DE69529224T2

DE69529224T2 - IMPFSTOFF-ZUSAMMENSETZUNGEN enthaltend teil-deacetyliertes Chitin

Info

Publication number: DE69529224T2
Application number: DE69529224T
Authority: DE
Inventors: Professor Illum; Berkshire Rg41 5Tu Microscience Ltd; Lisbeth West Pharmaceutical
Original assignee: West Pharmaceutical Services Drug Delivery and Clinical Research Center Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Services Ltd
Priority date: 1994-10-04
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2015-09-22
Also published as: DE69529224D1; KR100373593B1; BR9509190A; US6048536A; CA2201598A1; NZ292953A; GB9419979D0; JPH10506405A; CA2201598C; WO1996010421A1; EP0784485B8; ATE229816T1; TW426521B; CN1097467C; ES2192582T3; JP4240237B2; CN1159761A; AU3526995A; KR970706018A; EP0784485B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Impfstoffzusammensetzung für die intranasale Verabreichung, die Influenzavirus-Antigene und einen Schleimhaut-Hilfs- bzw. Verstärkungsstoff umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Immunisieren eines Patienten gegen Influenza durch Verabreichung dieser Zusammensetzung an den Patienten und ein Verfahren zur Erhöhung der Immunogenizität eines viralen Influenza-Antigens bei der intranasalen Verabreichung durch die gleichzeitige Verabreichung des besagten Hilfs- bzw. Verstärkungsstoffs. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung die Verwendung eines viralen Influenza-Antigens in Kombination mit einem Chitosan für die Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung für die intranasale Verabreichung zur Immunisierung eines Patienten gegen Influenza.
Zur Zeit übliche Influenza-Impfstoffe bestehen entweder aus deaktivierten ganzen Viren, zerteilten Viren (gesplittete Impfstoffe) oder gereinigten Zubereitungen der Membran-Glycoproteine Haemagglutenin (HA) und Neuraminidase (NA) Untereinheit-Impfstoffe. Haemagglutenin und Neuraminidase sind die Antigene, auf die die schützenden Antikörperreaktionen gerichtet sind, wobei Haemagglutenin das schützende Haupt-Antigen ist. Abschätzungen der Wirksamkeit von diesen parenteral verabreichten Impfstoffen variieren stark. Es wird angenommen, dass diese Impfstoffe hauptsächlich dadurch wirken, dass sie zirkulierende Anti-Haemagglutenin-IgG-Antikörper hervorrufen, die in den unteren Atmungstrakt übergehen.
M. L. Clements et al., J. Clinical Microbiology 24, 157-160, 1986 haben früher berichtet, dass sowohl sekretorisches IgA als auch im Serum auftretendes IgG bei der Immunität gegen Influenzaviren beteiligt sind. Darüber hinaus hat eine Reihe von veröffentlichten Studien an Mäusen die Bedeutung der im respiratorischen Bereich auftretenden IgA beim Schutz gegen eine Influenza-Infektion gezeigt. Es wurde auch gefunden, dass ein Vorteil der Stimulierung einer lokalen IgA-Reaktion auf Influenza darin be steht, dass sie häufig eine breitere Spezifizität als die Serumsreaktion besitzt und somit einen Überkreuzschutz gegen Viren bewirken kann, die Haemagglutenin-Moleküle besitzen, die von denen verschieden sind, die im Impfstoff vorhanden sind. Daher sollten Influenza-Impfstoffe, die sowohl lokale sekretorische als auch Serums-Antihaemagglutenin-Reaktionen hervorrufen, eine den herkömmlichen Impfstoffen überlegene Immunität bewirken. Eine parentarale Impfung (intramuskulär, subkutan usw.) ist jedoch hinsichtlich der Hervorrufung einer lokalen Antikörperproduktion nicht effektiv, wenn zuvor keine Schleimhaut-Exposition (d. h. eine Infektion) stattgefunden hat. Um das Schleimhaut-Immunsystem zu stimulieren, muss der Impfstoff örtlich auf eine Schleimhaut-Oberfläche aufgebracht werden.
