DE69620847T3

DE69620847T3 - Verfahren zur Herstellung einer alpha-Hydroxy-säure oder eines alpha-Hydroxy-amids mittels Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69620847T3
Application number: DE69620847T
Authority: DE
Inventors: Yasumasa Yamaguchi; Masahiro Yokohama-shi Ushigome; Takeshi Yokohama-shi Kato
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1995-11-10
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2016-11-09
Also published as: DE69620847D1; EP0773297A2; EP0773297A3; EP0773297B2; EP0773297B1; US5756306A; DE69620847T2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure oder eines α-Hydroxyamids durch einen Mikroorganismus. insbesondere sind optisch aktive α-Hydroxyamide und α-Hydroxysäuren industriell als Ausgangsmaterialien zur Synthetisierung verschiedener Arzneimittel, Agrochemikalien usw. wertvoll.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zu Beispielen bekannter Verfahren zur Herstellung von α-Hydroxysäuren durch Mikroorganismen gehören diejenigen, welche Mikroorganismen verwenden, die zu den Gattungen Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus, Candida, Nocardia usw. gehören ( JP-A-2-84198 , JP-A-3-224496 , JP-A-3-277292 usw.; der Begriff "JP-A", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung") und diejenigen, welche Mikroorganismen verwenden, die zu den Gattungen Nocardia, Bacillus, Brevibacterium, Aureobacterium, Pseudomonas, Caseobacter, Alcaligenes, Acinetobacter, Enterobacter, Arthrobacter, Escherichia, Micrococcus, Streptomyces, Flavobacterium, Aeromonas, Mycoplana, Cellulomonas, Erwinia, Candida, Bacteridium, Aspergillus, Penicillium, Cochliobolus, Fusarium, Rhodopseudomonas, Rhodococcus, Corynebacterium, Microbacterium, Obsumbacterium, Gordona usw. gehören ( JP-A-4-99495 , JP-A-4-99496 und JP-A-4-218385 entsprechend der US-Patentschrift 5223416 ; JP-A-4-99497 entsprechend der US-Patentschrift 5234826 ; JP-A-5-95795 entsprechend der US-Patentschrift 5296373 ; JP-A-5-21987 ; JP-A-5-192189 entsprechend der US-Patentschrift 5326702 ; JP-A-6-237789 entsprechend EP-A-0610048 ; JP-A-6-284899 entsprechend EP-A-0610049 ; JP-A-7-213296 entsprechend der US-Patentschrift 5508181 usw.).
Andererseits gehören zu Beispielen bekannter Verfahren zur Herstellung von α-Hydroxyamiden durch Mikroorganismen diejenigen, welche Mikroorganismen verwenden, die zu den Gattungen Rhodococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Arthrobacter, Alcaligenes, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus, Brevibacterium, Nocardia usw. gehören ( JP-A-4-222591 ; JP-A-5-192189 entsprechend der US-Patentschrift 5326702 ; JP-A-7-213296 entsprechend der US-Patentschrift 5508181 usw.).
Wenn ein α-Hydroxynitril enzymatisch unter Verwendung von Nitrilase oder Nitrilhydratase hydrolysiert oder hydratisiert wird, wobei eine α-Hydroxysäure oder ein α-Hydroxyamid erzeugt wird, taucht ein Problem auf, derart, daß das Enzym innerhalb eines kurzen Zeitraums inaktiviert wird. Es ist daher schwierig, die α-Hydroxysäure oder das α-Hydroxyamid in hoher Konzentration und hoher Ausbeute zu erhalten.
Wenn ein Aldehyd und Blausäure, welche wirtschaftlich gegenüber α-Hydroxynitril bevorzugt werden, als Ausgangsmaterialien verwendet werden, taucht ein anderes Problem auf, derart, daß die Reaktionsgeschwindigkeit mit einer Zunahme der Konzentration des Produkts α-Hydroxysäure oder α-Hydroxyamid in dem Reaktionsgemisch herabgesetzt wird. Die Folge ist, daß die Reaktion nicht bis zum Abschluß verläuft.
