapeutikum, ausgewählt aus Adriamycin und Cisplatin, sowie TALL-104-Zellen, die durch in-vitro-Behandlung mit IL-2 zur Verbesserung ihrer nicht MHC-beschränkten zytotoxischen Aktivität und durch Bestrahlung mit einer für die irreversible Hemmung der Zellvermehrung, jedoch nicht ihre zytotoxische Aktivität störenden Dosis modifiziert worden sind, gemeinsam verabreicht werden, wurde überraschenderweise festgestellt, daß diese gemeinsame Verabreichung eine Antitumorwirkung besitzt, die über die Summe der Antitumorwirkungen der Chemotherapie und der Zelltherapie jeweils für sich allein hinausgeht.
Die Erfindung stellt daher ein Mittel zur Reduzierung der Toxizität von Adriamycin bzw. Cisplatin als Chemotherapeutikum gegenüber einem Säuger bereit, indem dem Säuger eine Therapiekur mit dem Chemotherapeutikum sowie eine Therapiekur mit den wie oben definierten IL-2-stimulierten, modifizierten Zellen, die durch eine nicht MHC-beschränkte zytotoxische Aktivität gekennzeichnet sind, gemeinsam verabreicht werden. Vorteilhafterweise gestattet die kombinierte Wirkung der Zellinie und des Chemotherapeutikums ein niedrigere wirksame Dosis des Chemotherapeutikums als bei Abwesenheit der Zellinie erforderlich.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon weiter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In 1A sind die zytotoxischen und zytostatischen Aktivitäten von γ-bestrahlten TALL-104-Zellen gegenüber MGC#1-Tumorzellen im 18-Stunden-⁵¹Cr-Freisetzungs- bzw. 18-Stunden-³HTdR-Aufnahme-Inhibierungsassay gezeigt. SD-Werte (Standardabweichungen) von < 2,0 sind nicht gezeigt.
In 1B sind die Wirkungen unterschiedlicher chemotherapeutischer Arzneistoffe (in verschiedenen Dosen) auf das in-vitro-Wachstum von MGC#1-Tumorzellen gezeigt. Die Ergebnisse eines von drei durchgeführten Experimenten repräsentativen Experiments sind gezeigt.
Bei 2 handelt es sich um eine Wachstumskurve menschlicher MGC#1-Tumor-Transplatate in SCID-Mäusen, die intraperitoneal mit PBS, Adriamycin und/oder TALL-104-Zellen injiziert wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von soliden Tumoren. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß in gewissen Ausführungsformen die gemeinsame Verabreichung von Chemotherapie und Zelltherapie, wie sie ausführlich im folgenden beschrieben ist, eine synergistische Wirkung, d. h. eine Antikrebswirkung, die die Summe der Antikrebswirkungen der Chemotherapie bzw. Zelltherapie jeweils für sich allein bzw, die Summe ihrer Wirkungen übertrifft, liefert. In anderen Ausführungsformen liefert diese gemeinsame Verabreichung Antikrebswirkungen, die die Verabreichung der Chemotherapie bzw. der Zelltherapie jeweils allein übertreffen. Weiterhin eignet sich die Erfindung dazu, die Resistenz einer Krebserkrankung gegenüber Einzeltherapeutika durch vom Wirtsimmunsystsem unabhängigen Mechanismen zu überwinden. Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie, falls gewünscht, die Verwendung einer niedrigeren Dosis eines Chemotherapeutikums gestattet, beispielsweise um damit verbundene unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren.
Bei Verwendung der Erfindung wird eine Chemotherapiekur mit einem Chemotherapeutikum in Verbindung mit einer Zelltherapie an einen Menschen oder ein Tier als Patienten verabreicht. Diese Therapien werden jeweils in größeren Einzelheiten unten erörtert. Die Erfindung sieht eine gleichzeitige Verabreichung, eine aufeinanderfolgende Verabreichung oder eine kombinierte Verabreichung vor. Diese Verabreichungswege werden hierin als gemeinsame Verabreichung bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Verwendung kann mit anderen zur Krebsbehandlung geeigneten Therapien kombiniert werden. Es wird ebenfalls angenommen, daß diese Behandlung einem Säuger, der bereits aufgrund einer Krankheit einer Immunsuppression unterliegt, verabreicht werden kann. Die Bewertung des Immunzustands des menschlichen oder tierischen Patienten kann vom Fachmann leicht bestimmt werden.
Chemotherapie
Chemotherapeutika sind dem Fachmann allgemein bekannt. Zu solchen Chemotherapeutika zählen beispielsweise Alkylierungsmittel und Antibiotika. Zu den Alkylierungsmitteln gehören Platinverbindungen, wie z. B. Cisplatin. Zu den Antibiotikamitteln gehören die Anthracycline, wie z. B. Doxorubicin (auch als Adriamycin bezeichnet). Bei dem hier verwendeten Chemotherapeutikum handelt es sich um Adriamycin oder Cisplatin.