Eine auf die Schleimhaut erfolgende Verabreichung von Influenza-Impfstoffen hätte im Vergleich zu herkömmlichen parentaralen Immunisierungstherapien eine Reihe von Vorteilen. Hervorragend unter diesen ist eine wirksamere Stimulation des örtlichen Schleimhaut-Immunsystems des Atmungstraktes und die Wahrscheinlichkeit, dass die Impfstoff-Akzeptanzraten erhöht würden, weil die Furcht und die Unannehmlichkeiten, die mit Injektionen verbunden sind, vermieden würden. Demgemäß wurde eine Reihe von Versuchen gemacht, über die Schleimhaut zu verabreichende Influenza-Impfstoffe zu entwickeln. Ein Nachteil ist jedoch, dass deaktivierte Impfstoffe häufig eine schlechte Immunogenizität besitzen, wenn sie über eine Schleimhaut verabreicht werden. Um dieses Problem zu überwinden, hat eine Reihe verschiedener Versuche zur Verbesserung der Immunogenizität von oral oder intranasal verabreichten Influenza- Impfstoffen die Verwendung der B-Untereinheit des Cholera-Toxins (CTB) als Hilfsstoff, die Verkapselung der Impfstoffe in einer Vielzahl von Mikrokügelchen und die Verwendung von lebenden, abgeschwächten Stämmen umfasst. Bis heute wurde jedoch keine praktische Methode zum Erhöhen der Immunogenizität von über die Schleimhaut verabreichten Influenza-Impfstoffen entwickelt.
EP 506 326 beschreibt die Verwendung von gewissen di-equatorial gebundenen β 1-4 Polyuronaten oder von Chitosan für die Cytokin-Stimulation. Forschungsartikel in Vaccine 2, 93 (1984) und Vaccine 5, 270 (1987) beschreiben die immunologische Aktivität von Chitosan und einigen seiner Derivate. Keines dieser Dokumente beschreibt jedoch Influenza-Impfstoffzusammensetzungen, die für eine intranasale Verabreichung geeignet sind und ein Chitosan umfassen, bei dem es sich um ein Chitin handelt, das zumindest zu 80% deacetyliert ist oder legt einen solchen Impfstoff nahe.
Es wurde nun durch die Anmelder gefunden, dass durch die Verabreichung von Haemagglutenin- und Neuraminidase-Antigenen von Influenza zusammen mit einem speziellen Chitosan-Derivat in einer intranasalen Zubereitung die Erzielung von guten IgG- und guten IgA-Reaktionen möglich ist.
Chitosane sind Derivate von Chitin oder Poly-N-Acetyl-D-glucosamin bei denen der größere Anteil der N-Acetyl-Gruppen durch Hydrolyse entfernt worden ist.
Chitosane wurden bereits früher in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet und sind in EP-A-0 460 020 als Schleimhaut-Absorptionsverstärker beschrieben. In EP-A-0 460 20 wird jedoch weder beschrieben noch nahegelegt, dass das Chitosan einen Hilfsstoff-Effekt bewirken könnte, wenn es in einer Impfstoffzusammensetzung verabreicht wird.
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben jedoch gefunden, dass dann, wenn ein Chitosan in intranasal zu verabreichende Impfstoffzusammensetzungen aufgenommen wird, die die Neuraminidase- und Haemagglutenin-Antigene von Influenzaviren enthalten, gute systemische und lokale Immunreaktionen hervorgerufen werden.
Somit schafft die Erfindung gemäß einem ersten Aspekt eine Impfstoffzusammensetzung, die für eine Verabreichung über eine Schleimhaut geeignet ist, wobei die Zusammensetzung ein Influenzavirus-Antigen oder Influenzavirus-Antigene und eine wirksame Hilfsstoffmenge von Chitosan umfasst, wobei das Chitosan ein Chitin ist, das zumindest zu 80% deacetyliert ist.