Die Erfinder haben ausgiebige Untersuchungen durchgeführt, um diese Probleme zu lösen. Die Folge war, daß die Erfinder entdeckt haben, daß Enzyminaktivierung unterdrückt werden kann, wenn eine α-Hydroxysäure oder ein α-Hydroxyamid, dargestellt durch die folgende Formel (3), aus einem entsprechenden Aldehyd, dargestellt durch die folgende Formel (1), und Blausäure hergestellt wird, indem die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch gemessen wird und die Aldehydkonzentration in dem Reaktionssystem innerhalb eines vorherbestimmten Bereichs gehalten wird. So können α-Hydroxysäure oder α-Hydroxyamid in hoher Konzentration in hoher Ausbeute hergestellt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure oder eines α-Hydroxyamids durch einen Mikroorganismus oder ein verarbeitetes Produkt daraus, ausgewählt aus einem von einer Grundzelle, einem rohen Enzym, einem gereinigten Enzym, einer immobilisierten Zelle und einem immobilisierten Enzym mit Nitrilase- oder Nitrilhydrataseaktivität, bereit, welches die Schritte umfaßt, (i) ein Aldehyd, dargestellt durch die folgende Formel (1), und Blausäure mit dem Mikroorganismus oder dem verarbeiteten Produkt in einem wässerigen Medium zu behandeln, um dadurch ein Reaktionsgemisch, enthaltend die entsprechende α-Hydroxysäure oder das α-Hydroxyamid, dargestellt durch die folgende Formel (3), bereitzustellen, (ii) die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch zu messen und (iii) kontinuierlich und/oder intermittierend das Aldehyd und die Blausäure oder eine wässerige Cyanidsalzlösung dem Reaktionsgemisch in einer derartigen Weise zuzuführen, um die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb eines vorherbestimmten Bereichs von 0,1 to 1000 mM zu erhalten:
wobei R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Alkenylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Gruppe darstellt; und X eine Amidogruppe oder eine Carboxylgruppe darstellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung sind das Aldehyd, die Blausäure und das Sulfition, welches Sulfition wenn benötigt hinzugefügt wird, in einem Gleichgewichtszustand und reagieren in dem Reaktionsgemisch miteinander. So ist es schwierig, die wirklichen Konzentrationen dieser Substanzen zu bestimmen. Demgemäß wird (werden) die scheinbare(n) Konzentration(en) des Aldehyds in dem Reaktionsgemisch bestimmt. Genauer gesagt wird das Reaktionsgemisch während des Verlaufs der Reaktion beprobt und, wenn notwendig, verdünnt und einer fest-flüssig-Trennung unterworfen, nachfolgend die so erhaltene Lösung analysiert. Obwohl es vorzuziehen ist, für diese Analyse Flüssigkeitschromatographie zu verwenden, kann auch Gaschromatographie verwendet werden. Das Aldehyd wird dem Reaktionsgemisch in einer derartigen Weise zugeführt, um die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 0,01 bis 1000 mM, vorzugsweise von 0,05 bis 200 mM und noch stärker bevorzugt von 1 bis 50 mM, zu regulieren (zu steuern). Im letzten Schritt der Reaktion wird die Zuführung des Aldehyds unterbrochen, um dadurch die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch herabzusetzen.
Es ist auch möglich, die Cyanidionenkonzentration zusätzlich zur Aldehydkonzentration zu messen. Die Konzentration von Cyan in dem Reaktionsgemisch kann unter Verwendung eines Cyanidionensensors, eines Infrarotgasanalysators, eines Halbleitergassensors usw. bestimmt werden. In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Cyankonzentration in dem Reaktionsgemisch" die Summe der darin enthaltenen Konzentrationen von Blausäure und Cyanidion. Weiterhin wird das Aldehyd dem Reaktionsgemisch in einem Verhältnis von 0,98 bis 1,05 mol, vorzugsweise von 0,99 bis 1,03 mol, pro mol Blausäure zugeführt. Im letzten Schritt der Reaktion wird die Zuführung des Aldehyds unterbrochen, und Blausäure wird, wenn notwendig, allein zugeführt, um die Konzentration des Aldehyds in dem Reaktionsgemisch herabzusetzen.
