DE69325189T2

DE69325189T2 - Neue Pektinase

Info

Publication number: DE69325189T2
Application number: DE69325189T
Authority: DE
Inventors: Chitoshi Hatanaka; Susumu Maeda; Noriko Shimizu; Setsuko Uchida; Satoshi Watabe; Fumihide Yamaguchi
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1992-01-20
Filing date: 1993-01-20
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2013-01-21
Also published as: EP0552728B1; DK0552728T3; EP0552728A1; EP0868854A3; US5807727A; EP0868854A2; DE69325189D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Pektinase, die Pektin in niedermolekulares Pektin mit einem Molekulargewicht von 20000 bis 80000 spalten kann. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Pektinase läßt sich niedermolekulares Pektin aus Pektin, wobei die physiologische Aktivität des Pektins als Ballaststoff beibehalten wird, sowie Nahrungsmittel und Getränke erhalten, die das niedermolekulare Pektin enthalten.
Ballaststoffe werden als schwer verdauliche Bestandteile in Nahrungsmitteln definiert, die von menschlichen Verdauungsenzymen nicht verdaut werden können. Zu den Ballaststoffen gehören unverdauliche organische Materialien, wie Chitin und Chitosan, sowie Bestandteile der Pflanzenzellwände, wie Cellulose, Lignin und Pektin. In den letzten Jahren wurde gefunden, daß diese Ballaststoffe verschiedene Aktivitäten besitzen, beispielsweise eine die Ausscheidung verbessernde Wirkung sowie eine den Cholesteringehalt im Blut senkende Aktivität, und eine wichtige Rolle bei der Vorbeugung von Erkrankungen bei Erwachsenen spielen.
Unter diesen Ballaststoffen besitzen Pektinsubstanzen, wie Pektin und Pektinsäure, starke Ballaststoffaktivität. Verschiedene Wirkungen, wie eine die Ausscheidung verbessernde Wirkung, eine den Cholesteringehalt im Blut senkende Wirkung, eine die Gallensteinbildung unterdrückende Wirkung sowie eine Bluthochdruck senkende Wirkung, wurden beschrieben. Herkömmlicherweise werden Pektinsubstanzen in der Nahrungsmittelindustrie als Stabilisatoren in Marmeladen, Früchtegelees, Joghurtgetränken und Milchsäuregetränken verwendet.
Pektinsubstanzen werden in unreifen Früchten oder in Pflanzen an Cellulose gebunden und liegen in einem als Pro topektin bezeichneten Komplex vor. Protopektin ist insbesondere in Zitrusfrüchten, Äpfeln und Chinesischen Quitten in großen Mengen enthalten. Dieses Protopektin ist zwar unlöslich, es wird aber beim Reifen der Frucht hydrolysiert und bildet lösliches Pektin oder Pektinsäure.
Unter diesen Produkten ist Pektin ein Polysaccharid, das Galacturonan, ein Galacturonsäure-Polymer, als Hauptbestandteil sowie kleine Mengen an Rhamnose, Arabinose, Xylose und Galactose enthält. Es hat ein Molekulargewicht von 200000 oder höher.
Pektin ist gewöhnlich gering löslich und hochviskos und neigt zur Gelbildung. Aus diesen Grund wird trotz der oben beschriebenen verschiedenen Wirkungen von Pektin nur eine kleine Pektinmenge zu Nahrungsmitteln und Getränken gegeben. Es ist schwierig, Pektin in einer Menge zu Nahrungsmitteln und Getränken zu geben, die ausreicht, daß man die Ballaststoffaktivität erwarten kann.
W. Röcken et al. offenbaren in Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1981, Bd. 173: 26-31 die pektinolytische Aktivität von Hefen, die aus Getränken auf Orangenbasis und Zuckersirupen isoliert worden sind. Es wird beschrieben, daß Polygalacturonasen das gering veresterte und somit wasserunlösliche Pektin der Trübungspartikel angreifen.
J. Sanchez et al. offenbaren in Appl. Microbiol. Biotechnol., 1984, Bd. 20: 262-267, daß Hefen mit pektinolytischer Aktivität an der Spaltung des Faserbreis bei der herkömmlichen Kakaofermentation teilnehmen. Es werden verschiedene bekannte pektinolytische Enzyme diskutiert. Diese Enzyme gehören zu den folgenden drei Typen: eine Esterase, eine De polymerase, die über Hydrolyse wirkt, und eine Depolymerase, die über β-Eliminierung wirkt.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Pektinase bereitzustellen, die zur Herstellung von niedermolekularem Pektin geeignet ist.
Um die vorstehende erfindungsgemäße Aufgabe zu lösen, wird eine neue Pektinase bereitgestellt, die Pektin spalten kann, so daß ein niedermolekulares Pektin erhalten wird, das geringe Viskosität und hohe Löslichkeit besitzt. Die Erfinder haben auf der Grundlage der vorstehenden Annahme ausgiebige Untersuchungen an vielen Pektinasen durchgeführt. Als Ergebnis haben die Erfinder entdeckt, daß Endopolygalacturonasen [EC 3.2.1.15] aus einer Hefe (d. h. Kluyveromyces fragilis, JTF-1) der Gattung Kluyv romyces, einer Hefe (d. h. Geotrichum candidum, JTF-2) der Gattung Geotrichum, einer Hefe (d. h. Candida Kefyr, JTF-3) der Gattung Candida sowie einer Hefe (d. h. Saccharomyces bavanus, JTF-4) der Gattung Saccharomyces als Pektinasen geeignet waren. Außerdem haben die Erfinder entdeckt, daß die Abnahme des Molekulargewichts des Pektins durch Spaltung bei einem Molekulargewicht von etwa 20000 gestoppt wurde und die Spaltung nicht mehr voranschritt, selbst wenn man die aus den obigen Hefen erhaltenen Enzyme bis zur Spaltungsgrenze einwirken ließ. Die Erfinder haben auch entdeckt, daß niedermolekulare Pektine mit Molekulargewichten von 20000 bis 80000 durch geeignete Steuerung der Reaktionsbedingungen erhalten werden können.
Die Erfinder haben die Mikroorganismen zur Herstellung der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Pektinase (Endogalacturonasen) mit der Bezeichnung JTF-1 (Zugangsnummer: FERM BP-4056) am 11. Oktober 1991, JTF-2 (Zugangsnum mer: FERM BP-4057) am 19. Dezember 1991, JTF-3 (Zugangsnummer: FERM BP-4058) am 6. März 1992 und JTF-4 (Zugangsnummer: FERM BP-3916) am 9. Juli 1992 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology mit Sitz in 1-3, Higashi 1-chome, Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag zur Ineernationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren hinterlegt.
Die Erfinder haben zum erstenmal entdeckt, daß JTF-4 eine Endopolygalacturonase produziert.
Folglich wird erfindungsgemäß eine neue Pektinase mit den folgenden Eigenschaften (i) bis (vi) bereitgestellt:
(i) Die neue Pektinase ist eine Endopolygalacturonase, die von der Gattung Saccharomyces produziert wird und Pektin und Pektinsäure spaltet.
(ii) Der optimale pH-Wert bei der Reaktion bei 35ºC für 20 min beträgt 4,0.
(iii) Der stabile pH-Wert-Bereich beim Erhitzen bei 35ºC für 60 min beträgt 4,0 bis 8,0.
(iv) Die optimale Temperatur bei der Reaktion bei einem pH-Wert von 5,0 ist 45ºC.
(v) Die Enzymaktivität beim Erhitzen bei einem pH-Wert von 5,0 für 60 min ist bis zu 45ºC stabil.
(vi) Das Molekulargewicht beträgt 38000.
(vii) Die Pektinase spaltet Pektin oder Pektinsäure bis auf ein Molekulargewicht von 20000 bis 80000.
Die Endopolygalacturonasen (die von den Hefen JTF-1 bis JTF-4 hergestellten erfindungsgemäßen Endopolygalacturonasen werden als JTFP-1, JTFP-2, JTFP-3 bzw. JTFP-4 bezeichnet), die von den Hefen JTF-1, JTF-2, JTF-3 und JTF-4 produziert werden, wirken auf Pektine, so daß niedermolekulare Pektine erhalten werden.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Pektinase werden Nahrungsmittel und Getränke bereitgestellt, die 0,01 bis 50 Gew.-% des niedermolekularen Pektins enthalten.
Diese Erfindung kann aus der folgenden eingehenden Beschreibung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen besser verstanden werden, in denen:
Fig. 1 ein Graph ist, der die relative Aktivität und den pH-Wert zur Bestimmung des pH-Optimums eines Enzyms (JTFP-4) zeigt;
Fig. 2 ein Graph ist, der die relative Aktivität und den pH-Wert zur Bestimmung des stabilen pH-Wert-Bereichs des Enzyms (JTFP-4) zeigt;
Fig. 3 ein Graph ist, der die relative Aktivität und die Temperatur zur Bestimmung des Temperaturoptimums des Enzyms (JTFP-4) zeigt;
Fig. 4 ein Graph ist, der die relative Aktivität und die Temperatur zur Bestimmung des stabilen Temperaturbereichs des Enzyms (JTFP-4) zeigt; und
Fig. 5 ein Graph ist, der die Viskositätskurve eines erfindungsgemäßen niedermolekularen Pektins zeigt.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend beschrieben.
Eine erfindungsgemäße Endopolygalacturonase (JTFP-4) aus JTF-4, der zur Gattung Saccharomyces gehört, wird nachstehend beschrieben.
Das erfindungsgemäße Enzym JTFP-4 wirkt auf Pektin und Pektinsäure und hydrolysiert diese. JTFP-4 hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften.

