DE60201921T2 - Kondensierte Pyrazolverbindungen - Google Patents

Description

• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• cGMP, ein intrazellulärer sekundärer Messenger, spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung von verschiedenen zellulären Aktivitäten. Es wird durch lösliche Guanylatcyclase (sGC) aus GTP umgewandelt und durch Phosphodiesterasen (PDE) gespalten. Daher kann die Erhöhung der cGMP-Niveaus erreicht werden, indem die Aktivität von sGC erhöht oder die Aktivität von PDE verringert wird.
• Die Plättchenaggregation trägt zur Pathogenese von verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen bei, z. B. Arteriosklerose, myokardialer Infarkt, instabiler Angina Pektoris, Thrombose und Hypertension. Da geringe intrazelluläre Niveaus von cGMP eine erhöhte Plättchenaggregation hervorrufen, bietet die Erhöhung von cGMP-Gehalten in den Plättchen einen Weg zur Behandlung dieser Erkrankungen. Intrazelluläre cGMP-Gehalte sind auch dafür bekannt, andere physiologische Funktionen zu beeinflussen, z. B. die penile Erektion.
• Verbindungen, die die intrazellulären cGMP-Niveaus entweder durch Aktivierung von sGC oder durch Inhibierung von PDE erhöhen, haben klinische Implikationen bei Störungen, die mit geringen intrazellulären cGMP-Niveaus verbunden sind. Es ist festgestellt worden, dass bestimmte Pyrazolylverbindungen sGC aktivieren und potentielle kardiovaskuläre Arzneimittel sind.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Ein erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die kondensierte Pyrazolylverbindung 1-Benyzl-3-(5'-methoxymethyl-2'-furyl)-5,6-methylendioxoindazol und pharmazeutisch akzeptable Salze desselben.
• Die Struktur von 1-Benyzl-3-(5'-methoxymethyl-2'-furyl)-5,6-methylendioxoindazol ist im Folgendenden gezeigt.
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• Salze der erfindungsgemäßen Pyrazolylverbindung können beispielsweise zwischen einem positiv geladenen Substituenten, z. B. Amino, und einem Anion gebildet werden. Geeignete Anionen schließen Chlorid, Bromid, Iodid, Sulfat, Nitrat, Phosphat oder Acetat ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. In ähnlicher Weise kann ein negativ geladener Substituent (z. B. Carboxylat) ein Salz mit einem Kation bilden. Geeignete Kationen schließen Natriumion, Kaliumion, Magnesiumion, Calciumion und ein Ammoniumkation wie Tetramethylammoniumion ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
• Verbindungen dieser Erfindung können sGC aktivieren oder PDE inhibieren.
• Daher betrifft ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält, zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer geringen Aktivität von sGC, einer hohen Aktivität von PDE oder Plättchenaggregation verbunden sind.
• Einzelheiten verschiedener erfindungsgemäßer Ausführungsformen sind in der folgenden Beschreibung aufgeführt. Andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung und auch aus den Ansprüchen ersichtlich.
• AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Eine erfindungsgemäße kondensierte Pyrazolylverbindung kann durch das folgende Verfahren synthetisiert werden. Man setzt ein Alkylendioxoarylacylchlorid mit einer Arylverbindung um, um ein Alkylendioxoarylarylketon herzustellen. Das Keton wird dann mit einem Hydrazin umgesetzt, um ein Hydrazon herzustellen, das anschließend in Gegenwart eines ersten Katalysators Pb(OAc)₄ in ein Zwischenprodukt umgewandelt wird. Ohne gereinigt zu werden, wird das Zwischenprodukt in Gegenwart eines zweiten Katalysators BF₃·Et₂O weiter in eine kondensierte Pyrazolylverbindung umgewandelt. Erwünschte funktionelle Gruppen, z. B. Hydroxycarbonyl oder Hydroxyalkyl, können in die so erhaltene kondensierte Pyrazolylverbindung durch weitere Modifikationen eingeführt werden.
• Im Folgenden ist ein Schema gezeigt, das die Synthese einer erfindungsgemäßen kondensierten Pyrazolylverbindung darstellt:
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• Einzelheiten der Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung sind in Beispiel 1 beschrieben.
