DE69423414T2

DE69423414T2 - Biskonjugate, die zwei Saccharide und einen Spacer enthalten

Info

Publication number: DE69423414T2
Application number: DE69423414T
Authority: DE
Inventors: Peter Grootenhuis; Maurice Petitou; Constant Van Boeckel; Pieter Westerduin
Original assignee: Sanofi Synthelabo SA; Akzo Nobel NV
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1993-09-01
Filing date: 1994-08-30
Publication date: 2000-09-21
Anticipated expiration: 2014-08-31
Also published as: HUT69163A; DK0649854T3; PT649854E; ZA946673B; NO943222D0; CA2131229C; US5705489A; NO301984B1; HK1002009A1; NO943222L; KR950008528A; FI113540B; EP0649854B1; TW349951B; NZ264340A; HU9402514D0; JPH07304787A; FI944001A; AU679084B2; AU7161094A

Description

Die Erfindung betrifft einstellbare Biskonjugate aus zwei Sacchariden und einem Spacer, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, eine die Biskonjugate enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung und die Verwendung der Biskonjugate zur Herstellung eines Medikaments.
Aus zwei Sacchariden und einem Spacer bestehende antithrombotische Biskonjugate sind aus der europäischen Patentanmeldung 312,086 bekannt. Die Saccharidkomponenten dieser Verbindungen enthalten sulfatierte Galactopyranosyl-, Mannopyranosyl- oder Glucopyranosyleinheiten. Diese Saccharide gehören nicht zu der in der europäischen Patentanmeldung 529,715 offenbarten Klasse der Glycosaminoglycane bzw. Glycosaminoglycanoide, die Uronsäuren enthalten. Es wird nicht offenbart, ob diese Saccharide per se antithrombotische Aktivität aufweisen. Darüber hinaus wird nur ein Spacer mit einer sehr spezifischen Struktur offenbart, der eine Kettenlänge von nur 8 Atomen aufweisen kann, während gefunden wurde, daß die Biskonjugate der vorliegenden Erfindung inaktiv sind, wenn sie eine Spacer-Kettenlänge von weniger als 20 Atomen aufweisen. Weiterhin sind die Saccharide in den in EP 312,086 offenbarten Biskonjugaten mit dem Spacer über ihre beiden reduzierenden Enden verbunden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einstellbares Biskonjugat aus zwei Sacchariden und einem Spacer, wobei die Saccharide gleich oder verschieden sind und jeweils aus zwei bis sechs Monosaccharideinheiten bestehen, von denen wenigstens eine Einheit Uronsäure ist, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der Saccharide per se antithrombotische Aktivität aufweist und der Spacer wenigstens ein Saccharid mit dem anderen über sein nicht-reduzierendes Ende verbindet, wobei die Kettenlänge des Spacers 20- 120 Atome beträgt.
Es ist bekannt, daß kleine Kohlenhydratmoleküle des Glycosaminoglycan-Typs wirkungsvolle Anti-Xa- Inhibitoren sind, siehe z. B. das europäische Patent 84999. Aus später eingereichten Patentanmeldungen geht hervor, daß viele Varianten dieser Grundmoleküle ähnliche Wirkungen aufweisen. Es ist inzwischen klar, daß diese relativ kleinen Moleküle (von denen Pentasaccharide typische Beispiele sind) mit nur einem der Serinprotease-Inhibitoren wechselwirken, normalerweise mit Anti-Thrombin-III (AT-III). Der aktivierte Saccharid-AT-III-Komplex inhibiert dann selektiv den Faktor Xa. Aus Untersuchungen mit dem Naturstoff Heparin und seinen Fragmenten ist bekannt, daß zur AT-III-vermittelten Inaktivierung von Faktor IIa (Thrombin) längere Glycosaminoglycane erforderlich sind. Längere Glycosaminoglycane mit wenigstens 16 Saccharideinheiten haben Anti-Xa- sowie Anti-IIa- Aktivität.
Aus praktischen Gesichtspunkten ist eine Synthese von Glycosaminoglycanen mit 16 oder mehr Saccharideinheiten uninteressant, und eine Fragmentierung von Heparin oder anderen Glycosaminoglycan- Naturstoffen ergibt Substanzmischungen, die meistens mit anderen Verbindungstypen wie Proteinen, DNS, Viren usw. kontaminiert sind. Aus medizinischen Gesichtspunkten sind solche Mischungen weniger attraktiv als reine, gut definierte synthetische Verbindungen, zum Beispiel aufgrund der häufig vorkommenden Blutungsrisiken.
Es wurde jetzt gefunden, daß die Eigenschaften dieser größeren Glycosaminoglycane durch zwei miteinander durch einen Spacer verbundene kleine Saccharidmoleküle (enthaltend zwei bis sechs Monosaccharideinheiten) nachgeahmt werden können, wobei wenigstens ein Saccharid dazu fähig ist, mit Protease- Inhibitoren wie AT-III oder HC-II zu wechselwirken. Um auf die minimal erforderliche Distanz zwischen den beiden Sacchariden zu kommen, ist eine Spacer-Länge von wenigstens 20 Atomen erforderlich. Aus Synthesegründen sind Spacer, die länger als 120 Atome sind, weniger geeignet. Es wurde darüber hinaus gefunden, daß die chemische Struktur des Spacers von untergeordneter oder überhaupt gar keiner Bedeutung ist. Die antithrombotische Aktivität und das Verhältnis der αXa- zur αIIa-Aktivität der erfindungsgemäßen Biskonjugate hängt von der Beschaffenheit der Saccharide, der Stelle, an der sie mit dem Spacer verbunden sind, und der Länge der Spacer ab. So sind zum Beispiel Saccharide, die mit einem Spacer über ihre beiden reduzierenden Enden verbunden sind, nicht aktiv.
Wenigstens eines der Saccharide, vorzugsweise beide Saccharide, weist (weisen) per se AT-III- und/oder HC-II-Affinität auf, und/oder hat (haben) Anti-Faktor-IIa- und/oder Anti-Faktor-Xa-Aktivität.
Geeignete Biskonjugate sind Biskonjugate, wobei wenigstens eines der Saccharide die Formel:
aufweist, in der
R jeweils unabhängig aus H, OH, OSO&sub3;&supmin; und Alkoxy ausgewählt ist; R&sub1; jeweils unabhängig aus OSO&sub3;&supmin; und NHSO&sub3;&supmin; ausgewählt ist; und die gekurvte Linie für eine aufwärts- oder abwärtsgerichtete Bindung steht, und die negativen Ladungen durch Wasserstoff oder ein Alkalimetall-Kation ausgeglichen sind.
Der Ausdruck "Alkyl", wie er in dieser Formel verwendet wird, bedeutet eine Alkylgruppe mit 1-8 und vorzugsweise 1-4 Kohlenstoffatomen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Alkylgruppe um die Methylgruppe.
Der Ausdruck "Alkoxy" steht für eine Alkoxygruppe mit 1-8 und vorzugsweise 1-4 Kohlenstoffatomen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich dabei um die Methoxygruppe.
Das Alkalimetall ist vorzugsweise Natrium.
In ganz besonders bevorzugten Biskonjugaten weist wenigstens eines der Saccharide die folgende Formel auf:
wobei R&sub2; unabhängig für OSO&sub3;&supmin; oder OCH&sub3; steht.
Wie schon oben betont, ist die chemische Struktur des Spacers von untergeordneter Bedeutung. Einige Spacer bieten jedoch gegenüber anderen Vorteile in der Synthese. Einfache Spacer, die leicht eingebaut werden können, sind zum Beispiel Spacer mit der Formel:
= {Q-NT-CO-[(CH&sub2;)n-NT-CO-(CH&sub2;)m]p-S-}&sub2; oder = {Q-O-[(CH&sub2;)n-O]p-(CH&sub2;)m-S-}&sub2;
wobei
eine der beiden Gruppen Q an das nicht-reduzierende Ende eines der Saccharide gebunden ist und die andere Gruppe Q an das reduzierende oder nicht-reduzierende Ende des anderen Saccharids gebunden ist, und die Gruppen Q jeweils für eine Phenylen-(C&sub6;H&sub4;)-Gruppe oder -[(CH&sub2;O)q-(CH&sub2;)r-O]S-[(CH&sub2;)t-NT-CO]u(CH&sub2;)v stehen, und T unabhängig Wasserstoff oder Alkyl wie oben definiert darstellt; q für 0 oder 1 steht; r und t unabhängig für 2-4 stehen; und s unabhängig für 1-12, vorzugsweise 1- 6, steht, und u und v unabhängig für 1-6 stehen; n für 1-8 steht, m für 1-8 steht, p für 1-12 steht, und die Anzahl der Atome insgesamt 20-120 beträgt.