Die Impfstoffzusammensetzung ist vorzugsweise für eine intranasale Verabreichung geeignet.
Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung sowohl Haemagglutenin- als auch Neuraminidase-Influenzavirus-Antigene.
In einer bevorzugten Ausführungsform schafft die Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung, die für eine intranasale Verabreichung geeignet ist, wobei die Zusammensetzung gereinigte Haemagglutenin- und Neuraminidase-Influenzavirus-Antigene und eine wirksame Hilfsstoffmenge eines Chitosans enthält, wobei das Chitosan ein Chitin ist, das zumindest zu 80% deacetyliert ist.
Es ist bevorzugt, dass die gereinigten Haemagglutenin- und Neuraminidase-Antigene in der Form von Rosetten vorliegen. Die Rosetten sind vorzugsweise Teilchen mit einem Radius im Bereich von 10 nm bis 25 nm.
Es ist bevorzugt, dass die Rosetten im wesentlichen frei von Lipid sind und darüber hinaus ist bevorzugt, dass die gereinigte Haemagglutenin- und Neuraminidase-Antigen-Zubereitung insgesamt im wesentlichen lipidfrei ist.
Ein Beispiel für eine Haemagglutenin/Neuraminidase-Zubereitung, die für die Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist das "Fluvirin"-Produkt, das von Evans Medical Limited of Speke, Merseyside, im Vereinigten Königreich hergestellt und in den Handel gebracht wird; siehe auch S. Renfrey und A. Watts, Vaccine, 1994, Band 12, Nummer 8, Seiten 747-752.
Die Zusammensetzungen können Influenzavirus-Antigene von einem einzigen viralen Stamm oder aus einer Vielzahl von Stämmen enthalten. Beispielsweise kann die Zusammensetzung Antigene enthalten, die von bis zu drei oder mehr viralen Stämmen gewonnen wurden. Lediglich beispielsweise kann die Zusammensetzung Antigene von einem oder mehreren Stämmen von Influenza A zusammen mit Antigenen von einem oder mehreren Stämmen von Influenza B enthalten.
Vorzugsweise ist das Chitosan wasserlöslich.
Vorzugsweise ist das Chitosan zumindest zu 85% deacetyliert und in besonders bevorzugter Weise ist es zu 88% bis 90% deacetyliert.
Ein spezielles deacetyliertes Chitosan ist das "Sea Cure +"-Chitosanglutamat, das von Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norwegen zur Verfügung steht.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines bisher beschriebenen Chitosans für die Herstellung einer intranasalen Hilfsstoff-Zusammensetzung zur Erhöhung der Immunogenizität von Influenzavirus-Antigenen wie z. B. gereinigtem Haemagglutenin und Neuraminidase, wenn diese intranasal verabreicht wird.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt offenbart die Erfindung die Verwendung einer hier beschriebenen Zusammensetzung in einem Verfahren zum Immunisieren eines Empfängers gegen eine Influenza-Infektion, wobei dieses Verfahren das Verabreichen einer Impfstoffzusammensetzung an eine Schleimhautoberfläche des Empfängers (vorzugsweise intranasal) umfasst, wobei die Impfstoffzusammensetzung Influenzavirus-Antigene wie z. B. gereinigte Haemagglutenin- und Neuraminidase-Antigene zusammen mit einer wirksamen Hilfsstoffmenge eines Chitosans, so wie oben definiert, umfasst.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt offenbart die Erfindung die Verwendung einer hier definierten Zusammensetzung in einem Verfahren zur Erhöhung einer schützenden IgA-Schleimhaut-Immunantwort und einer systemischen IgG-Immunantwort durch eine (vorzugsweise intranasale) an eine Schleimhautoberfläche des Patienten erfolgende Verabreichung einer Impfstoffzusammensetzung, die Influenzavirus-Antigene, wie z. B. gereinigtes Haemagglutenin und Neuraminidase und eine wirksame Hilfsstoff- Menge eines Chitosans in der oben definierten Weise umfasst.