DE69505011T2

DE69505011T2 - Identifizierung von genen verantwortlich für die anpassung von mikroorganismen an eine bestimmte umgebung

Info

Publication number: DE69505011T2
Application number: DE69505011T
Authority: DE
Inventors: David William Holden
Original assignee: Imperial College Innovations Ltd
Current assignee: Emergent Product Development UK Ltd
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-12-11
Publication date: 1999-05-06
Anticipated expiration: 2015-12-12
Also published as: HUT76975A; AU4121996A; KR20040023806A; CN1510137A; SG56084A1; JP4220195B2; KR20050052665A; SG165157A1; KR100445103B1; US6015669A; WO1996017951A2; CN1912141B; CA2206515A1; CA2206515C; NO972468D0; EP1285960A2; ES2126332T3; ES2178101T3; JP2009005688A; PT889120E

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die bei der Anpassung eines Mikroorganismus an seine Umgebung involviert sind, insbesondere zur Identifizierung von Genen, die für die Virulenz eines pathogenen Mikroorganismus verantwortlich sind.

Hintergrund der Erfindung

Antibiotika-Resistenz bei Bakterien und anderen pathogenen Mikroorganismen erlangt zunehmende Bedeutung. Es ist daher wichtig, neue therapeutische Verfahren zu finden, um pathogene Mikroorganismen anzugreifen.
Pathogene Mikroorganismen müssen den Abwehrmechanismus des Wirts umgehen und fähig sein, in einer Umgebung mit schlechtem Nahrungsangebot zu wachsen, um eine Infektion herbeizuführen. Um dies zu tun, ist eine Reihe von "Virulenz "-Genen erforderlich.
Virulenzgene wurden unter Anwendung der klassischen Genetik nachgewiesen, es wurde eine Reihe von Verfahren angewendet, um eine Transposon-Mutagenese für die Identifizierung von bakteriellen Virulenzgenen auszunutzen. Beispielsweise wurden Mutanten nach definierten physiologischen Defekten z. B. der Verlust von durch Eisen gesteuerten Proteinen (Holland et al., 1992) oder in Versuchen zur Untersuchung der Penetration von epithelialen Zellen (Finlay et al., 1988) und beim Überleben in Makrophagen (Fields et al., 1989; Miller et al.; 1989a; Groisman et al., 1989) durchgemustert. Transposon-Mutanten wurden auch auf veränderte Virulenz in lebenden Tierinfektionsmodellen untersucht (Miller et al., 1989b). Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß Gene, die während unterschiedlicher Stufen der Infektion wichtig sind, identifiziert werden können, ist aber durch die Notwendigkeit einen großen Bereich von Mutanten einzeln hinsichtlich einer Veränderung in der Virulenz zu untersuchen, stark eingeschränkt. Miller et al. (1989b) verwendeten Gruppen mit 8 bis 10 Mäusen und infizierten oral 95 getrennte Gruppen mit jeweils mit einer unterschiedlichen Mutanten; sie verwendeten dabei zwischen 760 und 950 Mäuse. Wegen der extrem großen Anzahl von Tieren, die notwendig ist, war ein umfassendes Durchmustern (Screening) eines bakteriellen Genoms nach Virulenzgenen nicht durchführbar.
Vor kurzem wurde ein genetisches System (in vivo- Expressionstechnologie [IVET]) beschrieben, das in positiver Weise Salomella-Gene, die während einer Infektion spezifische induziert werden, selektiert (Mahan et al., 1993). Die Technik soll Gene identifizieren, die in einer besonderen Stufe des Infektionsprozesses exprimiert werden. Allerdings wird sie keine Virulenzgene identifizieren, die posttranskriptional gesteuert werden, und was noch wichtiger ist, sie wird keine Information liefern, ob das Gen (die Gene), das (die) identifiziert wurde(n), tatsächlich für den Infektionsprozeß erforderlich ist (sind) oder daran beteiligt ist (sind).
Lee & Falkow (1994), Methods Enzymol. 236, 531-545 beschreiben ein Verfahren zur Identifizierung von Faktoren, die das Eindringen von Salmonella in Säugetierzellen in vitro beeinflussen, durch Isolierung von hyperinvasiven Mutanten.
Walsh und Cepko (1992) Science 255, 434-440, beschreiben ein Verfahren, das die räumliche Lage von cerebralen kortikalen Elternzellen während der Entwicklung des cerebralen Kortex in der Ratte ausfindig macht. Das Verfahren von Walsh und Cepko verwendet eine Markierung ("tag"), die eine einzige Nukleinsäuresequenz und das lacZ-Gen enthält; allerdings gibt es keine Angabe, daß nützliche Mutanten oder Gene nach ihrem Verfahren nachgewiesen werden könnten.
WO 94/26933 und Smith et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6479-6483 beschreiben Verfahren, die auf die Identifizierung der funktionellen Regionen eines bekannten Gens oder zumindest auf ein DNA-Molekül, für das eine gewisse Sequenzinformation verfügbar ist, abzielen.
Groisman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1033-1037 beschreibt die molekulare funktionelle und evolutionäre Analyse von Sequenzen, die für Salmonella spezifisch sind.
Hensel et al. (1995) Science 269, 400-403 beschreiben die gleichzeitige Identifizierung von bakteriellen Virulenzgenen durch negative Selektion. Diese Abhandlung wurde im Juli 1995 veröffentlicht.
Slauch et al. (1994) Methods in Enzymology 235, 481-492 beschreiben eine in vivo-Expressionstechnologie zur Selektion von bakteriellen Genen, die spezifisch in Wirtsgeweben induziert werden.
Pascopella et al. (1994) Inf. Immun. 62, 1313-1319 beschreiben die Verwendung einer in vivo-Komplementation in Macobacterium tuberculosis, um ein genomisches Fragment, das mit Virulenz assoziiert ist, zu identifizieren.
US 5 397 697 beschreibt die Identifizierung von auf Pflanzen wirkenden Bakteriengenen.
Einige Virulenzgene für pathogene Mikroorganismen wie z. B. Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Yersinia pestis, Shigella flexneri und Listeria monocytogenes sind bereits bekannt, allerdings wurde in allen Fällen nur eine relativ geringe Anzahl der gesamten identifiziert.
Die Erkrankung, die Salmonella typhimurium bei Mäusen verursacht, liefert ein gutes experimentelles Modell für Typhoid-Fieber (Carter & Collins, 1974). Bis dato wurden etwa 42 Gene, die die Salmonella-Virulenz betreffen, identifiziert (Groisman & Ochman, 1994). Diese stellen annähernd ein Drittel der Gesamtzahl der vorhergesagten Virulenzgene dar (Groisman und Saier, 1990).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifizierung von Genen, die bei der Anpassung eines Mikroorganismus an seine Umgebung involviert sind, insbesondere auf eine Identifizierung weiterer Virulenzgene in pathogenen Organismen mit gesteigerter Effizienz. Eine weitere Aufgabe besteht in der Reduzierung der Anzahl von experimentellen Tieren, die bei der Identifizierung von Virulenzgenen verwendet werden.
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines Mikroorganismus mit verminderter Anpassung an eine besondere Umgebung bereit, bei dem folgenden Schritte umfaßt:
(1) eine Vielzahl von Mikroorganismen bereitgestellt wird, die jeweils unabhängig voneinander durch Insertionsinaktivierung eines Gens mit einer Nukleinsäure mit einer einmal vorkommenden Markersequenz mutiert sind, so daß jede Mutante eine unterschiedliche Markersequenz enthält, oder Klone dieser Mikroorganismen,
(2) einzeln aufbewahrte Proben jeder in Schritt (1) hergestellten Mutante und einzeln aufbewahrte Nukleinsäure mit der einmal vorkommenden Markersequenz jeder einzelnen Mutante bereitgestellt werden,
(3) eine Vielzahl der in Schritt (1) gebildeten Mutanten in die besondere Umgebung eingeführt und denjenigen Mikroorganismen, die dazu in der Lage sind, in der Umgebung wachsen gelassen werden,
(4) Mikroorganismen aus der Umgebung der einem ausgewählten Teil davon wiedergewonnen und die Nukleinsäure aus dem wiedergewonnenen Mikroorganismen isoliert wird,
(5) jede der Markersequenzen in der in Schritt (4) isolierten Nukleinsäure mit der einmal vorkommenden Markersequenz jeder der wie in Schritt (2) aufbewahrten einzelnen Mutanten verglichen wird und
(6) eine einzelne Mutante ausgewählt wird, die keine der in Schritt (4) isolierten Markersequenzen enthält,
wobei die besondere Umgebung nicht ein menschlicher Körper ist; oder wobei, wenn die besondere Umgebung ein differen zierter multizellulärer Organismus ist, der Organismus dann ein nicht-menschliches Tier oder eine Pflanze ist.
Somit wendet das Verfahren eine negative Selektion zur Identifizierung von Mikroorganismen mit verminderter Fähigkeit, sich in der Umgebung zu vermehren, an.
Ein Mikroorganismus kann in einer Reihe von unterschiedlichen Umgebungen leben; es ist bekannt, daß besondere Gene und ihre Produkte es dem Mikroorganismus erlauben, sich an eine besondere Umgebung anzupassen. Damit z. B. ein pathogener Mikroorganismus, beispielsweise ein pathogenes Bakterium oder ein pathogener Pilz in seinem Wirt überleben kann, ist das Produkt eines oder mehrerer Virulenzgene erforderlich. Somit ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein Gen eines Mikroorganismus, der es dem Mikroorganismus gestattet, sich an eine besondere Umgebung anzupassen, ein Virulenzgen.
Günstigerweise ist die besondere Umgebung ein differenzierter multizellulärer Organismus, wie z. B. eine Pflanze oder ein nicht-menschliches Tier. Es sind viele Bakterien und Pilze bekannt, die Pflanzen infizieren; sie sind fähig, in der Pflanze zu überleben und verursachen wegen des Vorhandenseins von und der Expression von Virulenzgenen Krankheiten. Wenn die besondere Umgebung eine Pflanze ist, umfassen die Bakterien Agrobacterium tumefaciens, das besonders bei Trauben Tumoren (Pflanzengallen) bildet; Erwinia amylovara; Pseudomonas solanacearum, das in einem weiten Pflanzenbereich ein Welken verursacht; Rhizobium leguminosarum, das eine Erkrankung bei Bohnen verursacht; Xanthomonas campestris p.v. citri, das ein Geschwür bei Citrusfrüchten verursacht; und umfassen die Pilze Magnaporthe grisea, der bei Reis eine Mehltauerkrankung hervorruft; Fusarium spp., der eine Reihe von Pflanzenerkrankungen hervorruft; Erisyphe spp.. Colletotrichum gloeosporiodes; Gaeumannomyces graminis, der Wurzel- und Kronenerkrankungen bei Getreide und Gräsern hervorruft; Glomus spp., Laccaria spp., Leptosphaeria maculans; Phoma tracheiphila; Phytophthora spp., Pyrenophora teres; Verticillium alboatrum und V. dahliae; und Mycosphaerella musicola und M. fijiensis. Wie im Folgenden detaillierter beschrieben wird, ist, wenn der Mikroorganism ein Pilz ist, eine haploide Phase für seinen Lebenszyklus erforderlich.
Entsprechend sind viele Mikroorganismen einschließlich Bakterien, Pilze, Protozone und Trypanosome bekannt, die Tiere, insbesondere Säugetiere einschließlich Menschen infizieren. Ein Überleben des Mikroorganismus in dem Tier und die Fähigkeit des Mikroorganismus, eine Krankheit zu verursachen, beruht zu einem großen Teil auf der Gegenwart von Virulenzgenen und der Expression von Virulenzgenen. Geeignete Bakterien umfassen Bordetella spp., insbesondere B. pertusis, Campylobacter spp., insbesondere C.d jejuni, Clostridium spp., insbesondere C. botulinum, Enterococcus spp., insbesondere E. faecalis, Escherichia spp., insbesondere E. coli, Haemophilus spp., insbesondere H. ducreyi und H. influenzae, Helicobacter spp., insbesondere H. pylori, Klebstella spp., insbesondere K. pneumoniae, Legionella spp., insbesondere L. pneumophila, Listeria spp., insbesondere L. monocytogenes, Mycobacterium spp., insbesondere M. smegmatis und M. tuberculosis, Neisseria spp., insbesondere N. gonorrhoeae und N. meningitidis, Pseudomonas spp., insbesondere PS. aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus spp. insbesondere S. aureus, Streptococcus spp., insbesondere 5. pyogenes und pneumoniae, Vibrio spp. und Yersinia spp., insbesondere Y. pestis. Alle diese Bakterien verursachen eine Erkrankung bei Menschen, und es gibt auch Tiermodelle für diese Erkrankung. Wenn demnach diese Bakterien in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, ist die besondere Umgebung ein Tier, das sie infizieren können und in dem sie eine Erkrankung hervorrufen. Wenn beispielsweise Salmonella typhimurium verwendet wird, um eine Maus zu infizieren, entwickelt die Maus eine Erkrankung, die als Modell für Typhoidfieber bei Menschen dient. Staphylococcus aureus verursacht Bakteriämie und Nierenabszeßbildung bei Mäusen (Alubs et al. (1991) Infect. Immun. 59, 1008-1014) und Endocarditis bei Hasen (Perlman & Freedman (1971) Yale J. Bio. Med. 44, 206-213).
Es ist erforderlich, daß ein Pilz oder ein höherer eukaryotischer Parasit für relevante Abschnitte seines Lebens (z. B. Wachstum in der Umgebung) haploid ist. Vorzugsweise ist ein integratives Transformationssystem mit DNA als Vermittler verfügbar, und wenn der Mikroorganismus ein für den Menschen pathogener Mikroorganismus ist, ist günstigerweise ein Tiermodell für die menschliche Erkrankung verfügbar. Geeignete Pilze, die für Menschen pathogen sind, umfassen bestimmte Aspergillus spp. (z. B. A. fumigatus), Cryptococcus neoformans und Histoplasma capsulatum. Die oben genannten Pilze haben ganz klar eine haploide Phase; für sie sind integrative Transformationssysteme mit DNA als Vermittler verfügbar. Es kann auch Toxoplasma verwendet werden, der ein Parasit mit haploider Phase während der Infektion ist. Bakterien haben ein haploides Genom.
Tiermodelle für menschliche Erkrankungen sind oft verfügbar, wobei das Tier eine Maus, eine Ratte, ein Hase, ein Hund oder ein Affe ist. Vorzugsweise ist das Tier eine Maus. Virulenzgene, die nach dem erfindungsgemäßen Ver fahren unter Verwendung eines Tiermodells für eine menschliche Erkrankung nachgewiesen wurden, sind in deutlicher Weise den Genen, die die Virulenz des Mikroorganismus bei Menschen bestimmen, sehr ähnlich.
Besonders bevorzugte Mikroorganismen zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung sind Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa und Aspergillus fumigatus.
Nachfolgend wird eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beschrieben.
Eine Nukleinsäure mit einer einmal vorkommenden Markersequenz wird folgendermaßen hergestellt. Es wird ein Komplexpool aus Markierungen ("tags") aus doppelsträngigen DNA-Sequenzen unter Anwendung der Oligonukleotid-Synthese und einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gebildet. Jede DNA-Markierung hat eine einmal vorkommende Sequenz von zwischen etwa 20 und 80 bp, vorzugsweise etwa 40 bp, die von "Armen" mit etwa 15 bis 30 bp, vorzugsweise etwa 20 bp flankiert wird, die für alle Markierungen ("tags") gewöhnlich sind. Die Anzahl der bp in der einmal vorkommenden Sequenz ist ausreichend, um eine große Anzahl (z. B. > 10¹&sup0;) einmal vorkommender Sequenzen durch statistische Oligonukleotid-Synthese bilden zu lassen, aber nicht zu groß, um die Bildung von Sekundärstrukturen zuzulassen, die mit einer PCR in Wechselwirkung treten können. Entsprechend sollte die Länge der Arme ausreichend sein, um ein wirksames Starten (Priming) der Oligonukleotide in einer PCR zu gestatten.
Es ist bekannt, daß die Sequenz am 5'-Ende des Oligonukleotids nicht der Zielsequenz, die amplifiziert werden soll, entsprechen muß.
Es ist üblich, daß die PCR-Primer untereinander keine Komplementärstrukturen enthalten, die länger 2 Basen sind, speziell an ihren 3'-Enden, da dieses Merkmal die Bildung eines künstlichen Produktes, des sogenannten "Primerdimeren" fördern kann. Wenn die 3'-Enden der zwei Primer hybridisieren, bilden sie einen "primed template"-Komplex; eine Primerextension führt zu einem kurzen Doppelprodukt, das "Primerdimeres" genannt wird.
In Primern sollte eine interne Sekundärstruktur vermieden werden. Für eine symmetrische PCR wird für beide Primer ein Gehalt von 40~bis 60% GC empfohlen, ohne lange Ausdehnung einer beliebigen Base. Die klassischen Schmelztemperaturberechnungen, die in Verbindung mit DNA-Sonden-Hybridisierungsuntersuchungen verwendet werden, sagen oft voraus, daß ein gegebener Primer bei einer spezifischen Temperatur schmelzen soll oder daß die Extensionstemperatur von 72ºC das Primer/Templat-Hybrid vorzeitig dissoziieren wird. In der Praxis sind die Hybride in dem PCR-Verfahren wirksamer als im allgemeinen durch einfache Tm-Berechnungen vorhergesagt wird.
Die optimalen Reassoziationstemperaturen können empirisch bestimmt werden und können höher sein als vorhergesagt. Taq-DNA-Polymerase zeigt im Bereich von 37 bis 55ºC Aktivität, so daß eine Primerextension während des Erwärmungsschritts auftreten wird und das Hybrid stabilisiert werden wird. Die Konzentrationen der Primer sind in einer herkömmlichen (symmetrischen) PCR gleich und liegen typischerweise im Bereich von 0,1 bis 1 uM.
Die "Markierungen" (tags) werden in einem Transposon oder transposonartigen Element gebunden, wobei die Nukleinsäure mit einer einmal vorkommenden Markersequenz gebildet wird. Vorteilhafterweise wird das Transposon auf einem Suicide- Vektor getragen, der als Plasmid in einem "Helfer"-Organismus gehalten wird, der aber nach einem Transferieren auf den Mikroorganismus des erfindungsgemäßen Verfahrens verlorengeht. Beispielsweise kann der "Helfer"-Organismus ein Stamm von Escherichia coli sein, kann der Mikroorganismus des Verfahrens Salmonella sein und ist der Transfer ein konjugaler Transfer. Obgleich das Transposon nach dem Transfer verloren sein kann, macht es bei einem Teil der Zellen eine Transposition durch, durch welche es sich statistisch zusammen mit seiner einmal vorkommenden Markierung in das Genom des Mikroorganismus, der in dem Verfahren eingesetzt wird, einbaut. Es ist am günstigsten, wenn das Transposon oder das transposonartige Element selektiert werden kann. Im Fall von Salmonella kann beispielsweise ein Kanamycin-Resistenzgen in dem Transposon vorhanden sein, und die Exkonjuganten werden auf einem Kanamycin enthaltenden Medium selektiert. Es ist auch möglich, einen auxotrophen Marker in der Empfängerzelle mit einem funktionellen Gen in der Nukleinsäure mit dem einmal vorkommenden Marker zu ergänzen. Dieses Verfahren ist insbesondere geeignet, wenn in dem Verfahren Pilze verwendet werden.
Vorzugsweise stammt das ergänzende funktionelle Gen nicht aus derselben Art wie der Empfänger-Mikroorganismus; anderenfalls kann ein nicht-statistischer Einbau erfolgen.
Es ist auch besonders günstig, wenn das Transposon oder das transposonartige Element auf einem Vektor getragen wird, welcher episomal (d. h. nicht als Teil des Chromosoms) in dem Mikroorganismus gehalten wird, welcher in dem Verfahren nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet wird, so lange er sich unter den ersten gegebenen Bedingungen befindet, während bei Änderung der Bedingungen in zweite Bedingungen das Episom nicht aufrecht erhalten werden kann, was die Selektion einer Zelle erlaubt, in der das Transposon oder transposonartige Element einen Transpositionsprozeß durchgemacht hat, durch den es sich statistisch, zusammen mit seinem einmal vorkommenden Marker in das Genom des Mikroorganismus, der in dem Verfahren verwendet wird, integriert. Diese besonders vorteilhafte Ausführungsform ist dadurch günstig, daß, sobald ein Mikroorganismus, der den episomalen Vektor trägt, hergestellt ist, der Transpositionsvorgang jedesmal zur Änderung des Zustandes des; Mikroorganismus (oder eines Klons davon) aus einem ersten gegebenen Zustand in einen zweiten gegebenen Zustand selektiert wird oder dadurch induziert wird, wobei sich das Transposon an verschiedener Stelle im Genom des Mikroorganismus integrieren kann. Wenn auf diese Weise einmal eine Hauptsammlung von Mikroorganismen produziert wurde, aus der jeder eine einmal vorkommende Markersequenz in dem Transposon oder transposonartigen Element, das auf dem episomalen Vektor (in einem ersten gegebenen Zustand) trägt, kann diese wiederholt zur Bildung von Pool aus Mutanten mit statistischer Insertion, von denen jede eine verschiedene Markersequenz (d. h. in dem Pool einmal vorkommend) enthält, verwendet werden. Diese Ausführungsform ist besonders nützlich, da sie (a) die Anzahl und Komplexität von Manipulationen reduziert, die notwendig sind, um die Pluralität ("Pool") von unabhängig mutierten Mikroorganismen nach Schritt (1) des Verfahrens zu bilden; (b) die Anzahl verschiedener Marker nur dieselbe zu sein braucht wie die Anzahl der Mikroorganismen bei der Vielzahl von Mikroorganismen in Schritt (1) des Verfahrens. Punkt (a) macht es leichter, das Verfahren bei Organismen zu verwenden, für die eine Transposon-Mutagenese schwieriger durchzuführen ist (z. B. Staphylococcus aureus), und Punkt (b) bedeutet, daß Markersequenzen mit besonders guten Hybridisierungscharakteristika selektiert werden können, was die Qualitätskontrolle einfacher macht. Wie nachfolgend näher beschrieben wird, ist die Pool-Größe vorteilhafterweise etwa 100 oder 200 unabhängig mutierte Mikroorganismen; daher wird die Hauptsammlung der Mikroorganismen vorteilhafterweise in ein oder zwei Mikrotiterplatten mit je 96 Vertiefungen aufbewahrt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die ersten vorgegebenen Bedingungen eine erste besondere Temperatur oder ein erster Temperaturbereich, z. B. 25ºC bis 32ºC, am günstigsten etwa 30ºC, und die zweiten vorgegebenen Bedingungen eine zweite besondere Temperatur oder ein zweiter Temperaturbereich, z. B. 35ºC bis 45ºC, am günstigsten 42ºC. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind die ersten vorgegebenen Bedingungen das Vorliegen eines Antibiotikums, z. B. Streptomycin, und die zweiten vorgegebenen Bedingungen die Abwesenheit des Antibiotikums; oder aber die ersten vorgegebenen Bedingungen sind die Abwesenheit eines Antibiotikums und die zweiten vorgegebenen Bedingungen sind das Vorliegen des Antibiotikums.
Transposons, die zur Integration in das Genom von Gramnegativen Bakterien geeignet sind, umfassen Tn5, Tn10 und Derivate davon. Transposons, die zur Integration in das Genom von Gram-positiven Bakterien geeignet sind, umfassen Tn916 und Derivate oder Analoga davon. Transposons, die in besonderer Weise zur Verwendung mit Staphylococcus aureus geeignet sind, umfassen Tn917 (Cheung et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6462-6466) und Tn918 (Albus et al. (1991) Infect. Immun. 59, 1008-1014).
Es ist besonders bevorzugt, wenn die Transposons die Eigenschaften der Tn917-Derivate, die von Camilli et al. in (1990) J. Bacteriol. 172, 3738-3744 beschrieben werden, haben und von einem temperaturempfindlichen Vektor, z. B. pE194Ts (Villafane et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 4822-4829) getragen werden.
