DE69621949T2

DE69621949T2 - Toxisches protein exprimierende viren und produktionszellinien

Info

Publication number: DE69621949T2
Application number: DE69621949T
Authority: DE
Inventors: Sunil Chada; J. Depolo; J. Jolly; C. Manning; E. Murphy; O. Ralston; Joan Robbins; Sybille Sauter
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2002-09-26
Anticipated expiration: 2016-12-21
Also published as: ATE219521T1; WO1997024452A2; DE69621949D1; EP0870050B1; ES2175184T3; EP0870050A2; PT870050E; JP2000502261A; DK0870050T3; WO1997024452A3

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Viren und insbesondere Producer-Zellinien und Verfahren, die damit im Zusammenhang stehen, die eine Produktion rekombinanter Viren erlauben, die für toxische oder fusogene Proteine codieren oder diese enthalten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Seit der Entdeckung der DNA in den 1940igern und weiter während der jüngsten Zeit der DNA-Rekombinationstechnik wurden eine substantielle Forschung durchgeführt, um die Möglichkeit zu verwirklichen, daß der Verlauf einer Krankheit durch Wechselwirkung mit den Nucleinsäuren lebender Organismen beeinflußt werden kann. In jüngerer Zeit wurde eine Vielzahl von Verfahren zur Änderung oder Beeinflussung von Genen beschrieben, die z. B. virale Vektoren umfassen, die von Retroviren, Adenoviren, Vaccinia- Viren, Herpes-Viren und adenoassoziierten Viren stammen (siehe Jolly, Cancer Gene Therapy 1 (1): 51-64; 1994).
Rekombinante Retroviren und verschiedene Verwendungen derselben wurden in zahlreichen Referenzen beschrieben, die z. B. Mann et al., Cell 33: 153, 1983, Cane und Mulligan, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81: 6349, 1984, Miller et al., Human Gene Therapy 1: 5-14, 1990, US-Patent Nrn. 4 405 712, 4 861 719, 4 980 289 und die PCT-Anmeldungen Nrn. WO 89/02 468, WO 89/05 349 und WO 90/02 806 umfassen. Kurz ausgedrückt, ein fremdes interessierendes Gen kann anstelle der normalen retroviralen RNA in das Retrovirus eingebaut werden. Wenn das Retrovirus seine RNA in eine Zelle injiziert, wird auch das fremde Gen in die Zelle eingeführt und kann in die zelluläre DNA des Wirts, so als wäre es das Retrovirus selbst, eingebaut werden. Eine Expression dieses fremden Gens im Wirt führt zu einer Expression des fremden Proteins durch die Wirtszelle.
Derzeit bieten bestimmte retrovirale Vektoren (z. B. die, die eine amphotrope Hülle haben) einen breiten Wirtsbereich, können aber im Vergleich zu dem Wirtsbereich, der vom VSV-G-Protein geboten wird (Marsh und Helenius, Advances in Virus Research 36: 107- 151, 1989), nicht mithalten. Kurz ausgedrückt, von vesikulärem Stomatitis Virus (VSV) ist bekannt, daß es verschiedene Gewebetypen einschließlich Muskel-, Leber-, Nerven-, Fibroblasten- und nicht-replizierende hämatopoetische Zellen infiziert. VSV-G hat verglichen zu einer amphotropen Hülle einen ausgedehnten Tropismus, der ein Eindringen in den Menschen, niedrigere Primaten, Nager, Amphibien, Fische und Insekten ermöglicht. Ein neuerer Bericht gibt an, daß VSV G-pseudotypisierte retrovirale Vektoren humane periphere hämatopoetische Stamm/Eltern-Zellen viel effizienter transduzieren als amphotrope Vektoren (Kerr et al., Blood 74 (Suppl. 1); 402a, 1994).
Wegen der ausgezeichneten fusogenen Eigenschaften des VSV-G-Proteins war allerdings eine stabile Zellinie aufgrund einer Zellfusion durch die gesamte Kultur schwer zu produzieren (Yee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9564-9568, 1994). Eine gewisse Expression von VSV-G wurde in murinen C127-Fibroblasten (Florkiewicz et al., J. of Cell Biol. 97: 1381-1388, 1983) und MDCK (Roman et al., Experimental Cell Research 175: 376-387, 1988)-Zellen beschrieben, obgleich die Spiegel einer Zelloberflächenexpression gering waren. WO 94/29440 beschreibt Verfahren zur Herstellung von VSV-Gpseudotypisierten retroviralen Vektoren und WO 87/03905 beschreibt Plasmide, die murine CMV-Promotoren enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die die Produktion rekombinanter viraler Partikel mit fusogenen Hüllen wie VSV-G erlauben oder die andere Proteine exprimieren, die für Zellen toxisch sind. Die vorliegende Erfindung liefert diese wie auch andere verwandte Vorzüge.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Zusammenfassend ausgedrückt, die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Retroviren bereit, die toxische und/oder oder fusogene Proteine haben. Beispielsweise werden in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Expressionsvektoren bereitgestellt, die einen CMV IE-Promotor funktionell an eine Nucleinsäuresequenz, die eine toxisches und/oder fusogenes Protein codiert, umfassen. Typische Beispiele für fusogene Proteine umfassen vesikuläres Stomatitis-Virus-G-Protein und Tollwut-Virus G-Protein. Typische Beispiele für toxische Proteine umfassen γ-IFN, IL-2 und TNF-β.
Außerdem werden retrovirale Vektoren, die einen der oben genannten Expressionsvektoren enthalten, Verpackungszellen, die eine gag/pol-Expressionskassette und einen Expressionsvektor, wie er oben beschrieben wurde, umfassen, wie auch Producer-Zellinien, die eine gag/pol-Expressionskassette, einen Expressionsvektor, wie er oben beschrieben wurde, und ein retrovirales Vektorkonstrukt umfassen, bereitgestellt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Retrovektorpartikeln bereitgestellt, wobei ein muriner Cytomegalovirus in einer retroviralen Producer-Zellinie der Erfindung bereitgestellt wird. Ein derartiges Verfahren kann außerdem die Schritte (a) Inkubieren von 10³ bis 10&sup5; Zellen, die eine gag/pol-Expressionskassette und retrovirales Vektorkonstrukt enthalten, in einer Kultur mit einer Oberfläche von mehr als 225 cm² unter Bedingungen und über eine Zeit, die ausreichen, damit die Zelle in die log-Wachstumsphase eintreten, und (b) Einführen eines Expressionsvektors, wie er oben beschrieben ist, in die Kultur, so daß vorübergehend Retrovektorpartikel aus den Zellen produziert werden können, umfassen. Typische Beispiele für Verfahren zur Einführung des Expressionsvektors in die Zellkultur derart, daß ein Eintritt des Expressionsvektors in die Zellen erfolgt, umfassen Lipofektion, Elektroporation oder Verwendung einer Quelle für Ca&spplus;&spplus;-Ionen und einer Quelle für PO&sub4;&supmin;-Ionen.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen deutlich. Außerdem werden verschiedene Referenzen im folgenden angegeben, die bestimmte Verfahren oder Zusammensetzung (z. B. Plasmide, usw.) detaillierter beschreiben und daher durch Referenz in ihrer Gesamtheit, so als wären sie einzeln aufgeführt, aufgenommen werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines VSV-G/SRE-Expressionskonstrukts.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Verteilung der Cystein-Reste in einem VSV-G-Gen.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung des HindIII "L"-Fragments von CMV.
Fig. 4A ist eine Southern-Blot-Analyse von drei Isolaten von RM-CMVG. Fig. 4B ist eine schematische Darstellung der Sonde, die in der Analyse verwendet wird, die in Fig. 4A dargestellt ist.
Fig. 5 sind zwei Aufnahmen (200x) von RCMVG- und wtMCMVNIH3T3-infizierten Zellen.
Fig. 6 ist ein Western-Blot von VSV-G-Expressions-Isolaten.
Fig. 7 ist ein Western-Blot von VSV-G-Expressions-Isolaten.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bevor die Erfindung weiter erläutert wird, kann es hilfreich sein, zum Verständnis derselben Definitionen bestimmter Ausdrücke, die im folgenden verwendet werden, zu geben.
"Expressionsvektor" und "Expressionskassette" betreffen eine Anordung, die fähig ist, die Expression einer Sequenz oder eines Gens von Interesse zu steuern. Der Nucleinsäure-Expressionsvektor muß einen Promotor beinhalten, der, wenn er transkribiert wird, funktionell an die interessierende(n) Sequenz(en) oder das Gen (die Gene) funktionell gebunden ist, sowie eine Polyandenylierungssequenz umfassen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung stammen sowohl der Promotor als auch die Polyandenylierungssequenz aus einer Quelle, die zu den Helferelementen gag/pol und env heterolog ist. In anderen Ausführungsformen der Erfindung können die hier beschriebenen Expressionsvektoren in einem Plasmidkonstrukt enthalten sein.
"Retroviraler Vektor", "retrovirales Vektorkonstrukt", "RETROVECTOR CONSTRUCTTM" und "rekombinanter retroviraler Vektor", die allgemein ein Untersatz von "Expressionsvektoren", wie sie oben diskutiert wurden, sind, beziehen sich auf ein Nucleinsäurekonstrukt, das ein Nucleinsäuremolekül von Interesse trägt, und in bestimmten Ausführungsformen fähig ist, die Expression eines Nucleinsäuremoleküls von Interesse zu steuern. Der retrovirale Vektor muß mindestens ein einen transkriptionalen Promotor/Enhancer oder Ort-definierendes Element (bzw. Elemente) oder andere Elemente enthalten, die eine Genexpression durch andere Mittel kontrollieren, z. B. abwechselndes Spleißen, nuclearer RNA-Export, posttranslationale Messenger-Modifikation oder posttranskriptionale Protein-Modifikation. Solche retroviralen Vektoren müssen auch ein Verpackungssignal, lange terminale Sequenzwiederholungen (LTRs) oder einen Teil davon und positive und negative Strang-Primerbindungsstellen, die für das verwendete Retrovirus geeignet sind (wenn diese nicht bereits im retroviralen Vektor vorliegen), umfassen. Gegebenenfalls kann der rekombinante retrovirale Vektor auch ein Signal, das eine Polyadenylierung steuert, selektierbare Marker, z. B. Neo, TK, Hygromycin, Phleomycin, Histidinol oder DHFR, wie auch eine oder mehrere Restriktionsstellen und eine Translationsterminationssequenz enthalten. Z. B. umfassen Vektoren typischerweise 5'-LTR, eine tRNA- Bindungsstelle, ein Verpackungssignal, einen Ursprung für die Synthese einer zweiten Strang-DNA und 3'-LTR oder einen Teil davon.
"Rekombinantes Retrovirus", "retrovirales Genabgabevehikel" und "retrovirales Vektorpartikel", wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beziehen sich auf ein Retrovirus, das mindestens ein interessierendes Gen trägt. Das Retrovirus kann auch einen selektierbaren Marker enthalten. Das rekombinante Retrovirus ist bei Infektion zur reversen Transkription seines genetischen Materials in DNA und Einbau seines genetischen Materials in eine Wirtszellen-DNA fähig.
"Verpackungszelle" bezieht sich auf eine Zelle, die die Elemente enthält, die zur Erzeugung eines infektiösen rekombinanten Virus, dem ein rekombinanter viraler Vektor fehlt, notwendig sind. Typischerweise enthalten solche Verpackungszellen eine oder mehrere Expressionskassetten, die fähig sind, Proteine zu exprimieren und die für gag-, pol- und env-Proteine codieren.
"Producer-Zelle" oder "Vektor-produzierende Zelle" bezieht sich auf eine Zelle, die alle Elemente enthält, die zur Herstellung rekombinanter viraler Vektorpartikel notwendig sind.
"Fusogenes Protein" betrifft Glycoproteine, die bewirken, daß Zellen in einer Kultur zu vielkernigen Syncytia verschmelzen. Typische Beispiele für fusogene Proteine umfassen VSV-G- und Tollwut-G-Protein.
"Toxisches Protein" bezieht sich auf ein Protein, das in Zellen ein cytotoxisches oder cytostatisches Verhalten zeigt. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung wird ein Protein für cytotoxisch gehalten, wenn bei Expression in einer rasch wachsenden Kultur innerhalb eines Zeitraums von 48 Stunden (verglichen mit derselben Kultur, die das Protein nicht exprimiert) mehr als 20% Zelltod auftritt. Entsprechend wird ein Protein als cytostatisch beurteilt, wenn bei Expression in einer schnellwachsenden Kultur eine Verringerung der Zellverdoppelungszeit um mehr als 20% in einem Zeitraum von 48 Stunden (verglichen mit derselben Kultur, die das Protein nicht exprimiert) auftritt. Bevorzugte Assays für die Toxizitätsmessung umfassen den MTT-Assay, der ein nicht-radioaktives Format zur quantitativen Bestimmung der Anzahl der lebensfähigen Zellen in Proliferations-Assays (z. B. Promega Corp., Madison, WI) oder den ³H-Einbau in entstehende DNA verwendet. Allerdings können gleicherweise eine Reihe anderer Assay-Formate verwendet werden, um verschiedene Parameter, die mit Zelltoxizität verbunden sind, z. B. Zellebensfähigkeit (Farbstoffausschluß, Zellzählung) und Zellmetabolismus (Farbstoffreduktion) verbunden sind (für weitere Details und Verfahren siehe A laboratory Handbook, Hrsg. J. E. Celis, Academic Press) zu beurteilen. Typische Beispiele für toxische Proteine umfassen γ-Interferon, Interleukin-2, TNF α und TNF β.

A. HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN RETROVIRALEN VEKTOREN, VERPACKUNGSZELLEN, PRODUCER-ZELLEN UND REKOMBINANTEN RETROVIREN

Wie oben beschrieben wurde, liefert die vorliegende Erfindung rekombinante Retroviren, die konstruiert wurden, um ein selektiertes Nucleinsäure-Molekül von Interesse zu tragen oder zu exprimieren.
Retrovirale Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung können in einfacher Weise aus einer ganzen Reihen von Retroviren konstruiert werden; diese Retroviren umfassen z. B. Retroviren des Typs B, C und D wie auch Spumaviren und Lentiviren (siehe RNA Tumur Viruses, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Solche Retroviren können in einfacher Weise eingesetzt werden, um retrovirale Gen-Abgabevehikel aufzubauen oder zu konstruieren; die Beschreibung dieser und die Beschreibung von Standardrekombinationstechniken wird hier als Referenz aufgenommen (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labaratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, PNAS 82 : 488, 1985).
Beispiele für retrovirale Gen-Abgabevehikel, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen z. B. die, die in EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; US-Patent Nr. 5 219 740; WO 93/11230; WO 93/10218; Vile und Hart, Cancer Res. 53: 3860-3864, 1993; Vile und Hart, Cancer Res. 53: 962-967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53: 83-88 1993; Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33: 493-503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg. 79: 729-735, 1993 (US- Patent Nr. 4 777 127, GB 2 200 651, EP 3 345 242 und WO 91/02805) beschrieben sind. Besonders bevorzugte rekombinante Retroviren umfassen die, die in WO 91/02805 und US 95/05789 beschrieben sind.
Verpackungszellinien, die zur Verwendung mit den oben beschriebenen Vektorkonstrukten geeignet sind, können in einfacher Weise hergestellt werden (siehe auch WO 92/05266) und verwendet werden, um Producer-Zellinien (auch Vektor-Zellinien oder "VCLs" genannt) zur Herstellung rekombinanter Vektorpartikel herzustellen; diese Offenbarung wird hier aufgenommen.
Nach anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Verfahren für eine vorübergehende Herstellung von Retrovektorpartikel bereitgestellt, umfassend die allgemeinen Schritte (a) Inkubieren von 10³ bis 10&sup5; Zellen, die eine gag/pol-Expressionskassette und ein retrovirales Vektorkonstrukt enthalten, in einer Kultur mit einer Oberfläche von über 225 cm² unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, damit die Zellen in die log-Wachstumsphase eintreten, und (b) Einführen eines Expressionsvektors, wie er oben beschrieben ist, in die Kultur, so daß Retrovektor-Partikel vorübergehend von diesen Zellen produziert werden können. Typische Beispiele für Methoden zur Einführung des Expressionsvektors in die Zellkultur, so daß ein Eintritt des Expressionsvektors in die Zellen auftritt, umfassen Lipofektion, Elektroporation oder Transfektion unter Ausnutzung einer Quelle für Ca&spplus;&spplus;-Ionen und einer Quelle für PO&sub4;&supmin;-Ionen (z. B. CaCl und HBS, Promega, Madison, WI). In bestimmten Ausführungsformen kann die Oberfläche der Kultur größer als 1200 cm² oder sogar größer als etwa 6 000 cm² sein.
Unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie sie hier offenbart sind, können leicht Verpackungs-Zellinien, die rekombinante retrovirale Partikel produzieren, mit Titern von über 10&sup6; oder 10&sup7; kbE/ml (im Rohüberstand) erhalten werden. Außerdem sollte betont werden, daß solche Titer im allgemeinen aus Titer-Assays an HT1080-Zellen erhalten werden, welche einen dreifach niedrigeren Titer als die Titer, die mit murinen 3T3- Zellen erhalten werden, produzieren.

B. REGULIERUNG DER GEN-EXPRESSION

Nach anderen Aspekten der Erfindung kann eine Regulierung der Gen-Expression erreicht werden, indem virale Vektoren verwendet werden, die in einem Zelltyp replizieren können, einen anderen aber erfolglos infizieren (d. h. die in ihrer nativen Spezies replikationskompetent sind und in anderen Spezies replikationsinkompetent sind). Ein derartiges System kann zur Produktion vieler Typen viraler Vektoren verwendet werden, bei denen eine Produktion viraler Proteine toxisch ist (z. B. AAV- und rep-Proteine, Adenovirus- Vektoren, virale Herpes-Vektoren, Sindbis- und andere alpha-Viren).
Beispielsweise werden in einer Ausführungsform der Erfindung Expressionsvektoren bereitgestellt, die einen murinen CMV-IE-Promotor funktionell an eine Nucleinsäuresequenz gebunden umfassen, welche für ein toxisches oder fusogenes Protein codiert. Kurz ausgedrückt, MCMV ist ein Mitglied der beta-Familie der Herpes-Viren. Diese Viren enthalten in ihrem Virion ein Transaktivator-Protein, das für die Initiierung einer Transkription aus den Immediate-Early-Genen verantwortlich ist. MCMV infiziert humane Zellen erfolglos, d. h. das Virus dringt in die humanen Zielzellen ein, es tritt eine gewisse "Early-Gen"-Expression auf, aber es werden keine viralen Partikel produziert. Dies erlaubt die Verwendung von MCMV, um in anderer Weise toxische Proteine in "burst"-Art (in Art eines Wurfes) in humanen Zellen zu exprimieren, worauf ein Ernten des Produktes ohne weitere Produktion von, und Kontamination mit, MCMV folgt. Daher kann das Produkt, das das toxische oder fusogene Protein enthält, geerntet werden und bei Zielzellen oder -geweben ohne signifikante MCMV-Toxizität verwendet werden.
Dieses Transaktivierungsphänomen kann verwendet werden, um die Expression einer großen Vielzahl toxischer und/oder fusogener Gene, z. B. des VSV-G-Gens, nach mindestens zwei unterschiedlichen Verfahren zu regulieren.
a) Das VSV-G-Gen kann unter die Kontrolle einer MCMV-Immediate-Early (IE)-Gens, z. B. ie1 oder ie3 gestellt werden, indem die Promotorregionen aus einem IE-Gen an das VSV-G-Gen fusioniert werden. Das modifizierte VSV-G-Gen wird dann durch homologe Rekombination wieder in das MCMV-Genom eingeführt. Da VSVg-Protein nicht unmittelbar toxisch ist, und der Lebenszyklus von MCMV in Mauszellen zwei oder drei Tage beträgt, können MCMV-Stämme mit herkömmlichen Titern (10&sup7;-10&sup9; pbE/ml) hergestellt werden. Rekombinante Virus-Stämme werden durch aufeinanderfolgende Plaque-Reinigungszyklen erhalten und können verwendet werden, um humane Pre- Producer-Zellen (Zellen, die einen retroviralen Vektor enthalten, denen aber ein Hüllprotein fehlt) zu infizieren. Da MCMV eine abortive Infektion in humanen Zellen bewirkt, werden VSV-G-pseudotypisierte retrovirale Vektoren aus den infizierten Zellen ohne Kontamination durch MCMV freigesetzt werden.
b) Das VSV-G-Gen kann unter die Kontrolle der ie-Gen-Regulatorsequenzen aus MCMV gestellt werden. Dieses Konstrukt kann in eine Pre-Producer-Zellinie (oben beschrieben) transfiziert werden. In Abwesenheit der ie-Transaktivatoren ist eine konstitutive Transkription aus dem MCMV-IE-Promotor sehr gering, was zu einer minimalen Expression des toxischen VSV-G-Genproteins führt. Wenn die Pre-Producer-Zelle mit Wildtyp-MCMV infiziert wird, verursacht der Transaktivator eine sehr schnelle und starke Expression des VSV-G-Gens, was zu einer Sekretion von VSV-G-pseudotypisierten retroviralen Vektoren führt. Da MCMV eine abortive Infektion in humanen Zellen bewirkt, werden VSV-G-pseudotypisierte retrovirale Vektoren aus der infizierten Zellen ohne Kontamination durch MCMV freigesetzt werden. Wenn geringe Level einer MCMV- Replikation in den humanen Pre-Producer-Zellen auftreten, können die MCMV-infizierten Kulturen mit Gancyclovir behandelt werden, um eine Synthese von späten MCMV- Proteinen zu verhindern.
Alternativ braucht das transaktivierende MCMV bezüglich der Replikationskapazität nicht funktionell zu sein und es kann ein rekombinantes MCMV aufgebaut werden, dem die frühen oder späten Gene oder beide fehlen. Ein solches rekombinantes MCMV kann in stabiler Weise in Zellen, die eine einzelne Kopie der deletierten Gene (d. h. der frühen oder späten) enthalten, vermehrt werden, wobei eine Transkomplementation und eine MCMV-Virusbildung ermöglicht wird.
Obgleich MCMV hier als Beispiel angeführt wird, sollte klar sein, daß die vorliegende Erfindung nicht in dieser Weise beschränkt wird. Es kann eine Vielzahl anderer Viren, die in ihrer nativen Spezies replikationskompetent und in anderen Spezies replikationsinkompetent sind, in der vorliegenden Erfindung gleichermaßen verwendet werden. Typische Beispiele umfassen Tier-Viren, z. B. Maus-angepaßtes Influenza-Virus und. Rhesus-Rotavirus, wie auch andere, die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt sind. TABELLE 1

C. TOXISCHE UND FUSOGENE PROTEINE

Wie oben diskutiert wurde, kann eine breite Vielzahl entweder natürlich vorkommender oder synthetisch produzierter toxischer oder fusogener Proteine durch Expressionsvektoren und/oder virale Vektoren der vorliegenden Erfindung exprimiert werden. Typische Beispiele für fusogene Proteine (die einen fusogenen Zustand vermitteln) umfassen VSV-G (Lazarini et al., J. Vir. 45: 773-781. 1983), Tollwut-Virus-G (Gaudin, et al., J. Virol. 67: 1365-1372, 1993), Semliki-Forest-Virus, Sindbis- und andere alpha-Viren, die E1- und E2-Glycoproteine haben (Whitt, M. et al., Virol. 185: 681, 1991).
Nach anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung können synthetische Chimäre dieser Glycoproteine produziert werden, die veränderte Aktivitäten haben. Beispielsweise kann ein synthetisches Chimäres einer extrazellulären Tollwut-Domäne, fusioniert an die VSV-G-Transmembran und die cytoplasmische Domäne, produziert werden, das paradoxerweise die Infektivität beibehält, dem aber Fusionsaktivität fehlt. (Whitt, M. et al., Virol. 185 : 681, 1991). Außerdem kann der Aufbau einer extrazellulären Transmembrandomäne nur aus Glycoproteinen zur Pseudotypisierung verwendbar sein. Typische Beispiele für Viren, die in dieser Weise pseudotypisiert werden können, umfassen HIV (Virology 209(2): 696-700, 1955; J Vir. 69(3): 1984-9; AIDS Res Hum Retroviruses 8(9): 1669-77, 1992), SIV (J. Med. Primatol 21(2-3): 69-73, 1992); HTL V (Int. J. Cancer 60(4): 567-70, 1995; Int. J. Cancer 59(5): 655-60, 1994; Int. J. Cancer 59(3): 416-21, 1994; Int. J. Cancer 56(1): 100-5, 1994; J. Vir. 65(1): 162-9, 1991; Virology 180(1): 420-4, 1991); MuLV (J. Vir. 67(8): 4712-21, 1993; J. Vir. 66(3): 1468-75, 1992); FIV (J. Vir. 67(7): 4142- 53, 1993; P.N.A.S. 89(18): 8457-61, 1992); RSV (J. Gen. Vir. 73 (Pt 11): 2995-7. 1992); AKV (Virology 186(1): 161-6, 1992); Cocal (J. Vir. Methods 44(2-3); 287-304, 1993); VSV-G (Virology 178(2): 373-83, 1990; J. Vir. 5(3): 1202-7, 1991); HSV (Vaccine 11(6): 675-8, 1993) und LDV (J. Vir. 69(7): 4237-44, 1995).
Die vorliegende Erfindung kann auch bei der Herstellung rekombinanter Viren, welche toxische Proteine exprimieren, einsetzbar sein. Typische Beispiele für Proteine, die für Zellen toxisch sind, umfassen γ-Interferon, IL-2 und TNF-β, wie auch andere toxische Moleküle (im folgenden detaillierter diskutiert), die durch das rekombinante Virus exprimiert werden können; sie umfassen z. B. Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, antivirales Protein, Tritin, Shigella-Toxin und Pseudomonas-Exotoxin A.