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt offenbart die Erfindung die Verwendung eines hier definierten Chitosans bei einem Verfahren zur Erhöhung der Immunantwort auf Influenzavirus-Antigene wie z. B. gereinigtes Haemagglutenin und Neuraminidase (d. h. wenn diese intranasal verabreicht werden) durch eine gleichzeitige Verabreichung eines Chitosans in der zuvor definierten Weise.
Die Zusammensetzungen der Erfindung und insbesondere die intranasal zu verabreichenden Zusammensetzungen können als Flüssigkeiten oder trockene Pulver für eine Verabreichung als Aerosole oder Tropfen zubereitet werden.
Zusammensetzungen zur Verabreichung als nasale Tropfen können einen oder mehrere Bestandteile der Art enthalten, wie sie üblicherweise in solchen Zusammensetzungen vorhanden sind, beispielsweise Konservierungsstoffe, Wirkstoffe zur Einstellung der Viskosität, Wirkstoffe zur Einstellung der Tonizität, Pufferwirkstoffe und dergleichen.
Um sicherzustellen, dass das Chitosan in dem wässrigen Medium löslich bleibt, und um auch sicherzustellen, dass das Haemagglutenin nicht durch einen zu saueren pH- Wert nachteilig beeinflusst wird, hat eine Lösung (beispielsweise für die intranasale Verabreichung) vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 6,5, in besonders bevorzugter Weise einen pH-Wert von ungefähr 6.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch das zur Verfügungstellen von Mitteln zur Abgabe von intranasalen Zubereitungen von Influenzavirus-Antigenen wie z. B. gereinigtem Oberflächen-Antigen, und Chitosan. Eine Abgabevorrichtung kann beispielsweise die Form eines Aerosol-Abgabesystems besitzen und kann so ausgebildet sein, dass es nur eine einzige Dosis oder mehrere Dosen abgibt.
Der Impfstoff wird dem Patienten in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um im Patienten eine schützende Immunantwort zu stimulieren. Beispielsweise kann der Impfstoff an Menschen in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden, wobei jede Dosis 1-250 Mikrogramm und besonders bevorzugt 5-50 Mikrogramm Protein enthält, das von jedem Virusstamm zubereitet ist. Wenn beispielsweise Haemagglutenin- und Neuraminidase-Zubereitungen aus drei Virusstämmen zubereitet werden, beispielsweise zweimal Influenza A und einmal Influenza B, könnte die Gesamtdosis von viralem Protein, das verabreicht wird, in der Größenordnung von 15-150 Mikrogramm liegen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Serum-IgG-Antihaemagglutenin-Reaktion bei Mäusen, die mit PSA immunisiert wurden. Jede Säule stellt den geometrisch gemittelten Titer von vier Mäusen dar. Die Fehlerbalken stellen den 1-Standardfehler des Mittelwerts dar. Der Grenzwert beträgt 50, da dies die untere Meßgrenze darstellt.
Fig. 2 zeigt die nasale IgA-Anti-Haemagglutenin-Reaktion bei Mäusen, die mit gereinigtem Oberflächen-Antigen (PSA) immunisiert wurden. Wie in Fig. 1 stellt jede Säule den geometrisch gemittelten Titer von vier Mäusen dar und die Fehlerbalken stellen den 1-Standardfehler des Mittelwerts dar.
Die Fig. 3a und 3b zeigen die Bestimmung von nasalen und pulmonaren Antihaemagglutenin abscheidenden Zellen von Mäusen, die mit gereinigtem Oberflächen-Antigen immunisiert wurden, unter Verwendung von ELISPOT. Fig. 3a verwendet einen logarithmischen Maßstab, während Fig. 3b einen linearen Maßstab verwendet.