Wie hierin verwendet und beansprucht, ist es selbstverständlich, daß "Zuführen von Blausäure zu dem Reaktionsgemisch" Zuführen eines Cyanidsalzes oder einer Lösung davon, wie beispielsweise eine Natriumcyanidlösung, zu dem Reaktor einschließt.
Wenn die Cyankonzentration in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung eines Cyanidionensensors bestimmt wird, kann die kurze Lebensdauer des Cyansensors durch Verdünnen des Reaktionsgemischs mit einem wässerigen Medium verlängert werden. Wenn ein Infrarotgasanalysator oder ein Halbleitergassensor dafür verwendet wird, kann diese Messung durch Bestimmen der Blausäuregaskonzentration in dem Gas, das in Kontakt mit dem Reaktionsgemisch ist, ausgeführt werden.
Im allgemeinen binden sich Aldehyde an Proteine und inaktivieren so Enzyme. Daher erwarten die Erfinder, daß das Verfahren der Regulierung der Auswirkung der Inhibierung eines Enzyms, welches Messen der Aldehydkonzentration und wahlweise der Cyankonzentration in dem Reaktionsgemisch und Steuern der Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb eines vorherbestimmten Bereichs umfaßt, in der Regel auf alle mikrobiellen Reaktionen, an denen Aldehyde teilnehmen, anwendbar ist. Daher ist der Mikroorganismus zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Säure oder eines Amids aus einem Aldehyd und Blausäure nicht besonders begrenzt, so lange wie er imstande ist, die Säure oder das Amid zu erzeugen (d. h. Nitrilase- oder Nitrilhydrataseaktivität hat).
Zu Beispielen von Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, gehören diejenigen, die zu den Gattungen Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Caseobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Nocardia, Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Bacillus, Aureobacterium, Enterobacter, Escherichia, Micrococcus, Streptomyces, Flavobacterium, Aeromonas, Mycoplana, Cellulomonas, Erwinia, Candida, Bacteridium, Aspergillus, Penicillium, Cochliobolus, Fusarium, Rhodopseudomonas usw. gehören.
Genauer gesagt sind zum Beispiel die folgenden Mikroorganismen in der vorliegenden Erfindung verwendbar, wobei FERN das Fermentation Research Institute bezeichnet, Pseudomonas sp. BC13-2 (FERN BP-3319), BC15-2 (FERN BP-3320), SK13 (FERN BP-3325), SK31 (FERN P-11310) und SK87 (FERN P-11311), Pseudomonas synxanta IAM 12356, Alcaligenes sp. BC12-2 (FERN P-11263), BC20 (FERN P-11264) und BC35-2 (FERN BP-3318), Acinetobacter sp. BC9-2 (FERN BP-3317), Caseobacter sp. BC4 (FERN BP-3316) und BC23 (FERN P-11261), Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419, Brevibacterium acetylicum IAM 1790, Brevibacterium helvolum ATCC 11822, Nocardia sp. N-775 (FERN P-4447), Nocardia asteroides IFO 3384, Nocardia calcarea KCCEIN 0191, Nocardia polychromogenes IFM 19, Rhodococcus sp. SK70 (FERN P-11304), SK92 (FERN BP-3324) und HR11 (FERN P-11306), Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674, ATCC 19140 und ATCC 33258, Rhodococcus erythropolis IFM 155, IFO 12320, IFO 12538 und IFO 12540, Gordona terrae, MA-1 (FERN BP-4535), Arthrobacter sp. SK103 (FERN P-11300), HR1 (FERN BP-3323) und HR4 (FERN P-11302), Arthrobacter oxydans IFO 12138, Bacillus subtilis ATCC 21697, Bacillus licheniformis IFO 12197, Bacillus megaterium ATCC 25833, Aureobacterium testaceum IAM 1561, Enterobacter sp. SK12 (FERN BP-3322), Escherichia coli IFO 3301, Micrococcus luteus ATCC 383, Micrococcus varians IAM 1099, Micrococcus roseus IFO 3768, Streptomyces griseus IFO 3355, Flavobacterium sp. SK150 (FERN P-11645), Flavobacterium flavescens ATCC 8315, Aeromonas punctata IFO 13288, Mycoplana dimorpha ATCC 4297, Cellulomonas fimi IAM 12107, Erwinia herbicola IFO 12686 und Candida guilliermondii IFO 0566.