• Erfindungsgemäße Verbindungen können verwendet werden, um die intrazellulären Niveaus von cGMP durch Aktivierung von sGC oder Inhibierung von PDE zu erhöhen. Daher betrifft ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von mindestens einer kondensierten Pyrazolylverbindung der Formel (I) (oder ihres Salzes) und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält, zur Behandlung von Erkrankungen, die mit niedrigen intrazellulären cGMP- Niveaus verbunden sind, z. B. Impotenz oder mit Plättchenaggregation verbundene Störungen. "Eine wirksame Menge" bezieht sich auf die Menge der Verbindung, die benötigt wird, um eine therapeutische Wirkung bei dem behandelten Individuum zu erzielen. Der Zusammenhang von Dosierungen für Tiere und Menschen (bezogen auf Milligramm pro Quadratmeter Körperoberfläche) ist in Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 1966, 50, 219 beschrieben. Die Körperoberfläche kann annähernd aus der Größe und dem Gewicht des Patienten ermittelt werden. Siehe wissenschaftliche Tabellen, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N.Y., 1970, 537. Wie von Fachleuten anerkannt ist, variieren wirksame Dosen auch in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg, der Arzneimittelträgerverwendung und der Möglichkeit einer Mitverwendung mit anderen therapeutischen Behandlungen einschließlich der Verwendung von anderen Antiplättchenaggregationsmitteln. Beispiele für die Träger schließen kolloidales Siliciumdioxid, Magnesiumstearat, Cellulose, Natriumlaurylsulfat und D&C Yellow Nr. 10 ein.
• Die pharmazeutische Zusammensetzung kann über einen parenteralen Weg, z. B. topisch, subkutan, intraperitoneal, intramuskulär und intravenös verabreicht werden. Beispiele für parenterale Dosierformen schließen wässrige Lösungen der aktiven Verbindung in einer isotonischen Kochsalzlösung, 5%ige Glucose oder irgendeinen anderen wohl bekannten pharmazeutisch akzeptablen Träger ein. Solubilisierungsmittel, wie Cyclodextrine, oder andere Solubilisierungsmittel, die Fachleuten wohl bekannt sind, können in der pharmazeutischen Zusammensetzung ebenso enthalten sein.
• Eine erfindungsgemäße kondensierte Pyrazolylverbindung kann unter Verwendung von wohl bekannten Verfahren in Dosierformen für andere Verabreichungswege (z. B. oral, mukosal oder perkutan) formuliert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann beispielsweise in Dosierformen für die orale Verab reichung in einer Kapsel, einer Geldichtung oder einer Tablette formuliert werden. Kapseln können irgendein wohl bekanntes pharmazeutisch akzeptables Material wie Gelatine oder Cellulosederivate umfassen. Tabletten können nach der herkömmlichen Verfahrensweise durch Komprimieren von Mischungen der aktiven Verbindungen, eines festen Trägers und eines Gleitmittels formuliert werden. Beispiele für feste Träger schließen Stärke und Zucker-Bentonit ein. Die Verbindung kann auch in Form einer Hartschalentablette oder -kapsel verabreicht werden, die beispielsweise Laktose oder Mannit als Bindemittel, einen konventionellen Füllstoff und ein Tablettiermittel enthält.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können vorläufig im Hinblick auf ihre Effizienz bei der Behandlung der oben beschriebenen Erkrankungen durch einen oder mehrere der folgenden in vitro-Assays geprüft werden:
• Die Wirksamkeit einer Verbindung bei der Aktivierung von sGC kann in vitro durch den folgenden Assay bewertet werden. Gewaschene Plättchen werden in einer Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschall getrennt. Das Lysat wird dann zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten, die als Quelle für sGC verwendet wird. Eine aliquote Menge der überstehenden Flüssigkeit und der zu prüfenden Verbindung werden in eine Pufferlösung gegeben, die GTP, ein Substrat für sGC, enthält. Die Aktivität von sGC kann durch das Verfahren ermittelt werden, das in Gerzer et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1983, 226: 180 beschrieben ist.
• Die Wirksamkeit einer Verbindung bei der Inhibierung von PDE kann in vitro durch den folgenden Assay bewertet werden. Gewaschene Plättchen werden in Tris-HCl-Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschall getrennt. Das Lysat wird zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten, die PDE enthält. Eine aliquote Menge der überstehenden Flüssigkeit wird entnommen, um eine PDE-haltige Lösung herzustellen. Die zu prüfende Verbindung und cGMP (ein Substrat für PDE) werden der Lösung zugegeben. Schlangengift von Ophiophagus hannah wird anschließend zugegeben, um das Phosphat in 5'-GMP (aus cGMP umgewandelt durch PDE) zur Bildung von ungeladenem Guanosin zu entfernen. Ein Ionenaustauscherharz wird verwendet, um das verbleibende cGMP zu entfernen. Die cGMP-freie Lösung wird dann zentrifugiert, und eine aliquote Menge der überstehenden Flüssigkeit wird entnommen, um das ungeladene Guanosin in einem Flüssigkeitsszintillationszähler zu quantifizieren. Die Aktivität von PDE wird auf Basis der Menge des ungeladenen Guanosins bewertet.
