DE68905805T2 - Cyclopentano-vitamin d-analoge. - Google Patents

Description

• Die Erfindung wurde im Verlauf einer Arbeit gemacht, die vom Department of Health and Human Services unterstützt wurde. Die Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
• Die Erfindung betrifft neue und biologisch aktive Vitamin- D-Verbindungen. Spezifischer betrifft die Erfindung 1α- Hydroxyvitamin-D-Analoge, die einen Cyclopentanring als Teil ihrer Seitenketten enthalten. Diese Verbindungen zeigen eine hohe Wirksamkeit bei verschiedenen Tests auf Vitamin-D-Aktivität, und stellen deshalb neue Vertreter für die bekannten Vitamin-D-Verbindungen dar.
• Es ist allgemein bekannt, daß Vitamin D für ein gesundes Knochenwachstum und Entwicklung und für die Aufrechterhaltung des Kalzium-Blutspiegels innerhalb des normalen biologischen Bereichs wesentlich ist. Es ist ebenfalls bekannt, daß diese Wirkung des Vitamin D von der metabolischen Überführung des Vitamins in seine biologisch aktiven Metaboliten abhängt. Spezifischerweise wurde gezeigt, daß 1α, 25-Dihydroxyvitamin D&sub3; (1,25-(OH)&sub2;D&sub3;), der normalerweise aus Vitamin D&sub3; im Tier oder Mensch gebildete hydroxylierte Metabolit der aktive Stoff ist, der für die Regulierung des Kalziumtransportes im Darm verantwortlich ist, und für die Kalziumresorption von dem Knochen (Knochenmobilisierung), wobei der gesamte Blut- Kalziumspiegel des Organismus kontrolliert wird, und die Beibehaltung der Kalziumhomöostase sichergestellt wird. (Diese mit Kalzium verbundenen Wirkungen der Vitamin-D- Metaboliten oder -Analogen wird in der folgenden Beschreibung kollektiv als die "calcämische Aktivität" der Verbindungen bezeichnet). Die Entdeckung der biologisch aktiven Metaboliten von Vitamin D haben die Herstellung vieler synthetischer analoger Verbindungen stimuliert, wie z.B. 1α-Hydroxy-Vitamin D&sub3;, 1α-Hydroxy-Vitamin D&sub2;, fluorierte Vitamin-D-Derivate, sowie analoger Verbindungen mit geänderten Seitenketten, und einige der natürlichen, sowie verschiedene der synthetischen Verbindungen, haben aufgrund ihrer biologischen Wirksamkeit und nützlichen Wirkungen auf das Kalziumgleichgewicht Verwendung gefunden, und wurden als therapeutische Mittel in der Prophylaxe oder Behandlung verschiedener Kalziumstoffwechsel- und Knochenerkrankungen vorgeschlagen, z.B. renale Osteodystrophie, Vitamin D- resistente Rachitis, Osteoporose und verwandte Krankheiten.
• Es ist ebenfalls bekannt, daß 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; und bestimmte verwandte Analoga zusätzlich zu ihrer "calcämischen Wirkung", wie dies vorstehend zusammengefaßt wurde, auch eine starke Wirkung bei der Inhibierung der Vermehrung bösartiger Zellen zeigen und ihre Differenzierung zu normalen Zellen induzieren (diese Aktivität wird hier als "Differenzierungsaktivität" von Vitamin-D-Verbindungen bezeichnet). Aufgrund ihrer bemerkenswerten Fähigkeit als die Differenzierung induzierende Mittel wurden 1α-Hydroxy Vitamin-D-Verbindungen als Anti-Krebs-Mittel vorgeschlagen, zumindest für bestimmte Arten von Krebs (Suda et al., US-Patent Nr. 4,391,802). In neuerer Zeit wurde eine Anzahl von Vitamin-D-Seitenkettenhomologen beschrieben, die z.B. die 24-Homo-, 26-Homo-, 26,27- Dimethyl-, und die 26,27-Diethyl-Analoga von 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; umfassen, von denen berichtet wird, daß sie vorzugsweise als die Differenzierung induzierende Mittel aktiv sind (DeLuca et al., US-Patent Nr. 4,717,721; Sai et al., Chem. Pharm. Bull. 33, 878 (1985); Ikekawa et al., Chem. Pharm. Bull. 35, 4362 (1987)). Zusätzlich wurden 1α- Hydroxyvitamin-D-Verbindungen zur Behandlung bestimmter Hauterkrankungen vorgeschlagen, wie z.B. Psoriasis (Dikstein und Hartzshtark, US-Patent 4,610,978). Dieses breite Wirkungsspektrum und die verschiedenen potentiellen Verwendungen von Vitamin-D-Verbindugnen haben die Forschung nach neuen Analoga mit wünschenswerten biologischen Eigenschaften weiter stimuliert.
Offenbarung der Erfindung
• Es wurden nun neue Vitamin-D-Verbindungen hergestellt, die eine extrem hohe Wirkung bei den gebräuchlichen Vitamin-D- Testsystemen zeigen. Spezifischerweise sind diese Verbindungen sowohl in ihren calcämischen als auch in ihren differenzierenden Wirksamkeiten wirksamer als der natürliche Metabolit, 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;. Die neuen Verbindungen sind 1α,25-Dihydroxyvitamin-D-Analoga, die einen Cyclopentanring in der Seitenkette enthalten, und können durch die folgende allgemeine Strukturformel dargestellt werden:
• worin R¹, R² und R³ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff oder einer Hydroxy-Schutzgruppe, und worin X und Y beide Wasserstoff bedeuten, oder zusammengenommen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindung bilden.