Diese Mikroorganismen sind jeweils in den vorstehend zitierten Patentveröffentlichungen beschrieben.
Andererseits gehören zu Beispielen verwendbarer Mikroorganismen in der vorliegenden Erfindung mit Nitrilhydrataseaktivität diejenigen, die zu den Gattungen Rhodococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Arthrobacter, Alcaligenes, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus, Brevibacterium und Nocardia gehören.
Genauer gesagt sind zum Beispiel die folgenden Mikroorganismen in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
Rhodococcus sp. HT40-6 (FERN BP-5231), Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278, Rhodococcus erythropolis IFO 12320, Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419, Pseudomonas sp. SK87 (FERN P-11311), Arthrobacter sp. HR1 (FERN BP-3323) und Alcaligenes sp. BC16-2 (FERN BP-3321).
Diese Mikroorganismen sind jeweils in den vorstehend zitierten Patentveröffentlichungen beschrieben.
Das Aldehyd, dargestellt durch Formel (1), zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, bei denen R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe (z. B. C₁-C₆-Alkyl), eine substituierte oder unsubstituierte Alkenylgruppe (z. B. C₂-C₃-Alkenyl), eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe (z. B. Cyclohexyl), eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe (z. B. Phenyl) oder eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Gruppe (z. B. ein Ring) darstellt. In dem Reaktionsgemisch befinden sich das Aldehyd und die Blausäure in einem dissoziierten Gleichgewichtszustand.
Verwendbare heterocyclische Gruppen, dargestellt durch R, enthalten mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen.
Zu Beispielen von verwendbaren Substituenten für die durch R dargestellte substituierte Gruppe gehören Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Aryl- und Aryloxygruppen, Halogenatome wie Chlor- und Bromatome und Hydroxyl-, Amino-, Nitro- und Thiolgruppen.
Zu speziellen Beispielen des Aldehyds gehören Acetaldehyd, Propionaldehyd, n-Butylaldehyd, n-Pentylaldehyd, n-Hexylaldehyd, n-Heptylaldehyd, β-Hydroxy-α,α-dimethylpropionaldehyd, Acrolein, 3-Phenylacrolein, Methacrylaldehyd, 2-Chloracetaldehyd, 3-Methylthiopropionaldehyd und 2-Phenylaldehyd, welche gegebenenfalls substituiert sind. Weiterhin können aromatische Aldehyde und diejenigen mit heterocyclischen Ringen ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise Benzaldehyd, 2-Thiophenaldehyd, 2-Pyridinaldehyd, 2-Pyrrolaldehyd und 2-Furaldehyd, welche gegebenenfalls substituiert sind. Was die Blausäure betrifft, kann ein Cyanid wie beispielsweise Natriumcyanid oder Kaliumcyanid verwendet werden.
Enzyminhibierung durch das Aldehyd wird durch Hinzufügen von Sulfition, wie beispielsweise ein Salz der schwefligen Säure oder ein saures Salz der schwefligen Säure, wirksam unterdrückt. Zu Beispielen des Salzes gehören Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze. Das Salz kann in einem Anteil von 1 bis 1000 mM zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt werden.
Wenn ein Mikroorganismus mit einer stereospezifischen Nitrilase oder Nitrilhydratase oder ein verarbeitetes Produkt daraus (z. B. Enzym, immobilisiertes Enzym, immobilisierte Zelle) in der Reaktion verwendet wird, ist es möglich, mindestens 50% des Aldehyds (d. h. mindestens 50% des Ausgangsmaterials) in eine der optisch aktiven Substanzen umzuwandeln. So kann eine optisch aktive α-Hydroxysäure oder ein α-Hydroxyamid vorteilhaft erhalten werden, ohne das Produkt optisch auftrennen zu müssen.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Hydrolyse oder Hydratisierung wird durch Inkontaktbringen eines Gemisches aus dem Aldehyd, dargestellt durch Formel (1), und Blausäure mit einem Mikroorganismus oder einem verarbeiteten Produkt daraus (z. B. Grundzelle, rohes Enzym, gereinigtes Enzym, immobilisierte Zelle, immobilisiertes Enzym) in einem wässerigen Medium, wie beispielsweise Wasser oder ein Puffer, durchgeführt.
