DE69624623T2

DE69624623T2 - Versteifte Monomethin-Cyaninfarbstoffe

Info

Publication number: DE69624623T2
Application number: DE69624623T
Authority: DE
Inventors: Bhalchandra Madhav Karandikar; Ratnakar Balvant Mujumdar; Alan Stewart Waggoner
Original assignee: Carnegie Mellon University
Current assignee: Carnegie Mellon University
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2016-05-31
Also published as: GB2301832B; DE29610062U1; GB2301832A; AU5478796A; GB9611290D0; EP0747448B1; AU719182B2; EP0747448A2; DE69624623D1; JPH09100416A; CA2178304A1; EP0747448A3; ATE227322T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chemische Farbstoffe, welche als Fluoreszenzmarker verwendet werden können. Insbesondere betrifft die Erfindung Verbindungen auf Cyaninfarbstoffbasis, welche durch die Einbringung einer Verbrückungsgruppe zwischen den heterozyklischen Ringen der Verbindungen versteift worden sind, und Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Zielfarbstoffe können hergestellt oder chemisch modifiziert werden, um reaktive oder andere Gruppen einzuschließen, um den Verbindungen zu gestatten, mit einem Material kovalent oder nichtkovalent zu assoziieren, um dadurch dem Material fluoreszierende Eigenschaften zu verleihen.
Fluoreszierende Farbstoffe sind allgemein bekannt und werden für die Fluoreszenzmarkierung und -nachweis von verschiedenen biologischen und nichtbiologischen Materialien durch Verfahrensweisen, wie Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzimmunoassay und -flusszytometrie, verwendet. Ein typisches Verfahren zur Markierung solcher Materialien mit fluoreszierenden Farbstoffen ist es, einen fluoreszierenden Komplex mit Hilfe einer Bindung zwischen geeigneten Gruppen auf dem Farbstoffmolekül und kompatiblen Gruppen auf dem zu markierenden Material zu kreieren. Auf diese Weise können Materialien wie Zellen, Gewebe, Aminosäuren, Proteine, Antikörper, Arzneistoffe, Hormone, Nucleotide, Nucleinsäuren, Lipide und Polysaccharide und dergleichen chemisch markiert und delektiert oder quantifiziert werden, oder sie können als fluoreszierende Sonden eingesetzt werden, welche spezifisch an Zielmaterialien binden können und durch Fluoreszenznachweisverfahren delektiert werden können.
Vier gängigerweise verwendete Klassen an fluoreszierenden Farbstoffen sind jene, die auf Fluorescein- (grüne Fluoreszenz) und Rhodamin- (orange Fluoreszenz), Cumann- und Pyren-(blaue Fluoreszenz)Chromophoren basieren. Farbstoffe, die auf Fluorescein basieren, haben eine Vielzahl von Nachteilen, einschließlich ihrer Tendenz, durch Licht auszubleichen, wenn sie durch starke Anregungsquellen illuminiert werden. Der resultierende schnelle Verlust des Bildes mit der Zeit macht den Nachweis und die Quantifizierung mit diesen Farbstoffen schwieriger. Fluoresceinderivate besitzen ebenfalls ein pH-empfindliches Absorptionsspektrum, und die Fluoreszenzausbeute nimmt in starkem Maße unterhalb von einem pH-Wert von 8 ab. Rhodaminderivate sind schwierig zu verwendende Markierungsreagenzien und sind nicht besonders fluoreszent, wenn sie an Proteine gebunden sind. Cumarin- und Pyrentrisulfonate besitzen breite Absorptions- und Emissionsspektren und relativ niedrige Extinktionskoeffizienten.
Multiple Fluorophore mit jeweils einem unterschiedlichen Emissionsspektrum werden gängigerweise in der Multiplexdetektion von durch Fluoreszenz markierten Materialien bei solchen Verfahrensweisen wie der Flusszytometrie, Mikroskopie, Elektrophorese etc. verwendet. Um das Überlappen von Fluoreszenzsignalen zu verringern, ist es wünschenswert, fluoreszierende Farbstoffe mit engen Absorptions- und Emissionsbanden zu verwenden. Farbstoffe, die z. B. auf dem Cumarinchromophor basieren, weisen breite Absorptions- und Emissionspeaks (sowie relativ niedrige Extinktionskoeffizienten) auf und sind deshalb für solche Anwendungen nicht so geeignet.
Das US-Patent Nr. 5268486 beschreibt, dass Cyaninverbindungen der Formel (1):
in der die gestrichelten Linien ein bis drei Ringe mit fünf bis sechs Atomen in jedem Ring bedeuten, als fluoreszierende Farbstoffe brauchbar sind. Die R&sub3;-, R&sub4;-, R&sub8;- und R&sub9;-Gruppen sind an den Ringen gebunden. Zumindest eine der R&sub8;- und R&sub9;-Gruppen ist eine Sulfonsäure oder Sulfonatgruppe, und mindestens eine der R&sub1;-, R&sub2;-, R&sub3;-, R&sub4;- und R&sub7;-Gruppen ist ein Rest, der mit Amino-, Hydroxy-, Phosphoryl- oder Sulfhydrylgruppen reagiert. Diese Verbindungen sind als fluoreszierend in den grünen, orangen, roten und im nahen Infrarotbereich liegenden Regionen des Spektrums beschrieben.
"Versteifte" Cyaninfarbstoffe mit einer Methingruppe zwischen den Heterozyklen und basierend auf der Bis-Pyrromethenbordifluorid-Struktur sind in den US-Patenten Nr. 4774339, 5128288, 5248782, 5274113 und 5451663 beschrieben. Die Grundstruktur ist in der Formel (2) gezeigt:
in der Pyrrolringe substituiert sein können. Besondere Derivate dieser Struktur schließen 3,3',5,5'- Tetramethyl-2,2'-bispyrromethen-1,1'-bordifluorid, das unter dem Handelsnamen BODIPY von Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, vertrieben wird, ein. BODIPY-Analoga sind in dem oben stehenden US-Patent Nr. 4774339 beschrieben. Die BODIPY-Moleküle fluoreszieren im Allgemeinen bei Wellenlängen von mehr als oder gleich 500 nm. Zum Beispiel werden in dem '339-Patent Farbstoffe auf Pyrrolbasis beschrieben, welche Wellenlängen, die zu Fluorescein vergleichbar sind, absorbieren und emittieren, d. h. bei etwa 490 bzw. 500 nm.
Eine Monomethinbordifluorid-Struktur auf Pyridinbasis der Formel (3) und ein Monomethinborkomplex auf Chinolinbasis (Formel (4) R = H; Scheibe et al., Z. Phys. Chem., Vol. 64, 97-114 (1969)) sind ebenfalls beschrieben worden. Obgleich die Verbindungen auf Chinolinbasis zur Verwendung als Laserfarbstoffe evaluiert wurden, ist es unbekannt, ob sie als fluoreszierende Marker brauchbar sind. Basierend auf ihrer Struktur wird angenommen, dass das Chinolinderivat ein Emissionsmaximum von mehr als 500 nm aufweisen würde.
Mit Alkylen versteifte Cyaninfarbstoffe der allgemeinen Formel (5) sind ebenfalls beschrieben worden; siehe zum Beispiel: Ramos et al., J. Crystallographic and Spectroscopic Research, Vol. 21, Nr. 2, 179-182 (1991); Sturmer und Gaugh, Photographic Science and Engineering, Vol. 19, Nr. 5, 273 (1975); britisches Patent Nr. 610064, 618889 (Kodak); US-Patent Nr. 4490463 (Kodak); 2541400 (Brooker et al.) und 3148187 (Heseltine).
Farbstoffe, wie jene oben beschriebenen, sind brauchbar in photographischen Emulsionen als Sensibilisierungsmittel. Gleichwohl können sie nicht verwendet werden und sind nicht als fluoreszierende Markierungsfarbstoffe beschrieben wurden.
Keine der vorstehenden Literaturen beschreibt fluoreszierende Farbstoffverbindungen, welche funktionelle Gruppen und/oder Solubilisierungsgruppen enthalten, die den Farbstoff für eine kovalente Markierung, insbesondere für die kovalente Markierung von biologischen Molekülen und anderen Zielmaterialien, geeignet macht. Es besteht deshalb ein Mangel an hellen, löslichen, fluoreszierenden Farbstoffverbindungen, welche im kürzeren Wellenlängenbereich (300-500 nm) des Spektrums fluoreszieren, erwünschte spektrale Eigenschaften aufweisen und verwendet werden können, um eine große Vielzahl von Materialien zu markieren.
Wir haben nun eine neue Klasse an versteiften Monomethincyaninen gefunden, welche helle, stark fluoreszierende, stark Licht-absorbierende Farbstoffe und fluoreszente Marker sind, welche im nahen UV- und blauen (300-500 nm) Bereich des Spektrums emittieren und welche bei einer Vielzahl von biologischen und nicht-biologischen Anwendungen eingesetzt werden können.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung versteifte fluoreszierende Monomethincyaninverbindungen der Formel (6):
wahlweise substituiert durch Gruppen R&sup4; bis R&sup7;, oder durch Gruppen R² bis R&sup7;, wenn T Kohlenstoffatome enthält, worin R² und R³ an die Kohlenstoffatome von T gebunden sind und R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind, oder wahlweise an Atome der Z¹- und Z²- Ringstrukturen gebunden sind;
die Gruppen R² bis R&sup7;, welche gleich oder verschieden sind, gewählt sind aus -R&sup9; und -L-R&sup9;, worin R&sup9; gewählt ist aus neutralen Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit reduzieren, polaren Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit erhöhen, funktionellen Gruppen, welche in Markierungsreaktionen verwendet werden können, reaktiven Gruppen, elektronenabgebenden und -abziehenden Gruppen, welche die Absorptions- und Emissionswellenlängen des fluoreszierenden Moleküls verschieben, lipid- und kohlenwasserstoffsolubilisierenden Gruppen, und L gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub6;-Alkylkette, einem C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Monoether oder -Polyether und einer bis zu vier sekundäre Amidbindungen enthaltenden C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Atomkette;
R¹ gewählt ist aus Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cyano, Nitro, Aldehyd, Halogen, Hydroxy, Alkylgruppen mit 26 Kohlenstoffatomen oder weniger, Amino, quaternäres Amino, Acetal, Ketal, Phosphoryl, Sulfhydryl, wassersolubilisierenden Gruppen und -(CH&sub2;)nQ, worin 1 < n < 26 und Q gewählt ist aus Amino, substituiertem Amino, quaternärem Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, Amid, Nitro und Gruppen, welche reaktiv sind mit Amino, Hydroxyl, Aldehyl, Phosphoryl oder Sulfhydrylgruppen;
T eine Verbindungsgruppe ist, so dass
ein 6- oder 7-gliedriger Ring ist;
X und Y gleich oder verschieden sein können und gewählt sind aus zweifach substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selen, CH=CH und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH&sub2;)nR&sup8;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R&sup8; gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sufat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Amino, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche reaktiv sind mit Amino, Hydroxyl, Carbonyl, Phosphoryl und Sulfhydrylgruppen;
eine der Gruppen Z¹ und Z² eine Bindung bedeutet oder die Atome, welche notwendig sind zur Vervollständigung eines, zweier kondensierter oder dreier kondensierter aromatischer Ringe, wobei jeder Ring fünf oder sechs Atome besitzt, gewählt aus Kohlenstoffatomen, und wahlweise nicht mehr als zwei Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen, und die andere Gruppe Z¹ oder Z² die Atome bedeutet, welche notwendig sind zur Vervollständigung eines, zweier kondensierter oder dreier kondensierter aromatischer Ringe, wobei jeder Ring fünf oder sechs Atome aufweist, gewählt aus Kohlenstoffatomen und wahlweise nicht mehr als zwei Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen; vorausgesetzt, dass mindestens eines von R¹ bis R&sup7; eine reaktive Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt oder eine funktionelle Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt.
Geeignete neutrale Gruppen können aus der Gruppe gewählt werden, die aus Wasserstoff und Halogenatomen besteht.
Geeignete polare Gruppen können Gruppen sein, die aus der Gruppe gewählt werden, die aus Amid, Sulfonat, Sulfat, Phosphat, quaternärem Ammonium, Guanidinium, Hydroxyl, Phosphonat besteht.
Geeignete funktionelle Gruppen können aus der Gruppe gewählt werden, die aus gegebenenfalls substituiertem Amino, Azido, Hydroxyl, Sulfhydryl, Imidazol, Carboxyl und Carbonyl besteht.
Geeignete reaktive Gruppen können aus der Gruppe gewählt werden, die aus Succinimidylester, Isothiocyanat, Isocyanat, Anhydrid, Halogenacetamid, Maleimid, Sulfonylhalogenid, Phosphoramidit, Säurehalogenid, Acylazid, Alkylimidat, Hydrazid, Arylimidat, Hydroxylaminen, Carbodiimiden besteht.
Geeignete Elektronen abgebende und -abziehende Gruppen können aus der Gruppe gewählt werden, die aus Amid-, Cyano-, Nitro-, Alkoxy-, Styryl-, Aryl- und Heteroarylgmppen besteht.
Geeignete Lipid- und Kohlenwasserstoff-solubilisierende Gruppen können aus der Gruppe gewählt werden, die aus Alkyl-, Aryl- und Aralkylgruppen besteht; und
L ist aus der Gruppe gewählt, die aus einer geraden oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub6;-Alkylkette, einem C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;- Monoether oder -polyether und einer C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenstoffkette, enthaltend bis zu vier sekundäre Amidverknüpfungen, besteht.
Bevorzugte R&sup9;-Gruppen werden gewählt aus: Wasserstoff, Halogen, Amid, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Sulfonat, quaternäres Ammonium, Guanidinium, Hydroxyl, Phosphonat, gegebenenfalls substituiertes Amino, Azido, Sulfhydryl, Carbonyl, reaktiven Gruppen, zum Beispiel Succinimidylester, Isothiocyanat, Anhydrid, Halogenacetamid, Maleimid, Sulfonylhalogenid, Phosphoramidit, Säurehalogenid, Alkylimidat, Hydrazid und Carbodiimid; und Gruppen, die mit Amino-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Phosphoryl- oder Sulfhydrylgruppen reaktiv sind.
Vorzugsweise ist R¹ gewählt aus Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cyano, Halogen, Alkylgruppen mit sechsundzwanzig Kohlenstoffatomen oder weniger und -(CH&sub2;)nQ, wobei 1 < n < 26 und Q gewählt ist aus Amino, Aldehyd, Hydroxyl und Gruppen, die mit Amino-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Phosphoryl oder Sulfhydrylgruppen reaktiv sind.
Bis-substituierter Kohlenstoff schließt Bis-C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen und C&sub4;-C&sub5;-Spiroalkylgruppen ein.
Geeigneterweise ist T aus > CR²R³, -CHR²-CH³- und BM&sub2; gewählt, wobei B Bor ist und M Fluor oder Chlor ist.
Geeignetes X und Y sind aus Bis-Alkyl-substituiertem Kohlenstoff, einschließlich C&sub4;-C&sub5;- Spiroalkylderivaten, Oxygen, Schwefel, Selen, -CH=CH- und Stickstoff gewählt.
Geeigneterweise ist W eine Gruppe -(CH&sub2;)nR&sup8;, in der n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist und R&sup8; aus Wasserstoff, Amino, Sulfonat, Carboxylat, Aryl, Hydroxyl und Gruppen gewählt ist, die mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Phosphoryl- oder Sulfhydrylgruppen reaktiv sind.