Für das ausgewählte Chemotherapeutikum geeignete Dosierungen sind dem Fachmann bekannt. Handelt es sich beispielsweise bei dem Mittel um Adriamycin, so kann eine geeignete Dosierung 30 mg/m², zweimal im 1wöchigen Abstand intravenös verabreicht, beinhalten. Dem Fachmann ist es jedoch leicht möglich, den Verabreichungsweg, die Anzahl an erhaltenen Dosen, den Zeitpunkt der Dosen sowie die Dosierungsmenge je nach Bedarf anzupassen. Da die gemeinsame Verabreichung der Chemotherapie mit der Zelline gemäß der vorliegenden Erfindung verbesserte Ergebnisse liefert, kann es weiterhin dem Fachmann wünschenswert erscheinen, die Dosis des verabreichten Chemotherapeutikums zu verringern, um so jegliche damit verbundenen toxische Nebenwirkungen zu reduzieren.
Unter Berücksichtigung der obigen Betrachtungen liegt im allgemeinen eine geeignete Dosis eines gegebenen Chemotherapeutikums bei erfindungsgemäßer Verabreichung zwischen 0,01 μg/ml und etwa 1 mg/ml und besonders bevorzugt zwischen 0,01 μg/ml und etwa 1 μg/ml. Eine solche Dosis, die sich je nach dem ausgewählten jeweiligen Arzneistoff oder -mittel anpassen läßt, kann auf jedem geeigneten Wege, einschließlich z. B. intravenös, intradermal, durch direkte lokalisierte Injektion, intraperitoneal, intranasal, u. ä., verabreicht werden. Die Dosen können je nach Bedarf wiederholt werden.
Zelltherapie
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden bei der Zelltherapie Zellen an einen Menschen oder ein Tier als Patienten verabreicht. Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Zellen besitzen eine nicht MHC-beschränkte Killeraktivität gegenüber einer großen Vielzahl von Tumoren aus mehreren Spezies, während Zellen aus Normalgeweben verschont bleiben. Wünschenswerterweise werden diese Zellen von einem oder einer Kombination aus T-Zellen stimulierenden Zytokinen stimuliert.
Bei der Zellinie handelt es sich um eine TALL-104-Zelllinie. Eine solche Zellinie ist erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110–2209, ebenso wie von einer Vielzahl akademischer und kommerzieller Quellen. So ist die TALL-104-Zellinie beispielsweise von der ATCC unter der Zugangsnummer CRL 11386 erhältlich.
Vor der erfindungsgemäßen Verwendung werden die von der ausgewählten Zellinie erhaltenen Zellen auf eine Weise behandelt, die zur irreversiblen Hemmung der Zellvermehrung führt, jedoch nicht die zytotoxische Aktivität der Zellen stört. Zu diesem Behandlungs verfahren gehört eine Bestrahlung und insbesondere eine γ-Bestrahlung. Zwar wird als Beispiel die γ-Bestrahlung verwendet, doch darf angenommen werden, daß andere Bestrahlungsverfahren verwendet werden könnten, um das Wachstum der Zellen zu stoppen. Dem Fachmann ist es leicht möglich, geeignete Verfahren zur Hemmung des Wachstums auszuwählen.
Die Zellen stammen aus einer TALL-104-Zellinie, wobei die Zellen mit einem T-Zellen stimulierenden Zytokin, nämlich IL-2, stimuliert wurden. TALL-104-Zellen lassen sich so modifizieren, daß sie mit einer erhöhten Zytotoxizität gegenüber Tumoren und virusinfizierten Zielen versehen werden. Solche Modifikationsverfahren wurden ausführlich in der am 24. November 1394 veröffentlichten WO 94/26284 beschrieben. Der Modifikationsschritt umfaßt die in-vitro-Behandlung der TALL-104-Zellen mit dem ausgewählten Zytokin. Das Interleukin, rekombinantes humanes (rh-)Interleulcin (IL) IL-2 induziert die zytotoxische Aktivität der Zellinie. Dieses Zytokin läßt sich auch zusammen mit rh-IL-12 verwenden. Werden diese Zytokine zusammen zur Modifikation der Zellinie verwendet, so zeigt die modifizierte Zellinie additive bzw. erhöhte zytotoxische Wirkungen. Dies führt zu einem signifikanten Anstieg der zytotoxischen Aktivität sowie der Rezyklisierungsfähigkeit und schließlich zur 100%igen Eliminierung der Tumorziele mit einem E : T-Verhältnis von < 0,1 : 1 [Cesano et al, J. Immunol., 151 : 2943 (1993)].
Bei einem weiteren Modifikationsschritt der vorliegenden Erfindung wird die TALL-104-Zellinie einer lethalen Bestrahlung ausgesetzt, um so den irreversiblen Verlust an Wachstumsfähigkeit bei vollständiger Beibehaltung der zytotoxischen Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo herbeizuführen. Dies wird dadurch erzielt, daß die Zellinien unmittelbar vor ihrer Verwendung einer γ-Bestrahlung unterworfen werden. Die Zellen werden vorzugsweise mit 4000 rad unter Verwendung einer ¹³⁷Cs-Quelle bestrahlt.