Ein weiterer geeigneter Spacer weist die Formel:
auf, wobei
eine der beiden Gruppen Φ an das nicht-reduzierende Ende eines der Saccharide gebunden ist und die andere Gruppe Φ an das reduzierende oder nicht-reduzierende Ende des anderen Saccharids gebunden ist und Φ für eine Phenylen-(C&sub6;H&sub4;)-Gruppe steht; n, m und o unabhängig für 1-8 stehen, und die Anzahl der Atome insgesamt 20-120 beträgt.
Andere ebenso geeignete Spacer weisen die Formel:
auf, wobei
eine der beiden freien Valenzen des Spacers an das nicht-reduzierende Ende eines der Saccharide gebunden ist und die andere freie Valenz des Spacers an das reduzierende oder nicht-reduzierende Ende des anderen Saccharids gebunden ist, und T unabhängig für H oder Alkyl wie oben definiert steht, m unabhängig für 1-8 steht, r unabhängig für 2-4 steht, s unabhängig für 1- 12, vorzugsweise für 1-6, steht; w für 0-10, vorzugsweise für 0-7, steht, x für 0 oder 1 steht, y für 0 oder 1 steht, z für 0 oder 1 steht, und die Anzahl der Atome insgesamt 20-120 beträgt.
Diese Ausführungsbeispiele sind aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit bevorzugt; die Spacer sind jedoch keinesfalls auf die oben aufgeführten Spacer beschränkt.
Die erfindungsgemäßen Biskonjugate werden als symmetrisch bezeichnet, wenn die beiden Saccharide gleich sind. Die Biskonjugate werden als asymmetrisch bezeichnet, wenn sich die beiden Saccharide voneinander unterscheiden. Asymmetrische Biskonjugate enthalten vorzugsweise ein Saccharid, das keine Uronsäureeinhei ten aufweist und sich somit von Glycosaminoglycanen und Glycosaminoglycanoiden unterscheidet, zum Beispiel ein Saccharid, das aus Glucoseeinheiten besteht, zum Beispiel Cellobiose, Maltotriose oder Maltopentaose oder deren Derivate.
Die erfindungsgemäßen Biskonjugate können mittels Verfahren hergestellt werden, die für die Darstellung von analogen Verbindungen bekannt sind. Die Kohlenhydratkomponenten werden gewöhnlich durch aus der Literatur bekannten Methoden hergestellt (zum Beispiel unter Verwendung der Methoden von EP 84999, EP 301618, EP 454220, EP 529715). Durch Einsatz von temporären Schutzgruppen kann die gewünschte Hydroxylgruppe für die Kupplung mit dem Spacer entschützt werden. Vorzugsweise wird jedoch eine geeignete Linker-Gruppe mit der gewünschten Hydroxylgruppe verbunden, zum Beispiel eine Nitrophenylgruppe, die während des üblichen Reduktionsschrittes (der Abspaltung der Benzylschutzgruppen) in die entsprechende Anilingruppe umgewandelt wird, deren Aminogruppe zur Kupplung mit dem Rest des Spacers (der zum Beispiel an seinem Ende ein Halogen oder einen aktivierten Ester einer Carboxylgruppe aufweist) eingesetzt werden kann, oder sie können gegebenenfalls vorübergehend geschützt und in einem späteren Schritt mit dem Rest des Spacers gekuppelt werden. Die Anilingruppe wird so Teil des Spacers.
Eine weitere Methode, die besonders nützlich ist, wenn die Kohlenhydratkomponenten gleich sind, ist die Kupplung der Kohlenhydratkomponente mit einer Komponente, die der Hälfte des Spacers entspricht und deren Ende, das nicht an das Saccharid gebunden werden soll, mit einer Schutzgruppe versehen ist, wobei die Komponente ohne die Schutzgruppe zu Dimerisierung neigt. Nach dem Entschützen dimerisiert das Molekül unter geeigneten Reaktionsbedingungen, wodurch das erfindungsgemäße Biskonjugat gebildet wird.
Eine Variante der oben erwähnten Methode beinhaltet die Kupplung eines Teils des Spacers mit der Kohlenhydratkomponente, wonach der Teil des Spacers durch chemische Kondensation weiter aufgebaut wird. Diese Methode eignet sich insbesondere zur Herstellung von Biskonjugaten mit verschiedenen Spacer-Längen, wobei von den gleichen Kohlenhydratkomponenten ausgegangen wird.
Noch eine weitere Methode ist die Kupplung des Spacers, oder einer Hälfte des Spacers, mit einem Teil der Kohlenhydratkomponente, die durch Standard- Kohlenhydrat-Kupplungsmethoden mit dem restlichen Kohlenhydratteil zum gewünschten Biskonjugat oder der Hälfte des Biskonjugats gekuppelt wird, wonach, falls nötig, wie oben beschrieben die Entschützung und Dimerisation des Spacers durchgeführt werden können.
Die erfindungsgemäßen Biskonjugate können zur Behandlung oder Prophylaxe von thrombotischen Erkrankungen und der Proliferation von glatten Muskelzellen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Biskonjugate können enteral oder parenteral verabreicht werden, und zwar an den Menschen vorzugsweise in einer Tagesdosis von 0,001-10 mg pro kg Körpergewicht. In Abmischung mit pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen, z. B. den im Standardwerk von Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, (18. Ausg., Mack Publishing Company, 1990, siehe insbesondere Teil 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture) genannten, lassen sich die Biskonjugate, wenn sie oral, buccal oder sublingual aktiv sind, zu festen Einzeldosen wie Pillen oder Tabletten verpressen oder zu Kapseln oder Zäpfchen verarbeiten. Die Biskonjugate können, wenn sie parenteral aktiv sind, auch mittels pharmazeutisch geeigneter Flüssigkeiten in Form einer Lösung, Suspension oder Emulsion als Formulierung zur Injektion oder Infusion verabreicht werden, oder als Spray, z. B. als Nasenspray.
Zur Herstellung von Einzeldosen, z. B. Tabletten, wird die Verwendung von gebräuchlichen Zusatzstoffen wie Füllstoffen, Farbstoffen, polymerförmigen Bindemitteln usw. in Betracht gezogen. Im allgemeinen können beliebige pharmazeutisch unbedenkliche Zusatzstoffe, die die Funktion der Wirkstoffe nicht stören, verwendet werden.
Zu geeigneten Trägern, mit denen die Zusammensetzungen verabreicht werden, zählen Lactose, Stärke, Cellulosederivate usw. oder deren Mischungen in geeigneten Mengen.
Die Einstellbarkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen wird in Tabellen I, II und III gezeigt. Es scheint, daß sich das Verhältnis der αXa- zur αIIa- Aktivität durch die Saccharide, die Spacer-Länge und deren Kombinationen einstellen läßt.
Die Spacer-Länge ist die Anzahl der Atome des Spacers, wobei entlang der kürzesten Kette zwischen den beiden Sacchariden gezählt wird und die mit dem Spacer verbundenen Sauerstoffatome der Saccharide nicht mitgezählt werden.
Bei den folgenden Ausdrücken in dieser Beschreibung handelt es sich um eingetragene Warenzeichen: Sephadex G-25, Sephadex G-50, Sephadex LH-20 und Dowex WX8. Tabelle I. Biskonjugate mit verschiedenen Saccharidkomponenten und der gleichen Spacer-Länge.
Biskonj. = Biskonjugat
Spacer-L. = Spacer-Länge
a Die Anti-Xa-Aktivität (Einheiten/mg) wurde nach der Methode von A. N. Teien und M. Lee, Thrombosis Research, 10, 399-410 (1977) bestimmt.
b Die Anti-IIa-Aktivität (Einheiten/mg) wurde nach der Methode von M. L. Larson et al., Thrombosis Research, 13, 285-288 (1978) bestimmt.
Schlußfolgerung: Tabelle I zeigt, daß das Verhältnis der αXa- zur αIIa-Aktivität der Biskonjugate durch Variieren der Saccharide eingestellt werden kann. Tabelle II. Biskonjugate mit der gleichen Saccharidkomponente und verschiedenen Spacer-Längen.
* Die Spacer-Länge wurde über die Methylengruppe der Cyclopentylgruppen (kürzeste Kette) bestimmt.