• Die Erfindung stellt auch neue synthetische Zwischenprodukte bereit, die für die Herstellung der vorstehend angegebenen Verbindungen nützlich sind. Diese Zwischenprodukte sind durch die vorstehend angegebene Struktur gekennzeichnet, in der X eine Phenylsulfonyl- (PhSo&sub2;)-Gruppe ist, und worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, oder eine schützende Hydroxygruppe.
• Der in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Ausdruck "Hydroxy-Schutzgruppe" bedeutet irgendeine Gruppierung, die zum Schutz von Hydroxyfunktionen verwendet wird, wie z.B. Acylgruppen, oder Alkylsilylgruppen, oder Alkoxyalkylgruppen. Eine geschützte Hydroxy-Gruppe ist irgendeine Hydroxyfunktion, die sich von einer dieser Hydroxy-Schutzgruppen ableitet. Beispiele für anwendbare Hydroxy-Schutzgruppen sind Acylgruppen, wie z.B. Alkanoylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, z.B. Acetyl, Propionyl, Butyryl, usw., oder Benzoyl- oder Alkyl-, Halogen- oder Nitrosubtituierte Benzoylgruppen, Alkylsilylgruppen, wie z.B. Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Dimethylethylsilyl, t- Butyldimethylsilyl und analoge Gruppierungen, und Alkoxyalkylgruppen, wie z.B. Methoxymethyl, Ethoxymethyl, Methoxyethoxymethyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydropyranyl, usw. Der Ausdruck "Alkyl", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Kohlenwasserstoff-Radikal mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in allen Isomeren Formen.
• Ein spezifisches und bevorzugtes Beispiel für die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen ist das Cyclopentano- 1,25-Dihydroxyvitamin D&sub3;-Analoga, das die nachstehend angegebene Struktur I besitzt:
• Ein weiteres bevorzugtes Beispiel ist das entsprechende 22,23-Dehydro-Analoga, nämlich Cyclopentano-1,25- dihydroxy-22-dehydrovitamin D&sub3;, mit der nachfolgenden Struktur II:
• Die vorstehend angegebenen Verbindungen (oder ihre Hydroxy-geschützten Derivate) werden durch Kuppeln eines geeigneten Seitenkettenfragmentes an einen vorgebildeten Vitamin-D-Kern hergestellt, der am Kohlenstoffatom 22 eine geeignete funktionelle Gruppe besitzt. Für die Synthese der vorstehenden Verbindungen von I und II ist der geeignete Vitamin-D-Kern das 1α-Hydroxyvitamin D-22- tosylat bzw. der 1α-Hydroxyvitamin-D-22-Aldehyd, die durch die folgenden Strukturen dargestellt werden:
• worin R¹ und R² Hydroxy-Schutzgruppen sind. Das geeignete Seitenkettenfragment ist ein Phenylsulfonyl-Derivat der folgenden Struktur:
• worin R³ eine Hydroxy-Schutzgruppe bedeutet.
• Die Kupplung der Phenylsulfonyl-Seitenketteneinheit mit dem vorstehend angegebenen 1α-Hydroxyvitamin-D-22-tosylat ergibt in zwei Basisstufen das neue Vitamin-D- Cyclopentano-Analoga der Struktur I (oder Hydroxygeschützte Derivate davon). Auf ähnliche Weise ergibt die Kupplung der gleichen Phenylsulfonyl-Seitenketteneinheit mit dem vorstehend angegebenen 1α-Hydroxyvitamin D-22- Aldehyd unter Verwendung der allgemeinen Bedingungen von Kutner et al. [Tetrahedron Letters 28, 6129 (1987)] das 22,23-ungesättigte Cyclopentano-Vitamin-D-Analog der Struktur II (oder Hydroxy-geschützte Derivate davon).
• Die Herstellung des Vitamin-D-22-Tosylats oder des 22- Aldehyds als Ausgangsmaterialien ist im Schema I schematisch dargestellt [vgl. ebenfalls Kutner et al., Tetraheron Lett. 28, 6129-6132 (1987)], während die Herstellung der Phenylsulfonyl-Seitenketteneinheit wie im Schema II angegeben erreicht wird. Die Kupplungsreaktion zwischen diesen Materialien zur Erhaltung der gewünschten Vitamin-D-Seitenkettenanaloga vom oben angegebenen Typ I oder II ist im Schema III veranschaulicht. In den folgenden Beispielen wird die Herstellung dieser Verbindungen näher beschrieben. Arabische Zahlen (z.B. Verbindungen 1, 2, 3, usw), die die Ausgangsmaterialien oder Produkte bezeichnen, wie sie in diesen spezifischen Beispielen verwendet werden, beziehen sich auf die im Prozeßschema I, II und III so numerierten Strukturen.