Die Bestrahlung der TALL-104-Zellen liefert eine modifizierte zytotoxische Zellinie, die ihre Vermehrungsfähigkeit und damit die Möglichkeit auf unkontrollierte Weise im Empfängerorganismus zu wachsen, verloren hat. Tatsächlich wird durch die in SCID-Mäuse transplantierten modifizierten, γ-bestrahlten TALL-104-Zellen der vorliegenden Erfindung im Gegensatz zu ihren nicht bestrahlten Gegenstücken keine Leukämie ausgelöst. Die modifizierten TALL-104-Zellen werden vorzugsweise wie folgt hergestellt. TALL-104-Zellen (ATCC CRL 11386) werden in Gewebekultur in Gegenwart von rekombinantem humanem (rh-)IL-2 exponentiell angezogen. Falls gewünscht, kann für etwa 18 Std. IL-12 zugegeben werden, um die Killeraktivität der Zellinie zu verbessern. Die mit Zytokin behandelten TALL-104-Zellen werden dann vorzugsweise mit etwa 4000 rad γ-bestrahlt. Die Bestrahlung kann über einen ausgewählten Zeitraum, wie z. B. etwa 30 Minuten, fortgesetzt werden.
Wünschenswerterweise werden etwa 10⁴ bis etwa 10¹² und vurzugsweise etwa 10¹² der zur Verwendung in der Erfindung ausgewählten Zellen in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger suspendiert und täglich über die gewünschte Zeitdauer auf einem geeigneten Weg verabreicht. Ein besonders wünschenswerter Träger ist Kochsalzlösung. Es sind jedoch andere geeignete Träger dem Fachmann allgemein bekannt und können leicht ausgewählt werden.
Wie oben erörtert kann die Zelltherapie gleichzeitig mit der Chemotherapie stattfinden, kurz nach dem Ende des Chemotherapieschemas beginnen oder zu einem einzigen Therapieschema kombiniert werden. Als Alternative und zur Zeit weniger wünschenswert ist die Verabreichung der Zelltherapie vor der Chemotherapie. Gegenwärtig umfaßt die bevorzugte Ausführungsform die Verabreichung der Zelltherapie während der Chemotherapiekur und insbesondere nach Sättigung des Zielgewebes (d. h. des Tumors) mit dem Chemotherapeutikum. Somit wird die Zelltherapie wünschenswerterweise ein bis vier Tage nach Verabreichung des Chemotherapeutikums verabreicht. Die Verabreichung der – Zelltherapie wird nach Bedarf wiederholt.
Beispielsweise können Zellen (z. B. etwa 2 × 10⁷ Zytokinstimulierte TALL-104-Zellen) täglich über 2 Wochen gleichzeitig mit der Chemotherapie verabreicht werden. Als Alternative kann die Verabreichung der Zellen kurz nach Ende der Chemotherapie beginnen. Bei noch einer weiteren Alternative kann die Zelltherapie in unterschiedlichen Dosen, in unterschiedlichen Zeitabständen (im Gegensatz zur täglichen Verabreichung) oder über einen kürzeren oder längeren Zeitraum verabreicht werden.
Die Zelltherapie kann mittels Injektion, z. B. intravenös, oder mit einem beliebigen der oben in Zusammenhang mit Chemotherapie erörterten Mitteln verabreicht werden. Weder der Zeitpunkt noch die Art und Weise der Verabreichung stellt eine Einschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Wie bei der Chemotherapie können die Zelltherapieschemata leicht angepaßt werden, wobei solche Faktoren wie die Zytotoxizität der ausgewählten Zellinie, die Art des behandelten soliden Tumors, das Stadium der Erkrankung sowie der Zustand des Patienten unter anderen dem Fachmann bekannten Gesichtspunkten berücksichtigt werden.
Obwohl diese Behandlungen für sich allein das Tumorwachstum nicht hemmten, konnten bei Verfolgung des tierischen oder menschlichen Patienten synergistische Antitumorwirkungen beobachtet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Als Alternative zur oben beschriebenen getrennten Verabreichung der Chemotherapie und Zelltherapie, ermöglichen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen kombinierten Chemotherapie-Zelltherapie-Ansatz.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein gewünschtes Chemotherapeutikum oder Chemotherapeutika und eine gewünschte Zelle enthalten, wie hierin beschrieben. Diese Zusammensetzungen können weiterhin einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten. Zu den geeigneten Trägern gehören z. B. Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung sowie Kochsalzlösung mit 5% HSA oder PPF. Andere geeignete Träger sind dem Fachmann allgemein bekannt und stellen keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Analog kann der Fachmann leicht weitere gewünschte Bestandteile auswählen, um sie in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung einzuschließen, wobei solche Bestandteile keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung darstellen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten Adriamycin oder Cisplatin. sowie modifizierte TALL-104-Zellen, wie hierin definiert.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können über die Wege sowie gemäß den Schemata, wie sie für die Chemotherapie und/oder Zelltherapie oben beschrieben wurden, verabreicht werden. Alternativ lassen sich weitere geeignete Wege und Schemata vom Fachmann leich festlegen.