Schlußfolgerung: Tabelle II veranschaulicht, daß das Verhältnis der αXa- zur αIIa-Aktivität der Biskonjugate durch Variieren der Spacer-Länge eingestellt werden kann. Tabelle III. Biskonjugate mit verschiedenen Sacchariden und/oder Spacer-Längen.
* Die Spacer-Länge wurde über die Methylengruppe der Cyclopentylgruppen (kürzeste Kette) bestimmt.
Schlußfolgerung: In Tabelle III wird gezeigt, wie das Verhältnis der αXa- zur αIIa-Aktivität der Biskonjugate durch Veränderung der Saccharide und Spacer-Längen eingestellt werden kann.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Monosaccharid 5
Verbindung 1 (3,5 g) (siehe Carb. Res. 1989, 186(2), 189-205) wurde in Dimethylformamid (30 ml) gelöst, und unter Stickstoff wurde Natriumhydrid (560 mg) zugegeben. Die Mischung wurde auf 0ºC abgekühlt, und innerhalb von einer Spanne von 2 Minuten wurde 1-Fluor-4-nitrobenzol (1,63 ml) zugegeben. Die Mischung wurde 30 min gerührt und dann eingeengt, mit Dichlormethan und Wasser verdünnt und extrahiert. Nach herkömmlicher Aufarbeitung wurde der Rückstand durch Säulenchromatographie gereinigt, wodurch man 4 g der Verbindung 2 erhielt.
Verbindung 2 wurde durch Acetolyse in Verbindung 3 umgewandelt, aus der durch Verseifung die Verbindung 4 erhalten wurde, die nach Reaktion mit Trichloracetonitril Verbindung 5 ergab. Die zur Synthese der Verbindungen 3, 4 und 5 angewandten Vorschriften waren die, die bei der Herstellung der Verbindung 9 (siehe unten), 41 bzw. 42 (siehe Beispiel 4) beschrieben sind.
Tetrasaccharid 14
Die Verbindung 7 wurde aus der Verbindung 6 (siehe Bioorganic and Medicinal Letters 1992, 2(9), 905) gemäß der für die Verbindung 39 (siehe Beispiel 4) beschriebenen Vorschrift dargestellt.
Verbindung 7 (14,6 g) wurde in Aceton (260 ml) gelöst und auf 0ºC gekühlt. Bei dieser Temperatur wurde eine Lösung von Chrom(VI)-oxid (10,8 g) in einer Mischung von Wasser (53 ml) und konzentrierter Schwefelsäure (10,5 ml) zugetropft. Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei 2ºC gerührt. Überschüssiges Chrom(VI)-oxid wurde mit Methanol zerstört, und nach Neutralisation der Mischung mit Natriumhydrogencarbonat wurde Wasser zugegeben. Nach Extraktion mit Dichlormethan wurde die organische Phase getrocknet und eingeengt. Das verbliebene Öl wurde in trockenem Dimethylformamid (174 ml) gelöst. Kaliumhydrogencarbonat (7 g) und Iodmethan (7 ml) wurden zugegeben, und die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen wurde der Rückstand durch Kieselgelchromatographie gereinigt, was 9,1 g der Verbindung 8 ergab.
Verbindung 8 (2,8 g) wurde in einer Mischung aus Essigsäureanhydrid (50 ml), Essigsäure (0,3 ml) und Trifluoressigsäure (3,0 ml) gelöst. Die Mischung wurde 3 Stunden lang gerührt und dann eingeengt und zusammen mit Toluol abgedampft, wodurch man 3,1 g der Verbindung 9 erhielt.
Verbindung 10 wurde durch Verseifung der Verbindung 9 dargestellt und anschließend in das Imidat 11 umgewandelt. Hierbei kamen die für die Darstellung der Verbindung 41 und 42 beschriebenen Vorschriften zum Einsatz (siehe Beispiel 4).
Verbindung 11 wurde mit Verbindung 12 gekuppelt (siehe Jaurand G., et al., Bioorganic and Medicinal Chem. Lett., 2(9), 897-900 (1992), Verbindung 12), wodurch man die Verbindung 13 erhielt, deren Lev-Gruppe abgespalten wurde, wodurch man das Tetrasaccharid 14 erhielt. Es wurden die für die Herstellung der Verbindungen 43 und 44 beschriebenen Verfahren angewandt (siehe Beispiel 4).
Zu einer Lösung von 79 mg des Tetrasaccharids 14 und 70 mg des Monosaccharids 5 in 2,5 ml Dichlormethan wurden 4 Å-Molekularsiebe (70 mg) gegeben. Die Mischung wurde auf -20ºC abgekühlt, und 6,8 umol Trimethylsilyl-trifluormethansulfonat wurden zugegeben. Die Mischung wurde 30 min gerührt, und Natriumhydrogencarbonat wurde zugegeben. Die Mischung wurde filtriert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand durch Kieselgelchromatographie gereinigt, wodurch man 88 mg des Pentasaccharids 15 erhielt, die in 7,3 ml Tetrahydrofuran gelöst und auf -5ºC abgekühlt wurden. Bei dieser Temperatur gab man 2,6 ml einer 30%igen wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung und, nach 10 min. 1,2 ml einer 1,25 M Lithiumhydroxidlösung zu. Die Mischung wurde bei 0ºC über Nacht gerührt, 4,8 ml Methanol und 1,3 ml einer 4 M Natronlauge wurden zugegeben, die Mischung wurde 1 h gerührt, die Temperatur auf 20ºC erhöht und die Mischung noch 20 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0ºC mit 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert, und das verseifte Produkt wurde mit Essigsäureethylester extrahiert. Das überschüssige Wasserstoffperoxid wurde durch Extraktion mit einer 5%igen Natriumsulfitlösung zersetzt, und die organische Mischung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft, wodurch man 89 mg des rohen Pentasaccharids 16 erhielt.
Das Pentasaccharid 16 wurde in 10,2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 55 mg Pd/C (10%) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht hydrogenolysiert, wodurch man 64 mg des rohen Pentasaccharids 17 erhielt.
Das Pentasaccharid 17 (49 mg) wurde in 2 ml einer Ethanol-Wasser-Mischung (1 : 1) gelöst, und diese Mischung wurde mit 16 mg Natriumhydrogencarbonat und 10,4 ul Benzyloxycarbonylchlorid (Z-Cl) versetzt. Nach 4stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand mit Methanol versetzt. Die Salze wurden abfiltriert und das Filtrat eingedampft, wodurch man 67 mg des rohen Penta saccharids 18 erhielt, das in 2,5 ml trockenem Dimethylformamid gelöst wurde. Unter Stickstoff wurden 442 mg Triethylamin-Schwefeltrioxid zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 50ºC gerührt, worauf unter Eiskühlung eine wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung zugegeben wurde. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und dann auf ein kleines Volumen konzentriert und auf einer Sephadex G-25-Säule entsalzt. Das isolierte Produkt wurde auf einer Dowex 50WX8 Na&spplus; Säule mit Wasser eluiert, was 104 mg des Pentasaccharids 19 ergab.
100 mg des Pentasaccharids 19 wurden in 8 ml Wasser gelöst, und nach Zugabe von 10% Pd/C wurde die Mischung über Nacht hydrogenolysiert, was 83 mg des Pentasaccharids 20 ergab. [α]D²&sup0; = +58,1º (c = 1; Wasser).
In einer Mischung von 0,1 ml Ethanol und 0,35 ml einer wäßrigen 0,05 M Dinatriumhydrogenphosphatlösung mit einem pH-Wert von 7, 8 wurden 9,6 mg des Pentasaccharids 20 und 4,8 mg Sulfo-LC-SPDP gelöst. Die Mischung wurde 3 Stunden lang gerührt und auf einer Sephadex G-25-Säule entsalzt, wodurch man 9,0 mg des Monokonjugats 21 erhielt.
Das Monokonjugat 21 (8,9 mg) wurde in 1,5 ml einer wäßrigen 0,05 M Natriumdihydrogenphosphatlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst. 157 ul einer 0,05 M Lösung von Tributylphosphin in Isopropanol wurden bei Raumtemperatur zugegeben, die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und Luft wurde durch die Reaktionsmischung geleitet. Nach Entsalzen der Mischung auf einer Sephadex G-25-Säule wurde das rohe Biskonjugat durch HPLC unter Verwendung einer Mono Q Anionenaustauschersäule gereinigt, wodurch man 4,0 mg des Biskonjugats I erhielt. [α]D²&sup0; = - +45,7º (c = 0,35; Wasser) Biskonjugat I