In der vorliegenden Erfindung werden die Aldehydkonzentration und wahlweise die Cyankonzentration in dem Reaktionsgemisch in diesem Schritt gemessen, und das Aldehyd und die Blausäure werden kontinuierlich und/oder intermittierend dazu hinzugefügt, um die Aldehydkonzentration innerhalb eines vorherbestimmten Bereichs zu erhalten.
Die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch ist wie vorstehend definiert. Der Mikroorganismus wird in einem Anteil von 0,001 bis 5,0 Gew.-% auf einer Trockenbasis, bezogen auf das Substrat, verwendet. Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich vom Gefrierpunkt bis 50°C, vorzugsweise von 5 bis 30°C.
Wenn das Aldehyd eine extrem geringe Löslichkeit in dem wässerigen Medium hat, kann die Reaktion wirksam durch Hinzufügen von 0,1 bis 5,0 Gew.-% eines grenzflächenaktiven Mittels (Triton X-100 [RTM], Tween 60 [RTM] usw.), Methanol, Ethanol, Dimethylsulfoxid usw. ausgeführt werden.
Die so erhaltene α-Hydroxysäure kann durch Behandeln des Reaktionsgemischs, aus welchem unlösliche Materie einschließlich der Zellen entfernt worden ist, durch dem gewöhnlichen Fachmann bekannte Verfahren, wie beispielsweise Einengen, Ionenaustausch, Elektrodialyse, Extraktion, Kristallisation usw., isoliert werden.
Um die vorliegende Erfindung weiter in größerer Ausführlichkeit, und nicht durch Eingrenzung, zu veranschaulichen, werden nachstehend die folgenden Beispiele angegeben.
BEISPIEL 1
Ein 50-mM-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 1000 mM Natriumsulfit, wurde in einen Reaktor eingefüllt, und die Temperatur wurde auf 30°C eingestellt. Dann wurde der Stamm Gordona terrae MA-1 in dieser Lösung suspendiert, um eine OD₆₃₀ von 4,2 zu erhalten. Dann wurde eine wässerige Lösung von Natriumcyanid und Benzaldehyd als Ausgangsmaterialien dem Reaktor zugeführt, während deren Molverhältnis auf 1,0:1,0 gesteuert wurde. Die Cyanidionenkonzentration in dem Reaktionsgemisch wurde mit einem Cyanidionendetektor gemessen, und die Zuführungsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Natriumcyanid wurde gesteuert, um die Ausgangsleistung des Cyanidionendetektors auf innerhalb von –220 bis –224 mV einzustellen. Im Verlauf der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch beprobt und filtriert. Das Filtrat wurde 10-fach mit Wasser verdünnt, und die Benzaldehydkonzentration wurde durch Flüssigkeitschromatographie gemessen. So wurden die Zuführungsgeschwindigkeiten der wässerigen Lösung von Natriumcyanid und Benzaldehyd reguliert, um die Benzaldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb des Bereichs von 10 bis 15 mM zu erhalten.
Nach 22 Stunden Ausführen der Reaktion enthielt das umgesetzte Gemisch R-Mandelsäure in einer Konzentration von 10,5% und einer optischen Reinheit von 99,0% ee. Die R-Mandelsäurekonzentration und die optische Reinheit wurden durch Flüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Ausbeute der R-Mandelsäure, bezogen auf das dem Reaktor zugeführte Benzaldehyd, betrug 97,0%.
BEISPIEL 2
Die Verfahrensweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß die wässerige Lösung von Natriumcyanid durch Blausäure ersetzt wurde. Nach 22 Stunden Ausführen der Reaktion enthielt das umgesetzte Gemisch R-Mandelsäure in einer Konzentration von 14,2% und einer optischen Reinheit von 99,0% ee. Die Ausbeute der R-Mandelsäure, bezogen auf das dem Reaktor zugeführte Benzaldehyd, betrug 97,0%.