Herstellung von neuen Vitamin Analoga I und II Allgemeine Verfahren:
• Die Infrarotspektren (IR) wurden an einen Nicolet MX-1 FT-IR Spektrometer unter Verwendung von Filmen oder Ölen der unverdünnten Substanzen verwendet. Die Ultraviolett (UV) Absorptionsspektren wurden mit einem Hitachi Model 60-100 UV-VIS Spektrometer aufgenommen. Die kernmagnetischen Resonanz (NMR)-Spektren wurden bei 270 oder 400 MHz mit Bruker WH-270 oder AM-400 FT Spektrometern in den angegebenen Lösungsmitteln aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen (6) werden stromabwärts von Me&sub4;SI (δ = 0.00) angegeben. Nieder- und Hoch-Auflösungsmassenspektren wurden bei 70 eV (wenn nicht anders angegeben) an einem Kratos MS-50 TC Instrument, das mit einem Kratcs DS-55 Datensystem ausgestattet war, gen essen. Die hochaufgelösten Daten wurden durch Peak- Muster (peak matching) erhalten. Die Proben wurden in eine Ionenqueile, die bei 120-250ºC gehalten wurde, mittels einer Direkteingabe-Sonde eingebracht.
• Silicagel 60 (Merck, 70-230 oder 230-400 mesh) wurde für die Säulenchromatographie verwendet. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde unter Verwendung von vorbeschichteten Aluminium-Silicagel-Platten mit UV- Indikator von EM Science (Gibbstown, NJ) durchgeführt. Folgende Lösungsmittel-Systeme wurden verwendet: A: Chloroform-Ethanol 85:15 (V/V); B: Hexan-Ethylacetat 1:1; und C: Hexan-Ethylacetat 3:1. Die Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) wurde unter Verwendung eines Waters Associates Liquid Chromatograph, der mit einem Modell 6000A Lösungsmittel- Zuführungssystem, einem Modell 6 UK Universal Injektor und einem Modell 450 Detektor für variable Wellenlängen ausgestattet war, durchgeführt. Zorbax-Silica (Phenomenex)-Säulen (6.2 mm x 20 cm und 10 mm x 25 cm) wurden verwendet. Lösungsmittel-Systeme: A: 3% 2-Propanol in Hexan; B: 2% 2-Propanol in Hexan; C: 6% 2-Propanol in Hexan; D: 10% 2-Propanol in Hexan; E: 20% 2-Propanol in Hexan; F: 2% Ethylacetat in Hexan. Für die Vorfiltration der HPLC-Proben wurden Silicagel-Sep-Pak (Waters Associates) Patronen verwendet.
• 3β-Acetoxy-22,23-bisnor-5-cholensäure (-cholenic acid) wurde von Steraloids (Wilton, NH) bezogen, Tetrahydrofuran (THF) wurde aus Natriumbenzophenonketyl destilliert. Andere Lösungsmittel wurden durch Standardmethoden gereinigt. n-Butyllithium in Hexan (Aldrich) wurde mit n- Propanol in Gegenwart von 1,10-Phenantrolin in THF unter Argon titriert.
Beispiel 1 Herstellung von Hydroxv-geschütztem Vitamin-Ester (1):
• Der Vitamin D-22-Ester (1) (vgl. Schema I) wurde aus 3β- Acetoxy-22,23-bisnor-5-cholensäure gemäß den allgemeinen von Kutner et al., Tetrahedron Lett. 28, 6129-6132 (1987) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Beispiel 2 Herstellung von Vitamin-D-22-Alkohol (2) und seinem Tosylat (3):
• Zu einer gerührten Lösung von 136.2 mg (0.23 mmol) Ester (1) in 5 ml wasserfreiem THF wurden 25 mg (0.65 mmol) Lithiumaluminiumhydrid unter Stickstoff bei 0ºC zugegeben. Die Suspension wurde 15 min lang bei 0ºC gerührt und der Überschuß des Reagens wurde durch tropfenweise Zugabe von 10% Wasser in THF zersetzt. Die Suspension wurde mit 10 ml THF verdünnt und das Rühren wurde weitere 15 min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Produkt wurde mittels eines Standard- Extraktionsverfahrens mit Ethylacetat isoliert. Die Silicagel-Sep-Pak-Filtration in 10% Ethylacetat in Hexan ergab den 22-Alkohol (2) (118.4 mg, 91%) als farbloses Öl: IR (Film) 3450, 2952, 2886, 1447, 1258, 1105, 1085, 834 cm&supmin;¹; UV (EtOH) λmax 264 nm, λmin 227 nm, A264/A227 = 1.57; ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0.00 (12H,, s, Si-CH&sub3;), 0.53 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0.85 [18H, s, Si-C(CH&sub3;)&sub3;], 1.04 (3H, d, J=6.4 Hz, 21-CH&sub3;), 3.37 und 3.63 (1H und 1H, jedes m, 22-CH&sub2;), 4.17 (1H, m, 3-H), 4.35 (1H, m, 1-H), 4.84 (1H, br s, 19Z-H), 5.16 (1H, br s, 19E-H), 6.00 (1H, d, J=12.2 Hz, 7-H), 6.21 (1H, d, J=12.2 Hz, 6-H); MS, m/z, 574 (M&spplus;, 17), 442 (67), 383 (11), 308 (17), 248 (100).