Spezifische Beispiele für die Gruppen R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; und die Gruppen, mit denen diese R-Gruppen reagieren, sind in Tabelle 1 aufgerührt. Alternativ können die R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; die funktionellen Gruppen von Tabelle 1 sein, welche mit den reaktiven Gruppen eines Zielmoleküls reagieren könnten. Tabelle 1
Zusätzlich zu diesen in Tabelle 1 aufgelisteten Gruppen sind eine Vielzahl von anderen Gruppen als reaktive Substituenten in den R¹-R&sup7;-Positionen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung möglich. Zum Beispiel die reaktiven Gruppen, welche besonders für das Markieren von Zielkomponenten mit verfügbaren Amino- und Hydroxy-funktionellen Gruppen brauchbar sind, schließen Folgende ein:
worin n = 0 oder eine ganze Zahl von 1-10 ist und mindestens eines von R¹&sup0; oder R¹¹ eine Abgangsgruppe wie I, Br oder Cl ist.
Spezifische Beispiele für mögliche R¹-, R²-, R³-, R&sup4;-, R&sup5;-, R&sup6;- und R&sup7; Gruppen, welche besonders brauchbar für die Markierung von Zielkomponenten mit verfügbaren funktionellen Sulhydrylgruppen sind, schließen Folgende ein:
worin n = 0 oder eine ganze Zahl ist und R¹² eine Abgangsgruppe wie I oder Br ist.
Spezifische Beispiele für mögliche funktionelle R¹-, R²-, R³-, R&sup4;-, R&sup5;-, R&sup6;- und R&sup7;- Gruppen, welche besonders brauchbar für das Markieren von Zielkomponenten durch Licht-aktivierte Vernetzungsverknüpfung sind, schließen Folgende ein:
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzen die Verbindungen der Formel (6) die Formel (7):
gegebenenfalls substituiert durch die Gruppen R&sup4; bis R&sup7;, wobei R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; an den X und Y enthaltenden Ringen gebunden sind, oder gegebenenfalls an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind, und wobei R¹, R&sup4; bis R&sup7;, X, Y, Z¹, Z² und M wie vorstehend definiert sind;
mit der Maßgabe, dass mindestens einer von R¹ und R&sup4; bis R&sup7; eine reaktive Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf einem Zielmaterial umfasst, oder eine funktionelle Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial umfasst.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzen die Verbindungen der Formel (6) die Formel (8);
wahlweise substituiert durch Gruppen R² bis R&sup7;, worin die Gruppen R² bis R³ an die Ethylen- Verbindungsgruppe,
gebunden sind, und die Gruppen R&sup4; bis R&sup7; an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind, oder wahlweise an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind, wobei die Gruppen R¹, R²-R&sup7;, X, Y, Z¹ und Z² wie vorstehend definiert sind;
mit der Maßgabe, dass mindestens eines von R¹ bis R&sup7; eine reaktive Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf einem Zielmaterial umfasst oder eine funktionelle Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial umfasst.
Alkyl ist eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1-26 Kohlenstoffatomen.
Aryl ist ein aromatischer oder polyaromatischer Substituent mit 1-4 aromatischen Ringen mit sechs konjugierten Kohlenstoffatomen und keinen Heteroatomen, welche gegebenenfalls miteinander verschmolzen sind oder aneinander durch Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindungen verbunden sind und durch eine Einfachbindung verknüpft sind, oder es ist gegebenenfalls und unabhängig durch geradekettige oder verzweigtkettige Alkylketten oder polaren Gruppen substituiert, welche die Wasserlöslichkeit erhöhen.
Heteroaryl ist ein 5- oder 6-gliedriger aromatischer Heterozyklus, welcher gegebenenfalls zu zusätzlichen 6-gliedrigen Ringen verschmolzen ist oder zu einem zusätzlichen 5- oder 6-gliedrigen heteroaromatischen Ring verschmolzen ist, wobei diese heteroaromatischen Ringe mindestens 1 oder nicht mehr als 3 Heteroatome enthalten, welche aus N, O und S gewählt sein können, wobei das Heteroaryl durch eine Einfachbindung verbunden ist und gegebenenfalls und unabhängig durch gerade oder verzweigte Alkylketten oder polare Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit erhöhen, substituiert ist.
Aralkyl ist eine C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppe, welche durch eine Aryl- oder Heteroarylgruppe substituiert ist.
Halogen und Halogengruppen sind jene, welche aus Chlor, Brom und Iod gewählt sind.
Für den Zweck der Erhöhung der Wasserlöslichkeit oder der Verringerung von einer nicht erwünschten nichtspezifischen Bindung der Fluoreszenz markierten Komponente an ungeeignete Komponenten in der Probe oder zur Verringerung von Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehreren reaktiven Chromophoren auf der markierten Komponente, was zu einem Quenchen der Fluoreszenz führen kann, können die funktionellen R¹-, R²-, R³-, R&sup4;-, R&sup5;-, R&sup6;- und R&sup7;-Gruppen aus den allgemein bekannten polaren und elektrisch geladenen chemischen Gruppen gewählt werden.
Beispiele für solche Gruppen sind -E-F-, wobei F Hydroxy, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertes Amino oder quaternäres Amino ist und wobei E eine Abstandsgruppe wie -(CH&sub2;)n- ist, wobei n 0-6 ist. Brauchbare Beispiele für die -E-F-Gruppen schließen die C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylsulfonate wie -(CH&sub2;)&sub3;-SO&sub3;&supmin; und -(CH&sub2;)&sub4;-SO&sub3;&supmin; ein.
Beispielhafte Verbindungen der vorliegenden Erfindung, welche die Fähigkeit zur Einstellung der Fluoreszenzfarbe, Wasserlöslichkeit und der Position der reaktiven oder funktionellen Gruppe besitzen, sind wie folgt:
i) 6,6'-Disulfo-meso-carboxymethyl-bis-(benzothiazolyl)methinbordifluorid
ii) α-Carboxymethyl-5,5'-disulfo-3,3'-ethylenoxacyanin
iii) 3,3'-Ethylen-6-sulfothia-5'-carboxymethyl-6'-sulfooxamonomethincyanin
iv) 5-Carboxymethyl-bis-(benzoxazotyl)methinbordifluorid
v) α-Carboxymethyl-3,3'-ethylenthiacyanin
vi) meso-Carboxymethyl-benzoxazolyl-benzothiazolylmonomethinbordifluorid.
Die hierin dargelegten Gruppen sollen nicht bedeuten, dass sie lediglich alle sind, von jenen Gruppen, welche an den R-Stellen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung eingebracht werden können. Es versteht sich, dass es verschiedene andere Gruppen gibt, welche mit Gruppen auf dem Material, was mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu markieren ist, reagieren werden. Verbindungen, welche durch die Einbringung von solchen anderen Gruppen an den R¹- bis R&sup7;-Positionen hergestellt werden, sollen durch die vorliegende Erfindung eingeschlossen sein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in zahlreichen biologischen und nicht-biologischen Anwendungen zum Einsatz kommen. Bezüglich nicht-biologischer Anwendungen können Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer oder mehreren ungeladenen Gruppen an den R¹- bis R&sup7;-Positionen, zum Beispiel C&sub1;&submin;&sub2;&sub6;-Alkyl- und Arylresten, in nichtpolaren Materialien gelöst werden, um diesen Materialien fluoreszierende Eigenschaften zu verleihen. Solche nichtpolaren Materialien schließen zum Beispiel Anstriche, Polymere, Wachse, Öle, Tinten und Kohlenwasserstofflösungsmittel ein. Eine andere nichtbiologische Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer oder mehreren geladen und/oder polaren Gruppen an den R¹- bis R&sup7;-Positionen in polaren Lösungsmitteln oder anderen Materialien, wie zum Beispiel Wasser, Ethylenglykol, Methylalkohol oder einer Mischung von Wasser und Methylalkohol, zu lösen. Solche geladenen R-Gruppen schließen zum Beispiel -NR&sub3;&spplus;, -SO&sub3;&supmin;, -PO&sub3;&supmin; und -COO&supmin; ein, wobei solche polaren R-Gruppen zum Beispiel Hydroxylgruppen einschließen. In Bezug auf biologische Anwendungen können biologische Moleküle nicht kovalent unter Verwendung der vorliegenden Komplexe markiert werden. Zum Beispiel können Komplexe der vorliegenden Erfindung, in denen mindestens eines von R¹ bis R&sup7; eine Ladung, zum Beispiel quaternäres Amino, enthält, eingesetzt werden, um nichtkovalent an geladenen biologischen Molekülen wie zum Beispiel DNA und RNA zu binden. Darüber hinaus können Verbindungen der vorliegenden Erfindung, in denen mindestens eines von R¹ bis R&sup7; eine ungeladene Gruppe ist, zum Beispiel ein langkettiges Alkyl, verwendet werden, um an nicht geladenen biologischen Molekülen wie beispielsweise biologischen Lipiden zu binden.
Die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls als Laserfarbstoffe gemäß den Verfahrensweisen, die in dem US-Patent Nr. 4916711 von Boy er und Morgan beschrieben sind, verwendet werden. Laserfarbstoffe müssen fluoreszent sein, müssen eine Quantenausbeute von mehr als 0,56 oder 0,57 aufweisen und müssen in vernünftiger Weise photostabil sein. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung erfüllen jedes dieser Erfordernisse. Ferner können die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung als Textilfarbstoffe, photographische Farbstoffe und als organische Leiter verwendet werden.
Die Komplexe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls als kovalente Markierung eines Zielmaterials zum Einsatz kommen, um fluoreszente Eigenschaften dem Zielmaterial zu verleihen. Eine kovalente Markierung unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann entweder in einer biologischen oder einer nicht-biologischen Anwendung genutzt werden. Beispiele für Zielmaterialien, welche bei nicht-biologischen Anwendungen markiert werden können, schließen zum Beispiel Materialien auf Zellulosebasis (einschließlich zum Beispiel Papiere), Textilien, Produkte auf Erdölbasis, photographische Filme, Gläser, Polymere und Gelfiltrations- und Chromatographiemedien ein.
Ein kovalentes Markieren unter Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann mit einer Zielsubstanz bewerkstelligt werden, welche mindestens eine funktionelle oder reaktive Gruppe, wie es vorstehend definiert ist, aufweist. Die Zielsubstanz kann mit einer Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung inkubiert werden, bei der mindestens eines von R¹ bis R&sup7; eine reaktive oder funktionelle Gruppe, wie vorstehend definiert, einschließt und kovalent mit der funktionellen oder reaktiven Gruppe des Zielmaterials binden kann. Das Zielmaterial und die Verbindung der vorliegenden Erfindung werden unter Bedingungen und für einen Zeitraum inkubiert, die ausreichend sind, um es zu ermöglichen, dass das Zielmaterial an die Verbindung der vorliegenden Erfindung kovalent gebunden wird.
R¹ bis R&sup7; können so gewählt werden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit unterschiedlichen Zielverbindungen reagieren und/oder unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen, wodurch eine Vielzahl von verwandten Verbindungen vorgesehen werden, welche in Multiplexanalysen zum Einsatz kommen können, wobei die Anwesenheit und Menge von verschiedenen Verbindungen in einer einzigen Probe differenziert werden muss, basierend auf den Wellenlängen und Intensitäten einer Anzahl von delektierten Fluoreszenzemissionen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in wässrigen, anderen polaren oder nichtpolaren Medien, welche das zu markierende Material enthalten, durch geeignete Wahl von R-Gruppen löslich gemacht werden.
Komplexe der vorliegenden Erfindung besitzen ebenfalls scharfe und deutliche Absorptions- und Emissionsmaxima, eine kleine Stokes-Verschiebung und sind relativ photostabil, sodass ihre Emissionssignale sich nicht abschwächen, wenn sie in einem Detektionssystem illuminiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Markierungsverfahren, wobei die Komplexe der vorliegenden Erfindung, die mindestens eine funktionelle Gruppe an den R¹- bis R&sup7;-Positionen einschließen, mit Amino, Hydroxyl, Aldehyd, Phosphoryl, Carboxyl, Sulfhydryl oder anderen reaktiven Gruppen von Proteinen oder anderen Materialien reagieren. Solche anderen Materialien, welche durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung markiert werden können, schließen Nucleinsäure, DNA, RNA, Blutzellen, mikrobielle Materialien und Peptide, Proteine, Arzneistoffe, Kohlenhydrate, Toxine, Teilchen, Kunststoff- oder Glasoberflächen, Polymere und andere Materialien, welche reaktive Amino-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen einschließen, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In breitem Umfang verfügbare automatisierte DNA-Sequenzierer, Instrumente für die Kapillarelektrophorese und Fluoreszenzgel-Lesegeräte sind Beispiele für Instrumente zum Detektieren von Fluoreszenz-markierten Materialien.
Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen Ein-Schritt-Markierungsverfahren betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls Zwei-Schritt-Markierungsverfahren, in denen in einem ersten Schritt eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer primären Komponente kovalent reagiert und dadurch diese markiert, wie einem Antikörper. In einem zweiten oder Färbungsschritt der Zwei- Schritt-Verfahrensweise wird die Fluoreszenz-markierte primäre Komponente dann als eine Sonde für eine sekundäre Komponente wie einem Antigen, für das der Antikörper spezifisch ist, verwendet. Wenn die Zielsubstanz der auf diese Weise markierten Antikörper eine Zelle ist, kann der zweite Schritt der Vorgehensweise verwendet werden, um die Menge an markierten Antikörpern, welche an den Typ der Zelle anheften, bestimmt werden, indem die Intensität der Fluoreszenz der Zellen bestimmt wird. Durch diese Zwei-Schritt-Verfahrensweise könnten monoklonale Antikörper und andere Komponenten, welche kovalent in dem ersten Schritt mit den fluoreszierenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung markiert sind, als Antigensonden verwendet werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um die Konzentration eines bestimmten Proteins oder einer anderen Komponente in einem System zu bestimmen. Wenn die Anzahl an reaktiven Gruppen auf einem Protein, welches mit einer Sonde reagieren kann, bekannt ist, kann die Fluoreszenz pro Molekül bekannt sein, und die Konzentration dieser Moleküle in dem System kann bestimmt werden durch die Fluoreszenzgesamtintensität des Systems. Das besondere Verfahren kann verwendet werden, um die Konzentration von verschiedenen markierten Analyten unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes oder anderer bekannter Immunofluoreszenz-Detektionssysteme zu messen. Die Konzentration von Fluoreszenz-markiertem Material kann ebenfalls bestimmt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Fluoreszenzpolarisations-Detektionsinstrumenten.