Es soll betont werden, daß, obgleich Transposone zur Inaktivierung eines Gens durch Insertion günstig sind, ein beliebiges anderes bekanntes Verfahren angewendet werden kann. Ein weiteres geeignetes Verfahren zur Inaktivierung eines Gens durch Insertion, insbesondere in bestimmten Bakterien wie Streptococcus, besteht in der Verwendung einer Insertions-Duplikations-Mutagenese wie die, die von Morrison et al. (1984) J. Bacteriol 159, 870 in bezug auf S. pneumoniae beschrieben wird. Das allgemeine Verfahren kann auch auf andere Mikroorganismen, speziell Bakterien angewendet werden.
Für Pilze werden Insertionsmutationen durch Transformation unter Verwendung DNA-Fragmenten oder Plasmiden, die die "Marker" tragen, und vorzugsweise selektierbaren Markern, die z. B. Resistenz gegenüber Hygromycin B oder Phleomycin kodieren, durchgeführt (siehe Smith et al. (1994) Infect. Immunol. 62, 5247-5254). Ein statistischer, einfacher Einbau von DNA-Fragmenten, die Hygromycin B-Resistenz kodieren, in das Genom fadenförmiger Pilze unter Anwendung eines durch Restriktionsenzym vermittelten Einbaus ist bekannt (REMI; Schiestl & Petes (1991); Lu et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Scie. USA 91, 12649-12653).
Eine einfache Technik der Insertionsmutagenese für einen Pilz wird bei Schiestl & Petes (1994) beschrieben und umfaßt beispielsweise die Verwendung von Ty-Elementen und ribosomaler DNA in Hefe.
Ein statistischer Einbau des Transposons oder einer anderen DNA-Sequenz erlaubt eine Isolierung einer Vielzahl von unabhängig voneinander mutierten Mikroorganismen, wobei ein unterschiedliches Gen in jeder Mutante durch Insertion inaktiviert ist und jede Mutante eine unterschiedliche Markersequenz enthält.
Eine Bibliothek aus solchen Insertionsmutanten ist in Mikrotiterplatten mit Vertiefungen so geordnet, daß jede Vertiefung einen verschiedenen Mutanten-Mikroorganismus enthält. DNA mit der einmal vorkommenden Markersequenz wird aus jedem einzelnen Mutanten-Mikroorganismus aufbewahrt (vorteilhafterweise wird die gesamte DNA aus dem Klon verwendet). Geeigneterweise erfolgt dies, indem eine Probe des Mikroorganismus aus der Mikrotiterschale entnommen wird, sie auf eine Nukleinsäure-Hybridisierungs-Membran (z. B. Nitrocellulose- oder Nylon-Membranen) aufgetragen wird, der Mikroorganismus in Alkali aufgelöst wird und die Nukleinsäure an der Membran fixiert wird. Auf diese Weise wird eine Replik der Inhalte der Mikrotiterplatten mit Vertiefungen hergestellt.
Es werden Pools aus den Mikroorganismen aus der Mikrotiterplatte mit Vertiefungen hergestellt und die DNA extrahiert. Diese DNA wird als Target für eine PCR unter Verwendung von Primern verwendet, welche sich an die gewöhnlichen "Arme", die die "Marker" flankieren, anfügen; dann wird die amplifizierte DNA markiert, z. B. mit 33P. Das Produkt der PCR wird verwendet, um die von jeder einzelnen Mutanten aufbe wahrte DNA zu untersuchen, wobei ein Referenzhybridisierungsmuster für die Replikas der Mikrotiterplatten mit Vertiefungen bereitgestellt wird. Dies ist eine Prüfung, ob jeder der einzelnen Organismen tatsächlich eine Markersequenz enthält und ob die Markersequenz amplifiziert und wirksam markiert werden kann.
Es werden Pools von Transposonmutanten hergestellt, um sie in die besondere Umgebung einzuführen. Günstigerweise werden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verwendet; die Pools umfassen 96 Transposorunutanten. Die Untergrenze für den Pool sind zwei Mutanten: es gibt keine theoretische Obergrenze für die Größe des Pools, aber, wie oben diskutiert wurde, kann die Obergrenze hinsichtlich der Umgebung, in die die Mutanten eingeführt werden, festgelegt werden.
Sobald die Mikroorganismen in die besondere Umgebung eingeführt sind, werden jene Organismen, die dazu fähig sind, in der Umgebung wachsen gelassen. Die Zeitdauer, für die Mikroorganismen in der Umgebung gelassen werden, wird durch die Natur des Mikroorganismus und die Umgebung bestimmt. Nach einer geeigneten Zeit werden die Mikroorganismen aus der Umgebung entfernt, die DNA wird extrahiert und die DNA wird als Schablone für eine PCR unter Verwendung von Primern, die sich an die "Arme", die die "Marker" flankieren, anfügen, verwendet. Das PCR-Produkt wird beispielsweise mit 32P markiert und wird verwendet, um die DNA zu untersuchen, die von jeder einzelnen Mutante, welche aus der Mikrotiterplatte mit Vertiefungen repliziert wurde, aufbewahrt wurde. Aufbewahrte DNA werden dadurch identifiziert, ob sie schwach oder überhaupt nicht mit der Sonde hybridisieren, die aus der DNA isoliert wird, welche aus den aus der Umgebung zurückgewonnenen Mikroorganismen isoliert wird. Diese nicht-hybridisierenden DNAs entsprechen Mutanten, deren Anpassung an die besondere Umgebung durch Insertion des Transposons oder einer anderen DNA-Sequenz vermindert wurde.
In einer besonderen Ausführungsform haben die "Arme" im Vergleich zu den "Markern" keine oder sehr geringe Kennzeichnung. Die PCR-Primer sind z. B. geeigneterweise so aufgebaut, daß sie keinen oder einen einzigen G-Rest enthalten, das mit 32P markierte Nukleotid dCTP ist; in diesem Fall ist kein oder ein radioaktiv markierter C-Rest in jeden "Arm" eingebaut, aber eine große Anzahl von radioaktiv markierten C-Resten ist in den "Marker" eingebaut. Vorzugsweise hat der "Marker" eine mindestens 10-mal höhere, vorzugsweise 20-mal höhere, bevorzugter 50-mal höhere Kennzeichnung eingebaut als die "Arme". Die "Arme" können geeigneterweise aus dem "Marker" entfernt werden, indem ein geeignetes Restriktionsenzym verwendet wird, für das eine Stelle im Primeraufbau eingebaut sein kann.
Wie oben diskutiert wurde, liegt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung vor, wenn der Mikroorganismus ein pathogener Mikroorganismus ist und die besondere Umgebung ein Tier ist. In dieser Ausführungsform wird die Größe des Mutanten-Pools, der in das Tier eingeführt wird, durch (a) die Anzahl der Zellen jeder Mutante, die voraussichtlich in dem Tier überlebt (unter der Annahme, daß kein Virulenzgen inaktiviert wurde) und (b) das Gesamtimpfmaterial des Mikroorganismus bestimmt. Wenn die Anzahl in (a) zu niedrig ist, können falsche positive Resultate entstehen, und wenn die Anzahl (b) zu hoch ist, dann kann das Tier sterben, bevor genug Mutanten eine Chance hatten, in der gewünschten Weise zu wachsen. Die Anzahl der Zellen (a) kann für jeden verwendeten Mikroorganismus bestimmt werden, ist aber vorzugsweise mehr als 50, bevorzugter mehr als 100.
Die Anzahl an unterschiedlichen Mutanten, die in ein einziges Tier eingeführt werden kann, liegt vorzugsweise zwischen 50 und 500 und ist günstigerweise etwa 100. Es ist bevorzugt, wenn das Gesamtimpfmaterial 106 Zellen (vorzugsweise 105 Zellen) nicht übersteigt, obgleich die Menge des Impfmaterials in Abhängigkeit von dem Mikroorganismus und dem Tier über oder unter diese Menge verändert werden kann.
In einem besonders günstigen Verfahren wird ein Impfmaterial mit 105, das je 1000 Zellen von 100 verschiedenen Mutanten enthält, für ein einziges Tier verwendet. Es soll betont werden, daß in diesem Verfahren ein Tier verwendet werden kann, um 100 Mutanten durchzumustern; im Vergleich dazu benötigen Verfahren des Standes der Technik mindestens 100 Tiere, um 100 Mutanten durchzumustern.
Allerdings ist es zweckdienlich, drei Tiere mit demselben Pool von Mutanten zu impfen, so daß mindestens zwei untersucht werden können (einer als eine Replika, um die Zuverlässigkeit des Verfahrens zu untersuchen), wohingegen das dritte als Reserve gehalten wird. Dennoch liefert das Verfahren noch eine mehr als 30-fache Einsparung bei der Anzahl der verwendeten Tiere.
Die Zeit von dem Zeitpunkt, an dem der Pool an Mutanten in das Tier eingeführt wird und dem Zeitpunkt, an dem die Mikroorganismen wiedergewonnen werden, kann in Abhängigkeit von dem Mikroorganismus und dem verwendeten Tier variieren. Wenn z. B. das Tier eine Maus ist und der Mikroorganismus Salmonella typhimurium ist, beträgt die Zeit zwischen Inokulation und Rückgewinnung etwa drei Tage.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Mikroorganismen in Schritt (5) an einer Stelle aus der Umgebung wiedergewonnen, die von der Einführungsstelle in Schritt (4) ziemlich weit entfernt ist, so daß die Virulenzgene, die untersucht werden, die einschließen, die in der Spanne des Mikroorganismus zwischen den beiden Stellen liegen.
So kann der Mikroorganismus beispielsweise in eine Pflanze an einer Läsion im Stamm oder an einer Stelle an einem Blatt eingeführt werden und der Mikroorganismus dann an einer anderen Stelle an dem Blatt, wo der Erkrankungszustand angezeigt ist, wiedergewonnen werden.
Im Fall eines Tiers kann der Mikroorganismus oral, intraperitoneal, intravenös oder intranasal eingeführt werden und wird zur einem späteren Zeitpunkt aus einem inneren Organ, z. B. der Milz, wiedergewonnen. Es kann nützlich sein, die bei oraler Verabreichung identifizierten Virulenzgene und die bei intraperitonealer Verabreichung identifizierten Gene zu vergleichen, da einige Gene notwendig sein können, um eine Infektion auf einem Weg, aber nicht auf dem anderen hervorzurufen. Salmonella wird vorzugsweise intraperitoneal eingeführt.
Weitere bevorzugte Umgebungen, die zur Identifizierung von Virulenzgenen verwendet werden können, sind Tierzellen in. Kultur (insbesondere Makrophagen und epitheliale Zellen) sowie Pflanzenzellen in Kultur. Obgleich eine Verwendung von Zellen in Kultur auf ihre eigene Weise nützlich ist, wird die Verwendung der ganzen Tiers oder der ganzen Pflanze als Umgebung, je nach Fall, ergänzend sein.
Bevorzugt ist es auch, wenn die Umgebung ein Teil des Tierkörpers ist. Innerhalb einer vorgegebenen Wirt-Parasit- Wechselwirkung ist eine Reihe verschiedener Umgebungen möglich, einschließlich verschiedener Organe und Gewebe sowie Teile davon wie z. B. der Peyer-Lappen.
Die Anzahl der einzelnen Mikroorganismen (d. h. Zellen), die aus der Umgebung wiedergewonnen werden, sollte mindestens die zweifache, vorzugsweise mindestens die zehnfache, bevorzugt mindestens die 100-fache Anzahl der verschiedenen Mutanten, die in die Umgebung eingeführt wurden, sein. Wenn beispielsweise ein Tier mit 100 verschiedenen Mutanten geimpft wird, sollten etwa 10 000 einzelne Mikroorganismen wiedergewonnen und deren Marker-DNA isoliert werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfaßt die folgenden Schritte:
(1A) Entfernung von Auxotrophen aus der Vielzahl von Mutanten, die in Schritt (1) produziert werden; oder
(6A) Bestimmen, ob die in Schritt (6) selektierte Mutante eine auxotrophe Mutante ist; oder
beide Schritte (1A) und (6A).
Es ist wünschenswert, einen auxotrophen (das ist ein Mutanten-Mikroorganismus, der Wachstumsfaktoren benötigt, die von dem Wildtyp oder von Prototrophen nicht benötigt werden) und einen Mutanten-Mikroorganismus zu unterscheiden, wobei ein Gen, das den Mikroorganismus sich an eine besondere Umgebung anpassen läßt, inaktiviert wird. Günstigerweise wird dies zwischen den Schritten (a) und (2) oder nach Schritt (6) getan.
Auxotrophe werden vorzugsweise nicht entfernt, wenn Virulenzgene identifiziert werden.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines Gens, das einem Mikroorganismus die Anpassung an eine besondere Umgebung gestattet, bereit, wobei das Verfahren das Verfahren nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt, an das sich der folgende zusätzliche Schritt anschließt:
(7) Isolieren des durch Insertion inaktivierten Gens oder eines Teils davon aus der in Schritt (6) ausgewählten einzelnen Mutante.
Verfahren zur Isolierung eines Gens, das einen einmal vorkommenden Marker enthält, sind auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfaßt den weiteren zusätzlichen Schritt:
(8) Isolieren des entsprechenden Wildtyp-Gens aus einem Wildtyp-Mikroorganismus unter Verwendung des in Schritt (7) isolierten, durch Insertion inaktivierten Gens oder eines Teils davon als Sonde.
Verfahren zur Gen-Sondierung sind auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt.
Molekularbiologische Verfahren, die zur Verwendung bei der Druchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden von Sambrook et al. (1989) offenbart.
Wenn der Mikroorganismus ein für Tiere pathogener Mikroorganismus ist, das Gen ein Virulenzgen ist und ein Transposon verwendet wurde, um das Gen durch Insertion zu inaktivieren, ist es günstig, die Virulenzgene zu klonen, indem genomische DNA aus der in Schritt (6) ausgewählten einzelnen Mutante mit einem Restriktionsenzym, das außerhalb des Transposons schneidet, verdaut wird; die nach Größe fraktionierte DNA, die das Transposon enthält, in einem Plasmid gebunden wird; und Plasmidrekombinanten auf der Basis von Antibiotikaresistenz, die durch das Transposon und nicht durch das Plasmid verliehen wird, ausgewählt (selektiert) werden. Die genomische DNA des Mikroorganismus, die dem Transposon benachbart ist, wird sequenziert, wobei zwei Primer, die an den terminalen Regionen des Transposons renaturieren, und zwei Primer, die in der Nähe der Polylinkersequenzen des Plasmids renaturieren, verwendet werden. Die Sequenzen können DNA-Datenbasis-Untersuchungen unterworfen werden, um festzustellen, ob das Transposon ein bekanntes Virulenzgen unterbrochen hat. Günstigerweise wird so eine nach diesem Verfahren erhaltene Sequenz mit den Sequenzen verglichen, die in den öffentlich zugänglichen Datenbasen, z. B. EMBL und Gen-Bank, vorhanden sind. Wenn die unterbrochene Sequenz in einem neuen Virulenzgen aufzutreten scheint, wird schließlich die Mutation zu einem neuen genetischen Hintergrund transferiert (im Fall von Salmonella z. B. durch eine durch Phage P22 vermittelte Transduktion); es wird der LD&sub5;&sub0; des Mutantenstamms bestimmt, um zu bestätigen, daß der nicht virulente Phänotyp auf dem Transpositionsvorgang und nicht auf einer sekundären Mutation beruht.
Die Anzahl von einzelnen Mutanten, die durchgemustert werden, um alle Virulenzgene in einem Mikroorganismus nachzuweisen, hängt von der Anzahl der Gene in dem Genom des Mikroorganismus ab. Es ist z. B. wahrscheinlich, daß 3000 bis 5000 Mutanten von Salmonella typhimurium durchgemustert werden müssen, um die Mehrheit der Virulenzgene nachzuweisen, wohingegen für Aspergillus spp., das ein größeres Genom als Salmonella hat, etwa 20 000 Mutanten durchgemustert werden. Es wird angenommen, daß etwa 4% nicht essentielle S. typhimurium-Gene für Virulenz benötigt werden (Grossman & Saier, 1990), und wenn das so ist, enthält das S. typhimurium-Genom etwa 150 Virulenzgene. Allerdings liefern die Verfahren der vorliegenden Erfindung einen schnelleren, bequemeren und besseren Weg zur Identifizierung von Virulenzgenen.
Es ist ein Mikroorganismus verwendbar, der nach dem Verfahren des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung erhalten wird. Derartige Mikroorganismen sind nützlich, da sie die Eigenschaft haben, zum Überleben in einer besonderen Umgebung nicht angepaßt zu sein.
Ein pathogener Mikroorganismus kann nicht angepaßt werden, um in einem Wirtsorganismus (Umgebung) zu überleben, und im Fall eines Mikroorganismus, der für Tiere, insbesondere Säugetiere, insbesondere Menschen pathogen ist, kann die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Mutante in einem Impfstoff verwendet werden. Die Mutante ist nicht virulent und daher wird erwartet, daß sie zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist; allerdings wird erwartet, daß sie antigen ist und zu einer Steigerung einer protektiven Immunreaktion führt.
Der pathogene Mikroorganismus, der nicht zum Überleben in einem Wirtsorganismus angepaßt ist und der nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann modifiziert werden, und zwar vorzugsweise durch die Einführung einer geeigneten DNA-Sequenz, um ein antigenes Epitop aus einem anderen pathogenen Organismus zu exprimieren. Dieser modifizierte Mikroorganismus kann als Impfstoff für jenen anderen pathogenen Organismus wirken.
Es ist auch ein Mikroorganismus verwendbar, der eine Mutation in einem Gen aufweist, welches unter Anwendung des Verfahrens nach dem zweiten Aspekt der Erfindung identifiziert wird.
Obgleich ein Mikroorganismus, der unter Anwendung des Verfahrens nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung erhalten wird, nützlich ist, ist es vorteilhaft, wenn eine Mutation spezifisch in das identifizierte Gen eingeführt wird. Insbesondere wenn der Mikroorganismus in einem Impfstoff verwendet werden soll, kann die Mutation in dem Gen eine Deletion oder eine Rasterverschiebungsmutation oder eine beliebige andere Mutation sein, die im wesentlichen nicht mehr rückgängig gemacht werden kann. Solche genspezifischen Mutationen können unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, z. B. Einführen einer Kopie des Mutantengens an einem autonomen Replikon (z. B. ein Plasmid oder virales Genom) und Vertrauen auf eine homologe Rekombination zur Einführung der Mutation in die Kopie des Gens im Genom des Mikroorganismus.
Ein geeigneter Mikroorganismus kann in einem Impfstoff verwendet werden; ein Impfstoff kann einen geeigneten Mikroorganismus und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Der geeignete Mikroorganismus ist die vorstehend genannte nicht-virulante Mutante.
Eine aktive Immunisierung des Patienten ist bevorzugt. In diesem Verfahren werden eine oder mehrere mutante Mikroorganismen in einer immunogenen Formulierung, die geeignete Adjuvantien und Trägerstoffe enthält, hergestellt und auf bekannten Wegen dem Patienten verabreicht. Geeignete Adjuvantien umfassen Freunds vollständiges oder unvollständiges Adjuvans, Muramyldipeptid, die "Iscoms" aus EP 109 942, EP 180 564 und EP 231 039, Aluminiumhydroxid, Saponin, DEAE-Dextran, neutrale Öle (z. B. Miglyol), pflanzliche Öle (z. B. Erdnußöl), Liposome, Pluronic-Polyole oder das Ribi-Adjuvans-System (sie z. B. GB-A-2 198 141). "Pluronic" ist ein eingetragenes Warenzeichen. Der Patient, der immunisiert werden soll, ist ein Patient, der vor der Erkrankung, die durch die virulente Form des Mikroorganismus hervorgerufen wird, geschützt werden soll.
Der vorstehend genannte, nicht-virulente Mikroorganismus, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, oder eine Formulierung davon kann nach einem beliebigen herkömmlichen Verfahren, das eine orale Verabreichung und eine parenterale (z. B. subkutane oder intramuskuläre) Injektion einschließt, verabreicht werden. Die Behandlung kann aus einer einzigen Dosis oder einer Vielzahl von Dosen über einen gewissen Zeitraum bestehen.
Obgleich es möglich ist, daß ein nicht-virulenter Mikroorganismus, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, allein verabreicht wird, ist es vorteilhaft, daß er als pharmazeutische Formulierung zusammen mit einem oder mehreren akzeptablen Trägern vorliegt. Der Träger (die Träger) müssen "akzeptabel" sein, d. h. mit dem nichtvirulenten Mikroorganismus, der nach dem ersten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird, verträglich sein und für die Empfänger nicht schädlich sein. Typischer weise werden die Träger Wasser oder Salzlösung sein, welche steril und pyrogenfrei sein sollen.
Es ist erkennbar, daß der Impfstoff in Abhängigkeit von seiner Mikroorganismus-Komponente auf den Gebieten der Humanmedizin und Veterinärmedizin verwendbar sein kann.
Erkrankungen, die durch Mikroorganismen verursacht werden, sind bei vielen Tieren, z. B. Haustieren bekannt. Wenn die Impfstoffe einen geeigneten nicht-virulenten Mikroorganismus, insbesondere ein nicht-virulentes Bakterium enthalten, sind sie bei Menschen aber auch z. B. bei Kühen, Schafen, Schweinen, Pferden, Hunden und Katzen sowie bei Geflügel wie z. B. Hühnern, Truthähnen, Enten und Gänsen anwendbar.
Verwendbar sind auch ein Gen, das nach dem Verfahren des zweiten Aspektes der Erfindung erhalten wird, und ein Polypeptid, das dadurch kodiert wird.
Durch den Ausdruck "Gen" schließen wir nicht nur die DNA- Regionen ein, die ein Polypeptid kodieren, sondern auch steuernde Regionen von DNA, z. B. DNA-Regionen, die Transkription, Translation und bei einigen Organismen Spleißen von RNA steuern. Somit umfaßt das Gen Promotoren, Transkriptionsterminatoren, Ribosom-Bindungssequenzen und für einige Organismen Introns und Spleiß-Erkennungsstellen.
Typischerweise wird eine Sequenzinformation des inaktivierten Gens, das in Schritt 7 erhalten wird, abgeleitet. Günstigerweise werden Sequenzen in der Nähe der Enden des Transposons als Hybridisierungsstelle eines sequenzierenden Primers verwendet. Die abgeleitete Sequenz oder ein DNA- Restriktionsfragment, das in Nachbarschaft zu dem inaktivierten Gen selbst ist, wird zur Herstellung einer Hybridi sierungssonde verwendet, mit der das entsprechende Wildtyp- Gen identifiziert und aus einem Wildtyp-Organismus isoliert wird.
Vorzugsweise wird die Hybridisierungssondierung unter strengen Bedingungen durchgeführt, um sicherzustellen, daß das Gen und nicht ein verwandtes Gen erhalten wird. Mit "strengen" meinen wir, daß das Gen mit der Sonde hybridisiert, wenn das Gen an einer Membran immobilisiert ist und die Sonde (in diesem Fall > 200 Nukleotide in der Länge ist) in Lösung ist und immobilisiertes Genhybridisierte Sonde 10 min in 0,1 · SSC bei 65ºC gewaschen wird. SSC ist 0,15 M NaCl/0,015 M Na-Citrat.
Bevorzugte Sondensequenzen zum Klonen von Salmonella- Virulenzgenen sind in den Fig. 5 und 6 dargestellt und werden in Beispiel 2 beschrieben.
Bestimmte Salmonella-Virulenzgene enthalten die in den Fig. 5 und 6 dargestellte Sequenz und werden in Beispiel 2 beschrieben.