• Eine eiskalte Lösung von 42.7 mg (0.22 mmol) p- Toluolsulfonylchlorid in 50 ul trockenem Pyridin wurde zu einer gerührten Lösung von Alkohol (2) bei 0ºC unter Stickstoff zugegeben. Die Mischung wurde bei 5ºC während 22 Std. gerührt und mittels TLC (System C) verfolgt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine eisgekühlte gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung gegossen und das Rühren wurde weiter 30 min fortgesetzt. Das Produkt wurde mit Ethylether-Hexan 1:1 (V/V) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigtem NaCl gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck entfernt und das Pyridin in einem Stickstoffstrom entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Sep-Pak-Filtration (5% Ethylacetat in Hexan) gereinigt und ergab reines Tosylat (3) (54 mg, 98%): IR (Film) 2950, 1580, 1367, 1267, 1189, 1178, 1099, 1085, 835 cm&supmin;¹; UV (Hexan) λmax 263 nm, λmin 236 nm; ¹H NMR (CDCl&sub3;), 6 0.00 (12H, s, Si-CH&sub3;), 0.43 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0.81 [18H, s, Si-C(CH&sub3;)&sub3;], 0.94 (3H, d, J=6.8 Hz, 2-CH&sub3;), 2.40 (3H, s, Ar-CH&sub3;), 3.64 und 3.91 (1H und 1H, jedes in, 22-CH&sub2;), 4.13 (1H, m, 3-H), 4.31 (1H, m, 1-H), 4.79 (1H, brs, 19Z-H), 5.13 (1H, brs, 19E-H), 5.94 (1H, d, J=12.8 Hz, 7-H), 6.17 (1H, d, J=12.8 Hz, 6-H), 7.43 und 7.84 (2H und 2H, jedes m, Ar-H); MS, m/z, 728 (6), 596 (30), 556 (7), 464 (7), 424 (44), 367 (19), 292 (23), 248 (100); exakte Masse berechnet für C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub8;O&sub5;Si&sub2;S, 728.4338; gefunden, 728.4326.
Beispiel 3 Herstellung von Vitamin-D-22-Aldehyd (4):
• Eine Lösung von 30 ul (0.34 mmol) Oxalylchlorid in 0.5 ml Dichlormethan wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 50 ul (0.7 mmol) DMSO in 3 inl Dichlormethan bei -60ºC unter Stickstoff zugegeben. Nach Rühren der Mischung während 10 min bei -60ºC wurde eine Lösung vom 27 mg (0.05 mmol) des Alkohols (2) in 1 ml Dichlormethan langsam zugegeben. Die Mischung wurde 30 min bei -60ºC gerührt und 0.2 ml Triethylamin zugegeben. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, gewaschen (NaCl) und getrocknet (MgSO&sub4;). Die Silicagel-Sep-Pak-Filtration ergab reines (4) (17 mg, 62%) als farbloses Öl: IR (Film) 2954, 2929, 2884, 2857, 1727, 1472, 1375, 1256, 1085, 909, 880,835 cm&supmin;¹; NMR (CDCl&sub3;), δ 0.00 (12H, s, Si-CH&sub3;), 0.60 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0.88 [18H, s, Si-C(CH&sub3;)3], 1.11 (3H, d, J=6.9 Hz, 21-CH&sub3;), 4.23 (1H, m, 3- H), 1H, m, 1-H), 4.93 (1H, br s, 19Z-H)1 5.19 (1H, br s, 19E-H), 6.07 (1H, d, J=10.0 Hz, 7-H), 6.26 (1H, d, H=10.0 Hz, 6-H), 9.54 (1H, d, J=3 Hz, 22-H); UV (Hexan) λmax 264 nm, λmin 227 nm, A264/A227 = 1.9; MS, m/z, 572 (M&spplus;, 13), 440 (53), 383 (11), 308 (14), 248 (100); exakte Masse berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub6;&sub0;O&sub3;Si&sub2;, 572.4081; gefunden 572.4117.
• Eine verbesserte Ausbeute an Aldehyd (4) wurde erhalten, wenn das obige Oxidationsverfahren unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde: Eine Lösung von 15 ul (0.17 mmol) Oxalylchlorid in 0.75 ml wasserfreiem Dichlormethan wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 25 ul (0.36 mmol) Dimethylsulfoxid in 0.25 ml wasserfreiem Dichlormethan bei -60ºC unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben. Nach Rühren der Mischung während 10 min bei -60ºC wurde eine Lösung von 20.3 mg (0.035 mmol) des Alkohols (2) in 0.5 ml wasserfreiem Dichlormethan langsam zugegeben, und der Kolben mit zusätzlich 0.2 ml des gleichen Lösungsmittels gespült. Die erhaltene Mischung wurde 30 min bei -60ºC gerührt und 0.3 nl (2.15 mmol) Triethylamin zugegeben (-60ºC). Die Mischung wurde 5 min lang gerührt, auf 0ºC erwärmen gelassen und mit Ether extrahiert. Die Etherphase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;), und die Silicagel-Sep-Pak-Filtration ergab (4) als farbloses Öl, das mittels HPLC (Zorbax-Sil 0.94 x 25 cm, 10% Ethylacetat in Hexan) weiter gereinigt wurde, und reinen Aldehyd (4) ergab (19 mg, 86% Ausbeute); nur eine Spur des Alkohol-Ausgangsmaterials wurde wiedergewonnen (0.12 mg).