Die Fluoreszenzverbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls bei einem Detektionsverfahren eingesetzt werden, wobei eine Vielzahl von den fluoreszierenden Verbindungen kovalent an einer Vielzahl von unterschiedlichen primären Komponenten wie Antikörpern gebunden sind, wobei jede primäre Komponente für eine unterschiedliche sekundäre Komponente wie ein Antigen spezifisch ist, um jede einer Vielzahl von sekundären Komponenten in einer Mischung aus sekundären Komponenten zu identifizieren. Gemäß diesem Verfahren des Einsatzes wird jede der primären Komponenten separat mit einer fluoreszierenden Verbindung mit einer unterschiedlichen Lichtabsorptions- und Emissionswellenlängen-Charakteristik im Vergleich zu den Farbstoffmolekülen, die für die Markierung der anderen primären Komponenten verwendet werden, markiert. Die so genannten primären Komponenten werden dann zu der Präparation, welche sekundäre Komponenten enthält, wie Antigene, hinzugesetzt, und den primären Komponenten wird gestattet, dass sie sich an die jeweiligen sekundären Komponenten, für welche sie selektiv sind, binden.
Jedwede nicht umgesetzte Sondenmaterialien können von der Präparation zum Beispiel durch Waschen entfernt werden, um eine Interferenz mit der Analyse zu verhindern. Die Präparation wird dann einem Bereich an Anregungswellenlängen ausgesetzt, einschließlich den Absorptionswellenlängen von bestimmten fluoreszierenden Verbindungen. Ein Fluoreszenz-Mikroskop oder ein anderes Fluoreszenz-Detektionssystem wie ein Flusszytometer oder Fluoreszenz-Spektrophotometer mit Filtern oder Monochromatoren, um die Strahlen der Anregungswellenlänge zu wählen und die Wellenlängen der Fluoreszenz zu wählen, kommt als Nächstes zum Einsatz, um die Intensität der Emissionswellenlängen in Entsprechung zu den angewandten fluoreszierenden Verbindungen zu bestimmen, wobei die Intensität der Fluoreszenz die Quantität der sekundären Komponente, welche mit einer bestimmten markierten primären Komponente verbunden wurde, angibt. Bekannte Techniken zur Durchführung von Multiparameter-Fluoreszenz-Studien schließen zum Beispiel die Multiparameter-Flusszytometrie ein.
In bestimmten Fällen kann eine einzelne Anregungswellenlänge angewandt werden, um die Fluoreszenz von zwei oder mehreren Materialien in einer Mischung anzuregen, wobei jede bei einer anderen Wellenlänge fluoresziert, und die Menge jeder markierten Spezies kann gemessen werden, indem ihre individuelle Fluoreszenzintensität bei ihrer jeweiligen Emissionswellenlänge delektiert wird. Sofern erwünscht, kann ein Lichtabsorptionsverfahren ebenfalls zur Anwendung kommen.
Das Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung kann bei jedem System zur Anwendung kommen, bei dem die Bildung einer primären fluoreszierenden Komponente möglich ist. Zum Beispiel kann eine in geeigneter Weise reaktive fluoreszierende Verbindung an ein DNA- oder RNA-Fragment konjugiert werden, und das resultierende Konjugat kann dann einer Bindung an einen komplementären Zielstrang von DNA oder RNA unterzogen werden. Eine geeignete Fluoreszenz- Detektionsgerätschaft kann dann zum Einsatz kommen, um die Anwesenheit von gebundenen fluoreszierenden Konjugaten nachzuweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die kovalente Reaktion zwischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung und Amin, Hydroxy, Aldehyd, Sulfhydryl, Phosphoryl und anderen bekannten funktionellen Gruppen auf Materialien wie zum Beispiel Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, derivatisierten Nucleinsäuren, Lipiden, bestimmten anderen biologischen Molekülen, biologischen Zellen, löslichen Polymeren, Polymerenteilchen, Polymeroberflächen, Polymermembranen, Glasoberflächen und anderen Teilchen und Oberflächen. Da das Nachweisen von Fluoreszenz hochempfindliche optische Techniken involviert, kann die Anwesenheit von diesen Farbstoff-"Markierungen" selbst dann nachgewiesen und quantifiziert werden, wenn die Markierung nur in sehr niedrigen Mengen vorhanden ist. Somit können die Farbstoff-Markierungsreagenzien ebenfalls verwendet werden, um die Menge eines Materials zu quantifizieren, welches markiert worden ist.
Im Vergleich zum Beispiel mit den Fluoresceinen sind die versteiften Monomethincyanine der vorliegenden Erfindung besonders photostabil und sind gegenüber pH-Änderungen zwischen einem pH-Wert von 2 und einem pH-Wert von 10 unempfindlich. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung absorbieren und emittieren Licht maximal bei Wellenlängen zwischen 300 und 500 nm oder weniger und stellen mithin Alternativen für Cumarine und Pyrene dar. Desgleichen entsprechen die ungefähren 300-500 nm-Emissionsmaxima der Verbindungen der vorliegenden Erfindung der "blauen" Region des sichtbaren Spektrums, was mithin im Allgemeinen niedriger als die der BODIPY-Verbindungen, Monomethincyaninkomplexen auf Chinolinbasis und Monomethincyaninkomplexen auf Pyridinbasis, wie oben diskutiert, ist, welche Absorptions- und Emissionsmaxima von 500 nm oder mehr aufweisen.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Verfähren zur Herstellung eines Komplexes der Formel (6) vor, welches die Reaktion einer Verbindung der Formel (A) oder einer protonierten Form davon umfasst:
welche gegebenenfalls durch die Gruppen R&sup4; bis R&sup7; substituiert ist, wobei R¹ und R&sup4; bis R&sup7;, X, Y, Z¹ und Z² wie oben definiert sind, mit einer Verbindung, die zur Bildung einer Verknüpfung T geeignet ist, wobei T wie vorstehend definiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (6) vor, welches die Umsetzung einer Borverbindung BM&sub3;, worin M Fluor, Chlor, Brom oder Iod ist, mit dem quaternisierten Derivat von Verbindung (A), umfasst, siehe Schemata 1b und 1c. Die Reaktion wird in geeigneter Weise in einem inerten nichtpolaren Lösungsmittel, zum Beispiel einem Kohlenwasserstoff wie Toluol, durchgeführt. Die Reaktion wird in geeigneter Weise in einer Base, zum Beispiel einer organischen Base wie Diisopropylethylamin, bei einer erhöhten Temperatur, zum Beispiel bei 50 bis 150ºC, und geeigneterweise bei 100 bis 125ºC, durchgerührt. BM&sub3; ist geeigneterweise Bortrifluoridetherat.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (7) vor, welches die Reaktion einer Verbindung der Formel:
R²-CHK-CHK-R³
worin R² und R³ wie vorstehend definiert sind und K eine Abgangsgruppe ist, gewählt aus Brom und para-Toluolsulfonat, mit einer Verbindung der Formel (A) umfasst.
Die Quaternisierung der Verbindungen der Formel (A) kann in geeigneter Weise in Gegenwart einer Säure HR, worin R ein Säurerest, zum Beispiel Halogenid, ClO&sub4;&supmin;, CF&sub3;CO&sub2;&supmin; oder para- Toluolsulfonyl ist, durchgeführt werden, wenn nicht die Gruppen R&sup4; bis R&sup7; in ausreichendem Maße Elektronen abziehend sind, um ein quaternäres Ammoniumion zu bilden, ohne den Bedarf nach der Anwesenheit einer Säure. Geeigneterweise ist R Halogenid, z. B. Bromid. Die Quaternisierungsreaktion wird geeigneterweise bei Raumtemperatur oder bis zu 250ºC durchgeführt.
Symmetrische Verbindungen der Formel (A), in der X und Y gleich sind und die Strukturen Z¹ und Z² gleich sind, können durch eine Cyclokondensationsreaktion hergestellt werden, in der eine Verbindung der Formel (B)
welche gegebenenfalls durch die Gruppen R&sup4; und R&sup5; substituiert ist, worin R&sup4;, R³, X und Z¹ wie vorstehend definiert sind, in geeigneter Stöchiometrie mit mindestens einer Verbindung, gewählt aus CH&sub2;(CN)&sub2;, CH&sub2;(COOH)&sub2; und CH&sub2;(COOEt)&sub2; umgesetzt wird. Die Reaktion wird geeigneterweise in Gegenwart von Polyphorphorsäure und Wärme durchgerührt. Als Alternative kann die Verbindung (B) eine Cyclokondensationsreaktion mit einer Verbindung der Formel
erfahren, wobei R' aus Methyl, Ethyl, Propyl und n-Butyl gewählt wird. Geeigneterweise wird die Reaktion in Gegenwart einer Base wie Triethylamin und durch Erhitzen unter Rückfluss in einem Alkohol wie Methanol durchgeführt; siehe Schema 1a.
Asymmetrische Verbindungen der Formel (A), in denen X und Y unterschiedlich sind, können durch die Reaktion einer Verbindung der Formel D:
gegebenenfalls substituiert durch die Gruppen R&sup4; und R&sup5;, wobei R¹, R&sup4;, R&sup5;, X und Z¹ wie vorstehend definiert sind, und R' aus Methyl, Ethyl, n-Butyl und Propyl gewählt ist, mit einer Verbindung der Formel (E):
welche gegebenenfalls durch R&sup6; und R&sup7; substituiert ist, wobei R&sup6;, R&sup7;, Y und Z² wie vorstehend definiert sind, und zwar durch Erhitzen unter Rückfluss in Lösung mit einem Alkohol wie Methanol hergestellt werden; siehe Schema 1a.
Die synthetischen Verfahren, die in dem Reaktionsschema 1a gezeigt sind, sind ebenfalls geeignet für die Herstellung der symmetrischen Verbindungen der Formel (A), und zwar durch die Reaktion einer Verbindung der Formel (D) mit der Verbindung der Formel (B), gegebenenfalls substituiert durch die Gruppen R&sup4; und R&sup5;, wobei R&sup4;, R&sup5;, X und Z¹ wie vorstehend definiert sind.
Vorläuferverbindungen der chemischen Formeln (B), (C), (D) und (E) können mittels Verfahren hergestellt werden, welche jenen im Fachbereich Erfahrenen allgemein bekannt sind, siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4 064 136 von Loew et al.
Um eine Verbindung der Formel (5) herzustellen, in der R¹ etwas anderes als Wasserstoff ist, wird eine Verbindung der Formel (A) in der R¹ Wasserstoff ist, in einem geeigneten stöchiometrischen Verhältnis mit einer Verbindung GR¹, in der G aus Chlor, Brom und Iod gewählt wird und R¹ etwas anderes als Wasserstoff ist, in Gegenwart einer Base, zum Beispiel NaH, NaOMe oder NaOEt, umgesetzt.
Es ist leicht einzusehen, dass bestimmte Verbindungen der Formel (5) als Intermediate für die Umwandlung zu anderen Verbindungen der Formel (5) mittels Verfahren, die jenen im Fachbereich Erfahrenen allgemein bekannt sind, brauchbar sein können. In gleicher Weise können bestimmte Intermediate für die Synthese von Derivaten der Formel (5) brauchbar sein. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mittels Verfahren synthetisiert werden, die hierin beschrieben sind. Derivate der Verbindungen mit einer besonderen Nützlichkeit werden entweder durch die Wahl geeigneter Vorläufer oder durch das Modifizieren der resultierenden Verbindungen mittels bekannter Verfahren hergestellt, um funktionelle Gruppen an einer Vielzahl von Positionen einzuschließen. Als Beispiele können die Komplexe der vorliegenden Erfindung so abgeändert werden, dass sie bestimmte reaktive Gruppen zur Herstellung eines fluoreszierenden Markierungsreagenzes einschließen, oder geladene oder polare Gruppen können hinzugesetzt werden, um die Löslichkeit der Verbindung in polaren oder nichtpolaren Lösungsmitteln oder Materialien zu erhöhen. Als Umwandlungsbeispiele kann ein Ester zu einer Carbonsäure umgewandelt werden oder kann zu einem Amidderivat umgewandelt werden.
Das Folgende sind spezifische Beispiele der Synthese von Verbindungen der vorliegenden Erfindung und beobachtete spektrale Daten für diese Verbindungen. Beispiel 1 Bis-(Benzothiazolyl)methinbordifluorid
i) in einen 100 ml großen Zwei-Hals-Rundkolben, der mit einem Kühler und einem Rührstab ausgestattet war, wurde Malonsäuredinitril (2,64 g, 40 mMol) in absolutem Ethanol (40 ml) gelöst. 2- Aminothiophenol (10 g, 80 mMol) wurde langsam dieser Lösung unter Rühren hinzugesetzt. Unter einer Stickstoffdecke wurde die Reaktionsmischung unter Rückfluss 6 Stunden lang erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der Kolben über Nacht im Kühlschrank gehalten. Blassgrüne Kristalle von Bis-(2- benzothiazolyl)methan, die sich gebildet hatten, wurden nach Vakuumfiltration rückgewonnen, mit Hexan gewaschen und getrocknet (Ausbeute: 82%).
ii) Bis-(2-benzothiazolyl)methan (2,82 g, 10 mMol) wurde in Chloroform (50 ml) in einem Erlenmeyer-Kolben gelöst. Bromwasserstoffsäure (10 mMol) in Eisessig wurde tropfenweise unter sanftem Rühren hinzugesetzt. Ein kanariengelbes Präzipitat bildete sich, was ein Verdicken der Reaktionsmischung verursachte. Das Rühren wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Es wurde ein feines gelbes Pulver nach der Filtration gewonnen und mit Ether gewaschen. Die Ausbeute war quantitativ, und das Bis-(2-benzothiazolyl)methenmonohydrobromidprodukt war ausreichend rein für die nächste Stufe.
iii) Bis-(2-benzothiazolyl)methinmonohydrobromid (1,1 g, 3 mMol) wurde in trockenem Toluol (50 ml) in einem Rundkolben, der mit einem Rührstab ausgestattet war, suspendiert. N,N- Diisopropylethylamin (1,6 ml, 9 mMol) wurde langsam der Suspension unter Rühren hinzugesetzt. Die Suspension wurde klar und farblos. Unter Verwendung einer Spritze wurde Bortrifluoretherat (1,1 ml, 9 mMol) vorsichtig der klaren Lösung hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde sofort gelb, und etwas Feststoff trennte sich ab. Unter einer Stickstoffatmosphäre wurde der Kolben auf einem Dampfbad eine Stunde lang erhitzt, gekühlt, und der Inhalt wurde mit Wasser (50 ml) gelöscht. Die Toluolschicht wurde abgetrennt und in einem Kühlschrank gelagert, um eine kleine Menge an gelbem Feststoff abzutrennen. Die Toluolschicht wurde dann filtriert, um feste Teilchen zu entfernen, und das Filtrat wurde auf einem Rotationsverdampfer abgedampft, wodurch man einen gelben Feststoff erhielt, welcher erneut in Aceton (20 ml) gelöst wurde. In Aceton unlösliches festes Material wurde abfiltriert und der gewünschte Bis(2-benzothiazolyl)methinbordifluorid-Komplex kristallisierte aus dem Filtrat aus (Ausbeute: 80%). Beispiel 2 Bis-(Benzoxazolyl)methinbordifluorid