(1) Substratspezifität

Das erfindungsgemäße JTFP-4 spaltet Pektin und Pektinsäure, aber nicht lösliche Stärke, Dextrin und Xylan.

(2) pH-Optimum

Das erfindungsgemäße JTFP-4 hat ein pH-Optimum nahe einem pH-Wert von 4.

(3) Stabiler pH-Wert-Bereich

Das erfindungsgemäße JTFP-4 ist im pH-Wert-Bereich von 4 bis 8 stabil.

(4) Enzymaktivität

Die Enzymaktivität von JTFP-4 beträgt 33,9 Einheiten/mg Protein (1 Einheit: die Menge eines Enzyms, die bei der Hydrolyse von Pektinsäuren 1 uMol einer reduzierenden Gruppe im Hydrolysat pro min bei 35ºC erzeugt).

(5) Temperaturoptimum

Das erfindungsgemäße JTFP-4 hat ein Temperaturoptimum nahe 45ºC.

(6) Stabile Temperatur

Das erfindungsgemäße JTFP-4 ist bis 45ºC stabil.

(7) Einfluß von Metallionen und Inhibitoren

Das erfindungsgemäße JTFP-4 wird mit Bariumchlorid zu 69% gehemmt, wird aber nicht mit Magnesiumsulfat gehemmt. JTFP-4 wird mit EDTA zu 74% gehemmt.

(8) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht von JTFP-4 beträgt 38000.