Beispiel 4 Herstellung des Phenylsulfonyl-Seitenkettenfragments (10).
• Das Hydroxylgruppen-geschützte Seitenkettenfragment wurde aus β-Propiolacton (5) als Ausgangsmaterial hergestellt. Das Lacton (5) wurde in das Diol (6) durch Umsetzung mit 1.4-Bis-(Bromagnesium)-butan gemäß einer bekannten Methode [P. Canonne, et al., J. Org. Chem. 45, 1828 (1980)] überführt. Die weitere Überführung der Verbindung (6) in die gewünschte Seitenketteneinheit (10) wurde gemäß den allgemeinen Verfahren von Kutner et al., Tetrahedron Lett. 28, 6129 (1987) durchgeführt. Auf diese Weise wurde die primäre Alkoholfunktion im Diol (6) in das Tosylat (7) überführt und das Tosylat durch das Thiophenol-Anion ersetzt, um das Phenylsulfid-Derivat (8) zu ergeben. Nach Oxidation des letzteren mit n-Chlorperbenzoesäure wurde das entsprechende Phenylsulfon (Verbindung 9) erhalten, das in die gewünschte Hydroxy-geschützte Form durch Überführung (unter Verwendung eines Überschusses an Triethylsilylchlorid und Imidazol in Dimethylformamid bei Raumtemperatur während ca. 2 Std.) in das Triethylsilyl-Derivat, Verbindung (10) überführt wurde. Das geschützte Sulfon (10) wurde mit einer Gesamtausbeute von 48% als dickes farbloses Öl erhalten: IR (Film) 3050, 2900, 1440, 1405, 1300, 1230, 1045, 1000 cm&supmin;¹; ¹H NMR (CDCl&sub3;), δ 0.47 (6H, J=5.7 Hz, Si-CH&sub2;), 0.86 (9H, t, J=5.7 Hz, C113), 1.46-1.57 (4H, m), 1.63-1.71 (4H, m), 1.86-1.89 (2H, m), 3.23-3.26 (2H, m), 7.58 (2H, t, J=7.3 Hz, Ar-H, meta), 7.66 (1H, t, J=7.3 Hz, Ar-H, para), 7.92 (2H, d, H=7.3 Hz, Ar-H, ortho); MS, m/z (30 eV, rel. int.), 368 (M&spplus;, 0.01), 339 (M&spplus;-Et, 100, 227 (8), 199 (8), 163 (17), 135 (10), 115 (9), 95 (13), 87 (12), 75 (14); exakte Masse berechnet für C&sub1;&sub9;H&sub3;&sub2;O&sub3;SSi, 368.1841; gefunden 368.1936.
Beispiel 5 Herstellung von Cyclopentano-1,25-dihydroxyvitamin D&sub3; Analoga I.
• Diisopropylamin (8 ul) wurden zu einer gerührten Lösung von n-BuLi (41 ul; 1.35 M in Hexan), die 1,10 Phentanthrolin als Indikator enthielt, bei -78ºC unter Argon zugegeben. Nach Rühren unter Argon während 30 min wurde eine Lösung des Phenylsulfon-Derivats (28 mg) (10) in THF (200 ul) zugegeben. Nach Rühren der resultierenden braunen Mischung bei -75ºC unter Argon während 30 min wurde das Kühlbad durch ein CCl&sub4;/Trockeneisbad ersetzt. Nach 15-minütigem Rühren bei -21ºC wurde eine THF-Lösung des Tosylats (11 mg) (3) zugegeben, und die Farbe der Reaktionsmischung wurde wieder rot. Die Lösung wurde bei -20 bis -10 C 3.5 Std. lang gerührt. Dann wurde gesättigtes Na&sub4;Cl bei -10ºC zugegeben und die Mischung mit Hexan extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und dann durch eine Silicalgel-Sep-Pak-Filterpatrone filtriert, und ergab das intermediäre Sulfon-Derivat (11) als Mischung der C-23- Epimeren. Dieses Produkt wurde direkt mit 5% Natriumamalgam desulfonyliert. Eine gesättigte Lösung von Na&sub2;HPO&sub4; in Methanol (500 ul) wurde zu einer gerührten Lösung des Sulfon-Derivats (11) in wasserfreiem THF (500 ul) zugegeben, gefolgt durch eine Zugabe von mehr gepulvertem NaHPO&sub4;. Die Mischung wurde unter Argon 30 min lang gerührt und auf 0ºC abgekühlt. Frisches 5%-iges Natriumamalgam wurde dann zugegeben und das Rühren 3 Std. lang bei 5ºC fortgesetzt. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels TLC (System C) verfolgt, und nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Mischung mit Hexan verdünnt und weitere 15 min lang gerührt. Die Hexanschicht wurde abdekantiert und die Methanolschicht wurde mit mehreren Portionen Hexan gewaschen. Die vereinigten Hexanextrakte wurden mittels kalter gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und dann über eine Silicagel-Sep-Pak-Filterpatrone filtriert und ergaben Hydroxy-geschütztes Triol (105 ug (12)). Die Schutzgruppen wurden durch Behandlung einer THF-Lösung (500 ul) von (12) mit einer Lösung von Tetrabutylamoniumfluorid in THF (10 ul; 1 M Lösung) entfernt. Nach 50-minütigem Rühren bei 50ºC unter Argon wurde Ether zugegeben und die organische Phase wurde mit NaCl-Lösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde dann abgedampft und der Rückstand durch Filtration über eine Silicagel-Sep-Pak-Filterpatrone (10% 2-Propanol in Hexan) filtriert, und das Produkt, die gewünschte Vitamin-analoge Verbindung I wurde dann durch präparative HPLC (10 mm x 25 cm Säule, System D) gereinigt. Triol I (54 ug), erhalten in 12%-iger Ausbeute (aus 3), zeigte die folgenden physikalischen Eigenschaften: IR (Film) 3360, 2930, 1605, 1442, 1378, 1291, 1145, 1105, 1080, 1062 cm&supmin;¹; UV (10% 2-Propanol in Hexan) λmax 264 nm, λmin 228 nm, A264/A228 = 1.71; 1H NMR (DC&sub3;OD),δ 0.48 (3H, s, 18CH&sub3;), 0.87 (3H, d, LT=6.4 Hz, 21-CH&sub3;), 4.03 (1H, m, 3-H), 4.25 (1H, m, 1-H), 4.80 (1H, br s, 19Z-H), 5.19 1H, br s, 19E-H), 5.98 (1H, d, J=11.2 Hz, 7-H), 6.23 (1H, d, J=11.1 Hz, 6-H); MS, m/z (relative Intensität), 442 (M&spplus;, 5), 424 (43), 406 (38), 388 (7), 298 (6), 285 (12), 269 (20), 251 (24), 134 (100), 85 (28); exakte Masse berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub8;O&sub3;, 442.3447; gefunden 442.3438.