Ortho-Aminophenol wurde mit Malonsäure in Polyphosphorsäuremedium mittels des Verfahrens des US-Patentes Nr. 3250780 kondensiert, um Bis-(benzoxazolyl)methan in 32-%iger Ausbeute zu erzeugen. Eine Alternative zu Malonsäure in der Kondensationsreaktion ist Diethylmalonat.
Das Kondensat wurde quaternisiert mit Bromwasserstoffsäure und wurde anschließend mit Bordifluorid wie im Beispiel 1 umgesetzt, um dem Bor-versteiften Komplex zu bilden.
Die beobachteten Absorptionsmaxima, molaren Extinktionskoeffizienten, Emissionsspektren und qualitative Löslichkeitsdaten für die Bor-versteiften Komplexe der Beispiele 1 und 2 sind in Tabelle 2 angeführt.
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die Absorptions- und Emissionsmaxima praktisch unempfindlich über einen weiten Bereich der Lösungsmittelpolarität sind. Beide Verbindungen weisen relativ kleine Stoke-Verschiebungen auf, wobei die Verbindung auf Oxazolbasis eine 28-nm-Verschiebung besitzt und die Verbindung auf Thiazolbasis nur eine Verschiebung von 5-7 nm aufweist.
Wie in Fig. 2 gezeigt (Thiazolverbindung von Beispiel 1) und Fig. 3 (Oxazolverbindung von Beispiel 2), sind die Absorptionsspektren (durchgezogene Linie) und Emissionsspektren (gestrichelte Linie) für die Verbindungen durch scharfe und enge Absorptionspeaks und Emissionspeaks, welche etwas breiter sind, gekennzeichnet.
Relative Fluoreszenzintensitäten der Verbindungen der Beispiele 1 und 2 sind in einer Vielzahl von Lösungsmitteln in der Tabelle 3 vorgesehen. Die Tabelle 3 gibt an, dass die Fluoreszenzintensitäten der Farbstoffe unempfindlich gegenüber der Lösungsmittelpolarität sind. Extrem hohe Fluoreszenzquanteneffizienzen werden ebenfalls für beide Farbstoffverbindungen festgestellt.
Der Widerstand gegenüber einem Photoabbau der Verbindungen der Beispiele 1 und 2 in Methanol und Dichlormethan wurde ebenfalls untersucht und wurde mit der Photoabschwächungsrate von Cumarin-30 verglichen. Eine entgaste Lösung von jedem Farbstoff in einer Quarzküvette wurde mit einer 500-Watt-Quecksilberdampflampe aus einer Entfernung von 4 Inch bestrahlt. Die optische Dichte der Lösung bei maximaler Wellenlänge wurde als Funktion der Zeit aufgezeichnet. In Methanol bleichten die Verbindungen auf Oxazolbasis und Cumarin-30 mit ähnlicher Rate aus, während die Verbindung auf Thiazolbasis etwas schneller ausbleichte. Die Verbindungen der Beispiele 1 und 2, gelöst in Dichlormethan, waren resistenter gegenüber einer Photoabschwächung bzw. Ausbleichung durch Licht als Cumarin-30. Tabelle 2 Spektral- und Löslichkeitsdaten für die Verbindungen der Beispiele 1 und 2
* Die Löslichkeitsdaten beziehen sich auf jede Farbstoffverbindung in dem angegebenen Lösungsmittel Tabelle 3 Beispiel 3 Bis-(carboxymethylbenzoxazolyl)methinbordifluorid
i) Zu einer magnetisch gerührten Lösung aus 4-Hydroxyphenylessigsäure (100 g, 0,65 Mol) in Eisessig (250 ml), gehalten bei 45ºC, wurde tropfenweise eine Mischung aus 40 ml Salpetersäure (spezifische Dichte: 1,4) und 60 ml Eisessig gegeben. Nach der Zugabe der Salpetersäure/Essigsäure- Mischung wurde das Rühren der resultierenden Mischung eine Stunde lang bei 25ºC fortgesetzt, und dann wurde der Kolben in Eiswasser eine Stunde lang gekühlt. Die resultierenden Kristalle wurden mit kaltem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet, wodurch man reine 3- Nitro-4-hydroxyphenylessigsäure erhielt (Ausbeute: 65%).
ii) 3-Nitro-4-hydroxyphenylessigsäure (19,7 g, 90,1 mMol) wurde in 160 ml wässriger 0,625 M Natriumhydroxidlösung gelöst. Palladium auf Aktivkohle 175 mg, 10 Gew.-% des Katalysators) wurde der resultierenden Lösung hinzugesetzt, und dann wurden 2,5 Äquivalente an Hydrazinhydrat vorsichtig tropfenweise unter Verwendung einer Spritze während 0,5 Stunden hinzugegeben. Die Temperatur der Mischung nahm beobachtbar auf 60ºC während der Reaktion zu. Die Reaktionsmischung wurde weiter auf 80ºC erhitzt und bei dieser Temperatur 0,5 Stunden lang konstant gehalten, gefolgt von einem Refluxieren für eine weitere Stunde. Während des Refluxierens wurde beobachtet, dass die orange Farbe der Lösung langsam verschwand. Nach dem Refluxieren wurde das Reaktionsgefäß auf 25ºC gekühlt, und die Mischung wurde über Celite filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das überschüssige Lösungsmittel wurde vom Filtrat entfernt, wodurch man 20-30 ml eines Konzentrats erhielt, dessen pH-Wert auf 4,5 mit Eisessig eingestellt wurde. Beim Kühlen des angesäuerten Konzentrats fingen Kristalle von 3-Amino-4-hydroxyphenylessigsäure an sich abzutrennen, und sie wurden mittels Filtration gesammelt. Eine zweite Ernte an Kristallen wurde beim Kühlen des angesäuerten Konzentrats über Nacht in einem Kühlschrank gewonnen. 3-Amino-4- hydroxyphenylessigsäure wurde in einer Ausbeute von 92% gewonnen.
iii) Malonsäuredinitril (0,66 g, 10 mMol) wurde in 5 ml trockenem Dioxan gelöst. Zu der Lösung wurden 0,92 g (20 mMol) Ethanol gegeben, gefolgt von der Injektion in einem Teil von 5 ml einer 4- M-Lösung von Chlorwasserstoffsäure in Dioxan. Die Reaktanten wurden 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende dicke weiße Aufschlämmung wurde filtriert, mit mindestens drei Portionen an trockenem Ether gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur 1-2 Stunden lang getrocknet, wodurch man eine Ausbeute von 93% an Ethylbisimidathydrochlorid erhielt.
iv) 3-Amino-4-hydroxyphenylessigsäure (1,67 g, 10 mMol) wurde in 30 ml trockenem Methanol in einem Rundkolben suspendiert. 1,15 g (5 mMol) des frisch hergestellten Bisimidathydrochlorids wurde schnell der Suspension hinzugesetzt und die Temperatur der resultierenden Mischung wurde bis zum Rückfluss erhöht, als eine zweite Portion an 30 ml trockenem Methanol hinzugegeben wurde. Es wurde festgestellt, dass innerhalb von Minuten die Lösung klar wurde. Mit Fortschritt des Refluxierens schied sich das Produkt Bis-(carboxymethylbenzoxazolyl)methan aus der Lösung aus und erhöhte die Trübheit der Mischung. Das Refluxieren wurde 4 Stunden lang fortgesetzt, wonach der Kolben auf Raumtemperatur gekühlt wurde und dann in einem Kühlschrank 12 Stunden lang gekühlt wurde. Bis-(carboxymethylbenzoxazolyl)methan wurde in 75-%iger Ausbeute in Form eines weißen Pulvers gewonnen und zwar nach der Filtration, nach dem Waschen mit Methanol und nach dem Trocknen.
v) Das Produkt aus dem vorstehenden Schritt (1,65 g, 4 mMol) wurde in Methanol (25 ml) suspendiert. Acetylchlorid (1 ml) wurde in einem Schuss hinzugesetzt, und die Suspension wurde sofort klar. Die Reaktionsmischung wurde erhitzt und 3 Stunden lang am Rückfluss gehalten, wobei sich ein weißer Feststoff nach 0,5 Stunden bildete. Das Reaktionsgefäß wurde auf 25ºC gekühlt, und dann wurde das Methanol unter Vakuum entfernt. Ethylacetat (25 ml) wurde dann dem nassen weißen Feststoff hinzugesetzt, gefolgt von 20 ml an 0,5 M wässrigen Natriumhydroxid. Nach kräftigem Mischen der wässrigen und organischen Schichten der Mischung wurde die organische Schicht gesammelt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum konzentriert, wodurch ein farbloses viskoses Öl erhalten wurde, welches den Dimethylester von Bis-(carboxymethylbenzoxazolyl)methan einschloss. Dieses Öl wurde im nächsten Schritt eingesetzt.
vi) Das quaternäre Hydrobromidsalz des Dimethylesters von Bis-(carboxymethylbenzoxazolyl)- methan wurde durch die Wirkung von Bromwasserstoffsäure hergestellt. Das quaternäre Salz wurde dann mit Bortrifluorid unter Verwendung einer Vorgehensweise, die der für die Verbindung von Beispiel 1 identisch war, kondensiert.
vii) Das Produkt von Schritt vi) wurde in einer Mischung von 35 ml Methanol und 5 ml Natriumhydroxid (80 mg/ml) suspendiert. Die Suspension wurde unter Rückfluss 0,75 Stunden lang erhitzt, und nach dem Kühlen wurde das Lösungsmittel teilweise unter Vakuum entfernt, wodurch man 3 ml eines Konzentrats erhielt. Der pH-Wert des Konzentrats wurde auf 4-5 mit Eisessig eingestellt, um das Produkt auszufällen. Bis-(carboxymethylbenzoxazolyl)methinbordifluorid wurde in Form eines weißen Pulvers gewonnen, gefolgt nach der Filtration des Konzentrats, dem Waschen mit kalten Wasser und dem Trocknen im Vakuum bei 25ºC (Ausbeute: 88%). ¹H-NMR in CDCl&sub3;: δ, 7,6 (m, 4H, 4-H, 6-H, 4'-H, 6'-H); 7,3 (d, 2H, J = 7 Hz, 7-H, 7'-H); 6,2 (s, 1H, Methin H); 3,8 (s, 4H, 2 CH&sub2;- COOH).
Die maximal beobachtete Absorptionswellenlänge für die Verbindung lag bei 362 nm, und die maximale Emissionswellenlänge lag bei 386 nm, beide in Methanol gemessen. Die Verbindung war hochfluoreszent. Beispiel 4 Benzoxazolyl-benzothiazolyl-methinbordifluorid
i) 2-Amino-benzolthiol (10 mMol) und Malonsäuredinitril (10 mMol) wurden in 10 ml Ethanol mit einer kleinen Menge an hinzugesetztem Eisessig (10 mMol) gelöst. Nach dem Rühren über Nacht wurde eine gelbe kristalline Masse nach der Filtration und Trocknung rückgewonnen, wodurch man 82% der theoretischen Ausbeute an 2-Cyanomethyl-benzothiazol (Schmp.: 105-106ºC) erhielt.
ii) Ein molares 1 : 1-Verhältnis von 2-Cyanomethyl-benzothiazol und 2-Aminophenol (10 mMol) wurde einheitlich gemischt, gemahlen und in einen Rundkolben überführt. Polyphosphorsäure (etwa 80%, 20 ml) wurde erwärmt, bis sie flüssig war und dann in den Kolben gegossen. Der Kolben wurde dann in ein Ölbad bei 185ºC gestellt und in einer Stickstoffumgebung erhitzt. Nach einer Stunde wurde der Kolben entfernt, und der Inhalt wurde über zerbrochenes Eis gegossen und eine Stunde lang gerührt. Die Brocken, welche sich bildeten, wurden heruntergebrochen, wodurch man eine braune Suspension erhielt, welche filtriert wurde, und die resultierenden Feststoffe wurden mit kaltem Wasser gewaschen, bis die Waschungen neutral waren. Das Produkt, 2-(2-Benzoxazolyl)-methyl-benzothiazol, wurde dann luftgetrocknet.
iii) Der letztendlich versteifte Borkomplex wurde aus 2-(2'-Benzoxazolyl)-methyl-benzothiazol synthetisiert, indem zuerst das quaternäre Hydrobromidsalz hergestellt wurde und dann dieses Salz mit Bortrifluorid wie in den vorstehenden Beispielen 1 und 3 kondensiert wurde. Die maximale absorptive Wellenlänge für die Verbindung lag bei 388 nm, und die maximale Emissionswellenlänge lag bei 414 nm, wobei beide in Methanol gemessen wurden. Die Verbindung war hochfluoreszierend in Methanol. Beispiel 5 Meso-acetyl-bis-(benzothiazolyl)methinbordifluorid
i) Eine Natriumhydridaufschlämmung in Mineralöl (80%, 30 mg) wurde schnell zu einem flammengetrockneten Rundkolben, der mit einem Rührstab ausgestattet war, überführt. Trockenes, frisch destilliertes Tetrahydrofuran (THF) (4 ml) wurde dann hinzugesetzt. In einen anderen Kolben wurde eine eingewogene Menge von Bis-Benzothiazolylmethan (siehe Beispiel 1) (0,28 g, 1 mMol) in 1,5 ml THF gelöst. Diese Lösung wurde tropfenweise zu der gerührten Natriumhydridaufschlämmung hinzugesetzt. Wasserstoffgas, welches sich während der Reaktion entwickelte, wurde vorsichtig abgezogen. Nachdem die Sprudelbildung aufgehört hatte, wurde die Reaktionsmischung 0,5 Stunden lang gerührt.
ii) Acetylchlorid (0,078 g, 1 mMol) wurde tropfenweise der Reaktionsmischung hinzugesetzt. Innerhalb von Minuten der Zugabe wurde die Reaktionsmischung trübe, und zwar aufgrund der Präzipitation von Natriumchlorid. Das Rühren wurde zwei Stunden lang fortgesetzt, wonach die Feststoffe mittels Filtration abgetrennt wurden. Das Filtrat wurde zu einem Öl abgedampft, welches dann mit Methanol (2 ml) verdünnt wurde und 0,5 Stunden lang ungestört stehen gelassen wurde, wobei sich ein Feststoff abtrennte. Ein weiteres Kühlen ergab mehr Feststoff. Nach der Filtration und Trocknung wurde das Produkt in etwa 30-%iger Ausbeute erhalten.
iii) Das quaternäre Hydrobromidsalz des obigen Mesoacetylderivats wurde durch Zugabe von Bromwasserstoffsäure hergestellt. Danach erfolgte die Kondensation des Salzes mit Bordifluorid mittels eines Verfahrens, das zu dem von Beispiel 1 ähnlich war, um Meso-acetyl-bis-(benzothiazolyl)methinbordifluorid (27%) zu erhalten. Die maximale Absorptionswellenlänge für das Chromophor lag bei 416 nm, gemessen in Methanol. Das Chromophor war weniger fluoreszierend als das Benzothiazol-Grundchromophor. Beispiel 6 Benzothiazolylpyridylmonomethinbordifluorid
i) 2-Pyridylmethyl-benzothiazol wurde hergestellt, indem ein molares 1 : 1-Verhältnis von 2- Cyanomethylpyridin und 2-Aminothiophenol in Ethanol 8 Stunden lang refluxiert wurde. Etwa 25 ml Ethanol wurden für eine Reaktion im Maßstab von 10 mMol verwendet. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde ein gelbes Öl erhalten. Das Öl wurde in Ether gelöst und mit wässriger 0,5 M Kaliumhydroxidlösung gewaschen, um nicht umgesetztes Thiol zu entfernen. Die organische Schicht wurde dann mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und abgedampft, wodurch man ein gelbes Öl erhielt.
ii) Die nachfolgenden Schritte der Quaternisierung und Kondensation mit Bortrifluorid waren jenen entsprechend, die für die Herstellung der Verbindung von Beispiel 1 verwendet worden waren. Die Ausbeute an Benzothiazolylpyridylmonomethinbordifluorid lag bei 40-50% des Theoretischen. Die maximale Absorptionswellenlänge für das Chromophor lag bei 430 nm, und die maximale Emissionswellenlänge lag bei 476 nm, beide in Methanol gemessen. Das Chromophor zeigte eine hohe Fluoreszenz in Methanol. Beispiel 7 2-(2'-Benzothiazolyl)-chinolinmethinbordifluorid
2-(2'-Benzothiazolylmethyl)-chinolin wurde aus 2-Methylbenzothiazol und 2-Chlorchinolin gemäß der Verfahrensweise, die in dem US-Patent Nr. 2541400 beschrieben ist, hergestellt. Das resultierende rohe 2-(2'-Benzothiazolylmethyl)-chinolin erfuhr die Quatemisierungs- und Kondensationsschritte wie im Beispiel 1. 2-(2'-Benzothiazolyl)-chinolinmethinbordifluorid zeigte eine maximale Absorptionswellenlänge von 480 nm und eine maximale Emissionswellenlänge von 492 nm, beide in Methanol gemessen. Das Chromophor zeigte eine grüne Fluoreszenz.

