DE69718358T2

DE69718358T2 - Verfahren für die Herstellung eines verbesserten Strukturaufbaus von Backwaren

Info

Publication number: DE69718358T2
Application number: DE69718358T
Authority: DE
Inventors: Filip Remi Jules Arnaut; Christian Emile Florius G. Renard; Pierre Patrick Aldo Tossut; Eric Jerome Vandamme; Nicole Melanie Francine Vekemans
Original assignee: Puratos NV
Current assignee: Puratos NV
Priority date: 1996-02-15
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2017-02-15
Also published as: DK0790003T3; EP0790003B1; US20030039722A1; DE69718358D1; EP0790003A1; US6627235B2; CA2197730C; ATE230931T1; US6399119B1; CA2197730A1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines verbesserten Strukturaufbaus von Backwaren sowie von neuen Dextranen und von neuen Mikroorganismen, welche dieselben erzeugen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Teig- und Backprodukte, welche diese Dextrane enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Die rheologischen Eigenschaften eines Teiges sind bestimmend für die Qualität des gebackenen Endproduktes. Um die Qualität von Brot und von gebackenen Produkten im Allgemeinen abzuschätzen, bedient man sich der folgenden hier aufgelisteten Parameter: Volumen, Weichheit der Krümelstruktur und Lebensdauer im Regal, Farbe des Krümels und der Kruste, Mehl und Form (rund, flach).
Sogenannte Brotverbesserer werden verwendet, um die rheologischen Eigenschaften des Teiges anzuheben und um demzufolge ein besseres gebackenes Endprodukt zu erhalten. Für diesen Zweck werden chemische Wirkstoffe verwendet, wie: Kaliumbromat, Ascorbinsäure, Iodate, Azodicarbonamid, Zystein. Emulgatoren werden ebenfalls verwendet, etwa: Diacetyltartarsäureester, Natrium- und Kalziumstearoyllactylat und Sucroseester, wenn dies notwendig ist.
Auch einige Enzyme verbessern die Eigenschaften des Teiges. Die Verwendung von α-Amylasen und Xylanasen ist jetzt weit verbreitet. Es gibt auch Oxidasen und Peroxidasen, die einen marginalen, verbessernden Einfluss auf die Rheologie des Teiges haben, aber dies ist nicht immer gleichbedeutend mit einem besseren Endprodukt.
Die Verwendung von Polysacchariden als Brotverbesserer ist bekannt und dokumentiert. Der positive Effekt auf die Rheologie des Teiges und auf die gesamte Qualität des Brotes ist immer auf bestimmte Fälle oder auf Kombinationen mit anderen Additiven oder Ingredienzien begrenzt. In den meisten Fällen wird Guargummi verwendet oder Johannisbrotkernmehl und, wenn dies notwendig ist, Carrageenan oder Alginate (Ward F., 1993).
In der Praxis geht es immer über eine Kombination von mehreren der oben erwähnten Komponenten über welche man einen wirtschaftlichen Brotverbesserer schafft. Die Formulierung von solch einem Brotverbesserer wird entsprechend dem Typ des Endproduktes angepasst, entweder Brot, Brötchen oder "belgische Pistolette", "französiche Baguette", oder entsprechend dem zum Einsatz gebrachten Verfahren: direkte Verarbeitung, verzögerte Fermentation, tief gefrorener Teig.
Obwohl die möglichen Kombinationen endlos sind, ist es klar, dass die gegenwärtigen Additive und Ingredienzien nicht immer den strikten Anforderungen der modernen Backtechnologie genügen. Darüber hinaus wird der Einsatz von bestimmten Additiven durch das Gesetz begrenzt oder verboten. Zum Beispiel ist die Verwendung von Bromat in Europa verboten, wohingegen dieselbe in den U.S. auf einer freiwilligen Basis begrenzt wird. Neue Ingredienzien, die bestehende chemische Additive ersetzen können, oder die eine neue Funktion neben den gegenwärtig existierenden Additiven ausüben, werden noch immer gesucht. Insbesondere wenn sie auf Naturprodukten beruhen.
Die oben erwähnten Ingredienzien und die Additive für Brot und für Brötchen werden auch in Backwaren verwendet (Kuchen, Biskuit). In diesen Backwaren ist das Volumen des gebackenen Endproduktes auch eines der Qualitätskriterien außer, unter anderen Kriterien, der Weichheit und der Lebensdauer im Regal.