(9) Aminosäurezusammensetzung

Das erfindungsgemäße JTFP-4 hat einen maximalen Gehalt von Glutamin und Glutaminsäure im Molekül (130 Reste pro Molekül).
Erfindungsgemäß läßt man die Endopolygalacturonase auf Pektin einwirken, so daß niedermolekulares Pektin erhalten wird.
Endopolygalacturonasen kommen gewöhnlich in Bakterien, Hefen, Pilzen und höheren Pflanzen vor. Es sind viele Schritte erforderlich, um das Enzym aus diesen Quellen zu reinigen. D. h. die Zellen werden aus einer Kulturlösung, die Mikroorganismen oder dergleichen enthält, entfernt, so daß ein Kulturüberstand erhalten wird. Der Kulturüberstand wird einer Ammoniumsulfatfällung unterworfen, so daß nur ein Protein ausgesalzt wird. Das Protein wird aufgrund seiner Ladung unter Verwendung eines Ionenaustauschmaterials abgetrennt. Das Enzym wird anhand der Molekulargewichte mittels Gelfiltration abgetrennt, wodurch nach einem solchen allgemeinen Enzymreinigungsverfahren die Endopolygalacturonase gereinigt ist.
Wird eine kommerziell erhältliche Pektinase verwendet, muß erfindungsgemäß die Reinigung so durchgeführt werden, daß Pektinesterase und Hemicellulase aus der Pektinase entfernt werden.
Da die von JTF-1, JTF-2, JTF-3 bzw. JTF-4 produzierten JTFP-1, JTFP-2, JTFP-3 und JTFP-4 extrazelluläre Enzyme sind, die aus den Mikroorganismen sezerniert werden, kann der Kul turüberstand direkt als Enzymrohlösung verwendet werden. Der Kulturüberstand wird gewöhnlich so erhalten, daß die Hefe auf Schrägagar und dann in Massenproduktion gezüchtet wird. Das erhaltene Kulturprodukt wird zentrifugiert, um die Mikroorganismen zu entfernen. Auf diese Weise kann der unter Verwendung der Hefe erhaltene Kulturüberstand direkt in einer Enzymreaktion verwendet werden, wodurch sich das Enzymreinigungsverfahren vorteilhaft vereinfacht.
Der Kulturüberstand wird vorzugsweise einer einfachen Behandlung, wie Dialyse, Ultrafiltration, Ionenaustausch oder Gelfiltration, unterworfen, um den bei der Reaktion unter Verwendung dieses Enzyms produzierten Hefegeruch zu beseitigen und eine transparentere Lösung zu erhalten.
Niedermolekulares Pektin wird so erhalten, daß das gereinigte Produkt, der Kulturüberstand oder sein behandeltes Endopolygalacturonase-Produkt, das wie oben beschrieben erhalten wird, mit einer Suspension umgesetzt wird, die durch Suspendieren von Pektin in einer Pufferlösung, wie Essigsäure, erhalten wird.
Der bei der vorliegenden Erfindung verwendete Typ der Endopolygalacturonase ist nicht auf einen spezifischen beschränkt, solange sie mit einem Pektin unter Bildung von niedermolekularem Pektin mit einem Molekulargewicht von etwa 20000 bis 80000 reagiert. JTFP-1 bis JTFP-4 werden jedoch vorzugsweise ohne arbeitsintensive Arbeitsgänge, wie Enzymreinigung, verwendet.
Als das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Pektin kann jedes Pektinmaterial verwendet werden, und sein Ursprung ist nicht auf einen spezifischen beschränkt. Daher können allgemein bekannte Pektine, die aus Früchten stammen, wie Zitronenpektin und Apfelpektin, verwendet werden.
In der Reaktion zwischen dem Pektin und einem aus JTFP-1 bis JTFP-4 kann ein gereinigtes Produkt, ein Kulturüberstand (Enzymrohlösung) oder sein behandeltes Produkt für die Umsetzung mit dem Pektin verwendet werden.
Die Spaltungsreaktion durch das Enzym wird vorzugsweise· für eine Reaktionsdauer von 12 bis 48 Stunden durchgeführt, wenn der Gehalt des Hefekulturüberstands 5 bis 20 Gewichtsteile, bezogen auf 1 Gewichtsteil Pektin, beträgt. Die bevorzugte Reaktionstemperatur und der bevorzugte pH-Wert sind diejenigen, die eine ausreichende Reaktion ermöglichen und die Endopolygalacturonase nicht inaktivieren, d. h. 30 bis -50ºC und ein pH-Wert von 4,0 bis 8,0.
Sogar wenn die Enzymreaktion an der Spaltungsgrenze durchgeführt wird, wird erfindungsgemäß der Pektinabbau beendet, wenn das Molekulargewicht etwa 20000 beträgt. Daher kann durch Steuerung der Reaktionsbedingungen, wie der Reaktionsdauer, niedermolekulares Pektin mit einem willkürlichen Molekulargewicht im Bereich von etwa 20000 bis 80000 erhalten werden.
Das unter Verwendung der erfindungsgemäßen Pektinase erhaltene niedermolekulare Pektin kann zwar ein Molekulargewicht von 20000 bis 80000 haben, das Molekulargewicht liegt aber hinsichtlich der Beibehaltung der physiologischen Aktivität als Ballaststoff und der leichten Zugabe des niedermolekularen Pektins zu Nahrungsmitteln und Getränken vorzugsweise im Bereich von etwa 50000 bis 70000. Das niedermolekulare Pektin hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 60000.
Das Pektin-Spaltungsprodukt kann direkt getrocknet und verwendet oder weiterbehandelt werden.
Wenn eine weitere Behandlung durchgeführt werden soll, wird das Pektin-Spaltungsprodukt mittels Dialyse oder Ultrafiltration gereinigt, so daß Galacturonsäure und ihr Oligosaccharid im Spaltungsprodukt sowie die als Pufferlösung bei der Reaktion verwendete Essigsäure entfernt werden. Das gereinigte Spaltungsprodukt wird unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie Ethanol oder Aceton, ausgefällt oder mittels Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen getrocknet, so daß ein Pulver zum späteren Gebrauch erhalten wird.
Durch Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Pektinase werden Nahrungsmittel und Getränke bereitgestellt, die niedermolekulare Pektine enthalten.
Das durch das vorstehende Verfahren erhaltene erfindungsgemäße niedermolekulare Pektin hat ein Molekulargewicht, das von dem eines Polysaccharids, wie Pektin oder Agarose, bis zu dem eines Oligosaccharids, wie Maltooligosaccharid oder Fruktooligosaccharid reicht. Das niedermolekulare Pektin hat zwar eine kleinere Viskosität und eine höhere Löslichkeit als das ursprüngliche Pektin, hat aber eine die Ausscheidung verbessernde Wirkung als eine der physiologischen Aktivitäten des Ballaststoffes.
Da das erfindungsgemäße niedermolekulare Pektin die obigen Eigenschaften besitzt, kann es andererseits in einer Reihe von Nahrungsmitteln und Getränken, wie Säften, Süßigkeiten, Broten und Marmeladen, in einer Menge enthalten sein, die es ermöglicht, die physiologische Aktivität als Ballaststoff beizubehalten, d. h. 0,01 bis 50 Gew.-% und vorzugsweise 0,1 bis 5 Gew.-%, und die gewöhnlich nicht enthalten sein kann.
Die Nahrungsmittel und Getränke, die das durch Verwendung der neuen erfindungsgemäßen. Pektinase erhaltene niedermolekulare Pektin enthalten, weisen mit den vorstehenden Mengen bessere physikalische Eigenschaften auf und sind wohlschmeckender. Diese physikalischen Eigenschaften und der Wohlgeschmack unterscheiden sich von denjenigen, die durch Zugabe von herkömmlichem Pektin zu Nahrungsmitteln und Getränken erhalten werden.
Da die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme (JTFP-1 bis JTFP-4) extrazelluläre, aus den Mikroorganismen sezernierte Enzyme sind, kann wie oben beschrieben der Kulturüberstand direkt als Enzymrohlösung und bei der Enzymreaktion verwendet werden. Daher vereinfacht das Enzym vorteilhaft das Enzymreinigungsverfahren, und Pektin kann leicht in niedermolekulares Pektin gespalten werden. Wenn man die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme bis zur Spaltungsgrenze auf Pektine einwirken läßt, kann die Molekulargewichtsabnahme des Pektins durch Spaltung bei etwa 20000 beendet werden, und es ist eine charakteristische Eigenschaft des Enzyms, daß die Spaltung nicht weiter voranschreiten kann. Durch Steuerung der Reaktionsbedingungen kann ein niedermolekulares Pektin mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 20000 bis 80000 erhalten werden.
Da das erhaltene niedermolekulare Pektin eine kleine Viskosität und hohe Löslichkeit besitzt und die physiologische Aktivität (z. B. eine die Ausscheidung verbessernde Wirkung) des Ballaststoffes beibehalten kann, läßt sich das niedermolekulare Pektin leicht in einer Menge zu Nahrungsmitteln und Getränken geben, die ausreicht, daß die physiologische Aktivität als Ballaststoff bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung wird anhand ihrer Beispiele beschrieben, ist aber nicht darauf beschränkt.