BEISPIEL 3
Ein 20-mM-Phosphatpuffer (pH 8,5) wurde in einen Reaktor eingefüllt, und die Temperatur wurde auf 10°C eingestellt. Dann wurde der Stamm Rhodococcus sp. HT40-6 in dieser Lösung suspendiert, um eine OD₆₃₀ von 4,2 bereitzustellen.
Nach dem Hinzufügen von Benzaldehyd in den Reaktor und Auflösen desselben, um eine Konzentration von 30 mM bereitzustellen, wurden Benzaldehyd und Blausäure als Ausgangsmaterialien dem Reaktor in einem Molverhältnis von ihnen von 1,0:1,0 zugeführt. Die Cyanidionenkonzentration in dem Reaktionsgemisch wurde mit einem Cyanidionendetektor gemessen, und die Zuführungsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Natriumcyanid wurde gesteuert, um die Ausgangsleistung des Cyanidionendetektors auf innerhalb von –145 bis –150 mV einzustellen. Während des Verlaufs der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch beprobt und filtriert. Das Filtrat wurde 10-fach mit Wasser verdünnt, und die Benzaldehydkonzentration wurde durch Flüssigkeitschromatographie gemessen. So wurden die Zuführungsgeschwindigkeiten der wässerigen Lösung von Natriumcyanid und Benzaldehyd reguliert, um dadurch die Benzaldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb des Bereichs von 35 bis 40 mM zu erhalten.
Nach dem Ausführen der Reaktion für 66 Stunden enthielt das umgesetzte Gemisch Mandelsäureamid in einer Konzentration von 32% und einer optischen Reinheit (S-Mandelsäureamid) von 77% ee. Die Ausbeute des Mandelsäureamids, bezogen auf das dem Reaktor zugeführte Benzaldehyd, betrug 95%. Mandelsäureamid wurde aus dem umgesetzten Gemisch auskristallisiert.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Ein 50-mM-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 100 mM Natriumsulfit, wurde in einen Reaktor eingefüllt, und die Temperatur wurde auf 30°C eingestellt. Dann wurde der Stamm Gordona terrae MA-1 in dieser Lösung suspendiert, um eine OD₆₃₀ von 4,2 bereitzustellen. Dann wurde eine wässerige Lösung von Natriumcyanid und Benzaldehyd als Ausgangsmaterialien in einem Molverhältnis von 1,0:1,0 zugeführt. Die Cyanidionenkonzentration in dem Reaktionsgemisch wurde mit einem Cyanidionendetektor gemessen, und die Zuführungsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Natriumcyanid wurde gesteuert, um die Ausgangsleistung des Cyanidionendetektors auf innerhalb von –220 bis –224 mV einzustellen.
Nach dem Ausführen der Reaktion für 22 Stunden enthielt das umgesetzte Gemisch R-Mandelsäure in einer Konzentration von 5,0% und einer optischen Reinheit von 97% ee. Die Ausbeute der R-Mandelsäure, bezogen auf das dem Reaktor zugeführte Benzaldehyd, betrug 93%.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Ein 50-mM-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 100 mM Natriumsulfit, wurde in einen Reaktor eingefüllt, und die Temperatur wurde auf 30°C eingestellt. Dann wurde der Stamm Gordona terrae MA-1 in dieser Lösung suspendiert, um eine OD₆₃₀ von 4,2 bereitzustellen. Dann wurde eine wässerige Lösung von Natriumcyanid und Benzaldehyd, die als Ausgangsmaterialien verwendet wurden, in einem Molverhältnis von 1,0:0,98 zugeführt. Die Cyanidionenkonzentration in dem Reaktionsgemisch wurde mit einem Cyanidionendetektor gemessen, und die Zuführungsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Natriumcyanid wurde gesteuert, um die Ausgangsleistung des Cyanidionendetektors auf innerhalb von –220 bis –224 mV einzustellen. In diesem Fall wurde die Cyankonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb des Bereichs von 20 bis 22 mM reguliert.