D. ANDERE HETEROLOGE NUCLEINSÄURE-MOLEKÜLE

Durch die Expressionsvektoren oder rekombinanten Retroviren der vorliegenden Erfindung kann eine ganze Vielzahl von Nucleinsäure-Molekülen getragen und/oder exprimiert werden. Im allgemeinen treten die hier beschriebenen Nucleinsäure-Moleküle natürlicherweise im Expressionsvektor oder im rekombinanten Virus, der/das sie trägt, nicht auf; dies liefert einige Vorteile, typischerweise die Fähigkeit, eine Krankheit oder ein anderes pathogenes Agens oder einen Zustand zu bekämpfen.
Substanzen, die durch die hier beschriebenen Nucleinsäure-Moleküle codiert werden können, umfassen Proteine (z. B. Antikörper, die Einzelkettenmoleküle enthalten), immunstimulierende Moleküle (z. B. Antigene), immunsupprimierende Moleküle, blockierende Mittel, Palliativa (z. B. Toxine, Antisinn-Ribonucleinsäuren, Ribozyme, Enzyme und anderes Material, das fähig ist, die Funktion eines pathogenen Agenzes zu hemmen), Cytokine, verschiedene Polypeptide oder Peptidhormone, ihre Agonisten oder Antagonisten, wobei diese Hormone aus Geweben stammen können, z. B. aus der Hypophyse, dem Hypothalamus, der Niere, aus endothelialen Zellen, der Leber, dem Pankreas, Knochen, dem hämopoetischen Mark und der Nebennierenrinde. Solche Polypeptide können zur Induktion von Wachstum, Geweberegression, Suppression von Immunreaktionen, Apoptosis, Gen-Expression, Blockierung einer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, Immunreaktion eingesetzt werden und können zur Behandlung bestimmter Anämien, Diabetes, Infektionen, Bluthochdruck, abnormaler Blutchemiewerte (z. B. erhöhtes Blutcholesterin, Mangel an Blutgerinnungsfaktoren, erhöhtes LDL mit erniedrigtem HDL), Alzheimer-Leveln, assoziiert mit Amyloid-Protein, Knochenerosion/Calcium-Abscheidung verwendet werden und ebenso zur Kontrolle verschiedener Metabolitspiegel, z. B. Steroidhormone, Purine und Pyrimidine eingesetzt werden.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Verabreichung eines Expressionsvektors oder eines rekombinanten Retrovirus, der die Expression eines Palliativums steuert, bereitgestellt. Typische Beispiele für Palliativa, die direkt zur Hemmung des Zellwachstums wirken, umfassen Toxine wie z. B. Ricin (Lamb et al., Eur. J. Biochem. 148: 265-270, 1985).
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung steuert der Expressionsvektor oder das rekombinante Retrovirus die Expression einer Substanz, die fähig ist, eine anderenfalls inaktive Vorstufe zu einem aktiven Inhibitor eines pathogenen Agenzes zu aktivieren, oder eines konditionellen toxischen Palliativums, wobei das Palliativum für die Zelle toxisch ist, die den pathogenen Zustand exprimiert. Wie aus der hier gegebenen Offenbarung zu ersehen ist, kann eine große Vielzahl inaktiver Vorstufen in aktive Inhibitoren eines pathogenen Agenzes umgewandelt werden. Z. B. sind daher Expressionsvektoren oder rekombinante Retroviren, die die Expression eines Genproduktes (z. B. ein Protein) steuern, z. B. Herpes-Simplex-Virus-Thymindin-Kinase (HSVTK) oder Varicella-Zoster-Virus- Thymidin-Kinase (VZVTK), die eine Metabolisierung antiviraler Nucleosid-Analoga in ihre aktive Form unterstützt, bei der Aktivierung von Nucleosid-Analoga-Vorstufen (z. B. AZT oder ddC) in ihre aktive Form verwendbar. Eine AZT- oder ddI-Therapie wird dadurch wirksamer sein, und geringere Dosen, eine geringere allgemeine Toxizität und eine höhere Wirksamkeit gegen produktive Infektion ermöglichen. Zusätzliche Nucleosid- Analoga, deren Nucleotidtriphosphat-Formen Selektivität für retrovirale reverse Transkriptase zeigen, aber als Resultat der Substratspezifität von zellulärem Nucleosid und Nucleotidkinasen nicht phosphoryliert sind, werden wirksamer gemacht werden.
Nach noch einem weiteren Aspekt werden Expressionsvektoren und rekombinante Retroviren bereitgestellt, die einen therapeutischen Effekt haben, indem sie für ein oder mehrere Ribozyme (RNA-Enzyme) codieren (Haseloff und Gerlach, Nature 334: 585, 1989), die RNA-Moleküle, die einer pathogenen Funktion entsprechen, spalten und demnach inaktivieren werden (siehe auch Foster und Symons, Cell 48: 211-220, 1987; Haseloff und Gerlach, Nature 328: 596-600, 1988; Ruffner et al., Biochem. 29: 10, 695-10, 702, 1990; US-Patent Nrn. 5 254 678 und 4 987 071 und PCT Publication Nr. WO 93/23569). Nach einem anderen Aspekt werden Expressionsvektoren und rekombinante Retroviren bereitgestellt, die ein biologisch aktives Nucleinsäure-Molekül umfassen, das eine Antisinnsequenz ist (eine Antisinnsequenz kann auch durch eine Nucleinsäuresequenz codiert sein und dann via Transkription in einer Wirtszelle produziert werden). In bevorzugten Ausführungsformen wird die Antisinnsequenz aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen, die für das Influenzavirus, HIV, HSV, HPV, CMV und HBV codieren, ausgewählt. Die Antisinnsequenz kann auch eine Antisinn-RNA sein, die zu RNA- Sequenzen komplementär ist, die für die Pathogenität erforderlich sind. Alternativ kann das biologisch aktive Nucleinsäure-Molekül eine Sinn-RNA (oder DNA) sein, die zu RNA- Sequenzen komplementär ist, welche zur Pathogenität erforderlich sind.
Noch weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf rekombinante Retroviren, die zur Immunstimulierung fähig sind. Kurz, die Fähigkeit, fremde Gene zu erkennen und abzuwehren, ist für die Funktion des Immunsystems essentiell. Das Immunsystem muß insbesondere fähig sein, "eigen" von "nicht-eigen" (d. h. fremd) zu unterscheiden, so daß die Abwehrmechanismen des Wirts gegen eindringende Einheiten anstatt gegen Wirtsgewebe gerichtet werden. Typischerweise werden cytologische T-Lymphozyten (CTLs) durch Zeigen einer Zelloberflächen-Erkennungsstruktur, z. B. ein bearbeitetes, pathogenspezifisches Peptid, in Verbindung mit einem MHC-Klasse I- oder Klasse II-Zelloberflächenprotein induziert oder stimuliert.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Stimulierung einer spezifischen Immunantwort und zur Inhibierung der viralen Verbreitung bereit, indem ein Expressionsvektor oder rekombinanter Retroviren, die die Expression eines Antigens oder einer modifizierten Form davon in empfänglichen Zielzellen steuern, verwendet werden, wobei das Antigen fähig ist, entweder (1) eine Immunantwort auf das virale Antigen zu initiieren oder (2) die virale Verbreitung durch Besetzung zellulärer Rezeptoren, die für virale Wechselwirkungen notwendig sind, zu verhindern.
Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Expressionsvektoren oder rekombinanten Retroviren der vorliegenden Erfindung konstruiert werden, um "immunmodulatorische Faktoren" zu exprimieren. Immunmodulatorische Faktoren betreffen Faktoren, die, wenn sie durch eine oder mehrere der Zellen, die bei einer Immunantwort involviert sind hergestellt werden, oder die, wenn sie exogen den Zellen zugesetzt werden, bewirken, daß die Immunantwort von der, die in Abwesenheit des Faktors aufgetreten wäre, bezüglich Qualität und Wirksamkeit unterschiedlich ist. Die Qualität oder Wirksamkeit einer Antwort können durch eine Vielzahl von Assays, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, gemessen werden; diese umfassen z. B. in vitro-Assays, die die Zellproliferation messen (z. B. ³H-Thymidin-Aufnahme), und cytotoxische in vitro-Assays (z. B. die die &sup5;¹Cr-Freisetzung messen) (siehe Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645-655, 1991). Immunmodulatorische Faktoren können in vivo und ex vivo aktiv sein.
Typische Beispiele für solche immunmodulatorischen Faktoren umfassen Cytokine oder Lymphokine, Interferone (z. B. γ-IFN), Tumornekrosefaktoren (TNFs) (Jayaraman et al., J. Immunology 144: 942-951, 1990), CD3 (Krissanen et al., Immunogenetics 26: 258- 266, 1987), ICAM-1 (Altman et al., Nature 338: 512-514, 1989; Simmons et al., Nature 331: 624-627, 1988), ICAM-2, LFA-1, LFA-3 (Wallner et al., J. Exp. Med. 166(4): 923-932, 1987), MHC-Klasse I-Moleküle, MHC-Klasse II-Moleküle, B7.1-3, β&sub2;-Mikroglobulin (Parnes et al., PNAS 78: 2253-2257, 1981), Chaperone, z. B. Calnexin und MHC-gebundene Transporterproteine oder Analoga davon (Powis et al., Nature 354: 528-531, 1991).
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Expressionsvektoren und rekombinante Retrovektoren, die für immunogene Teile gewünschter Antigene codieren, einschließlich z. B. viraler, bakterieller oder Parasiten-Antigene. Typische Beispiele umfassen virale Antigene von Hepatitis B und C (z. B. WO 93/15207), Katzen-Leukämie-Virus- und/oder Immundefizienz-Virus-Antigene (z. B. WO 94/06921). Noch andere Beispiele umfassen Expressionsvektoren oder rekombinante Retroviren, die die Expression nicht-tumorgener, veränderter Gene, z. B. das ras (ras*)-Gen und des p53-Gen (siehe WO 93/10814), steuern.

E. ZELLKULTURKONZENTRATION UND REINIGUNG REKOMBINANTER RETROVIRALER PARTIKEL

Wie oben beschrieben wurde, stellt die vorliegende Erfindung rekombinante retrovirale Präparate bereit, die zur Verabreichung an Menschen und andere warmblütige Tiere geeignet sind. Es kann insbesondere eine große Vielzahl von Verfahren angewendet werden, um rekombinante Retroviren, die zur Verabreichung geeignet sind, herzustellen; diese umfassen z. B. die Verwendung von Fermentatoren oder Bioreaktoren, sich drehenden Flaschen, Zellhotels oder Zellfabriken und Hohlfaserkultur ein.
Kurz ausgedrückt, für Bioreaktoren oder Fermentatoren werden Zellen vorzugsweise an Mikroträgern (d. h. Cytodex 1 oder Cytodex 2; Pharamcia, Piscataway, N. J.) bei Konzentrationen im Bereich von 3 bis 15 g/l Mikroträger wachsen gelassen. Bei sich drehenden Flaschen umfassen Bedingungen die, die oben für Bioreaktoren beschrieben werden, außer daß Mikroträgerperlen im allgemeinen nicht bevorzugt sind. Typische Beispiele für solche Verfahren wie auch andere Verfahren, z. B. Zellhaltevorrichtungen oder Zellfabriken und Hohllinkerkultur sind in WO 96/0926 beschrieben.
Nach einer Kultur kann eine Vielzahl von Verfahren angewendet werden, um die Viruskonzentration und -reinheit zu erhöhen; diese umfassen z. B. Präzipitation rekombinanter Retroviren mit Ammoniumsulfat, Polyethylenglycol ("PEG")-Konzentrierung, Konzentrierung durch Zentrifugation (mit oder ohne Gradienten wie z. B. PERCOLL) oder mit "Polstern" wie Saccharose, Verwendung von Konzentrierungsfiltern (z. B. Amicon- Filtration) und durch 2-Phasentrennungen. Typische Beispiele für Konzentrierung und Reinigung und rekombinante retrovirale Partikel sind in WO 96/0926 beschrieben.

F. VERABREICHUNG

Wie oben beschrieben wurde, können rekombinante retrovirale Partikel der vorliegenden Erfindung mit hohem Titer an eine ganze Reihe von Stellen verabreicht werden; diese umfassen z. B. Stellen wie zerebrale spinale Flüssigkeit, Knochmark, Gelenke, endotheliae Arterienzellen, das Rektum, bukkale/sublinguale Stellen, Vagina, das Lymphsystem; außerdem kann die Stelle ein Organ sein, das aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Leber, Milz, Haut und Gehirn ausgewählt ist, oder sie kann eine Stelle sein, die aus der Gruppe bestehend aus Tumoren und interstitiellem Raum ausgewählt ist. Bei weiteren Ausführungsformen kann das rekombinante Retrovirus intraokular, intranasal, sublingual, oral, topisch, intravesikal, intrathekal, topisch, intravenös, intraperitoneal, intrakraniell, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden. Weitere typische Verabreichungswege umfassen Gastroskopie, ECRP und Colonoskopie, die keine vollständigen Operationsverfahren und keinen Krankenhausaufenthalt erfordern, die aber die Anwesenheit von medizinischem Personal verlangen.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung, nicht aber zur Beschränkung, angeführt.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Herstellung von retroviralen Vektor-Grundgerüsten

Retrovirale Grundgerüste, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können von einem Fachmann auf diesem Gebiet einfach hergestellt werden. Typische Beispiele für solche Grundgerüste, z. B. KT-1 und KT-3, sind in WO 91/02805 und WO 95/05789 beschrieben.

BEISPIEL 2

Gewinnung des VSV-G-Gens aus dem Plasmid MLP-G

Das VSV-G-Gen (Lazarini et al., J. Vir. 45: 773-781, 1983; siehe auch Sequenz ID NO: 1 und 2) wird aus einem Plasmid, das VSV-G enthält (z. B. pMLP-G, das den adenoviralen späten Hauptpromotor und die dreigeteilte Leader-Sequenz hat (Kaufman, P.N.A.S. 82: 689-693, 1985; Ballay et al., in Hepadna Viruses, W. Robinson, K. Koike und H. Will (Hrsg.), S. 173-187, Liss, New York, 1987, siehe auch WO 92/05266)), als ein 1,6 kb PCR- Produkt unter Verwendung der Primer #5 und #2, die auch eine Sac II-Stelle am 5'- und eine EcoR I-Stelle am 3'-Ende einführen, isoliert.