[Beispiele]

Teile und Prozentangaben geben in den Beispielen, wenn nicht anders angegeben, Gewichtsteile und Gew.-% wieder.

Beispiel 1

Verfahren zur Züchtung von JTF-1 bis JTF-4 und Herstellung von Enzymrohlösungen

(1) Verfahren zur Züchtung yon JTF-1 und Herstellung einer Enzymrohlösung

Kluyveromyces fragilis JTF-1 wurde auf Schrägagar aus Kartoffel-Saccharose-Agar (pH-Wert 5,0) bei 27ºC 24 Stunden gezüchtet. Eine Platinöse der kultivierten Kluyveromyces fragilis wurde in 50 ml eines Mediums (pH-Wert 5,0) überimpft, das 5% Glucose, 0,2% Ammoniumphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat und 0,4% Hefeextrakt enthielt, und wurde 3 Tage bei 27ºC stationär gezüchtet. Dieses gezüchtete Produkt wurde in 1 l Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das obige Kulturmedium überimpft und 3 Tage bei 27ºC stationär gezüchtet. Das erhaltene gezüchtete Produkt wurde 10 Minuten bei 13000 U/min zentrifugiert, um JTF-1 zu entfernen, wodurch ein Kulturüberstand erhalten wurde.

(2) Verfahren zur Züchtung von JTF-2 und Herstellung einer Enzymrohlösung

Es wurde ein Kulturüberstand nach den gleichen Verfahren, wie in (1), erhalten, ausgenommen daß Geotrichum candidum JTF-2 anstelle von Kluyveromyces fragilis JTF-1 verwendet wurde.

(3) Verfahren zur Züchtung von JTF-3 und Herstellung einer Enzymrohlösung

Candida Kefyr JTF-3 wurde auf Schrägagar aus Kartoffel- Saccharose-Agar (pH-Wert 5,0) 3 Tage bei 22ºC gezüchtet. Eine Platinöse der gezüchteten Candida Kefyr wurde in 50 ml eines Mediums (pH-Wert 5,0) überimpft, das 5% Glucose, 0,2% Ammoniumphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 011% Magnesiumsulfat und 0,4% Hefeextrakt enthielt, und wurde 3 Tage bei 22ºC stationär gezüchtet. Dieses gezüchtete Produkt wurde in 1 l Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das obige Kulturmedium überimpft und 4 Tage bei 22ºC stationär gezüchtet. Das erhaltene gezüchtete Produkt wurde 10 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert, um JTF-3 zu entfernen, wodurch ein Kulturüberstand erhalten wurde.

(4) Verfahren zur Züchtung von JTF-4 und Herstellung einer Enzymrohlösung

Saccharomyces bavanus JTF-4 wurde auf Schrägagar aus Kartoffel-Saccharose-Agar (pH-Wert 5,0) 3 Tage bei 28ºC gezüchtet. Eine Platinöse der gezüchteten Saccharomyces bayanus wurde in 50 ml eines flüssigen Mediums (5% Glucose, 0,2% Ammoniumphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat und 0,4% Hefeextrakt; pH-Wert 5,0) in einem 200-ml- Erlenmeyerkolben überimpft und 3 Tage bei 28ºC stationär gezüchtet. Dieses gezüchtete Produkt wurde in 1 l Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das obige Kulturmedium in einem 3-1-Erlenmeyerkolben überimpft und 3 Tage bei 28ºC stationär gezüchtet. Das erhaltene gezüchtete Produkt wurde 10 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert, um JTF-4 zu entfernen, wodurch ein Kulturüberstand erhalten wurde.