Die Gene können jene sein, die in den Sequenzen, die in den Fig. 11 und 12 dargestellt sind, enthalten sind oder von denen mindestens ein Teil in den Sequenzen, die in den Fig. 11 und 12 dargestellt sind, enthalten ist, und die durch das Verfahren nach dem zweiten Aspekt der Erfindung identifiziert wurden. Die in den Fig. 11 und 12 dargestellten Sequenzen sind Teil eines Genclusters aus Salmonella typhimurium, das ich Virulenz-Gencluster 2 (VGC2) genannt habe. Die Position von Transposon-Insertionen innerhalb der Sequenz ist angezeigt; diese Transposon-Insertionen inaktivieren eine Virulenz-Determinante des Organismus. Wie es im Folgenden und insbesondere in Beispiel 4 ausführlicher dis kutiert wird, sammeln sich, wenn das Verfahren des zweiten Aspekts der Erfindung zur Identifizierung von Virulenzgenen in Salmonella typhimurium verwendet wird, viele der Nukleinsäure-Insertionen (und daher identifizierte Gene) in einem relativ kleinen Teil des Genoms. Diese Region, VGC2, enthält weitere Virulenzgene, die später beschrieben werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Gen kann in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden. Somit kann das Gen (DNA) in Übereinstimmung mit bekannten Techniken verwendet werden, geeigneterweise im Hinblick auf die hier enthaltenen Lehren modifiziert werden, um einen Expressionsvektor aufzubauen, der dann verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle für die Expression und Produktion des Polypeptids zu transformieren. Derartige Techniken umfassen die, die in den US-Patenten Nr. 4 440 859, erteilt am 3. April 1984 an Rutter et al.; Nr. 4 530 901, erteilt am 23. Juli 1985 an Weissman; Nr. 4 582 800, erteilt am 15. April 1986 an Crowl; Nr. 4 677 063, erteilt am 30. Juni 1987 an Mark et al.; Nr. 4 678 751, erteilt am 7. Juli 987 an Goeddel; Nr. 4 704 362, erteilt am 3. November 1987 an Itakura et al.; Nr. 4 710 463, erteilt am 1. Dezember 1987 an Murray; Nr. 4 757 006, erteilt am 12. Juli 1988 an Toole, Jr. et al.; Nr. 4 766 075, erteilt am 23. August 1988 an Goeddel et al. und Nr. 4 810 648, erteilt am 7. März 1989 an Stalker, offenbart sind.
Die DNA, die das Polypeptid kodiert, kann zur Einführung in einen geeigneten Wirt an eine breite Vielfalt anderer DNA- Sequenzen gebunden werden. Die Begleit-DNA wird von der Natur des Wirts, der Art der Einführung der DNA in den Wirt abhängen und davon, ob eine episomale Erhaltung und Integration gewünscht wird.
Im allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, z. B. ein Plasmid, in geeigneter Orientierung und einem korrekten Leseraster zur Expression eingefügt. Bei Bedarf kann die DNA an geeignete Transkriptions- und Translations- Steuerungs-Nukleotidsequenzen gebunden sein, welche durch den gewünschten Wirt erkannt werden, obgleich solche Steuerungen im allgemeinen im Expressionsvektor vorhanden sind. Der Vektor wird dann durch Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher wird es notwendig sein, transformierte Wirtszellen zu selektieren. Eine Selektionstechnik beinhaltet ein Einarbeiten einer DNA- Sequenz mit beliebigen notwendigen Kontrollelementen in einen Expressionsvektor, wobei die DNA eine selektierbare Eigenschaft in der transformierten Zelle, z. B. Antibiotika- Resistenz, kodiert. Alternativ kann das Gen für eine solche selektierbare Eigenschaft auf einem anderen Vektor sein, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle zu kotransformieren.
Wirtszellen, die durch die rekombinante DNA transformiert wurden, werden dann für eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet im Hinblick auf die hier offenbarten Lehren bekannt sind, kultiviert, um die Expression des Polypeptids zu gestatten, das dann isoliert wird.
Es sind viele Expressionssysteme bekannt, einschließlich Bakterien (z. B. E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae), fadenförmige Pilze (z. B. Aspergillus), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen.
Die Vektoren beinhalten ein prokaryontisches Replikon, z. B. das Co1E1 ori zur Fortpflanzung in einem Prokaryonten, sogar wenn der Vektor zur Expression in anderen, nichtprokaryontischen Zelltypen zu verwenden ist. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promotor umfassen, z. B. einen prokaryontischen Promotor, der fähig ist, die Expression (Transkription und Translation) der Gene in einer bakteriellen Wirtszelle, z. B. E. coli, die damit transformiert wird, zu steuern.
Ein Promotor ist ein Expressions-Kontrollelement, das durch eine DNA-Sequenz gebildet wird, die ein von Binden RNA- Polymerase und eine Transkription erlaubt. Promotorsequenzen, die mit beispielhaften bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren bereitgestellt, die günstige Restriktionsstellen zur Insertion eines DNA-Segments enthalten.
Typische prokaryontische Vektorplasmide sind pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, erhältlich von Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA) und pTrc99A und pKK223-3, erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.
Ein typisches Säugetierzell-Vektorplasmid ist pSVL, erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Dieser Vektor verwendet den SV40-späten Promotor, um die Expression von geklonten Genen voranzutreiben, wobei der höchste Expressionslevel in T-Antigen-produzierenden Zellen, z. B. COS-1- Zellen, festgestellt wurde.
Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, ebenfalls erhältlich von Pharmacia. Dieser Vektor verwendet den durch Glukocoritkoid induzierbaren Promotor der langen terminalen Wiederholung des mammären Maus-Tumorvirus, um eine Expression des geklonten Gens zu steuern.
Verwendbare Hefe-Plasmidvektoren sind pRS406-406 und pRS413-416 und sind im allgemeinen von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA erhältlich. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Yeast Integrating plasmids (Y1ps) und beinhalten die Hefe-selektierbaren Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3. Die Plasmide pRS413-416 sind Yeast Centromere plasmids (YCps).
Es wurde eine Vielzahl von Verfahren entwickelt, um DNA in durchführbarer Weise über komplementäre kohäsive Enden an Vektoren zu binden. Beispielsweise können komplementäre Homopolymerstränge zu dem DNA-Segment gegeben werden, damit sie in die Vektor-DNA eingefügt werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbindung zwischen den komplementären Homopolymerschwänzen zusammengefügt, wobei rekombinante DNA-Moleküle gebildet werden.
Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsstellen enthalten, liefern ein alternatives Verfahren eines Bindens des DNA-Segments an Vektoren. Das DNA-Segment, das durch Endonuklease-Restriktionsverdauung gebildet wird, wie dies früher beschrieben wurde, wird mit Bacteriophagen T4- DNA-Polymerase oder E. coli-DNA-Polymerase I behandelt, das sind Enzyme, die hervorstehende 3'-einsträngige Enden mit ihren 3'-5'-exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und zurückgesetzte 3'-Enden mit ihren polymerisierenden Aktivitäten auffüllen.
Die Kombination dieser Aktivitäten bildet stumpf endende DNA-Segmente. Die stumpf endenden Segmente werden dann mit einem großen molaren Überschuß an Linkermolekülen in Gegen wart eines Enzyms inkubiert, welches fähig ist, die Ligation von stumpf endenden DNA-Molekülen zu katalysieren, beispielsweise Bacteriophagen-T4-DNA-Ligase. Somit sind die Produkte der Reaktion DNA-Segmente, die polymere Linkersequenzen an ihren Enden tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und an einen Expressionsvektor gebunden, der mit einem Enzym gespalten worden war, das Enden produziert, die mit denen des DNA-Segments kompatibel sind.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Restriktionsendonuklease-Stellen enthalten, sind im Handel aus einer Reihe von Quellen, einschließlich International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA, erhältlich.
Ein wünschenswerter Weg, um die DNA, die das Polypeptid kodiert, zu modifizieren, besteht in der Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion, wie sie von Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491 offenbart wird.
In diesem Verfahren wird die DNA, die enzymatisch amplifiziert werden soll, von zwei spezifischen Oligonukleotid- Primern flankiert, welche selbst in die amplifizierte DNA eingebaut werden. Diese spezifischen Primer können Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen enthalten, die zum Klonen in Expressionsvektoren unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingesetzt werden können.
Es können Varianten der Gene hergestellt werden. Vorzugsweise hat die Variante eine mindestens 70%ige Sequenzidentität, bevorzugter eine mindestens 85%ige Sequenzidentität (Gleichheit), am günstigsten eine mindestens 85%ige Sequenzidentität mit den Genen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden. Natürlich können Ersatz, Deletionen und Insertionen toleriert werden. Der Ähnlichkeitsgrad zwischen einer Nukleinsäuresequenz und einer anderen kann unter Verwendung des GAP-Programms der University of Wisconsin Computer Group bestimmt werden.
In entsprechender Weise können Varianten von Proteinen, die durch die Gene kodiert werden, hergestellt werden.
Mit "Varianten" schließen wir Insertionen, Deletionen und Substitutionen, entweder konservative oder nichtkonservative, ein, wobei solche Änderungen die Normalfunktion des Proteins nicht wesentlich verändern.
Durch den Begriff "erhaltende Substitutionen" sind Kombinationen wie z. B. Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr gemeint.
Derartige Varianten können hergestellt werden, indem die wohlbekannten Verfahren der Proteintechnik und der auf eine Stelle gerichteten Mutagenese angewendet werden.
Es ist ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Fähigkeit eines Mikroorganismus, sich an eine besondere Umgebung anzupassen, reduziert, umfassend die Schritte des Selektierens einer Verbindung, die die Funktion (1) eines Gens, das nach dem Verfahren des zweiten Aspekts der Erfindung erhalten wird, oder (2) eines Polypeptids, das durch ein derartiges Gen kodiert wird, stört, anwendbar.
Ein paarweises Durchmustern nach Verbindungen, die die Wiltyp-Zelle beeinträchtigen, allerdings keine Zelle, die ein nach den Verfahren der Erfindung isoliertes Gens überproduziert, ist ebenfalls anwendbar. Beispielsweise kann eine Zelle eine Wildtyp-Zelle sein und eine zweite Zelle kann die Salmonella-Zelle sein, die durch Überexprimieren des Gens, das nach dem Verfahren der Erfindung isoliert wurde, hergestellt ist. Die Lebensfähigkeit und/oder das Wachstum jeder Zelle in der besonderen Umgebung wird in Gegenwart einer zu untersuchenden Verbindung bestimmt, um zu identifizieren, welche Verbindung die Lebensfähigkeit oder das Wachstum der Wildtyp-Zelle, nicht aber der Zelle, die das Gen überexprimiert, reduziert.
Vorzugsweise ist das Gen ein Virulenzgen.
Der Mikroorganismus (z. B. S. typhimorium) kann beispielsweise hergestellt werden, um das Virulenzgen, das durch das Verfahren des ersten Aspektes der Erfindung identifiziert wurde, zu überexprimieren. Es werden jeweils (a) der "überexprimierende" Mikroorganismus und (b) ein äquivalenter Mikroorganismus (der das Virulenzgen nicht überexprimiert) verwendet, um Zellen in Kultur zu infizieren. Ob eine besondere Testverbindung die Virulenzgen-Funktion selektiv hemmt, wird bestimmt, indem die Menge der Testverbindung beurteilt wird, die erforderlich ist, um eine Infektion der Wirtszellen durch (a) den überexprimierenden Mikroorganismus und (b) den äquivalenten Mikroorganismus zu verhindern (zumindest für einige Virulenzgen-Produkte wird angenommen, daß die Testverbindung sie inaktivieren wird und sie selbst durch Binden des Virulenzgen-Produktes inaktiviert wird). Wenn zur Verhinderung einer Infektion durch (a) mehr der Verbindung der erforderlich ist als zur Verhinderung einer Infektion durch (b), dann legt dies nahe, daß die Verbindung selektiv ist. Es ist bevorzugt, wenn die Mikroorganismen (z. B. Salmonella) extrazellulär durch ein mildes Antibiotikum wie z. B. Gentamycin (das Wirtszellen nicht durchdringt) zerstört wird, und daß die Wirkung der Testverbindung zur Verhinderung einer Infektion der Zelle durch der Mikroorganismus darin besteht, daß die Zelle aufgelöst wird und bestimmt wird, wie viele Mikroorganismen vorhanden sind (z. B. durch Plattieren auf Agar).
Paarweise Screens und andere Screens für Verbindungen werden im allgemeinen bei Kirsch & Di Domenico (1993) in "The Discovery of Natural Products with a Therapeutic Potential" (Ed, V. P. Gallo), Kapitel 6, Seiten 177-221, Butterworths, V. K, offenbart.
Paarweise Screens können in einer Reihe von verwandten Formaten aufgebaut sein, wobei die relative Empfindlichkeit für eine Verbindung unter Verwendung zwei genetisch verwandter Stämme verglichen wird. Wenn die Stämme sich an einer einzigen Stelle unterscheiden, dann kann eine Verbindung, die für dieses Ziel spezifisch ist, identifiziert werden, indem die Empfindlichkeit jedes Stamms für den Inhibitor verglichen wird. Beispielsweise werden Inhibitoren, die für das Target spezifische sind, gegenüber einem superempfindlichen Teststamm im Vergleich zu sonst isogenen Schwerstamm aktiver sein. Dies wird in einem Agar-Diffusionsformat bestimmt, indem die Größe der Hemmzone, die die Scheibe oder Vertiefung, welche die Verbindung trägt, umgibt, gemessen wird. Aufgrund einer Diffusion wird ein kontinuierlicher Konzentrationsgradient der Verbindung aufgebaut; die Empfindlichkeit des Stamms gegenüber Inhibitoren ist proportional zum Abstand von der Scheibe oder Vertiefung zu dem Rand der Zone. Bei allgemeinen antimikrobiellen Mitteln oder antimikrobiellen Mitteln mit Wirkmechanismen, die sich von dem gewünschten unterscheiden, wird im allgemeinen beobachtet, daß sie ähnliche Aktivitäten gegen die beiden Stämme haben.
Bei einem anderen Typ eines molekulargenetischen Screens, der Paare von Stämmen umfaßt, wird ein geklontes Genprodukt in einem Stamm in Vergleich zu einem Kontrollstamm überexprimiert. Das Grundprinzip hinter diesem Analysentyp besteht darin, daß der Stamm, der eine erhöhte Menge des Target-Proteins enthält, gegenüber Inhibitoren, die für das geklonte Genprodukt spezifisch sind, resistenter sein sollte als ein isogener Stamm, der normale Menge des Targe- Proteins enthält. Es wird erwartet, daß in einem Agar- Diffusionstest die Größe der Zone, die eine spezifische Verbindung umgibt, bei dem Stamm, der das Target-Protein überexprimiert, im Vergleich zu einem sonst isogenen Stamm kleiner ist.
Eine zusätzliche oder alternative Selektion einer Verbindung wird in den folgenden Schritten erreicht:
1. Ein Mutanten-Organismusus, der unter Verwendung des Verfahrens des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten wird, wird als Kontrolle verwendet (er hat einen vorgegebenen Phänotyp, z. B. Nicht-Virulenz).
2. Eine zu untersuchende Verbindung wird mit dem Wildtyp- Mikroorganismus vermischt.
3. Wildtyp-Mikroorganismus wird in die Umgebung (mit oder ohne die Testverbindung) eingeführt.
4. Wenn der Wildtyp-Mikroorganismus unfähig ist, sich an die Umgebung anzupassen (im Anschluß an eine Behandlung durch die Verbindung oder in Gegenwart der Verbindung), ist die Verbindung eine, die die Fähigkeit des Mikroorganismus, sich an die besondere Umgebung anzupassen oder in ihr zu überleben, reduziert.
Wenn die Umgebung ein Tierkörper ist, und der Mikroorganismus ein pathogener Mikroorganismus ist, kann die nach diesem Verfahren identifizierte Verbindung in einem Arzneimittel verwendet werden, um eine Infektion mit dem Organismusus zu verhindern oder zu lindern.
Eine Verbindung, die durch das oben genannte Selektionsverfahren identifizierbar ist, kann verwendbar sein.
Es ist zu erkennen, daß eine Verwendung solcher Verbindungen in Beziehung zu dem Verfahren, durch das sie identifiziert werden können, und insbesondere in Beziehung zu dem Wirt eines pathogenen Organismusus steht. Wenn die Verbindung beispielsweise durch ein Verfahren identifizierbar ist, das ein Virulenzgen oder ein dadurch kodiertes Polypeptid aus einem Bakterium, welches ein Säugetier infiziert, verwendet, kann die Verbindung in der Behandlung einer Infektion eines Säugetiers durch das Bakterium nützlich sein.
Wenn die Verbindung durch ein Verfahren identifizierbar ist, das ein Virulenzgen oder ein dadurch kodiertes Polypeptid aus einem Pilz, der eine Pflanze infiziert, verwendet, kann die Verbindung bei der Behandlung der Infektion einer Pflanze durch den Pilz verwendbar sein.
Nützlich sein kann ein Molekül, das selektiv mit einem Gen, das nach dem Verfahren des zweiten Aspekts der Erfindung erhalten wird, oder einem Nukleinsäureprodukt davon in Wechselwirkung tritt und im wesentlichen die Funktion desselben hemmt.
In dem Begriff "Nukleinsäureprodukt davon" schließen wir eine beliebige RNA, speziell mRNA, die von dem Gen transkribiert wird, ein.
Vorzugsweise ist ein Molekül, das selektiv mit dem Gen oder diesem Nukleinsäure-Produkt in Wechselwirkung tritt und im wesentlichen die Funktion desselben hemmt, eine Nukleinsäure mit Gegensinn oder ein Nukleinsäure-Derivat mit Gegensinn.
Noch vorteilhafter ist es, wenn das Molekül ein Oligonukleotid mit Gegensinn ist.
Oligonukleotide mit Gegensinn sind eine einzelsträngige Nukleinsäure, die sich spezifisch an eine komplementäre Nukleinsäuresequenz binden kann. Durch Bindung an die geeignete Targetsequenz wird ein RNA-RNA-, ein DNA-DNA- oder RNA-DNA-Duplex gebildet. Diese Nukleinsäuren werden oft "mit Gegensinn" bezeichnet, da sie zu der Richtung oder Kodierungsstrang des Gens komplementär sind. Kürzlich wurde die Bildung einer Dreifach-Helix als möglich bewiesen, in der das Oligonukleotid an ein DNA-Duplex gebunden ist. Es wurde festgestellt, daß Oligonukleotide Sequenzen in der Hauptfurche der DNA-Doppelhelix erkennen können. Dadurch wurde eine Dreifachhelix gebildet. Dies legt nahe, daß es möglich ist, sequenzspezifische Moleküle zu synthetisieren, die über eine Erkennung der Wasserstoff-Bindungsstellen der Hauptfurche spezifisch doppelsträngige DNA binden.
Die Sequenz der Nukleinsäure oder des Oligonukleotids mit Gegensinn kann in einfacher Weise unter Bezugnahme auf die Nukleotidsequenz des fraglichen Gens bestimmt werden. Beispielsweise kann die Nukleinsäure oder können die Oligo nukleotide mit Gegensinn so gestaltet sein, daß sie zu einem Teil der Sequenz, die in den Fig. 11 oder 12 dargestellt ist, speziell zu Sequenzen, die einen Teil eines Virulenzgens bilden, komplementär ist (sind).
Oligonukleotide werden durch zelluläre endogene Nukleasen abgebaut oder inaktiviert. Zur Überwindung dieses Problems ist es möglich modifizierte Oligonukleotide, die z. B. veränderte Internukleotidbindungen haben, in denen die natürlich vorkommenden Phosphodiester-Bindungen durch eine andere Bindung ersetzt sind, zu verwenden. Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 zeigen eine erhöhte Hemmung in einer Gewebekultur von HIV-1 bei Verwendung von Oligonukleotidphosphoramidaten und -phosphorthioaten. Sarin et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451; zeigten eine verstärkte Hemmung von HIV-1 unter Verwendung von Oligonukleotidmethylphosphonaten auf. Agrawal et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794 wiesen eine Hemmung der HIV-1-Replikation sowohl von früh infizierten wie auch von chronisch infizierten Zellkulturen unter Verwendung von Nukleotidsequenz-spezifischen Oligonukleotidphosphorthioaten nach. Leither et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 berichteten über eine Hemmung der Replikation bei einer Gewebekultur von Influenzavirus durch Oligonukleotidphosphorthioate.
Es wurde gezeigt, daß Oligonukleotide mit künstlichen Bindungen in vivo gegenüber einem Abbau resistent sind. Beispielsweise berichten Shaw et al. (1991) in Nucleic Acids Res. 19, 747-750, daß ansonsten unmodifizierte Oligonukleotide in vivo gegenüber Nukleasen resistenter werden, wenn sie am 3'-Ende durch bestimmte verkapselnde Strukturen blockiert sind, und die nicht verkapselten Oligonukleotidphosphorthioate in vivo nicht abgebaut werden.
Eine detaillierte Beschreibung des H-Phosphonat-Verfahrens zur Synthese von Oligonukleosidphosphorthioaten wird von Agrawal und Tang in Tetrahedron Letters 31, 7541-7544 (1990) geliefert. Synthesen von Oligonukleosidmethylphosphonaten, -phosphordithioaten, -phosphoramidaten, -phosphatestern, -Brückenphosphoramidaten und -Brückenphosphorthioaten sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Agrawal und Goodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539; Nielsen et al. (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager et al. (1988) Biochemistry 27, 7237; Uznanski et al. (1987) Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta 71, 1517; Crosstick und Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405. Es sind auch andere Verfahren zur Synthese oder Produktion möglich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid Deoxyribonukleinsäure (ΔNA), obgleich auch Ribonukleinsäure (RNA)-Sequenzen synthetisiert und angewendet werden können.
Die Oligonukleotide sind vorzugsweise so aufgebaut, daß sie gegenüber einem Abbau durch endogene nukleolytische Enzyme resistent sind. Ein in vivo-Abbau von Oligonukleotiden produziert Oligonukleotid-Abbauprodukte mit reduzierter Länge. Solche Abbauprodukte beteiligen sich wahrscheinlicher an einer nicht spezifischen Hybridisierung und sind weniger wahrscheinlich wirksam gegenüber ihren Gegenstücken voller Länge. Somit ist es wünschenswert, Oligonukleotide zu verwenden, die gegenüber einem Abbau im Körper resistent sind und die fähig sind, die Targetzellen zu erreichen. Die vorliegenden Oligonukleotide können gegenüber einem Abbau in vivo resistenter gemacht werden, indem die natürlichen Phosphodiester-Bindungen durch eine oder mehrere interne künstliche Internukleotid-Bindungen ersetzt werden, z. B. indem Phosphat durch Schwefel in der Bindung ersetzt wird. Beispiele für Bindungen, die verwendet werden können, umfassen Phosphorthioate, Methylphosphonate, Sulfon, Sulfat, Ketyl, Phosphordithioate, verschiedene Phosphoramidate, Phosphatester, Brückphosphorthioate und Brückenphosphoramidate. Solche Beispiele sind eher erläuternd als beschränkend, da weitere Internukleotidbindungen auf dem Fachgebiet bekannt sind; sie z. B. Cohen (1990), Trends in Biotechnology. Die Synthese von Oligonukleotiden, die eine oder mehrere dieser Bindungen durch Phosphodiester-Internukleotidbindungen ersetzt haben, ist auf dem Fachgebiet bekannt, wobei synthetische Wege zur Herstellung von Oligonukleotiden mit gemischten Internukleotid-Bindungen eingeschlossen sind.
Oligonukleotide können gegenüber Extension durch endogene Enzyme resistent gemacht werden, indem die 5'- oder 3'- terminalen Nukleotide verkapselt werden oder entsprechende Gruppen dort eingearbeitet werden. Ein Reagens zur Ausbildung von Verkapselungen ist als Amino-Linker IITM von Applied BioSystems Inc., Foster City, CA im Handel erhältlich. Verfahren zum Ausbilden von Verkapselungen werden beispielsweise von Shaw et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750 und Agrawal et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (17) 7595-7599 beschrieben.