• In vitro-Assays können verwendet werden, um die Wirksamkeit einer erfindungsgemäßen kondensierten Pyrazolylverbindung bei der Inhibierung der Plättchenaggregation zu bestimmen, die den geringen intrazellulären cGMP-Niveaus zuzuschreiben ist. Beispielsweise wird die Verbindung in einer Plättchensuspension inkubiert, die einen Plättchenaggregationsfaktor enthält, und der Aggregationsgrad wird turbidimetrisch mit einem Zweikanal-Lumi-Aggregometer gemessen und durch das in Teng et al., Biochem. Biophys Acta 1987, 924: 375–382 beschriebene Verfahren in einen Prozentwert umgewandelt.
• In vivo-Screening kann durch die folgenden Verfahrensweisen durchgeführt werden, die in der Technik wohl bekannt sind. Ohne weitere Ausführungen wird angenommen, dass der Fachmann auf Basis dieser Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Umfang verwenden kann. Die folgenden speziellen Beispiele, die die Synthese und die biologische Prüfung von bestimmten erfindungsgemäßen Verbindungen beschreiben, sind daher als lediglich veranschaulichend und nicht als den Rest der Offenbarung in irgendeiner Weise einschränkend auszulegen.
• Beispiel 1
• Synthese von 1-Benyzl-3-(5'-methoxymethyl-2'-furyl)-5,6-methylendioxoindazol
• 0,23 g Verbindung 1 (0,66 mmol) wurden in 5 ml THF gelöst. Der Lösung wurden 0,8 g NaH (3,3 mmol) bei 0 ± 2°C zugegeben, um eine Mischung zu erhalten, die 0,5 Stunden lang bei dieser Temperatur reagieren gelassen wurde. 0,1 g Methyliodid (0,66 mmol) wurden dann der Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wurde eine weitere Stunde lang gerührt, bevor sie mit Eiswasser gequenscht wurde. Die so erhaltene Mischung wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert und der Extrakt wurde mit Wasser neutralisiert, gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen, um einen Rückstand zu erhalten, der durch Säulenchromatographie (Kieselgel/Benzol) gereinigt wurde, um 0,24 g Verbindung 4 in einer Ausbeute von 80% zu erhalten.
  Schmp.: 99–101°C
  MS (%), m/z: 362 (M⁺)
  IR (KBr) K_max: 1635 cm^–1 (C=O).
  ¹H-NMR (CDCl₃) Λ: 3,42 (3H, S, -OCH₃), 4,52 (2H, S, -CH₂O-), 5,52 (2H, S, =NCH₂-), 5,98 (2H, S, -OCH₂O-), 6,48 (1H, d, J = 3,3 Hz, H-4'), 6,61 (1H, S, H-7), 6,79 (1H, d, J = 3,3 Hz, H-3'), 7,15–7,30 (5H, m, H-4, Phenyl) und 7,38 (1H, S, H-4).
  Elementaranalyse C, H, N (%):
  berechnet: 68,60, 5,01, 7,73;
  gefunden: 69,58, 5,03, 7,71.
• Aktivierung von sGC
• Gewaschene Kaninchenblutplättchen wurden durch das in Teng et al., Thromb. Haemost. 1988, 59: 304 beschriebene Verfahren hergestellt. Sie wurden dann in 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4) suspendiert und anschließend durch Ultraschall getrennt. Das so erhaltene Lysat wurde 20 Minuten lang bei 39 000 × g und 4°C zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde als Quelle für sGC verwendet. Zwei aliquote Mengen (50 μl) der überstehenden Flüssigkeit wurden jeweils zwei Tris-HCl-Pufferlösungen (150 μl, 50 mM, pH 7,4) zugegeben, die jeweils GTP (0,2 mM, die 1 × 10⁶ cpm [α-³²P] GTP enthielten), MgCl₂ (5 mM), cGMP (2,5 mM), Kreatinphosphat (15 mM) und Kreatinphosphokinase (30 μg) enthielten. Eine der beiden Lösungen enthielt auch 100 μM einer kondensierten Pyrazolylverbindung. Nach 10minütiger Inkubierung bei 30°C wurde die Umwandlung von GTP in cGMP durch sGC mit HCl (200 μl, 0,5 N) beendet. Die Reaktionslösungen wurden dann 6 Minuten lang auf 100°C erhitzt und in einem Eisbad gekühlt. Nach der Zugabe von Imidazol (200 μl, 1 mM) zu jeder Mischung wurden GTP und cGMP auf neutralem Aluminiumoxid, wie in White et al., Anal. Biochem. 1971, 41: 372 beschrieben, getrennt. Die Radioaktivität ([³²P]cGTP) wurde in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen, um die Menge von GTP zu bestimmen.