Stand der Technik

Die Verwendung von Dextranen auf dem Gebiet des Backens ist nicht weit verbreitet, obwohl eine Anzahl von Anwendungen beschrieben worden sind. Die Zugabe von Dextranen zu Weizenteigen und der negative Einfluss dieser Zugabe auf die Endqualität des gebackenen Brotes ist bekannt (Ross A. S. et al., J. Sci. Food Agric. 1992, 91-98; Ross A. S.: PhD Thesis, University of New South Wales (Australia), 1994 (XP000610156) & Dissertation Abstracts International, part 56, Nr. 7, p. 3524, 1996)
Auf der anderen Seite hat die Japanische Patentanmeldung JP-07055124B2 den positiven Einfluss der Dextrane auf die Weichheit und auf die Regallebensdauer von Backprodukten bewiesen. Zusätzlich scheinen Dextrane einen geringen Einfluss auf die Kraft des Ausströmens von Gas durch Hefe zu besitzen. Dieser Einfluss ist vergleichbar mit dem von anderen Komponenten, wie Johannisbrotkernmehl, arabisches Gummi, Eiweiß, Gelatine (Kolostori M., Elelmezesi Ipar 1978, 32 (3), 107-112).
Das U.S. Patent 2,983,613 beschreibt die Einbindung einer Menge an Dextranen in den Teig, die ausreicht um den Gluteninhalt des Teiges zu erweichen und um das spezifische Volumen des resultierenden Backproduktes zu erhöhen. Dieses Dokument beschreibt, dass das Brot, das Dextrane enthält, in dem Volumen etwa 20% größer wird als Produkte, die keine Dextrane enthalten.
Die besagten Dextrane werden durch Züchten des Mikroorganismus Leuconostoc Mesenteroides B512 hergestellt, was zu Dextranen mit einem Molekulargewicht von etwa 2 · 10&sup6; bis zu etwa 4 · 10&sup6; Dalton führt.
Dextrane sind in dem Dokument EP-0153013-A beschrieben worden als Quellmittel in Formulierungen, die für die enterale Verabreichung bei den Menschen geeignet sind. Dies geschieht hauptsächlich aus Gründen der Diät (wenig Kalorien) und für die Behandlung einer Störung des Magen- Darm-Traktes bei einem Menschen.
Dextrane kennen mittels Bakterien synthetisiert werden. Dextrane sind α-D-Glucane, die hauptsächlich zusammengesetzt sind aus (1-6) verbundenen α-D-Glucopyranosylresten. Sie werden hauptsächlich durch Bakterien erzeugt, die auf einem Substrat aufwachsen, wobei die einzige Quelle für Kohlenstoff in Sucrose besteht. Diese Bakterien gehören im Wesentlichen zu der Gruppe der Milchsäurebakterien und noch spezifischer gesehen zu der Spezies des Lactobacillus, Leuconostoc und Streptococcus. Beispiele von den Herstellern von Dextranen können in der unten stehenden Tabelle gefunden werden:
Gereinigte Dextrane werden im allgemeinen durch eine Deproteinierung Von Polysacchariden erhalten, die aus den Fermentationsfluiden isoliert werden.
Eine weitere Reinigung wird durch fraktioniertes Niederschlagen mit Alkohol oder mit Ketonen erzielt.
Dextrane, die ein wohl definiertes Molekulargewicht aufweisen, werden durch eine partielle Hydrolyse erzielt.
Die Struktur (wie die Länge der Kette, die Verzweigungsgrad, der Typ der Verbindungen) der Dextrane wird im wesentlichen durch die Unterarten der Bakterien und weniger durch die Familie, die Gattung oder die Spezies bestimmt. Einige der Bakterien erzeugen lösliche und unlösliche Dextrane zur selben Zeit.
Die Grundstruktur der Dextrane besteht aus (1-6) verbundenen α-D-Glucopyranosylresten. Manchmal gibt es Verzweigungen bei C-2, C-3 oder bei C-4. Isolierte (1-3) verbundene α-D-Glucopyranosylreste oder Sequenzen von diesen Resten können die (1-6) Gebiete unterbrechen. Alle diese Dextrane sind mehr oder weniger verzweigt und die Verzweigung hängt sehr stark von den Unterarten ab (Jeans A. et al., J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 5041-5052). Die meisten der Verzweigungen sind aus einzelnen α-D- Glucopyranosylresten zusammengesetzt, obwohl man Verzweigungen mit 2-50 Monomeren gefunden hat. Einige Verzweigungen werden durch (1-3) verbundene α-D- Glucopyranosylreste gebildet.
Alternan ist zusammengesetzt aus Glukoseeinheiten, welche alternierend α (1-6) verbunden und α (1-3) verbunden sind. Unter anderen wird es durch den Leuconostoc Mesenteroides NRRL B-1355 erzeugt.
Lösliche Dextrane sind aus Sequenzen von (1-6) verbundenen α-D-Glucopyranosylresten zusammengesetzt, auf denen in unregelmäßigen Abständen Verzweigungen von einzelnen α-D-Glucopyranosylresten ersetzt werden.
Unlösliche Dextrane sind stärker komplex und sie enthalten häufig mehr (1-3) verbundene α-D- Glucopyranosylsequenzen.
Dextrane werden durch Dextransucrase (E.C. 2.4.1.5) synthetisiert. Der IUPAC Name läutet Sucrose: 1,6-α-D- Glucan-6-α-D-Glucosyltransferase (IUB, 1984). Das Enzym ist äußerst häufig extrazellulär und es wird durch Sucrose induziert. Das pH-Optimum für Leuconostoc Dextransucrase liegt zwischen pH 5,0 und pH 5,5 bei der Temperatur von 29- 34ºC.
Ein Verfahren für die Herstellung und für die Isolierung von Dextransucrase der Leuconostoc Mesenteroiden wird von Ajongwen N. J. (Biotechnol. Lett., 1993, 9 (4), 243- 248) beschrieben.