Ein weiteres Verfahren, um Oligonukleotide gegenüber einem Nukleaseangriff resistent zu machen, besteht darin, daß sie "selbst-stabilisiert" werden, wie dies von Tang et al. (1993) in Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735 beschrieben wird. Selbst-stabilisierte Oligonukleotide haben Haarnadelschleifen-Strukturen an ihren 3'-Enden und zeigen eine erhöhte Beständigkeit gegenüber Abbau durch Schlangengift- Phosphodiesterase, DNA-Polymerase I und fötales Rinderserum. Die selbst-stabilisierte Region des Oligonukleotids stört ein Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäuren nicht; Pharmakokinetik- und Stabilitätsuntersuchungen bei Mäusen haben eine erhöhte in vivo-Persistenz von selbststabilisierten Oligonukleotiden hinsichtlich ihrer linearen Gegenstücke gezeigt.
Die eigene Bindungsspezifität der Gegensinn-Oligonukleotide, die für die Basenpaarung charakteristisch ist, wird verstärkt, indem die Verfügbarkeit der Gegensinn- Verbindung an ihrem vorgesehenen Ort in vivo limitiert wird, was eine niedrigere Dosierung erlaubt und systemisch Wirkungen auf ein Minimum beschränkt. Auf diese Weise werden Oligonukleotide lokal angewendet, um die gewünschte Wirkung zu erreichen. Die Konzentration der Oligonukleotide an der gewünschten Stelle ist viel höher als bei einer systemischen Verabreichung der Oligonukleotide; der therapeutische Effekt kann unter Verwendung einer deutlich geringeren Gesamtmenge erzielt werden. Die lokale hohe Konzentration von Oligonukleotiden verstärkt eine Penetration der Targetzellen und blockiert eine Translation der Ziel-Nukleinsäuresequenzen wirksam.
Die Oligonukleotide können mit beliebigen Mitteln, die für eine lokalisierte Verabreichung eines Arzneimittels geeignet sind, zu der Stelle gebracht werden. Beispielsweise kann eine Lösung der Oligonukleotide direkt an der Stelle injiziert werden oder kann durch Infusion unter Verwendung einer Infusionspumpe befördert werden. Die Oligonukleotide können auch in eine implantierbare Vorrichtung eingearbeitet werden, die, wenn sie an der gewünschten Stelle angebracht ist, die Oligonukleotide in die Umgebung freisetzt.
Die Oligonukleotide werden am günstigsten über ein Hydrogel-Material verabreicht. Das Hydrogel ist nicht entzündlich und biologisch abbaubar. Es sind viele derartige Materialien bekannt, einschließlich derer, die aus natürlichen und synthetischen Polymeren hergestellt sind. Das Verfahren kann ein Hydrogel verwenden, das unterhalb der Körpertemperatur flüssig ist, aber unter Bildung eines die Form beibehaltenden halbfesten Hydrogels bei oder in der Nähe der Körpertemperatur geliert. Bevorzugtes Hydrogel sind Polymere aus Ethylenoxid-Propylenoxid-Repetiereinheiten. Die Eigenschaften des Polymers hängen vom Molekulargewicht des Polymers und dem relativen Prozentgehalt an Polyethylenoxid und Polypropylenoxid in dem Polymer ab. Bevorzugte Hydrogele enthalten zwischen etwa 10 und etwa 80 Gew.-% Ethylenoxid und zwischen etwa 20 und etwa 90 Gew.-% Propylenoxid. Ein besonders bevorzugtes Hydrogel enthält etwa 70% Polyethylenoxid und 30% Polypropylenoxid.
Hydrogele, die verwendet werden können, sind z. B. von BASF Corp., Parsippany, NJ unter der Handelsbezeichdnung PluronicR erhältlich.
In dieser Ausführungsform wird das Hydrogel auf einen flüssigen Zustand abgekühlt, dann werden die Oligonukleotide zu einer Konzentration von etwa 1 mg Oligonukleotid pro Gramm Hydrogel in die Flüssigkeit gemischt. Das resultierende Gemisch wird danach auf die zu behandelnde Oberfläche aufgetragen, z. B. durch Sprühen oder Aufstreichen während einer Operation oder unter Verwendung eines Katheters oder endoskopischer Verfahren. Wenn sich das Polymer erwärmt, verfestigt es sich unter Bildung eines Gels, und die Oligonukleotide diffundieren über einen Zeit raum, der durch die genaue Zusammensetzung des Gels definiert ist, aus dem Gel in die umgebenden Zellen.
Die Oligonukleotide können mittels anderer Implantate, die im Handel erhältlich sind oder in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben sind, verabreicht werden, wobei Liposome, Mikrokapseln und implantierbare Vorrichtungen eingeschlossen sind. Z. B. können Implantate aus biologisch abbaubaren Materialien wie z. B. Polyanhydride, Polyorthoester, Polymilchsäure und Polyglykolsäure sowie Copolymere davon, Collagen und Protein-Polymere, oder aus nichtbiologisch abbaubaren Materialien wie z. B. Ethylenvinylacetat (EVAc), Polyvinylacetat, Ethylenvinylalkohol und Derivaten derselben, verwendet werden, um die Oligonukleotide lokal bereitzustellen. Die Oligonukleotide können in das Material eingearbeitet; werden, wenn es polymerisiert wird, oder verfestigt wird, wobei Schmelz- oder Lösungsmittelverdampfungs-Techniken angewendet werden, oder es kann mechanisch mit dem Material vermischt werden. In einer Ausführungsform werden die Oligonukleotide in Überzüge für implantierbare Vorrichtungen eingearbeitet oder auf diese aufgetragen, wobei diese Vorrichtungen beispielsweise mit Dextran überzogene Siliciumdioxid-Kügelchen, Stents oder Katheter sind.
Die Dosis der Oligonukleotide hängt von der Größe der Oligonukleotide und dem Zweck, zu dem sie verabreicht werden, ab. Im allgemeinen wird der Bereich auf der Basis der zu behandelnden Gewebeoberfläche errechnet. Die wirksame Dosis an Oligonukleotid hängt von der Länge und der chemischen Zusammensetzung des Oligonukleotids ab, liegt aber im allgemeinen im Bereich von etwa 30 bis 300 ug/cm² Gewebeoberfläche.
Die Oligonukleotide können dem Patienten im allgemeinen sowohl zu therapeutischen wie auch zu prophylaktischen Zwecken verabreicht werden. Die Oligonukleotide können nach einem beliebigen wirksamem Verfahren verabreicht werden, z. B. parenteral (beispielsweise intravenös, subkutan, intramuskulär) oder durch orale, nasale oder andere Mittel, die es den Oligonukleotiden erlauben, in den Blutstrom des Patienten einzutreten und in diesem zu zirkulieren. Systemisch verabreichte Oligonukleotide werden vorzugsweise zusätzlich zu lokal verabreichten Oligonukleotiden gegeben, sind aber auch ohne eine lokale Verabreichung von Nutzen. Eine Dosierung im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 g pro Verabreichung an einen erwachsenen Menschen wird im allgemeinen für diese Zweck wirksam sein.
Es ist zu erkennen, daß die oben beschriebenen Moleküle bei der Behandlung oder der Prävention einer Infektion, die durch den Mikroorganismus, aus dem das Gen isoliert wurde, oder einen nahen Verwandten dieses Mikroorganismus verursacht wird, nützlich sind. Somit ist das Molekül ein Antibiotikum.
Die oben beschriebenen Moleküle können zur Verwendung in der Medizin geeignet sein.
Ein Verfahren der Behandlung eines Wirts, der eine Infektion mit dem Organismus oder einem nahen Verwandten dieses Organismus hat, oder dafür empfänglich ist, kann nützlich sein. Dabei umfaßt das Verfahren Verabreichen einer wirksamen Menge eines oben beschriebenen Moleküls, wobei das Gen in diesem Organismus oder einem nahen Verwandten des Organismus vorhanden ist.
Mit "wirksamer Menge" meinen wir eine Menge, die im wesentlichen die Infektion verhindert oder bessert. Mit "Wirt" schließen wir ein beliebiges Tier oder eine beliebige Pflanze ein, die durch einen Mikroorganismus infiziert werden kann.
Es ist zu erkennen, daß pharmazeutische Formulierungen des oben beschriebenen Moleküls nützlich sind. Solche pharmazeutischen Formulierungen umfassen das Molekül zusammen mit einem oder mehreren akzeptablen Trägern. Der Träger (die Träger) müssen "akzeptabel" sein, d. h. mit dem Molekül verträglich sein und für die Empfänger desselben nicht schädlich sein. Typischerweise werden die Träger Wasser oder Salzlösung sein, die steril und pyrogenfrei sind.
Wie oben erwähnt wurde und wie es in Beispiel 4 später detaillierter beschrieben wird, haben wir festgestellt, daß bestimmte Virulenzgene sich in Salmonella typhimorium in einer Region des Chromosoms, das wird VGC2 genannt haben, sammeln. DNA-DNA-Hybridisierungsexperimente haben gezeigt, daß Sequenzen, die mindestens zu einem Teil VGC2 homolog sind, in vielen Spezies und Stämmen von Salmonella gefunden werden, aber nicht in den untersuchten E. coli- und Shigella-Stämmen vorhanden sind (siehe Beispiel 4). Diese Sequenzen entsprechen fast sicher konservierten Genen, zumindest bei Salmonella und mindestens einige von ihnen sind Virulenzgene. Es wird angenommen, daß äquivalente Gene in anderen Salmonella-Spezies und - wenn vorhanden - äquivalente Gene in anderen enteralen oder anderen Bakterien ebenfalls Virulenzgene sind.
Ob ein Gen in der VGC2-Region ein Virulenzgen ist, wird in einfacher Weise bestimmt. Beispielsweise sind jene Gene innerhalb der VGC2-Region, die nach dem Verfahren des zweiten Aspekts der Erfindung identifiziert wurden (wenn das Verfahren auf Salmonella typhimurium angewendet wird und die Umgebung ein Tier, z. B. eine Maus ist), Virulenzgene. Virulenzgene werden auch identifiziert, indem eine Mutation in dem Gen (vorzugsweise eine nicht polare Mutation) gemacht wird und bestimmt wird, ob der mutante Stamm nicht virulent ist. Verfahren zur Herstellung von Mutationen in einem selektierten Gen sind bekannt und werden im folgenden noch beschrieben.
Die VGC2-DNA von Salmonella typhimurium oder ein Teil davon oder eine Variante dieser DNA oder eine Variante eines Teils davon kann verwendbar sein.
Die VGC2-DNA von Salmonella typhimurium ist in Fig. 8 graphisch dargestellt, und ist ohne weiteres aus Salmonella typhimurium ATCC 14028 (erhältlich aus der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA; auch hinterlegt bei der NCTC, Public Health Laboratory Service, Colindale, GB unter der Zugriffs-Nr. NCTC 12021) unter Verwendung der in Beispiel 4 bereitgestellten Information erhältlich. Es können z. B. Sonden, die von den in den Fig. 11 und 12 dargestellten Sequenzen abgeleitet sind, verwendet werden, um γ-Klone aus einer genomischen Bibliothek von Salmonella typhimurium zu identifizieren. Standard-Genom-Walking-Verfahren können angewendet werden, um die gesamte VGC2-DNA zu erhalten. Die in Fig. 8 dargestellte Restriktionsmappe kann zur Identifizierung und Lokalisierung von DNA-Fragmenten aus VGC2 verwendet werden.
Mit "Teil der VGC2-DNA aus Salmonella typhimurium" meinen wir eine beliebige DNA-Sequenz, die mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide bevor zugter mindestens 50 Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 100 Nukleotide und am günstigsten mindestens 500 Nukleotide des VGC2 enthält. Ein besonders bevorzugter Teil der VGC 2-DNA ist die in Fig. 11 dargestellte Sequenz oder ein Teil davon. Ein weiterer besonders bevorzugter Teil der VGC&sub2;-DNA ist die in Fig. 12 dargestellte Sequenz oder ein Teil davon.
Vorzugsweise ist der Teil der VGC2-DNA ein Gen oder ein Teil davon.
Gene innerhalb der VGC2-Region können durch statistische Analyse der offenen Leseraster unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen identifiziert werden. Wenn ein offenes Leseraster größer als etwa 100 Kodons ist, ist es wahrscheinlich, daß es ein Gen ist (obgleich kleinere Gene als dieses bekannt sind). Ob ein offenes Leseraster der ein Polypeptid kodierenden Region eines Gens entspricht, kann experimentell bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Teil der DNA, die dem offenen Leseraster entspricht, als Sonde beim Northern (RNA)-Blotting verwendet werden, um zu bestimmen ob mRNA gebildet wird, die an dem DNA hybridisiert; alternativ oder zusätzlich kann eine Mutation in das offene Leseraster eingeführt werden, dann kann die Wirkung der Mutation auf den Phänotyp des Mikroorganismus bestimmt werden. Wenn der Phänotyp verändert ist, dann entspricht das offene Leseraster einem Gen. Methoden zur Identifizierung von Genen innerhalb einer DNA-Sequenz sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Mit "Variante der DNA oder eine Variante eines Teils davon" meinen wir eine beliebige Variante, wie sie durch den oben angegebenen Begriff "Variante" definiert ist.
Somit beinhalten Varianten von VGC2-DNA aus Salmonella typhimurium äquivalente Gene oder Teile davon aus anderen Salmonella-Spezies, z. B. Salmonella typhi und Salmonella enterica, wie auch äquivalente Gene oder Teile davon aus anderen Bakterien, z. B. anderen enteralen Bakterien.
Der Begriff "äquivalentes Gen" umfaßt Gene, die funktionell äquivalent sind, und jene, bei denen eine Mutation zu einem gleichen Phänotyp (z. B. Nicht-Virulenz) führt. Es wird deutlich, daß vor der vorliegenden Erfindung VGC2 oder die darin enthaltenen Gene noch nicht identifiziert waren und sicherlich nicht mit einer Virulenzbestimmung in Verbindung standen.
Ein Mutantenbakterium, in dem, wenn das Bakterium normalerweise ein Gen enthält, das dasselbe wie ein Gen in VGC2 ist oder zu diesem äquivalent ist, das Gen mutiert oder abwesend ist, kann nützlich sein; nützlich sein können auch Verfahren zur Herstellung eines Mutanten-Bakteriums, in dem, wenn das Bakterium normalerweise ein Gen enthält, daß dasselbe wie ein Gen in VGC2 ist oder diesem äquivalent ist, das Gen mutiert oder abwesend ist. Das folgende ist ein bevorzugtes Verfahren zur Inaktivierung eines VGC2- Gens. Man führt Subklonierung des Gens an einem DNA-Fragment aus einer Salmonella-λ-DNA-Bibliothek oder einer anderen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines Fragments von VGC2 als Sonde bei Hybridisierungsexperimenten durch und kartiert das Gen in bezug auf Restriktionsenzymstellen und charakterisiert das Gen durch DNA-Sequenzierung in Escherichia coli. Unter Verwendung von Restriktionsenzymen führt man dann in die kodierende Region des Gens ein DNA- Segment ein, das die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum (z. B. Kanamycin) kodiert ein, möglicherweise nach Deletion eines Teils der kodierenden Region des geklonten Gens durch Restriktionsenzyme. Methoden und DNA-Konstruktionen, die einen Antibiotika-Resistenzmarker enthalten, sind verfügbar, um sicherzugehen, daß die Inaktivierung des interessierenden Gens vorzugsweise nicht polar ist, d. h. die Expression von Genen stromabwärts von dem interessierenden Gen nicht beeinträchtigt. Die Mutantenversion des Gens wird dann aus E. coli in Salmonella typhimurium unter Anwendung einer Phagen P22-Transduktion transferiert, dann werden die Transduktanten durch Southern-Hybridisierung auf eine homologe Rekombination des Mutantengens in das Chromosom untersucht.
Dieses Verfahren wird üblicherweise bei Salmonella angewendet (und kann auch bei S. typhi verwendet werden); weitere Details können in vielen Aufsätzen einschließlich Galan et al. (1992) 174, 4338-4349 gefunden werden.
Eine Verwendung des Mutanten-Bakteriums in einem Impfstoff; pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Bakterium und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten; ein Polypeptid, das durch VGC2-DNA von Salmonella typhimurium kodiert wird, oder ein Teil davon oder eine Variante eines Teils davon; ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Fähigkeit eines Bakteriums, einen Wirt zu infizieren oder eine Erkrankung in einem Wirt hervorzurufen, reduziert; eine Verbindung, die durch dieses Verfahren identifizierbar ist; ein Molekül, das selektiv mit der Funktion eines Gens in VGC2 oder einem Nukleinsäure- Produkt davon in Wechselwirkung tritt und diese wesentlich hemmt; und die medizinische Verwendung und pharmazeutische Zusammensetzung daraus können nützlich sein.
Die VGC2-DNA enthält Gene, die nach dem Verfahren des ersten und des zweiten Aspekts der Erfindung identifiziert wurden, wie auch Gene, die durch ihre Lage identifiziert wurden (obgleich sie nach den Verfahren des ersten und zweiten Aspekts der Erfindung identifizierbar waren).
Es ist bevorzugt, wenn das Gen aus VGC2 ist oder ein äquivalentes Gen aus einer anderen Spezies von Salmonella, z. B. S. typhi ist. Vorzugsweise ist das Mutanten-Bakterium eine S. typhimurium-Mutante oder eine Mutante einer anderen Spezies von Salmonella, z. B. S. typhi.
Es wird angenommen, daß zumindest einige der Gene in VGC2 dem Bakterium, z. B. S. typhimurium, die Fähigkeit verleihen, in Zellen einzudringen.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, wobei:
Fig. 1 ein besonders bevorzugtes Verfahren der Erfindung schematisch darstellt.
Fig. 2 zeigt eine Southern-Hybridisierungsanalyse von DNA aus 12 S. typhimurium-Exkonjuganten nach Verdauung mit EcoRV. Der Filter war sondiert mit dem Kanamycin-Resistenzgen des Mini-Tn5-Transposons.
Fig. 3 zeigt eine Kolonie-Blot-Hybridisierungsanalyse von DNA aus 48 S. typhimurium-Exkonjuganten von einer Hälfte einer Mikrotiterplatte (A1-H6). Der Filter war mit einer Sonde hybridisiert, die markierte amplifizierte Tags (Markierungen) aus DNA enthielt, welche aus einem Pool der ersten 24 Kolonien (A1-D6) isoliert worden waren.
Fig. 4 zeigt eine DNA-Kolonie-Blot-Hybridisierungsanalyse von 95 S. typhimurium-Exkonjuganten einer Mikrotiterplatte (A1-H11), die einer Maus injiziert worden waren. Replizierfilter wurden mit markierten amplifizierten Markierungen aus dem Pool (Impfstoffmuster) oder mit markierten amplifizierten Markierungen aus DNA, die aus über aus 10 000 gesammelten Kolonien, welche aus der Niere des infizierten Tiers (Nierenmuster) wiedergewonnen worden waren, isoliert, hybridisiert. Die Kolonien B6, A11 und C8 lieferten starke bis schwache Hydrierungssignale bei beiden Filtersätzen. Die Hydrierungssignale aus den Kolonien A3, C5, G3 (aroA) und F10 sind in dem Impfstoffmuster, aber nicht in dem Nierenmuster vorhanden.
Fig. 5 zeigt die Sequenz eines Salmonella-Gens, das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurde, und ein Vergleich zu dem Escherichia coli clp-Protease- Genom.
Fig. 6 zeigt partielle Sequenzen eines weiteren Salmonella-Gens, das unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung isoliert wurde (SEQ 1D-Nr. 8 bis 36).
Fig. 7 zeigt die Kartierung von VGC2 auf dem S. typhimurium-Chromosom. (A) DNA-Sonden aus drei Regionen von VGC2 wurden bei einer Southern-Hybridisierungsanalyse von Lysaten aus einem Satz von S. typhimurium-Stämmen, die in Mud-P22-Prophagen eingeschlossen waren, verwendet. Lysate, die mit einem 7,5 kb PstI-Fragment (Sonde A in Fig. 8) hybridisierten, sind dargestellt. Die anderen beiden verwendeten Sonden hybridisierten mit denselben Lysaten. (B) die Insertionspunkte und Packungsrichtungen des Phagen sind zusammen mit der Kartenposition in Minuten angegeben (Edition VIII, Referenz 22 in Beispiel 4). Die Phage- Kennzeichnungen entsprechen den folgenden Stämmen: 18P, TT15242; 18Q, 15241; 19P, TT15244; 19Q, TT15243; 20P, TT15246 und 20Q, TT15245 (Referenz in Beispiel 4). Die Lagen der kartierten Gene werden durch horizontale Balken dargestellt, und die ungefähre Lage anderer Gene sind gekennzeichnet.
Fig. 8 zeigt eine physikalische und genetische Karte von VGC2. (A) Die Positionen von 16 Transposoninsertionen sind über der Linie angegeben. Die Ausdehnung von VGC2 wird durch die dickere Linie angegeben. Die Position und Richtung einer Transkription von ORFs, die im Text von Beispiel 4 beschrieben sind, werden durch Pfeile unter der Linie zusammen mit den Namen ähnlicher Gene angegeben, und zwar mit der Ausnahme für ORFs 12 und 12, deren Produkte dem Sensor bzw. Regulator-Komponenten einer Vielzahl von Zweikomponenten-Regulatorsystemen ähnlich sind. (B) Die Lage von überlappenden Klonen und eines EcoRI/XbalI-Restriktionsfragments aus Mud-P22 Prophage-Stamm TT15244 ist als ausgefüllter Balken dargestellt. Es sind lediglich die Teile der λ-Klone, die kartiert wurden, dargestellt; die Klone können über diese Grenzen hinaus ausgedehnt werden. (C) Die Positionen von Restriktionsstellen sind markiert: B, BamHI; E, EcoRI; V, EcoRV; H, HindIII; P, PstI und X, XbaI. Die Positionen des 7,5 kb PstI-Fragments (Sonde A), das in Fig. 7 als Sonde verwendet wird, und die des 2, 2 kb PstI/HindIII-Fragments (Sonde B), das in Fig. 10 als Sonde verwendet wird, sind unter der Restriktionskarte gezeigt. Die Positionen von Sequenz I (in Fig. 11 beschrieben) und Sequenz 2 (in Fig. 12 beschrieben) werden durch die dünnen Pfeile (markierte Sequenz 1 und Sequenz 2) gezeigt.
Fig. 9 beschreibt eine Kartierung der Grenzen von VGC2. (A) die Positionen der kartierten Gene bei Minuten 37 bis 38 auf dem E. coli K12-Chromosom sind nach der entsprechenden Region des S. typhimurium LT2-Chromosoms (Minuten 30 bis 31) ausgerichtet. Eine ausgedehnte Karte der VGC2- Region ist mit 11 S. typhimurium (S. t.)-DNA-Fragmenten, die als Sonden verwendet wurden (dicke Balken) und den Restriktionsstellen, die zu Bildung derselben verwendet wurden, dargestellt: B, BamHI; C, ClaI; H, Hindil; K, KpnI; P, PstI; N, NsiI und S. SalI. Sonden, die mit genomischer DNA von E. coli K12 (E.c.) hybridisierten werden durch + gekennzeichnet; jene, die nicht hybridisierten, werden durch - gekennzeichnet.
Fig. 10 zeigt, daß VGC2 bei und spezifisch für Salmonella konserviert wird. Genomische DNA aus Salmonella serovars und anderen pathogenen Bakterien wurde mit PstI (A), Hindill oder EcoRV (B) restriktiert und einer Southern- Hybridisierungsanalyse unterworfen, wobei ein 2, 2 kb PstI/HindIII-Fragment aus λ-Klon 7 als Sonde (Sonde B Fig. 2) verwendet wurde. Die Filter wurden hybridisiert und unter strengen (A) oder nicht strengen (B) Bedingungen gewaschen.
Fig. 11 zeigt die DNA-Sequenz von "Sequenz 1" von VGC2 aus der Mitte bis zum linksgängigen Ende (siehe die mit Pfeil markierte Sequenz 1 in Fig. 2). Die DNA ist in alle sechs Leseraster übersetzt, und die Start- und Stop-Positionen von vermeintlichen Genen sowie die Transposon-Insertionspositione für verschiedene Mutanten, die durch STM identifiziert wurden, sind angegeben (SEQ 1D Nr. 37).
Wie es üblich ist, bezeichnet ein * ein Stop-Kodon; Standard-Nukleotid-Unklarheitscodes werden bei Bedarf verwendet.
Fig. 12 zeigt die DNA-Sequenz von "Sequenz 2" von VGC2 (Cluster C) (siehe die mit Pfeil markierte Sequenz in Fig. 2). Die DNA ist in alle sechs Leseraster übersetzt, die Start- und Stop-Positionen von vermeindlichen Genen sowie die Transposon-Insertionspositionen für verschiedene Mutanten, die durch STM identifiziert wurden, sind angegeben (SEQ 1D Nr. 38).
Wie es üblich ist, bezeichnet ein · ein Stop-Kodon, Standard-Nukleotid-Unklarheitscodes werden verwendet, wenn es notwendig ist.
Die Fig. 7 bis 12 sind für Beispiel 4 am relevantesten.