Primer-2: (Sequenz ID NO: 3)

5'-GCC GAA TTC AAT TGA GGC CTC TTT G-3' (25-mer)

Primer-5: (Sequenz ID NO: 4)

5-GAT CCG CGG AGA ATC GAT CTG TTT CCT TGA CAC TAT GAA GTG CCT TTT G-3' (49-mer)
Das PCR-Produkt wird in den TA-Klonierungsvektor pCRTMII (INVITROGEN CORP. San Diego, CA) kloniert und durch partielle Sequenzierung und korrekte Orientierung des VSV-G-Gens untersucht. Das VSV-G-Gen wird dann aus dem TA-Klonierungsvektor gewonnen und in den eukaryontischen Expressionsvektor pcDNAIII (INVITROGEN) ligiert. Der PCR-Klon wird dann durch Co-Transfektion von 293(2-3)- Zellen mit dem VSV-G exprimierenden pcDNAIII und pCB/β-gal im Verhältnis 1 : 1 unter Verwendung des Profectin-Kits von PROMEGA untersucht. Parallel dazu wird als positive Probe pMLP-G mit dem pCB/β-gal-Plasmid co-transfiziert. Nach der Co-Transfektion wird frisches Medium zu den Zellen gegeben, Überstand wird gesammelt und 24 Stunden später steril filtriert (0,45 mm). HT1080-Zielzellen werden dann mit beiden Überständen in verschiedenen Verdünnungen transduziert, wie es im folgenden beschrieben wird:
Am Tag eins werden drei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 · 10&sup5; HT1080 in 2 ml Medium (DMEM mit hohem Glucose-Gehalt, mit 10% FBS, nichtessentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat) pro Vertiefung beschickt. Zellen werden 24 Stunden bei 37ºC und 10% CO&sub2; vor einer Transduktion am nächsten Tag inkubiert.
Am Tag zwei wird das Medium entfernt und 1 ml Medium, enthaltend 8 ug Polybren/ml, wird zugesetzt. Die Zellen werden 30 Minuten bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert. Der Überstand wird verdünnt, indem vorsichtig Vektor-enthaltendes Medium zu einer geeigneten Konzentration von 5 kbE/ml hinzupipettiert wird. 5, 20 und 50 ul des verdünnten Überstands werden in die Vertiefungen 1 bzw. 3 gegeben, das Medium wird verquirlt und 24 Stunden bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert.
Am Tag 3 wird 1 ml Medium pro Vertiefung zugesetzt und die Zellen werden 24 Stunden bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert.
Am Tag 4 wird ein X-gal-Färbeverfahren an den transduzierten Zellen durchgeführt. Die Gesamtzahl an blauen Zellen wird pro Vertiefung gezählt und der Titer wird bestimmt. Kurz, das Medium wird abgegossen und es werden 0,5 ml Fixierungslösung (PBS mit 2% (V/V) Formaldehyd und 0,2% (V/V) Glutaraldehyd) pro Vertiefung zugesetzt. Die Zellen werden 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, die Fixierungslösung wird abfließen gelassen und die Zellen werden mit 2 ml PBS pro Vertiefung gewaschen. Die Vertiefungen werden Ausfließen gelassen und 0,5 ml frisch gemischte X-gal-Färbung (PBS mit 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 2 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml X-gal) werden pro Vertiefung zugesetzt. Die Zellen werden 2 Stunden bis über Nacht bei 37ºC inkubiert und die blauen Zellen werden gezählt.
Wenn der Titer zwischen pMLP-G und dem auf PCR-basierenden VSV-G-Genprodukt im Expressionsvektor vergleichbar ist, wird das auf PCR basierende VSV-G-Gen mittels Lark Sequenzierungstechnik sequenziert und mit der VSV-G-Sequenz in pMLP-G verglichen. Wenn der Titer des durch PCR wieder hergestellten VSV-G-Gens viel niedriger oder Null ist, werden andere Plasmidklone mit VSV-G, das an PCR II ligiert ist, durchgemustert.
Das funktionelle VSV-Gen kann entweder aus dem prokaryontischen TA-Klonierungsvektor pCRTMII oder aus dem eukaryontischen Expressionsvektor pcDNAIII gewonnen werden.

BEISPIEL 3 (REFERENZBEISPIEL)

Verwendung des Tetracyclin-induzierbaren Promotorsystems zur Herstellung einer stabilen, VSV-G exprimierenden Verpackungs-Zellinie

A. Einführung

Wie im folgenden detaillierter beschrieben wird, wird der Tetracyclin-Transaktivator (tTA) in die 293(2-3) PCL eingeführt und konstitutiv exprimiert. Eine zweite Transfektion der 293(2-3)tTA-Zellinie führt die tet-Operatorsequenzen mit dem VSV-G- Gen, das hinter den tet-Operatorsequenzen fusioniert ist, ein.

B. Plasmid-Präparationen

Plasmid-Präparaten für jedes der folgenden Plasmide werden unter Verwendung des QIAGEN-Plasmid-Kits (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA) im wesentlichen wie vom Hersteller beschrieben, hergestellt. Kurz ausgedrückt, die Plasmide werden in E. coli DH 12S (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) elektroporiert und Kulturen werden in LB- Brühe, ergänzt mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug/ml bei allen Plasmiden, außer pMLP-G, das Tetracyclin in einer Endkonzentration von 5 ug/ml erforderte, wachsen gelassen. Elektroporierte Bakterien werden als Einzelkolonien auf LB-Agarplatten, die die jeweiligen Antibiotika enthielten, plattiert. Einzelne Kolonien werden selektiert, es werden Miniplasmidpräparationen hergestellt und ein charakteristischer Restriktionsenzym-Abbau durchgeführt, um die Identität jedes Plasmids zu beweisen. Wenn ein einzelner Klon identifiziert ist, werden Glycerinkulturen (1 : 1 Verdünnung 40%iges Glycerin und Bakteriensuspension) bei -80ºC gelagert. Die folgende Tabelle listet die verfügbaren Plasmide auf, beschreibt die codierenden Regionen und die Quelle für die Plasmide. Plasmide zur Herstellung einer stabilen, Tetracyclin-induzierbaren VSV-G-PCL
Der eukaryontische Expressionvektor, pREP8 (Invitrogen, San Diego, CA), der das Histidinol-Resistenzgen wie auch den Epsetin-Barr-Virus-Replikationsursprung und EBNA enthält, wird mit EcoRI abgebaut und es wird ein 5,8 Kb-Fragment isoliert, relegiert und in E. coli transfiziert. Dieser Vektor, pHIS, enthält nur den Plasmid-Replikationsursprung, das Ampicillin-Resistenzgen und das Histidinol-Resistenzgen mit dem SV40-Promotor und Polyadenylierungssequenzen.

C. Konstruktion des Luciferase-Reporterplasmids pUHD 10-3/luc

Zunächst wird die Tetracyclin-Transaktivatorfunktion in einem transienten Transfektions-Assay untersucht, wobei eine tTA-kontrollierte Luciferase-Reportereinheit verwendet wird. Beide Regulatorplasmide, pUHD 15-20 und pUHD 15-1, werden in den transienten Assays analysiert, um zu bestimmen, welches Plasmid ein besseres System hinsichtlich der Leckanfälligkeit und dem Aktivierungslevel nach Tetracyclin-Entfernung liefert. Die Co-Transfektionsexperimente werden in 293(2-3)-Zellen und C-17 gag/pol- Zellen wie auch in HeLa-Zellen als positive Kontrollen durchgeführt.

1. Klonierung des Luciferase-Gens in pUHD 10-3

Plasmid pUHD 10-3 wird mit EcoRI (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) linearisiert, der 5'-Überhang mit Nucleotiden und dem Klenow-Fragment im Restriktionsenzympuffer aufgefüllt. Der Vektor wird dann mit PCI (Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol, Amresco Inc., Solon, Ohio) behandelt, um Proteine zu entfernen, und mit Ethanol präzipitiert. HindIII-Linker werden an das Plasmid ligiert, das Plasmid mit HindIII einer Restriktion unterworfen und mit CIP (intestinale Kälberphosphatase) dephosphoryliert. Nach Dephosphorylierung wird der Vektor PCI-extrahiert und Gel-gereinigt, wobei der Qiaex-Gel-Reinigungs-Kit von Qiagen verwendet wird und im wesentlichen nach den Verfahren des Herstellers vorgegangen wird.
Das Luciferase-Gen wird aus pT3/T7-Luc (Clontech) als 1,9 kb-Fragment nach einem HindIII-Abbau (New England Biolabs) isoliert, die zwei Fragmente werden über Agarosegel gereinigt, um das 1,9 kb Luciferase-codierende Fragment von dem 3,15 kb Vektor zu trennen, und das Luciferase-Gen wird in den mit HindIII einer Restriktion unterzogenen pUHD 10-3-Vektor ligiert, um pUHD 10-3/luc herzustellen.
Ein Aliquot der Ligation wird in E. coli DH 12S (Life Technologies) elektroporiert, die Kulturen werden eine Stunde lang bei 37ºC in LB-Brühe wachsen gelassen, ein Aliquot wird auf LB-Agarplatten, ergänzt mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml, plattiert, und über Nach bei 37ºC inkubiert. Einzelne Kolonien werden selektiert, in 2 ml LB-Brühe, supplementiert mit Ampicillin zu 100 ug/ml Endkonzentration, wachsen gelassen und eine Plasmid-Minipräparation unter Verwendung der Qiagen-Miniprep-Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) nach den Angaben des Herstellers hergestellt.
Um Klone zu identifizieren, die das Luciferase-Gen tragen, wird ein doppelter Abbau mit Restriktionsenzymen SalI und SacI (New England Laboratories) oder ein einzelner Abbau mit HindIII (New England Laboratories) durchgeführt. Die Elektrophorese des Abbaus an einem analytischen Agarosegel zeigt den linearisierten Vektor mit 3,15 kb und ein 1,9 kb Fragment für das Luciferase-Gen. Klone mit beiden Fragmenten werden bezüglich der Orientierung des Luciferase-Gens im Vektor weiter analysiert. Ein XbaI- Abbau (New England Laboratories) wird durchgeführt und die elektrophoresierten Fragmente an einem 1% Agarosegel untersucht. Das Fragmentmuster für die korrekte Orientierung ist 0,14, 1,76 und 3,15 kb und für die inverse Orientierung 0,14 und 5,0 kb.
Eine Plasmid-Präparation eines Klons mit der korrekten Luciferase-Orientierung (pUHD 10-3/luc) wird unter Verwendung des Qiagen-Plasmidkits durchgeführt.

2. Transiente Expression von Luciferase in 293(2-3)-, D-17-gag/pol- und HeLa- Zellen

293(2-3) und D-17-Verpackungszellen (WO 92/05266) (wie auch HeLa-Zellen als positive Kontrollen) werden mit pUHD 10-3/luc und entweder pUHD 15-20 oder pUHD 15-1 in Verhältnissen 1 : 20, 1 : 50 und 1 : 100 co-transfiziert. Die Plasmide werden über Calciumphosphat-Präzipitation unter Verwendung des Profection-Kits von Promega (Promega Corp., Madison, WI) nach den Empfehlungen des Herstellers eingeführt. Zwei Gewebekulturschalen für jede der verschiedenen Plasmidkombinationen, Verhältnisse und Zellinien werden erstellt. Zu einer Schale wird Tetracyclin, Anhydrocyclin oder Desoxycyclin gegeben, zu der anderen nicht.
Eins der Tetracycline wird mehrere Stunden vor der Co-Transfektion in einer Endkonzentration von 1 ug/ml zugegeben. Die Zellen beider Schalen pro Kombination werden 24 Stunden nach Transfektion auf Luciferase-Aktivität untersucht.

3. Analyse der Luciferase-Aktivität

Der Luciferase-Assay wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Promega) durchgeführt. Das tTA-Regulatorplasmid (pUHD 15-20 oder pUHD 15-1), das die geringste Grundaktivität und den höchsten Grad der Luciferase-Aktivität in Tetracyclinfreier Kultur liefert, wird verwendet, um eine stabile VSV-G-produzierende 293(2-3)- und/oder D-17-Zellinie einzuführen.

4. Aufbau stabiler 293(2-3)tTA- und D-17 gag/pol-tTA-Zellinien

Das Regulationssystem in 293(2-3) und D-17-gag/pol-Zellen wird in zwei Schritten etabliert. Zuerst werden 293(2-3)- und D-17 gag/pol-Zellen mit einem tTA-Regulatorplasmid und pUT 507 im Verhältnis 10 : 1 co-transfiziert. Die Plasmide werden über Calciumphosphat-Präzipitation unter Verwendung des Profection-Kits von PROMEGA eingeführt. Die Co-Transfektion wird ausgeführt, wie es vom Hersteller empfohlen ist. Zwei Tage nach der Co-Transfektion werden die Zellen 10 Tage lang mit Zeocin selektiert, bis alle nicht-resistenten Zellen tot sind. Die Zellen werden dann aus der Selektion entnommen und in verschiedenen Platten mit 96 Vertiefungen wird eine limitierende Verdünnung durchgeführt, so daß ein Drittel der Vertiefungen Wachstum zeigt. Jeder Klon wird transient mit pUHD 10-3/luc einer Transfektion unterzogen und auf Luciferase- Aktivität durchgemustert. Klone mit hohen Leveln an Luciferase-Aktivität und niedrigen Grundlevel in Gegenwart von Tetracyclin werden zur Einführung des klonierten VSV-G- Gens in pUHD 10-3 verwendet. Die Zellen werden dann aus der Selektion entnommen und in mehreren Platten mit 96 Vertiefungen wird eine limitierende Verdünnung durchgeführt, so daß ein Drittel der Vertiefungen Wachstum zeigt. Jeder Klon wird transient mit pUHD 10-3/luc einer Transfektion unterzogen und auf Luciferase-Aktivität durchgemustert. Klone mit hohen Level an Luciferase-Aktivität und niedrigen Grundlevel in Gegenwart von Tetracyclin werden verwendet, um das klonierte VSV-G-Gen in pUHD 10-3 einzuführen.