Beispiel 6 Herstellung des Cyclopentano-1 25-dihydroxy-22-dehydro- Vitamin D&sub3;-Analog II.
• Zu einer gerührten LÖsung von 27 mg (73 umol) 1-[-(Phenylsulfonyl)ethyl]-1- [(triethylsilyl)oxyl]-cyclopentano (10) in 300 ul wasserfreiem Tetrahydrofuran (das 1,10-Phenanthrolin als Indikator enthielt) wurden unter Argon-Atmosphäre bei -78ºC 11 ul Diisopropylamin (80 umol), und dann 62 ul n- BuLi (1.3 M in Hexan) (80 µmol) zugefügt. Die Lösung wurde unter Argon-Atmosphäre bei -78ºC 30 min lang gerührt, und dann 1.8 mg Aldehyd (4) (3 µmol) in 300 ul wasserfreiem Tetrahydrofuran zugegeben und bei -78ºC 1 Std. lang gerührt. Die Mischung wurde durch Zugabe von 1 ml gesättigter NH&sub4;Cl-Lösung zersetzt, auf 0ºC erwärmt und mit Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde mit Kochsalzlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Eine präparative HPLC (Zorbax-Sil 9.4 mm x 25 cm Säule, Lösungsmittel-System 10% Ethylacetat in Hexan) ergab 0.5 mg unumgesetzten Aldehyd und 2.3 mg der Hydroxysulfone (13) als Mischung der Epimeren.
• Eine gesättigte Lösung von Na&sub2;HPO&sub4; in Methanol (1.0 ml) wurde zu einer gerührten Lösung von Hydroxysulfonen (13) (2.3 mg) in 1.0 ml wasserfreiem THF zugegeben, gefolgt von gepulvertem wasserfreiem Na&sub2;HPO&sub4; (160 mg). Die Mischung wurde unter Argon-Atmosphäre 30 min lang gerührt und auf 0ºC abgekühlt. Frisches 5%-iges Natriumamalgam (ca. 400 mg) wurde dann hinzugefügt, und die Mischung wurde 16 Std. bei 5ºC gerührt. Die Mischung wurde mit 5 ml Hexan verdünnt und das Rühren wurde 15 min lang fortgesetzt. Die Lösungsmittel wurden abdekantiert und das feste Material wurde mit Hexan (3 x 5 ml) gewaschen. Zu der vereinigten organischen Lösung wurde Eis und Kochsalz zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und durch eine Sep-Pak- Filterpatrone in Hexan hindurchgeleitet. HPLC-Reinigung ergab 260 ug der Verbindung (14) zusammen mit 126 ug des 22-hydroxylierten Produkts (Zorbax-Sil 9.4 mm x 25 cm Säule, 10% Ethylacetat in Hexan). Das geschützte Triol (11) wurde in 1.0 ml wasserfreiem THF gelöst und Tetrabutylammoniumchlorid in wasserfreiem THF (50 ul, 1 M Lösung) zugegeben. Die Mischung wurde unter Argon- Atmosphäre 1 Std lang bei 50ºC gerührt. Ether (5 ml) wurde dann zugegeben und die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen. Die Lösungsmittel wurden entfernt und der Rückstand wurde in 1:1 2-Propanol/Hexan gelöst und über eine Silicagel-Sep-Pak-Filterpatrone geleitet. Präparative HPLC (Zorbax-Sil 9.4 mm x 25 cm Säule, 20% 2-Propanol in Hexan) ergab das 22E-Dehydrotriol (II) (110 ug) Uv (EtOH) λmax 264 nm, λmax 228, A264/A228= 1.7; ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0.56 (3H, s, 18-CH&sub3;), 1.04 (3H, d, J=6.5 Hz, 21-CH&sub3;), 4.23 (1H, m, 3-H), 4.44 (1H, m, 1-H), 4.99 (1H, br s, 19Z-H), 5.32 (1H, br s, 19E-H), 5-41 (2H, m, 22 und 23 H), 6.01 (1H, d, J=11.3 Hz, 7-H), 6.37 (1H, d, J=11.2 Hz, 6-H). MS, m/z (relative Intensität) 440 (M&spplus;, 14), 422 (51), 404 (20), 287 (10), 269 (22), 251 (18), 152 (30), 134 (100), 116 (8), 85 (98); exakte Masse berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub4;O&sub3;, 440.3290; gefunden 440.3305.