Beispiel 8

Proteinmarkierung

Etwa 20 mg des Bis-(carboxymethylbenzoxazolyl)methinbordifluorid-Komplexes (Bis- carboxymethyl-Farbstoff vom Beispiel 3) und etwa 25 mg Disuccinimidylcarbonat (DSC) wurden in 250 ml eines wasserfreien Dimethylformamids (DMF) suspendiert. Die Suspension wurde auf 55ºC erhitzt, um den Bis-carboxymethyl-Farbstoff zu lösen und das DSC und die Lösung wurden bei dieser Temperatur eine Stunde lang gehalten. Der Bis-carboxymethyl-Farbstoff und DSC reagierten unter Bildung vom Disuccinimidylbenzoxazolylmethmbordifluorid-Komplex (Blue 1-OSu), einem Disuccinimidylester von Blue-1. Eine Sephadex-G50-Säule wurde mit Phosphatpufferlösung (PBS) hergestellt. Zu 1 mg Schaf-IgG-Protein in 400 Mikrolitern CO&sub3;&supmin;/HCO&sub3;&supmin; Pufferlösung (pH 9,6) wurden 10-15 Mikroliter DMF-Reaktionsmischung gegeben, welche das Blue 1-OSu enthielt. Die Protein/- Farbstoff-Lösung wurde 10 Minuten lang gevortexed und die Lösung wurde dann auf die Sephadex- Säule gegeben und mit PBS eluiert. Die erste Fraktion, welche eluierte, war das Protein/Farbstoff- Konjugat, welches im blauen Bereich unter einer 365-nm-UV-Lampe fluoreszierte.
Ein Experiment wurde durchgeführt, um das Schaf-IgG-Protein bei einem höheren Farbstoff-zu-Protein-Verhältnis (Farbstoff-Moleküle pro Protein-Molekül) zu markieren. 1-2 mg des getrockneten Bis-carboxymethyl-OSu-Pulvers wurden direkt zu 1 mg Protein, welches in 400 Mikrolitern einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9,6 suspendiert war, gegeben. Das resultierende Farbstoff/IgG-Konjugat wurde dann auf einer Sephadex-G50-Säule gereinigt. Es wurde geschätzt, dass das Farbstoff-zu-Protein-Verhältnis des Farbstoff/Protein-Konjugates bei 2,7 : 1 lag. Das Protein/Farbstoff-Konjugat in PBS wurde ebenfalls bezüglich seines Emissionsspektrums getestet und dahingehend bestimmt, dass es eine maximale Anregungswellenlänge von 380 nm und eine maximale Emissionswellenlänge von 425 nm aufwies. Die Quantenausbeute des Protein/Farbstoff-Konjugates wurde zu 0,5 berechnet. Beispiel 9 6,6'-Disulfo-meso-carboxymethyl-bis-(benzothiazolyl)methinbordifluorid
i) Eine Natriumhydridaufschlämmung in Mineralöl (80%, 30 mg) wurde schnell zu einem flammengetrockneten 25 ml großen Rundkolben, der mit einem Rührstab ausgestattet war, überführt. Trocknes, frisch destilliertes THF (4 ml) wurde dann hinzugesetzt. In einem anderen Kolben wurde eine eingewogene Menge an Bis-benzothiazolylmethan (0,28 g, 1 mMol) in 1,5 ml trockenem THF gelöst. Diese Lösung wurde tropfenweise der gerührten Natriumhydridaufschlämmung hinzugesetzt. Wasserstoffgas, welches sich während der Reaktion entwickelte, wurde vorsichtig abgezogen. Nachdem das Aufbrausen aufgehört hatte, wurde die Reaktionsmischung 0,5 Stunden lang gerührt.
Methylbromacetat (0,153 g, 1 mMol) wurde tropfenweise der Reaktionsmischung hinzugesetzt. Innerhalb von Minuten der Zugabe wurde die Reaktionsmischung aufgrund der Bildung von Natriumbromid trübe. Das Rühren wurde 2 Stunden lang fortgesetzt, wonach die Feststoffe mittels Filtration abgetrennt wurden. Das Filtrat wurde zu einem grünen Öl abgedampft. Das Öl wurde mit Methanol (2 ml) verdünnt und ungestört 0,5 Stunden lang stehen gelassen, als sich ein gelber/grüner Feststoff abtrennte. Ein weiteres Kühlen ergab mehr Feststoff. Nach der Filtration und Trocknung wurden 0,1 g Feststoffe rückgewonnen (Ausbeute: 28%).
ii) Methyl-3,3-bis-(benzothiazol-2-yl)propionat (0,176 g, 0,5 mMol) wurde in 8 ml Chloroform in einem 25 ml großen Rundkolben gelöst. Bromwasserstoffsäure in Essigsäure (30%, 50 Mikroliter) wurde tropfenweise der gerührten Lösung hinzugesetzt. Innerhalb von Minuten bildete sich ein gelbes Präzipitat. Das Rühren wurde weitere 0,5 Stunden fortgesetzt. Nach der Filtration und Trocknung wurde das Hydrobromidsalz als ein hellgelbes Pulver gewonnen (0,12 g, 55%).
ii) Das Hydrobromidsalz von Schritt ii) (1,0 g, 2,3 mMol) wurde in trockenem Toluol (15 ml) in einen 100 ml großen Rundkolben, der mit einem Rührstab ausgestattet war, suspendiert. N,N-Diisoproypiethylamin (3 ml) wurde tropfenweise der gerührten Suspension unter einer Stickstoffatmosphäre zugesetzt, wodurch die Reaktionsmischung klar wurde. Bortrifluoridtrietherat (5 ml) wurde dann vorsichtig der Reaktionsmischung hinzugesetzt, wobei der Kolben in einem Eis/Wasser- Bad gehalten wurde. Nach 4 Stunden wurde das Rühren beendet und die Reaktionsmischung in einem Abzug filtriert. Nach dem Waschen mit Wasser (100 ml) und Isopropanol (100 ml) und dem Trocknen wurde ein gelber Feststoff rückgewonnen. Die Umkristallisation aus Isopropanol/Chloroform ergab gelbe Kristalle (0,25 g, 27%) von Meso-carboxymethyl-bis-(benzothiazolyl)methinbordifluorid (Carboxymethyl-Blue 2-Farbstoff).
iv) Carboxymethyl-Blue 2-Farbstoff (0,2 g) wurde in 5 ml Methylenchlorid suspendiert. Chlorsulfonsäure (0,5 ml) wurde tropfenweise in die Suspension injiziert, wonach sie klar wurde. Eine Chlorsulfonierung wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 10 ml Wasser gelöscht. Die organische Schicht wurde vorsichtig abgetrennt. Das in der wässrigen Schicht enthaltende Produkt wurde einer Basenhydrolyse durch Zugabe von Natriumhydroxid (0,25 g) unterzogen, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden lang gerührt. Die Beendigung der Hydrolyse wurde durch Auflösen des Produktfarbstoffs angegeben, wodurch man eine klare blau fluoreszierende Lösung erhielt.
Das Reaktionsprodukt zeigte die Anwesenheit von zwei Verbindungen (Rf = 0,8 und Rf = 0,3) auf einer Umkehrphasen-C-18-TLC, wenn mit 10% Methanol-Wasser eluiert wurde. Die Mischung wurde mit Hilfe einer Umkehrphasen-C-18-Säulen-Chromatographie unter Verwendung von 10% Methanol/Wasser als Elutionsmittel aufgetrennt. Zwei Fraktionen, die eine hellblaue Fluoreszenz zeigten, wurden erhalten, was den Mono- und Bis-sulfonierten Carboxymethyl-Blue 2-Farbstoff ergab (Ausbeute: 50 mg, 10% bzw. 120 mg, 20%).
v) Das Bis-sulfonierte Derivat wurde weiter zur Herstellung eines Succinimidylesters und einer Proteinkonjugation wie folgt eingesetzt. Etwa 5-10 mg des oben hergestellten Bis-sulfonierten Derivates wurden mit etwa 10 mg DSC in 0,25 ml Hexamethylphosphoramid (HMPA) und 50 Mikrolitern Pyridin inkubiert. Die Mischung wurde auf 100ºC unter Rühren erhitzt und 0,25 Stunden lang reagieren gelassen, um das Disuccinimidylderivat zu erhalten. Nach dem Kühlen des Produktes auf Raumtemperatur wurden etwa 5-10 Mikroliter dieses Derivates unter Verwendung eines Kapillarröhrchens entfernt und zu einer frisch hergestellten Lösung von Schaf-IgG in PBS-Puffer (1 mg in 400 Mikrolitern) gegeben. Nach 15 Minuten wurde das Farbstoff/Protein-Konjugat von nicht umgesetztem Farbstoff unter Verwendung einer Sephadex-G50-Säule abgetrennt. Beispiel 10 α-Carboxymethyl-5,5'-disulfo-3,3'-ethylen-oxacyanin-methylester
i) Ethylbisimidat wurde durch eine Modifikation des Verfahrens von McElvain et al. (J. Amer. Chem. Soc., 71, 40, (1971)) hergestellt. Malonsäuredinitril (0,66 g, 10 mMol) wurde in trockenem Dioxan (5 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde Ethanol (0,92 g, 20 mMol) hinzugesetzt. Eine 4M- Lösung von HCl in Dioxan (5 ml) wurde in einem Schuss in die Malonsäuredinitrillösung injiziert. Die resultierende Mischung wurde 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene dicke weiße Aufschlämmung wurde filtriert, mit drei Portionen an 50 ml trockenem Ether gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur 1-2 Stunden lang getrocknet. Die Ausbeute an Ethylbisimidathydrochlorid lag bei 93%.
ii) Zu einer Suspension von 3-Amino-4-hydroxybenzolsulfonsäure (18,9 g, 0,1 Mol) in Methanol (100 ml) wurde Triethylamin (11,2 g, 0,11 Mol) gegeben. Die Lösung wurde auf 50 ml konzentriert und gekühlt. Ein braunes kristallines Produkt an Triethylaminsalz wurde erhalten, welches bei 200ºC unter Zersetzung schmolz. Die Ausbeute lag bei 85-90% des Theoretischen.
Triethylaminsalz (29 g, 0,1 Mol) wurde in trockenem Methanol (200 ml) suspendiert. Frisch hergestelltes Bisimidat (11,5 g, 0,05 Mol) wurde der Suspension hinzugesetzt und die Mischung wurde bis zum Rückfluss erhitzt. Innerhalb von 5 Minuten wurde die Lösung klar. Das Erhitzen wurde 2 Stunden lang fortgesetzt, wonach die Lösung trübe wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann gekühlt, und braune Kristalle von 5,5'-Disulfo-3,3'-oxacyanintriethylaminsalz wurden abfiltriert (Ausbeute: 12 g). Die Kristalle schmolzen bei 170-175ºC.
iii) Das oben erhaltene Produkt (100 mg, 0,2 mMol) und Methyl-3,4-di-para-tosylbutyrat (88 mg, 0,2 mMol) wurden gründlich gemischt und bei 185ºC (Ölbadtemperatur) für 20 Minuten langsam erhitzt. Die resultierende dunkelbraune Masse wurde mit 0,2 mMol Triethylamin und Isopropanol (20 ml) trituriert, bis ein freies Pulver erhalten worden war (100 mg). Das rohe Produkt zeigte drei helle Flecken auf C18-TLC in 10% Methanol/Wasser. Die Mischung wurde auf einer C18-Säule mit einer Wasser/Methanol-Mischung als Elutionsmittel chromatographiert. Die freie Säure mit Rf = 0,75 wurde aus dem Lösungsmittel gewonnen, um ein silberfarbenes Pulver zu ergeben (Ausbeute: 10 mg).
Wie in Fig. 5 gezeigt, zeigte das UV-Spektrum der Verbindung ein Absorptionsmaximum bei 364 nm und ein Emissionsmaximum bei 406 nm, wenn mit 360 nm angeregt wurde. Die Quantenausbeute lag bei 0,8 mit Chininsulfat als Standard. Der freie Säurefarbstoff wurde verwendet, um den Succinimidylester ohne weitere Reinigung herzustellen.
iv) Die erhaltene Säure von oben wurde in 100 Mikrolitern trockenem DMF, das 10 Mikroliter Pyridin enthielt, gelöst. Überschüssiges (10 mg) DSC wurde hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei 65-70ºC 2 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde trockener Diethylether (50 ml) hinzugegeben. Der präzipitierte aktive Ester wurde filtriert und im Vakuum 1 Stunde lang getrocknet.
Der getrocknete aktive Ester (etwa 1 mg) wurde in DMF (50 Mikroliter) gelöst, und 10 Mikroliter dieser Stammlösung wurden 30 Minuten lang mit 1 mg Schaf-IgG-Protein, gelöst in 250 ml Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,4), umgesetzt. Das Farbstoff-Antikörper-Konjugat wurde von nicht umgesetztem Farbstoff auf einer Größenausschluss-Säule (Sephadex G50) unter Verwendung einer PBS-Lösung (pH 7) als Elutionsmittel abgetrennt. Die Absorptions- und Emissionsspektren des Farbstoff-Antikörper-Konjugats sind in Fig. 6 gezeigt. Das Protein absorbierte bei 280 nm (0,1387- Absorptionseinheiten), und der Farbstoff absorbierte bei 372 nm (0,04257-Absorptionseinheiten). Beispiel 11 Meso-5-carboxypentyl-3,3'-ethylenthiacyanin
i) Eine Natriumhydridaufschlämmung in Mineralöl (80%, 30 mg) wurde schnell in einen flammengetrockneten 25 ml großen Rundkolben, der mit einem Rührstab ausgestattet war, überführt. Trockenes, frisch destilliertes THF (4 ml) wurde dann hinzugesetzt. In einem anderen Kolben wurde eine eingewogene Menge an Bis-benzothiazolylmethan (0,28 g, 1 mMol) in 1,5 ml trockenem THF gelöst. Diese Lösung wurde tropfenweise bei Raumtemperatur zu der gerührten Natriumhydridaufschlämmung gegeben. Wasserstoffgas, welches sich während der Reaktion entwickelte, wurde langsam abgezogen. Nachdem das Aufbrausen aufgehört hatte, wurde die Reaktionsmischung 0,5 Stunden lang gerührt.