Beispiel 2

Das Monokonjugat 21 (14,7 mg) wurde in einer Mischung aus 1 ml Methanol und 2 ml einer wäßrigen Lösung von 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat mit einem pH-Wert von 8 gelöst. Unter Stickstoff wurden bei Raumtemperatur 247 ul einer 0,05 M Lösung von Tributylphosphin in Isopropanol zugegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt, und dann wurde eine Lösung von 1,68 mg 23 in 0,5 ml Dimethylformamid zugegeben, und die Mischung wurde weitere 3 Stunden gerührt. Nach Entsalzen der Mischung auf einer Sephadex G-25-Säule wurde das Rohprodukt weiter auf einer Sephadex G-50- Säule durch Elution mit einer 0,05 M wäßrigen Natriumchloridlösung mit 10% Acetonitril gereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden auf einer Sephadex G-25- Säule entsalzt, wodurch man 5,5 mg Biskonjugat 11 erhielt. [α]D²&sup0; = +7,0º (c = 0,34; Wasser). Biskonjugat II

Beispiel 3

Methyl-2,3,6-tri-o-benzyl-α-D-glucopyranosid (2,1 g) 24 wurde in 75 ml Dimethylformamid gelöst, und bei Raumtemperatur wurden 5,5 ml Tetraethylenglykol-dip-tosylat zugegeben. Die Mischung wurde mit Natriumhydrid (162 mg) versetzt und 2 h bei 50ºC erhitzt. Lithiumazid (4,5 g) wurde zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde weitere 5 h bei 70ºC gerührt. Die Mischung wurde dann eingeengt und durch Säulenchromatographie gereinigt, wodurch man 1,52 g der Verbindung 25 erhielt.
Eine Lösung der Verbindung 25 (768 mg) in 40 ml Essigsäureanhydrid wurde bei -20ºC mit 10 ml einer 5%igen (v/v) Lösung von Schwefelsäure in Essigsäureanhydrid (auf -20ºC gekühlt) versetzt. Die Mischung wurde 10 min bei dieser Temperatur gerührt, und dann wurde Natriumacetat (3,5 g) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Nach 10 min wurde die Mischung mit Essigsäureethylester extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden mit einer 10%igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Säulenchromatographie des Rohproduktes ergab 573 mg der Verbindung 26.
Verbindung 26 (269 mg) wurde in einer Mischung von 5,5 ml Dimethylformamid, 31 ul Essigsäure und 28 ul Hydrazinmonohydrat gelöst. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann mit Dichlormethan und Wasser verdünnt und extrahiert. Übliche Aufarbeitung und Säulenchromatographie des Produktes ergab 158 mg der Verbindung 27.
Verbindung 27 (158 mg) wurde in 2 ml Dichlormethan gelöst. Unter Stickstoff wurden Trichloracetonitril (0,13 ml) und Cäsiumcarbonat (17,8 mg) zugegeben. Die Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und eingedampft. Säulenchromatographie des Produktes ergab 182 mg der Verbindung 28.
Verbindung 31 wurde durch Kupplung der Verbindung 11 mit der Verbindung 29 hergestellt (siehe H. Lucas et al., Angew. Chem. 1993, 105, 462-464), wodurch die Verbindung 30 gebildet wurde, von der die Lev-Gruppe abgespalten wurde. Die für die Darstellung der Verbindungen 43 und 44 beschriebenen Vorschriften wurden befolgt (siehe Beispiel 4). Verbindung 11
Die Verbindungen 32, 33 und 34 wurden analog dem für die Verbindungen 15, 16 bzw. 17 beschriebenen Verfahren hergestellt (siehe Beispiel 1).
Verbindung 34 (35 mg) wurde in 0,35 ml einer Stammlösung von 280 ul Triethylamin in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Bei einem pH-Wert von 7,5 wurde die Mischung mit N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid (10,6 mg) versetzt und, nach 30 min Rühren, wurde ein Teil des Lösungsmittels abgedampft. Der Rückstand wurde zunächst auf einer Sephadex LH-20-Säule und dann auf einer Rp-18-Säule (Acetonitril: Wasser: Ammoniak = 95 : 5 : 2 v/v) gereinigt, wodurch man 29,4 mg der Verbindung 35 erhielt.
Verbindung 36 wurde ähnlich wie für Verbindung 19 beschrieben (siehe Beispiel 1) dargestellt. [α]D²&sup0; = 22,8º (c = 0,3; Wasser).
Verbindung 36 (51,4 mg) wurde in 4 ml Wasser gelöst, und der Katalysator (10% Pd/C) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter einer Atmosphäre von Wasserstoffgas gerührt. Nach Abfiltrieren wurde das Lösungsmittel abgedampft, was 47 mg der Verbindung 37 ergab.
Verbindung 37 (15,1 mg) wurde in 450 ul einer Lösung von N,N-Diisopropylethylamin in Dimethylformamid : Wasser = 7 : 3 (pH 9,0) gelöst und bei einem konstanten pH-Wert von 9,0 mit einem Überschuß an Sulfosuccinimidyl-6-[3'-(2-pyridyldithio)propioamido]- hexanoat versetzt. Die Mischung wurde 20 min gerührt und dann auf einer Sephadex G-25-Säule mit Wasser : Acetonitril 8 : 2 (v/v) entsalzt, wodurch man 16 mg der rohen Verbindung 38 erhielt.
Biskonjugat III wurde aus der Verbindung 38 in ähnlicher Weise dargestellt wie in Beispiel 1 für die Umwandlung der Verbindung 21 in das Biskonjugat I beschrieben.
[α]D²&sup0; = +29,6º (c = 0,125; Wasser). Biskonjugat III