Biologische Aktivität der neuen Vitamin-D-Analoga
• Die neuen Vitamin-D-Analoga, Cyclopentano-1,25-dihydroxy- Vitamin D&sub3; (Verbindung I) und Cyclopentano-1-25-dihydroxy- 22E-dehydro-Vitamin D&sub3; (Verbindung II) wurden sowohl auf ihre calcämische Aktivität als auch auf ihre differenzierende Aktvität unter Verwendung anerkannter Verfahren getestet. Die Testverfahren und erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Beispielen beschrieben.
Beispiel 7 Intestinale Kalziumtransport-Aktivität und Knochen- Kalzium-Mobilisierungsaktivität der Verbindungen I und II
• Männliche, vor kurzem entwöhnte Ratten (erhalten von Harlan-Sprague Dawley Co., Madison, WI) wurden mit einer Diät, die wenig Kalzium enthielt, und kein Vitamin D (0.02% Kalzium, 0.3% P), wie von Suda et al., (J. Nutr. 100, 1049-1052, 1970) beschrieben, während einer Gesamtzeit von 4 Wochen ad libitum gefüttert. Am Ende der dritten Woche wurden die Tiere statistisch in Gruppen von jeweils 6 Ratten unterteilt. Eine Gruppe (Kontrollgruppe) erhielt eine tägliche Dosis des Lösungsmittelträgers (0.1 ml 95% Propylenglycol/5% Ethanol) durch intraperitoneale (i.p.) Injektion während einer Gesamtzeit von 7 Tagen. Die anderen Gruppen erhielten die Mengen der Testverbindungen (d.h. 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;, Verbindung I, oder Verbindung II), wie in Tabelle 1 angegeben, gelöst in der gleichen Menge des Lösungsmittelträgers, durch tägliche Injektion während eines Zeitraums von 7 Tagen. Die Tiere wurden 24 Std. nach der letzten Injektion getötet, und ihre Gedärme wurden für die intestinalen Kalziumtransport-Messungen entfernt, und ihr Blut wurde für den Test auf die Knochen-Kalzium- Mobilisierung (Messung der Serum-Kalzium-Spiegel) gesammelt. Der intestinale Kalziumtransport wurde mittels der Darmsack-Methode (everted gut sac technique) [Martin & DeLuca, Am. J. Physiol. 216, 1351 (1969)], wie von Halloran and DeLuca [Arch. Biochem. Biophys. 208, 477-486 (1981)] beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse, die auf die übliche Weise als Verhältnis der serosalen/mucosalen Kalzium-Konzentrationen angegeben sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt. Die Knochen-Kalzium- Mobilisierung wurde durch Messen der Serum-Kalzium-Spiegel untersucht, unter Verwendung der Standardverfahren: 0.1 ml aliquoter Teile des Serums wurden mit 1.9 ml einer 0.1%- igen wässerigen Lösung von LaCl&sub3; verdünnt und die Kalziumkonzentrationen wurden dann direkt durch Atomabsorptions-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als mg-% Kalzium, sind ebenfalls in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Aktivität von Cyclopentano-Vitamin-D-Analogen auf den intestinalen Kalziumtransport und die Knochen- Kalzium-Mobilisierung (Serum-Kalzium-Spiegel) verabreichte Verbindung Menge ng/Tag Kalziumtransport [Ca Serosal]/[Ca Mucosal] Serum-Kalzium mg% Mittel±S.E.M. Keine (Kontrolle) Cyclopentano-1,25-(OH)&sub2;D&sub3; (Verbindung I) Cyclopentano-1,25-(OH)&sub2;-22-Dehydro-D&sub3; (Verbindung II)
Beispiel 8 Differenzierende Wirkung der Verbindungen I und II
• Der Grad der Differenzierung von HL-60 Zellen (menschliche Leukämiezellen) als Antwort auf die Testverbindungen wurde nach drei verschiedenen Methoden untersucht: NBT- Reduzierung, Esterase-Aktivität, und Phagozytose- Aktivität. Die NBT-Reduktion und die Phagozytose-Tests wurden, wie von DeLuca et al. im US-Patent 4,717,721 beschrieben, durchgeführt. Der dritte Test, die Messung der nicht spezifischen Säureesterase als Marker für den Grad der Differenzierung wurde gemäß dem Verfahren, wie es im Sigma Kit Nr. 90, erhältlich von Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO, [vgl. auch Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2610 (1987); Ostrem et al., J. Biol. Chem. 262, 14164 (1987))] durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 angegeben. Die Daten der drei Untersuchungen werden als Prozent der differenzierten Zellen, die aus der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen an 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; (als Vergleichsstandard verwendet) oder der Cyclopentano-Vitamin-D-Analoga I und II angegeben. Tabelle 2 Differenzierende Aktvität von Cyclopentano-1,25-(OH)&sub2;D&sub3; (Verbindung I) und Cyclopentano-1,25-(OH)&sub2;-22-dehydro-D&sub3; (Verbindung II) in HL-60-Zellkulturen %Differenzierte Zellen verabreichte Verbindung Konzentration (molar) Esterase Phagozytose Cyclopentano-1,25-(OH)&sub2;D&sub3; (Verbindung I) Cyclopentano-1,25-(OH)&sub2;-22-Dehydro-D&sub3; (Verbindung II)