Nach dem Ausführen der Reaktion für 22 Stunden wurde die Zuführung von Benzaldehyd unterbrochen, während die Zuführung der wässerigen Lösung von Natriumcyanid fortgesetzt wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der für 30 Stunden durchgeführten Reaktion.
VERGLEICHSBEISPIELE 3 BIS 7
Die Verfahrensweise von Vergleichsbeispiel 2 wurde wiederholt, außer daß das Molverhältnis der wässerigen Lösung von Natriumcyanid und Benzaldehyd als Ausgangsmaterialien gesteuert wurde, wie in Tabelle 1 angeführt ist. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der für 30 Stunden durchgeführten Reaktion.
VERGLEICHSBEISPIEL 8
Die Verfahrensweise von Vergleichsbeispiel 2 wurde wiederholt, außer daß Blausäure für die wässerige Lösung von Natriumcyanid als Satire ersetzt wurde und das Molverhältnis von Blausäure zu Benzaldehyd auf 1,00:1,00 gesteuert wurde. Nach Ausführen der Reaktion für 30 Stunden enthielt das umgesetzte Gemisch R-Mandelsäure in einer Konzentration von 14,5% und einer optischen Reinheit von 99,0% ee. Die Ausbeute der R-Mandelsäure, bezogen auf das dem Reaktor zugeführte Benzaldehyd, betrug 97,8%.
VERGLEICHSBEISPIEL 9
Ein 20-mM-Phosphatpuffer (pH 8,5) wurde in einen Reaktor eingefüllt, und die Temperatur wurde auf 10°C eingestellt. Dann wurde der Stamm Rhodococcus sp. HT40-6 in dieser Lösung suspendiert, um eine OD₆₃₀ von 4,2 bereitzustellen.
Nach dem Hinzufügen von Benzaldehyd hierzu und Auflösen desselben, um eine Konzentration von 30 mM bereitzustellen, wurden die Ausgangsmaterialien Blausäure und Benzaldehyd dem Reaktor zugeführt, während deren Molverhältnis auf 1,0:1,02 gesteuert wurde. Die Cyanidionenkonzentration in dem Reaktionsgemisch wurde mit einem Cyanidionendetektor gemessen, und die Zuführungsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Natriumcyanid wurde gesteuert, um die Ausgangsleistung des Cyanidionendetektors auf innerhalb von –145 bis –150 mV einzustellen. In diesem Fall wurde die Cyankonzentration in dem Reaktionsgemisch auf innerhalb des Bereichs von 18 bis 20 mM gesteuert. Nach dem Ausführen der Reaktion für 66 Stunden enthielt das umgesetzte Gemisch Mandelsäureamid in einer Konzentration von 33% und einer optischen Reinheit (S-Mandelsäureamid) von 77% ee. Die Ausbeute des Mandelsäureamids, bezogen auf das dem Reaktor zugeführte Benzaldehyd, betrug 95%. Mandelsäureamid wurde aus dem umgesetzten Gemisch auskristallisiert.
VERGLEICHSBEISPIEL 10
Ein 50-mM-Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 100 mM Natriumsulfit, wurde in einen Reaktor eingefüllt, und die Temperatur wurde auf 30°C eingestellt. Dann wurde der Stamm Gordona terrae MA-1 in dieser Lösung suspendiert, um eine OD₆₃₀ von 4,2 bereitzustellen. Dann wurde eine wässerige Lösung der Ausgangsmaterialien Natriumcyanid und Benzaldehyd in einem Molverhältnis davon von 1,0:0,97 zugeführt. Die Cyanidionenkonzentration in dem Reaktionsgemisch wurde mit einem Cyanidionendetektor gemessen, und die Zuführungsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Natriumcyanid wurde gesteuert, um die Ausgangsleistung des Cyanidionendetektors auf innerhalb von –220 bis –224 mV einzustellen. Nach dem Ausführen der Reaktion für 22 Stunden wurde die Zuführung des Benzaldehyds unterbrochen, während die Zuführung der wässerigen Lösung von Natriumcyanid fortgesetzt wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der für 30 Stunden durchgeführten Reaktion.