Beispiel 4

Biskonjugat IV [α]D²&sup0; = +50,8º (c = 0,32; Wasser)) wurde gemäß der Vorschrift von Beispiel 3 dargestellt, wobei das Tetrasaccharid 44 anstelle von 31 verwendet wurde und von Succinimido-N-(benzyloxycarbonyloxy)-glycin anstelle von N-(Benzyloxycarbonyloxy)- succinimid Gebrauch gemacht wurde. Biskonjugat IV

Darstellung von Tetrasaccharid 44

Disaccharid 29 (0,8 g) wurde in Dioxan (5,3 ml) gelöst, und dann wurden Lävulinsäure (278 mg) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (494 mg) und 4-Dimethylaminopyridin (25 mg) zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang gerührt und dann wurde Diethylether zugegeben und auf 0ºC abgekühlt. Die Kristalle wurden abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Das verbliebene Öl wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, was 900 mg der Verbindung 39 ergab.
Eine Lösung der Verbindung 39 (1 g) in Essigsäureanhydrid (50 ml) wurde auf -20ºC gekühlt. Bei dieser Temperatur wurde die Mischung unter Stickstoff mit 10 ml der Lösung A, die durch Zugabe von 1 ml 98%iger Schwefelsäure zu 20 ml Essigsäureanhydrid bei - 20ºC hergestellt wurde, versetzt. Die Mischung wurde 2,5 Stunden lang gerührt, und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von Natriumacetat gestoppt. Die kalte Reaktionsmischung wurde mit Essigsäureethylester und einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung versetzt, und nach Extraktion wurde die organische Phase mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, was 800 mg der Verbindung 40 ergab.
Verbindung 40 (800 mg) wurde in trockenem Tetrahydrofuran (10 ml) gelöst, und unter Stickstoff mit Piperidin (1,3 ml) versetzt. Die Mischung wurde 20 Stunden lang bei 20ºC gerührt und dann mit Essigsäureethylester verdünnt. Die organische Phase wurde mit 0,3 N Salzsäure und Wasser gewaschen und getrocknet. Nach Einengen der organischen Phase wurde der Rückstand durch Säulenchromatographie gereinigt, wodurch man 430 mg der Verbindung 41 erhielt.
Eine Lösung der Verbindung 41 (490 mg) in Dichlormethan (5,4 ml) wurde mit Cäsiumcarbonat (43 mg) und Trichloracetonitril (0,52 ml) versetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 20ºC belassen. Nach Abfiltrieren wurde das Filtrat eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie gereinigt, was 417 mg der Verbindung 42 ergab.
Verbindung 42 (317 mg) und Verbindung 29 (243 mg) wurden zweimal zusammen mit Toluol eingeengt. Dichlormethan (7,1 ml) und gepulverte 4 Å Molekularsiebe (235 mg) wurden zugegeben, und die Mischung wurde auf -20ºC abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde eine Lösung von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (8,75 ul) in Dichlormethan (2,8 ml) zugetropft. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt, und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von festem Natriumhydrogencarbonat gestoppt. Die Mischung wurde noch 15 min gerührt und dann filtriert und eingeengt. Säulenchromatographische Reinigung ergab 372 mg der Verbindung 43.
Verbindung 43 (370 mg) wurde in Pyridin (1,2 ml) aufgenommen. Bei 20ºC wurde eine Mischung aus Pyridin (1,2 ml), Essigsäure (1,56 ml) und Hydrazinhydrat (0,18 ml) zugegeben, und die Mischung wurde 7 min gerührt. Nach Verdünnen mit Wasser und Extraktion mit Essigsäureethylester wurde die organische Phase mit Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und durch Säulenchromatographie gereinigt, was 324 mg der Verbindung 44 ergab.