• Inhibierung von PDE
• Gewaschene menschliche Blutplättchen wurden durch das in Teng et al., Biochem. Biophys Acta 1989, 990: 315–320 beschriebene Verfahren hergestellt. Sie wurden dann in 50 mM-Tris-HCl-Pufferlösung mit pH 7,4 (die 5 mM MgCl₂ enthielt) suspendiert und anschließend durch Ultraschall bei 4°C getrennt. Das so erhaltene Lysat wurde 20 Minuten lang bei 39 000 × g und 4°C zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten, die PDE enthielt. Aliquote Mengen der überstehenden Flüssig keit wurden entnommen, um zwei PDE-Lösungen (in einer Tris-HCl-Pufferlösung) herzustellen, wovon eine 10 μM einer kondensierten Pyrazolylverbindung enthielt. Beide Lösungen wurden zuerst 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert, worauf Zugabe von 10 μM cGMP (die 0, 1 μCi [³H] cGMP enthielten) folgte. Nach weiterer 30minütiger Inkubierung bei 37°C, wobei cGMP durch PDE in 5'-GMP umgewandelt wurde, wurden beide Lösungen 1 Minute lang auf 100°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Schlangengift von Ophiophagus hannah (0,1 ml, 1 mg/ml) wurde dann zugegeben, worauf eine 30minütige Inkubierung bei 25°C folgte, um 5'-GMP in ungeladenes Guanosin umzuwandeln. Eine Aufschlämmung von Ionenaustauscherharz (1,0 ml, Dowex-1, bezogen von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde jeder Lösung zugegeben, um jegliches verbliebenes cGMP zu binden und zu entfernen. Jede so erhaltene cGMP-freie Lösung wurde dann zentrifugiert und eine aliquote Menge (0,5 ml) der überstehenden Flüssigkeit wurde entnommen, um ungeladenes Guanosin in einem Flüssigkeitsszintillationszähler zu quantifizieren.
• Beispiel 2
• Inhibierung der Plättchenaggregation
• EDTA wurde Blut zugegeben, das aus der marginalen Ohrvene eines Kaninchens entnommen wurde, um eine EDTA-Endkonzentration von 6 mM zu erreichen. Das EDTA enthaltende Blut wurde dann 10 Minuten lang bei 90 × g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, ein Plättchen-reiches Plasma, wurde weiter 10 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert. Die so erhaltenen Plättchenklumpen wurden mit einer Lösung gewaschen, die EDTA (2 mM) und Serumalbumin (3,5 mg/ml) enthielten, und dann wiederum 10 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert. Die Klumpen wurden dann mit einer EDTA-freien Tyrode-Lösung der folgenden Zusammensetzung (mM) gewaschen: NaCl (136,8), KCl (2,8), NaHCO₃ (11,9), MgCl₂ (1,1), NaH₂PO₄ (0,33), CaCl₂ (1,0) und Glukose (11,2). Nach Zentrifugation unter denselben Bedingungen wurden die Plättchenklumpen in der oben beschriebenen EDTA-freien Tyrode-Lösung suspendiert. Die Plättchenanzahl wurde mit einem Coulter Counter (Modell ZM) gezählt und auf 4,5 × 10⁸ Plättchen/ml eingestellt.
• Eine zu prüfende Verbindung wurde 4 Plättchensuspensionen zugegeben, die dann 3 Minuten lang bei 37°C unter Rührbedingungen (900 UpM) inkubiert wurden. Eine Minute nach dem Rühren wurden 4 Aggregationsinduktionsmittel, d. h. Thrombin, Kollagen, Arachidonsäure (AA) und Plättchenaggregationsfaktor (PAF) jeweils 4 Suspensionen zugegeben, was die Aggregation der Plättchen herbeiführte. Die Plättchenaggregation in jeder Suspension wurde mit einem Zweikanal-Lumi-Aggregometer (Modell 1020, Payton, Kanada) durch das turbidimetrische Verfahren gemessen, das in Born et al., J. Physiol. 1963, 168: 178–195 beschrieben ist. Die prozentualen Werte der Plättchenaggregation, die 5 Minuten nach der Zugabe von jedem Aggregationsinduktionsmittel bestimmt wurden, wurden durch das Verfahren berechnet, das in Teng et al., Biochem. Biophys Acta 1987, 924: 375–382 beschrieben ist.
• Eine erfindungsgemäße Verbindung wurde geprüft und zeigte eine inhibierende Wirkung auf die Plättchenaggregation, die durch verschiedene Induktionsmittel induziert wurde.

Claims (4)

1-Benzyl-3(5'-methoxymethyl-2'-furyl)-5,6-methylendioxoindazol und pharmazeutisch akzeptable Salze desselben.

Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2 zur Behandlung von Erkrankungen, die mit niedrigen intrazellulären cGMP-Niveaus verbunden sind.

Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der die Zusammensetzung Plättchenaggregation hemmt.