Methyliodohexanoat (0,256 g, 1 mMol) wurde tropfenweise der Reaktionsmischung hinzugesetzt. Innerhalb der Minuten der Zugabe wurde die Reaktionsmischung trübe aufgrund der Bildung von Natriumiodid. Das Rühren wurde 2 Stunden lang fortgesetzt, wonach die Feststoffe mittels Filtration abgetrennt wurden. Das Filtrat wurde zu einem grünen Öl abgedampft. Das Öl wurde mit Methanol (2 ml) verdünnt und ungestört 0,5 Stunden lang stehen gelassen, wobei sich ein gelber/grüner Feststoff abtrennte. Ein weiteres Kühlen ergab mehr Feststoff. Nach der Filtration und nach dem Trocknen wurden 0,1 g des Produktes, Meso-bis-(benzothiazolyl)methan-hexansäure-methylester rückgewonnen (Ausbeute: 28%).
ii) Das Produkt von Schritt i) (100 mg, 0,24 mMol) und Ethylenglykol-di-p-tosylat (100 mg, 0,27 mMol) wurden gründlich gemischt und bei 185ºC (Ölbadtemperatur) 20 Minuten lang erhitzt. Die resultierende dunkelbraune Masse wurde mit 0,2 mMol Triethylamin trituriert, bis ein freies Pulver erhalten worden war (50 mg). Nach der Hydrolyse des Methylesters mit Natriumhydroxid wurde das rohe Produkt auf einer C18-Umkehrphasen-Säule mit Wasser/Methanol als Elutionsmittel chromatographiert, wodurch man die gewünschte freie Säure erhielt. Das UV-Spektrum dieser Verbindung in Wasser, 0,1 N HCl und 0,1 N NaOH zeigte ein Absorptionsmaximum bei 454 nm und ein Emissionsmaximum bei 472 nm, wenn bei 418 nm angeregt wurde. Die Quantenausbeute lag bei 0,8 mit Chininsulfat als Standard. In einer separaten Testung unter Verwendung von PBS als Lösungsmittel, zeigte die Verbindung ein Absorptionsmaximum von 454 nm und ein Emissionsmaximum bei 472 nm. Es wurde eine Quantenausbeute von 0,28 unter Verwendung von Cumann 30 in Ethanol als Referenzstandard aufgezeichnet.
Meso-5-carboxypentyl-3,3'-ethylenthiacyanin wurde zu seinem Succinimidylester umgewandelt und an Schaf-IgG-Protein konjugiert. In PBS stellte man fest, dass das Konjugat ein Absorptionsmaximum von 456 nm, ein Emissionsmaximum von 472 nm und eine Quantenausbeute von 0,15 unter Verwendung von Cumarin 30 in Ethanol als Referenzstandard aufwies.
iii) Meso-5-carboxypentyl-3,3'-ethylenthiacyanin wurde unter Verwendung der folgenden Vorgehensweise sulfoniert. Der Farbstoff (100 mg) wurde in einer Mischung von konzentrierter Schwefelsäure (1 ml) und Essigsäureanhydrid (1 ml) gelöst und bei 140ºC eine 1 Stunde lang erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt, und die dunkelbraune Masse wurde mit Aceton (50 ml) trituriert. Der resultierende Feststoff wurde filtriert und chromatographiert auf einer Umkehrphasen-C18-Säule, und zwar mit 5% Methanol/Wasser als Elutionsmittel, Rf = 0,3. Beispiel 12 3,3'-Ethylen-6-sulfothia-5'-carboxymethyl-6'-sulfo-oxamonomethincyanin
i) Zu einer magnetisch gerührten Lösung von 4-Hydroxyphenylessigsäure (100 g, 0,65 Mol) in Eisessig (250 ml), gekühlt in einem Eisbad, wurde tropfenweise eine Mischung von konzentrierter Salpetersäure (40 ml) und Eisessig (80 ml) über einen Zeitraum von 20 Minuten gegeben. Das Rühren wurde 1 Stunde lang bei 5ºC und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Lösung wurde während der Zugabe gelblich-braun. Die viskose Masse wurde filtriert und mit kaltem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Das Produkt wurde aus Methanol kristallisiert, wodurch man hellgelbe Kristalle erhielt (72 g, 56%), Schmp.: 146-7ºC; ¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 8,0 (1H, s, 2-H); 7,5 (1H, d, J = 7 Hz, 6H); 7,1 (1H, d, J = 7 Hz, 5-H); 3,6 (2H, s, CH&sub2;).
ii) Zu einer gerührten Lösung von Natriumhydroxid (1 g) in 40 ml Wasser in einem Rundkolben wurde 3-Nitro-4-hydroxyphenylessigsäure von Schritt i) (4,93 g, 0,025 Mol) gegeben. Der Feststoff löste sich sofort, wodurch man eine orangefarbige Lösung erhielt. 10% Pd/Aktivkohle (50 mg) wurde hinzugegeben, gefolgt von einer tropfenweise Zugabe von Hydrazinmonohydrat (3,25 ml). Nach der Beendigung der Zugabe (5 Minuten) wurde die Mischung bei 60ºC 1,5 Stunden lang erhitzt. Die Temperatur wurde bis zum Rückfluss erhöht und das Erhitzen weitere 0,5 Stunden fortgesetzt. Die Lösung erschien klar mit dem darin suspendierten Pd/C. Die Lösung wurde heiß filtriert, auf das halbe Volumen konzentriert und dann gekühlt. Die Lösung wurde anschließend auf einen pH-Wert von 4-5 mit Essigsäure angesäuert. Das weiße Präzipitat, 3-Amino-4-hydroxyphenylessigsäure, welches sich nach dem Kühlen abtrennte, wurde abfiltriert und mit Ethanol gewaschen, Schmp.: 225-7ºC (Ausbeute: 3,4 g, 30%). ¹H-NMR (D&sub2;O, δ) 7,9 (1H, d, J = 7 Hz, 6-H); 7,8 (s, 1H, 2-H); 7,65 (1H, d, J = 7 Hz, 5-H); 3,4 (2H, s, CH&sub2;COOH).
iii) 2-Cyanomethylbenzothiazol wurde entsprechend dem Verfahren von Saito et al., Synthesis, 210-11, (1983), wie im Beispiel 4, Schritt i) angerührt, hergestellt.
iv) Eine Mischung von 2-Cyanomethylbenzothiazol (1,74 g, 0,01 Mol) und Natriummethoxid (0,5 g, 0,01 Mol) in wasserfreiem Methanol (50 ml) wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden lang gerührt. Das erhaltene orange Pulver wurde im nächsten Schritt ohne Trennung eingesetzt. Essigsäure wurde der Mischung hinzugesetzt, um Natriummethoxid zu neutralisieren. 3-Amino-4-hydroxyphenylessigsäure (1,67 g, 0,01 Mol) wurde hinzugesetzt, und die Mischung wurde am Rückfluss erhitzt. Nach 4 Stunden war das Methanol abdestilliert, und der Rückstand (3,4 g) wurde mittels Flash- Chromatographie auf einer Silicagel-Säule (50 g) unter Verwendung von Chloroform/Methanol als Elutionsmittel gereinigt. Gelblich grüne Kristalle wurden aus Ethanol erhalten, Schmp.: 182-4ºC (Ausbeute: 0,75 g, 23%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;, δ) 8,1 (1H, d, J = 7 Hz), 7,9 (1H, d, J = 7 Hz), 7,62 (1H, D, J = 7 Hz), 7,6 (1H, s), 7,4-7,55 (2H, m), 7,3 (1H, d, J = 7 Hz), 5,0 (2H, s, CH&sub2;-Brücke), 3,7 (2H, s, CH&sub2;COOH).
v) 324 mg (1 mMol) der von Schritt iv) erhaltenen Säure und 370 mg (1 mMol) Ethylenglykoldi- p-toluolsulfonat wurden zusammen 4 Stunden bei 170ºC erhitzt. Das resultierende gelbe feste Produkt wurde gekühlt, und es wurde Aceton (100 ml) hinzugesetzt, gefolgt von Triethylamin (2 ml). Die Lösung wurde bis zur Trockne abgedampft, und der Rückstand wurde mit Ether gewaschen, um überschüssiges Triethylamin zu entfernen. Die feste dunkelbraune Masse wurde dann in Methanol gelöst. Natriumiodid, gelöst in 10 ml heißem Methanol, wurde hinzugesetzt, um 3,3'-Ethylen-cyaninp-sulfonat zu dem Iodid umzuwandeln. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und die gesamte Masse wurde in einer Lösung aus 10% Methanol in Chloroform gelöst, gefolgt von Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Chloroform/Methanol als Elutionsmittel. Die zwei gelben Produkte erschienen sehr hell im UV-Licht und wurden isoliert. Das Produkt von Fraktion A (20 mg, Rf = 0,3, Silicagel unter Verwendung von 10% Methanol/Chloroform) wurde nicht charakterisiert. Der Rückstand von Fraktion B, wurde nach der Abdampfung als der gewünschte Farbstoff charakterisiert, 3,3'-Ethylen-thia-(5'-carboxymethyloxa)monomethincyanin (Verbindung 12A), (Ausbeute: 150 mg, Rf = 0,1, Silicagel unter Verwendung von 50% Methanol/Chloroform). Es wurde auf einer Umkehrphasen-C18-Säule unter Verwendung einer Wasser/Methanol-Mischung als Elutionsmittel gereinigt. ¹H-NMR (DMSO-d6, δ) 8,2 (1H, d, J = 7 Hz), 7,9 (1H, D, J = 7 Hz), 7,45-7,6 (3H, m), 7,4 (1H, t), 7,3 (1H, d, J = 7 Hz), 6,5 (1H, s, CH-Brücke), 4,9-4,7 (4H, breites m, CH&sub2;-CH&sub2;), 3,4 (2H, s, CH&sub2;COOH). UV (Methanol) λmax 410 nm, &epsi; 61 000, Emmax 420 nm, φ 0,24 in Wasser und 0,82 in Methanol, bezogen auf Cumann 30 als Standard.
vi) 3,3'-Ethylen-thia-(5'-carboxymethyloxa)monomethincyanin (Verbindung 12A) (100 mg) wurde in einer Mischung von konzentrierter Schwefelsäure (1 ml) und Essigsäureanhydrid (1 ml) gelöst und auf 140ºC 1 Stunde lang erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt, und die dunkelbraune Masse wurde mit Aceton (50 ml) trituriert. Die Lösung wurde filtriert, und der erhaltene Feststoff wurde auf einer Umkehrphasen-C18-Säule chromatographiert, und zwar mit Wasser als Lösungsmittel, wodurch man 3,3'-Ethylen-6-sulfothia-5'carboxymethyl-6'-sulfo-oxamonomethincyanin (Verbindung 12B) erhielt; (Rf = 0,8, C18, Wasser). ¹H-NMR (D&sub2;O, δ) 8,2 (1H, s, 7-H), 8,1 (1H, s, 7'- H), 7,95 (1H, d, J = 7 Hz, 5-H), 7,75 (1H, d, J = 7 Hz, 4-H), 7,45 (1H, s, 4'-H), 6,3 (1H, s, CH- Brücke), 4,9-4,7 (4H, breites m, CH&sub2;-CH&sub2;), zusammenlaufend mit einem Wassersignal), 4,0 (2H, s, CH&sub2;COOH). UV (Methanol) λmax 414 nm, &epsi; 70 000, Emmax 420 nm, φ 0,60 (Wasser), bezogen auf Cumann 30 als Standard.
vii) Farbstoff/Protein-Konjugations-Experimente wurden bezüglich des nicht-sulfonierten Farbstoffs (Verbindung 12A) und des sulfonierten Farbstoffs (Verbindung 12B) durchgeführt. Beide Verbindungen wurden jeweils zu ihren Succinimidylestern gemäß den in Mujumdar et al., Bioconjugate Chem., 4, 105, (1993), beschriebenen Verfahren umgewandelt. Der Farbstoff (1 mg) wurde in 100 Mikrolitern trockenem DMF, enthaltend 10 Mikroliter Pyridin, gelöst. DSC (7 mg) wurde der Mischung hinzugesetzt und bei 65-70ºC zwei Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Lösungsmittel unter reduziertem Druck bei 50ºC entfernt. Der getrocknete Succinimidylester wurde in 100 Mikrolitern trockenem DMF gelöst, und man ließ 10 Mikroliter dieser Stammlösung 30 Minuten lang mit 1 mg Schaf-IgG, gelöst in 250 Mikrolitern Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,4) reagieren. Das Farbstoff-Antikörper- Konjugat wurde von dem nicht umgesetzten Farbstoff mittels Größenausschlusschromatographie (Sephadex G50) unter Verwendung von PBS (pH 7) als Elutionsmittel abgetrennt. Die folgenden spektralen Daten wurden für jede der konjugierten und nichtkonjugierten Verbindungen (12A) und (12B) in verschiedenen Lösungsmittel erhalten (siehe Tabelle 4). Tabelle 4
* Das Farbstoff-IgG befand sich drei Tage lang bei Raumtemperatur.
Der Farbstoff (12A) wurde ebenfalls in Experimenten verwendet, um DNA zu markieren. 5-Aminopropargyl-2'-deoxycytidin-5'-triphosphat wurde in die Sequenz von DNA mittels einer standardmäßigen Nick-Translations-Reaktion eingebaut. Die resultierende DNA, welche aliphatische Aminogruppen enthielt, wurde mittels Ethanol-Präzipitation gereinigt, in Borat-EDTA-Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert. Fluoreszierende DNA wurde gebildet, indem diese Amino-DNA (etwa 1 Mikrogramm) mit N-Hydroxysuccinimidylester von 12A umgesetzt wurde. 1 Mikrogramm Amino- Propargyl-DNA in 25 Mikrolitern Puffer wurde mit 25 Mikrolitern Formamid verdünnt, auf 77ºC 5 Minuten lang erhitzt, um die DNA zu einer einzelsträngigen Form zu denaturieren, und dann sofort auf Eis gekühlt, um eine Neubildung der doppelsträngigen DNA zu inhibieren. Diese kalte Lösung wurde mit einem gleichen Volumen an Carbonatpuffer (0,1 M, pH 9,2) verdünnt. Der aktive Ester von 12A (etwa 10 mMol in 1 Mikroliter DMF) wurde der DNA hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Die DNA wurde mit Ammoniumacetat/Ethanol präzipitiert, zweimal mit eiskaltem 70-%igen Ethanol gewaschen, dann erneut in TRIS-EDTA-Puffer gelöst. Das fluoreszierende DNA-Produkt wurde mittels Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert und unter Einsatz einer standardmäßigen UV-Trans-Illuminierung visualisiert.