BEISPIEL 1

Herstellung einer Zubereitung mit gereinigtem Oberflächen-Influenza-B-Antigen und Chitosanglutamat

1A. Eine Lösung von 1%-igem Chitosanglutamat, einem deacetylierten Chitin mit mittlerer Viskosität, das ungefähr 11% restliche N-Acetyl-Gruppen aufwies, wurde dadurch zubereitet, dass das Chitosanglutamat in 0,8%-igem Natriumchlorid gelöst wurde. Die Sorte des verwendeten Chitosanglutamats war "Sea Cure + 210", das von Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norwegen verfügbar ist.
1B. Gereinigtes Oberflächen-Influenza-Antigen (PSA), das sowohl Influenza-A- als auch Influenza-B-Protein enthielt und von Evans Medical Limited, Speke, Merseyside, Großbritannien unter dem Warenzeichen "Fluvirin" im Handel erhältlich ist, wurde in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung aufbereitet, so dass sich eine Proteinkonzentration von ungefähr 1 mg/ml ergab. Das PSA besteht nahezu vollständig aus dem Spike-Protein Haemagglutenin (HA) obwohl es auch etwas Neuraminidase enthält.
1C. Eine 1 : 1-Mischung der Chitosanglutamat-Lösung und der PSA-Lösung wurde zubereitet, um eine intranasal zu verabreichende Impfstoffzusammensetzung zu ergeben, die 0,5% Chitosanglutamat (zu 11% acetyliert), 0,8% NaCl, 0,1% PSA und Phosphatpuffer enthielt, so dass sich eine Lösung mit einem pH-Wert von 6 ergab.
1D. Kontroll-Lösungen, welche die gleichen PSA-Konzentrationen aber kein Chitosanglutamat enthielten und solche, die die gleichen Konzentrationen von Chitosanglutamat aber kein PSA enthielten, wurden ebenfalls zubereitet. Darüber hinaus wurde eine Zusammensetzung zubereitet, welche die gleiche Konzentration von PSA enthielt, das an den bekannten Hilfsstoff Alhydrogel (Aluminiumhydroxid) adsorbiert war. Das PSA wurde an das Alhydrogel über Nacht bei 4ºC adsorbiert.

BEISPIEL 2

Immunisierungsstudien an Mäusen

2A. Die vier gemäß Beispiel 1 zubereiteten Zusammensetzungen wurden Gruppen von 12 erwachsenen (6-8 Wochen) weiblichen BALB/c-Mäusen in der folgenden Weise verabreicht:
Gruppe 1 20 ul (10 ul pro Nasenloch) PSA/Chitosan-Lösung intranasal verabreicht. PSA-Dosis = 10 ug.
Gruppe 2 20 ul PSA intranasal verabreicht (Gesamt-PSA-Dosis = 10 ug).
Gruppe 3 200 ul PSA/Alhydrogel subkutan verabreicht (PSA-Dosis = 10 ug).
Gruppe 4 20 ul Chitosan-Lösung intranasal verabreicht.
Gruppe 5 20 ul PSA (10 ul pro Nasenloch) täglich 3 Tage lang verabreicht (für diese Untersuchung wurden Gruppen von 4 Mäusen verwendet).
2B. Das Immunisierungsverfahren wurde in monatlichen Intervallen dreimal mit der Ausnahme durchgeführt, dass in Gruppe 5 die Mäuse mit drei aufeinanderfolgenden täglichen Dosen immunisiert wurden. Die Immunisierungs- und Probenentnahme-Vorgehensweise ist in Tabelle 1 dargestellt. Immunisierungs- und Probenentnahme-Regime Tabelle 1
An jedem Probenpunkt wurden vier Mäuse aus jeder Gruppe durch eine Herzpunktierung vollständig ausgeblutet, ihre Köpfe wurden entfernt und ihre Nasengänge mit 1 ml PBS + 1%-igem Bovinserum-Albumin gewaschen. Gruppe 5 umfasste nur vier Mäuse, so dass das Blut durch eine Schwanzpunktierung für die beiden ersten Probenentnahmen erhalten wurde und die Nasenwaschung erst beim dritten Probenentnahmepunkt durchgeführt wurde.