Beispiel 5

Darstellung des aktivierten Esters 52

Tetraethylenglykol 45 (10 g) wurde in trockenem Tetrahydrofuran (150 ml) gelöst und bei 0ºC portionsweise mit Natriumhydrid (60%ige Dispersion in Petroleum, 1,64 g) versetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und dann mit einer Lösung von tert.-Butyldimethylsilychlorid (6,18 g) in Tetrahydrofuran (20 ml) versetzt und weitere 15 min gerührt. Nach 10 min Rühren wurde die Mischung mit Wasser verdünnt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Der organische Extrakt wurde getrocknet und eingeengt. Säulenchromatographie des Rohproduktes ergab 6 g der Verbindung 46.
Verbindung 46 (5,0 g) wurde in Tetrahydrofuran (80 ml) aufgenommen und mit Bromessigsäure-t-butylester (26,2 ml) versetzt. Die Mischung wurde bei 50ºC gerührt, und unter Stickstoff wurde portionsweise Natriumhydrid (1,16 g) zugegeben. Nach einer Stunde Rühren wurde die Mischung analog Verbindung 46 aufgearbeitet. Durch Säulenchromatographie des Rückstandes erhielt man die Verbindung 47 (5 g).
Eine Lösung der Verbindung 47 (3,1 g) in einer Mischung aus Essigsäure (25 ml), Wasser (8,3 ml) und Tetrahydrofuran (8,3 ml) wurde 24 Stunden lang bei 20ºC gerührt. Die Mischung wurde mit Natronlauge neutralisiert, mit Wasser verdünnt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurde getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch eine Kieselgelsäule filtriert, wodurch man 1,52 g der Verbindung 48 erhielt.
Verbindung 48 (1,4 g) wurde in Dichlormethan (12,7 ml) aufgenommen. Pyridin (7,7 ml) und p- Toluolsulfonsäurechlorid (1,3 g) wurden zugegeben, und die Mischung wurde 20 Stunden lang bei 20ºC gerührt. Nach Verdünnen mit Wasser wurde die Mischung mit Dichlormethan extrahiert.
Übliche Aufarbeitung und Säulenchromatographie des Rohproduktes ergab 1,5 g der Verbindung 49.
Eine Lösung der Verbindung 49 (570 mg) in Aceton (20 ml) wurde mit Kaliumthioacetat (350 mg) versetzt. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 20ºC belassen. Die Mischung wurde mit Wasser verdünnt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Nach Abdampfen der organischen Phase und Filtrieren durch eine Kieselgelsäule wurden 440 mg der Verbindung 50 isoliert.
Verbindung 50 (120 mg) wurde in Dichlormethan (1,5 ml) aufgenommen und bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure (0,20 ml) versetzt. Die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und dann mit Toluol verdünnt und eingeengt. Der Rückstand wurde dreimal zusammen mit Toluol eingeengt. Säulenchromatographie des Rohproduktes ergab 91 mg der Verbindung 51.
Verbindung 51 (29,1 mg) wurde in trockenem Dimethylformamid (1,5 ml) gelöst, und N,N- Diisopropylethylamin (12,8 ul) wurde zugegeben. O-(N- Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat (22,3 mg) wurde unter Stickstoff zugegeben, und die Mischung wurde 1,5 Stunden lang gerührt. Diese Stammlösung des aktivierten Esters 52 wurde für die Spacer-Verlängerung der Verbindung 54 verwendet.
Zur Herstellung der Verbindung 54 wurde die Vorschrift von Beispiel 3 zur Herstellung der Verbindung 34 angewandt, mit dem einzigen Unterschied, daß Tetrasaccharid 53 anstelle der Verbindung 31 eingesetzt wurde:
Verbindung 53 wurde gemäß der von H. Lucas et al. in Angew. Chem. 1993, 32(3), 434-436 beschriebenen Vorschrift hergestellt. In dieser Literaturangabe ist die Darstellung eines Tetrasaccharids (12) in Diagramm 2 dargestellt. Zur Herstellung der Verbindung 53 wurde der Schritt d) im Diagramm 2 modifiziert: anstelle einer Benzylgruppe wurde eine Methylgruppe eingeführt, indem CH&sub3;I anstelle von BnBr verwendet wurde. Die anderen Reaktionsschritte in der Darstellung von 53 waren ähnlich der Herstellung des Tetrasaccharids 12 in der besagten Literaturangabe.
Verbindung, 54 (52 mg) wurde in einer Mischung von Dimethylformamid (150 ul) und Wasser (150 ul) gelöst. Man gab 4-Methylmorpholin (50 ul) und, nach 5 Minuten Rühren, die Stammlösung des aktivierten Esters 52 zu. Nach 1 Stunde Rühren wurde die Mischung eingeengt und der Rückstand über eine Rp-18-Säule (Wasser : Methanol = 7 : 3 v/v) gereinigt, wodurch man 48 mg der Verbindung 55 erhielt.
Verbindung 55 (48 mg) wurde zweimal zusammen mit Dimethylformamid eingeengt, getrocknet und in trockenem Dimethylformamid (2,1 ml) gelöst. Unter Stickstoff wurde Triethylamin-schwefeltrioxid (312 mg) zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 50ºC gerührt, wonach eine wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung zugegeben wurde. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, auf ein kleines Volumen eingeengt und auf einer Sephadex G-25-Säule entsalzt. Das isolierte Produkt wurde mit Wasser von einer Dowex WX8 Na&spplus;-Säule eluiert, wodurch man 73 mg eines sulfatierten Pentasaccharid-Derivats erhielt. Diese Verbindung wurde mit 0,2 N Salzsäure (2,0 ml) behandelt. Nach Neutralisieren wurde die Mischung auf einer Sephadex G- 25-Säule entsalzt, wodurch man 57 mg der Verbindung 56 erhielt.
Verbindung 56 (50 mg) wurde in 10,7 ml einer Hydroxylaminlösung in Puffer gelöst. (Man erhält diese Lösung, indem man Hydroxylamin-hydrochlorid (174 mg) in 100 ml einer 0,1 M Natriumdihydrogenphosphatlösung löst und den pH-Wert mit einer 4 N Natronlauge auf 7,5 einstellt.) Die Reaktionsmischung wurde 90 Minuten lang bei 20ºC gerührt, und dann wurde der pH-Wert auf 8,5 eingestellt und die Mischung für weitere 24 Stunden gerührt. Nach Entsalzen und Reinigung der Mischung auf einer Sephadex G-50-Säule wurden 40 mg des reinen Biskonjugats V isoliert. [α]D²&sup0; = +42, 9º (c = 1; Wasser) Biskonjugat V Biskonjugat V

Beispiel 6

Das Biskonjugat VI wurde ähnlich wie für das Biskonjugat V beschrieben dargestellt, mit dem einzigen Unterschied, daß das Tetrasaccharid 57 (bei dem es sich um das Tetrasaccharid 12 von H. Lucas et al., Angew. Chem. 1993, 32(3), 434-436 handelt) anstelle der Verbindung 53 verwendet wurde. [α]D²&sup0; = +31,6º (c = 0,82; Wasser) Biskonjugat VI

Beispiel 7

Zur Herstellung des Biskonjugats VII wurde die Vorschrift von Beispiel 5 befolgt, mit dem Unterschied, daß anstelle des Monokonjugats 54 die Verbindung 89 verwendet wurde. Verbindung 89 wurde gemäß der Vorschrift zur Herstellung der Verbindung 34 (wie in Beispiel 3 beschrieben) dargestellt, unter Verwendung der Verbindung 60 anstelle des Monosaccharids 24. [α]D²&sup0; = +66,6º (c = 0,5; Wasser) Biskonjugat VII

Darstellung der Verbindung 60:

Verbindung 58 (29 g) und Iodmethan (15,5 ml) wurden in Dimethylformamid (50 ml) gelöst. Diese Lösung wurde bei 20ºC tropfenweise zu einer Suspension von Natriumhydrid (10,5 g) in Dimethylformamid gegeben. Die Mischung wurde 16 Stunden lang gerührt, und das überschüssige Natriumhydrid wurde mit Methanol zerstört. Nach Zugabe von Wasser wurde die Mischung mit Essigsäureethylester extrahiert. Nach Einengen wurden 25 g der Verbindung 59 isoliert. Verbindung 59 (44 g) wurde in Dichlormethan (90 ml) gelöst und mit Triethylsilan (92 ml) versetzt. Eine Mischung aus Trifluoressigsäure (44 ml) und Trifluoressigsäureanhydrid (0,9 ml) wurde zugetropft und die Mischung 1 Stunde lang bei 20ºC gerührt. Die Reaktion wurde mit kalter Natriumhydrogencarbonatlösung gequenscht, und die Mischung wurde mit Essigsäureethylester extrahiert, getrocknet und eingeengt. Kieselgelchromatographie des Rückstands ergab 31 g der Verbindung 60.

Beispiel 8

Das Monosaccharid 69 wurde wie folgt dargestellt:
Eine Lösung von 1,5-Anhydromannose 61 (19,1 g) in Aceton (75 ml) und 2,2-Dimethoxypropan (75 ml) wurde mit Camphorsulfonsäure (200 mg) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. Triethylamin wurde zugegeben und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan versetzt, die Salze wurden abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt. Säulenchromatographie des Rohproduktes ergab 15 g der Verbindung 62.
Verbindung 62 (3,0 g) und Tetraethylenglykoldi-p-tosylat wurden in trockenem Tetrahydrofuran (250 ml) gelöst. Die Mischung wurde auf 60ºC erhitzt, und unter Stickstoff wurde Natriumhydrid (900 mg) zugegeben. Die Mischung wurde 30 min gerührt und dann eingeengt und der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt, wodurch man 3,9 g der rohen Verbindung 63 erhielt.
Verbindung 63 (3,9 g) wurde in Tetrahydrofuran (25 ml) gelöst, und N-Methylbenzylamin (1,95 ml) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang auf Rückflußtemperatur erhitzt und dann eingeengt, was 5,0 g der rohen Verbindung 64 ergab.
Die rohe Verbindung 64 (5,1 g) wurde in 30 ml von Methanol : 1 N Salzsäure 9 : 1 (v/v) gelöst, und die Mischung wurde 5 Stunden lang bei 85ºC gerührt. Nach Abkühlen wurde Pyridin (50 ml) zugegeben und die Lösung eingeengt, was die rohe Verbindung 65 ergab.
Die rohe Verbindung 65 wurde in 75 ml von Pyridin : Essigsäureanhydrid 2 : 1 (v/v) gelöst; 4- Dimethylaminopyridin (25 mg) wurde zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit Toluol verdünnt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Essigsäureethylester gelöst und mit verdünnter Salzsäure versetzt. Nach Extraktion wurde die saure wäßrige Phase mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und erneut mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, was 1,86 g der Verbindung 66 ergab.
Verbindung 66 (1,86 g) wurde in einer Mischung von Essigsäureanhydrid (45 ml) und Trifluoressigsäure (3,8 ml) gelöst. Die Lösung wurde 60 Stunden lang bei 20ºC gerührt und dann mit Toluol verdünnt. Nach Einengen wurde der Rückstand in Ethylacetat gelöst und mit Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Säulenchromatographie des Rohproduktes ergab 0,5 g der Verbindung 67.
Verbindungen 68 und 69 wurden gemäß der in Beispiel 3 für die Verbindung 27 bzw. 28 beschriebenen Weise dargestellt. Biskonjugat VIII
Verbindung 69 wurde mit dem Tetrasaccharid 57 gekuppelt und dann verseift und hydrogenolysiert (wie in Beispiel 3 für die Verbindungen 32, 33 bzw. 34 beschrieben), wonach man die Verbindung 70 erhielt.
Verbindung 70 wurde mit dem aktivierten Ester 52 behandelt und dann sulfatiert (entsprechend der Darstellung der Verbindungen 55 und 56, Beispiel 5), was die Verbindung 71 ergab.
Verbindung 71 wurde mit Hydroxylamin behandelt (gemäß der Darstellung des Biskonjugats V aus der Verbindung 56, Beispiel 5), wodurch das Biskonjugat VIII entstand.
[α]D²&sup0; = +27,3º (c = 1; Wasser)