Dextrane können auch mit Hilfe von Dextrindextranase (E.C. 2.4.1.2) von zum Beispiel Acetobacter capsulatus ATCC 11894 Kazuya Yamamoto (Biosci., Biotech, Biochem. 1993, 57(9), 1450-1453) synthetisiert werden.
Die Kettenlänge der Dextrane hängt von den Bedingungen der Fermentation ab. Dies bedeutet, dass die Anwesenheit von Akzeptoren, wie etwa Maltose, das Molekulargewicht beeinflussen wird.
Dextrane bilden viskose Lösungen. Diese Lösungen zeigen ein Newtonsches Verhalten bei Konzentrationen von < 30% Gew./Gew. bei den Dextranen mit einem niedrigen Molekulargewicht. Dextrane mit einem höheren Molekulargewicht zeigen ein schwach pseudoplastisches Verhalten bei Konzentrationen von > 1,5% Gew./Gew. (McCurdy R. D., 1994). Es gibt keine einzelnen Korrelationen zwischen der Viskosität von Lösungen der Dextrane und deren Verzweigungen. Der die Viskosität vergrößernde Effekt beruht auf einer Kombination der Struktur (mehr oder weniger verzweigt) und, des Molekulargewichtes (Jeanes A. et al., J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 5041-5052).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines verbesserten Strukturaufbaus von Backwaren, welches den Schritt umfasst, in einen Teig eine ausreichende Menge an Exopolysacchariden einzubinden, wobei die besagten Exopolysaccharide in einer Lösung eine Zunahme der Viskosität (wenn sie einer konstanten Beanspruchung ausgesetzt sind) mit der Zeit ergeben und wobei sie danach ein Aufrechterhalten der erzielten Viskosität zeigen. Vorzugsweise liegt die besagte Zunahme der Viskosität höher als 0,4 · 10&supmin;³ Pas, vorzugsweise höher als 0,8 · 10&supmin;³ Pas nach 5.000 Sekunden für eine 1%-ige Lösung, bezogen auf das Gewicht der Exopolysaccharide unter einer Beanspruchung von 0,5 Pa. Daher stellten die Erfinder fest, dass die Exopolysaccharide in überraschender Weise in der Lage sind, eine beträchtliche Zunahme des spezifischen Volumens eines Backproduktes zu verursachen. Vorteilhaft ist wenn die besagten Exopolysaccharide, vorzugsweise Dextrane, aus Bakterien gewonnen werden, die zu der Gruppe der Milchsäurebakterien gehören. Hauptsächlich Dextrane mit einem hohen Molekulargewicht (> 2 · 10&sup6; Dalton) und einer geringen Verzweigung scheinen den am deutlichsten ausgeprägten Effekt zu besitzen. In vielen Fällen geben solche Dextrane auch sehr viskose Lösungen. Der Effekt ist nicht nur auf die Viskosität als solche zurückzuführen, denn Xanthan besitzt nicht denselben Effekt und es bildet noch sehr viskose Lösungen. Guar gibt auch viskose Lösungen und hat einen schlechten und begrenzten Effekt auf das Brotvolumen. Schwach verzweigte Dextrane mit einer geringen Viskosität, aber mit einem hohen Molekulargewicht, sind auch getestet worden. Der positive Effekt der Dextrane der Unterspezies der Leuconostoc Mesenterciden, insbesondere der Stamm LMGP-16878 (hier weiter unten P-171 genannt), ist meistens betont (p-171). Die Dextrane sind vorzugsweise aus linearen Ketten mit einem hohen Molekulargewicht zusammengesetzt. Dextrane mit einem hohen Molekulargewicht und mehr Verzweigungen sind weniger wirksam, wie von den Dextranen des Lactobacillus Sanfrancisco P-172 und des Leuconostoc Mesenteroides B512F bewiesen worden ist, wie weiter unten beschrieben wird. Das Molekulargewicht und der Verzweigungsgrad hängen von den Unterarten und von den Bedingungen der Fermentation (Sucrosekonzentration, Temperatur) ab.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue Dextrane, die 2 · 10&sup6; Dalton übersteigen und die einen Verzweigungsgrad von weniger als 5% aufweisen. Vorzugsweise sind die besagten Dextrane auch durch die 1H-NMR-Spektren gekennzeichnet, wie sie in der beiliegenden Fig. 2 dargestellt sind. Vorzugsweise werden die Dextrane lyophilisiert. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der die Dextrane gemäss der Erfindung produziert und der vorzugsweise die Hinterlegungsnummer LMGP-16878 besitzt. Ein letzter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den Teig und die gebackenen Nahrungsmittelprodukte, die Dextrane gemäss der Erfindung enthalten, wie etwa Brot, "belgische Pistoletten", tief gefrorener Teig, Kuchen, Biskuitkuchen usw.
Die. Unterart des Leuconostoc Mesenteroides gemäss der Erfindung würde unter dem Budapester Vertrag in der Belgischen Koordinierten Sammlung von Mikroorganismen (Belgian Coordinated Collection of Microcrganisms) (BCCM) unter der Nummer LMGP-16878 angemeldet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt das 1 H-NMR-Spektrum der Dextranfraktion "B512F" dar
Fig. 2 stellt das 1 H-NMR-Spektrum der Dextranfraktion "P171" dar
Fig. 3 stellt das 1 H-NMR-Spektrum der Dextranfraktion "P172" dar
Fig. 4 stellt das Viskositätsprofil der Dextranfraktion "B512F" dar
Fig. 5 stellt das Viskositätsprofil der Dextranfraktion "P171" dar
Fig. 6 stellt das Viskositätsprofil der Dextranfraktion "P172" dar
Fig. 7 stellt das Viskositätsprofil der Dextranfraktion "P171" mit 36000 Unterbrechungen dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung

1. Kennzeichnung der Struktur der Dextrane der Spezies Leuconostoc Mesenteroides durch die magnetische Protonnuklear Resonanzspektroskopie (1H-NMR).

Dextranfraktionen wurden aus den Unterarten von Leuconostoc Mesenteroides NRRL B512F, Leuconostoc Mesenteroides P-171 (in der BCCM zu finden unter der Nummer LMGP-16878) und Lactobacillus Sanfrancisco P-172 gewonnen. Dextran wurde unter Verwendung der Verfahren isoliert, die einem Experten auf diesem Gebiet wohl bekannt sind und die weiter unten beschrieben werden. Die 1H-NMR Spektren der gewonnenen Dextranfraktion wurden auf einer Bruker AM-300 (300 MHz) Maschine bei der Temperatur von 85ºC registriert. Die Proben wurden vorher in D&sub2;O (1 mg/ml) aufgelöst, lyophilisiert und erneut aufgelöst in D&sub2;O. Aceton wurde als ein Standard verwendet (2,23 ppm).
Die 1-NHMR Spektren der Dextranfraktionen B512F, p-171 und p-172 sind in den beiliegenden Fig. 1 bis 3 dargestellt.
Für die drei Dextranproben wurde ein eindeutig ausgeprägtes Dublett in dem anomerischen Bereich bei δ4,99 und δ4,97 ppm nachgewiesen. Pasika W.M. und Gragg L.H. (Canadian Journal of Chemistry, 1962, 41, 293-299) ordnen das Dublett mit der größten Intensität und δ5,05 ppm in dem Spektrum des linearen Dextran NRRL B-512F den anomerischen Protonen der α (1-6) verbundenen Glucosemonomeren zu. Dextran NRRL B-512F ist zu 95% aus α (1-6) verbundenen und zu 5% aus α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren zusammengesetzt (Robyt, J. F., 1992, Developments in carbohydrate chemistry, ed. Alexander R. J. AACC St. Paul, Minnesota, 55121-2097, USA). Anomerische Protonen der α (1- 3) verbundenen Glucosemonomeren können von Pasika und Gragg (1962) nicht mit Hilfe eines 60 MHz Spektrometers nachgewiesen werden. Gemäss diesen Autoren sind die anomerischen Protonen der α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren in dem Spektrum der verzweigten Dextrane B- 742 durch eine Resonanz bei δ5,40 ppm gekennzeichnet. Robyt (1992) berichtet über das Vorhandensein von 50% der α (1-6) verbundenen und 50% der α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren für diese verzweigten Dextrane des Leuconostoc Mesenteroides B-742. In dem Spektrum der verzweigten Dextrane finden Pasika und Gragg (1962) zwei zusätzliche Resonanzen bei δ5,29 ppm und δ4,67 ppm heraus. Die Autoren ordnen diese Resonanzspitzen jeweils der α- und der β-Konfiguration der anomerischen. Protonen der reduzierenden Enden der Dextranpolymere zu. Für lineare Dextrane ist die Konzertration der anomerischen Protonen kleiner als die Nachweisgrenze des Spektrometers.
Seymour et al (Carbohydrate Research, 1979, 74, 77-92) beschreiben die 1H-NMR Spektren, die mit einem 100 MHz Spektrometer bei 90ºC registriert worden sind, von den Dextranfraktionen der NRRL Unterarten der Leuconostoc Mesenteroiden B-742, B-1299, B-1355 und B-1501, als auch von den nativen Dextranen der L. Mesenteroiden B-1142, B-1191, B-1402. Auf der Grundlage dieser Spektren ordnen die Autoren die Resonanz mit δ4,93-4,87 ppm den anomerischen Protonen der erweiterten Kette mit den (1-6) verbundenen Glucosemonomeren zu. Resonanzspitzen bei δ5,03-5,08 ppm werden den anomerischen Protonen der 2,6-Di-O-substituierten α-D-Glucopyranosylreste zugeordnet, während die Spitzen mit δ5,22-5,27 ppm den anomerischen Protonen der 3,6- und 4,6- Di-O-substituierten α-D-Glucopyranosylreste zugeordnet werden. Auf der Grundlage dieser Daten und des 1H-NMR Spektrums der Probe mit Dextranen B-512F wurde es möglich, das Dublett mit δ5,31-5,30 ppm, das in den Spektren der drei Dextranproben vorhanden ist, den anomerischen Protonen von den α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren zuzuordnen. Die kleinen Unterschiede in den gemessenen Deltawerten können durch eine niedrigere Temperatur erklärt werden, bei welcher die Spektren aufgenommen worden sind. Seymour et al. haben in der Tat gezeigt, dass eine Verminderung der Temperatur, bei welcher das Spektrum aufgenommen wird, eine kleine Verschiebung in Richtung auf die höheren ppm-Werte verursacht. Bei einem Vergleich der Intensitäten der Resonanzspitzer mit δ4,98-4,97 und δ5,31-5,30 ppm in dem Spektrum der Fraktion der Dextrane, die aus dem Leuconostoc Mesenteroides B-512F herstammen, stellen die Erfinder 94% an α (1-6) verbundenen Glucosemonomeren und 6% an α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren fest.
Meyer und Lamberts (Carbohydrate Research, 1978, 66, 33-42) unterscheiden Dubletten anomerischer Protonen von homogenen und von heterogenen α (1-6) verbundenen und α (1- 3) verbundenen Glucosemonomeren in den 1H-NMR Spektren des Dextranmutanten Streptococcus. Die Spektren wurden bei der Temperatur von 80ºC in einer 9 : 1 Me&sub2;SO-d6-D&sub2;O Mischung registriert. Aus diesem Grund ist es schwierig, diese Spektren mit jenen zu vergleichen, die in D&sub2;O aufgenommen worden sind.
In der Zone der Nicht α (1-6) Resonanzen des bei 270 MHz registrierten Spektrums bemerken Meyer und Lamberts zwei Dubletts bei δ5,00 und δ5,09 ppm. Diese werden jeweils den anomerischen Protonen der heterogenen und der homogenen α (1-3) verbundenen Glucosereste zugeordnet. Die Autoren stellen auch eine größere Resonanz mit δ4,75 ppm in der Zone der α (1-6) Resonanzen, verursacht durch anomerische Protone der homogenen α (1-6) verbundenen, die Kette verlängernden Glucosemonomeren fest, sowie eine Schulter von heterogenen α (1-6) verbundenen Glucoseresten.
Diese Schulter kann auch in dem bei 300 MHz aufgenommenen 1H-NMR Spektrum der Dextranfraktion B-512F nachgewiesen werden. Gemäss den Daten von Meyer und Lamberts (1978) und gemäss der bekannten Zusammensetzung dieser Dextranfraktion ist es möglich, diese Schulter den 6% an α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren zuzuordnen. In der Zone von den α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren stellen die Erfindet ein Dublett mit einer schmalen Schulter bei leicht höheren ppm-Werten fest. Dies weist hin auf die Anwesenheit eines überwiegend heterogenen α (1-3) verbundenen Glucoserestes, weicher der Struktur der Dextrane entspricht, die von dem Leuconostoc Mesenteroides 512F herstammen, wie von Robyt (1992) beschrieben.
Als eine Schlussfolgerung aus der vorhergehenden Analyse können wir die Resonanzen, die bei δ4,98-4,97 ppm und bei δ5,32-5,30 ppm in den Spektren der Dextranfraktionen B-512F und 41729 festgestellt worden sind, den anomerischen Protonen von den jeweiligen homogenen α (1-6) verbundenen und heterogenen α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren zuordnen. Entsprechend können wir die Resonanzen, die bei δ4,98-4,97 ppm und bei δ5,30 ppm in dem Spektrum der Dextranfraktion 'P172' festgestellt worden sind, jeweils den α (1-6) verbundenen und α (1-3) verbundenen Glucosemonomeren zuordnen. Es ist möglich, dass die Zwischenresonanzen aus den anomerischen Protonen von den α (1-2) verbundenen Glucoseresten herstammen (siehe Tabelle I). Tabelle 1