VERGLEICHSBEISPIEL 11

Die Verfahrensweise von Vergleichsbeispiel 10 wurde wiederholt, außer daß das Molverhältnis der wässerigen Lösung von Natriumcyanid und Benzaldehyd, die als Ausgangsmaterialien verwendet wurden, auf 1,00:1,06 gesteuert wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der für 30 Stunden durchgeführten Reaktion. TABELLE 1

Bsp. Nr.	Natriumcyanid (Molverhältnis)	Benzaldehyd (Molverhältnis)	Angesammelte Konzentration (%)	Optische Reinheit (%)	Mandelsäureausbeute (%)	R-Mandelsäureausbeute (%)
Bsp. 4	1,00	0,98	9,5	94,8	99,9	94,7
Bsp. 5	1,00	0,99	10,2	95,9	99,7	95,6
Bsp. 6	1,00	1,00	10,6	96,5	97,7	94,3
Bsp. 7	1,00	1,02	10,1	98,3	96,7	94,3
Bsp. 8	1,00	1,04	9,9	98,5	94,6	93,2
Bsp. 9	1,00	1,05	9,7	98,5	93,7	92,3
Vgl. Bsp. 2	1,00	0,97	6,0	93,0	99,9	93,9
Vgl. Bsp. 3	1,00	1,06	9,3	98,7	91,0	89,8

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein α-Hydroxynitril hydrolisiert oder hydratisiert werden, während die Aldehydkonzentration, welche einer der Faktoren ist, die das Enzym inhibieren, während der Reaktion bei einem kontinuierlich niedrigen Niveau gehalten wird. So kann die enzymatische Aktivität für einen längeren Zeitraum in einem stabilen Zustand erhalten werden. Dies macht es möglich, das Produkt Säure oder Amid in einer hohen Konzentration anzusammeln.
Wenn auch die Erfindung ausführlich und mit Bezug auf spezielle Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifizierungen darin ausgeführt werden können, ohne von deren Schutzumfang abzuweichen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure oder eines α-Hydroxyamids durch einen Mikroorganismus oder ein verarbeitetes Produkt daraus, ausgewählt aus einem von einer gemahlenen Zelle, einem rohen Enzym, einem gereinigten Enzym, einer immobilisierten Zelle und einem immobilisierten Enzym mit Nitrilase- oder Nitrilhydrataseaktivität, welches die Schritte umfaßt, (i) ein Aldehyd, dargestellt durch die folgende Formel (I), und Blausäure mit dem Mikroorganismus oder dem verarbeiteten Produkt in einem wässerigen Medium zu behandeln, um dadurch ein Reaktionsgemisch, enthaltend die entsprechende α-Hydroxysäure oder das α-Hydroxyamid, dargestellt durch die folgende Formel (3), bereitzustellen, (ii) die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch zu messen und (iii) kontinuierlich und/oder intermittierend das Aldehyd und die Blausäure oder eine wässerige Cyanidsalzlösung dem Reaktionsgemisch in einer derartigen Weise zuzuführen, um die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb eines vorherbestimmten Bereichs von 0,01 bis 1000 mM zu erhalten:
wobei R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Alkenylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Gruppe darstellt; und X eine Amidogruppe oder eine Carboxylgruppe darstellt.
Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure oder eines α-Hydroxyamids durch einen Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Zuführungsschritt das Zuführen einer wässerigen Cyanidsalzlösung zu dem Reaktionsgemisch und Regulieren der Zuführungsgeschwindigkeiten des Aldehyds und der wässerigen Cyanidsalzlösung zu dem Reaktionsgemisch, um die Aldehydkonzentration innerhalb des vorherbestimmten Bereichs zu erhalten, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure oder eines α-Hydroxyamids durch einen Mikroorganismus nach Anspruch 1, welches umfaßt, die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb eines Bereiches von 0,05 bis 200 mM zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure oder eines α-Hydroxyamids durch einen Mikroorganismus nach Anspruch 1, welches umfaßt, die Aldehydkonzentration in dem Reaktionsgemisch innerhalb eines Bereiches von 1 bis 50 mM zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure oder eines α-Hydroxyamids durch einen Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Reaktionsgemisch Sulfition enthält.