Die unten angegebenen Beispiele zeigen, daß die Kombination aus Chemotherapie (Adriamycin) und adoptiver Immuntherapie mit der von MHC unbeschränkten zytotoxischen T-Zellinie TALL-104 dahingehend wirksam war, daß dadurch die vollständige Resistenz eines in SCID-Mäusen transplantierten menschlichen Magentumors (MGC #1) gegenüber den Einzelbehandlungsformen überwunden werden konnte. Obwohl Adriamycin und Zytokin-stimulierte TALL-104-Zellen starke zytostatische Wirkungen gegenüber diesen Tumorzellen in vitro zeigten, deuteten die in-vivo-Experimente darauf hin, daß keines der Mittel allein signifikante Antitumorwirkungen im SCID-Mausmodell aufwies. Das Fehlen einer in-vivo-Aktivität könnte lediglich auf die verwendeten experimentellen Bedingungen zurückzuführen sein, wie z. B. der zwischen der Tumorimplantation und dem Beginn der Behandlung verstrichenen Zeit oder den Verabreichungsplan und -weg für Adriamycin und TALL-104-Zellen. Durch diese Bedingungen könnte die Anzahl der zum Ort des Tumors gewanderten und dort eingenisteten Effektorzellen ebenso wie die Absorption von Adriamycin negativ beeinflußt worden sein, was zu niedrigen Serumspiegeln dieses Arzneistoffs führte. Wurde die Chemotherapie und die Zelltherapie zusammen eingesetzt (in den gleichen Dosen sowie mit dem gleichen Verabreichungplan und -weg) wurde eine dramatische Tumorwirkung gegen MGC #1-Tumortransplantate beobachtet: insbesondere wies 1/3 der Tiere eine dauerhafte vollständige Reaktion (Nekrose und Ausfallen der Tumormassen) und 2/3 von ihnen untergingen eine klinische Reaktion, die zwar partiell und transient, jedoch, verglichen mit dem gezeigten vollständigen Fehlen von Antitumorwirkungen durch die Einzelbehandlungen im gleichen Experiment, signifikant war. Trotz der relativ niedrigen Anzahl der im Kombinationstherapieexperiment verwendeten Mäuse (n = 6) werden diese Ergebnisse als hochsignifikant angesehen, da spontane Nekrose und Regression der subkutanen Tumoren niemals zuvor beobachtet wurden und andererseits eine hohe Reproduzierbarkeit des Tumorwachstums in einer großen Anzahl von mit Implantaten versehenen Mäusen beobachtet wurde. Außerdem waren in der Kombinationstherapiegruppe die Standardabweichungen der Durchschnittstumorvolumen zu den verschiedenen Zeitpunkten immer sehr niedrig (2).
Aus den Antitumorwirkungen des erfindungsgemäßen Immunchemotherapieprotokolls lassen sich mehrere Rückschlüsse ziehen. Untersuchungen an immunkompetenten Mäusen mit syngenen Tumoren zeigten, daß durch die Kombination von adaptiv übertragenen T-Zellen und gewissen Chemotherapeutika (insbesondere Cyclophosphamiden) eine signifikante Anzahl an Tieren erfolgreich behandelt werden konnte und die Tumorregression vorwiegend durch T-Zellen vermittelt wurde [P. Greenberg et al, J. Exp. Med., 161 : 1122–1134 (1985); M. Bookman et al, J Immunol., 139 : 3166–3170 (1987); und F. Fornelle et al, Int. J Cancer, 42 : 952-957 (1988)]. Zur Unterstützung dieser Daten wurde in anderen Untersuchungen gezeigt, daß zusätzlich zur direkten Tumorzytotoxizität einige chemotherapeutische Arzneistoffe das Ansprechen des Wirtsimmunsystems modulieren können [M. Awwad et al, Immunology, 65 : 87–92 (1988) und R. North, J. Exp. Med., 155 : 1063–1074 (1982)]. Da die als Mausmodell in dieser Untersuchung verwendeten SCID-Mäuse praktisch keine funktionellen T- und B-Zellen besitzen [G. Bosma et al, Nature, 301 : 527 (1983)], sind die während und nach der Immunchemotherapie beobachteten Antitumorwirkungen unabhängig von der Immunantwort des Wirts und daher von den oben angegebenen verschieden [P. Greenberg et al, J. Exp. Med., 161 : 1122–1134 (1985); M. Bookman et al, J. Immunol., 139 : 3166–3170 (1987); und F. Fornelle et al, Int. J Cancer, 42 : 952–957 (1988)]. Diesbezüglich wird durch die Verwendung eines immungeschwächten Tiers zur Untersuchung der Antitumorwirkungen der Adriamycin-TALL-104-Zelltherapie in dieser Untersuchung die Rolle, die das Wirtsimmunsystem bei der Antwort auf den Immunchemotherapie-Kombinationsansatz spielt, ausgeschlossen. Andererseits stellt angesichts der Tatsache, daß die Mehrzahl menschlicher Neoplasmen nicht immunogen ist und daher keine signifikante T-Zellantwort in dem autochthonen Wirt hervorrufen kann, das einen menschlichen Tumor tragende SCID-Mausmodell ein sehr geeignetes und relevantes experimentelles System zum Austesten der direkten tumoriziden Wirkung neuer therapeutischer Anwendungen dar.