D. Konstruktion des VSV-G-Expressionsplasmids pUHD 10-3/VSV-G

Das VSV-G-Gen wird mit einem doppelten EcoRI-SacII-Abbau aus dem pCRTMII- TA-Klonierungsvektor isoliert. Das 1,6 kb VSV-G-Gen wird isoliert und durch Elektrophorese an einem 1% Agarosegel unter Verwendung des QIAEX-Kits wie oben beschrieben gereinigt. Das Plasmid pUHD 10-3 wird mit SacII und EcoRI einer Restriktion unterzogen und das VSV-G-Gen in die Hauptkette (in das Grundgerüst) ligiert.
Ein Aliquot der Ligation wird in E. coli DH 12S (Life Technologies) elektroporiert, die Kulturen werden in LB-Brühe für eine Stunde bei 37ºC wachsen gelassen, ein Aliquot wird auf LB-Agarplatten, komplementiert mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml, plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Einzelne Kolonien werden herausgenommen, in 2 ml LB-Brühe, komplementiert mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml, über Nacht wachsen gelassen und eine Plasmid-Minipräparation, wie oben beschrieben, hergestellt.
Zur Identifizierung von Klonen, die das VSV-G-Gen tragen, wird ein doppelter Abbau mit Restriktionsenzymen SacII und XbaI (New England Laboratories) durchgeführt. Die Elektrophorese des Abbaus an einem 1%igen analytischen Agarose-Gel zeigt den linearisierten Vektor mit 3,15 kb und ein 1,6 kb-Fragment für das VSV-G-Gen.
Es wird eine Plasmid-Präparation eines Klons mit der korrekten VSV-G-Orientierung (pUHD 10-3/VSV-G) unter Verwendung des Qiagen-Plasmid-Kits hergestellt.
E. Konstruktion einer stabilen 293(2-3)tTA/VSV-G- und/oder D-17 gag/poltTA/VSV-G-Zellinie
Das VSV-G-Gen wird in den 293(2-3)tTA- und/oder D-17tTA/VSV-G-Klon durch Transfektion von pUHD 10-3/VSV-G und pUT 507, eingeführt, worauf eine Selektion mit Phleomycin oder Zeocin folgt.
Beide Plasmide werden in 293(2-3)tTA- und D-17-gag/pol-Zellen im Verhältnis 10 : 1 durch Calciumphosphat-Präzipitation unter Verwendung des Profektions-Kits vom Promega nach den Empfehlungen des Herstellers eingeführt. Ab der Zeit der Co-Transfektion werden die Zellen in Tetracyclin-enthaltendem Medium (1 ug/ml Endkonzentration) gehalten. Zwei Tage nach der Co-Transfektion werden die Zellen mit Histidinol 10 Tage lang selektiert, bis alle nicht-resistenten Zellen tot sind. Die Zellen werden aus der Selektion genommen und in mehreren Platten mit 96 Vertiefungen wird eine limitierende Verdünnung durchgeführt, so daß ein Drittel der Vertiefungen Wachstum zeigt. Jeder Klon wird in zwei Gewebekulturschalen aufgeteilt, wobei eine Schale Medium ohne Tetracyclin zur Induzierung der Produktion von VSV-G enthält. Einen Tag später werden die Zellen in Medium ohne Tetracyclin mit dem β-Gal-Gen (aus pCB/β-gal) über Calciumphosphat- Transfektion transfiziert, um das Titerpotential für jeden der PCL-Klone zu bestimmen. Zwei Tage nach der Transfektion wird der Überstand geerntet und die HT1080-Zielzellen werden wie folgt mit dem viralen Partikeln, die das β-Gal-Gen tragen, transduziert.
Am Tag eins wird der Überstand jeweils in drei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 · 10&sup5; HT1080 in 2 ml Medium (DMEM mit hohem Glucose-Gehalt, mit 10% FBS, nicht-essentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat) pro Vertiefung ausgesät. Die Zellen werden exakt für 24 Stunden bei 37ºC und 10% CO&sub2; vor Transduktion am nächsten Tag inkubiert.
Am Tag zwei wird das Medium entfernt und 1 ml Medium, enthaltend 8 mg Polybren/ml, wird pro Vertiefung zugesetzt. Die Zellen werden 30 Minuten bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert. Der Überstand wird durch leichtes Pipettieren mit Medium zu einer Konzentration von 5 kbE/ml verdünnt. Es werden 5, 20 und 50 ml des verdünnten Überstands in 1 bzw. 3 Vertiefungen gegeben, das Medium wird verwirbelt und bei 37ºC und 10% CO&sub2; für 24 Stunden inkubiert.
Am Tag drei wird 1 ml Medium pro Vertiefung zugesetzt und die Zellen werden bei 37ºC und 10% CO&sub2; 24 Stunden lang inkubiert.
Am Tag vier wird ein X-gal-Färbevorgang an den transduzierten Zellen durchgeführt. Die Zahl der blauen Zellen wird pro Vertiefung gezählt und der Titer wird bestimmt.
Für das X-gal-Färben wird das Medium ablaufen gelassen, 0,5 ml Fixierlösung (PBS mit 2% (V/V) Formaldehyd und 0,2% (V/V) Glutaraldehyd) wird pro Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen zugesetzt, die Zellen werden 5 Minuten Raumtemperatur inkubiert, die Fixierlösung wird ablaufen gelassen, die Zellen werden mit 2 ml PBS-Puffer pro Vertiefung gewaschen, die Vertiefungen werden auslaufen gelassen und 0,5 ml frisch gemischte X-gal-Färbung (PBS mit 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 2 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml X-gal) werden pro Vertiefung zugesetzt, die Zellen 2 Stunden bis über Nacht bei 37ºC inkubiert, dann werden die blauen Zellen gezählt.
Sobald das Titerpotential bestimmt ist, werden vier Klone mit der höchsten Kapazität zur Herstellung infektiöser viraler Partikel für mehrere Wochen in einem Medium, das Tetracyclin enthält, in Kultur gehalten, um so die Grundlevel der VSV-G- Expression zu bestimmen. Nur Klone, die keine Effekte einer VSV-G-Toxzität zeigen, sind als stabile VSV-G-PCLs verwendbar.

BEISPIEL 4 (REFERENZBEISPIEL)

Verwendung von IPTG/Temperatur-indizierbaren LAP-Promotorsystemen zur Herstellung einer stabilen VSV-G-exprimierenden Verpackungszellinie

Wie im folgenden detaillierter beschrieben wird, wird jedes der LAP, das von einem starken Promotor gesteuert wird, in die 293(2-3)-Verpackungszellinie eingeführt und konstitutiv exprimiert. Eine zweite Transfektion der 293(2-3)LAP-Zellinie für die LAP- Bindungsdomäne (lac-Operator-Sequenzen) führt, gesteuert durch einen schwachen Promotor mit dem VSV-G-Gen, das hinter den lac-Operator-Sequenzen fusioniert ist, ein.

A. Beschreibung der LAP267- und LAP348-Promotorsysteme

LAP348: Dieses Promotorsystem wird durch IPTG negativ reguliert, daher wird die Expression der VSV-G-Hülle durch Zusatz von IPTG unterdrückt.
LAP267: Im Gegensatz dazu erlaubt LAP267 eine Expression der VSV-G-Hülle nach Zusatz von IPTG und/oder einer Verschiebung der Temperatur nach unten auf 32ºC. LAP267 enthält eine Insertion der transkriptionalen Aktivierungsdomäne von HSV VP16 innerhalb der Inducer-bindenden und Dimerisierungsdomäne des lac-Repressorproteins, das das LAP267-Protein temperaturempfindlich macht. IPTG hat bei der permissiven Temperatur (32ºC) keine Wirkung auf die LAP267-Aktivität. Die LAP267-Aktivität wird durch IPTG bei 39,5ºC gerettet.

B. Plasmid-Präparationen

Plasmid-Präparationen für jedes der folgenden Plasmide werden unter Verwendung des Quiagen-Plasmids (Quiagen Inc., Chatsworth, CA) nach den Vorschlägen des Herstellers ausgeführt. Kurz gesagt, die Plasmide werden in E. coli DH 12S (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) elelctroporiert, die Kulturen werden in LB-Brühe, ergänzt mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml für alle Plasmide außer für pMLP-G, das Tetracyclin zu einer Endkonzentration von 5 ug/ml benötigt, wachsen gelassen. Elektroporierte Bakterien werden als Einzelkolonien auf LB-Agarplatten, die das jeweilige Antibiotikum enthalten, plattiert, einzelne Kolonien werden herausgenommen, es werden Miniplasmidpräparationen hergestellt und es wird für jedes Plasmid ein charakteristischer Restriktionsenzymabbau durchgeführt, um die Identität jedes Plasmids zu bestätigen. Sobald ein einzelner Klon identifiziert ist, werden Glycerin-Kulturen (1 : 1-Verdünnung aus 40%igem Glycerin und Bakterienspuspension) bei -80ºC gelagert. Die folgende Tabelle führt die verfügbaren Plasmide auf, beschreibt die codierenden Regionen und die Quelle der Plasmide. Plasmide für die Herstellung einer stabilen, IPTG-induzierbaren VSV-G-PCL

C. Konstruktion der Luciferase-Reporter-Plasmide pL7/luc und pL14/luc

Zunächst wurden die LAP-Funktionen in einem transienten Transfektions-Assay unter Verwendung einer LAP267- oder LAP348-kontrollierten Luciferase-Reportereinheit untersucht. Kombinationen beider Regulatorplasmide, pCMV267 und pHCMVLAP348, zusammen mit einem der zwei Reporterplasmide pL7/luc und pL14/luc werden in den transienten Assays analysiert, um zu bestimmen, welche Plasmid-Kombination ein besseres System bezüglich der Leckanfälligkeit und dem Aktivierungslevel nach IPTG/Temperatur- Induktion liefert. Die Co-Transfektionsexperimente werden in 293(2-3)- und D-17 gag/pol- Zellen wie auch in HeLa-Zellen als Positivkontrolle durchgeführt.

D. Klonierung des Luciferase-Gens in pL7CAT und pL14CAT

Das StuI-Ball-Fragment aus pL7CAT und pL14CAT, das für das CAT-Gen codiert, wird unter Verwendung eines zweifachen Abbaus jeder zwei Reporterplasmide mit Stul und BalI deletiert. Die zwei resultierenden Fragmente für jedes Plasmid mit glatten Enden werden mit 1% Agarosegel getrennt und das pL7- und pL14-Gerüst werden ausgeschnitten, unter Verwendung des Qiaex-Reinigungskits von Qiagen nach den Angaben des Herstellers Gel-gereinigt. Dieser Schritt eliminiert das CAT-Gen aus Plasmiden pL7CAT und pL14CAT. HindIII-Linker werden an jedes der Gerüste ligiert, die Gerüste werden mit HindIII einer Restriktion unterworfen und mit intestinaler Kälberphosphatase behandelt, um die Relegationschance zu vermindern. Das Luciferase-Gen wird aus dem pT3/T7-Luc- Plasmid durch HindIII-Abbau isoliert, das 1,9 kb Luciferase-Gen isoliert und über 1% Agarosegel wie oben beschrieben gereinigt und dann das Luciferase-Fragment in die HindIII-Stellen jedes der Plasmid-Gerüste ligiert.
Ein Aliquot der Ligation wird in E. coli DH 12S (Life Technologies) elektroporiert, die Kulturen werden in LB-Brühe für eine Stunde bei 37ºC wachsen gelassen, ein Aliquot wird auf LB-Agarplatten, ergänzt mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml, plattiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Einzelne Kolonien werden herausgegriffen, in 2 ml LB-Brühe, ergänzt mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml, über Nacht wachsen gelassen und eine Plasmid-Minipräparation unter Verwendung des Qiagen- Miniprep-Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) nach den Instruktionen des Herstellers durchgeführt.
Um Klone zu identifizieren, die das Luciferase-Gen tragen, wird ein analytischer Restriktionsenzymabbau durchgeführt. Unter Verwendung des Qiagen-Plasmidkits wird eine Plasmid-Präparation eines Klons mit der korrekten Luciferase-Orientierung (pL7/luc und pL14/luc) hergestellt.

E. Transiente Expression von Luciferase in 293(2-3)-, D-17gag/pol- und Hela- Zellen

293(2-3)-, D-17gag/pol- und Hela-Zellen als positive Kontrollen werden entweder mit pL7/luc oder pL14/luc und entweder pCMV267 oder pHCMVLAP348 in Verhältnissen von 1 : 20, 1 : 50 und 1 : 100 co-transfiziert. die Plasmide werden über Calciumphosphat- Präzipitation unter Verwendung des Profektionskits von Promega (Promega Corp., Madison, WI), wie es vom Hersteller empfohlen wird, eingeführt. Zwei Gewebekulturschalen mit jeder der verschiedenen Plasmid-Kombinationen, Verhältnisse und Zellinien werden eingeführt. Eine der zwei Schalen wird mit IPTG mit 5 mM und/oder einer Temperaturverschiebung für LAP267-enthaltenden Kombinationen und IPTG-Entfernung für die LAP348-enthaltenden Kombinationen induziert.
Die Zellen werden mehrere Stunden vor der Co-Transfektion induziert. Die Zellen beider Schalen pro Kombination werden 24 Stunden nach Transfektion auf Luciferase- Aktivität analysiert.

F. Analyse der Luciferase-Aktivität

Der Luciferase-Assay wird nach den Instruktionen des Herstellers (Promega) durchgeführt.
Das LAP-Regulatorplasmid (pCMV267 oder pHCMVLAP348), das die niedrigste Grundaktivität und den höchsten Luciferase-Aktivierungsgrad unter nicht-induzierenden Kulturbedingungen liefert, wird verwendet, um eine stabile VSV-G-produzierende 293(2-3)- und/oder D-17 gag/pol-Zellinie einzuführen.