Beispiel 1: Identifizierung von Virulenzgenen in Salmonella typhimurium

Materialien und Verfahren

Bakterienstämme und Plasmide

Salmonella typhimurium, Stamm 12023 (entspricht American Type Culture Collection (ATCC), Stamm 14028) wurde von der National Collection of Type Cultures (NCTC), Public Health Laboratory Service, Colindale, London, GB erhalten. Eine spontane, gegen Nalidixsäure resistente Mutante dieses Stamms (12023 Nalr) wurde in unserem Labor selektiert. Ein weiterer Abkömmling von Stamm 12023, CL1509 (aroA::Tn10) war ein Geschenk von Fred Heffron. Die Escherichia coli- Stämme CC118 λpir (Δ[ara-leu], araD, ΔlacX74, galE, galK, phoA20, thi-1, rpsE, rpoß, argE(Am), recAl, λpir Phagenlysogen) und S17-1 λpir (Tpr, Smr, recA, thi, pro, hsdR&supmin;'M&spplus;, RP4 : 2-Tc:Mu:KmTn7, λpir) waren Geschenke von Kenneth Timmis. E. coli DH5α wurde zur Vermehrung von pUC18 (Gibco-BRL) und Bluescript (Stratagene)-Plasmide enthaltender S. typhimurium-DNA verwendet. Plasmid pUTmini-Tn5Km2 (de Lorenzo et al., 1990) war ein Geschenk von Kenneth Timmis.
Aufbau von Markierungen mit halbstatistischer Sequenz und von Ligationen
Der Oligonukleotid-Pool RT1 (5'-CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT- [NK]20-AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG-3') (SEQ 1D Nr. 1) und Primer P2 (5'-TACCTACAACCTCAAGCT-3') (SEQ 1D Nr. 2), P3 (5'-CATGGTACCCATTCTAAC-3') (SEQ 1D Nr. 3), P4 (5'- TACCCATTCTAACCAAGC-3') (SEQ 1D Nr. 4) und PS (5'- CTAGGTACCTACAACCTC-3') (SEQ 1D Nr. 5) wurden mit einem Oligonukleotid-Synthesizer (Applied Biosystems, Modell 380 B) synthetisiert. Doppelsträngige DNA-Markierungen (tags) wurden aus RT1 in 100 ul Volumen PCR, das 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl und 10 mM Tris-C1 (pH 8,0) mit 200 pg RT1 als Target; 250 uM jeweils dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 100 pM Primer P3 und PS; und 2,5 E Amplitaq (Perkin-Elmer Cetus) enthielt, hergestellt. Die thermischen Zyklusbedingungen waren 30 Zyklen mit 95ºC über 30 s, 50ºC für 45 s und 72C für 10 s. Das PCR-Produkt wurde durch Gel gereinigt (Sambrook et al. 1989), durch eine elutipD-Säule (erhältlich von Schleicher und Schull) geführt und vor einer Ligation in pUC18 oder pUTmini-Tn5Km2 mit KpnI verdaut. Für Ligationen wurden Plasmide mit KpnI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Gibco-BRL) dephosphoryliert. Linearisierte Plasmid-Moleküle wurden vor einer Ligation mit Gel gereinigt (Sambrook et al., 1989), um irgendwelche restliche nicht-geschnittene Plasmid-DNA aus der Verdauung zu entfernen. Ligationsreaktionen enthielten jeweils etwa 50 ng Plasmid und doppelsträngige Markierungs- DNA in 25 ul Volumen mit einer Einheit T4-DNA-Ligase (Gibco-BRL) in einem Puffer, der mit dem Enzym zugeführt wurde. Ligationen wurden über 2 h bei 24C durchgeführt. Um den Anteil an bakteriellen Kolonien zu bestimmen, die entweder aus einer Selbstligation der Plasmid-DNA oder ungeschnittener Plasmid-DNA entstanden, wurde eine Kontrollreaktion durchgeführt, in der die doppelsträngige Markierungs-DNA aus der Ligationsreaktion weggelassen wurde. Dies führte zu keinen gegen Ampicillin resistenten Bakterienkolonien im Anschluß an eine Transformation von E. coli CC118 (Sambrook et al. 1989) im Vergleich zu 185 Kolonien, die aus einer Ligationsreaktion hervorgingen, die die doppelsträngige Markierungs-DNA enthielt.

Bakterielle Transformation und Paarungen

Die Produkte verschiedener Ligationen zwischen pUT mini-Tn5Km2 und der doppelsträngigen Markierungs-DNA wurden zur Transformation von E. coli CC118 (Sambrook et al., 1989) verwendet. Insgesamt wurden annähernd 10 300 Transformanten gesammelt und Plasmid-DNA, die aus dem Pool extrahiert worden war, wurde zur Transformation von E, coli S-17 λpir (de Lorenzo & Timmis, 1994) verwendet. Für Paarungsexperimente wurden ein Pool von annähernd 40 000 gegen Ampicillin resistente E. coli S-17 λpir-Transformanten und S. typhimurium 12023 Nalr getrennt bis zu einer optischen Dichte (OD)&sub5;&sub8;&sub0; von 1,0 kultiviert. Aliquots jeder Kultur (0,4 ml) wurden mit 5 ml 10 mM MgSO&sub4; vermischt und durch eine Millipore-Membran (0,45 um Durchmesser) filtriert. Die Filter wurden auf die Oberfläche von Agar, der M9-Salze enthielt (de Lorenzo & Timmis, 1994) gelegt und für 16 h bei 37ºC inkubiert. Die Bakterien wurden wiedergewonnen, indem die Filter in flüssigem LB-Medium 40 min bei 37ºC geschüttelt wurden; dann wurden Exkonjuganten selektiert, indem die Suspension auf LB-Medium, das 100 ug ml-1 Nalidixsäure (zur Selektion gegen den Donorstamm) und 50 ug ml-1 Kanamycin (zur Selektion des Rezipientenstamms) enthielt, aufgetragen wurde. Jeder Exkonjugant wurde untersucht, indem Nalidixsäure resistente (nalr), Kanamycin-resistente (kanr)-Kolonien auf MacConkey- Lactose-Indikatormedium (zur Unterscheidung zwischen E. coli und S. typhimurium) und auf LB-Medium, das Ampicillin enthielt, transferiert wurden. Annähernd 90% der nalr-, kann-Kolonien waren auf Ampicillin empfindlich, was anzeigte, daß diese aus authentischen Transpositionsvorgängen resultierten (de Lorenzo & Timmis, 1994). Einzelne Ampicillin-empfindliche Exkonjuganten wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die das LB-Medium enthielten, aufbewahrt. Für eine Lanzeitlagerung bei -80ºC wurde entweder 7% DMSO oder 15% Glycerin in dem Medium eingeschlossen.

Phänotypische Charakterisierung von Mutanten

Mit Mutanten wurde eine Replikaplattierung von Mikrotiterplatten auf ein festes Medium, das M9-Salze und 0,4% Glucose enthielt (Sambrook et al., 1989) zur Identifizierung von Auxotrophen durchgeführt. Mutanten mit grober Kolonienmorphologie wurden durch Mikroskopieren der Kolonien auf Agarplatten mit niedriger Vergrößerung nachgewiesen.

Kolonienblots, DNA-Extraktionen, PCRs, DNA-Markierungen und Hybridisierungen

Für Kolonien-Blot-Hybridisierungen wurde ein Metallreplikator mit 48 Vertiefungen (Sigma) verwendet, um Exkonjuganten von Mikrotiterplatten auf Hybond N-Nylonfilter (Amersham, GB), die auf die Oberfläche von LB-Agar, das 50 ug ml-1 Kanamycin enthielt, gelegt worden waren, zu transferieren. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden die Filter, die die Bakterienkolonien trugen, entfernt und 10 min bei Raumtemperatur getrocknet. Die Bakterien wurden mit 0,4 N NaOH lysiert, dann wurden die Filter mit 0,5 N Tris-C1 pH 7,0 nach den Anweisungen des Filterherstellers gewaschen. Die bakterielle DNA wurde durch Belichtung mit UV-Licht aus einem Stratalinker (Stratagene) an den Filtern fixiert. Es wurden Hybridisierungen mit 32P-markierten Sonden unter strengen Bedingungen durchgeführt, wie dies vorher beschrieben wurde (Holden et al., 1989). Für DNA-Extraktionen wurden S. typhimurium-Transposon-Mutantenstämme in flüssigem LB- Medium auf Mikrotiterplatten wachsen gelassen oder in LB- Medium resuspendiert, worauf sich ein Wachstum auf festen Medien anschloß. Eine Gesamt-DNA wurde nach dem Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Verfahren gemäß Ausubel et a1. (1987) hergestellt. Kurz zusammengefaßt, Zellen aus 150 bis 100 ul-Volumen wurden durch Zentrifugation ausgefällt und in 576 ul TE resuspendiert. Dazu wurdend 15 ul 20%iges SDS und 3 ul 20 mg ml-1 Proteinase K gegeben. Nach einstündigem Inkubieren bei 37ºC wurden 166 ul 3 M NaCl zugesetzt und das ganze kräftig vermischt, worauf 80 ul 10%iges (G/V) CTAB und 0,7 M NaCl zugesetzt wurden. Nach kräftigem Vermischen wurde die Lösung 10 min lang bei 65ºC inkubiert. Im Anschluß an eine Extraktion mit Phenol und Phenol- Chloroform wurde die DNA durch Zusatz von Isopropanol ausgefällt, mit 70%igem Ethanol gewaschen und mit einer Konzentration von etwa 1 ug ul-1 in TE resuspendiert.
Die DNA-Proben wurden zur Bildung von markierten Sonden zwei PCR-Zyklen unterworfen. Die erste PCR wurde in 100 ul Reaktionen durchgeführt, welche 20 mM Tris-C1 pH 8,3; 50 mM KCl; 2 mM MgCl&sub2;; 0,01% Tween 80; jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 2,5 Einheiten Amplitaq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus); jeweils 770 ng Primer P2 und P4 und 5 ug Target-DNA enthielten. Nach einer anfänglichen Denaturierung über 4 min bei 95ºC bestand ein thermischer Kreislauf aus 20 Zyklen bei 50ºC über 45 s, bei 72º über 10 s und bei 95ºC über 30 s. Die PCR-Produkte wurden mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/l) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. DNA wurde in 10 ul TE resuspendiert, dann wurden die PCR-Produkte durch Elektrophorese durch ein 1,6% Seaplaque (FMC Bioproducts)-Gel in TAE-Puffer gereinigt. Es wurden Gelscheiben, die Fragmente mit etwa 80 bp enthielten, ausgeschnitten und für die zweite PCR verwendet. Diese Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 20 ul durchgeführt und enthielt 20 mM Tris-C1 pH 8,3; 50 mM KCl; 2 mM MgCl&sub2;; 0,01% Tween 80; jeweils 50 uM dATP, dTTP, dGTP; 10 ul 32P-dCTP (3000 Ci/mmol, Amersham); jeweils 150 ng Primer P2 und P4; annähernd 10 ng Target-DNA (1-2 ul 1,6% Seaplaque-Agarose, die das PCR-Produkt des ersten Durchgangs enthielt); 0,5 Einheiten Amplitaq-Polymerase enthielten. Die Reaktion wurde mit 20 ul Mineralöl überdeckt, dann wurde ein thermischer Durchgang durchgeführt, wie es oben beschrieben ist. Der Einbau der radioaktiven Markierung wurde durch Extinktion mit Whatman DE81-Papier (Sambrook et al., 1989) quantitativ bestimmt.

Infektionsstudien

Einzelne Salmonella-Exkonjuganten, die markierte Transposons enthielten, wurden in 2% Trypton, 1% Hefeextrakt, 0,92% V/V Glycerin, 0,5% Na&sub2;PO&sub4;, 1% KNO&sub3; (TYGPN-Medium) (Ausubel et al., 1987) auf Mikrotiterplatten bei 37ºC über Nacht wachsen gelassen. Es wurde ein Metallreplikator verwendet, um ein kleines Volumen der über Nacht-Kulturen auf eine frische Mikrotiterplatte zu transferieren, dann wurden die Kulturen bei 37ºC inkubiert, bis der OD&sub5;&sub8;&sub0;-Wert (gemessen unter Verwendung eines Titertek Multiscan-Mikro titerplatten-Lesegerätes) in jeder Vertiefung etwa 0,2 war. Dann wurden Kulturen aus einzelnen Vertiefungen gesammelt und der OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert unter Verwendung eines Spektralphotometers bestimmt. Die Kultur wurde in steriler Salzlösung auf ungefähr 5 · 10&sup5; cfu ml-1 verdünnt. Weitere Verdünnungen wurden auf TYGPN, das Nalidixsäure (100 mg ml-1) und Kanamycin (50 mg ml-1) enthielt aufgetragen, um zu bestätigen, daß cfu in dem Impfmaterial vorlag.
Gruppen aus drei weiblichen BALB/c-Mäusen (20-25 g) wurden intraperitoneal 0,2 ml Bakteriensuspension, die etwa 1 · 10&sup5; cfu ml-1 enthielt, injiziert. Die Mäuse wurden drei Tage nach der Inokulation getötet, ihre Nieren wurden zur Wiedergewinnung der Bakterien entfernt. Die Hälfte jeder Niere wurde in 1 ml steriler Salzsäure in einem Mikrozentrifugenröhrchen homogenisiert. Zelluläre Überreste wurden sich absetzen gelassen und 1 ml Salzlösung, die noch Zellen in Suspension enthielt, wurde in ein frisches Röhrchen gegeben und für 2 min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet wurde in 1 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. In sterilem destilliertem Wasser wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt, 100 ml jeder Verdünnung wurden auf TYGPN-Agar, der Nalidixsäure (100 ug ml-1) und Kanamycin (50 ug ml-1) enthielt, aufgetragen. Bakterien wurden von Platten, die zwischen 1000 und 4000 Kolonien enthielten wiedergewonnen, und insgesamt über 10 000 Kolonien, die aus jeder Niere wiedergewonnen worden waren, wurden gesammelt und zur Herstellung von DNA zur PCR-Erzeugung von Sonden verwendet, um Kolonien-Blots durchzumustern.