2. Zusammensetzung der Monosaccharide

Polysaccharide (mehr oder weniger 5 mg) wurden einer Prehydrolyse während einer Stunde mit H&sub2;SO&sub4; 12 M (250 ul) bei Raumtemperatur unterzogen und nach einer Verdünnung auf H&sub2;SO&sub4; 1 M wurde das Verfahren der Hydrolyse während einer Dauer von drei Stunden in einem Bad mit kochendem Wasser fortgesetzt.
Die Monosaccharide, die gebildet wurden, werden abgeleitet zu Alditol-Acetaten: 1100 ml einer internen Standardlösung von 10 mg Allose in 100 ml einer 1 : 1 verdünnten gesättigten Benzoesäurelösung wurde zu dem hydrolisierten Substrat hinzugefügt.
Die Reagenzgläser wurden in Eiswasser gekühlt und 1 ml von 25% NH&sub3; wurde hinzugefügt. Ein Tropfen 2-Octanol wurde hinzugefügt, um ein übertriebenes Aufschäumen zu vermeiden, und 200 ul einer Lösung von Natriumborhydrid in NH&sub3; 2 N wurde ebenfalls hinzugefügt.
Während 30 Minuten wurden die Reagenzgläser in einem Wasserbad bei der Temperatur von 40ºC inkubiert.
400 ul von Eisessig wurden zu den Lösungen hinzugefügt. Die Reagenzgläser wurden gut geschüttelt (Wirbel). Ein Teil der resultierenden Mischung (500 ul) wurde auf ein anderes Reagenzglas (50 ml) übertragen und mit 500 ul 1- Methylimidazol und 5,0 ml Essigsäureanhydrid gemischt. Den Mischungen wurde erlaubt für eine Dauer von 10 Minuten in Ruhe zu verweilen. Ethanol (900 ul) wurde hinzugefügt und den Mischungen wurde erlaubt wieder für eine Dauer von weiteren 5 Minuten in Ruhe zu verweilen. Nach der Hinzugabe Von 500 ul einer Bromphenolblaulösung (0,04%) wurden die Reagenzgläser in Eiswasser gestellt und 5,0 ml einer 7,5 M KOH-Lösung wurden hinzugefügt. Nach 5 Minuten wurde eine neue 5,0 ml KOH-Lösung (7,5 M) hinzugefügt und die Reagenzgläser wurden geschüttelt, indem man sie nach unten und nach oben drehte. Nach einer Phasentrennung wurde die farblose, organische Phase mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und die Alditolacetate, die vorhanden waren, wurden bei 225ºC auf einer Supelco SP-2380 Säule (30 m, 0,32 mm ID, 0,20 um Filmdicke) getrennt mit Hilfe eines Chrompack Gaschromatographen Model CP9001 und mit einem Flammenionisationsdetektor Model 901A. Spitzenflächeh wurden mit einem HP3396 Series 20 II Integrator berechnet.
Die folgende Tabelle II stellt die Zusammensetzung der Monosaccharide der Dextranfraktion "P171" dar.