G. Konstruktion einer stabilen 293(2-3)LAP267-, D-17 gag/pol-LAP267-, D-17 gag/pol-LAP348- und/oder 293(2-3)LAP348.Zellinie

Das Regulatorsystem wird in zwei Schritten in 293(2-3)- und D-17 gag/pol-Zellen eingeführt. Zuerst werden 293(2-3)- und D-17 gag/pol-Zellen mit einem LAP-Regulatorplasmid und pUT507 im Verhältnis 10 : 1 co-transfiziert. Die Plasmide werden über Calciumphosphat-Präzipitation unter Verwendung des Profektionskits von Progmega im wesentlichen nach den Anweisungen des Herstellers eingeführt. Die Co-Transfektion wird so durchgeführt, wie es vom Hersteller empfohlen ist. Zwei Tage nach der Co-Transfektion werden die Zellen mit G418 mit 0,8 mg/ml 10 Tage lang selektiert, bis alle nicht-resistenten Zellen tot sind. Die Zellen werden dann aus der Selektion genommen und mit mehreren Platten mit 96 Vertiefungen wird eine limitierende Verdünnung durchgeführt, so daß ein Drittel der Vertiefungen Wachstum zeigt. Jeder Klon wird transient mit pL7/luc oder pL14/luc transfiziert und auf Luciferase-Aktivität durchgemustert. Klone mit hohem Level an Luciferase-Aktivität und niedrigen Grundlevel unter nicht-inudzierenden Kulturbedingungen werden verwendet, um das VSV-G-Gen, das kloniert wurde, in pL7 oder pL14 einzuführen.

H. Konstruktion der VSV-G-Expressionsplasmide pL7/VSV-G und pL14/VSV-G

Das VSV-G-Gen wird aus dem pCRTMII TA-Klonierungsvektor mit einem EcoRI- Abbau gewonnen. Das 1,6 kb VSV-G-Gen wird durch Elektrophorese an 1% Agarosegel unter Verwendung des QIAEX-Kits, wie es oben beschrieben wurde, isoliert und gereinigt.
Die Plasmide pL7CAT und pL14CAT werden mit StuI und BalI abgebaut, wodurch das CAT-Gen deletiert wird. EcoRI-Linker werden an die glatten Enden ligiert, die Gerüste mit EcoRI einer Restriktion unterworfen und mit intestinaler Kälberphosphatase behandelt. Dann werden das 1,6 kb VSV-G in die pL7- und die pL14-Hauptkette (bzw. Grundgerüste) ligiert.
Ein Aliquot der Ligation wird in E. coli DH 12S (LIFE TECHNOLOLOGIES) elektroporiert, die Kulturen werden für eine Stunde bei 37ºC in LB-Brühe wachsen gelassen, ein Aliquot wird auf LB-Agarplatten, ergänzt mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml, plattiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Einzelne Kolonien werden herausgenommen, in 2 ml LB-Brühe, ergänzt mit Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml, über Nacht wachsen gelassen und es wird wie oben beschrieben eine Plasmid-Minipräparation hergestellt.
Für mehrere Klone jeder der Ligationen wird ein analytischer Restriktionsenzymabbau durchgeführt, um die korrekte Ligation zu identifizieren. Es wird eine Plasmid- Präparation eines Klons für jede Ligation mit der korrekten VSV-G-Orientierung (pL7/VSV-G und pL14NSV-G) unter Verwendung des Qiagen-Plasmidkits hergestellt.

I. Konstruktion einer stabilen 293(2-3)LAP267/VSV-G-, D-17 gag/pol- LAP267/VSrG- und/oder 293(2-3)LAP348/VSV-G-, D17 gag/pol-LAP 348/VSV-G- Zellinie

VSV-G-Gen wird in die 293(2-3) LAP- und D-17 gag/pol-LAP-Klone in einer Co- Transfektion von pL7/VSV-G oder pL14/VSV-G und pHIS zur Selektion mit Histidinol eingeführt.
Beide Plasmide werden in einem Verhältnis 10 : 1 (VSV-G : Selektionsmarker) über Calciumphosphat-Präzipitation unter Verwendung des Profectionskits von PROMEGA nach den Empfehlungen des Herstellers in 293(2-3)LAP- und D-17 gag/pol-LAP-Zellen eingeführt. Ab der Co-Transfektionszeit werden die Zellen in nicht-induzierendem Medium gehalten. Zwei Tage nach der Co-Transfektion werden die Zellen mit Histidinol für 10 Tage selektiert, bis alle nicht-resistenten Zellen tot sind. Die Zellen werden dann aus der Selektion genommen und in mehreren Platten mit 96 Vertiefungen wird eine limitierende Verdünnung durchgeführt, so daß ein Drittel der Vertiefungen Wachstum zeigt. Jeder Klon wird in zwei Gewebekulturschalen aufgeteilt, wobei eine Schale unter VSV-G-induzierenden Bedingungen kultiviert wird und eine Schale unter VSV-G-unterdrückenden Bedingungen kultiviert wird. Einen Tag später werden die induzierten Zellen mit β-Gal- Gen (aus pCB/β-gal) über Calciumphosphat-Transfektion transfiziert, um das Titerpotential jedes der PCL-Klone zu bestimmen. Die nicht-induzierten Zellen werden mit dem β-gal- Gen transfiziert, um auch die Undichtigkeit der VSV-G-Expression zu analysieren. Zwei Tage nach der Transfektion wird der Überstand geerntet und HT1080 Zielzellen mit den viralen Partikeln, die das β-gal-Gen tragen, wie folgt transduziert:
Am Tag eins wird jeder Überstand in drei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 · 10&sup5; HT1080 in 2 ml Medium (DMEM mit hohem Glucose-Gehalt, mit 10% FBS, nicht-essentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat) pro Vertiefung ausgesät. Die Zellen werden genau 24 Stunden bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert, bevor sie am nächsten Tag transduziert werden.
Am Tag zwei wird das Medium entfernt und es wird 1 ml Medium, enthaltend 8 ug Polybren/ml, pro Vertiefung zugesetzt. Die Zellen werden 30 Minuten bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert. Eine Verdünnung des Überstands durch leichtes Pipetieren mit Medium zu einer geeigneten Konzentration von 5 kbE/ul folgt. 5, 20 und 50 ml des verdünnten Überstands wird in die Vertiefungen 1 bzw. 3 gegeben, das Medium wird verwirbelt und 24 Stunden bei 37ºC und 10% CO&sub2; inkubiert.
Am Tag drei wird 1 ml Medium pro Vertiefung zugegeben und die Zellen werden bei 37ºC und 10% CO&sub2; 24 Stunden inkubiert.
Am Tag vier wird ein X-gal-Färbeprozeß an den transduzierten Zellen durchgeführt.
Kurz beschrieben, das Medium wird ablaufen gelassen und 0,5 ml Fixierlösung (PBS mit 2% (V/V) Formaldehyd und 0,2% (V/V) Glutaraldehyd) werden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen gegeben. Die Zellen werden 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, die Fixierlösung wird ablaufen gelassen und die Zellen werden mit 2 ml PBS pro Vertiefung gewaschen. Die Vertiefungen werden dann auslaufen gelassen und 0,5 ml frisch gemischte X-gal-Färbung (PBS mit 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 2 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml X-gal) werden pro Vertiefung zugesetzt. Die Zellen werden 2 Stunden bis über Nacht bei 37ºC inkubiert und blaue Zellen werden gezählt.
Sobald das Titerpotential bestimmt ist, werden die vier Klone mit der höchsten Kapazität zur Herstellung infektiöser viraler Partikel für mehrere Wochen in nicht-induzierendem Medium gehalten, um die Grundlevel einer VSV-G-Expression zu bestimmen. Nur Klone, die keine Effekte einer VSV-G-Toxizität zeigen, sind als stabile VSV-G-PCL verwendbar.

BEISPIEL 5

Wechselnder Glycoprotein-Metabolismus zur Herstellung stabiler pseudotypisierender Zellen

Wie oben beschrieben wurde, stellt die vorliegende Erfindung auch Zellinien bereit, die einen veränderten oder mutierten Glycosylierungsweg aufweisen, die einen Expressionsvektor tragen, oder enthalten, der die Expression eines anderenfalls toxischen glycosylierten Proteins oder fusogenen Proteins steuert.
Beispielsweise können Lec 1-, 2- und 8-Zellen (ATCC CRL 1735, 1736, 1737), von denen bekannt ist, daß sie veränderte Glycosylierungs-Phänotypen haben, durch Transfektion mit pMLP-G essentiell durchgemustert werden und mit einem geeigneten Selektionsmarker auf Antibiotikaresistenz selektiert werden. Isolierte Kolonien werden durch Strömungs-Cytometrie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers für VSV-G (z. B. von Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) analysiert. Stabile Zellklone werden zu Erzeugung von Verpackungszellinien verwendet.

BEISPIEL 6

Tollwut-G-Protein-Verpackungszellinien

Ein Plasmidvektor, der abgeschwächtes Tollwut-Virus Stamm SAD B 19 G-Protein enthält (pSAD61 EMBL/GenBank Acc. No. M31046, Conzelmann, FRCVDA Tübingen, D) wird als Matrize zur PCR-Amplifikation der G-Protein-Sequenz zur Verwendung bei der Pseudotypisierung retroviraler Vektoren verwendet.
Kurz ausgedrückt, die Sequenz, die für das G-Protein codiert, wird nach Anweisungen des Herstellers (Perkin Elmer) amplifiziert, wobei die im folgenden angegebenen Primer verwendet werden:

Sequenz ID NO: 5

5'-3' GTC AAG CTT AAC ATC CCT CAA AAG ACT CAA GGA AAG ATG G
Dieser Primer ist die Sinn-Sequenz des G-Proteins, der die ATG-Startstelle enthält, mit einer HindIII-Stelle am 5'-Ende.

Sequenz ID NO: 6

5'-3' GAT ATC TCG AGC TTA CAG TCT GGT CTC ACC CCC ACT CTT
Dieser Primer ist die anti-Sinn-Sequenz des G-Proteins am Ende des Proteins mit einer XhoI-Stelle am 5'-Ende.
Sowohl der 5'- wie auch der 3'-Primer haben Restriktionsstellen, die mit den 5'-HindIII- und 3'-XhoI-Stellen der Multiklonierungsstelle von pcDNA3 (Invitrogen SD, CA) kompatibel sind.
Das resultierende PCR-Produkt wird isoliert, mit HindIII und XhoI abgebaut und an HindIII und XhoI, abgebaut mit pcDNA3, ligiert, um so pcDNA2/Rab-G-Plasmid zu bilden. Gag/pol-Vorverpackungslinien werden mit pcDNA3/Rab-G transfiziert und auf Neor-Resistenz selektiert. Stabile Zellinien werden unter Verwendung des geeigneten Arzneimittels selektiert und der Pool subkloniert.

BEISPIEL 7

Alpha-Virus-Kern-, E1-, E2-Verpackungszellinien

Das VSV-G-Protein-Äquivalent in alpha-Viren, z. B. im Sindbis-Virus, ist ein Heteroprotein aus drei Proteinen: Kern, D1 und E2, wie im folgenden detailliert beschrieben wird, kann ein Plasmidvektor, der Sindbis-DNA (ATCC 75891) enthält, als Matrize verwendet werden, um die Kern- und E1- und E2-Glycoproteine zur Verwendung bei der Pseudotypisierung retroviraler Vektoren zu amplifizieren.
Kurz, ähnlich wie oben in Beispiel 6 beschrieben, wird Kern-, E1- und E2-Protein nach den Anweisungen des Herstellers (Perkin Elmer) amplifiziert, wobei die folgenden Primer verwendet werden:

Sequenz ID NO: 7

5'-3' GTC AAG CTT GCT AGC TAC AAC ACC ACC ACC ATG AAT ACA G
Dieser Primer ist die Sinn-Sequenz für das Kernprotein, das die ATG-Startstelle enthält, mit einer HindIII-Stelle am 5'-Ende.

Sequenz ID NO: 8

5'-3' GAT ATC TCG AGC GGC CGC TCA TCT TCG TGT GCT AGT CAG
Dieser Primer ist die Anti-Sinn-Sequenz des E2-Proteins bei der Termination des Proteins mit einer XhoI-Stelle am 5'-Ende.
Sowohl der 5'- wie auch 3'-Primer hat Restriktionsstellen, die mit den 5'-HindIII- und 3'-XhoI-Stellen der Multiklonierungsstelle von pcDNA3 (Invitrogen SD, CA) kompatibel sind.
Das resultierende PCR-Produkt wird isoliert, mit HindIII und XhoI abgebaut und an pcDNA3, das mit HindIII und XhoI abgebaut worden war, ligiert, um das pcDNA3/Kern- E1-E2-G-Plasmid zu bilden. Gag/pol-Vorverpackungslinien wurden mit pcDNA3/Kern-E1- E2-G transfiziert und auf Neor-Resistenz selektiert. Stabile Zellinien werden unter Verwendung des geeigneten Arzneimittels selektiert und der Pool subkloniert.

BEISPIEL 8

Synthetische G-Protein-Verpackungszellinien

Ein Beispiel für ein synthetisches G-Protein ist die Ectodomäne von Tollwut G, das an den Ankerresten am cytoplasmatischen Ende der Transmembranregion gestutzt wurde.
Diese Trunkation wird unter Verwendung der Reagenzien aus Beispiel 5 durchgeführt, außer daß der folgende 3'-Primer verwendet wird:

Sequenz ID NO: 9

5'-3' GAT ATC TCG AGT TAG ACT CTT CTA CAA CAT GTC ATC AGG
Dieser Primer ist die Anti-Sinn-Sequenz des G-Proteins in der Ankerregion des Proteins mit einer XhoI-Stelle am 5'-Ende.
Das resultierende PCR-Produkt wird isoliert, mit HindIII und XhoI abgebaut und an pcDNA3, das mit HindIII und XhoI abgebaut wurde, ligiert, um das pcDNA3/ΔG-Plasmid zu bilden. Gag/pol-Vorverpackungslinien werden mit pcDNA3/ΔG transfiziert und auf Neor-Resistenz selektiert. Unter Verwendung des geeigneten Arzneimittels werden stabile Zellinien selektiert und der Pool wird subkloniert.