Klonierung eines Virulenzgens und DNA Sequenzierung

Aus S. typhimurium-Exkonjuganten wurde die Gesamt-DNA isoliert und getrennt mit SstI, SaII, PstI und SphI verdaut. Verdauungsprodukte wurden durch Agarosegele fraktioniert, auf Hybond N&spplus;-Membranen (Amersham) transferiert und einer Southern-Hybridisierungsanalyse unter Verwendung des Kanamycin-Resistenzgens pUT mini-Tn5Km2 als Sonde unterworfen. Die Sonde wurde mit Digoxygenin (Boehringer, Mannheim) markiert; es wurde eine Chemielumineszenzdetektion nach Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Bedingungen der Hybridisierung und des Waschens waren wie oben beschrieben. Es wurden Restriktionsenzyme, die einen Anstieg hybridisierender Fragmente im 3-5 kb-Bereich bewirkten, verwendet, um DNA für präparatives Agarosegel zu verdauen, DNA-Fragmente, die den Größen der Hybridisierungssignale entsprachen, wurden daraus ausgenschnitten, gereinigt und in pUC18 ligiert. Zur Transormierung von E. coli DHSa zu Kanamycin-Resistenz wurde Ligations-Reaktionen angewendet. Plasmide aus Kanamycin-resistenten Transformanten wurden gereinigt, indem sie durch eine elutipD-Säule geleitet wurden und durch Restriktionsenzym-Verdauung untersucht wurden. Plasmidinserts wurden partiell nach dem Di-Deoxy-Verfahren (Sanger et al., 1977) sequenziert, wobei der -40-Primer und der umgekehrt sequenzierende Primer (United States Biochemical Corporation) und die Primer P6 (5'-CCTAGGCGGCCAGATCTGAT-3') (SEQ ID Nr. 6) und P7 (5'-GCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3' (SEQ ID Nr. 7), die an den I- bzw. O-Enden von Tn5 renaturieren, verwendet werden. Nukleotidsequenzen und abgeleitete Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung des Macvector 3,5-Software-Paketes, das mit einem Macintosh SE/30-Computer beschrieben wurde, gesammelt. Die Sequenzen wurden mit dem E. MBL- und Genbank- DNA-Datenbanken unter Verwendung des UNIX/SUN-Computer systems im Human Genome Mapping Project Resource Centre, Harrow, GB verglichen.

Resultate

Aufbau einer Markierung

Die Struktur der DNA-Markierungen ist in Fig. 1a dargestellt. Jede Markierung besteht aus einer variablen zentralen Region, die von "Armen" mit gleichbleibender Sequenz flankiert wird. Die Sequenz der zentralen Region ([NK]&sub2;&sub0;) wurde so aufgebaut, daß das Auftreten von Stellen für die üblicherweise verwendeten 6 bp-Erkennungs- Restriktionsenzyme verhindert wird, sie aber ausreichend variabel ist, um sicherzustellen, daß dieselbe Sequenz in 2 · 10¹¹ Molekülen nur einmal auftritt (eine DNA-Sequenzierung von 12 statistisch selektierten Markierungen zeigte, daß keine mehr als 50% Identität über die variable Region teilte). (N bezeichnet eine beliebige Base (A, G, C oder T) und K bezeichnet G oder T.) Die Arme enthalten KpnI-Stellen in der Nähe der Enden, um den anfänglichen Klonierungsschritt zu erleichtern; die HindIII-Stellen, die die variable Region begrenzen, wurden verwendet, um radioaktiv markierte variable Regionen vor einer Hybridisierungsanalyse aus den Armen freizusetzen. Die Arme wurden so aufgebaut, daß die Primer P2 und P4 jeweils nur einen Guanin-Rest enthalten. Daher wird während einer PCR unter Verwendung dieser Primer nur ein Cytosin in jeden neu synthetisierten Arm eingearbeitet, im Vergleich zu durchschnittlich zehn in der einmal vorkommenden Sequenz. Wenn radioaktiv markiertes dCTP in der PCR enthalten ist, wird in der einmal vorkommenden Sequenz im Vergleich zu jedem Arm eine 10-fach stärkere Markierung vorhanden sein. Dies ist beabsichtigt, um Hintergrund-Hybridisierungssignale von den Armen, nachdem diese durch Verdauung mit Hindill aus den einmal vorkommenden Sequenzen freigesetzt wurden, auf ein Minimum zu beschränken. Doppelsträngige Markierungen werden mit der KpnI-Stelle des mini-Tn5-Transposons Km2, das auf dem Plasmid pUT getragen wird, verknüpft (de Lorenzo & Timmis, 1994). Eine Replikation dieses Plasmids hängt von dem R6K-spezifizierten-π-Produkt des pir-Gens ab. Es trägt die oriT-Sequenz des RP4-Plasmids, die eine Übertragung auf eine Vielzahl bakterieller Spezies zuläßt (Miller & Mekalanos, 1988), und das tnp*-Gen, das für die Transposition des mini-Tn5-Elements notwendig ist. Die markierten mini-Tn5-Transposone werden durch Konjugation auf S. typhimurium transferiert; 288 Exkonjuganten, die aus Transpositionsvorgängen resultierten, wurden in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten aufbewahrt. Die Gesamt-DNA, die aus 12 der genannten isoliert worden war, wurde mit EcoRV verdaut und einer Southern-Hybridisierungsanalyse unter Verwendung des Kanamycin-Resistenzgens des mini-Tnd5- Transposons als Sonde unterworfen. In jedem Fall war in dem Exkonjuganten als Resultat eine einfache Integration des Transposons an einer unterschiedlichen Stelle des bakteriellen Genoms aufgetreten (Fig. 2).

Untersuchungen der Spezifität und Empfindlichkeit

Als nöchstes bestimmten wir die Wirksamkeit und Gleichmäßigkeit einer Amplifikation der DNA-Markierungen in PCRs, die Pools aus Exkonjuganten-DNAs als Targets für die Reaktionen beinhalteten. Bei einem Versuch, eine ungleiche Amplifikation von Markierungen in der PCR auf ein Minimum zu reduzieren, bestimmten wir die maximale Menge an DNA- Target, die in einer 100 ul-Reaktion verwendet werden konnte und die kleinste Anzahl von PCR-Zyklen, die zu Produkten führte, die durch Ethidiumbromid-Färbung eines Agarosegels sichtbar gemacht werden konnten (5 ug DNA bzw. 20 Zyklen).
S. typhimurium-Exkonjuganten, die eine stationäre Wachstumsphase in Mikrotiterplatten erreicht hatten, wurden kombiniert und es wurde versucht, die DNA zu extrahieren. Diese wurde einer PCR unter Verwendung der Primer P2 und P4 unterworfen. PCR-Produkte mit 80 bp wurden durch Gel gereinigt und als Targets für eine zweite PCR verwendet, wobei dieselben Primer aber mit 32P-markiertem CTP verwendet wurden. Dies führte dazu, daß über 60% des radioaktiv markierten dCTP in die PCR-Produkte eingebaut war. Die radioaktiv markierten Produkte wurden mit HindIII verdaut und verwendet, um Kolonienflecken-DNA aus ihren entsprechenden Mikrotiterplatten zu sondieren. von den 1510 auf diese Weise untersuchten Mutanten ergaben 358 kein klares Signal auf einem Autoradiogramm im Anschluß an eine über Nacht-Belichtung des Koliniefleckens. Dafür gibt es drei mögliche Erklärungen. Erstens ist es möglich, daß ein Teil der Transposone keine Markierungen trug. Durch Vergleich der Transformationshäufigkeiten, die aus Ligationsreaktionen resultieren, welche das Transposon in Gegenwart oder Abwesenheit von Markierungen involvieren, scheint es allerdings unwahrscheinlich, daß mehr als etwa 0,5% der gesamten nicht-markierte Transposone sind (siehe Materialien und Methoden). Wahrscheinlichere Gründe sind die, daß die variable Sequenz in einigen der Markierungen gestützt wurde und/oder daß einige der Sequenzen Sekundärstrukturen bildeten, wobei beide Gründe eine Amplifikation verhindern könnten. Mutanten, die keine klaren Signale geben konnten, wurden in weitere Untersuchungen nicht eingeschlossen. Die Spezifizität der in wirksamer Weise amplifizierbaren Markierungen wurde bewiesen, indem eine Sonde aus 24 Kolonien einer Mikrotiterplatte hergestellt wurde und diese verwendet wurde, um einen Koloniefleck von 48 Kolonien, welche die 24 zur Bildung der Sonde verwendeten einschlossen, zu sondieren. Das Fehlen eines Hybridisierungssignals von den 24 Kolonien, die nicht zur Bildung der Sonde verwendet worden waren (Fig. 3), zeigte, daß die angewendeten Hybridisierungsbedingungen ausreichend streng waren, um eine Querhybridisierung unter markierten Markierungen zu verhindern und legt nahe, daß kein Exkonjugant innerhalb einer Mikroplatte noch einmal vorkommt.
Es gibt weitere Betrachtungen bei der Bestimmung der größtmöglichen Poolgröße, die als Impfstoff bei Tierexperimenten verwendet werden kann. Da die Menge der markierten Markierung für jedes Transposon umgekehrt proportional zu der Komplexität des Markierungspool ist, gibt es eine Grenze für die Poolgröße, oberhalb welcher Hybridisierungssignale zu schwach werden, um nach einer über Nacht-Belichtung eines Autoradiogramms nachgewiesen zu werden. Da die Komplexität des Pools zunimmt, so muß auch die Wahrscheinlichkeit zunehmen, das ein virulenter Vertreter des Pools nicht in ausreichender Anzahl in der Niere eines infizierten Tiers vorliegt, um ausreichend markierte Sonde zu produzieren. Wir haben die Obergrenze für die Poolgröße in dem murinen Modell von Salmonellose, das wir verwendet haben, nicht bestimmt; sie muß aber über 96 liegen.

Virulenztest mit den Transposon-Mutanten

Insgesamt 1152 Insertionsmutanten mit einer einmal vorkommenden Markierung (aus zwei Mikrotiterplatten) wurden auf Virulenz in BALB/c-Mäusen in 12 Pools, von denen jeder durch eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen dargestellt wurde, getestet. Tiere erhielten eine intraperitoneale Injektion von etwa 103 Zellen jeder von 96 Transposon- Mutanten einer Mikrotiterplatte (10&sup5; Organismen insgesamt). Drei Tage nach Injektion wurden die Mäuse getötet; die Bakterien wurden durch Plattieren von Nierenhomogenaten auf Labormedium wiedergewonnen. Etwa 10 000 Kolonien, die aus jeder Maus wiedergewonnen worden waren, wurden gesammelt und die DNA wurde extrahiert. Die in dieser DNA-Probe vorhandenen Markierungen wurden amplifiziert und durch die PCR markiert, dann wurden Kolonieflecken sondiert und mit dem Hybridisierungsmuster verglichen, das unter Verwendung von Markierungen, die aus dem Impfmaterial implifiziert wurden (Fig. 3) erhalten wurden. Als Kontrolle wurde eine aroA- Mutante von S. typhimurium markiert und als eine der 96 Mutanten in dem Impfmaterial verwendet. Es wurde nicht erwartet, daß dieser Stamm in der Niere wiedergewonnen würde, da seine Virulenz stark verringert ist (Buchmeier et al., 1993). Es wurden 41 Mutanten identifiziert, deren DNA mit markierten Markierungen aus dem Impfmaterial hybridisierte, nicht aber mit markierten Markierungen aus Bakterien, die aus der Niere wiedergewonnen waren. Das Experiment wurde wiederholt, es wurden dieselben 41 Mutanten wieder identifiziert. Zwei von diesen waren - wie erwartet - die aroA-Mutante (eine pro Pool). Eine weitere war eine auxotrophe Mutante (sie war im minimalen Medium nicht gewachsen). Alle Mutanten hatten normale Koloniemorphologie.

Beispiel 2: Klonierung und partielle Charakterisierung von Sequenzen, die das Transposon flankieren

DNA wurde aus einer der Mutanten, die in Beispiel 1 beschrieben sind (Pool 1, F10), extrahiert, mit SstI verdaut und auf der Basis von Kanamycin resistent subgeklont. Die Sequenz mit 450 bp, die ein Ende des Transposons flankierte, wurde unter Verwendung von Primer P7 bestimmt. Diese Sequenz zeigte eine 80%ige Idendität mit dem E. coli clp (Ion)-Gen, das eine wärmegesteuerte Proteas kodiert (Fig. 5). Nach unserer Kenntnis wurde dieses Gen vorher nicht mit einer Virulenz-Determinante in Verbindung gebracht.
In Fig. 6 sind partielle Sequenzen von 13 weiteren Salmonella typhimurium-Virulenzgenen dargestellt (Sequenzen A2 bis A9 und B1 bis B5). Abgeleitete Aminosäuresequenzen von P2D6, S4C3, P3F4, P7G2 und P9B7 tragen Ähnlichkeiten mit einer Familie von mit Sekretion verbundenen Proteinen, die überall in bakteriellen Pathogenen von Pflanzen und Tieren konserviert wurden und die bei Salmonella als die inv-Familie bekannt sind. Bei S. typhimurium sind die inv- Gene für eine bakterielle Invasion im Darmgewebe notwendig. Die Virulenz von inv-Mutanten wird abgeschwächt, wenn sie auf oralem Wege inokuliert werden, nicht aber wenn sie intraperitoneal verabreicht werden. Die Entdeckung von mit inv-verwandten Genen, die für Virulenz infolge einer intraperitonealen Inokulation erforderlich sind, legt einen neuen Sekretionsapparat nahe, der für einen Befall der nicht-phagozytären Zellen der Niere und anderer Organe erforderlich ist. Die Produkte dieser neuen Gene könnten bessere Arzneimittelziele darstellen als die inv-Proteine in der Behandlung von erfolgten Infektionen.
Eine weitere Charakterisierung der Gene, die in diesem Beispiel identifiziert wurden, ist in Beispiel 4 beschrieben.

Beispiel 3: LD&sub5;&sub0;-Bestimmungen und Untersuchungen über Mäuseimpfung

Mutationen, die durch das Verfahren der Erfindung identifiziert wurden, verringern eine Virulenz.
Fünf der Mutationen in Genen, die vorher nicht mit Virulenz in Verbindung gebracht worden waren, wurden durch eine P22- vermittelte Transduktion auf den auf Nalidixsäure empfindlichen Elternstamm von S. typhimurium 12028 transferiert. Transduktanten wurden durch Restriktionskartierung untersucht, dann auf intraperitonealem Weg Gruppen von BALB/c- Mäusen injiziert, um ihre 50%ig letale Dosis (LD&sub5;&sub0;) zu bestimmen. Die LD&sub5;&sub0;-Werte für die Mutanten S4SC3, P7G2, P3F4 und P9B7 waren alle um mehrere Größenordnungen höher als die des Wildtyp-Stamms. Kein Unterschied in der LD&sub5;&sub0; wurde für die Mutante PIF10 nachgewiesen: allerdings gab es eine statistisch deutliche Abnahme bei der Menge der PIF10- Zellen, die aus den Nieren der Mäuse wiedergewonnen wurden, welchen ein Impfmaterial, das aus einem gleichen Anteil dieses Stamms und des Wildtyp-Stamms bestand, injiziert worden war. Daraus ergibt sich, daß diese Mutation Virulenz abschwächt, allerdings zu einem Grad, der durch LD&sub5;&sub0; nicht nachweisbar ist.
Die Mutanten P3F4 und P9B7 wurden in einer Impfmaterial- Konzentration von 10&sup7; Zellen/Maus auch auf oralem Weg verabreicht. Keine der Mäuse wurde krank, was anzeigt, daß die oralen LD&sub5;&sub0;-Konzentrationen für diese Mutanten mindestens eine Größenordnung höher liegen als die des Wildtyp-Stamms.
Bei der Untersuchung der Mäuseimpfung wurden anfangs Gruppen aus fünf weiblichen BALB/s-Mäusen mit einer Masse von 20 bis 25 g oral (p.o.) oder intraperitoneal (i.p.) in Serie mit 10-fachen Verdünnungen von Salmonella typhimurium-Mutantenstämmen P3F4 und P9B7 inokuliert. Nach vier Wochen wurden die Mäuse dann mit 500c.f.u. des Eltern-Wildtyp-Stamms inokuliert. Über vier Wochen wurden dann die Todesfälle aufgezeichnet.
Eine Gruppe von zwei Mäusen mit demselben Alter und aus der gleichen Charge wie die Mäuse, die mit den Mutanten-Stämmen geimpft worden waren, wurden i.p. mit 500c.f.u. des Wildtyps als positive Kontrolle geimpft. Beide nichtimmunisierte Mäuse starben wie erwartet innerhalb von 4 Wochen.
Die Resultate sind im Folgenden tabelarisch aufgelistet: 1) p.o. Ausgangsinokulation mit Mutantenstamm P3F4 2) i.p. Ausgangsinokulation mit Mutantenstamm P3F4 3) p.o. Ausgangsinokulation mit Mutantenstamm p9B7 4) i.p. Ausgangsinokulation mit Mutante P9B7
Aus diesen Experimenten ist zu schließen, daß die Mutante P3P4 einen gewissen Schutz gegen einen nachfolgenden Wildtyp-Angriff zu geben scheint. Dieser Schutz scheint bei Mäusen, die i.p. immunisiert waren, größer zu sein.

Beispiel 4: Identifizierung einer Virulenz-Stelle, die ein zweites Sekretionssystem vom Typ III in Salmonella typhimurium kodiert

Die in diesem Beispiel verwendeten Abkürzungen sind VGC1 für Virulenzgen-Cluster 1; VGC2 für Virulenzgen-Cluster 2.
Hintergrund zu den beschriebenen Experimenten
Salmonella typhimurium ist wichtigstes Agens von Gastroenteritis bei Menschen und erzeugt eine allgemeine Krankheit bei Mäusen, die als Modell für menschliches Typhoidfieber (1) dient. Im Anschluß an eine orale Inokulation von Mäusen S. typhimurium gehen die Bakterien aus dem Lumen des Dünndarms durch die Darmschleimhaut, und zwar via Enterocyten oder M-Zellen der Peyer's Lappenfolikel (2). Die Bakterien befallen dann Makrophagen und neutrophile Leukocyten, treten in das retikuloendotheliale System ein und breiten sich auf andere Organe einschließlich der Niere und Leber aus, wo eine weitere Fortpflanzung zu einer überwältigenden und fatalen Bakteriämie führt (3). Um Wirtszellen zu befallen, um in einer Vielzahl von physiologisch streßfollen intrazellulären und extrazellulären Umgebungen zu überleben und zu replizieren und um die spezifischen antibakteriellen Aktivitäten des Immunsystems zu umgehen, wendet S. typhimurium ein verfeinertes Repertoir an Virulenzfaktoren an (4).
Um ein umfassenderes Verständnis des Virulenzmechanismus von S. typhimurium und von anderen pathogenen Mikroorganismen zu erreichen, wurde das Transposon-Mutagenese-System in Beispiel 1 beschrieben, das in passender Weise "durch Unterschrift markierte Mutagenese" ("signature-tagged mutagenesis" = STM) genannt wird und das die Stärke einer Mutationsanalyse mit der Fähigkeit, gleichzeitig das Schicksal einer großen Anzahl von unterschiedlichen Mutanten in einem einzigen Tier zu verfolgen, kombiniert (5 und Beispiel 1; Literaturstelle 5 wurde nach dem Prioritätsdatum für diese Erfindung veröffentlicht). Unter Anwendung dieses Verfahrens identifizierten wir 43 Mutanten mit reduzierter Virulenz aus insgesamt 1152 Mutanten, die wir durchmusterten. Die Nukleotidsequenzen von DNA, die die Insertionspunkte von Transposon in 5 dieser Mutanten flankierten, zeigten, daß sie mit Genen verwandt waren, die Sekretionssysteme, Typ III einer Vielzahl von bakteriellen Pathogenen Mikroorganismen kodieren (6, 7). Die Produkte des inv/spa-Genclusters von S. typhimurium (8, 9) sind Produkte, die ein Sekretionssystem, Typ III bilden, was für den Aufbau von Oberflächenansätzen erforderlich ist, die einen Eintritt in epitheliale Zellen vermitteln (10). Daher wird die Virulenz von Stämmen, die Mutationen in dem inv/spa-Cluster tragen, nur abgeschwächt, wenn das Impfmaterial oral verabreicht wird und nicht, wenn er intraperitoneal gegeben wird (8). Im Gegensatz dazu sind die 5 Mutanten, die durch STM identifiziert wurden, nach intraperitonealer Inokulation nicht virulent (5).
In diesem Beispiel zeigen wird, daß die Transposon- Insertionspunkte dieser 5 Mutanten und zusätzlicher 11 Mutanten, die durch STM identifiziert wurden, alle zu derselben Region des S. typhimurium-Chromosoms kartieren. Eine weitere Analyse dieser Region zeigte zusätzliche Gene, deren abgeleitete Produkte Sequenzähnlichkeit mit anderen Komponenten von Sekretionssystemen vom Typ III haben. Diese chromosomale Region, die wir als Virulenzgen-Cluster 2 (VGC2) bezeichnen, liegt in einer Reihe von anderen Enterobakterien nicht vor und stellt eine wichtige Stelle für die S. typhimurium-Virulenz dar.

Materialien und Methoden

Bakterienstämme, Transduktion und Wachstumsmedien

Salmonelle enterica, Serotypen 5791 (aberdeen), 423180 (gallinarum), 7101 (cubana) und 112416 (typhimurium LT2) wurden von den National Collections of Type Cultures, Public Health Laboratory Service, GB erhalten. Genomische DNA aus Salmonella typhi BRD123 war ein Geschenk von G. Dougan; enteropathogenes Escherichia coli (EPEC), enterohämorrhagisches E. coli (EHEC), Vibrio cholera Biotyp E1 Tor, Shigella flexneri Serotyp 2 und Staphylococcus aureus waren klinische Isolate, die von dem Department of Infectious Diseases and Baceteriology, Royal Postgraduate Medical School, GB, erhalten wurden. Genomische DNA aus Yersinia pestis war ein Geschenk von J. Heesemann. Allerdings kann genomische DNA unter Anwendung von Standardverfahren isoliert werden. Die Bakterienstämme und die Methoden, die zur Erzeugung von mit Unterschrift markierten mini-Tn5-Transposon-Mutanten von S. typhimurium NCTC, Stamm 12023, verwendet wurden, wurden früher beschrieben (5, 11). Eine Routinevermehrung von Plasmiden erfolgte in E. coli DH5α. Bakterien wurden in LB-Brühe (12), die mit den geeigneten Antibiotika ergänzt waren, wachsen gelassen. Bevor Virulenzlevel einzelner Mutantenstämme beurteilt wurden, wurden die Mutationen zuerst durch eine durch Phage P22 vermittelte Transduktion (12) auf den auf Nalidixsäure empfindlichen Elternstamm von S. typhimurium 12023 transferiert. Transduktanten wurden vor einer Verwendung als Impfmaterial durch Restriktionsverdauung und Southern- Hybridisierung analysiert.