Beispiel 2

Verfahren zur Präparation von JTFP-4

Der im Beispiel 1 erhaltene Kulturüberstand wurde durch ein Milliporefilter (Porengröße: 0,45 um) filtriert, um JTF-4 vollständig zu entfernen. Das Kulturfiltrat wurde über Nacht in einer 0,02 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 5,0) bei 5ºC dialysiert. Etwa 600 ml des dialysierten Kulturüberstands wurde an eine Ionenaustauschsäule (S-Sepharose) adsorbiert und nach einem Dichtegradientenverfahren unter Verwendung einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert. Aktive Fraktionen wurden gesammelt, und eine Gelfiltrations-Säulenchromatographie wurde durchgeführt, wobei eine 0,02 M Essigsäure-Pufferlösung als Elutionsmittel verwendet wurde. Das Chromatogramm zeigte einen hochaktiven Peak. Die dem hochaktiven Peak entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und über Nacht bei 5ºC in destilliertem Wasser dialysiert. Das dialysierte Produkt wurde mittels Gelfiltration auf 5 ml eingeengt. Etwa 1 mg des gereinigten Enzyms wurde als Protein aus 600 ml Kulturüberstand erhalten.
Die Enzymaktivität (eine Einheit) wurde bestimmt, indem die Anzahl an reduzierenden Gruppen im durch die Enzymreaktion erhaltenen Hydrolysat gemäß dem Somogyi-Nelson-Verfahren gemessen wurde. D. h. eine Einheit ist die Menge Enzym, die 1 uMol der reduzierenden Gruppen des Hydrolysats pro Minute bei 35ºC erzeugt (die Anzahl der erzeugten reduzierenden Gruppen wird als Menge Galacturonsäure angenommen). Als Ergebnis dieser Messung wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Enzymaktivität 33,9 Einheiten/mg Protein betrug.
Wenn mit dieser Probe eine SDS-Polyacrylamidelektrophorese durchgeführt wurde, wurde die Probe als einzelne Bande nachgewiesen.

Beispiel 3

Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms (JTFP-4) zu untersuchen.

(1) Substratspezifität

Zur Untersuchung der Substratspezifität des Enzyms wurde die Reaktivität zwischen dem Enzym und den in Tabelle 1 gezeigten Substraten untersucht.
Die Substrate wurden jeweils so zugegeben, daß die Endkonzentration in einer 0,2 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 5,0) auf 0,2% eingestellt wurde. Es wurden 0,1 ml der Enzymlösung zu 0,15 ml der jeweiligen erhaltenen Lösung gegeben - und damit 20 Minuten bei 35ºC umgesetzt. Das Vorliegen/Fehlen der Substratspaltungsaktivität wurde nachgewiesen, indem die Anzahl an reduzierenden Enden für das jeweilige Substrat gemessen wurde. Die Spaltungsaktivität für jedes Substrat ist in Tabelle 1 gezeigt. Das Zeichen o in Tabelle 1 gibt ein durch das Enzym gespaltenes Substrat wieder, das Zeichen x gibt ein nicht durch das Enzym gespaltenes Substrat wieder.

Tabelle 1 Substratspezifität

Substrat Spaltung
Pektin
Pektinsäure o
Dextrin x
Stärke x
Xylan x
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Enzym Pektin und Pektinsäure spalten kann, aber lösliche Stärke, Dextrin und Xylan nicht spaltet.

(2) pH-Optimum

Es wurden 0,02 ml einer Enzymlösung zu 0,23 ml einer Mchllvaine-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 2 bis 7, die Pektinsäure in einer Endkonzentration von 0,2% enthielt, gegeben und 20 min bei 35ºC damit umgesetzt. Die Aktivität wurde durch das Somogyi-Nelson-Verfahren gemessen. Die Enzymaktivitätswerte wurden als relative Aktivitäten gemessen, wobei der maximale Aktivitätswert als 100% definiert wurde. Wie in Fig. 1 gezeigt, wurden die durch das Somogyi-Nelson- Verfahren erhaltenen relativen Aktivitäten als Funktion des pH-Wertes aufgetragen, so daß das pH-Optimum erhalten wurde. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß das pH-Optimum des erfindungsgemäßen Enzyms bei 4 lag.

(3) Stabiler pH-Wert-Bereich

Die Pufferlösungen waren eine 0,2 M McIllvaine-Pufferlö- Sung (pH-Wert von 3 bis 7) und eine Phosphorsäure-Pufferlösung (pH-Wert von 7 bis 10).
Es wurden 0,025 ml des erfindungsgemäßen Enzyms zu jeweils 0,125 ml der Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3 bis 10 gegeben und 1 Std. bei 35ºC behandelt. Zu der behandelten Lösung wurden 0,15 ml einer 0,5 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 5,0) gegeben, um den pH-Wert auf 5,0 einzustellen. Zu dieser Lösung wurde Pektinsäure gegeben, so daß die Endkonzentration auf 0,2% eingestellt wurde, die erhaltene Lösung wurde 20 min bei 35ºC umgesetzt, und die Aktivität wurde durch das Somogyi-Nelson-Verfahreivgemessen. Wie in Fig. 2 gezeigt, wurden die durch das Somogyi-Nelson-Verfahren erhaltenen relativen Aktivitäten als Funktion des pH-Wertes aufgetragen, so daß der stabile pH-Wert-Bereich erhalten wurde. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Enzym in einem pH-Wert-Bereich von 4 bis 8 stabil war.

(4) Temperaturoptimum

Es wurden 0,02 ml des erfindungsgemäßen Enzyms zu 0,23 ml einer 0,2 M Mchllvaine-Pufferlösung (pH-Wert 5,0), die 0,2% Pektinsäure enthielt, gegeben und damit 5 min bei einer Temperatur von 20ºC bis 80ºC umgesetzt. Die Aktivität wurde durch das Somogyi-Nelson-Verfahren gemessen. Die Enzymaktivitätswerte wurden als relative Aktivitäten gemessen, wobei der maximale Aktivitätswert als 100% definiert wurde. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurden die durch das Somogyi-Nelson-Verfahren erhaltenen relativen Aktivitäten als Funktion der Temperatur aufgetragen, so daß das Temperaturoptimum erhalten wurde. Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Temperaturoptimum des erfindungsgemäßen Enzyms bei etwa 45ºC lag.