In-vitro-Experimente deuten auf eine additive antiproliferative Wirkung niedriger Dosen an Adriamycin und TALL-104-Zellen gegenüber MGC #1-Tumorzellen hin. Man darf annehmen, daß sich dieses Ergebnis in verbesserten Antitumorwirkungen bei einem in-vivo-Szenario äußert, in dem wahrscheinlich suboptimale Konzentrationen an Effektorzellen und/oder Arzneistoffen zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Behandlung am Ort des Tumors vorhanden sind. Diesbezüglich deuteten „Trafficking"-Experimente, bei denen mit ⁵¹Cr-markierte Zytokin-stimulierte TALL-104-Zellen in MGC #1-Tumoren tragenden SCID-Mäusen verwendet wurden, darauf hin, daß nur wenige der intraperitoneal transferierten Effektoren in Tumorgeweben akkumulierten (~ 4% der Gesamtanzahl verabreichter Zellen pro Gramm Tumorgewebe). Da die Einwanderung von Effektorzellen in die Tumormasse ein Schlüsselmerkmal für die erfolgreiche adaptive Therapie darstellt, könnten die synergistischen Antitumorwirkungen von Adriamycin und TALL-104-Zellen wenigstens teilweise die Folge einer erhöhten Akkumulation von TALL-104-Zellen am Ort des Tumors sein. Diese Hypothese wird durch die Ergebnisse von Kawata et al, Mol. Biother., 2 : 221–227 (1990) unterstützt, die eine zweifache Akkumulation von LAK-Zellen in Maustumoren nach einer Adriamycin-Injektion, möglicherweise als Folge eines Arzneistoff-induzierten Anstiegs der Tumorvaskularisierung, die wiederum die Einwanderung von Lymphozyten begünstigen würde, zeigen. Die bei anderen Systemen [J. Gold et al, J. Surg. Oncol., 58 : 212–221 (1995)] vorgeschlagene Möglichkeit, daß (vor den zytotoxischen Zellen verabreichtes) Adriamycin Oberflächenveränderungen auf dem Tumor induziert, wodurch dessen Empfindlichkeit gegenüber TALL-104-Zelllyse erhöht wird, erscheint unwahrscheinlich, da die in-vitro-Vorbehandlung von MGC #1-Tumorzellen mit unterschiedlichen Dosen an Adriamycin keine solche Wirkung ergab (nicht gezeigt).
Die Erfindung wird durch diese Beispiele erläutert. Insbesondere werden in den folgenden Beispielen Experimente dargestellt, in denen die kombinierten Wirkungen der Chemotherapie (Adriamycin) mit TALL-104-Zellen in mit einer menschlichen Tumorprobe, die gegenüber den Einzelbehandlungsformen vollständig resistent ist, transplantierten SCID-Mäusen getestet wurden. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung und schränken den Umfang der Erfindung nicht ein.
Beispiel 1 – Herstellung der Zellen
Die TALL-104-Zellinie wurde in IMDM (Gibco-BRL, Grand Island, NY), supplementiert mit 10% FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 100 U/ml rekombinantem humanem (rh-)IL-2 (Chiron, Emeryville, CA) in einem luftbefeuchteten Brutschrank mit 10% CO₂ bei 37°C gehalten. Die Zellinie wurde wiederholt hinsichtlich Mycoplasma-Kontamination unter Verwendung eines kommerziellen PCR-Kits überwacht (ATCC, Manasss, VA). Die TALL-104-Zellen wurden vor Gebrauch in vitro und in der adaptiven Therapie γ-bestrahlt (4000 rad).
Beispiel 2 – Implantation des Tumors
Gefrorene Tumorfragmente wurden durch Metallgitter hindurch zerkleinert und auf AccuPrep^TM-Lymphozytengradienten (Accurate Chemical, Westbury, NJ) zentrifugiert, um tote Zellen und Erythrozyten zu entfernen. Die an der Zwischenphase erhaltenen Magentumorzellen wurden in Komplettmedium resuspendiert und bei 37°C in einer luftbefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert.
Fünf- bis 6-Wochen-alte CB-17 SCID-Mäuse (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) wurden in einer keimfreien Umgebung in The Wistar Institute Animal Facility gehalten. Die Mäuse wurden subkutan (s. c.) mit metastatischen Pleuraergüssen (0,3 × 0,3-cm-Fragente) aus einem Patienten mit Magenkarzinom (MGC #1) transplantiert.
Nach der Implantation wuchs die Biopsieprobe als lokalisierte Tumormasse, die anschließend geerntet, zerschnitten und seriell in andere SCID-Mäuse passagiert wurde. Ein Teil der Tumore wurde in IMDM mit 40% FBS und 10% DMSO (Sigma) eingefroren. Trotz des hoch metastatischen Verhaltens dieses Tumors in dem ursprünglichen Patienten zeigten die transplantierten Tumorfragmente keine metastatischen Eigenschaften in der Maus.