Beispiele 13 und 14

Unter Verwendung der synthetischen Wege der vorliegenden Erfindung wurden die folgenden Verbindungen 13 und 14 hergestellt.
Die Verbindungen zeigten die folgenden spektralen Eigenschaften in den angegebenen Lösungsmitteln (siehe Tabelle 5). Die Verbindung 14 wurde ebenfalls an Schaf-IgG-Protein konjugiert und zeigte die angegebenen spektralen Eigenschaften. Die Quantenausbeuten wurden unter Verwendung von Cumann 30 in Ethanol als Referenzstandard bestimmt. Tabelle 5
* Die relative Quantenausbeute basierte auf Cumann 30 (0,67)

Beispiel 15

Kovalente Markierung auf einer Glasoberfläche

Alkoxysilane sind dafür bekannt, mit Glasoberflächen zu reagieren. Ein solches Reagenz 3-Aminopropyltrimethoxysilan, ist dafür bekannt, poröse Glasperlen zu beschichten, wodurch das Aminopropylderivat des Glases zum Einsatz als ein Absorptionsmittel für die Affinitätschromatographie gebildet wird; siehe Biochem. Biophys. Act., 212, 1, (1970); J. Chromatography, 97, 39, (1974). Diese Vorgehensweise wurde angepasst, um Objektträger aus Glas mit fluoreszierenden Farbstoffverbindungen der vorliegenden Erfindung zu färben.
Gold Seal-Mikroobjektträger (Becton-Dickinson) wurden mit destilliertem Wasser und mit Aceton gewaschen. Die Objektträger wurden dann mit einer 10-%igen (v/v) Lösung von 3- Aminopropyltrimethoxysilan (Sigma Chemicals) in Xylol 30 Minuten lang behandelt. Die Objektträger wurden dann in absolutem Ethanol gespült, um das Xylol zu entfernen, in Wasser gespült und dann in Luft getrocknet. Eine Lösung (etwa 200 Mikroliter) an Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,4) wurde auf das Zentrum jedes Objektträgers gegeben, zusammen mit 20 Mikrolitern einer Lösung eines Farbstoffs der vorliegenden Erfindung, gelöst in DMF (etwa 2 mg Farbstoff/100 Mikroliter DMF). Die eingesetzte Farbstoffverbindung war die nachfolgende Succinimidylestermonomethincyanin-Verbindung:
Das Succinimidylesterderivat wurde mittels des Verfahrens, das allgemein in dem US-Patent Nr. 5268486 beschrieben ist, hergestellt. Die Objektträger wurden 20 Minuten lang inkubiert, bevor sie mit destilliertem Wasser gespült wurden. Auf diese Weise wurde die Succinimidylester- Farbstoff-Verbindung kovalent an der Oberfläche der Objektträger aus Glas gebunden. Die Anwesenheit des kovalent gebundenen Farbstoffs auf der Glasoberfläche wurde mittels Fluoreszenz- Spektrophotometrie nachgewiesen.