(5) Stabiler Temperaturbereich

Es wurden 0,02 ml des erfindungsgemäßen Enzyms zu 0,13 ml einer 0,5 M Mchllvaine-Pufferlösung (pH-Wert 5,0) gegeben und 60 min bei einer Temperatur von 20ºC bis 65ºC hitzebehandelt. Nachdem die Reaktionslösung mit Eis gekühlt worden war, wurden 0,1 ml einer 0,5%igen wäßrigen Pektinsäurelösung zu jeder behandelten Lösung gegeben und damit 20 min bei 35ºC umgesetzt. Die Aktivität wurde durch das Somogyi-Nelson-Verfahren gemessen. Die Enzymaktivitätswerte wurden als relative Aktivitäten gemessen, wobei der maximale Aktivitätswert als 100% definiert wurde. Wie in Fig. 4 gezeigt, wurden die durch das Somogyi-Nelson-Verfahren erhaltenen relativen Aktivitäten als Funktion der Temperatur aufgetragen, so daß der stabile Temperaturbereich erhalten wurde. Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß die relative Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms bis zu 45ºC 73% betrug, aber bei 65ºC auf etwa 20% reduziert wurde. Der stabile Temperaturbereich war auf bis zu 45ºC beschränkt.

(6) Einfluß von Metallionen und Inhibitoren

Die Einflüsse von Metallionen und Inhibitoren auf das erfindungsgemäße Enzym wurden untersucht.
Die Metallionen und Inhibitoren in Tabelle 2 wurden jeweils in 0,15 ml einer 0,2 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 5,0), die 0,002 ml der gereinigten Enzymlösung enthielt, gegeben, so daß eine Konzentration von 1 mM erhalten wurde. Die Lösungen wurden jeweils 5 min bei 35ºC umgesetzt, und 0,1 ml einer 0,5%igen wäßrigen Pektinsäurelösung wurden dazugegeben. Die erhaltene Lösung wurde 20 min bei 35ºC umgesetzt. Das Hemmverhältnis wurde unter Verwendung des Somogyi-Nelson-Verfahrens berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Das Hemmverhältnis ist der relative Wert, bezogen auf den Fall (0%), in dem kein Metall oder Inhibitor zugegeben wird. Tabelle 2 Einfluß von Metall und Inhibitoren
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß dieses Enzym am stärksten (74%) durch EDTA gehemmt wurde. Das Enzym wurde durch das Bariumion (Bariumchlorid) zu 69% gehemmt. Keine Hemmung wurde mit dem Magnesiumion (Magnesiumsulfat) gefunden.

(7) Molekulargewicht

Mittels SDS-Polyacrylamidelektrophorese wurde bestimmt, daß das Molekulargewicht dieses im Beispiel 2 erhaltenen Enzyms 38000 betrug.

(8) Aminosäurezusammensetzung

Das erfindungsgemäße Enzym wurde mit 6 M Salzsäure 24 Std. bei 105ºC hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde mit einem Aminosäure-Analysegerät (Hitachi, Modell 835) analysiert, um die Mengen der enthaltenen Aminosäuren zu messen. Die Messung wurde dreimal wiederholt, und das Verhältnis der Aminosäuremengen wurde berechnet, so daß die Aminosäurezusammensetzung erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3 Aminosäurezusammensetzung

Aminosäure Aminosäurerest (pro Molekül)
Asparagin + Asparaginsäure 15
Threonin - 11
Serin 43
Glutamin + Glutaminsäure 130
Glycin 37
Alanin 17
Valin 9
Methionin 1
Isoleucin 6
Leucin 7
Tyrosin 1
Phenylalanin 4
Lysin 8
Histidin 6
Arginin 3
Prolin 8
Bem.) Es wurden keine Experimente zum Nachweis von Tryptophan und Cystein durchgeführt.
Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß die Menge an Aminosäureresten pro Molekül am größten bei Glutamin + Glutaminsäure und am zweitgrößten bei Serin ist.

Beispiel 4

Herstellung und Analyse eines niedermolekularen Pektins aus Zitrone

a) Herstellung eines niedermolekularen Pektins aus Zitrone

(1) Herstellung von niedermolekularem Pektin durch JTF- 1-Kulturüberstand

Es wurden 100g eines Zitronenpektins (Wako Junyaku Kogyo) in 4 l einer 0,025 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 4,8) suspendiert, und 1 l des in (1) von Beispiel 1 hergestellten Kulturüberstands wurden hinzugegeben. Die erhaltene Lösung wurden 24 Std. bei 40ºC umgesetzt. Die erhaltene Reaktionslösung wurde mit einem Rotationsverdampfer bei 60ºC eingeengt und über Nacht gegen die 100fache Menge der Probenlösung an deionisiertem Wasser dialysiert. Das dialysierte Produkt wurde außerdem gefriergetrocknet, so daß 58,34 g des niedermolekularen Zitronenpektins erhalten wurden.

(2) Herstellung von niedermolekularem Pektin durch JTF- 2-Kulturüberstand

Es wurden 59,25 g eines niedermolekularen Pektins aus Zitrone nach den gleichen Verfahren wie in (1) erhalten, ausgenommen, daß 1 l des in (2) von Beispiel 1 erhaltenen Kulturüberstands verwendet wurde.

(3) Herstellung von niedermolekularem Pektin durch JTF- 3-Kulturüberstand

Es wurden 60,74 g eines niedermolekularen Pektins aus Zitrone nach den gleichen Verfahren wie in (1) erhalten, ausgenommen, daß 1 l des in (3) von Beispiel 1 erhaltenen Kulturüberstands verwendet wurde.