BEISPIEL 9

Erzeugung von Preproducer-Zellinien

A. Bildung einer Preproducer-Zellinie

Pre-Producer-Zellinien sind Zellen, die gag/pol-Gene und einen retroviralen Vektor enthalten, denen aber ein Hüll-Gen fehlt. Solche Zellinien können im wesentlichen wie folgt hergestellt werden. N2-β-gal wird verwendet, um 293 (2-3)-Zellen (die nur eine gag/pol-Expressionskassette enthalten) zu transduzieren; G418-resistente Klone werden isoliert. Klone werden dann auf β-gal-Expression getestet und ein stabiler positiver Klon isoliert.

B. Untersuchung von Pre-Producer-Zellinien auf Wachstum in Medium mit Selen- Mangel

293 (2-3)/β-gal-Pre-Producerzellen werden in DMEM-10% FBS aufgetaut und systematisch an Medium mit Selen-Mangel, z. B. dem DMEM, ergänzt mit Insulin/Transferin (IT,Collaborative Research) (siehe allgemein, Speier et al., supra) adaptiert. Dieses Protokoll beinhaltet ein Anfangswachstum in FBS-enthaltendem Medium und anschließende Erschöpfung an FBS aus dem Medium mit Zunahme an IT-enthaltendem Medium. Das Anpassungsverfahren an einen Zustand mit Selen-Mangel ist üblicherweise in 2 bis 3 Wochen beendet und angepaßte Zellen können oft für mehr als drei Monate in einem Zustand mit Selen-Mangel gehalten werden.

BEISPIEL 10

Herstellung eines retroviralen Vektors durch transiente Transfektion in ultragroßem Maßstab

A Einführung

Oft werden hohe Expressionslevel eines neu eingeführten Proteins von einer Zellinie gewünscht, z. B. Expression von gag-pol oder eines Hüllproteins in einer retroviralen Vektorverpackungszellinie. Allerdings können in einigen Fällen cytopathische oder cytostatische Effekte toxischer Proteine, wie z. B. VSV-G, ihren maximalen stabilen Expressionslevel stark einschränken, so daß ihre Verwendbarkeit in einer stabil transfizierten und stabil exprimierenden Zellinie stark begrenzt oder aufgehoben wird. Eine nützliche Alternative zu einer stabilen Expression ist eine transiente Expression, die auf eine transiente Transfektion eines Expressionsplasmids folgt. Solche Transfektionen können entweder unter Anwendung von DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposomen oder CaPO&sub4;-Präzipitation erreicht werden (siehe Current Protocols in Molecular Biology or Molecular Cloning, a Labaratory Manual für typische Protokolle). Nach der transienten Transfektion wird ein prozentualer Anteil der Zellen aufgenommen und für mindestens einige Tage vernünftig hoher Level selbst eines toxischen Gens exprimieren gelassen. Zur Herstellung retroviraler Vektoren war eine transiente Transfektion mit CaPO&sub4; das am häufigsten ausgewählte transiente Transfektionsverfahren, und zwar wegen der Einfachheit, der hohen DNA-Kopienanzahl und Expression pro Zelle und insbesondere wegen der Vektorproduktion mit hohem Titer. Es wurde zur Vektorherstellung in kleinem Maßstab entweder mit typischen retroviralen Hüllproteinen Finer et al., Blood 83: 43-50, 1994; Pear et al., PNAS USA 90: 8392, 1993) oder zur Pseudotypisierung mit VSV-G-Protein (Burns et al., PNAS USA 90: 8033-8037, 1993) verwendet. Obgleich diese Methodologie zur Herstellung geringer Mengen oder Versuchsmengen einer Vielzahl verschiedener Vektoren gut angepaßt ist, ist sie für eine Produktion in mittlerem oder größerem Maßstab weniger geeignet. Es ist z. B. bekannt, daß die CaPO&sub4;-Transfektionseffizienz in großem Umfang von einem genauen pH der Lösung und einer Anzahl schlecht verstandener anderer Parameter abhängt. Es wird allgemein angenommen, daß eine spezifische Transfektion von Zellen auf Platten mit 10 cm oder kleiner gegenüber kleineren Protokollschwankungen und Abweichungen von veröffentlichten Protokollen (z. B. Current Protocols in Molecular Biology or Molecular Cloning, a Laboratory Manual) intolerant ist. Dementsprechend spezifizieren veröffentlichte Beiträge zur CaPO&sub4;-Transfektion Platten von 10 cm oder kleiner für einen freien Gasaustauch und eine CO&sub2;-Äquilibrierung. Eine Vergrößerung des Maßstabs erfolgt dann durch Arbeiten mit einer großen Zahl dieser Platten, wie es z. B. in dem jüngeren Artikel von J. Yee et al. beschrieben ist (Yee et al., "A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: Highly efficient infection of primary hepatocytes," PNAS USA 91 : 9564-9568, 1994). Das Erhöhungspotential bei Transfektionen an kleinen Platten ist deutlich limitiert.
Wie oben detaillierter beschrieben wurde, kann ein viraler Vektor unter Verwendung von Kulturanlagen (1200 bis 6000 cm² jeweils) mit Rohtitern hergestellt werden, die denen entsprechen, die bei einer Transfektion mit traditionellen kleinen Platten erhalten werden oder darüber liegen. Das Protokoll ist einfach, verwendet gängige, billige Reagenzien, um die gewünschten Plasmide zu transfizieren, und erleichtert die Herstellung viel größerer Mengen eines retroviralen Vektors als sie mit den früher beschriebenen transienten Transfektionsverfahren praktikabel sind. Tabelle 1 zeigt die Resultate einer Infektion von 293(2-3)-Zellen in einer zweischichtigen Zellanlage mit 1200 cm², um G- pseudotyisierten N2-β-gal-retroviralen Vektor zu produzieren. Das hier beschriebene einfache Protokoll erfordert nur den Zusatz der mit CaPO&sub4; präzipitierten DNA zu dem Medium über den Zellen und den Austausch gegen frisches Medium nach 24 Stunden; es ist in einfacher Weise auf eine große Anzahl von Zellanlagen erweiterbar. Dies macht die Herstellung von 10 oder 1001 G-pseudotypisiertem Vektor mit hohem Titer möglich.
Die Zellinie 293(2-3) ist ein MLV-gag-pol-exprimierender Klon, der aus humanen embryonalen Nieren-293-Zellen stammt. Das Plasmid pMLP-G exprimiert VSV-G aus einem Adenovirus-MLP-Promotor. Das Plasmid, das den retroviralen Testvektor, pN2B- gal-neo enthält, wird zusammen mit dem pMLP-G-Plasmid co-transfiziert. Ähnliche Titer können erhalten werden, indem entweder dieses Co-Transfektionsverfahren angewendet wird oder durch Transvektion von pMLP-G allein in einer 293(2-3)/B-gal-Zellinie (ein 293(2-3)-Klon, transduziert mit dem B-gal-Vektor).

B. Herstellung eines VSV-G-Pseudotypisierten retroviralen Vektors durch CaPO&sub4;- Massentransfektion

1. Herstellung von Zellen zur Transfektion

Die 293 Zellen (ATCC CRL 1573), die MLV-gag-pol exprimieren, 293(2-3) genannt, werden am Tag vor der Transfektion zu einer zweischichtigen Zellanlage (Nung) mit etwa 1200 cm² Zellkulturfläche geführt. Dieser gag-pol-exprimierende Klon der Zellinie 293 wird durch Standardmethoden, wie sie in der Literatur beschrieben sind, hergestellt. Zwischen 4 und 48 Stunden, vorzugsweise zwischen 18 und 24 Stunden, später werden die Zellen zur Transfektion verwendet, die einen Konfluenzlevel von vorzugsweise 30% bis 90%, am günstigsten 60 bis 80% erreicht haben.

2. Herstellung des DNA-CaPO&sub4;-Präzipitats

Zwei Plasmide werden in einem Präzipitat co-transfiziert. Das Plasmid MLP-G exprimiert das VSV-G-Gen und das Plasmid pCBß-gal enthält einen retroviralen Vektor, der β-gal- und das Neomycin-Resistenzgen exprimiert. Für jede 100 cm² Kulturfläche werden 10 bis 40 ug jedes Plasmids, vorzugsweise ungefähr 20 ug, verwendet. Die Plasmide werden durch Quiagen-Kit-Standardmethoden hergestellt. Gegebenenfalls werden sie vor Transfektion durch Ethanol-Präzipitation oder Chloroform-Extraktion sterilisiert. Für die Zellanlage werden ungefähr 240 ug jedes Plasmids in TE (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA) in einem konischen Polypropylen-Röhrchen (Corning oder Falcon) mit einem Fassungsvermögen von 50 ml vermischt und dann mit Wasser und TE (1/10 TE) auf 10,8 ml (0,9 ml/100 cm²) verdünnt, so daß die Endkonzentration an Tris 2 mM oder weniger ist. Dann werden 1,2 ml (0,1 ml/100 cm²) 2,5 M CaCl&sub2; zugemischt. In ein getrenntes 50 ml Röhrchen werden 12 ml Hepes-gepufferte Salzlösung (2xHeBS), pH ungefähr 7,08 zugesetzt (Lösungsrezeptur siehe unten). In einer sterilen Gewebekulturschale mit Hut wird das 2 · HeBS kontinuierlich verwirbelt, während das DNA- Gemisch durch langsamen tropfenweisen Zusatz aus einer Pipette über einen Zeitraum von etwa 30 Sekunden zugesetzt wird. Das resultierende Präzipitat wird bei Raumtemperatur 15 Minuten absetzen gelassen.

3. Transfektion

Das Standardwachstumsmedium wird von den Zellen entfernt, das DNA-Präzipitat wird zugesetzt und das Medium plus DNA wird vorsichtig in die Zellanlage ersetzt. Nach 4 bis 24 Stunden, vorzugsweise 16 bis 24 Stunden, wird das Medium entfernt und die Zellen werden zweimal mit etwa 50 ml PBS gespült. Dann wird das Medium in täglichen Intervallen durch frisches ersetzt, und zwar über so viele Erntetage, wie gewünscht, aber für mindestens zwei Tage; Tag 2 und Tag 3 nach Transfektion wird immer gesammelt, da dies typischerweise die optimalen Tage für beste Titer sind.

4. Lösungen

2,5 M CaCl&sub2;: 367,4 g CaCl&sub2;-Dihydrat pro Liter, steril filtriert.
2 · HeBS: 0,21 g Na&sub2;HPO&sub4;, 16,4 g NaCl, 11,9 g HEPES-Säure, ~800 ml H&sub2;O.
Einstellen des pH auf 7,08 mit 10 N NaOH und mit H&sub2;O auf 1 l. Steril filtrieren und Lagern bei 20ºC in Aliquots.

BEISPIEL 11

Ein VSV-G-Fusionsprotein, das eine Induzierung von Syncytia in Producer-Zellen verhindert

A. Hintergrund

Wie im folgenden näher diskutiert wird, können die letzten 49 Aminosäuren des C-Terminus von VSV-G, das die Transmembran-Domäne (TM) umfaßt, durch die letzten 54 Aminosäuren des MoMLV env ersetzt werden. Dieses chimäre Protein umfaßt mehrere MLV-Komponenten: Die Transmembran-Domäne, die amphipathische Schleife und das R-Peptid.
Andere chimäre Proteine, die ähnlich hergestellt werden können, umfassen Fusionen der zwei Hüllproteine innerhalb oder außerhalb der TM-Domänen, z. B. wird die VSV-G- TM-Domäne ganz oder teilweise an MLV-Sequenzen innerhalb des C-Terminus fusioniert. In diesem Zusammenhang sollte zu verstehen sein, daß Hüllproteine und Sequenzkombinationen, die aus der Fusion der zwei Proteinsequenzen abgeleitet sind, zu einer geschwächten Fusiogenität des resultierenden Chimären führen werden.

B. Konstruktion eines VSV-G-Fusionsproteins

Das Folgende beschreibt beispielhaft den Ersatz der 49 letzten Aminosäuren des C- Terminus des VSV-G durch die äquivalenten 54 Aminosäuren des C-Terminus von MLV.
Die resultierende Aminosäure ist im folgenden dargestellt. Die Verbindung ist durch (::) gekennzeichnet:
(VSV-G-Indiana)...GWFSSWK::IMGPLIVLLLFGP...-(Ampho env-4070A)...

1. Materialien

MoMLV-4070A-Ampho-Hüllexpressionsvektor pEnvAm-Dra, der SV40 poly A beinhaltet. Das VSV (Indiana-Stamm)-Hüllprotein G stammt von pMLP-G. pSC6 ist eine CMV-Promotor-Expressionskassette (siehe WO 91/02805).
Die Konstruktion des chimären Proteins verwendet das überlappende PCR- Verfahren und die folgenden Primer: Primer I: (VSV-G: 803-825 bp; einschließlich einer PstI-Stelle) (Sequenz ID NO: 10)

Primer II: (Verbindungssequenz: 1398-1415 von G und 7616-7634 von Ampho) (Sequenz ID NO: 11)

5' TGG TTC AGT AGT TGG AAA/ATC ATG GGA CCT CTA ATA G

Primer III: (Komplementär zur Primer II) (Sequenz ID NO: 12)

5' C TAT TAG AGG TCC CAT GAT/TTT CCA ACT ACT GAA CCA Primer IV: (SV40 Poly A von pEnvAm-Dra; 161-185 bp; BamHI-Stelle; negativer Strang) (Sequenz ID NO: 13)

2. Konstruktion des Expressionsvektors

PCR-amplifizierte DNA, die die zwei Sätze an Primern (I plus II und III plus IV) verwenden, werden reassoziiert und PCR-amplifiziert, wobei die Primer I und IV verwendet werden. Die resultierende DNA wird mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI abgebaut. Das resultierende Fragment mit etwa 900 bp Hybrid G/A wird in pSC6 (abegebaut mit EcoRV und BamHI) zusammen mit ClaI (geglättet) zu PstI (800 bp) von VSV-G-DNA kloniert. Das Plasmid wird pG/A genannt.