Beispiel 3 – In-vitro-Empfindlichkeit von MGC #1-Zellen gegenüber zytotoxischen/zytostatischen Wirkungen von TALL-104-Zellen und Adriamycin
A. Zytotoxizitätsassays
Die TALL-104-Zellen wurden in vier unterschiedlichen Konzentrationen mit einer festen Anzahl (10⁴/Well) an ⁵¹Cr-markierten MGC #1-Zellen 18 Stunden inkubiert. Die prozentuale spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung wurde aus dem Mittelwert von drei Wiederholungsexperimenten berechnet [A. Cesano et al, Cancer Res., 56 : 3021 (1996)].
B. Zytokinproduktion
Die TALL-104-Zellen (2 × 10⁶/ml) wurden über Nacht bei 37°C mit MGC #1-Zellen in einem E : T-Verhältnis von 10 : 1 inkubiert. Das von den Zellen befreite Medium wurde geerntet, filtriert und auf die Anwesenheit von IFN-γ, TNF-α, TNF-β und GM-CSF unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits (Endogen, R & D, Boston, MA) wie beschrieben getestet [A. Cesano et al, Cancer Res., 56 : 3021 (1996)]. MGC #1-Zellkulturen, die 10 Tage allein inkubiert worden waren, wurden ebenfalls auf Zytokinproduktion getestet.
C. Proliferationsassays
Die zytostatischen Wirkungen der TALL-104-Zellen (in vier unterschiedlichen Konzentrationen) auf MGC #1-Zellen (10⁴/Well) wurden in 18-h-³HTdR-Einbauassays wie beschrieben getestet [A. Cesano et al, Cancer Res., 56 : 4444–4452 (1996)]. Bei den Experimenten, in denen die Wirkungen von Adriamycin (Pharmacia, Piscataway, NJ) gemessen wurde, wurden MGC #1-Zellen (10⁴/Well) 48 Stunden in Gegenwart und Abwesenheit dieses Arzneistoffs in Konzentrationen von 0,01 bis 100 μg/ml kultiviert, bevor sie mit ³H-TZdR gepulst wurden.
D. Ergebnisse
Die aus der Biopsieprobe des Patienten gewonnenen Magenkrebszellen waren gegenüber der Lyse durch bestrahlte TALL-104-Zellen vollkommen resistent, wie in einem 18stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay gemessen wurde, doch waren sie hochempfindlich gegenüber ihrer zytostatischen Aktivität (1A). Die Inkubation von bestrahlten TALL-104-Zellen mit MGC #1-Zellen führte ebenfalls zur Produktion signifikanter Konzentrationen an IFN-γ, TNF-α, TNF-β und GM-CSF (nicht gezeigt). Von allen auf antiproliferative Aktivität gegen MGC #1-Zellen in vitro getesteten chemotherapeutischen Arzneistoffen war Adriamycin der wirkungsvollste und konnte die Vermehrung der Tumorzellen um 75% bzw. 100% bei Dosen von 0,1 bzw. 1 μg/ml hemmen (1B).
Beispiel 4 – Wirkung chemotherapeutischer Arzneistoffe auf TALL-104-Zellfunktionen
Die Wirkung verschiedener Chemotherapeutika auf TALL-104-Zellen wurde untersucht. Die Zytotoxizität, Lymphokinproduktion und Vermehrung wurden wie in Beispiel 3 oben beschrieben unter Verwendung von 0,01 bis 100 μg/ml der in Tabelle 1 unten aufgeführten Arzneistoffe getestet.
Wie aus den in Tabelle 1 unten aufgeführten Ergebnissen ersichtlich ist, hatte Dacarbazin (ein nichtklassisches Alkylierungsmittel) keinen Einfluß auf die Zytotoxizität oder Lymphokinproduktion. Adriamycin (ein Antibiotikum), Steroide (Hormone) und Cisplatin (ein Alkylierungsmittel) hatten keinen Einfluß auf die Zytotoxizität und nur einen geringen Einfluß auf die Lymphokinproduktion in therapeutischen Konzentrationen.
Tabelle 1
Beispiel 5 – Antitumorwirkungen von TALL-104-Zellen in SCID-Mäusen
A. Behandlungsprotokolle
Alle Behandlungen wurden 3 Wochen nach Implantation der Tumorfragmente (außer wenn anders angegeben) begonnen, wenn ein signifikantes makroskopisches Wachstum der Tumoren erkennbar war. Jede Behandlungsgruppe bestand aus 4–6 Mäusen. Im ersten Experiment wurden Zytokinstimulierte, γ-bestrahlte TALL-104-Zellen (2 × 10⁷/Maus in 500 μl PBS) oder PBS allein über 2 Wochen täglich intraperitoneal verabreicht; in einem zweiten Experiment wurden 10⁷ Zellen/Maus in 100 μl PBS bzw. PBS allein intraläsional alle zwei Tage in insgesamt sechs Injektionen injiziert. In einem dritten Experiment wurde den Mäusen die primäre Tumormasse chirurgisch entfernt und anschließend entweder bestrahlte TALL-104-Zellen (2 × 10⁷/Maus) oder PBS allein täglich über 2 Wochen intraperitoneal injiziert.