Tabelle II

Probe P171
Arabinose (%) 0,00
Xylose (%) 0,00
Mannose (%) 2,54
Galactose (%) 0,04
Glucose (%) 97,42
Die Mannose ist ein Artefakt des Analyseverfahrens.

3. Verteilung des Molekulargewichtes auf Sephacryl

Die Verteilung des Molekulargewichtes von Dextranlösungen 10 mg/10 ml 0,3% NaCl wurde durch eine Gelpermeationschromatographie auf einer Sephacryl S-500 HR Säule (Pharmacia, Dextrantrennkapazität von 40 bis 20.000 kDa, I · 2,5 cm, Fluss = 2,5 ml/Minute) definiert. Fraktionen von 2,5 ml/Minute wurden gesammelt und 1 ml einer jeden Fraktion wurde auf dem gesamten Carbohydratinhalt analysiert.
Die Ergebnisse offenbarten das hohe Molekulargewicht von P-171, P-172 sowie von B-512F. Sogar das P-171 hatte ein höheres Molekulargewicht (siehe Fig. 2).

4. Messungen der Viskosität

Die Messungen der Viskosität wurden mit Hilfe eines Brookfield Viskosimeters (Stoughton, Ma, USA) durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass das P-171 eine viel höhere Viskosität besaß als B512F oder P172. Trotzdem kann B512F noch einen Anstieg des Volumens verursachen, vorausgesetzt das Molekulargewicht der gebildeten Dextrane ist hoch genug.
Die viskoelastischen Eigenschaften einer auf das Gewicht bezogenen 1%-igen wässrigen Lösung der Dextrane B512F (Fig. 4), P-171 (Fig. 5 und 7) und P-172 (Fig. 6) wurden mit Hilfe eines Bohlin spannungskontrollierten dynamischen Rheometers analysiert.
Die Lösung wurde in den Analysbehälter mit konzentrischen Zylindern hineingeschüttet.
Folgende Bedingungen wurden angewandt:
Beanspruchung 0,5 Pa
Verzögerungszeit 45 s
Integrationszeit 0 s
Ruhezeit 150 s
Temperatur 5ºC
Die Analyse wurde im Duplikat durchgeführt.
Die Fig. 4 bis 6 zeigen deutlich einen Unterschied unter den Dextranen. Dextrane gemäss der Erfindung (P-171) bauten eine Struktur auf, wenn eine Beanspruchung angelegt wurde. Dies spiegelte sich wieder durch die Zunahme der Viskosität (ausgedrückt in Pas) mit der Zeit. Wenn die Anwendung der Beanspruchung gestoppt wurde (1), wurde der Strukturaufbau sogar nach einer Unterbrechung von 3.600 Sekunden (Fig. 7) beibehalten. Eine weitere Anwendung der Beanspruchung hatte zu einem weiteren Strukturaufbau geführt. Die Geschwindigkeit der Zunahme der Viskosität war am Beginn der Anwendung der Beanspruchung am höchsten.
Kombiniert mit den Backergebnissen zeigen diese Daten eine positive Korrelation zwischen der Fähigkeit, unter einer Beanspruchung eine Struktur (zunehmende Viskosität) auf zubauen, und eine das spezifische Volumen steigernde Wirkung der Dextrane in Backwaren.

5. Ergebnisse des Backtests

5. 1 Protokoll eines Backtests von 100 g Brot

Ingredienzien:

100 g Weizenmehl Surbi (Molens von Deinze)
58 ml Wasser
5% frische Hefe (Bruggeman)
2% Salz
2% Kristalline Dextrose
4 mg Vit C p.a. Sigma A7506

Rezept:

- Mischung in einem Nadelkneter von National (National, Lincoln, Nebraska, USA) bis zur optimalen Vermischung (+/-4,5 Minuten);
- 20 Minuten Massenfermentation bei. Raumtemperatur;
- Abrundung und Stehenlassen während 20 Minuten bei Raumtemperatur zum Fermentieren;
- 50 Minuten Gärung in den Brotformen bei 36ºC und 80º relativer Feuchte;
- Backen während einer Dauer von 20 Minuten bei 215ºC in dem Ofen von National. Das Volumen der gebackenen Produkte wurde mit Hilfe des Verfahrens der Verschiebung von Rapssamen gemessen, was in dem Bäckereiwesen allgemein angewandt wird. Die Backwaren wurden nach dem Anstieg des Volumens bewertet, verglichen mit einem Referenzstandard.
Bemerkung: Berichtigungen wurden vorgenommen für die Wasserabsorption von Polysacchariden.

5.2 Protokoll eines Backtestes von 1 kg "Belgischen Pistoletten"

Ingredienzien:

1000 g Weizenmehl Surbi (Molens von Deinze)
610 g Wasser
60 g Hefe (Bruggeman)
20 g Salz

Rezept:

- 13 Minuten Mischung in einem Artofex Mischer;
- Massenfermentation (15 Minuten);
- danach wurde der Teig erneut gefaltet;
- zweite Massenfermentation (10 Minuten);
- Zwischenentspannung (10 Minuten);
- Abrundung mit Hilfe eines Rotamats (Teigstück von 30 g);
- Ruhen während 5 Minuten;
- Schneiden der Teigstücke;
- Gärung (80 Minuten);
- Backen 20 Minuten bei 230ºC in einem Ofen von dem Typ Ooms unter Verwendung von Dampf.
Bemerkung: Berichtigungen wurden vorgenommen für die Wasserabsorption der Polysaccharide.