Figuren

Die Fig. 1 ist eine Auftragung der relativen Fluoreszenzintensität gegen die Wellenlänge für Bis-benzoxazolylmethinbordifluorid-Komplex der vorliegenden Erfindung und Bis-Benzoxazolylmethinhydrochlorid;
die Fig. 2 ist eine Auftragung der Absorptions- und Emissionsspektren von Bis-benzothiazolylmethinbordifluorid-Verbindung der vorliegenden Erfindung; und
die Fig. 3 ist eine Auftragung der Absorptions- und Emissionsspektren von Bis-benzoxazolylmethinbordifluorid-Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Die Zunahme in der Fluoreszenz, die von einer Versteifung der Heteiozyklen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung herrührt, wird in Fig. 1 gezeigt, welche die relativen Fluoreszenzspektren in Methanol von Bis-benzoxazolylmethenbordifluorid-Komplex (Kurve a) und Bis-benzoxazolylethenbordifluoridhydrochlorid (Kurve b), beide angeregt bei 348 nm, zeigt. Die Quantenausbeute des Bor-versteiften Komplexes ist um ein Mehrfaches größer als die des nicht versteiften Farbstoffs.
Die Fig. 4 ist eine Auftragung der relativen Fluoreszenzspektren eines Ethylen-versteiften Benzoxazolylmethin-Komplexes der vorliegenden Erfindung (Kurve a), von 5,5'-Disulfo-3,3'-ethylenoxacyanin, eines nicht versteiften N,N-Dimethyl-di-2-benzoxazolylmethans in Glycerol (Kurve b) und in Wasser (Kurve c), wobei alle Proben bei 364 nm angeregt wurden.
Die Fig. 5 ist eine Auftragung des UV-Absorptionsspektrums und -emissionsspektrums für die Verbindung von Beispiel 10.
Die Fig. 6 ist eine Auftragung des UV-Absorptionsspektrums der Verbindung von Beispiel 10, konjugiert an den IgG-Schaf-Antikörper.

Claims

1. Verbindung der Formel:

wahlweise substituiert durch Gruppen R&sup4; bis R&sup7;, oder durch Gruppen R² bis R&sup7;, wenn T Kohlenstoffatome enthält, worin R² und R³ an die Kohlenstoffatome von T gebunden sind und R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; an die X und y enthaltenden Ringe gebunden sind, oder wahlweise an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind;

die Gruppen R² bis R&sup7;, welche gleich oder verschieden sind, gewählt sind aus -R&sup9; und -L-R&sup9;, worin R&sup9; gewählt ist aus neutralen Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit reduzieren, polaren Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit erhöhen, funktionellen Gruppen, welche in Markierungsreaktionen verwendet werden können, reaktiven Gruppen, elektronenabgebenden und -abziehenden Gruppen, welche die Absorptions- und Emissionswellenlängen des fluoreszierenden Moleküls verschieben, lipid- und kohlenwasserstoffsolubilisierenden Gruppen, und L gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub6;- Alkylkette, einem C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Monoether oder -Polyether und einer bis zu vier sekundäre Amidbindungen enthaltenden C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Atomkette;

R¹ gewählt ist aus Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cyano, Nitro, Aldehyd, Halogen, Hydroxy, Alkylgruppen mit 26 Kohlenstoffatomen oder weniger, Amino, quaternäres Amino, Acetal, Ketal, Phosphoryl, Sulfhydryl, wassersolubilisierenden Gruppen und -(CH&sub2;)nQ, worin 1 < n < 26 und Q gewählt ist aus Amino, substituiertem Amino, quaternärem Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, Amid, Nitro und Gruppen, welche reaktiv sind mit Amino, Hydroxyl, Aldehyl, Phosphoryl oder Sulfhydrylgruppen;

T eine Verbindungsgruppe ist, so dass

ein 6- oder 7-gliedriger Ring ist;

X und Y gleich oder verschieden sein können und gewählt sind aus zweifach substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selen, CH=CH und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH&sub2;)nR&sup8;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R&sup8; gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sufat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Amino, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche reaktiv sind mit Amino, Hydroxyl, Carbonyl, Phosphoryl und Sulfhydrylgruppen;

eine der Gruppen Z¹ und Z² eine Bindung bedeutet oder die Atome, welche notwendig sind zur Vervollständigung eines, zweier kondensierter oder dreier kondensierter aromatischer Ringe, wobei jeder Ring fünf oder sechs Atome besitzt, gewählt aus Kohlenstoffatomen, und wahlweise nicht mehr als zwei Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen, und die andere Gruppe Z¹ oder Z² die Atome bedeutet, welche notwendig sind zur Vervollständigung eines, zweier kondensierter oder dreier kondensierter aromatischer Ringe, wobei jeder Ring fünf oder sechs Atome aufweist, gewählt aus Kohlenstoffatomen und wahlweise nicht mehr als zwei Sauterstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen;

vorausgesetzt, dass mindestens eines von R¹ bis R&sup7; eine reaktive Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt oder eine funktionelle Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt.

2. Verbindung der Formel:

wahlweise substituiert durch Gruppen R&sup4; bis R&sup7;, worin R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind, oder wahlweise an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind;

worin M aus F und Cl gewählt ist;

die Gruppen R&sup4; bis R&sup7;, welche gleich oder verschieden sind, gewählt sind aus -R&sup9; und -L-R&sup9;, worin R&sup9; gewählt ist aus neutralen Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit reduzieren, polaren Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit erhöhen, funktionellen Gruppen, welche in Markierungsreaktionen verwendet werden können, reaktiven Gruppen, elektronenabgebenden und -abziehenden Gruppen, welche die Absorptions- und Emissionswellenlängen des fluoreszierenden Moleküls verschieben, lipid- und kohlenwasserstoffsolubillsierenden Gruppen, und L gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub6;- Alkylkette, einem C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Monoether oder -Polyether und einer bis zu vier sekundäre Amidbindungen enthaltenden C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Atomkette;

X und Y gleich oder verschieden sein können und gewählt sind aus zweifach substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selen, CH=CH und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH&sub2;)nR&sup8;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R&sup8; gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl. Hydroxyl, Sulfonat, Sufat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Amino, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche reaktiv sind mit Amino, Hydroxyl, Carbonyl, Phosphoryl und Sulfhydrylgruppen;

vorausgesetzt, dass mindestens eines von R¹ und R&sup4; bis R&sup7; eine reaktive Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer funktionellen Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt oder eine funktionelle Gruppe für die kovalente Reaktion mit einer reaktiven Gruppe auf einem Zielmaterial umfaßt.

3. Verbindung der Formel;

wahlweise substituiert durch Gruppen R² bis R&sup7;, worin die Gruppen R² bis R³ an die Ethylen-Verbindungsgruppe,

gebunden sind, und die Gruppen R&sup4; bis R&sup7; and die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind, oder wahlweise an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind;

R¹ gewählt ist aus Wasserstoff. Aryl, Heteroaryl, Cyano, Nitro, Aldehyd, Halogen, Hydroxy, Alkylgruppen mit 26 Kohlenstoffatomen oder weniger. Amino, quaternäres Amino, Acetal, Ketal, Phosphoryl, Sulfhydryl, wassersolubilisierenden Gruppen und -(CH&sub2;)nQ, worin 1 < n < 26 und Q gewählt ist aus Amino, substituiertem Amino, quaternärem Amino, Aldehyd. Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, Amid, Nitro und Gruppen, welche reaktiv sind mit Amino, Hydroxyl, Aldehyl, Phosphoryl oder Sulfhydrylgruppen;

X und Y gleich oder verschieden sein können und gewählt sind aus zweifach substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff. Schwefel, Selen, CH=CH und N-W, worin N Stickstoff ist und W gewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH&sub2;)nR&sup8;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R&sup8; gewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halogen, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulfonat, Sufat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Amino, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, welche reaktiv sind mit Amino, Hydroxyl, Carbonyl, Phosphoryl und Sulfhydrylgruppen;

4. Verbindung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, worin R&sup9; gewählt ist aus:

- neutralen Gruppen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Halogenatomen;

- polaren Gruppen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amid, Sulfonat, Sulfat, Phosphat, quaternärem Ammonium, Guanidinium, Hydroxyl, Phosphonat;

- funktionellen Gruppen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus wahlweise substituiertem Amino, Azido, Hydroxyl, Sulfhydryl, Imidazol, Carboxyl und Carbonyl;

- reaktiven Gruppen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Succinimidylester, Isothiocyanat, Isocyanat, Anhydrid, Halogenacetamid, Maleimid, Sulfonylhalogenid, Phosphoramidit, Säurehalogenid, Acylazid, Alkylimidat, Hydrazid, Arylimidat, Hydroxylaminen, Carbodiimiden;

- elektronenabgebenden und -abziehenden Gruppen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amid, Cyano, Nitro, Alkoxy, Sryryl, Aryl und Heteroarylgruppen;

- lipid- und kohlenwasserstoffsolubilisierenden Gruppen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Aryl und Aralkylgruppen; und

L aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einer geraden oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub6;-Alkylkette, einem C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Monoether oder -Polyether und einer bis zu vier sekundäre Amidbindungen enthaltenden C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Atomkette.

5. Verbindung nach Anspruch 1, gewählt aus:

i) 6,6'-Disulfo-meso-carboxymethyl-bis-(benzothiazolyl)methinbordifluorid

ii) α-Carboxymethyl-5,5'-disulfo-3,3'-ethylen-oxacyanin

iii) 3,3'-Ethylen-6-sulfothia-5'-carboxymethyl-6'-sulfooxamonomethincyanin

iv) 5-Carboxymethyl-bis-(benzoxazolyl)methinbordifluorid

v) α-Carboxymethyl-3,3'-ethylenthiacyanin

vi) meso-Carboxymethyl-benzoxazolyl-benzothiazolylmonomethinbordifluorid

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend das Umsetzen einer Verbindung der Formel (A) oder eine protonierte Form hiervon

wahlweise substituiert durch Gruppen R&sup4; bis R&sup7;, worin R¹ und R&sup4; bis R&sup7;, X, Y, Z¹ und Z² wie vorangehend definiert sind, mit einer für die Ausbildung der Bindung T geeigneten Verbindung, worin T wie vorangehend definiert ist.

7. Verbindung der Formel

oder eine protonierte Form hiervon;

wahlweise substituiert durch Gruppen R&sup4; bis R&sup7;, worin R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; an die X und Y enthaltenden Ringe gebunden sind, oder wahlweise an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind, und worin R¹, R&sup4; bis R&sup7;, X, Y, Z¹ und Z² wie vorangehend definiert sind;

8. Verfahren zum Verleihen von Fluoreszenzeigenschaften an ein nichtpolares Material, wobei das Verfahren die Schritte des Auflösens in dem nichtpolaren Material der Verbindung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-5 genannt, umfaßt, worin mindestens eine der Gruppen R¹ bis R&sup7; eine ungeladene Gruppe ist.

9. Verfahren zum Verleihen von Fluoreszenzeigenschaften an ein polares Material, wobei das Verfahren die Schritte des Auflösens in dem polaren Material einer Verbindung, wie in mindestens einem der Ansprüche 1-5 beansprucht, umfaßt, worin mindestens eine der R-Gruppen aus der geladene Gruppen und polare Gruppen umfassenden Gruppe gewählt wird.

10. Verfahren zum Verleihen von Fluoreszenzeigenschaften an ein Zielmaterial, wobei das Verfahren die Schritte des Inkubierens:

i) eines Zielmaterials mit mindestens einer funktionellen Gruppe, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Hydroxyl, Phosphoryl, Carbonyl und Sulfhydrylgruppen; oder das mindestens eine reaktive Gruppe besitzt, die mit der mindestens einen funktionellen Gruppe kovalent binden kann; und

ii) einer Menge der fluoreszierenden Verbindung, wie in mindestens einem der Ansprüche 1-5 beansprucht, worin mindestens eine der R-Gruppen eine funktionelle Gruppe ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Hydroxyl, Phosphoryl, Carbonyl und Sulfhydryl; oder worin mindestens eine der R-Gruppen eine reaktive Gruppe ist, die mit der mindestens einen funktionellen Gruppe kovalent binden kann;

über einen ausreichenden Zeitraum umfaßt, um es der mindestens einen funktionellen oder reaktiven Gruppe der fluoreszierenden Verbindung zu ermöglichen, kovalent an die mindestens eine reaktive oder funktionelle Gruppe des Zielmaterials zu binden.

11. Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Nukleinsäure, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

i) Vorsehen einer Probe der zu sequenzierenden Nukleinsäure, einer Primer- Nukleinsäuresequenz, welche zu mindestens einem Teil der zu sequenzierenden Nukleinsäure komplementär ist, einem Vorrat an Desoxynukleoti den und mindestens einem Didesoxynukleotid zur Terminierung der Sequenzierungsreaktion, und einer Polymerase;

ii) Durchführen von Nukleinsäurekettenverlängerungs- und Kettenterminierungsreaktionen;

iii) Abtrennen der Oligonukleotidfragmente gemäß der Größe;

dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere der Didesoxynukleotide oder der Primer-Nukleinsäuresequenz mit einer Verbindung gemäß mindestens einem, der Ansprüche 1-5 markiert wird.