Durchmustern einer Lamda-Bibliothek

Lamda (λ)-Klone mit überlappenden Insert-DNAs, die VGC2 überdecken, wurden nach Standardverfahren (13) aus einer λ1059-Bibliothek (14) erhalten, die Inserts aus dem Produkt einer partiellen Sau3A-Verdauung der genomischen DNA von S. typhimurium enthält. Die Bibliothek wurde via K. Sanderson von dem Salmonella Genetic Stock Centre (SGSC), Calgary, Canada erhalten.

Mud P22 Lysogene

Radioaktiv markierte DNA-Sonden wurden mit Hybond N (Amersham)-Filtern, die DNA trugen, die aus Lysaten eines Satzes von S. typhimurium-Stämmen, die Mud-P22-Prophagen an bekannten Positionen in dem S. typhimurium-Genom beherbergten, hergestellt worden war. Die Herstellung von durch Mitomycin induzierten Mud-P22-Lysaten war wie beschrieben (12, 15). Der Satz aus Mud-P22-Prophagen war ursprünglich von Benson und Goldman (16) zusammengestellt worden und wurde von dem SGSC erhalten.

Gel-Elektrophorese und Southern-Hybridisierung

Eine Gel-Elektrophorese wurde in 1%- oder 0,6%- Agarosegel-Durchgängen in 0,5 · TBE durchgeführt. Gelfraktionierte DNA wurde auf Hybond N- oder N+-Membranen (Amersham) transferiert; strenge Hybridisierung und Waschschritte (Zulassen einer Hybridisierung zwischen Nukleotidsequenzen mit 10% oder weniger nicht Übereinstimmung) waren so, wie es bei Holden et al. (17) beschrieben ist. Bei nicht strengen Bedingungen (Zulassen einer Hybridisierung zwischen Sequenzen mit 50%iger Nicht-Übereinstimmung) wurden Filter über Nacht bei 42ºC in 10% Formamid/0,25 M Na&sub2;HPO&sub4;/7% SDS durchgeführt; der strengste Schritt wurde mit 20 mM innerhalb Na&sub2;HPO&sub4;/l % SDS bei 42ºC durchgeführt. DNA-Fragmente, die als Sonden verwendet wurden, wurden mit [32P]dCTP unter Verwendung des "Radprime"- System (Gibco-BRL) oder mit [Digoxigenin-11]dUTP markiert und nachgewiesen, wobei das Digoxigenin-System (Boehringer Mannheim) entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde, außer daß eine Hybridisierung in derselben Lösung wie die, die für radioaktiv markierte Sonden verwendet wurde, durchgeführt wurde. Genomische DNA wurde zur Southern-Hybridisierung hergestellt, wie es vorstehend beschrieben ist (13).

Molekulare Klonierung und Nukleotidsequenzierung

Restriktionsendonukleasen und T4-DNA-Ligase wurden von Gibco-BRL erhalten. Allgemeine Molekularbiologie-Techniken waren, wie sie von Sambrook et al. beschrieben sind (18). Eine Nukleotidsequenzierung wurde durch das Dideoxy-Kettenbeendigungsverfahren (19) unter Verwendung eines T7-Sequenzierungskits (Pharmacia) durchgeführt. Sequenzen wurden mit der MacVector 3,5-Software oder AssemblyLIGN-packages aufgebaut. Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen wurden mit denen der European Molecular Biology Laboratory (EMBL) und den SwissProt-Datenbanken verglichen, wobei BLAST- und FASTA-Programme des GCG-Paketes von der University of Wisconsin (Version 8) (20) mit dem Netzwerkservice im Human Genome Mapping Project Resource Centre, Hinxton, GB verwendet wurden.

Virulenz-Tests

Gruppen aus fünf weiblichen BALB/c-Mäusen (20-25 g) wurden oral (p. o.) oder intraperitoneal (i. p.) mit 10-fachen Verdünnungen von Bakterien, die in physiologischer Salzlösung suspendiert waren, inokuliert. Zur Herstellung des Impfmaterials waren Bakterien bei 37ºC in LB-Brühe unter Schütteln (50 Upm) wachsen gelassen und dann zum Beimpfen von frischem Medium für verschieden lange Zeiträume verwendet, bis eine optische Dichte (OD) bei 560 nm von 0,4 bis 0,6 erreicht war. Für Zelldichten von 5 · 10&sup8; kolonienbildender Einheiten ("colony forming units", cfu) pro ml und darüber wurden Kulturen durch Zentrifugation konzentriert und in Salzlösung resuspendiert. Die Konzentration von cfu/ml wurden geprüft, indem eine Verdünnungsreihe des Impfmaterials auf LB-Agarplatten aufgetragen wurde. Mäuse wurde i.p. mit 0,2 ml Volumen und p.o. durch Gabe desselben Volumens Impfmaterial inokuliert. Die LD&sub5;&sub0;-Werte wurden nach 28 Tagen durch das Verfahren von Reed und Meunch (21) errechnet.

Resultate

Lokalisierung von Transposon-Insertionen

Die Herstellung einer Bank von Salmonella typhimuriummini Tn5-Transposon-Mutanten und der Screen, der zur Identifizierung von 43 Mutanten mit abgeschwächter Virulenz verwendet wird, wurden bereits früher (5) beschrieben. Transposone und flankierende DNA-Regionen wurden aus Exkonjuganten durch Selektion nach Kanamycin-Resistenz oder durch umgekehrte PCR geklont. Aus 33 Mutanten wurden Nukleotidsequenzen mit 300 bis 600 bp DNA, die die Transposone flankieren, erhalten. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denen in den DNA- und Protein-Datenbanken zeigte an, daß 14 Mutanten aus Transposoninsertionen in vorher bekannte Virulenzgene resultierten, 7 aus Insertionen in neue Gene mit Ähnlichkeit zu bekannten Genen der Enterobakterien entstanden, und 12 aus Insertionen in Sequenzen ohne Ähnlichkeit zu Eintragungen in den DNA- und Protein-Datenbanken resultierten (Literaturstelle 5, Beispiel 1 und dieses Beispiel).
Drei Beweise legten nahe, daß 16 von 19 Transposoninsertionen in neue Sequenzen sich in drei Regionen des Genoms sammelten, die anfänglich A, B und C genannt wurden. Erstens, ein Vergleich der Nukleotidsequenzen aus Regionen, die die Transposon-Insertionspunkte flankierten, mit einander und mit denen in Datenbanken zeigte, daß einige Sequenzen miteinander überlappten oder eine starke Ähnlichkeit zu verschiedenen Regionen desselben Gens hatten. Zweitens, eine Southern-Analyse von genomischer DNA, die mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut worden war und mit Restriktionsfragmenten, die die Transposon-Insertionspunkte flankieren, sondiert worden war, daß einige Transposon- Insertionen an denselben Restriktionsfragmenten lokalisiert waren. Drittens, wenn dieselben DNA-Sonden mit Plaque aus einer S. typhimurium-λ-DNA-Bibliothek hybridisiert wurden, stellten wir fest, daß die Sonden aus Mutanten, von denen die zwei vorangehenden Schritte angeregt hatten, daß miteinander verbunden werden könnten, mit denselben λ-DNA- Klonen hybridisierten. Somit wurden zwei Mutanten (P9B7 und P12F5) Cluster A, fünf Mutanten (P2D6, P9B6, P11C3, P11D10 und P11H10) Cluster B und neun Mutanten (P3F4, P4F8, P7A3, P7B8, P7G2, P8G12, P9G4, P10E11 und P11B9) Cluster C zugeteilt (Fig. 8).
Eine Hybridisierung von DNA-Sonden aus diesen drei Clustern mit Lysaten aus einem Satz S. typhimurium-Stämmen, die Mud- P22-Prophagen eingeschlossen enthielten (15, 16), zeigte, daß die drei Stellen alle in der Region von 30 bis 31 min lokalisiert waren (Edition VIII, Literaturstelle 22) (Fig. 7), was anzeigte, daß die drei Stellen eng an eine große Virulenzstelle gebunden waren oder diese bildeten. Um zu bestimmen, ob einer der λ-Klone, die Cluster A, B und C überdeckten, überlappende DNA-Inserts enthielt, wurden DNA- Fragmente aus den terminalen Regionen jedes Klons als Sonden in der Southern-Hybridisierungsanalyse der anderen λ-Klone verwendet. Hybridisierende DNA-Fragmente zeigten, daß mehrere λ-Klone überlappen und daß Cluster A, B und C benachbarte Region umfassen (Fig. 8). DNA-Fragmente von den Enden dieser Region wurden dann verwendet, um die λ- Bibliothek zu sondieren, um so weitere Klone zu identifizieren, die Inserts enthalten, welche die Nachbarregionen repräsentieren. Es wurden keine λ-Klone identifiziert, die das äußere rechtshändige Ende der Stelle bedecken, so daß diese Region durch Klonierung eines 6,5 kb EcoRI/XbaI- Fragments aus dem Lysat des Mud-P22-Prophagenstamm TT15244 (16) erhalten wurde.
Danach wurden Restriktionskartierung und Southern- Hybridisierungsanalyse angewendet, um eine physikalische Karte dieser Stelle zu konstruieren (Fig. 8). Um diese Stelle von dem gut charakterisierten inv/spa-Gencluster bei Minute 63 (Edition VIII, Literaturstelle 22) (8, 9, 23, 24, 25, 26) zu unterscheiden, bezeichnen wir das zuletzt genannte als Virulenzgen-Cluster 1 (VGC1) und nennen die neue Virulenzstelle VGC2. Fig. 2 zeigt die Position von zwei Teilen der DNA, deren Nukleotidsequenz bestimmt wurde ("Sequenz 1" und "Sequenz 2"). Die Nukleotidsequenz ist in den Fig. 11 und 12 dargestellt.

Kartierung der Grenzen von VGC2 auf dem S. typhimurium- Chromosom

Eine Nukleotidsequenzierung von λ-Klon 7 an der linksgängigen Seite VGC2 zeigte das Vorliegen eines offenen Leserasters (ORF), dessen abgeleitete Aminosäuresequenz zu über 90% mit dem abgeleiteten Produkt eines Segments des ydhE -Gen von E. coli identisch ist; eine Sequenzierung des geklonten 6,5 kb EcoRI/XbaI an der rechtsgängigen Seite von VGC2 zeigte daß Vorliegen eines ORF, dessen vorhergesagte Aminosäuresequenz zu über 90% mit Pyruvatkinase I von E. coli, die durch das pykF-Gen kodiert wird, identisch ist (27). Auf dem E. coli-Chromosom liegen ydhE und pykF eng nebeneinander, und zwar bei Minute 37 bis 38 (28). Elf nichtüberlappende DNA-Fragmente, die auf der Länge von VGC2 verteilt waren, wurden als Sonden in einer nicht strengen Southern-Hybridisierungsanalyse der genomischen DNA von E. coli und S. typhimurium eingesetzt. Eine Hybridisierung von DNA-Fragmenten zeigte, daß eine Region von annähernd 40 kb, die VGC2 enthielt, im E. coli-Genom felhte und daß die Grenzen von VGC2 innerhalb eines 1 kb lagen (Fig. 9). Ein Vergleich der Lage der XbaI-Stelle in der Nähe des rechtsgängigen Endes von VGC2 (Fig. 8) mit einer Karte von bekannten XbaI-Stellen (29) in der Region von Minute 30 des Chromosoms (22) ermöglicht es, daß eine Kartenposition von 30,7 min für VGC2 abgeleitet wird.

Struktur von VGC2

Eine Nukleotidsequenzierung von Teilen aus VGC2 zeigte das Vorliegen von 19 ORFs (Fig. 8). Der G+C-Gehalt von etwa 26 kb Nukleotidsequenz in VGC2 ist 44,6%; im Vergleich dazu werden 47% für VGC1 (9) und 51 bis 53% für das gesamte Salmonella-Genom (30) geschätzt.
Die kompletten abgeleiteten Aminosäuresequenzen für ORFs 1-11 entsprechen denen von Proteinen der Sekretionssysteme, Typ III (6, 7), von denen bekannt ist, daß sie für die Abgabe von Virulenzdeterminanten in einer Vielzahl von bakteriellen Pathogenen von Pflanzen und Tieren notwendig sind (7). Die vorhergesagten Proteine von ORFs 1-8 (Fig. 8) entsprechen in Gliederung und Sequenz den Produkten der ysch-U-Gene von Yersinia pseudotuberculosis (31), invC/spaS des inv/spa-Clusters in VGC1 von Salmonella typhimurium (8, 9) und spa47/spa40 des spa/mxi-Clusters von Shigella flexneri (32, 33, 34, 35). Beispielsweise ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von ORF3 (Fig. 8) zu 50% identisch mit YscS von Y. pseudotuberculosis (31), zu 34% identisch mit Spa9 von S. flexneri (35) und zu 37% identisch mit SpaQ von VGC1 von S. typhimurium (9). Das vorhergesagte Proteinprodukt von ORF9 ist eng verwandt mit der LcrD-Proteinfamilie, und zwar hat es eine 43%ige Identität mit LcrD von Y. enterocolitica (36), eine 39%ige Identität mit MxiA von S. flexneri (32) und eine 40%ige Identität mit InvA von VGC1 (23). Partielle Nukleotidsequenzen für die verbleibenden ORFs, die in Fig. 8 angegeben sind, lassen erkennen, daß das vorhergesagte Protein von ORF10 Y. enterocolitica YscJ (37) am ähnlichsten ist, ein Lipoprotein, das in der Bakterien-Außenmembran liegt, während ORF11 S. typhimurium InvG, einem Glied der PulD-Famile von Translocasen, ähnlich ist (38). ORF12 und ORF13 zeigen deutliche Ähnlichkeit zu den Sensor- bzw. Regulator-Untereinheiten aus einer Vielzahl von Proteinen, die zwei Komponenten-Regulatorsysteme umfassen (39). Es gibt reichliche Kodierungskapazität für weitere Gene zwischen ORF9 und 10, ORF10 und 11 und zwischen ORF19 und dem rechtsgängigen Ende von VGC2.

VGC2 ist bei Salmonellae konserviert und ist spezifisch für Salmonellae

Ein 2, 2 kb PstI/HindIII-Fragment, das in der Mitte von VGC2 lokalisiert ist (Sonde B, Fig. 8) und dem Sequenzähnlichkeit mit Eintragungen in den DNA- und Protein-Datenbanken fehlt, wurde als Sonde bei einer Southern-Hybridisierungsanalyse von genomischer DNA aus Salmonella-Serotypen und anderen pathogenen Bakterien verwendet (Fig. 10A). DNA- Fragmente, die unter nicht strengen Bedingungen hybridisieren, zeigten, daß VGC2 in S. aberdeen, S. gallinarum, S. cubana, S. typhi vorhanden ist und bei EPEC, EHEC, Y. pestis, S. flexneri, V. cholera und S. aureus fehlt. Somit wird VGC2 bei Salmonellae konserviert und ist wahrschein lich spezifische für Salmonellae. Um zu bestimmen, ob der Aufbau der Stelle bei den untersuchten Salmonella-Serotypen konserviert wird, wurden strenge Southern-Hybridisierungen mit genomischer DNA, die mit zwei weiteren Restriktionsenzymen verdaut worden war, durchgeführt. Hybridisierende DNA-Fragmente zeigten, daß es eine gewisse Heterogenität in der Anordnung von Restriktionsstellen zwischen S. typhimurium LT2 und S. gallinarum, S. cubana und S. typhi (Fig. 10B) gibt. Darüber hinaus enthalten S. gallinarum und S. typhi zusätzlich zu den in anderen untersuchten Salmonellae vorliegenden hybridisierende Fragmente, was nahe legt, daß Regionen von VGC2 in diesen Spezies verdoppelt wurden.

VGC2 ist für Virulenz bei Mäusen notwendig

Vorhergehende Experimente zeigten, daß die LD&sub5;&sub0;-Werte für eine i.p.-Inokulation von Transposon-Mutanten P3F4, P7G2, P9B7 und P11C3 mindestens 100-mal größer waren als die des Wildtyp-Stamms (5). Um die Bedeutung von VGC2 im Infektionsprozeß zu klären, wurden die p.o.- und i.p.-LD&sub5;&sub0;-Werte für die Mutanten P3F4 und P9B7 bestimmt (Tabelle 1). Beide Mutanten zeigten eine Verringerung der Virulenz in der Größenordnung des mindestens 5-fachen bei jedem Inokulationsweg im Vergleich zu dem Elternstamm. Diese starke Verringerung der Virulenz auf beiden Inokulationswegen zeigt, daß VGC2 für Vorgänge im Infektionsprozeß nach einer Penetration von epithelialen Zellen bei BALB/c-Mäusen erforderlich ist. Tabelle 1: LD&sub5;&sub0;-Werte von S. typhimurium-Stämmen
cfu = koloniebildende Einheit

Diskussion

Es wurde eine bisher unbekannte Virulenzstelle in S. typhimurium mit etwa 40 kb, die sich bei Minute 30,7 auf dem Chromosom befindet, durch Kartieren der Insertionspunkte einer Gruppe von durch Unterschrift markierten Transposon-Mutanten mit abgeschwächter Virulenz identifiziert (5). Diese Stelle wird als Virulenzgen-Cluster 2 (VGC2) bezeichnet, um sie von den inv/spa-Virulenzgenen bei 63 min (Edition VIII, Literaturstelle 22), für die wir die Bezeichnung VGC1 vorschlagen, zu unterscheiden. VGC1 und VGC2 kodieren beide Komponenten von Sekretionssystemen vom Typ III. Allerdings sind diese Sekretionssysteme in ihrer Funktion unterschiedlich.
Von 19 Mutanten, die aus Insertionen in neue Gene (Literaturstelle 5 und dieses Beispiel) entstanden, wurden 16 in dieselbe Region des Chromosoms kartiert. Es ist möglich, daß mini-Tn5-Insertion vorzugsweise in VGC2 auftritt. Da die angewendete negative Selektion zur Identifizierung von Mutanten mit abgeschwächter Virulenz (5) sehr streng war (wiedergegeben durch die hohen LD&sub5;&sub0;-Werte für VGC&sub2;-Mutan ten), ist es alternativ möglich, daß unter den vorher unbekannten Genen nur Mutationen in denen von VGC2 zu einem ausreichenden Grad der Abschwächung führen, der ausreicht, um bei der Durchmusterung aufgedeckt zu werden. Das Fehlen früherer Nachforschungen nach S. typhimurium Virulenz- Determinanten zur Identifizierung von VGC2 könnte aus dem Vertrauen herrühren, das eher Zellkulturuntersuchungen als einem lebenden Tiermodell für Infektion gegeben wird. Eine frühere Untersuchung, die Regionen des S. typhimurium LT2- Chromosoms, die einzig bei Salmonellae auftreten (40), identifizierte, lokalisierte eine solche Region (RF333) bei 30,5 bis 32 Minuten. Daher kann RF333 VGC2 entsprechen, obgleich es nicht bekannt war, daß RF333 bei einer Virulenzbestimmung involviert war.
Vergleiche mit den Sekretionssystemen vom Typ III, die durch das Virulenzplasmid von Yersinia und Shigella kodiert werden, wie auch mit VGC1 von Salmonella zeigen, daß VGC2 die Grundstrukturkomponenten des Sekretionsapparates kodiert. Darüber hinaus ist die Reihenfolge von ORFs 1-8 in VGC2 dieselbe wie die Genreihenfolge bei Homologen in Yersinia, Shigella und VGC1 von S. typhimurium. Die Tatsache, daß der Aufbau und die Struktur des VGC2-Sekretionssystems nicht enger mit VGC1 als mit den entsprechenden Genen von Yersinia verwandt ist, legt zusammen mit dem niedrigen G+C-Gehalt von VGC2 nahe, daß VGC2 wie VGC1 (40, 41, 42) unabhängig voneinander via horizontale Transmission von S. typhimurium erworben wurde. Die Proteine, die durch die ORFs 12 und 13 kodiert werden, zeigen starke Ähnlichkeit mit bakteriellen Zweikomponenten-Regulatoren (39) und könnten jedes der ORFs 1-11 und/oder die sekretierten Proteine dieses Systems steuern.
Viele Gene in VGC1 haben gezeigt, daß sie für den Eintritt von S. typhimurium in epitheliale Zellen wichtig sind. Dieser Prozeß erfordert bakteriellen Kontakt (2) und resultiert in zytoskeletalen Neuanordnungen, die zu einer lokalisierten Membrankräuselung führen (43, 44). Die Rolle von VGC1 und seine Beschränkung auf diese Stufe der Infektion wird in der annähernd 50-fachen Abschwächung der Virulenz bei BALB/c-Mäusen, die p.o. mit VGC1-Mutanten inokuliert wurden, und durch die Tatsache, daß VGC1- Mutanten keinen Virulenzverlust zeigen, wenn sie i.p. verabreicht werden (8), wiedergegeben. Die zweite Beobachtung erklärt auch, warum keine VGC1-Mutanten auf unserem Film erhalten wurden (5). Im Gegensatz dazu sind Mutanten in VGC2 sowohl als Folge einer p.o.- wie auch als Folge einer i.p.-Inokulation stark geschwächt. Dies zeigt, daß VGC2 im Gegensatz zu VGC1 für Virulenz in Mäusen nach einer epithelialen Zellpenetration erforderlich ist; allerdings schließen diese Feststellungen eine Rolle von VGC1 in dieser frühen Infektionsstufe nicht aus.
Zusammenfassend führte damit eine Kartierung der Insertionspunkte von 16 mit Signatur-markierten Transposon- Mutanten auf dem Salmonella typhimurium-Chromosom zu der Identifizierung eines 40 kb-Virulenzgens-Clusters bei 30,7 Minuten. Diese Stelle wird bei allen anderen untersuchten Salmonella-Spezies beibehalten, ist aber bei einer Vielzahl anderer pathogener Bakterien oder in Escherichia coli K12 nicht vorhanden. Die Nukleotidsequenzierung eines Teils dieser Stelle zeigte 11 offene Leseraster, deren vorhergesagte Proteine, Komponenten eines Sekretionssystems vom Typ III kodieren. Um zwischen diesen und dem Sekretionssystem vom Typ III, die durch die inv/spa-Invasionsstelle kodiert wird, zu unterscheiden, bezeichnen wir die inv/spa-Stelle als Virulenzgen-Cluster 1 (VGC1) und die neue Stelle VGC2. VGC2 hat einen geringeren G+C-Gehalt als das Salmonella-Genom und wird von Genen flankiert, deren Produkte eine mehr als 90%ige Identität mit denen der E. coli ydhE- und pykF-Gene teilen. Somit wird VGC2 wahrscheinlich horizontal durch Inserteion in einer Region, die der zwischen den ydhE- und pdykF-Genen von E. coli entspricht, erworben. Virulenzuntersuchungen an VGC2-Mutanten haben gezeigt, daß diese im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm nach oralter oder intraperitonealer Inokulation um mindestens 5 Größenordnungen geschwächt sind.