Die Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen wurden auf ihre Signifikanz mit dem Student's t-Test für ungepaarte Daten getestet. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
B. Ergebnisse
Im ersten Satz von Experimenten wurden die TALL-104-Zellen jeden Tag über 2 Wochen intraperitoneal in SCID-Mäuse, die 3 Wochen zuvor mit MGC #1-Tumorfragmenten transplantiert worden waren, injiziert. 4 Wochen nach Beendigung der Therapie wurden alle (mit PBS injizierten) Kontrollen und Versuchsmäuse getötet. Es konnte kein signifikanter Gewichtsunterschied zwischen den Tumoren der behandelten Mäuse und dem Gewicht der Kontrollmäuse nachgewiesen werden (Tabelle 2).
Im zweiten Satz von Experimenten wurden MGC #1-Transplantate tragende Mäuse intraläsional mit den TALL-104-Zellen (bzw. PBS) alle zwei Tage mit insgesamt 6 Injektionen injiziert. Alle Mäuse wurden 1 Monat nach der letzten Injektion getötet und die Tumormassen entfernt und gewogen. Bei diesem Versuchsaufbau konnte ebenfalls kein signifikanter Gewichtsunterschied zwischen den Tumoren der behandelten Mäuse und den der Kontrolle nachgewiesen werden (Tabelle 2).
Danach wurde die Antitumorwirksamkeit der TALL-104-Zellen nach operativer Entfernung des primären Tumors, so daß eine klinische Umgebung geschaffen wurde, die der der „Minimal Residual Disease" in Krebspatienten ähnelt, bewertet. Aus Mäusen mit 3 Wochen alten MGC #1-Transplantaten, die hochmobil erschienen und weder an der Haut noch an der Bauchdecke hafteten, wurde der Tumor operativ herausgeschnitten, und die Tiere wurden dann einer TALL-104-Zelltherapie (bzw. PBS-Injektionen) gemäß der im ersten Experiment verwendeten Vorschrift unterzogen. Zum Zeitpunkt der Operation wogen die Tumoren 0,781 ± 0,112 g. Einen Monat nach der letzten Zellinjektion wurden alle Mäuse getötet und nekropsiert. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, hatte die TALL-104-Zellbehandlung keine signifikante Hemmwirkung auf das lokalisierte erneute Wachstum der Tumorzellen in den Mäusen; diese in-vivo-Daten stehen im Gegensatz zu den beobachteten, von den TALL-104-Zellen gegenüber MGC #1-Zellen in vitro gezeigten antiproliferativen Wirkungen (1A).
Tabelle 2 Wirkungen der Einzelbehandlung mit entweder TALL-104-Zellen oder Adriamycin auf das lokalisierte Wachstum von MGC #1-Tumortransplantaten
Beispiel 6 – Chemotherapie
Aufgrund der in-vitro-Beobachtung, daß MGC #1-Tumorzellen hochsensitiv gegenüber den zytotoxischen Wirkungen von Adriamycin waren (1B), wurde dieser Arzneistoff für die in-vivo-Untersuchung gewählt. Zwei Gruppen von MGC #1-Tumortransplantate tragenden Mäusen (n = 6) wurden mit zwei i. p.-Injektionen von Adriamycin (30 mg/m² im Abstand von 1 Woche) bzw. mit PBS behandelt. Die einen Monat nach der letzten Injektion durchgeführte Autopsie ergab keine signifikanten Unterschiede in den Tumorgewichten zwischen den Kontrollen und den mit Adriamycin behandelten Mäusen (Tabelle 2).