5.3 Protokoll eines Backtests für einen Biskuitkuchen (Gebäck)

Ingredienzien:

500 g Tegral Biscuit®
375 g Ganze Eier
50 g Wasser
* Tegral Biscuit® ist ein Handelsprodukt von Puratos N. V. Belgien. Es enthält ein Backpulver, einen Emulgator, Kuchenmehl und Zucker.

Rezept:

- Alle Ingredienzien wurden in einem Hobart® Mischer während 15 bis 30 Sekunden bei Geschwindigkeitsstufe 1 und während 5 Minuten bei Geschwindigkeitsstufe 3 gemischt. Danach wurde die Dichte des Teigs gemessen durch Auffüllen und Wiegen einer Tasse, deren Volumen bekannt ist.
- 200 g des Teigs wurde in die Backform getan (rund, Durchmesser 20 cm).
- der Teig wurde bei 180ºC während einer Dauer von 25 bis 30 Minuten gebacken.
- nach dem Backen wurden die Biskuitkuchen aus der Backform herausgeholt und abgekühlt.

6. Ergebnisse der Tests

Relative Volumenunterschiede von weniger als 3% sind nicht bedeutsam. Test 1 (100g Test) Test 2 (100g Test) Test 3 (Einfluss der Zellen) (100 g Test) Test 4 (Verwendung eines vollständigen Kulturmediums - ausgedrückt als Trockensubstanz) - (100g Test) Test 5: in "Belgischen Pistoletten" zusammen mit einem vollständigen Verbesserungsmittel.
S500 ist ein im Handel erhältliches Brotverbesserungsmittel von Puratos N. V.
x wenn nicht anders gekennzeichnet.

Test 6: Biskuitkuchen

Die Dichte des Biskuitkuchens wird bewertet.
Die Dichte des Backproduktes wird auf der Grundlage des gemessenen Volumens mittels des Verfahrens der Verschiebung von Rapssamen und des Gewichtes berechnet. Ergebnisse:

7. Bedingungen der Fermentation

7.1 Klassische diskontinuierliche fermentation.

Ein Impfmittel wurde hergestellt, das dann in einem Verhältnis von 2-15% in das Endfermentationsmedium geimpft wurde. Eine mögliche Zusammensetzung des Fermentationsmediums lautet:
Sucrose 40 g/l
Lab lemco 8 g/l
Hefeextrakt 4 g/l
Tween 80 l ml/l
Triammoniumcitrat 2 g/l
Natriumacetattrihydrat 5 g/l
Dikaliumhydrogenphosphat 2 g/l
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,2 g/l
MnSO&sub4;·4H&sub2;O 50 mg/ml
Anfangs pH 6,7
Nach einer Fermentation von 12-20 Stunden Dauer bei 25ºC wurde das Impfmittel in das Endfermentationsmedium geimpft. Dann fand eine klassische diskontinuierliche Fermentation mit dem Leuconostoc Mesenteroides P171 statt. Die Fermentation fand in einem Biostat B Fermentor (Braun) mit einer Kapazität von 21 statt. Im Hinblick auf eine industrielle Anwendung wurde beschlossen, das einfachste Medium zu wählen, hergestellt aus den folgenden Komponenten: Sucrose als C-Sucrose, Hefeextrakt (Oxoid L21®) als komplexe N-Quelle und als Quelle für Co-Faktoren, Na&sub2;HPO&sub4;- Salz als Puffer.
Eine mögliche Zusammensetzung würde sein:
Sucrose 125 g/l
Hefeextrakt 20 g/l
Na&sub2;HPO&sub4; 16 g/l
Anfangs pH 6,7
Die Sucrose kann zwischen 50 und 400 g/L liegen. Der Anfangs pH kann zwischen 7 und 6,1 liegen und daher war es notwendig, die Lösung zu puffern.
Puffersalze kennen irgendeine chemische Substanz sein, welche die Kapazität hat, in dem gegebenen Gebiet zu puffern.
Während der Fermentation wurde nur die Temperatur geprüft, es gab keine pH-Kontrolle, keine Belüftung. Trotzdem fand ein Umrühren statt, um heterogene Substanzen in dem Fermentor zu vermeiden.
Die Bedingungen, unter denen die Fermentation stattfand, sind in der unten stehenden Tabelle beschrieben:
Temperatur 25ºC
Volumen 1,5 l
Belüftung Keine
Behandlung 1200 Umdrehungen pro Minute
Impfmittel 6,7%
Die Arbeitstemperatur wurde auf 25ºC eingestellt. Im allgemeinen kann die Temperatur zwischen 20 und 30ºC eingestellt werden. Der pH-Wert nimmt im Verlaufe der Fermentation ab. Wenn der pH-Wert nicht länger abnimmt, dann hat die Fermentation ihr Ende erreicht.