Literaturstellen für dieses Beispiel

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Beispiel 5: Identifizierung von Virulenzgenen in Streptococcus pneumoniae

(a) Mutagenese

Bei Fehlen eines passenden Transposonsystems ist der wirksamste Weg zur Bildung von markierten Mutanten von Streptococcus pneumoniae die Anwendung einer Insertions- Duplikations-Mutagenese (Morrison et al. (1984), J. Bacteriol. 159, 870). Statistische S. pneumoniae-DNA- Fragmente mit 200 bis 400 bp werden durch Verdauung von genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym oder durch physikalisches Scherzerkleinern mit Ultraschall und anschließende Gel-Fraktionierung und eine Wiederherstellung der DNA-Enden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase gebildet. Die Fragmente werden in Plasmid pJDC9 (Pearce et al. (1993), Mol. Microbiol. 9, 1037, das das erm-Gen für Erythormycin-Selektion in E. coli und S. pneumoniae trägt), das vorher durch Einbau von DNA-Sequenz-Markierungen in eine der Polylinker-Klonierungsstellen modifiziert worden war, gebunden. Die Größe von klonierter S. pneumoniae-DNA ist ausreichend, um eine homologe Rekombination zu gewährleisten, und reduziert die Möglichkeit der Bildung einer nicht repräsentativen Bibliothek in E. coli (die Expression von S. pneumoniae-Proteinen kann für E. coli toxisch sein). Es sind alternative Vektoren verfügbar, die verschiedene selektierbare Marker tragen und die anstelle von pJDC9 verwendet werden können. Markierte Plasmide, die DNA-Fragmente tragen, werden in einen geeigneten S. pneumoniae- Stamm eingeführt, der auf der Basis von Serotyp und Virulenz in einem murinen Modell von Pneumococcen-Pneumonie ausgewählt wird. Die Regulierung der Tauglichkeit zur genetischen Transformation in S. pneumoniae wird durch einen Kompetenzfaktor gesteuert, ein Peptid aus 17 Aminosäuren, das kürzlich von der Don Morrisons Gruppe an der University of Illinois in Chicago charakterisiert wurde und das in Havarstein, Coomaraswamy und Morrison (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11140-11144 beschrieben wird. Ein Einbau von sehr kleinen Mengen dieses Peptids in Transformationsexperimente führt zu sehr effizienten Transformationshäufigkeiten bei einigen eingekapselten klinischen Isolaten von S. pneumoniae. Dies überwindet eine Haupthürde in der Pneumococcen-Molekulargenetik; die Verfügbarkeit des Peptids erleichtert den Aufbau von S. pneumoniae-Mutantenbanken stark und gestattet Flexibilität bei der Auswahl des zu mutierenden Stamms (der zu mutierenden Stämme). Ein Teil der Transformanten wird analysiert, um die homologe Integration der Plasmidsequenzen zu bestätigen, und auf Stabilität untersucht. Der sehr niedrige Umkehrlevel, der mit Mutanten assoziiert ist, die durch Insertion-Duplikation erzeugt werden, wird durch die Tatsache, daß die duplizierten Regionen kurz sind (200-400 bp), auf ein Minimum reduziert; wenn allerdings der Umkehrlevel unannehmbar hoch ist, wird eine Antibiotikaselektion während des Wachstums der Transformanten in Kultur und während des Wachstums im Tier aufrecht erhalten.

(b) Tiermodell

Die S. pneumoniae-Mutantenbank ist in Pools zur Inokulation in Swiss- und/oder C57B/l/6-Mäuse eingeteilt. Es werden vorbereitende Experimente durchgeführt, um die optimale Komplexität der Pools und den optimalen Level des Impfmaterials zu bestimmen. Ein attraktives Modell verwendet Impfmaterialien mit 105 cfu, die durch den Mund in die Luftröhre abgegeben werden (Veber et al. (1993), J. Antimicrobial Chemodtherapy 32, 473). Swiss-Mäuse entwickeln eine akute Pneumonie innerhalb von 3 bis 4 Tagen, C57B1/6-Mäuse entwickeln subakute Pneumonie innerhalb von 8 bis 10 Tagen. Diese Lungeninfektionsmodelle führen zum Zeitpunkt des Todes zu 108 cfu/Lunge (Veber et al. (1993), J. Antimicrobial Chemotherapy 32, 473). Wenn es erforderlich ist, erhalten Mäuse auch intraperitoneale Injektionen zur Identifizierung von Genen, die für eine Blutfluß-Infektion notwendig sind (Sullivan et al. (1993), Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37, 234).

(c) Virulenzgen-Identifizierung

Wenn die Parameter des Infektionsmodells optimiert sind, wird eine Mutantenbank, die aus mehreren tausend Stämmen besteht, Virulenztest unterworfen. Mutanten mit abgeschwächter Virulenz werden durch Hybridisierungsanalyse identifiziert, bei der markierte Markierungen aus dem "Eingabe-" und "wiedergewonnenen" Pool als Sonden verwendet werden. Wenn S. pneumoniae-DNA nicht einfach aus einer Kolonie aufgesaugt werden kann, wird chromosomale DNA in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten vor einem Transfer auf Nylon-Membranen chemisch oder enzymatisch freigesetzt, wobei eine Dot-Blot-Apparatur verwendet wird. DNA, die das integrierte Plasmid flankiert, wird in E. coli durch Plasmidhilfe geklont (Morrison et al. (1984), J. Bacteriol. 159, 870) und sequenziert. Genomische DNA-Bibliotheken werden in geeigneten Vektoren aufgebaut, die entweder in E. coli oder einem Gram-positiven Wirtsstamm gehalten werden, und werden mit Restriktionsfragmenten, die das integrierte Plasmid flankieren, sondiert, wobei geklonte Virulenzgene isoliert werden, die dann vollständig sequenziert werden und einer detaillierten Funktionsanalyse unterworfen werden.

Beispiel 6: Identifizierung von Virulenzgenen in Enterococcus faecalis

(a) Mutagenese

Mutagenese von E. faecalis wird unter Verwendung von Plasmid pAT112 oder einem Derivat, das für diesen Zweck entwickelt wurde, ausgeführt. pAT112 trägt Gene zur Selektion sowohl in Gram-negativen wie in Gram-positiven Bakterien und die att-Stelle von Tn1545. Seine Gegenwart ist daher im Wirtsstamm der Integrase zur Transposition erforderlich; es werden stabile, einzelne Kopieinsertionen erhalten, wenn der Wirt kein Exzisionase-Gen enthält (Trieu- Cuot et al. (1991), Gene 106, 21). Eine Wiedergewinnung von DNA, die das integrierte Plasmid flankiert, wird durch Restriktionsverdauung von genomischer DNA, intramolekularer Ligation und Transformation von E, coli erreicht. Das Vorhandensein von einzelnen Stellen für Restriktionsenzyme in pAT112 und seinen Derivaten wird (Trieu-Cuot et al. (1991), Gene 106, 21) den Einbau von DNA-Sequenzmarkierungen vor einer Übertragung auf einen virulenten Stamm von E. faecalis, der Plasmid pAT145 trägt (zur Bereitstellung der Integrasefunktion) entweder durch Konjugation, Elektroporation oder Transformation gestatten (Trieu-Cuot et al. (1991), Gene 106, 21; Wirth et al. (1986), J. Bacteriol. 165, 831).

(b) Tiermodell

Eine große Anzahl von Insertionsmutanten werden auf statistische Integration des Plasmids durch Isolierung von DNA aus Transzipienten, Restriktionsenzymverdauung und Southern-Hybridisierung analysiert. Einzlene Mutanten werden in denyertiefungen von Mikrotiterplatten aufbewahrt; Komplexität und Größe von Pool-Impfmaterialien werden vor einer Durchmusterung der Mutantenbank optimiert. Es werden zwei unterschiedliche Modelle einer Infektion, die E. faecalis verursacht wird, verwendet. Das erste ist ein etabliertes Endocarditis-Rattenmodell, das eine Schwanzveneninjektion von bis zu 10&sup8; cfu von E. faecalis in Tiere, denen ein Katheter durch die aortale Klappe eingesetzt worden war, beinhaltet (Whitman et al. (1993), Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37, 1069). Die Tiere werden zu verschiedenen Zeiten nach der Inokulation getötet; dann werden bakterielle Vegetationen an der aortalen Klappe herausgeschnitten, homogenisiert und zur Isolierung von Bakterienkolonien auf Kulturmedium aufgetragen. Außerdem werden virulente Bakterien zu verschiedenen Zeiten nach der Inokulation aus dem Blut gewonnen. Das zweite Modell ist das von Peritonitis bei Mäusen als Folge einer intraperitonealen Injektion von bis zu 10&sup9; cfu E. faecalis (Chenoweth et al. (1990), Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34, 1800). Wie bei dem S. pneumonieae- Modell wurden vorbereitende Experimente zur Festsetzung der optimalen Komplexität der Pools und des optimalen Impfmateriallevels vor einer Durchmusterung der Mutantenbank durchgeführt.

(c) Virulenzgen-Identifizierung

Die Isolierung von DNA, die die Integrationsstelle von pAT112 flankieren unter Verwendung ihre E. coli-Replikationsursprungs wird durch das Fehlen von Stellen für die meisten der üblicherweise verwendeten 6 bp-Erkennungs- Restriktionsenzyme in dem Vektor vereinfacht. Daher wird DNA aus den interessierenden Stämmen mit einem dieser Enzym verdaut, selbst ligiert, in E. coli transformiert und unter Verwendung von Primer auf der Basis der Sequenzen, die den att-Stellen auf dem Plasmid benachbart sind, sequenziert. Eine genomische DNA-Bibliothek von E. faecalis wird mit interessierenden Sequenzen sondiert, um intakte Kopien von Virulenzgenen zu identifizieren, die dann sequenziert werden.

Beispiel 7: Identifizierung von Virulenzgenen in Pseudomonas aeruginosa

(a) Mutagenese

Da Transposon Tn5 unter anderem zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa mit einem Mutagen verwendet wurde, und von dem mini-Tn5-Derivat, das zur Identifizierung von Salmonella typhimurium-Virulenzgenen verwendet wurde (Beispiel 1), berichtet wird, daß es eine breite Verwendung unter Gram-negativen Bakterien, einschließlich verschiedener Pseudomonas (DeLorenzo und Timaris (1994), Methods Enzymol. 264, 386) findet, wird eine P. aeruginosa- Mutantenbank unter Verwendung unseres vorhandenen Pools aus mit Signature markierten mini-Tn5-Transposonen durch konjugalen Transfer des Selbstmordvektors auf einen oder mehrere virulente (und möglicherweise mukoide) Rezipientenstämme aufgebaut. Dieses Verfahren stellt eine merkliche Zeitersparnis dar. Weitere Derivate von Tn5, die speziell für eine P. aeruginosa-Mutagenese geplant wurden (Rella et al. (1985), Gene 33, 293) können alternativ mit dem mini-Tn5- Transposon verwendet werden.

(b) Tiermodell und Virulenzgen-Indentifizierung

Die Bank aus P. aeruginosa-Insertionsmutanten wird nach abgeschwächter Virulenz bei einem Modell einer chronischen Lungeninfektion bei Ratten durchgemustert. Suspensionen von P. aeruginosa-Zellen werden in einen Bronchus nach Tracheostomie eingeführt; eine Erkrankung entwickelt sich über einen Zeitraum von 30 Tagen (Woods et al. (1982), Infect. Immun. 36, 1223). Bakterien werden durch Plattieren von Lungenhomogenaten auf Labormedium wiedergewonnen; Sequenzmarkierungen aus diesen werden verwendet, um DNA- Kolonie-Blots aus Bakterien, die als Impfmaterial eingesetzt werden, zu sondieren. Es ist auch möglich, die · Mutantenbank Virulenztests in einem Modell von endogener Bakterieämie (Hirakata et al. (1992), Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36, 1198) und cystischer Fibrose in Mäusen (Davidson et al. (1995), Nature Genetics 9, 351) zu unterwerfen. Klonierung und Sequenzierung von DNA, die die Transposone flankiert, wird durchgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Bibliotheken genomischer DNA zur Isolierung und Sequenzierung von intakten Kopien der Gene werden im Labor durch Standardverfahren erstellt.

Beispiel 8: Identifizierung von Virulenzgenen in Aspergillus fumigatus

(a) Mutagenese

Das funktionelle Äquivalent der Transposonmutagenese in Pilzen ist die durch Restriktionsenzym vermittelte Integration (REMI) von transformierender DNA (Schiestl and Petes (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7585). In diesem Verfahren werden Pilzzellen mit DNA-Fragmenten, die einen selektierbaren Marker tragen, in Gegenwart eines Restriktionsenzyms transformiert. Einfache Kopieintegrationen treten an unterschiedlichen genomischen Stellen auf, die durch die Target-Sequenz des Restriktionsenzyms definiert sind. REMI wurde bereits erfolgreich zur Isolierung von Virulenzgenen von Cochliobolus (Lu et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12649) und Ustilago (Bolker et al. (1995), Mol. Gen. Genet. 248, 547) verwendet; es hat sich gezeigt, daß eine Verbindung eines aktiven Restriktionsenzyms mit einem Plasmid, das Hygromycin-Beständigkeit kodiert, zu einer einfachen und offenbar statistischen Integration des linearen Plasmids in das A. fumigatus-Genom führt. An einer günstigen Stelle werden Sequenzmarkierungen in einen oder zwei Vektoren zur Hygromycin-Beständigkeit eingeführt und zur Transformation eines klinischen Isolats von A. fumigatus verwendet.

(b) Tiermodell und Virulenzgen-Identifizierung

Das Aspergillose-Niedrigdosis-Modell in neutropenischen Mäusen entspricht dem Verlauf einer Lungenerkrankung bei Menschen besonder gut (Smith et al. (1994), Infect. Immun. 62, 5247). Mäuse werden intranasal mit bis zu einer Million Condiosporen/Maus beimpft. Virulente Pilzmutanten werden 7 bis 10 Tage später wiedergewonnen, indem Lugenhomogenate zur Beimpfung von flüssigem Medium verwendet werden. Nach wenigen Stunden werden Hyphen gesammelt, aus denen DNA zur Amplifikation und Markierung von Markierung extrahiert wird, um Kolonienblots aus DNA aus dem Transformantenpool, der das Impfmaterial enthält, zu sondieren. DNA aus den Regionen, die die REMI-Insertionspunkte flankieren, werden durch Verdauen der Transformanten-DNA mit Restriktionsenzym, das außerhalb des REMI-Vektors schneidet, Selbstligation und Transformation von E. coli geklont. Es werden Primer auf der Basis der bekannten Sequenz des Plasmids verwendet, um die benachbarten A. fumigatus-DNA-Sequenzen zu bestimmen. Um zu beweisen, daß die Insertion des Vektors die Ursache für den nicht-virulenten Phänotyp war, wird das wiedergewonnene Plasmid erneut mit demselben Restriktionsenzym, das zux Klonierung verwendet wurde, geschnitten und zurück zu dem Elternstamm A. fumigatus, Wildtyp, transformiert. Transformanten, die durch homologe Rekombination entstanden waren, werden dann Virulenztests unterworfen.

Literaturstellen (andere als für Beispiel 4)

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Claims

1. Verfahren zur Identifizierung eines Mikroorganismus mit verminderter Anpassung an eine besondere Umgebung, bei dem:

(1) eine Vielzahl von Mikroorganismen bereitgestellt wird, die jeweils unabhängig voneinander durch Insertionsinaktivierung eines Gens mit einer Nukleinsäure mit einer einmal vorkommenden Markersequenz mutiert sind, so daß jede Mutante eine unterschiedliche Markersequenz enthält, oder xlone dieser Mikroorganismen,

(2) einzeln aufbewahrte Proben jeder in Schritt (1) hergestellten Mutante und einzeln aufbewahrte Nukleinsäure mit der einmal vorkommenden Markerseguenz jeder einzelnen Mutante bereitgestellt werden,

(3) eine Vielzahl der in Schritt (1) gebildeten Mutanten in die besondere Umgebung eingeführt und denjenigen Mikroorganismen, die dazu in der Lage sind, in der Umgebung wachsen gelassen werden,

(4) Mikroorganismen aus der Umgebung oder einem ausgewählten Teil davon wiedergewonnen und die Nukleinsäure aus den wiedergewonnenen Mikroorganismen isoliert wird,

(5) jede der Markersequenzen in der in Schritt (4) isolierten Nukleinsäure mit der einmal vorkommenden Markersequenz jeder der wie in Schritt (2) aufbewahrten einzelnen Mutanten verglichen wird und

(6) eine einzelne Mutante ausgewählt wird, die keine der in Schritt (4) isolierten Markerseguenzen enthält,

wobei die besondere Umgebung nicht ein menschlicher Körper ist.

2. Verfahren zur Identifizierung eines Mikroorganismus mit verminderter Anpassung an eine besondere Umgebung, bei dem:

(1) eine Vielzahl von Mikroorganismen bereitgestellt wird, die jeweils unabhängig voneinander durch Insertionsinaktivierung eines Gens mit einer Nukleinsäure mit einer einmal vorkommenden Markersequenz mutiert sind, so daß jede Mutante eine unterschiedliche Markerseguenz enthält, oder Klone dieser Mikroorganismen,

(3) eine Vielzahl der in Schritt (1) gebildeten Mutanten in die besondere Umgebung eingeführt und denjenigen Mikroorganismen, die dazu in der Lage sind, in der Umgebung wachsen gelassen werdend

(5) jede der Markersequenzen in der in Schritt (4) isolierten Nukleinsäure mit der einmal vorkommenden Markersequenz jeder der in Schritt (2) aufbewahrten einzelnen Mutanten verglichen wird und

(6) eine einzelne Mutante ausgewählt wird, die keine der in Schritt (4) isolierten Markersequenzen enthält, wobei, wenn die besondere Umgebung ein differenzierter multizellulärer Organismus ist, der Organismus ein nicht-mehschliches Tier oder eine Pflanze ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die in Schritt (1) definierte Vielzahl von Mikroorganismen aus einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt wird, die jeweils eine Nukleinsäure mit einer einmal vorkommende Markersequenz enthalten, indem deren Zustand von einem ersten vorgegebenen Zustand in einen zweiten vorgegebenen Zustand geändert wird, wobei (a) in dem ersten vorgegebenen Zustand dis einen einmal vorkommenden Marker enthaltende Nukleinsäure episomal gehalten wird und (b) in dem zweiten vorgegebenen Zustand die eine einmal vorkommende Markersequenz enthaltende Nukleinsäure ein Gen durch Insertion inaktiviert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem ferner:

(1A) auxotrophe Mutanten aus der Vielzahl der in Schritt (1) gebildeten Mutanten entfernt werden oder

(6A) bestimmt wird, ob die in Schritt (6) ausgewählte Mutante eine auxotrophe Mutante ist, oder

beide Schritte (1A) und (6A) durchgeführt werden.

5. Verfahren zur Identifizierung eines Gens, das einem Mikroorganism die Anpassung an eine besondere Umgebung gestattet, wobei das Verfahren das Verfahren nach einem dar Ansprüche 1 bis 4 umfaßt, worauf sich folgender Schritt anschließt:

(7) Isolieren des durch Insertion inaktivierten Gens aus der in Schritt (6) ausgewählten einzelnen Mutante.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem als weiterer Schritt:

(8) aus einem Wildtyp-Mikroorganismus das entsprechende Wildtyp-Gen unter Verwendung des in Schritt (7) isolierten, durch Insertion inaktivierten Gens als Sonde isoliert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die besondere Umgebung ein differenzierter multizellulärer Organismus ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der multizelluläre Organismus eine Pflanze ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der multizelluläre Organismus ein nicht-menschliches Tier ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Tier eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Hund oder ein Affe ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Tier eine Maus ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei in Schritt (4) die Mikroorganismen aus der Umgebung an einer Stelle wiedergewonnen werden, die von der Einführungsstelle in Schritt (3) entfernt ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei in Schritt (3) der Mikroorganismus oral oder intraperitoneal eingeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, sofern von Anspruch 8 oder 9 abhängig, wobei in Schritt (4) die Mikroorganismen aus der Milz wiedergewonnen werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Mikroorganismus ein Pilz ist.

17. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus ein für Pflanzen pathogenes Bakterium ist.

18. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus ein für Pflanzen pathogener Pilz ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Mikroorganismus ein für Tiere pathogenes Bakterium ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Mikroorganismus ein für Tiere pathogener Pilz ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Bakterium ein beliebiges der Bakterien Bordetella pertussis, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Escherichia coli, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebstella pneumoniae, Legionella pneumophila, Listeria spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Vibrio spp. und Yersinia pestis ist.

22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Pilz ein beliebiger der Pilze Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Histoplasma capsulatum ist.

23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (1) das Gen unter Verwendung eines Transposons oder Transposon-ähnlichen Elements oder einer anderen DNA-Sequenz, das/die eine einmal vorkommende Markersequenz trägt, durch Insertion inaktiviert wird.

24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (1) jede verschiedene Markerseguenz an jeder Seite von Sequenzen flankiert wird, die für jede der Nukleinsäuren gewöhnlich sind.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei in Schritt (2) die den einmal vorkommenden Marker enthaltende Nukleinsäure unter Anwendung von DNA-Amplifikationstechniken und Oligonukleotid-Primern, die mit den gewöhnlichen Sequenzen hybridisieren, isoliert wird.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei in Schritt (4) die eine Vielzahl der Markersequenzen enthaltende Nukleinsäure unter Anwendung von DNA-Amplifikationstechniken und Oligonukleotid-Primern, die an die gewöhnlichen Sequenzen hybridisieren, isoliert wird.