(4) Herstellung von niedermolekularem Pektin durch JTF- 4-Kulturüberstand

Es wurden 70,40 g eines niedermolekularen Pektins aus Zitrone nach den gleichen Verfahren wie in (1) erhalten, ausgenommen, daß 1 l des in (4) von Beispiel 1 erhaltenen Kulturüberstands verwendet wurde.

b) Analyse des niedermolekularen Zitronenpektins

Die in (1) bis (4) unter a) erhaltenen niedermolekularen Zitronenpektine wurden den nachstehenden Messungen (1) bis (4) unterworfen.

(1) Messung des Molekulargewichts

Der Hauptpeak der jeweiligen niedermolekularen Zitronenpektine wurde mittels HPLC-Analyse unter Verwendung einer TSK-G 4000 PW-Gelfiltrationssäule gemessen, um sein Molekulargewicht unter Verwendung von Pullulan (STANDARD P-82, Showa Denko) als Standard-Probe zu berechnen.

(2) Messung des Verhältnisses von Galacturonsäure zu Neutralzucker

Nachdem jedes niedermolekulare Zitronenpektin vollständig unter Verwendung von Driselase (KYOWA HAKKO) gespalten worden war, wurde das Verhältnis von Galacturonsäure zu Neutralzucker mittels HPLC-Analyse unter Verwendung einer Shodex-Zucker SH-1821-Säule (S. Matsuhashi, S. Inoue und C. Hatanaka, Biosci. Biotech. Biochem 56, S. 1053 (1992)) gemessen.

(3) Messung I der Viskosität

Eine 5%ige Lösung der jeweiligen erfindungsgemäßen niedermolekularen Zitronenpektine würde hergestellt, und ihre Viskosität wurde unter Verwendung eines Viskosimeters vom Typ E (Tokyo Keiki, VISCONIC ED Type) gemessen.
Die Ergebnisse der vorstehenden Messungen (1) bis (3) sind in Tabelle 4 gezeigt.

(4) Messung II der Viskosität

Die in (1) von a) erhaltene Viskosität des niedermolekularen Zitronenpektins wurde der eines Zitronenpektins verglichen. Die Viskositäten wurden unter Verwendung eines Viskosimeters vom Typ E gemessen (50 U/min). Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Die Viskosität des Pektins war erheblich geringer. Ähnliche Ergebnisse wurden für andere niedermolekulare Pektine erhalten.

(5) Die Ausscheidung verbessernde Wirkung

Vier Wochen alte männliche SD-Ratten wurden mit einem kommerziellen Festfutter (Orienthefe-Festfutter MF) 4 Tage lang gefüttert und in 4 Gruppen mit jeweils fünf Ratten aufgeteilt. Ein Futter mit dem in (1) von a) erhaltenen niedermolekularen Pektin und den in Tabelle 5 gezeigten Komponenten sowie ein Festfutter wurden jeder Gruppe gegeben, und die Ratten wurden 9 Tage lang gefüttert. Die Ausscheidungen der Ratten wurden am neunten Tag gesammelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Härte der Ausscheidungen durch das Festfutter wurde als Bezug verwendet. Die harten Ausscheidungen sind - (negativ), und die weichen Ausscheidungen sind + (positiv) Tabelle 5
1) Das Pektin und das niedermolekulare Pektin wurden aus Zitronenpektin (Wako Junyaku Kogyo) hergestellt. Tabelle 6
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das niedermolekulare Pektin, das unter Verwendung der erfindungsgemäßen Hefe hergestellt wurde, eine die Ausscheidungen erweichende Wirkung sowie eine die Ausscheidung verbessernde Wirkung aufweist. Ähnliche Ergebnisse wurden für andere niedermolekulare Pektine erhalten.

Beispiel 5

Anwendungen des niedermolekularen Pektins

Anwendungen für das in (1) von Beispiel 4 erhaltene niedermolekulare Pektin werden unter den folgenden Punkten a) bis c) beschrieben.

a) 30%iger Apfelsaft

Es wurden 6 Teile eines Sfach eingeengten Apfelsafts, 10 Teile gekörnter Zucker, 0,2 Teile DL-Äpfelsäure, 0,02 Teile Natriumzitrat und 83 Teile destilliertes Wasser mit 1 Teil des niedermolekularen Pektins gemischt, um einen 30%igen Apfelsaft herzustellen, der 1 Gew.-% niedermolekulares Pektin enthielt.
Der das niedermolekulare Pektin enthaltende Saft wies weiche nektarartige physikalische Eigenschaften auf.

b) Hartbonbons

Ein Zusammensetzungsmaterial (Tabelle 7), das 1 Teil niedermolekulares Pektin enthielt, wurde zur Herstellung eines harten Apfelbonbons verwendet.
Zucker, Hirsegelee und Wasser wurden miteinander gemischt, und das erhaltene Gemisch wurde auf 110ºC erhitzt. Das in einer kleinen Menge Wasser gelöste niedermolekulare Pektin wurde zum vorstehenden Gemisch gegeben und bis auf 147ºC eingekocht. Zitronensäure, Gewürze und ein Farbstoff wurden zugegeben und in das eingekochte Gemisch eingemischt. Das erhaltene Gemisch wurde abgekühlt und geformt. Als Kontrolle wurde ein hartes Apfelbonbon hergestellt, das durch Zugabe von 1 Teil Pektin erhalten worden war, und mit dem Bonbon von b) verglichen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 8 zusammengefaßt.