Antikörper-Studien

In allen Studien wurden ganze Influenza-Impfstoffe (WIV) als Antigen verwendet. Obwohl WIV nur ungefähr 50% HA aufweist, wurde angenommen, dass die Untersuchungen primär die Anti-HA-Antikörper maßen. Diese Annahme wurde dadurch bestätigt, dass WIV durch PSA ( 100% HA) ersetzt und einige Untersuchungen wiederholt wurden. Die Ergebnisse waren mit beiden Antigenen ähnlich. Die HA-spezifischen Serum-IgG- und nasalen IgA-Antikörper wurden durch Enzym Linked Immunabsorbant Assey (ELISA) gemessen. Nach einer Hintergrundskorrektur wurden die einzelnen Optische-Dichte-Lösungskurven (OD) aufgetragen und die titrierten Werte ermittelt. Der Titer wurde als die Lösung des Serums ermittelt, die zu einer OD-Ablesung von 0,2 führte oder als die Lösung der Nasenspülung, die zu einer OD-Ablesung von 0,1 führte.
Ebenso wie die Durchführung der Nasenspülung beim dritten Probenpunkt wurden Lymphozyten aus den Schleimhautmembranen des Nasenhohlraums und der Lungen isoliert und die örtliche Immunreaktion durch ELISPOT analysiert.

Ergebnisse

1. Serum-Anti-HA-Serum-Reaktion

Gereinigte Oberflächen-Antigene (Fig. 1 und Tabelle 2)

Wie erwartet, wurde durch die subkutane (S/C) Immunisierung mit PSA + Alhydrogel eine gute Serumsreaktion hervorgerufen. Alle untersuchten Tiere hatten nach der Primärimmunisierung serokonvertiert und der geometrisch gemittelte Titer (GMT) war gut. Die Reaktion stieg nach jeder Verstärkung an, wobei der GMT nach der dritten Dosis sehr hoch war ( 800.000). Im Gegensatz hierzu war die Serumsreaktion auf das nasal allein verabreichte PSA schlecht: Nur zwei der vier Mäuse hatten nach der ersten Do sis serokonvertiert, keine der untersuchten Mäuse hatte nach der zweiten Dosis Serum-HA-Antikörper (hierbei handelte es sich um andere Mäuse als diejenigen, die nach der ersten Immunisierung untersucht wurden) und obwohl alle untersuchten Tiere nach der dritten Dosis serokonvertiert hatten, war der GMT niedriger als der von Tieren, die eine Dosis von PSA + Alhydrogel erhalten hatten. Chitosan erhöhte die Serumsreaktion von intranasal verabreichtem PSA: Nach der dritten Impfung war die Antikörper- Reaktion bei Mäusen, die PSA + Chitosan erhielten, 360 mal stärker als die von Mäusen, die PSA nur I/N erhalten hatten. Die Stärke der Serumsreaktion in den PSA + Chitosan-Mäusen war sehr ähnlich zu der von S/C-immunisierten Mäusen; tatsächlich ergab sich kein statistischer Unterschied in den GMT-Werten der beiden Gruppen an jedem Probeentnahmepunkt (Students t-Test p > 0,01).
Einige Mäuse wurden drei Mal an aufeinanderfolgenden Tagen dadurch immunisiert, dass lediglich PSA intranasal verabreicht wurde, um zu untersuchen, ob diese Vorgehensweise Vorteile gegenüber einer ein Mal pro Monat erfolgenden Immunisierung hatte. Obwohl alle diese Mäuse in dieser Gruppe messbare Serum-Antikörper 21 Tage nach der ersten Dosis aufwiesen und der GMT zu diesem Zeitpunkt höher war als bei Mäusen, die intranasal eine einzige Dosis PSA erhalten hatten, nahm die Anzahl von seropositiven Mäusen während des Verlaufs der Studie ab, obwohl dies der GMT nicht tat (in dieser Gruppe wurden zu jedem Zeitpunkt von den gleichen Mäusen Proben genommen). Am zeitlichen Endpunkt war der GMT der Mäuse unter dem monatlichen Regime um eine Größenordnung höher als bei den Mäusen mit dem täglichen Regime. Tabelle 2 Serums-IgG-Anti-HA-Reaktion in Mäusen, die mit PSA immunisiert wurden
a Anzahl positiv/Anzahl getestet
b geometrisch gemittelter Titer

2. IgA-Anti-HA-Reaktion bei nasaler Spülung

Gereinigtes Oberflächen-Antigen (PSA) (Fig. 2 und Tabelle 3)