• Die vorstehenden Testergebnisse bestätigen, daß die neuen Cyclopentano-Analoga I und II eine hohe calcämische und differenzierende Wirksamkeit zeigen. Tatsächlich zeigen die in der Tabelle 1 und Tabelle 2 angegebenen Testergebnisse im Hinblick auf die calcämische Aktivität und die differenzierende Aktivität, daß die zwei Cyclopentano-Vitamin D-Analoga wirksamer als das natürliche Hormon, 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; sind. Die von den Analoga I und II (vgl. Tabelle l) hervorgerufene Kalziumtransport- Antwort ist etwa die gleiche wie die von 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;, aber die beiden Analoga sind deutlich wirksamer als 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; im Hinblick auf ihre Wirkung auf die Kalzium-Mobilisierung aus Knochen (Tabelle 1). Auf ähnliche Weise zeigen die Daten in Tabelle 2, daß die Analoga I und II etwa 5 mal aktiver sind als 1,25-(OH)2D&sub3; bei der Induzierung der Differenzierung von Leukämiezellen. Dies wird z.B. dadurch evident, daß beide Verbindungen I und II eine 90%-ige Differenzierung bei einer Konzentration von 5 x 10&supmin;&sup8; M erzielen, während eine 5fach höhere Konzentration (1 x 10&supmin;&sup7; M) von 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; erforderlich ist, um den gleichen Grad an Differenzierung zu erreichen.
• Auf der Basis dieser Ergebnisse kann man die Schlußfolgerung ziehen, daß beide der neuen Cyclopentano- Analoga wirksam als Kalzium-regulierende Mittel oder als die Differenzierung induzierende Mittel verwendet werden können. Die neuen Analoga können deshalb in der Prophylaxe oder Behandlung von Störungen des Kalziumstoffwechels, wie z.B. renaler Osteodystrophie, Vitamin D-resistente Rachitis, Osteoporose und verwandten Krankheiten verwendet werden. Auf die gleiche Weise zeigt ihre hohe Wirksamkeit bei der Induzierung der Differenzierung bösartiger Zellen zu normalen Zellen an, daß die Cyclopentano-Analoga anstelle solcher bekannter Verbindungen wie 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; für die Behandlung neoplastischer Erkrankungen, insbesondere von Leukämien, verwendet werden können.
• Für die Zwecke der Behandlung können diese Verbindungen als Lösungen in unschädlichen Lösungsmitteln, oder als Emulsionen, Suspensionen, oder Dispersionen in geeigneten und unschädlichen Lösungsmitteln und Trägern, oder als Pillen, Tabletten, oder Kapseln auf konventionelle, an sich bekannte Weise formuliert werden. Solche Formulierungen können auch andere pharmazeutisch annehmbare Substanzen, wie z.B. inerte Träger, oder Stabilisatoren, Anti-Oxidantien, Bindemittel, Farbstoffe oder emulgierende oder Geschmacks-modifizierende Mittel enthalten.
• Die Verbindungen werden vorteilhafterweise durch Injektion verabreicht, oder durch intravenöse Infusion geeigneter steriler Lösungen, oder in Form oraler Dosen als Pillen, Tabletten, oder Kapseln. Für die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen des Kalziumstoffwechsels werden die Verbindungen an Patienten in Dosen verabreicht, die ausreichen, um die Störung zu korrigieren oder sie zu verhindern. Geeignete Dosisbereiche liegen von 0.1 bis 10 ug pro Tag, abhängig von dem Zustand und dem Ansprechen des zu behandelnden Patienten. Ähnliche Dosismengen sind bei der Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Verbindungen für die Behandlung neoplastischer Erkrankungen geeignet.

Claims (11)

1. Verbindungen der folgenden Struktur:

worin R¹, R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und einer Hydroxy-Schutzgruppe, X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Phenylsulfonyl, Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy und einer geschützten Hydroxy-Gruppe, und worin X und Y zusammengenommen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung bilden.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxy-Schutzgruppe eine Acylgruppe oder eine Alkoxyalkylgruppe ist.

3. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxy-Schutzgruppe eine Alkylsilylgruppe ist.

4. Die Verbindung mit der Struktur:

5. Die Verbindung mit der Struktur:

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine der in Anspruch 1 beanspruchten Verbindungen zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen, allein oder in Kombination, in einer Menge von ca. 0.1 bis ca. 10 ug vorhanden sind.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung von Anspruch 4, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung in einer Menge von ca. 0.1 bis ca. 10 ug vorhanden ist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung von Anspruch 5, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung in einer Menge von ca. 0.1 bis ca. 10 ug vorhanden ist.