Beispiel 7 – Immunchemotherapie
Als Versuch, die von MGC #1-Tumortransplantaten gezeigte hohe Resistenz gegenüber der Behandlung mit entweder Chemotherapie oder adaptiver Therapie zu überwinden, wurde ein Kombinationsschema auf Grundlage der aufeinanderfolgenden Verabreichung von zwei Zyklen Adriamycin und anschließend TALL-104-Zellen hinsichtlich der therapeutischen Wirksamkeit in MGC #1-Tumortransplantate tragenden SCID-Mäusen (n = 6) getestet. Im letzten Experiment erhielten die Mäuse zwei i. p.-Dosen Adriamycin (Tag 1 und 7) und die Zytokin-stimulierten, γ-bestrahlten TALL-104-Zellen (2 × 10⁷/Maus) von Tag 2 bis 6 und von Tag 8 bis 14. Die Kontrollgruppen (n = 4) erhielten PBS, Adriamycin bzw. TALL-104-Zellen jeweils allein. Die Tumormassen wurden vor der Therapie und danach in wöchentlichen Zeitabständen über den gesamten 5wöchigen Zeitraum der Nachuntersuchung (unter Verwendung einer Millimeter-Schieblehre) vermessen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 2 zusammengefaßt. Nach der ersten Behandlungswoche konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den durchschnittlichen Tumorgrößen in den unterschiedlichen Gruppen von Mäusen festgestellt werden. Doch zeigten bemerkenswerterweise zwei Mäuse, die die Kombinationstherapie erhalten hatten, eine makroskopisch auffällige Tumornekrose am Ende der ersten Behandlungswoche; die Nekrose setzte sich bis zum Ausfallen der Tumormasse bei beiden Mäuse fort, wodurch eine nekrotische Narbe während der zweiten Woche der Nachuntersuchung zurückblieb. Aus diesem Grund sind die auf die Tumormessung in diesen zwei Mäusen bezogenen Werte nicht in 2 gezeigt und konnten in keiner, nach der zweiten Nachuntersuchungswoche durchgeführten statistischen Berechnung eingeschlossen werden. Am Ende der zweiten Behandlungswoche waren die Tumoren der vier verbliebenen mit Adriamycin und den TALL-104-Zellen behandelten Tiere deutlich kleiner im Vergleich zu den auf den mit PBS- bzw. Adriamycin-behandelten Mäusen vorhandenen Tumoren (p < 0,05 bzw. p < 0,002). Im Gegensatz dazu wurde zu diesem Zeitpunkt kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den mit Adriamycin und TALL-104-Zellen behandelten Mäusen und der Gruppe von Mäusen, die nur die TALL-104-Zellen erhalten hatten, beobachtet. Tatsächlich wurde in beiden Gruppen eine diskrete Schrumpfung (36% bzw. 20%) der Tumorgröße festgestellt. Die Tumorverkleinerung war bereits am Ende von Woche 1 nachweisbar (jedoch nicht statistisch signifikant). Vom Ende von Woche 3 an (1 Woche nach Einstellung aller Behandlungen) setzte sich das Tumorwachstum in allen anderen Gruppen von Mäusen, einschließlich der Gruppe, die nur TALL-104-Zellen allein erhalten hatte, fort, während sich die Tumorschrumpfung in der Gruppe von Mäusen, die die Kombinationstherapie erhalten hatte, stabilisierte (~36%). Daher war der Unterschied im Tumorvolumen zwischen mit Adriamycin und TALL-104-Zellen behandelten Tieren und den Tieren, die entweder PBS, Adriamycin oder TRLL-104-Zellen allein erhalten hatten, statistisch signifikant (p < 0,02, p < 0,001 bzw. p < 0,05). Ähnlich Ergebnisse wurden am Ende der vierten Woche beobachtet. Zum Ende der fünften Woche vergrößerte sich das Tumorvolumen in den mit TALL-104-Zellen allein behandelten Mäusen so weit, daß es sehr nahe bei dem in PBS- oder Adriamycin-behandelten Mäusen beobachteten lag. Diese Daten zeigten, daß TALL-104-Zellen für sich allein zwar Antitumoraktivität gegenüber MGC #1-Tumorwachstum während der ersten 2 Behandlungswochen zeigten, daß diese Wirkungen jedoch transient waren und die Tumoren sich schnell weiterentwickelten, sobald die Zellinjektionen eingestellt wurden. Die drei Kontrollgruppen wurden am Ende von Woche 5 aufgrund der hohen Tumorlast (mit etwa dem 3fachen Volumen des in mit dem Kombinationsschema behandelten Mäusen beobachteten Tumors) getötet. Die mit Adriamycin und TALL-104-Zellen behandelten Mäuse wurden noch 4 weitere Wochen einer Nachuntersuchung unterzogen: während dieser Zeit wuchsen die Tumoren langsam doch stetig und erreichten am Ende von Woche 9 die Größe der von der Gruppe von Mäusen, die nur mit TALL-104-Zellen behandelt worden waren, in Woche 5 gezeigten Tumoren. An diesem Punkt wurde das Experiment beendet.

Claims

Verwendung von TALL-104-Zellen, die in vitro durch Behandlung mit IL-2 zur Verbesserung ihrer nicht MHC-beschränkten Zytotoxizität und durch Bestrahlung mit einer für die irreversible Hemmung der Vermehrung dieser Zellen geeigneten, jedoch nicht die zytotoxische Aktivität der Zellen in Kombinatien mit einem Chemotherapeutikum, ausgewählt aus Adriamycin und Cisplatin, störenden Dosis modifiziert worden sind, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Krebsbehandlung in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die TALL-104-Zellen während der Behandlung mit dem Chemotherapeutikum von dem Arzneimittel bereitgestellt werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die TALL-104-Zellen nach der Behandlung mit dem Chemotherapeutikum von dem Arzneimittel bereitgestellt werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Chemotherapeutikum um Adriamycin handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Chemotherapeutikum um Cisplatin handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um einen resistenten Tumor in einem Säuger handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (a) ein Chemotherapeutikum, ausgewählt aus Adriamycin und Cisplatin, (b) TALL-104-Zellen, die in vitro durch Behandlung mit IL-2 zur Verbesserung ihrer nicht MHC-beschränkten Zytotoxizität und durch Bestrahlung mit einer für die irreversible Hemmung der Vermehrung dieser Zellen geeigneten, jedoch nicht die zytotoxische Aktivität der Zellen störenden Dosis modifiziert worden sind, und gegebenenfalls (c) einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.