Beispiel 9

Das Biskonjugat IX wurde gemäß der Vorschrift von Beispiel 4 dargestellt, mit einem Unterschied: anstelle des Glucopyranosylimidats 28 wurde ein Analog von Mannopyranosylimidat 69 verwendet, das anstelle von -N(CH&sub3;)Bn am Ende der Tetraethylenglykol-Seitenkette -N&sub3; aufwies. Die -N&sub3; enthaltende Verbindung wurde durch Reaktion von Verbindung 63 mit Lithiumazid anstelle von N-Methylbenzylamin hergestellt. Alle anderen Reaktionsschritte in der Synthese des Azid-enthaltenden Mannopyranosylimidats entsprachen der Synthese von 69.
[α]D²&sup0; = +33,2º (c = 0,25; Wasser) Biskonjugat IX

Beispiel 10

Zur Darstellung des Biskonjugats X kam die Vorschrift von Beispiel 9 zur Anwendung, mit dem Unterschied, daß anstelle des Tetrasaccharids 57 in der Darstellung der Pentasaccharid-Komponente das Tetrasaccharid 53 eingesetzt wurde. [α]D²&sup0; = +26,5º (c = 1; Wasser) Biskonjugat X

Beispiel 11

Das Biskonjugat XI wurde aus Verbindung 75 entsprechend der Umwandlung von Verbindung 32 in das Biskonjugat III (Beispiel 3) dargestellt, mit dem Unterschied, daß anstelle von N-(Benzyloxycarbonyloxy)- succinimid Succinimido-N-(benzyloxycarbonyloxy)-glycin eingesetzt wurde.
[α]D²&sup0; = +25,7º (c = 0,49; Wasser) Biskonjugat XI

Darstellung der Verbindung 75

214 mmol der Verbindung 28 und 178 mmol der Verbindung 72 (siehe EP 529715, Darstellung V) wurden bei Raumtemperatur in 4 ml Dichlormethan gelöst, und 160 mg von 4 Å Molekularsieben wurden zugegeben. Diese Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Die Mischung wurde dann auf -20ºC abgekühlt und mit 21,4 mmol einer 40 mM Lösung von Trimethylsilyl-trifluormethansulfonat in Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten lang gerührt und dann über Celite abfiltriert und anschließend mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde einer Acetolyse unterworfen, indem man ihn in einer Mischung aus Trifluoressigsäure und Essigsäureanhydrid auflöste. Das Reaktionsprodukt wurde mit Benzylamin in Diethylether behandelt, und anschließend mit Trichloracetonitril in Dichlormethan in Gegenwart von Kaliumcarbonat, was Verbindung 73 ergab (Ausbeute: 50%).
0,121 mmol der Verbindung 73 und 0,093 mmol der Verbindung 74 (siehe EP 529715, Darstellung IX) wurden in 3,2 ml Dichlormethan gelöst. In Gegenwart von Molekularsieben und unter Argon wurde die Mischung auf -20ºC gekühlt und dann mit 0,470 ml einer Lösung von Trimethylsilyl-trifluormethansulfonat in Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang bei -20ºC gerührt und dann filtriert, mit Wasser gewaschen, eingedampft und auf einer Sephadex LH-20-Säule und dann auf einer Kieselgelsäule gereinigt, wodurch man die Verbindung 75 erhielt (62%).

Beispiel 12

Maltopentaose 76 (500 mg) wurde in 15 ml Pyridin : Essigsäureanhydrid = 2 : 1 (v/v) gelöst, über Nacht gerührt und eingeengt. Nach gemeinsamem Einengen mit Toluol erhielt man 930 mg der Verbindung 77.
Die Reaktionen 77 → 78 → 79 wurden gemäß der für die Umwandlung 26 → 27 → 28 beschriebenen Verfahren durchgeführt, und die sich anschließende Kupplungsreaktion zur Verbindung 80 wurde entsprechend der für die Kupplungsreaktion der Verbindungen 28 und 31 (siehe Beispiel 3) beschriebenen Methode durchgeführt.
Verbindung 80 (300 mg) wurde in trockenem Methanol gelöst und mit einer kleinen Menge Kaliumtert-butyloxid versetzt. Die Mischung wurde über Nacht gerührt. Dowex H&spplus; wurde zum Neutralisieren der Mischung zugegeben, und nach Filtrieren wurde das Filtrat eingeengt, wodurch man 180 mg der Verbindung 81 erhielt.
Verbindung 81 wurde gemäß der für Verbindung 35 beschriebenen Vorschrift (Beispiel 3) sulfatiert, wodurch die Verbindung 82 gebildet wurde. Nach Hydrogenolyse der Verbindung 82 gemäß der für die Umwandlung von Verbindung 16 in 17 beschriebenen Vorschrift (siehe Beispiel 1) erhielt man die Verbindung 83.

Darstellung des asymmetrischen Biskonjugats XII

Lösung A

Verbindung 83 (42 mg) wurde in einer Mischung von 0,1 M Natriumdihydrogenphosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,5 (1,3 ml) und Dimethylformamid (0,5 ml) gelöst und mit Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat (7 mg) versetzt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang gerührt.