Tabelle 7

Bestandteile (Gewichtsteile)
Zucker 60
Hirsegelee 40
Apfelsaft (Sfach eingeengt) 2
Wasser 17,5
Zitronensäure 1
Gewürze 0,1
Farbstoff geeignete Menge
Niedermolekulares Pektin 1 Tabelle 8
Wenn 1 Gew.-% Pektin zum Bonbonmaterial gegeben wurde, bildete das Pektin einen Pulverklumpen und ließ sich nicht ausreichend dispergieren. Wurde dagegen niedermolekulares Pektin in der gleichen Menge wie das Pektin zugegeben, ließ sich das niedermolekulare Pektin ausreichend dispergieren und erleichterte die Herstellung von Bonbons. Außerdem war das Bonbon mit Pektin zu sauer und hatte einen merkwürdigen Geschmack. Das Bonbon mit niedermolekularem Pektin schmeckte dagegen gut.

c) Brot

Es wurde Brot unter Verwendung des in Tabelle 9 gezeigten Zusammensetzungsmaterials hergestellt.
Zuvor wurden 2,5 Teile niedermolekulares Pektin in Wasser gelöst, und diese wäßrige Lösung wurde in das Material (Tabelle 9) ohne Trockenhefe eingemischt. Das erhaltene Gemisch wurde in die Brotform einer Sanyo-Brotmaschine (SPM-B1) überführt, und die Trockenhefe wurde zugegeben. Das Gemisch wurde geknetet und fermentiert, um das Brot zu backen. Als Kontrolle wurde Brot unter Verwendung der Materialzusammensetzung (Tabelle 9) ohne das niedermolekulare Pektin gebakken.

Tabelle 9

Bestandteile (Gewichtsteile)
Proteinreiches Mehl 250
Zucker 14
Salz 3,5
Magermilch 6,8
Ziehfett 15
Trockenhefe 2,5
Wasser 180
Niedermolekulares Pektin 2,5
Die Ergebnisse des organoleptischen Tests sind in Tabelle 10 gezeigt. Brot mit etwa 0,5 Gew.-% niedermolekularem Pektin und Kontrollbrot waren fast gleich, aber das Brot mit niedermolekularem Pektin war weicher als die Kontrolle. Tabelle 10
Die obigen Tests a) bis c) wurden auch für die in (2) bis (4) des Beispiels 4 erhaltenen niedermolekularen Pektine durchgeführt, und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.

Beispiel 6

Herstellung eines niedermolekularen Apfelpektins

Aus Apfelpektin (Wako Junyaku Kogyo) wurden niedermolekulare Apfelpektine hergestellt, die durch die gleichen Verfahren wie in (1) von Beispiel 4 unter Verwendung der in (1) und (3) von Beispiel 1 erhaltenen Kulturüberstände erhalten wurden. Die erhaltenen niedermolekularen Pektine besaßen jeweils ein Molekulargewicht von 6,6 · 10&sup4;.

Beispiel 7

Herstellung von niedermolekularem Pektin durch den mittels Dialyse erhaltenen Kulturüberstand

(1) Herstellung von niedermolekularem Pektin unter Verwendung des Kulturüberstands aus einer von JTF-1 erhaltenen Enzymrohlösung

Ein niedermolekulares Pektin wurde nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 4 hergestellt, ausgenommen, daß ein Kulturüberstand, der durch Dialysieren von 1 l des im Verfahren (1) des Beispiels 1 erhaltenemüberstands über Nacht gegen 300 l einer 0,025 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 4,8) erhalten worden war, anstelle des im Verfahren (1) von Beispiel 1 hergestellten Kulturüberstands verwendet wurde. Das erhaltene niedermolekulare Pektin hatte ein Molekulargewicht von 6,6 · 10&sup4;.

(2) Herstellung von niedermolekularem Pektin unter Verwendung des Kulturüberstands aus einer von JTF-2 erhaltenen Enzymrohlösung

Ein niedermolekulares Pektin wurde nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 4 hergestellt, ausgenommen, daß ein Kulturüberstand, der durch Dialysieren von 1 l des im Verfahren (2) des Beispiels 1 erhaltenen Überstands über Nacht gegen 300 l einer 0,025 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 4,8) erhalten worden war, anstelle des im Verfahren (2) des Beispiels 1 hergestellten Kulturüberstands verwendet wurde. Das erhaltene niedermolekulare Pektin hatte ein Molekulargewicht von 6,6 · 10&sup4;.

(3) Herstellung von niedermolekularem Pektin unter Verwendung des Kulturüberstands aus einer von JTF-3 erhaltenen Enzymrohlösung

Ein niedermolekulares Pektin wurde nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 4 hergestellt, ausgenommen, daß ein Kulturüberstand, der durch Dialysieren von 1 l des im Verfahren (3) des Beispiels 1 erhaltenen Überstands über Nacht gegen 300 l einer 0,025 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 4,8) erhalten worden war, anstelle des im Verfahren (3) des Beispiels 1 hergestellten Kulturüberstands verwendet wurde. Das erhaltene niedermolekulare Pektin hatte ein Molekulargewicht von 6,6 · 10&sup4;.

(4) Herstellung von niedermolekularem Pektin unter Verwendung des Kulturüberstands aus einer von JTF-4 erhaltenen Enzymrohlösung

Ein niedermolekulares Pektin wurde nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 4 hergestellt, ausgenommen, daß ein Kulturüberstand, der durch Dialysieren von 1 l des im Verfahren (4) des Beispiels 1 erhaltenen Überstands über Nacht gegen 300 l einer 0,025 M Essigsäure-Pufferlösung (pH-Wert 4,8) erhalten worden war, anstelle des im Verfahren (4) des Beispiels 1 hergestellten Kulturüberstands verwendet wurde. Das erhaltene niedermolekulare Pektin hatte ein Molekulargewicht von 6,6 · 10&sup4;.

Claims

1. Pektinase zur Spaltung von Pektin oder Pektinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß

(i) die Pektinase eine Endopolygalacturonase ist, erhalten aus einem Saccharomyces-Stamm,

(ii) der optimale pH bei der Reaktion bei 35ºC für 20 Minuten 4,0 beträgt,

(iii) der stabile pH-Bereich beim Erwärmen bei 35ºC für 60 Minuten 4,0 bis 8,0 beträgt,

(iv) die optimale Temperatur bei der Reaktion bei einem pH von 5,0 45ºC beträgt,

(v) die enzymatische Aktivität beim Erwärmen bei einem pH von 5,0 für 60 Minuten bis 45ºC stabil ist,

(vi) das Molekulargewicht 38000 ist, und

(vii) die Pektinase Pektin oder Pektinsäure zu einem Molekulargewicht von 20000 bis 80000 spaltet.

2. Pektinase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Endopolygalacturonase aus Saccharomyces bayanus hergestellt wird.