3. Zellkultur/Titer-Assay

(a) Die Hybrid-env-Plasmid-DNA (pG/A) wird unter Verwendung des CaPO&sub4;- Präzipitatverfahrens wie oben beschrieben in die gag-pol-exprimierenden 293/(2-3)-Zellen transfiziert. Die Bildung von Syncytia wird nach 1, 2 und 3 Tagen visuell beurteilt.
(b) Parallel dazu wird pG/A mit pKT-1 in 293(2-3)- und SCV21- oder DA-gagpol-Zellen co-transfiziert, um transiente Titer und Hüllinktionalität zu beurteilen. Dieses Verfahren der transienten (48 Stunden) Expression ist oben beschrieben. Die Co-Transfektion von pMLP-G plus N2 β-gal in die oben genannten Zellen wird als Kontrolle in diesem Experiment verwendet.
(c) Um eine stabile Expression der Hybridhülle in Producer-Zellen zu beurteilen: 48 Stunden nach Transfektion werden die Zellen (aus (b) oben) für 10 Tage einer G418-Selektion unterzogen und stabile Pools werden auf Vektor-Produktion, Infektiosität und Tendenz zur Syncytia-Bildung untersucht.

BEISPIEL 12

Verwendung von rekombinantem Cytomegalovirus, das vesikuläres Stamatitits- Virus-G-Protein exprimiert, um retrovirale Vektoren zu pseudotypisieren

A. Materialien und Verfahren

1. Viren und Zellinien

Wildtyp-MCMV (Stamm Smith K181+), RV427 und RMCMVG werden wachsen gelassen und an NIH3T3-Zellen getitert wie es in Manning et al., J. Vir. 66 3794-3802, 1992; Stoddart, J. Vir. 68(10): 6243-6253, 1994 beschrieben ist. NIH3T3-, HeLa-, 293- und 293-gag/pol (eine 293-Linie, die gag und pol enthält, der aber ein env-Gen fehlt) -Zellen werden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, wachsen gelassen.

2. Plasmide und Präparationen von rekombinantem Virus

Eine Plasmid-Klonierung wird nach einer Standardtechnik durchgeführt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). pON401 enthält das HindIII-L-Fragment von MCMV (Manning et al., Vir. 66: 3794-3802, 1992). pCMV-G enthält das VSV-G-Protein unter transkriptionaler Kontrolle des HCMVieI-Promotor-Enhancers. Um pON401CMVG aufzubauen, wird das 2665 bp HincII-Fragment von pCMV-G, das VSV-G enthält, zwischen die HpaI-Stellen von pON401 (Fig. 3) kloniert. Dies führt zu einer Deletion des 79-bp HpaI-Fragments in pON401. pMLP-G enthält das VSVG-Protein unter transkriptionaler Kontrolle des Adenovirus-Haupt-späten Promotors.
Protokolle für die Herstellung und Isolierung von rekombinantem MCMV wurden beschrieben (Manning et al., Vir. 167: 477-484, 1988). Kurz gesagt, 15 ug linearisiertes pON401CMVG wird mit RM427-Virus-DNA unter Verwendung der Calciumphosphat- Präzipitation co-transfiziert. Die bei der Transfektion eingesetzte Menge an RM427-DNA wird für jede virale DNA-Präparation empirisch bestimmt. Die Co-Transfektionen werden geerntet, wenn die cytopathische Wirkung (cpe) beendet ist, etwa 5 Tage nach Transfektion.
Um β-gal-Rekombinanten zu isolieren wird ein Assay mit limitierender Verdünnung durchgeführt; d. h. Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen werden mit NIH3T3-Zellen (10&sup4; Zellen/Vertiefung) beschickt. Rekombinante Virus-Pools, die aus der Co-Transfektion entstehen, werden getitert und dann verwendet, um die Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Verdünnung zu infizieren, die etwa 75 Plaque-bildende Einheiten (pfu) pro Platte mit 96 Vertiefungen enthält, zu infizieren. Wenn ein cytopathischer Effekt (cpe) offensichtlich wird (etwa 7 Tage nach Infektion) wird Methylumbellyliferon (MUG) allen Vertiefungen in einer Endkonzentration von 150 ug/ml zugesetzt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (3-24 h) wird die Platte in einen Kasten mit UV-Licht gelegt und photographiert. Vertiefungen, die Eltern-β-gal-+-Virus (RM427) enthalten, fluoreszieren. Nicht-infizierte Vertiefungen oder Vertiefungen, die mit einer β-gal-Rekombinanten infiziert sind, fluoreszieren nicht. Virus aus Vertiefungen mit cpe und ohne Fluoreszenz wird wachsen gelassen und durch DNA- Blot-Analyse untersucht.

3. DNA-Analyse

Virale DNA wird aus gereinigten Virionen (Vieria et al., J. Virol. 68: 4837-4846, 1994) hergestellt und einer DNA-Blot-Analyse unterworfen, wie sie früher beschrieben wurde (Manning et al., Vir. 167: 477-484, 1988).

4. Isolierung von infizierten Zeliproteinen und Immunoblotting

Zur Herstellung von Gesamtzellprotein werden Zellen mit Virus bei einer Multiplizität einer Infektion (MOI) von 10 infiziert. Zu geeigneten Zeitpunkten werden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gespült und dann in NP40-Lyse-Puffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% Desoxycholat), ergänzt mit Aprotinin (2 ug/ml), Pepstatin (1 ug/ml), Leupeptin (2 ug/ml) und Peflabloc SC (1 mg/ml) lysiert. Alle Protease-Inhibitoren werden von Boehringer Mannheim bezogen. Platten werden für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Zellen werden durch Abkratzen geerntet, in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in einer Mikrozentrifuge bei hoher Geschwindigkeit 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Überstände werden gesammelt und bis zur Analyse bei -80ºC gelagert.
Proteine infizierter Zellen werden an 10% SDS-Polyacrylamid-Gelen (Novex) getrennt, auf Nitrocellulose transferiert und einer Western-Blot-Analyse unterworfen. Der primäre Antikörper ist ein monoklonaler Maus-Antikörper auf VSV-G-Glycoprotein (Simgma Immuno Chemicals), der in einer Verdünnung von 1 : 100 000 verwendet wird. Peroxidase-konjugierter Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Boehringer Mannheim) wird in einer Verdünnung von 1 : 30 000 als sekundärer Antikörper verwendet. Die Blots werden unter Verwendung von ECL (Amersham) nach den Anweisungen des Herstellers entwickelt.

5. Producer-Zellen, retrovirale Vektorproduktion und Titration

Zur Herstellung der Zellinie zur Verwendung in der Herstellung eines pseudotypisierten Vektors werden 293 gag/pol-Zellen mit N2-βgal, einem VSV-G-pseudotypisierten retroviralen Vektor, infiziert. N2-βgal enthält die Gene für Neomycin- Phosphotransferase (neor) und β-Galactosidas (β-gal). G418-resistente Kolonien werden selektiert. Ein Färben der resultierenden Zellinien mit Bluogal (GIBCO BRL) zeigt, daß alle Zelle blau sind. Um das VSV-G-pseudotypisierte Retrovirus herzustellen, werden 10 cm-Platten mit 293 gag/pol (N2 β-gal)-Zellen mit RMCMVG mit der gewünschten MOI in einem Gesamtvolumen von 2 ml infiziert. Zwei Stunden nach der Infektion werden die Zellen zweimal gewaschen und dann in 2 ml Medium inkubiert, bis sie geerntet werden. 24 oder 48 Stunden nach der Infektion werden die Überstände filtriert (0,45 um Poren) und bis zur Titerbestimmung bei -80ºC gelagert. Überstände werden an HeLa-Zellen einer Titerbestimmung unterzogen. Am Tag vor der Infektion werden 2 · 10&sup6; Zellen auf 10 cm- Platten gesät. Am Tag 1 werden Platten mit 100 ul Überstand in 2 ml Medium, das Polybren (Sigma; 8 ug/ml) enthält, infiziert. Nach einer 2-stündigen Inkubation werden die Platten gewaschen und über Nacht mit frischem Medium inkubiert. Am Tag 2 werden Platten, die mit Überständen aus RMCMVG-infizierten Zellen infiziert sind, 1 : 10 und 1 : 100 aufgeteilt. Die aus scheininfizierten oder wt-MCMV-infizierten Überstände werden 1 : 2 aufgeteilt. Am Tag 3 wird 6418 (Sigma; 1 mg/ml) zu dem Medium gegeben. 10 bis 14 Tage später werden Kolonien gefärbt und gezählt.

B. Resultate

1. Konstruktion von RMCMVG

RMCMVG wird nach Co-Transfektion von NIH3T3-Zellen mit RM427-DNA und pON401-CMVG (Fig. 3) isoliert. Nach Durchmusterung von acht Platten mit 96 Vertiefungen auf β-gal-Rekombinanten wird festgestellt, daß sechs Vertiefungen β-gal-Virus enthielten. Drei dieser werden wachsen gelassen und ein weiteres Mal Plaque-gereinigt. Diese stellen Rekombinante dar, die aus zwei unabhängigen Co-Transfektionen stammen. Virale DNA wird aus diesen drei Isolaten hergestellt und einer DNA-Blot-Analyse unterworfen. Wie in Fig. 4 dargestellt ist, enthalten alle drei rekombinanten Viren die 5,7 kbp- und 4,6 kpb-HindIII-Banden, die für einen VSV-G-Rekombinante vorausgesagt werden. Isolate D9 wird wachsen gelassen und es werden Stammtiter mit etwa 1 · 10&sup8; Plaque-bildenden Einheiten (PbE/ml) erhalten. Dies entspricht Stammtitern des Wildtyp- MCMV, was anzeigt, daß eine VSV-G-Expression für die MCMV-Replikation in Zellkultur nicht toxisch ist. Im Gegensatz-zu dem Wiltyp-MCMV zeigte N RMCMVG- Plaque eines deutlichen Syncytium-Phenotyp (Fig. 5A).

2. RMCMVG-exprimiert VSV-G-Glycoprotein in zulässigen und nicht-zulässigen Zellen

NIH3T3-Zellen werden mit den drei Isolaten von RMCMVG infiziert und einer Western-Blot-Analyse unterworfen. Wie in Fig. 6 gezeigt ist, exprimierten NIH 3T3- Zellen, die mit allen drei Isolaten infiziert waren, 24 Stunden nach der Infektion reichlich Mengen an G-Protein. Zellen, die mit RM427 infiziert waren, zeigten keinerlei VSV-G- Expression. Als positive Kontrolle ist eine Bahn, die G-Glycoprotein, hergestellt nach Transfektion von 293 Zellen mit pMLP-G, enthalten. Um zu bestimmen, ob RMCMVG das G-Protein in nicht-zulässigen Zellen exprimiert, werden 293 Zellen mit RMCMVG infiziert, und 6, 24 und 48 h nach Infektion wird Protein gesammelt. Wie in Fig. 7 dargestellt ist, wird eine VSV-G-Protein-Expression früh nachgewiesen und hatte 24 Stunden nach Infektion ihre Spitze.

3. RMCMVG-Infektion kann verwendet werden, um retrovirale Vektoren zu pseudotypisieren

Um die Fähigkeit von RMCMVG zur Pseudotypisierung retroviraler Vektoren zu untersuchen, werden 293-gag/pol-(N2-β-gal)-Zellen entweder mit Wildtyp-MCMV oder RMCMVG infiziert. Überstände werden 24 Stunden und 48 Stunden nach Infektion gesammelt und einer Titerbestimmung durchgeführt. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, werden Spitzen-Neo-Titer mit etwa 1 · 10&sup4; koloniebildenden Einheiten (kbE/ml) in Zellüberständen 24 h nach Infektion durch RMCMVG bei MOI von 10 oder 20 gefunden. Keine retroviralen Titer werden in den Überständen von scheininfizierten Zellen oder Zellen, die mit Wildtyp-MCMV infiziert sind, gefunden. TABELLE 1 Herstellung von VSV-G-pseudotypisiertem Vektor aus 293-gag/pol-(N2-β-gal)-Zellen nach Infektion mit RMCMVG oder Wildtyp-MCMV
Da 293-Zellen für eine MCMV-Replikation nicht permissiv sind, sollte in den Überständen kein RMCMVG sein. Als in den Überständen der Titer für RMCMVG bestimmt wird, werden Titer von 200 Plaque-bildenden Einheiten (kbE)/ml gefunden (Daten nicht angegeben). Diese geringe Menge an MCMV ist vermutlich Virus, das aus der Anfangsinfektion übrig ist. Die große Größe von MCMV (300 nm) im Vergleich zum retroviralen Vektor sollte eine einfache Entfernung dieses Rest-MCMV aus dem Überstand ermöglichen.

Claims

1. Retrovirale Verpackungszelllinie, umfassend eine humane Wirtszelle, die eine gag-pol-Expressionscassette und einen Expressionsvektor enthält, wobei der Expressionsvektor einen murinen Cytomegalovirus-immediate early (CMV IE)-Promotor funktionell an eine Nucleinsäuresequenz, die für ein toxisches oder fusogenes Protein codiert, gebunden umfasst.

2. Verpackungszelllinie nach Anspruch 1, wobei das fusogene Protein vesikuläres Stomatitis-Virus-G-Protein ist.

3. Retrovirale Producer-Zelllinie, die eine retrovirale Verpackungszelllinie nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst, wobei die retrovirale Verpackungszelllinie zusätzlich ein retrovirales Vektorkonstrukt enthält.

4. Verfahren zur Herstellung retroviraler Partikel, umfassend Bereitstellen eines murinen Cytomegalovirus in einer retroviralen Producer-Zelllinie nach Anspruch 3.