Reaktionsmischung B

Das Monokonjugat 71 (17,5 mg) wurde in 1,7 ml einer Lösung von 50 mmol Hydroxylamin in 0,1 M Natriumdihydrogenphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 unter Argon gelöst. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt, wodurch man eine Lösung der Verbindung 84 erhielt. Zu dieser Lösung wurde unter Argon 1 Äquivalent der Lösung A gegeben. Die Mischung wurde weitere 2 Stunden gerührt. Während dieses Vorgangs wird auch symmetrisches Biskonjugat gebildet, das durch Behandlung mit Dithiothreitol entfernt wurde. Nach 30 Minuten Rühren wurde die Mischung auf einer Sephadex G- 50-Säule gereinigt, was 4,7 mg des asymmetrischen Biskonjugats XII ergab.
[α]D²&sup0; = +40,3º (c = 0,38; Wasser) Darstellung des sulfatierten Maltopentasoids Asymmetrisches Biskonjugat XII

Beispiel 13

Das asymmetrische Biskonjugat XIII wurde gemäß der für die Darstellung des Biskonjugats XII beschriebenen Vorschrift dargestellt. Anstelle des Pentasaccharids 71 wurde die analoge Verbindung 85 verwendet. Verbindung 85 wurde durch Umwandlung der Verbindung 89 mittels Spacer-Verlängerung mit dem aktivierten Ester 52 und Sulfatierung, wie für die Umwandlung von 54 in 56 (siehe Beispiel 5) beschrieben, erhalten. Die Verbindung 89 ist in Beispiel 7 erwähnt.
[α]D²&sup0; = +65,4º (c = 0,09; Wasser) Asymmetrisches Biskonjugat XIII

Beispiel 14

Das sulfatierte Maltotriosid 87 wurde aus der Verbindung 86 gemäß der für die Darstellung von Maltopentasoid 83 aus Verbindung 76 (siehe Beispiel 12) beschriebenen Vorschrift dargestellt.
Reaktion A: Verbindung 87 (25 mg) wurde in 1,0 ml von 0,1 M Natriumdihydrogenphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst und mit Sulfosuccinimidyl- (4-iodacetyl)aminobenzoat (21 mg) versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 20ºC gerührt und auf einer Sephadex G-15-Säule gereinigt, wodurch man 30 mg des Produktes erhielt.
Reaktion B: Verbindung 85 (15 mg) wurde in 1,7 ml einer Lösung von 50 mmol Hydroxylamin in 0,1 M Natriumdihydrogenphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 unter Argon aufgelöst. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 20ºC gerührt und auf einer Sephadex G-25-Säule gereinigt, wodurch man 14 mg der Verbindung 88 erhielt.
Das aus Reaktion A erhaltene Produkt und Verbindung 88 wurden in 1 ml eines 0,1 M Natriumhydrogenphosphatpuffers gelöst und unter Argon 60 Stunden lang bei 4ºC gerührt. Das symmetrische Biskonjugat wurde durch Behandlung mit Dithiothreitol entfernt. Nach 30 Minuten Rühren wurde die Mischung auf einer Sephadex G-50-Säule gereinigt, wodurch man 13 mg des Biskonjugats XIV erhielt.
[α]D²&sup0; = +55,7º (c = 0,46; Wasser) Maltotriosid Asymmetrisches Biskonjugat XIV

Beispiel 15

Das asymmetrische Biskonjugat XV wurde gemäß der für die Herstellung des asymmetrischen Biskonjugats XIV beschriebenen Vorschrift dargestellt. Anstelle des Maltotriosids 87 wurde Verbindung 91 verwendet.
Das sulfatierte Cellobiose-Derivat 91 wurde aus Cellobiose-octaacetat 90 gemäß der für die Herstellung der Verbindung 83 aus Verbindung 77 beschriebenen Vorschrift (Beispiel 12) dargestellt.
[α]D²&sup0; = +51,2º (c = 0,83; Wasser) Asymmetrisches Biskonjugat XV

Claims

1. Einstellbares Biskonjugat aus zwei Sacchariden und einem Spacer, wobei die Saccharide gleich oder verschieden sind und jeweils aus zwei bis sechs Monosaccharideinheiten bestehen, von denen wenigstens eine Einheit Uronsäure ist, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Saccharide per se antithrombotische Aktivität aufweist und der Spacer wenigstens ein Saccharid mit dem anderen über sein nicht-reduzierendes Ende verbindet, wobei die Kettenlänge des Spacers 20-120 Atome beträgt.

2. Biskonjugat nach Anspruch 1, wobei wenigstens eines der Saccharide per se Affinität für AT-III und/oder HC-II und/oder Anti-Faktor-IIa- und/oder Anti- Faktor-Xa-Aktivität aufweist.

3. Biskonjugat nach Anspruch 2, wobei beide Saccharide per se Affinität für AT-III und/oder HC-II und/oder Anti-Faktor-IIa- und/oder Anti-Faktor-Xa- Aktivität aufweisen.

4. Biskonjugat nach einem der Ansprüche 1-3, wobei wenigstens eines der Saccharide die Formel

aufweist, in der

R jeweils unabhängig aus H, OH, OSO&sub3;&supmin; und (1-8C)Alkoxy ausgewählt ist;

R&sub1; jeweils unabhängig aus OSO&sub3;&supmin; und NHSO&sub3;&supmin; ausgewählt ist; und die gekurvt e Linie für eine aufwärts- oder abwärtsgerichtete Bindung steht, und die negativen Ladungen durch Wasserstoff oder ein Alkalimetal-Kation ausgeglichen sind.

5. Biskonjugat nach einem der Ansprüche 1-4, wobei wenigstens eines der Saccharide die folgende Formel aufweist

in der R&sub2; unabhängig für OSO&sub3;&supmin; oder OCH&sub3; steht.

6. Biskonjugat nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Spacer die Formel:

= {Q-NT-CO-[(CH&sub2;)n-NT-CO[(CH&sub2;)m]p-S-}&sub2; oder = {Q-O-[(CH&sub2;)n-O]p-(CH&sub2;)m-S}&sub2;

aufweist, wobei

eine der beiden Gruppen Q an das nicht-reduzierende Ende eines der Saccharide gebunden ist und die andere Gruppe Q an das reduzierende oder nicht-reduzierende Ende des anderen Saccharids gebunden ist, und die Gruppen Q jeweils für eine Phenylen-(C&sub6;H&sub4;)-Gruppe oder -[(CH&sub2;O)q-(CH&sub2;)r-O]s-[(CH&sub2;)t-NT-CO]u-(CH&sub2;)v stehen, und T unabhängig Wasserstoff oder (1-8C)Alkyl darstellt; q für 0 oder 1 steht; r und t unabhängig für 2-4 stehen; und

s unabhängig für 1-12 steht, und u und v unanhängig für 1-6 stehen;

n für 1-8 steht, m für 1-8 steht, p für 1-12 steht, und die Anzahl der Atome insgesamt 20-120 beträgt.

7. Biskonjugat nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Spacer die Formel:

aufweist, wobei eine der beiden Gruppen Φ an das nichtreduzierende Ende eines der Saccharide gebunden ist und die andere Gruppe Φ an das reduzierende oder nichtreduzierende Ende des anderen Saccharids gebunden ist, und Φ für eine Phenylen-(C&sub6;H&sub4;)-Gruppe steht; n, m und o unabhängig für 1-8 stehen, und die Anzahl der Atome insgesamt 20-120 beträgt.

8. Biskonjugat nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Spacer die Formel:

aufweist, wobei

eine der beiden freien Valenzen des Spacers an das nicht-reduzierende Ende eines der Saccharide gebunden ist und die andere freie Valenz des Spacers an das reduzierende oder nicht-reduzierende Ende des anderen Saccharids gebunden ist, und T unabhängig für H oder (1-8C)Alkyl steht, m unabhängig für 1-8 steht, r unabhängig für 2-4 steht, s unabhängig für 1-12 steht; w für 0-10 steht, x für 0 oder 1 steht, y für 0 oder 1 steht, z für 0 oder 1 steht, und die Anzahl der Atome insgesamt 20-120 beträgt.

9. Biskonjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die negativen Ladungen durch Wasserstoff oder ein Alkalimetall-Kation ausgeglichen sind:

10. Biskonjugat nach einem der Ansprüche 1-9 zur Verwendung in der Therapie und/oder Prophylaxe von Krankheiten.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als Wirkstoff das Biskonjugat nach einem der Ansprüche 1-9 und pharmazeutisch unbedenkliche Hilfsstoffe.

12. Verwendung des Biskonjugats nach einem der Ansprüche 1-9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von thrombotischen Erkrankungen und der Proliferation von glatten Muskelzellen.