Subkutan verabreichtes PSA + Alhydrogel zeigte eine sehr schlechte Induzierung einer nasalen IgA-Reaktion was mit Feststellungen übereinstimmt, die bereits früher von uns und anderen getroffen wurden. Nasal allein verabreichtes PSA war ebenfalls ein schlechtes Schleimhaut-Immunogen obwohl es ausgedrückt in der Anzahl von reagierenden Tieren etwas besser war als die subkutane Immunisierung. Das Hinzufügen von Chitosan verstärkte die IgA-Reaktion sehr stark, obwohl die Reaktion nach der ersten Dosis gering war; eine HA-spezifische IgA konnte bei drei von vier Mäusen festgestellt werden. Die IgA-Reaktion wurde bei diesen Mäusen durch die zweite Immunisierung stark erhöht. Die abschließende Immunisierung hatte einen geringen Effekt; tatsächlich hatten die mittleren spezifischen IgA-Werte geringfügig abgenommen. Tabelle 3 Nasale IgA-Anti-HA-Reaktion bei mit PSA immunisierten Mäusen
a Anzahl positiv/Anzahl getestet
b geometrisch gemittelter Titer

Reaktionen auf Chitosan allein

Die Seren und die Nasenspülungsflüssigkeit bei den allein mit Chitosan immunisierten Kontrollmäusen waren in allen Untersuchungen negativ.

Lokale Reaktion durch Anti-HA-Antikörper abscheidende Zellen (ASC) in nasalen und pulmonaren Geweben

Lymphozyten wurden aus der nasalen Schleimhaut und der Lungenparenchyma von Gruppen von vier Mäusen am dritten Probenentnahmepunkt isoliert. Lymphozyten von einzelnen Mäusen wurden gepoolt und auf Zellen untersucht, die IgA-, IgG- und IgM- Anti-Influenza-Antikörper abschieden, wobei ELISPOT verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3a und 3b dargestellt.
B Zellen, die HA-spezifische Antikörper abschieden, waren in den Nasen- und Lungengeweben aller Gruppen messbar. Es war eine wesentlich größere Anzahl derartiger Zellen in der PSA + Chitosan-Gruppe vorhanden, und dies ergibt sich am deutlichsten, wenn die Ergebnisse auf einem linearen Maßstab aufgetragen werden (Fig. 3b). In allen Fällen mit Ausnahme der subkutan immunisierten Mäuse herrschten IgA-Antikörper abgebende Zellen (ASC) im Nasenhohlraum vor, während entweder IgG oder IgM in den Lungen vorherrschte. Die Stärke der Reaktion ist ähnlich in den Lungen und Nasen von PSA + Chitosan-Mäusen.

Claims

1. Impfstoff-Zusammensetzung, die für eine Verabreichung über die Schleimhaut geeignet ist, wobei die Zusammensetzung ein Influenzavirus-Antigen und eine wirksame Hilfsstoff-Menge Chitosan enthält, wobei das Chitosan ein deacetyliertes Chitin ist, das zumindest zu 80% deacetyliert ist.

2. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Chitosan zumindest zu 85% deacetyliert ist.

3. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der das Chitosan zu 88% bis 90% deacetyliert ist.

4. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die für eine intranasale Verabreichung geeignet ist.

5. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die sowohl Haemagglutenin- und Neuraminidase-Influenzavirus-Antigene enthält.

6. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1, die für eine intranasale Verabreichung geeignet ist, wobei die Zusammensetzung gereinigte Haemagglutenin- und Neuraminidase-Influenzavirus-Antigene und eine wirksame Hilfstoff- Menge Chitosan enthält.

7. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, bei der die Haemagglutenin- und Neuraminidase-Influenzaviren in der Form von Rosetten vorhanden sind, die einen Radius im Bereich von 10 bis 25 Nanometer besitzen.

8. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Chitosan wasserlöslich ist.

9. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 6,5 besitzt.

10. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 9, bei der der pH-Wert ungefähr 6 beträgt.

11. Pharmazeutisches Produkt, das eine Abgabevorrichtung umfaßt, die zur intranasalen Abgabe einer Zusammensetzung geeignet ist, in Kombination mit einer Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

12. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 11, bei der die Abgabevorrichtung ein Aerosol-Abgabesystem ist.