7.2 Herstellung der Dextransucrase und der nachfolgenden Synthese der Dextrane.

Es war nicht notwendig, die Dextrane in Anwesenheit der Mikroorganismen zu synthetisieren. Es war möglich, zuerst die Dextrane unter Verwendung geeigneter Mikroorganismen (in dem, vorliegenden Fall vorzugsweise die P171) herzustellen. Zuerst wurde ein Impfmittel entsprechend dem oben erwähnten Verfahren hergestellt. Dieses Impfmittel wurde in einen Fermentor geimpft. Ein mögliches Kulturmedium würde sein:
Hefeextrakt 20 g/l
Dinatriumhydrogenphosphat 16 g/l
Sucrose 40 g/l
Anfangs pH 6,7
Danach wurden die Zellen von dem Kulturmedium getrennt mit Hilfe einer Mikrofiltration oder durch Zentrifugieren.
Wenn sich dies als notwendig herausstellte, wurde das Kulturmedium durch Ultrafiltration konzentriert.
Danach wurde die enzymatische Lösung in einer konzentrierten Zuckerlösung verdünnt und die Dextrane wurden synthetisiert. Die Dextransynthese kann auch durch eine direkte Zugabe von Dextransucrase oder Dextrindextranase in der grundlegende Formulierung des Endproduktes erreicht werden, das gebacken wurde. Die Dextrane wurden dann während der Fermentation gebildet.

8. Dextranisolierung

Um die Dextrane zu isolieren, wurde ein Volumen eines Kulturmediums mit einem gleichen Volumen Ethanol (dies ist auch möglich mit Isopropanol) gemischt. Dies bewirkt, dass die Dextrane niederschlagen. Nach dem Niederschlagen der Dextrane wurde das Überstehende sorgfältig abgeschäumt.
Der erhaltene Niederschlag wurde eingefroren und danach lyophilisiert. Die lyophilisierten Dextrane wurden gemahlen und in den Backtests verwendet.
Ein anderes Protokoll besteht darin, zuerst das Kulturmedium durch Zugabe von Dextranen zu verdünnen. Die Lösung wurde zentrifugiert, um die Zellen zu beseitigen, und dann um die Dextrane niederzuschlagen und zu trocknen.
Die Lyophilisierung kann auch durch ein Trocknen an der Luft oder durch Trocknung bei einer erhöhten Temperatur ersetzt werden. Ein Sprühtrocknen war in dieser Phase auch möglich.

Claims

1. Verfahren für die Herstellung eines verbesserten Strukturaufbaus von Backwaren, welches den Schritt umfasst, in einen Teig eine ausreichende Menge an Exopolysacchariden einzubinden, um eine Zunahme der Viskosität mit der Zeit zu verursachen, wobei die besagten Exopolysaccharide die Eigenschaft besitzen, eine Zunahme der Viskosität zu verursachen, welche nach 5.000 Sekunden höher ist als 0,4 · 10&supmin;³ Pas für eine auf das Gewicht bezogene 1%-ige Lösung der Exopolysaccharide unter einer Beanspruchung von 0,5 Pa, die erzielte Viskosität aufrechtzuerhalten und den Teig zu backen, wodurch Backwaren erzielt werden, die einen verbesserten Strukturaufbau besitzen.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Zunahme der Viskosität größer ist als 0,8 · 10&supmin;³ Pas.

3. Verfahren gemäss Anspruch 2, wobei die Exopolysaccharide aus Bakterien gewonnen werden, die zu der Gruppe der Milchsäurebakterien gehören.

4. Verfahren gemäss Anspruch 3, wobei die Exopolysaccharide Dextrane sind.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, wobei die Dextrane ein Molekulargewicht aufweisen, das 2 · 10&sup6; Dalton übersteigt.

6. Verfahren gemäss den Ansprüchen 4 oder 5, wobei die Dextrane einen Verzweigungsgrad von weniger als 5% aufweisen.

7. Verfahren gemäss irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Exopolysaccharide aus Unterarten von Leuconostoc Mesenteroides gewonnen werden, vorzugsweise aus dem Stamm mit der Hinterlegungsnummer LMGP-16878.

8. Verfahren gemäss irgendeinem der vorstehenden Ansprüche 4 bis 7, wobei die Dextrane in Anwesenheit von Milchsäurebakterien synthetisiert werden.

9. Verfahren gemäss irgendeinem der vorstehenden Ansprüche 4 bis 7, wobei die Dextrane mit Hilfe von Dextransucrase synthetisiert werden, die von Milchsäurebakterien erzeugt wird.

10. Dextrane mit einem Molekulargewicht, das 2 · 10&sup6; Dalton übersteigt und einen Verzweigungsgrad von weniger als 5% aufweist.

11. Dextrane gemäss Anspruch 10 mit einem 1H-NMR-Spektrum, das Resonanzen bei δ4,98-4,97 und δ5,32-5,30 ppm in einem Verhältnis von etwa 1.000/0,0485 aufweist, mit einem bedeutenden Dublett, das in dem anomeren Gebiet bei 4,9904 ppm und 4,9786 ppm nachgewiesen worden ist.

12. Dextrane gemäss den Ansprüchen 10 oder 11, die lyophilisiert werden.

13. Mikroorganismus, der die Dextrane gemäss Anspruch 10 oder 11 erzeugt und der die Hinterlegungsnummer LMGP- 16878 trägt.

14. Teig, der die Dextrane gemäss irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12 enthält.

15. Gebackenes Nahrungsmittelprodukt, das die Dextrane gemäss irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12 oder den Teig gemäss Anspruch 14 enthält.